NO166238B

NO166238B - Fremgangsmaate for konvertering av et dinitril ved hjelp av et enzym.

Info

Publication number: NO166238B
Application number: NO853852A
Authority: NO
Inventors: Sven Erik Godtfredsen; Otto Andresen
Original assignee: Novo Industri As
Priority date: 1984-10-01
Filing date: 1985-09-30
Publication date: 1991-03-11
Also published as: NO853852L; AU599890B2; DK440985A; CN85107055A; AU4815885A; ATE87657T1; DE3587230T2; IE852409L; EP0178106A2; DK440985D0; EP0178106B1; EP0178106A3; NO166238C; DE3587230D1; IE60256B1

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for

selektiv omdannelse av bare eller hovedsakelig én av cyanogruppene i dinitriler til tilsvarende cyanokarboksylsyre eller cyanokarboksylsyreamid, ved hjelp av enzymer som i det følgende er betegnet mononitrilaser.

Forekomsten av nitrilkonverterende enzymer er vel anerkjent. Blant disse er slike nitril-konverterende enzymer som katalyserer omdannelsen av nitriler til de tilsvarende karboksylsyrer, blitt spesielt godt studert av forskere på området. Undersøkelser som er utført under anvendelse av slike enzymer angir at omdannelsen av nitriler ved nitrilkonverterende enzymer kan foregå på molekyl-nivået ved forskjellige mekanismer. Skjema 1 nedenfor oppsummerer et hypotetisk skjema som er blitt fremsatt for å forklare omdannelsen av nitriler til karboksylsyrer.

hvor R angir et radikal, dvs. resten av nitrilet, og "Enzym"

angir et nitrilkonverterende enzym.

Som angitt i skjema 1 har man tenkt at nitriler med den generelle formel I som angripes av enzymet, går til mellomproduktet med den generelle formel Ia, som i nærvær av vann brytes ned til en karboksylsyre med den generelle formel III eller til det tilsvarende karboksylsyreamid med den generelle formel II. Amidet ifølge formel II kan deretter konverteres til overgangsformen med formel Ila og til slutt til den tilsvarende karboksylsyre med formel III. De nitrilkonverterende enzymer som katalyserer omdan-nelsene fra en forbindelse med formel I til en forbindelse med formel II, fra en forbindelse med formel II til en forbindelse med formel III og fra en forbindelse med formel I til en forbindelse med formel III, er betegnet henholdsvis nitril-hydrataser, -amidaser og -nitrilaser. Betegnelsen nitrilkonverterende enzym anvendt i det foreliggende omfatter således nitrilaser og nitril-hydrataser som eventuelt inneholder amidaser.

Området av nitriler som kan underkastes enzym-katalysert omdannelse, er faktisk meget vidt. Som påpekt i en fersk oversikt over biokonvertering av nitriler av Jallageas et al., Adv. Biochem.Engineer., 14 (1980), 1 et seq., ser det ut til at et hvert nitril kan undergå enzymatisk konvertering. Denne oversikt beskriver også mikrobielle kilder til nitrilkonverterende enzymer med en ytterst vid spesifisitet, idet den navngir arter av Bacillus, Bacteridium, Micrococcus og Brevibacterium. Forfatterne an-tar at deres mikrobielle nitrilaser er ikke-spesifikk. Man vil også vente at mikrobielle nitrilaser vil angripe begge cyanogruppene i dinitriler.

En lignende beskrivelse fremkommer i US-patent nr. 3 940 316 av Jallageas' forskningsgruppe, nemlig en fremgangsmåte ved hvilken nitriler hydrolyseres til syrer ved anvendelse av bakterier som viser nitrilase-aktivitet. Hydrolysen er angitt å være fullstendig, dvs. dinitriler hydrolyseres fullstendig.

En ytterligere analog beskrivelse av den samme forskningsgruppe fremgår av US-patent nr. 4 001 081 i henhold til hvilken to spesifikke dinitriler omdannes til de tilsvarende diamider under anvendelse av bakterier med nitrilase-aktivitet, dvs. begge cyanogrupper omdannes; se eksempler 5 og 11 i dette.

Det er nå overraskende blitt funnet at visse nitrilkonverterende enzymer betegnet mononitrilaser, og blant disse til og med slike som har vid substrat-spesifisitet,kan anvendes for selektiv omdannelse av bare eller hovedsakelig én av cyanogruppene i dinitriler. Det er med andre ord blitt funnet at visse nitrilkonverterende enzymer for alle praktiske formål er mononitrilaser, og denne oppdagelse muliggjør utøvelse av denne oppfinnelse.

Den foreliggende oppfinnelse omfatter selektiv enzymatisk konvertering av et dinitril til tilsvarende cyanokarboksylsyre eller cyanokarboksylsyreamid, ved hjelp av en mononitrilase og deretter, hvis ønskelig, utvinning av det ønskede produkt.

Mange mikrobielle kilder til mononitrilaser kan anvendes for tilveiebringelse av de mononitrilaser som anvendes ved fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse. Således er mononitrilasene av mikrobiell opprinnelse, idet de dannes av bakterier, sopp eller andre mikroorganismer. For eksempel kan de følgende mikrobielle arter anvendes for dannelse av mononitrilaser: Arter av Pseudomonas, Gluconobacter, Agrobacterium, Acetobacter, Achromobacter, Acinetobacter, Alcaligenes, Citrobacter, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Serratia, Yersinia, Chromobacterium, Aeromonas, Vibrio, Flavobacterium, Micrococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Clostridium, Lactobacillus, Leuconostoc, Brevibacterium, Cellulomonas, Corynebacterium, Microbacterium, Propionibacterium, Mycobacterium, Streptomyces, Bacteridium, Chaetomelia, Septoria, Diplodia, Arthrobacter, Nocardia, Stenphylium, Torylopsis, Phoma, Conothyrium, Myrothecium, Pestalotia, Melanconium, Epicoccum, Penicillium, Aspergillus, Sepedonium, Fusidium, Oidiodendron, Cephalosporium, Scopulariopsis, Paecilomyces, Verticillium, Tricothecium, Pullularia, Monotospora, Cladosporium, Helminthosporium, Chrysosporium, Rhodotorula, Kloeckera, Geotrichum og Fusarium. stammer av Agrobacterium radiobacter, Pseudomonas aeroginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Corynebacterium nitrilophilus, Corynebacterium pseudodiphteriticum, Nocardia rhodochrous, Escherichia coli, Neurospora crassa, Lathyrus sylvestris, Lathyrus odoratus, Vieia villosa, stamme A4 (oppbevart ved Laboratory of Microbiology (i det følgende betegnet LMD), Nederland, under nr. LMD 79.2, og oppbevart ved National Collection of Industrial Bacteria (i det følgende betegnet NCIB) 12. april 1985 under nr. 12070), stammer N-771, N-774 og N-775 (oppbevart ved Fermentation Research Institute (i det følgende betegnet FRI), Japan, hénholdsvis under nr. 4445, 4446 og 444 7, og stammer R 332 (oppbevart ved Centraalbureau voor Schimmelcultures (i det følgende betegnet CBS), Nederland), R 340 (CBS nr.495.74, R 341 (CBS nr. 496.74), A 111 (CBS nr. 497.74),

B 222 (CBS nr. 498.74), A 112, A 13, A 141, A 142, B 211, B 212,

B 221, C 211 (CBS nr. 499.74), R 21, R 22, R 311, R 312 (CBS nr. 717-73) og R 331 beskrevet i US-patent nr. 4 001 081. 12. April 1985 ble stammer av Rhodococcus sp. deponert henholdsvis under nr. CBS 496.74, 494.74 og 495.74, LMD 79.2 og CBS 717.73,

498.74 og 497.74, ble utsådd på nytt og deponert under henholdsvis fra nr. NCIB 12067 til og med 12073.

Et spesifikt nitril-konverterende enzyms velegnethet for anvendelse ved fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse kan testes ved at man overvåker den enzym-katalyserte konvertering av dinitrilet som skal konverteres, ved høytrykks-væskekromatografi (i det følgende kalt HPLC), gass-væske-kromatografi, nukleærmagnetisk resonans-spektroskopi (i det følgende betegnet NMR) eller andre analytiske teknikker, for eksempel påvisning av ammoniakk frigitt under reaksjonen. Nitrilkonverterende enzymer som bare angriper én av cyanogruppene i et spesifikt dinitril, er mononitrilaser. Videre er nitrilkonverterende enzymer som innen et visst tidsrom angriper bare én av cyanogruppene i et spesifikt dinitril, egnet ved utførelsen av denne oppfinnelse. Videre kan nitrilkonverterende enzymer som fortrinnsvis hydrolyserer én av cyanogruppene i et spesifikt dinitril og som innen et visst tidsrom også angriper den annen cyanogruppe i mindre grad, for eksempel mindre enn 25 %, fortrinnsvis mindre enn 5 %, ved den tid den første cyanogruppe er blitt omdannet, også anvendes ved utførelsen av denne.oppfinnelse (skjønt i slike tilfeller blir rensningen av den ønskede forbindelse (Formel V) vanskeligere). Slike nitrilkonverterende enzymer er i praksis mononitrilaser og betraktes i det foreliggende å være mononitrilaser av den grunn at de har den mononitrilase-spesifisitet som trenges for fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse. Iføl-ge ovenstående forklaring omfatter mononitrilaser mononitril-hydrataser som eventuelt inneholder amidaser.

De mononitrilase-preparater som anvendes ved fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse, omfatter ethvert preparat som kan omdan-ne bare eller hovedsakelig én av de cyanogrw<p>per som er til stede i et dinitril, til en karboksylsyregruppe eller en karboksyl-syreamidgruppe. Mononitrilase-preparatene kan være meget godt rensede mononitrilaser, rå-enzymer isolert fra mikroorganismer, sprukne celler av nevnte mikroorganismer eller uskadde celler.

Det kan være fordelaktig å anvende mononitrilasene i en immobilisert form som lett kan fremstilles ifølge kjente fremgangsmåter. Mononitrilasene kan også anvendes i en kjemisk modifisert form som oppviser større stabilitet og aktivitet enn de naturlig forekommende enzymer.

Nitrilkonverterende enzymer oppviser bred spesifisitet. Dessuten er mononitrilaser anvendelig i stor utstrekning ved den ønskede omdannelse av dinitriler ifølge denne oppfinnelse.

Mer spesifikt kan cyanokarboksylsyrer og cyanokarboksylsyreamider med den generelle formel

1 12 hvor R representerer -NH2" eller -0H, og X og X er de samme eller forskjellige, idet hver representerer rettkjedet eller forgrenet alkylen eller arylen hvorav hver kan være substituert med én, to eller flere av de følgende grupper: hydroksy, amino, karboksy, nitro, cyano, aryl, lavere alkoksy, lavere alkyltio eller lavere alkylen, med det forbehold at X 2videre kan være en valensbinding, kan fremstilles ved at bare eller hovedsakelig én av cyanogruppene i det tilsvarende dinitril med den generelle formel IV

hvor X 1 og X o hver er som definert ovenfor, konverteres med en mononitrilase. Det henvises forøvrig til patentkravet.

Betegnelsen "lavere" anvendt i forbindelse med noen av sub-stituentene eller en del av en substituent i forbindelsene med formel IV og V angir at den aktuelle gruppe fortrinnsvis inneholder ikke mer enn 6 karbonatomer, fortrinnsvis ikke mer enn 4 karbonatomer. Følgelig er lavere alkyl fortrinnsvis metyl, etyl og propyl. Aryl er fortrinnsvis fenyl eller naftyl. Aryl(lavere-alkyl) er fortrinnsvis benzyl. Lavere alkylen er fortrinnsvis me-tylen, etylen, propylen og 1,4-butylen. Lavere alkoksy er fortrinnsvis metoksy og etoksy. Lavere alkyltio er fortrinnsvis metyltio eller etyltio. Arylen er fortrinnsvis o-, m- og p-fenyl-en. Fortrinnsvis inneholder den alkylen-rest som er betegnet X 1 eller X 2, ikke mer enn 22 karbonatomer, fortrinnsvis ikke mer enn 18 karbonatomer.

Spesifikke og foretrukkede eksempler på dinitriler ifølge formel IV er dinitriler av malonsyre som kan være substituert med 1,5-pentylen eller etylen, av ravsyre, av glutarsyre og av adipinsyre.

Fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse kan utføres ved at man behandler dinitriler (formel IV) i oppløsning, for eksempel en vandig oppløsning, med en mononitrilase. Konsentrasjonen av dinitrilet (formel IV) i reaksjonsmediet kan varieres etter behov fra fortynnet til sterkt konsentrerte oppløsninger. Organiske løsningsmidler kan tilsettes til reaksjonsblandingen eller den enzymatiske reaksjon kan utføres i et i det vesentlige vannfritt mil-jø som for eksempel består av det rene utgangsmateriale (formel IV) eller en blanding av utgangsraaterialet (formel IV) og et orga-nisk løsningsmiddel. Det organiske løsningsmiddel kan bl.a. være dioksan, dimetylsulfoksyd eller N,N-dimetylformamid, som kan være blandet med vann, for eksempel 30/70 (volumdeler). Overgangsfor-mene (formel Ia og Ila) kan ved angrep av andre nukleofiler enn vann, så som for eksempel alkoholer, tioler og aminer, tilveie-bringe de tilsvarende karboksylsyre-mellomprodukter, for eksempel estere, tioestere og amider. Ved utførelse av fremgangsmåten iføl-ge denne oppfinnelse i nærvær av alkoholer, tioler eller aminer kan karboksylsyreamider, karboksylsyreestere eller karboksylsyre-tioestere således syntetiseres.

Den enzymatiske konvertering blir passende fulgt av analyse av porsjoner av reaksjonsblandingen for eksempel med HPLC, gass-væske-kromatografi, NMR-spektroskopi eller, når det anvendes amidaser eller nitrilaser, bestemmelse av ammoniakk. Reaksjonen stop-pes på det ønskede tidspunkt for eksempel ved at enzymet fjernes, ved oppvarming av reaksjonsblandingen eller ved surgjøring for eksempel til en pH-verdi på ca. 1, for eksempel med saltsyre. Den reaksjonstid som bestemmes på denne måte, kan være fra mindre enn 1 time til flere timer, og det kan være ønskelig å justere pH-verdien i reaksjonsblandingen og røre reaksjonsblandingen. Deretter isoleres den ønskede forbindelse (formel V) på en måte som i og for seg er kjent, eventuelt etter fjerning av monotrilasen på en måte som i og for seg er kjent, for eksempel ved filtrering eller sentrifugering.

En passende reaksjonstemperatur er i området fra 0 til 50°C, fortrinnsvis fra 30 til 40°C. pH-verdien i reaksjonsmediet er passende i området fra 4,5 til 10,5, fortrinnsvis fra 6 til 9.

Det oppnådde utbytte avhenger bl.a. av konsentrasjonen av det enzym og substrat som anvendes, av temperaturen og pH-verdien i reaksjonsmediet og reaksjonstiden.

En foretrukket anvendelse av denne oppfinnelse angår fremstilling av epsilon-kaprolaktam, som anvendes for fremstilling av nylon 6. Ved fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse kan adipinsyre-dinitril konverteres til adipinsyre-mononitril. Sistnevn-te forbindelse kan hydrogenere ved fremgangsmåter kjent på området til 6-amino-n-kapronsyre, som deretter kan dehydratiseres til epsilon-kaprolaktam ved fremgangsmåter kjent på området. Alter-nativt omdannes adipinsyre-dinitril ved fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse til det tilsvarende cyanokarboksylsyreamid, -ester eller -tioester, som kan hydrogeneres og deretter cykliseres til epsilon-kaprolaktam. På helt samme måte kan andre laktamer dannes fra de tilsvarende dinitriler.

En ytterligere foretrukket anvendelse av denne oppfinnelse angår fremstilling av chirale forbindelser. Prochirale substra-ter med den generelle formel IV kan således omdannes ved fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse, til chirale produkter med den generelle formel V. For eksempel kan prochirale dialkylerte derivater av malonsyre-dinitril eller beslektede alifatiske dinitriler konverteres ved fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse til de tilsvarende chirale monocyanoforbindelser.

Fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse er ytterligere illustrert ved de følgende eksempler. Eksemplene illustrerer noen foretrukkede utførelsesformer av fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse.

Eksempel 1

500 ml av et medium som inneholdt Pepton (6 g/l), Peptikase (4 g/l), kjøttekstrakt (1,5 g/l), gjærekstrakt (3 g/l) og gluko-se (10 g/l) i konisk formede rystekolber ble inokulert med 10 ml av en 24 timer gammel kultur av stamme B 222 (CBS nr. 4 98.74, omtalt i US-patent nr. 4 001 081; denne organisme er der betegnet Brevibacterium, men den er også blitt klassifisert som Rhodococcus). Kulturene ble inkubert i 24 timer ved 37°C med rysting med kretsende bevegelse. Den dannede biomasse ble isolert ved sentrifugering, vasket 3 ganger med 100 ml porsjoner av 0,1 M

fosfatbuffer med pH 7,0 og til slutt suspendert i 10 ml av nevnte buffer. Den enzymatisk aktive cellemassesuspensjon ble tilsatt til 15 ml 800 mM adipinsyre-dinitril i 0,1 M fosfatbuffer med pH 7. Den resulterende reaksjonsblanding ble omrørt ved 22°C i 3 timer, ekstrahert med 3 volumandeler dietyleter, sur-gjort ved tilsetning av 1 M fosforsyre og ekstrahert med 3 volumandeler dietyleter. De samlede eterfaser ble vasket med saltopp-løsning, tørket over natriumsulfat og konsentrert i vakuum under tilveiebringelse av cyanokarboksylsyren i et utbytte på 90 %. Produktet var homogent ved bedømmelse med tynnsjikt-kromatografi på silikagelplater og oppviste et IR-spektrum identisk med spektret for en autentisk prøve av cyanokarboksylsyren.

Eksempel 2

En 30 mM oppløsning av glutarsyredinitril i 0,1 M fosfatbuffer med pH 7 ble behandlet hovedsakelig som beskrevet i eksempel 1 med mononitrilase-cellemasseproduktet. Frigivelsen av ammoniakk i reaksjonsblandingen ble overvåket, og når konverteringen til monocyanomonokarboksylsyren ble bedømt å være fullstendig, ble den enzymatiske reaksjon stoppet ved at pH i reaksjonsblandingen ble senket til 1 ved tilsetning av 1 M saltsyre. Uoppløselig materiale ble fjernet fra reaksjonsblandingen ved sentrifugering, hvoretter reaksjonsproduktene ble fjernet fra blandingen ved kontinuerlig ekstraksjon med dietyleter. Den eteriske oppløsning av reaksjonsproduktet ble til slutt tørket over natriumsulfat og konsentrert i vakuum under tilveiebringelse av den ønskede monocyanomonokarboksylsyre i et utbytte på 75 %.

Eksempel 3

En 30 mM oppløsning av malonsyredinitril i 0,1 M fosfat-buf f er (pH 7) ble behandlet med mononitrilasen analogt med beskrivelsen i eksempel 2. Reaksjonsproduktet ble isolert ved gjentatt ekstraksjon av reaksjonsblandingen med kloroform etter surgjøring og metning med natriumklorid. Etterfølgende fordamp-ning av den anvendte kloroform tjente til tilveiebringelse av den ønskede monocyanomonokarboksylsyre i et utbytte på 60 %.

Eksempel 4

En 10 mM oppløsning av sebacinsyredinitril i 0,1 M fosfat-buf f er med pH 7 som inneholdt 20 % dioksan, ble behandlet med mononitrilasen analogt med beskrivelsen i eksempel 1. Reaksjonsproduktet isolert som beskrevet i eksempel 2, viste seg å være den ønskede monocyanomonokarboksylsyre ved sammenligning med en autentisk prøve av denne forbindelse. Det ble oppnådd et utbytte på 70 %.

Eksempel 5

1,4-dicyanobenzen (10 mM) i en fosfatbuffer (0,1 M, pH 7) som inneholdt 20 % dioksan, ble behandlet med mononitrilasen analogt med beskrivelsen i eksempel 1. Forløpet av den enzym-katalyserte konvertering ble overvåket ved analyse av reaksjonsblandingen under anvendelse av HPLC med intervaller på 15 minutter. Reaksjonen ble stoppet ved surgjøring med 1 M saltsyre når konverteringen til den ønskede monocyanomonokarboksylsyre ble bedømt å være optimal, hvoretter opparbeidelse analogt med beskrivelsen i eksempel 1 ga det ønskede produkt i et utbytte på 65 %.

Eksempel 6

3,3-dimetylglutarsyredinitril ble behandlet med mononitrilasen analogt med fremgangsmåten som er beskrevet i eksempel 1 under tilveiebringelse av 3,3-dimetyl-4-cyanosmørsyre i et utbytte på 85 %.

Eksempel 7

3-metyl-3-hydroksyglutarsyre-dinitril ble behandlet med mononitrilasen analogt med beskrivelsen i eksempel 2 under tilveiebringelse av den ønskede 3-metyl-3-hydroksy-4-cyanosmørsyre i et utbytte på 6 5 %.

Eksempel 8

3-etyl-3-aminoglutarsyre-dinitril ble konvertert på en måte analogt med den som er beskrevet i eksempel 7, under tilveiebringelse av 3-etyl-3-amino-4-cyanosmørsyre i et utbytte på 55 %.

Eksempel 9

a) Stamme B222 ble dyrket i det medium som er beskrevet i eksempel 1, supplert med 100 ppm monofluoracetamid. Etter 14

dager ble den dannede biomasse isolert i det vesentlige som beskrevet i eksempel 1, og deretter tilsatt til 1000 ml av en 0,4 M oppløsning av adiponitril i 10 mM ammoniumbikarbonatbuffer med pH 7,5. Porsjoner av reaksjonsblandingen ble oppsamlet med

intervaller på 5 minutter og analysert med HPLC under anvendelse av en reversert-fase-kolonne av typen "Suphelco" C-18 og et elueringsmiddel som bestod av 10 mM fosfatbuffer med pH 7. Etter 25 minutter ble reaksjonsblandingen funnet å inneholde monoamid-derivatet av adiponitril i en mengde som svarte til et utbytte på 99,5 %. Mononitrilasen ble straks fjernet fra reaksjonsblandingen ved filtrering, hvoretter den resulterende oppløsning ble frysetørket under tilveiebringelse av det ønskede 5-cyanopentansyreamid i et utbytte på 98 %. Forbindelsen var homogen ifølge bedømmelse ved HPLC og tynnsjikt-kromatografi, og oppførte seg i disse tester på en måte som var identisk med en autentisk prøve av den ønskede forbindelse. b) Ved omsetning av adiponitril med Brevibacterium-enzymet fremstilt som beskrevet ovenfor, med det forbehold at reaksjonstiden var 3 timer i stedet for 25 minutter, fikk man fremdeles 5-cyanopentansyreamid.

Eksempel 10

Glutarsyredinitril ble behandlet på en måte som var analog til den som er beskrevet i eksempel 9, under tilveiebringelse av den tilsvarende monoamidomonocyano-forbindelse i et utbytte på 95 %.

Eksempel 11

Sebacinsyre-dinitril ble konvertert til det tilsvarende monoamidomonocyano-derivat på en måte som var analog til den som er beskrevet i eksempel 9. Det ble oppnådd et utbytte på 75 %.

Eksempel 12

3-metyl-3-hydroksyglutarsyre-dinitril ble behandlet med mononitrilasen analogt til beskrivelsen i eksempel 9 under tilveiebringelse av 3-metyl-3-hydroksy-4-cyanoglutarsyreamid i et utbytte på 80 %.

Eksempel 13

Et mononitrilase-preparat fremstilt som beskrevet i eksempel 9, ble suspendert i en 3 % vandig oppløsning av natriumalgi-nat. Den resulterende suspensjon ble dråpevis overført til en vandig 0,1 M kalsiumkloridoppløsning. De resulterende pellets ble omrørt i kalsiumkloridoppløsningen i 3 timer og deretter vasket med flere porsjoner vann som inneholdt 0,9 % natriumklorid.

Den immobiliserte mononitrilase ble deretter pakket i en kolonne, og en vandig oppløsning som inneholdt adiponitril (0,4 M)

og ammoniumbikarbonat (5 mM, pH 7,5) ble ledet gjennom den resulterende enzymreaktor. Prøver av elueringsmidlet fra reaktoren ble analysert ved hjelp av HPLC ved den fremgangsmåte som ble anvendt i eksempel 9, og strømningen gjennom reaktoren ble jus-tert slik at man sikret et utbytte av den ønskede monoamidomono-cyano-forbindelse på 95 %.

Eksempel 14

Et nitrilasepreparat ble tilveiebrakt fra CBS 496.74,

dep. nr. NCIB 12067 analogt med det som er beskrevet i eksempel 1. De resulterende enzymatisk aktive celler ble suspendert i en 30 mM oppløsning av adiponitril i 10 mM fosfatbuffer som ble omrørt effektivt ved romtemperatur. Forløpet for den hydro-lytiske reaksjon ble overvåket ved hjelp av HLPC, som anga et utbytte av monoamidoforbindelsen på 97%.

Eksempel 15

Et enzympreparat fremstilt som beskrevet i eksempel 14, ble suspendert i 10 mM fosfatbuffer hvortil det ble tilsatt rent adiponitril inntil det ble oppnådd et tofase-system av nitril-

og vannfase. Blandingen ble deretter omrørt effektivt for emul-gering av dinitrilet i den vandige enzymholdige fase. Porsjoner av reaksjonsblandingen ble analysert som angitt i eksempel 9.

Det ble oppnådd et utbytte av det ønskede monoamid på 76 % etter opparbeidelse på vanlig måte.

Eksempel 16

Under anvendelse av et enzympreparat tilveiebrakt som beskrevet i eksempel 14 ble malonsyredinitril konvertert til den tilsvarende monocyanomonokarboksylsyre på en måte som var analog til den som er beskrevet i eksempel 3.

Eksempel 17

Under anvendelse av et enzympreparat som beskrevet i eksempel 14 og den fremgangsmåte som er skissert i eksempel 6 ble 3,3-dimetyl-4-cyanosmørsyre fremstilt i et utbytte på 70 %.

Claims

Fremgangsmåte for konvertering av et dinitril med formel IV:

til den tilsvarende cyanokarboksylsyre eller cyanokarboksylsyreamid med formel V:

hvor R<1> representerer -NH2 eller -0H, og X<1> og X<2> er de samme eller forskjellige, idet hver representerer rettkjedet eller forgrenet alkylen eller arylen hvorav hver kan være substituert med én, to eller flere av de følgende grupper: hydroksy, amino, karboksy, nitro, cyano, aryl, lavere alkoksy, lavere alkyltio eller lavere alkylen, med det forbehold at X<2> videre kan være en valensbinding, karakterisert ved at dinitrilet behandles med en mononitrilase av mikrobiell opprinnelse, fortrinnsis av bakteriell opprinnelse, mest foretrukket et immobilisert enzym, idet mononitrilasen oppviser enzym-kjemiske og immunologiske egenskaper som er identisk med egenskapene hos den mononitrilase som stammer fra en av syv stammer av Rhodococcus sp. med deponeringsbetegnelser nr. NCIB 12067 til 12073 , konverteringen avbrytes før cyanogruppen i det ønskede produkt (formel V) i noen vesentlig grad er blitt omdannet av mononitrilasen, og deretter, hvis ønskelig, utvinnes det ønskede produkt.