DK167918B1

DK167918B1 - Koagulationsneutrale, hydrofile glasfibre, fremgangsmaade til fremstilling heraf, middel til fraskillelse af plasma fra blod omfattende glasfibrene samt deres anvendelse

Info

Publication number: DK167918B1
Application number: DK313686A
Authority: DK
Inventors: Hans Wielinger; Helmut Freitag
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1985-07-04
Filing date: 1986-07-01
Publication date: 1994-01-03
Also published as: PT82908A; DE3523969A1; DK313686D0; NO171971B; EP0208218A3; NO862626L; KR870001126A; JPS627650A; AU560350B2; ES2000311A6; EP0208218A2; US4786603A; ATE50760T1; JPH0475860B2; PT82908B; CA1262220A; ZA864832B; AU5937986A; DE3669308D1; EP0208218B1

Description

i DK 167918 B1

Den foreliggende opfindelse angår koagulationsneutrale, hydrofile glasfibre, en fremgangsmåde til fremstilling heraf, et middel til fraskillelse af plasma fra blod omfattende glasfibrene samt deres anvendelse.

5 I EP patentansøgning nr. 00 45 476 beskrives midler og fremgangsmåder til fraskillelse af plasma eller serum fra komplet blod, som muliggør bestemmelse af indholdsstoffer fra komplet blod på enkel måde. Ifølge dette litteratursted kan plasma adskilles fra erytrocytterne ved, at man lader det komplette 10 blod løbe gennem et lag af glasfibre med fiberdiametre på under 2,5 jLtm, som tilbageholder erytrocytterne. Blodet påføres derved fortrinsvis på en ende af et retvinklet uvævet glasfibermateriale, hvorfra plasmaen transporteres kapillært til det øvrige område. På denne med plasma fyldte del af det uvævede 15 materiale trykkes efter plasmaudvindingsprocessen en matrix, som indeholder de for reaktionen nødvendige reagenser (papir, sugende film etc.), og i hvilken påvisningsreaktionen for den parameter, der skal påvises, gennemføres ved remissionsmålinger.

20 Dette enkle plasmaudvindings- og plasmatransportsystem kan anvendes til alle klinisk-kemisk vigtige parametre, med undtagelse af parametre, der skal bestemmes ved blodkoagulationsundersøgelser. Det er kendt, at koagulationsanalyser principielt skal gennemføres i plastbeholdere eller glasbeholdere, som er 25 inaktiveret ved hjælp af en belægning af siliconeharpiks, fordi ubehandlet glas påvirker blods eller plasmas koagulationsevne. Glas aktiverer således koagulation af plasma, hvis koncentration af koagulationsfaktorer ligger i normalområdet, hvorved enfasekoagulationstiden ifølge Quick forkortes for 30 sådant plasma. Enfasekoagulationstiden ifølge Quick forlænges hos plasma med lavere procenter ved inaktivering af koagulationsfaktorer. Glas inaktiverer derved først og fremmest faktorerne V og Ila. Ved denne inaktivering og de dermed falskt forlængede koagulationstider tilintetgøres den diagnostiske 35 nytte, fordi forholdene mellem de enkelte koagulationsfaktorer DK 167918 B1 2 forskubbes. Den i procent angivne Quick-værdi omfatter ud over fibrinogenkoncentrationen aktiviteten af faktorerne II, V, vil og X. En plasmaportion fra sunde donorer defineres som 100% plasma, og ved fortynding med fysiologisk kogsaltopløsning 5 fremstilles tilsvarende plasmaprøver med lavere procenter. Ud fra denne fortyndingsrække konstrueres en referencekurve, ved hjælp af hvilken Quick-værdierne for patientplasma kan fastlægges .

Også bestemmelsen af den partielle thromboplastintid (PTT) på-10 virkes negativt af inaktiveringen af faktorerne XII og XI. Påvisningen af antithrombin III og heparin forstyrres betragteligt gennem en inaktivering af thrombin forårsaget af glas.

Formålet med den foreliggende opfindelse er derfor at modificere glasfibre således, at disse bliver koagulationsneutrale 15 uden at ændre deres adskillelses- og transportegenskaber, og som derved bliver anvendelig til de hæmostasiologiske undersøgelser.

Tilsyneladende er der følgende løsningsmuligheder: anvendelse af fibermaterialer af plastarter. Disse fibermaterialer har 20 imidlertid med hensyn til deres adskillelsesopførsel over for erytrocytterne ikke de ønskede egenskaber og påvirker til dels betragteligt plasmas koagulationsevne. Desuden er det kendt, at man kan belægge glas på overfladen ved siliconebehandling med siliconeharpiksemulsioner og dermed udelukke en påvirkning 25 af koagulationsfaktorerne. Denne siliconebehandling bevirker i det specielle tilfælde med glasfibre imidlertid en så stærk hydrofobering af overfladen, at der ikke mere kan finde en befugtning sted og at fibrene dermed fuldstændigt taber deres erytrocytadskiHelses- og plasmatransportegenskaber.

30 Det har nu overraskende vist sig, at man kan modificere glasfiberoverflader kemisk med bestemte silaner således, at de bibeholder de hydrofile egenskaber, som for eksempel er nødvendige for uvævede glasfibermaterialers sugeevne, men taber på- DK 167918 B1 3 virkningen af koagulationsfaktorerne, det vil sige bliver koagulationsneutrale .

Opfindelsen angår således koagulationsneutrale, hydrofile glasfibre, som er ejendommelige ved, at der på deres overflade 5 er bundet silaner med strukturen *'3 z-s i-r1-o-ch2-ch-ch2-x

10 I I

R'3 °h hvor R2 betegner en alkylengruppe med 2-6 carbonatomer, X betegner en hydroxygruppe, en eventuelt med en eller flere hy-15 droxygrupper substitueret alkoxygruppe, en aminosyre- eller en peptidrest, Z betegner en oxygeribro til glasoverfladen, og R'3 enten betegner en lavere alkylgruppe med 1-6 carbonatomer eller en oxygenbro til siliciumatomerne i nabogruppen eller til glasoverfladen.

20 Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af glasfibrene, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man omsætter rensende glasfibre med en silan med formlen I

\ 25 R3-Si-R1-0-CH2-CH-CH2 (I) / \ / R2 0 hvori Ri betegner en alkylengruppe med 2-6 carbonatomer, R2 betegner en lavere alkoxygruppe med 1-6 carbonatomer, og 30 R3 betegner en lavere alkyl- eller lavere alkoxygruppe med 1-6 carbonatomer, og ved hydrolyse, alkoholyse eller omsætning med en aminosyre eller et peptid omdanner oxirangruppen til X.

DK 167918 B1 4

Behandlingen af glasfibrene sker på kendt måde ved, at man anvender stoffer med den almene formel I i vandige, let surt indstillede opløsninger (FEBS Lett. 93, 5 - 6 (1978)). Ved denne proces sker der både en udvikling af de reaktive Si-OH-5 grupper, som reagerer med glasoverfladen, samt en omsætning af oxiranringene til dioler. Ved anvendelse af silaner med en al-koxygruppe R2 dannes monomolekylære lag. Ved anvendelse af silaner med 2 eller 3 alkoxygrupper dannes alt efter reaktionsbetingelser flerlagede overtræk (normalt 4-12 lag), da sila-I 10 nerne også reagerer med hinanden under polykondensation.

En fordelagtig mulighed er belægningen af glasoverfladen med stoffer med den almene formel I i vandfrie, organiske opløsningsmidler, eventuelt under katalyse med svage baser og efterfølgende omsætning af oxiranringene til dioler under sur 15 katalyse i vandig opløsning (Advan. Chromatogr., 21, 48 - 53 (1978)). Efter denne fremgangsmåde kan der opbygges monomolekylære eller få silanmolekyler tykke lag.

Det er desuden også muligt at udnytte reaktiviteten af oxiran-eller diolgruppen for derved at tilknytte yderligere ligander, 20 som holder glasset koagulationsneutralt, men som forandrer hy-drofiliciteten, for så vidt dette ser ud til at være nødvendigt og retfærdiggør de yderligere omkostninger. Stærkt ioni-ske ligander udelukkes derved, da de påvirker koagulationen, men en tilkobling af aminosyrer og peptider kan være fordelag-25 tig. En alkoholyse af oxiranringen med en monoalkohol fører til mere hydrofobe glycolmonoethere og med polyoler til hydrofile polyolforbindelser.

Det opnåede slutprodukt har til glasoverfladen bundet silaner med følgende struktur: DK 167918 B1 5 K'3

Z-Si~R1-0-CH2-CH~CH2“X

I I

5 R'3 OH

hvor X betegner en hydroxygruppe, en eventuelt med en eller flere hydroxygrupper substitueret alkoxygruppe, en aminosyre eller en peptidrest, Z betegner en oxygenbro til glasoverfla-10 den og R'3 enten betegner en lavere alkylgruppe med 1-6 carbonatomer eller en oxygenbro til siliciumatomerne i nabogruppen eller til glasoverfladen.

Således modificerede glas/glasfibre forholder sig neutralt 15 over for koagulationskaskadeforløbet.

Som alkylengrupper Rj_ kommer ligekædede eller forgrenede grupper med 2-6 C-atomer på tale, hvor siliciumatomet skal være adskilt fra etheroxygenatomet med mindst 2 C-atomer. Ethylen og propylen foretrækkes.

20 Som alkyl- eller alkoxygrupper R2 og R3 kommer ligekædede og forgrenede lavere alkylgrupper med 1-6 C-atomer, især methyl og ethylgrupper på tale, som er enkle at fremstille og omsætte. såfremt X betegner en alkoxygruppe, indeholder denne ligeledes 1-6 C-atomer. Methoxy, ethoxy, propoxy, 2-hydroxyethy-25 lenoxy og 2,4-dihydroxypropylenoxy er foretrukne grupper. Som aminosyrer eller peptidrester kommer især de i human serum indeholdte naturlige aminosyrer og peptider, især albumin på tale, som ikke forstyrrer koagulationskaskaden.

Glasfibrene ifølge opfindelsen lægges efter sædvanlige frem-30 gangsmåder til uvævede materialer der, som blandt andet beskrevet i eksemplerne, kan anvendes i midler til bestemmelse af koagulationsparametre. De kan imidlertid også anvendes i DK 167918 B1 6 form af. en kort søjle til plasmaudvinding ifølge EP patentansøgning nr. 0045 476, hvorpå plasmaet derefter på sædvanlig måde kan anvendes i koagulationsforsøg.

Opfindelsen angår desuden et middel til fraskillelse af plasma 5 fra blod til hæmostasiologiske undersøgelser, bestående af et lag af de her omhandlede glasfibre med en middeldiameter på 0,2-5 μπι, fortrinsvis 0,5-2,5 /m, og en densitet på 0,1 - 0,5 g/cm3.

i

Opfindelsen angår endvidere anvendelse af glasfibre til frem-10 stilling af forsøgsmateriale til hæmostasiologiske undersøgelser.

Det er indlysende, at i sådanne midler skal ikke blot glasfiberlagene ifølge opfindelsen men også alle øvrige af de med plasma i kontakt kommende dele bestå af koagulationsneutrale 15 materialer, hvor der især kan anvendes tilsvarende for fagfolk kendte plastarter.

Eksempel 1

Fremstilling af koagulationsneutrale alasfibre.

Til 1 liter vand, som med en syre (for eksempel saltsyre eller 20 eddikesyre) blev bragt til en pH-værdi på 2,0 - 4,0, fortrinsvis 3,0, sættes 5 - 50 g, fortrinsvis 20 g 7-glycidoxypropyl-trimethoxysilan. Til fraspaltning af methanol og udvikling af Si-OH-grupperne omrøres indtil der ikke mere kan ses nogen u-klarhed. Reaktionen kan accelereres ved forøgelse af tempera-25 turen. En reaktionstid på en time ved 80°C har vist sig særlig gunstig. Til denne opløsning sættes 0,5 - 10 g glasfibre, fortrinsvis 2 - 7 g. Der røres videre i 1 til 4 timer, fortrinsvis 1 time, og derved bindes silanen til glasoverfladen og oxiranringen omsættes til diolgruppen. Reaktionen forløber 30 hurtigere ved højere temperaturer. Glasfibrene frasuges og vaskes grundigt efter med vand. Glasfibrene opslæmmes ill i - --- DK 167918 Bl - *Γ 7 vand, der blev indstillet med saltsyre til en pH-værdi på 2,0 - 4,0, fortrinsvis 3,o, og på en bladdanner dannes blade med en fladevægt på 20 - 200 g/m2. Den fladevægt, der skal vælges, afhænger af, til hvilken anvendelse de dannede uvævede mate-5 rialer behøves (se dertil eksempel) .

Eksempel 2

Afprøvning af glasfibrene for koaqulationsneutralitet

Fra de ifølge eksempel 1 fremstillede glasfibre bringes portioner på 40 mg sammen med portioner på 300 μΐ opsamlet plasma 10 fra sunde donorer såvel som fra med antikoaguleringsmidler behandlede patienter, og der inkuberes i 1 minut ved 37°C. Derpå fraskilles plasmaet ved centrifugering. Plasmaen undersøges før og efter behandlingen med glas for enfasekoagulationstiden ifølge Quick. Derved kan Clotting-testen anvendes: 15 Start af koagulationskaskaden med calciumchlorid og thromboplastin og fasthagning af prøven, hvorved tiden til dannelse af fibrintrådene måles. Der kan ligeledes fremdrages en fotobestemmelse af Quick-tiden (Becher, U. et in der Gerinnungsdi-agnostik, F.K. Schattauer Verlag, Stuttgart - New York (1984), 20 side 17-30).

Derudover testes indflydelsen på thrombin (faktor Ila) som følger. 300 μΐ af en opløsning af thrombin i vand med cirka 3 U/ml bringes på den ovenfor beskrevne måde sammen med glas. I alle forsøg, hvor glasset blev modificeret ved fremgangsmåden 25 ifølge opfindelsen, optræder der ingen forskelle i koagula-tionsopførslen hos plasma før og efter behandlingen med modificeret glas. Også thrombinaktiviteten (thrombin inaktiveres fuldstændigt af ubehandlet glas) forbliver uforandret.

Aktivitetsbestemmelsen af thrombin gennemføres med Tos-Gly-30 Pro-Arg-p-nitroanilin som substrat. Dertil inkuberes 2 ml puffer tris/HCl 2,00 mmol/1, pH-værdi 8,1 med 50 μΐ thrombinop- DK 167918 B1 8 løsning ved 25°C i 3 minutter, og derpå startes reaktionen med 100 μΐ 3,8 mmol/1 substrat i puffer, og kinetikken følges.

Eksempel 3

Bestemmelse af enfasekoaaulationstiden ifølge Quick 5 Fremstilling af forsøgsmateriale Reaaensmatrix

Et-papir med en fladesugeevne på 60-70 ml/m2 imprægneres med en vandig opløsning med følgende sammensætning:

Hepes 250 mmol/1 (puffer) 10 Tos-Gly-Pro-Arg-p-phenylendiamin 1 mmol/1 (substrat) N-(4-fluorphenyl)-N-methylamino- 30 mmol/1 (kobler) methanphosphonsyre

Kaninhj ernethromboplastin 1,2 g/1

Denne opløsning indstilles med natronlud på pH-værdi 7,3.

15 Efter tørringen skæres af det imprægnerede papir baner med en bredde på 15 mm.

Oxidationsmatrix

Et nylonnet, trådtykkelse cirka 40 μια, maskevidde cirka 60 μια (type NY 20 HC Super fra firmaet Zuricher Beuteltuchfabrik, 20 Schweiz) imprægneres med en vandig opløsning af 50 mmol K3[Fe(CN)6]/l og 50 mmol calciumchlorid/1. Efter tørring skæres af det imprægnerede net 15 mm brede baner.

Forsøgsmaterialets opbygning På en 100 mm bred polystyrenfolie lægges det uvævéde glasfi-25 bermateriale ifølge opfindelsen med en fladevægt på 50 - 60 g/m2 i en bredde på 15 mm og fikseres med et nylonnet med en DK 167918 B1 9 trådtykkelse på 140 μια og en maskebredde på 250 μια, som lægges over og klæbes til i enden (se fig. 1). I den frie ende af det uvævede glasfibermateriale lægges oxidations- og reagensma-trix'en over hinanden og afdækkes og fastklæbes med en 200 μια.

5 tyk transparent polycarbonatfolie med en bredde på 15 mm (se fig. 1) . De således fremstillede bånd skæres til 6 mm brede strimler. Opbygningen af forsøgsstrimlerne vises i fig. 1. Der er: 1. Polystyrenbærerfolie 10 2. Klæbemiddel 3. Nylonnet 4. Uvævet glasfibermateriale ifølge opfindelsen 5. Oxidationsmatrix 6. Reagensmatrix 15 7. Polycarbonatafdækningsfolie

Bestemmelse af enfasekoaqulationstiden ifølge Quick

Sammenligning mellem teststrimler, som blev fremstillet med glasfibrene ifølge opfindelsen og ikke-silaniserede glasfibre.

På nylonnettet, hvormed det uvævede glasfibermateriale er fik-20 seret, pipetteres 35 μΐ af en citratblod-fortyndingsrække (hæ-matokrit på 40%) på 100%, 50%, 33%, 25% og 12,5% blod i fysiologisk NaCl-opløsning. Erytrocytterne tilbageholdes i adskillelsesdelen. Teststrimlerne tempereres derpå til 37°c, og med et remissionsfotometer følges farvedannelsen med tiden.

25 Det skal derved iagttages, at der med glasfibrene ifølge opfindelsen opnås væsentligt højere signaler end med ubehandlede glasfibre. Som Quick-tid kan der ved anvendelse af silanise-rede glasfibre tages den tid, i løbet af hvilken der gennemløbes en remissionsformindskelse på 10% remission. Derimod kan 30 der ved anvendelsen af ubehandlede glasfibre kun fremdrages de tidsrum, inden for hvilke der finder en ændring på 4% remission sted. Også spredningerne ved forsøg med glasfibrene ifølge opfindelsen er væsentligt mindre, da der ikke fra glassets

Claims

20 Af tabellen ses, at der, som det er kendt fra koagulationsanalyser ved hjælp af Clotting-testen, med glas hos plasma fra sunde donorer (100% plasma) foregår en aktivering, mens plasmaer med lavere procenter tydeligt inaktiveres. Desuden fremgår det at referencekurven, som opnås med en for-25 søgsopbygning med glasfibrene ifølge opfindelsen, ligner referencekurven fra det fotometriske Quick-forsøg meget (se fig. 2, hvor ordinataksen angiver % plasma (100% svarer til plasma hos raske patienter), og abscisseaksen angiver koagulationstiden) . 30 Patentkrav.

1. Koagulationsneutrale, hydrofile glasfibre, kende- DK 167918 B1 tegnet ved, at der på deres overflade er bundet silaner med strukturen: R'3

2. Glasfibre ifølge krav 1, kendetegnet ved, at silanlaget er 1 til 30, især 4-12 molekyllag tykt.

3. Fremgangsmåde til fremstilling af glasfibre ifølge krav 1 - 2, kendetegnet ved, at man omsætter rensede glas- 20 fibre med en silan med formlen I % \ R3-Si-R1-0-CH2-CH-CH2 (I) / \ /

25 R2 O hvori R2 betegner en alkylengruppe med 2-6 C-atomer, R2 betegner en lavere alkoxygruppe med 1-6 C-atomer, og R3 betegner en lavere alkyl- eller lavere alkoxygruppe med 1-6 3 0 C-atomer, og ved hydrolyse, alkoholyse eller omsætning med en aminosyre eller et peptid omdanner oxirangruppen til X. DK 167918 B1

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at omsætningen gennemføres i vandig opløsning i nærværelse af en sur katalysator, og at der som gruppe X opnås en hydroxygrup-pe.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at omsætningen gennemføres i et vandfrit medium.

5 Z-Si-R1-0-CH2-CH-CH2-X I I R'3 oh hvor Rx betegner en alkylengruppe med 2-6 C-atomer, X betegner 10 en hydroxygruppe, en eventuelt med en eller flere hydroxygrup-per substitueret alkoxygruppe, en aminosyre- eller en peptidrest, Z betegner en oxygenbro til glasoverfladen og R'3 enten betegner en lavere alkylgruppe med 1-6 carbonatomer eller en oxygenbro til siliciumatomerne i nabogruppen eller 15 til glasoverfladen.

6. Middel til fraskillelse af plasma fra blod til hæmostasio-logiske undersøgelser, bestående af et lag af glasfibre med en middeldiameter på 0,2 - 5 μτα, fortrinsvis 0,5 - 2,5 μια, og en 10 densitet på 0,1 - 0,5 g/cm3, kendetegnet ved, at glasfibrene er ifølge krav l eller 2.

7. Middel ifølge krav 6, kendetegnet ved, at fibrene er lagt i lag i en søjle, hvis top er beregnet til optagelse af blodet og hvis bund er beregnet til aftagelse af 15 plasma.

8. Middel ifølge krav 6, kendetegnet ved, at glasfiberlaget består af et glasfiberpapir eller uvævet glasfiber-materiale og er en del af et diagnostisk middel til påvisning af koagulationsparametre.

9. Middel ifølge krav 8, kendetegnet ved, at glas fiberlaget er det øverste lag af et flerlags diagnostisk middel.

10. Middel ifølge krav 8 eller 9, kendetegnet ved, at glasfiberlaget står i sugende kontakt med et plasmatrans- 25 portlag, der på deres side står i sugende kontakt med et eller flere reagenslag eller kan bringes i kontakt med disse.

11. Anvendelse af glasfibre ifølge krav 1 eller 2 til frem- DK 167918 B1 stilling af forsøgsmateriale til hæmostasiologiske undersøgelser.