NO166148B - Fremgangsmaate og apparat for kromatografisk separasjon avbiologiske makromolekyler. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte som gjør det mulig ad kromatograf isk vei - dvs. ved hjelp av en adsorpsjons-prosess som hovedsakelig baserer seg på kromatografisk selek-tivitet - å separere biologiske makromolekyler, såsom proteiner, enzymer, toxiner, antistoffer ... med det formål å oppnå anrikede oppløsninger for det eller de ønskede makromolekyler.

Visse biologiske molekyler, særlig biologiske makromolekyler, er karakterisert ved svært høy molekylvekt (over 5000) og en tendens til å forandres kjemisk, med derav følgende tap av biologisk aktivitet eller av molekylenes funksjonsevne (eksempelvis overgang fra proteiner til peptider). Disse egenskaper begrenser typen av separasjonsmetoder som kan benyttes i industriell målestokk for rensing (utfelling, ultrafiltrering og kromatografi). De kromatografiske metoder (selektiv adsorpsjon) utgjør i dag de tekniske foranstaltninger som er best spesifisert og best egnet for produksjon i industriell målestokk av biologiske makromolekyler med ekstrem renhet.

Slike fremstillingsmetoder utføres ved perkolasjon av en oppløsning som inneholder de biologiske makromolekyler i et fast harpikssjikt med gitte kromatografiske egenskaper og som er egnet til å fremme en selektiv adsorpsjon av disse molekyler. I det tilfelle hvor den eller de ønskede makromolekyler bindes fast til harpiksen, er det mulig å foreta separasjon og oppnå en renset.og konsentrert molekylmengde ved eluering av harpiksen med en oppløsning som har en gitt pH-verdi eller en egnet ionestyrke. I det tilfelle hvor de ønskede makromolekyler forblir i den behandlede oppløsning, (de øvrige makromolekyler er da bundet til harpiksen) oppnås direkte den ønskede separasjon.

Denne kromatografiske teknikk hvor det gjøres bruk av et fast sjikt har gitt resultater som er vel kjent innen bioteknologi, og det skal særlig vises til følgende dokumenter hvor eksempler på denne teknikk er angitt: - "Method of Plasma Protein Fractionation", av J.M. Curling, Academic Press, 1980, side 149-160. - "Protein recovery by ion exchange", av D.T. Jones, Food Processing Industry, April 1975, side 21 og 23, - "Nouveau procédé de valorisation du lactosérum" av B. Mirabel, Rhone-Poulenc Industries, Informations chimie" nr. 175, mars 1978, side 105-109, - Patentskriftene FR 2 321 932 og 2 359 634, hvilke omtaler nye harpikser for ioneutveksling for proteinseparasjon.

Imidlertid fremviser slike metoder for kromatografisk separasjon i et fast sjikt visse ulemper, og den mest alvorlige beror på det faktum at sjiktet gradvis tilstoppes. Denne tilstopping bevirkes hovedsakelig av faste urenheter som befinner seg i oppløsningen og ofte fremkommer som en følge av utfelling av visse elementer i denne. Konsekvensene av denne tilstopping er særdeles alvorlige i industriell målestokk. For å kunne oppnå en fast utfellingsrate over tid, må begynnelsestrykket for oppløsningen økes inntil det får verdier i størrelsesordenen 3 til 4 ganger de nominelle trykkverdier, og dette medfører betydelige tekniske vanskeligheter. For visse anvendelser vil en slik økning faktisk være helt uaksep-tabel. Dessuten er den sykliske rensing av kromatografiske harpikser særdeles vanskelig å utføre i praksis og denne renseprosess medfører vanligvis vasking i adskilte rom, hvilket hindrer en kontinuerlig drift av installasjonene og krever kostbare og kompliserte behandlingsrutiner. Det skal bemerkes at visse kromatografiske harpikser, hovedsakelig av mineralsk natur, har lettsmuldrende bærere og vil således kunne ødelegges i løpet av renseprosessen slik at det dannes fine partikler som tilstopper visse soner i sjiktet. Andre typer kromatografiske harpikser, hovedsakelig av organisk natur, lar seg ikke rengjøre når deres åpninger er blitt tilstoppet og må vrakes. I visse tilfeller kan tilstoppingen medføre en sammenklumping av hele sjiktet, og rengjøring er da ikke mulig. Ytterligere en meget alvorlig konsekvens av tilstoppingen beror på endringen av harpiks-sjiktets bindeevne etter gjentatte rengjøringer. Uansett hvilke forholdsregler som tas, vil en viss mengde urenheter avleires i den kromatografiske harpiks og gradvis redusere dennes bindeevne, slik at det etter en tid blir nødvendig å kassere harpiksen.

Disse omtalte vanskeligheter er velkjente blant spesialister innenfor biologisk kromatografering og det er derfor i de fleste tilfeller nødvendig å foreta en grundig rensing av de aktuelle oppløsninger før anvendelsen. Denne rensing utgjør en betydelig kostnadsfaktor for fremstillings-prosessen og begrenser anvendelsen av denne til fremstilling av kostbare produkter (medikamenter), hvilket hindrer dens bruk for en lang rekke anvendelser hvor de produserte makromolekyler representerer en lavere verdi (behandling av visse naturprodukter med biologisk opprinnelse eller biprodukter fra spesielt næringsmiddelindustri med tilknytning til.landbruket).

Nok en ulempe ved fremgangsmåtene for kromatograf ering i et fast sjikt beror på den korte brukstid for harpiksene, idet disse ødelegges temmelig fort som følge av påkjenninger ved sammenpressing og de ulike mellomliggende behandlingsopera-sjoner de undergår for vasking og fjerning av tilstoppende materialer.

Pr. idag har de ovennevnte problemer enten ikke funnet sin løsning eller de er løst på bekostning av en betydelig kostnadsøkning når det gjelder biologiske makromolekyler. Siden den økonomiske side ved denne teknologi er så betydelig og dertil har betydning for både næringsmiddelsektoren, den farmasøytiske industri, veterinærtjenesten etc, er en rekke forsøk blitt utført med det formål å redusere de viktige konsekvenser som er omtalt ovenfor og dermed i større grad å kunne utnytte fordelene ved de kromatografiske metoder for separasjon av biologiske makromolekyler. Således har enkelte forskere anbefalt å benytte et bevegelig sammenpresningssjikt som består av en lagsammensetning hvor hvert enkelt lag for-skyves ved å ta ut harpiksen i den ene ende og deretter å innføre den igjen ved den andre ende etter vasking og rengjø-ring. (D.T. Jones, "Protein recovery by ion exchange"). Imidlertid er det ennå ikke fremkommet noen tilfredsstillende løsning med generell anvendelse og visse betydelige ulemper eksisterer fortsatt, såsom eksempelvis nødvendigheten av rengjøring, den gradvise reduksjon av bindeevnen og nedslitingen av de anvendte kromatografiske harpikser.

Ellers har man innenfor andre tekniske områder, særlig innenfor mineralseparasjon, lenge anvendt kromatografering med fluidisert sjikt for å unngå tilstopping og reduksjon av harpiksenes nedbrytning: - Metallioneseparasjon: "A continuous ion exchange column", av Turner og Church, Trans. Instn. Chem. Engrs., Volum 41, 1963 side 283-288", - Ekstraksjon av uran: "Assessment of Fluidised Bed Ion Exchange Equipment", av M.J. Slater, J. Appl. Chem. Biotechnol. 1975, vol. 25, side 367-378.

Fremgangsmåter hvor det anvendes kromatografering i fluidisert sjikt for separasjon av molekyler med liten størrelse (og med en høy stabilitet) har vært kjent i mer enn 20 år. Imidlertid har bioteknikerne aldri forsøkt å anvende denne teknikk for kromatograf ering av biologiske makromolekyler, fordi teknikken alltid har syntes umulig å tilpasses til en slik behandlingsmåte av ulike og mer eller mindre objektive årsaker. Enkelte av disse årsaker har etter spesialistenes vurdering vært at de kromatografiske harpikser som har vært spesifisert innenfor makromolekyl-biologien har hatt egenskaper (for liten granulometri, tetthet for nær vannets, ikke tilpassbare fysiske parametre) som har umuliggjort fluidisering av sjiktet uten at partikler er biitt ført med i væskestrømmen. Andre årsaker har vært kinetiske forhold ved bindingen av de biologiske makromolekyler, og denne binding - hovedsakelig forårsaket av de for store mellomliggende hulrom - fremviser en redusert virkningsgrad i fluidisert sjikt, hvorved en slik fremgangsmåte faller uegnet. Andre årsaker har sammenheng med de meget lave hastigheter som det vil være nødvendig å benytte for å føre oppløsningen gjennom et fluidisert lag (uegnethet for industriell produksjon).

Således var allerede i 1980 motforestillingene innenfor de tekniske fagkretser tilstrekkelig store til at en eminent bioforsker skrev i den ovenfor omtalte artikkel: "Methods of Plasma Protein Fractionåtion", av J.M. Curling, side 152": "Vi har valgt en kolonne med fast sjikt heller ienn en med et fluidisert sjikt. Å fluidisere sjiktet forutsetter en oppstigende fluidumstrøm og store partikler med tilstrekkelig tetthet til å holdes i likevekt under innvirkningen av de oppstigende krefter. De geler som er disponible for fraksjonering av proteiner har imidlertid sjelden særlig større tetthet enn vann og vil gi en særdeles fortynnet suspensjon selv ved lave strømningshastigheter. Dertil må kornstørrelsen og størrelsen av de mellomliggende hulrom være så små som overhodet mulig for å øke sannsynligheten for at væskeele-mentet skal gjennomtrenge det indre porevolum, pga. den langsomme makromolekyldiffusjon. Det faste sjikt muliggjør et minimalt volum av søylen og krever kun et lavt vannforbruk. Alle disse forhold teller økonomisk, hvilket har betydning når hovedprinsippet for fremgangsmåten velges. I lys av dette er det åpenbart at bruken av kromatografiske fremgangsmåter innen den biologiske industri krever spesielle bærere med eksepsjonelt gode mekaniske egenskaper. Disse bærere bør være steriliserbare når de anvendes i en søyle i den mest kompakte form, og de bør tillate svært høye strømnings-hastigheter når det hver dag skal behandles oppløsningsmengder av størrelsesordenen flere hundre eller flere tusen liter".

Det skal bemerkes at to eldre patentskrifter, GB-PS 1 148 661 og FR-PS 2 105 032, henholdsvis vedrørende en kromatografisk prosess i et fast sjikt for biologiske molekyler og hvor sjiktet er fluidisert eller befinner seg i en åpen søyle, og ioneutveksling i et fluidisert sjikt for rensing av hardt vann eller et uraniumsalt, henviser til en mulig anvendelse for rensing av biologiske stoffer. Imidlertid må det innses at man i disse patentskrifter ikke har vært i stand til å omstøte de betenkeligheter som er nevnt ovenfor, således beskriver det første patent som sikter mot en behandling under turbulente forhold uansett formen på sjiktet - fast, fluidisert eller åpent - to eksempler på kromatografering av biologiske molekyler, i begge tilfeller molekyler med liten størrelse, nemlig kodein og atropin. Dessuten henviser dette britiske patentskrift i sin generelle del til en liste over mulige anvendelser hvor det benyttes hormoner, vitaminer, alkaloider og antibiotika, hvilke alle har små molekyler unntatt visse av hormonene. Det andre patent gir som eksempel kun rensingen av hardt vann for å fjerne salter og rensingen av et uraniumsalt. Dette franske patent omtaler i sin generelle del anvendelsen av en ioneutvekslingsprosess for biologiske stoffer, og man vet at slike enkle utvekslingsprosesser ikke er anvendbare for annet enn molekyler med svært liten størrelse (i motsetning til kromatografiske prosesser som anvender spesielle selektive kromatografiske harpikser).

Den foreliggende oppfinnelse har til formål å forbedre den aktuelle teknikk for kromatograf isk separasjon av biologiske makromolekyler innenfor den angjeldende bioteknologi. Oppfinnelsen er rettet mot kromatografering av molekyler med stor molekylvekt (over 5000), såsom proteiner, enzymer, tpxiner og antistoffer.

Et hovedformål for den foreliggende oppfinnelse er særlig å kunne muliggjøre kromatografisk separasjon av slike biologiske makromolekyler uten å være beheftet med de alvorlige ulemper som slik separasjon er kjennetegnet ved når det gjelder tilstopping av sjiktene.

Et annet formål med relasjon til det foregående er å kunne redusere slitasjen betraktelig av de harpikspartikler som danner sjiktene.

Nok et formål med den foreliggende oppfinnelse er å

muliggjøre en kontinuerlig drift for separasjonen.

Endelig er et formål med oppfinnelsen å kunne utføre den kromatografiske separasjon av, biologiske makromolekyler på en økonomisk måte egnet for industriell anvendelse i et stort antall prøver med høy molekylvekt, og særlig med sikte på en økonomisk utnyttelse av proteinrike biprodukter fra næringsmidler med tilknytning til landbruket, naturprodukter såsom melk, blod> blodserum, blodplasma og syntetiske produkter.

For å løse denne oppgave er det ifølge oppfinnelsen

skaffet tilveie en fremgangsmåte for kromatografisk separasjon av biologiske makromolekyler med molekylvekt over 5000 i en oppløsning, ved å føre oppløsningen til kontakt med et sjikt av kromatografisk selektiv harpiks, spesifikk for de makromolekyler som skal separeres og således bevirke en selektiv adsorpsjon, idet fremgangsmåten er kjennetegnet

ved anvendelse av en kromatografisk harpiks med midlere granulometri Gm og tetthet Mv og hvis verdier ligger i et område Z som i et diagram over Gm = f(Mv) ligger utenfor en kurve som har asymptotelinjer ved Mv = 1050 kg/m3 og Gm = 30yam (fig. 1), som plasseres i en søyle som omfatter i det minste én etasje, og som ved bunnen har en gjennomhullet fordelingsanordning som fremviser følgende egenskaper: de åpne seksjoner utgjør tilnærmet mellom 0,1% og 10%, den midlere diameter av de åpne seksjoner er over ca. 300 Jim, den midlere diameter av de åpne seksjoner ligger mellom 2 G , og 20 G m, det tilføres en oppløsning til hver etasje i søylen via søylens distribusjonssystem, og det kromatografiske harpikssjikt gjøres flytende ved å innstille den utgående strøm av oppløsning slik at det oppnås en lineær midlere væskestrømningshastighet i søylens rette seksjon på mellom 1,5 V , og 12 V ,, hvor V c er

J c mf * mf mf den minimale hastighet for harpiksens fluidisering. ;Den midlere granulometri Gm for harpiksen er definert på vanlig måte ved formelen ;;hvor xi er massen for den partikkelfraksjon som har granulometrien G^. ;Således er det på en uventet måte i forhold til den ;kjente teknikk blitt konstatert at det er mulig å utføre en kromatograf isk separasjon av biologiske makromolekyler ved selektiv adsorpsjon i et flytende sjikt ved å kombinere de hver for seg kjente forhold som vedrører kromatografisk harpiks og fordeling av en oppløsning (konstruksjonen av fordelings-elementer, utstrømning av næringsmiddeloppløsning). Som eksemplene har vist har anvendelsen av et fluidisert sjikt overras-kende nok ikke redusert ioneutvekslingskapasiteten i den kromatografiske harpiksen, og evnen til selektiv overførsel av materialer blir derfor stort sett den samme som den oppnådd i et fast sjikt. ;Fortrinnsvis velges en kromatograf isk harpiks med midlere granulometri Gm mellom 75 og 300 jim, hvilket på diagrammet på fig. 1 tilsvarer det horisontale parti som befinner seg mellom begrensningskurven C og de to rette linjer. D-| og D2« Det skal bemerkes at det er av interesse at ikke kornstør-relsens spredning er for stor og en siling eller filtrering av disse harpikser utføres derfor fortrinnsvis på forhånd for på denne måte å begrense spredningen til ca. 50% omkring den midlere verdi Gm. ;Videre blir, ifølge et foretrukket utførelseseksempel, den kromatografiske harpiks plassert i en søyle med hovedsakelig vertikal utstrekning og som omfatter mellom to og fem etasjer som suksessivt gjennomstrømmes av oppløsningen, idet tappingen av denne oppløsning utføres med overflømming ved den øverste etasjes øvre parti og hvor hver etasje (med unntak av denne øverste) er begrenset ved to gjénnomhullete fordelingssystemer hvor det ene fordeler oppløsning til den nederste del i sin respektive etasje, mens det andre system fordeler oppløsning mot den etasje som befinner seg rett ovenfor. ;Man har kunnet, konstatere at det for en samlet mengde av kromatograf isk harpiks finner sted en betydelig forbedring av egenskapene for separasjon over en gitt tid ved fraksjonering i fluidisert sjikt over flere etasjer, og separa-sjonsegenskapene nærmer seg de som oppnås i faste sjikt. Dette fenomen kan forklares ved det faktum at det på en måte søkes dannet en konsentrasjonsgradient (som fremmer separasjonen) og ' som naturlig forefinnes i de faste sjikt, men egéntlig ikke i et fluidisert sjikt i en etasje. ;Av denne årsak muliggjør fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen på samme tid oppnåelsen av hovedsakelig de egenskaper man oppnår ved faste sjikt, uten dermed å være belemret med de alvorlige ulemper som disse faste sjikt fremviser: tilstopping og behov for rengjøring samt nedbryting av harpiksene, forårsaket av sammenpressingen og rengjøringen. Faktisk muliggjør det fluidiserte sjikt en fri passasje for urenheter i oppløs-ningen uten noen risiko for tilstopping.%Ingen rengjøring behøves derfor og dette medfører at harpiksenes levetid økes betydelig. ;Dessuten kan den foreslåtte fremgangsmåte utføres kontinuerlig grunnet fraværet av spenninger som ellers kunne skapes ved rengjøringsprosessene: den kromatografiske harpiks kan føres i kontinuerlig sirkulasjon ovenfra og nedover i søylen og med en kontinuerlig tilførsel til harpiksen ovenfra og en likeledes kontinuerlig tapping i den nedre del, idet separasjonen i det fluidiserte sjikt derved kan foregå kontinuerlig i søylen med en samtidig utførelse av vasking, eluering og rensing utenfor selve søylen. ;Det må være klart at man ikke skal forveksle de tradisjonelle vaskeoperasjoner som enten består av en enkel rensing med destillert vann - eller en annen oppløsning-eller en elueringsprosess som omfatter en gjennomstrømning av en gjenvinningsoppløsning, med de prosesser for rengjøring eller fjerning av oppslemmet materiale som i de kjente fremgangsmåter krever en kraftig mekanisk behandling av harpiksene, hvilket nettopp gir årsak til disse harpiksers nedbrytning og problemene med å holde prosessen kontinuerlig igang. ;Sirkulasjonen av kromatografisk harpiks mellom to etasjer som ligger over hverandre kan foregå ved hjelp av et lederør innrettet for å la harpiksen sirkulere ved flømming i dette rør fra en overliggende etasje ned til en underliggende. ;Dessuten anordnes fortrinnsvis én eller flere inn-snevringer i hver etasje for å sikre en fullstendig fornyelse av etasjens harpiks uten å innføre dødsoner. ;Naturligvis kan også fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen om nødvendig foregå diskontinuerlig: den kromatografiske harpiks lukkes da inne i hver etasje i søylen ved at sirkulasjon mellom etasjene hindres, derved utføres separasjonen i det fluidiserte sjikt med sykluser for selektiv fiksering med vasking, eluering og rensing i søylen. Denne fremgangsmåte er også fordelaktig i forhold til separasjonsfremgangsmåten i et fast sjikt av samme grunner som nevnt ovenfor: særlig skal nevnes at det ikke er nødvendig å demontere søylen for fjerning av oppslemmet materiale. ;I disse todriftstyper (kontinuerlig, diskontinuerlig) gis søylen fortrinnsvis tilførsel på en slik måte at oppløs-ningens utløp inne i søylen hovedsakelig holdes konstant, i det minste under fasene for selektiv fiksering, og variasjonen i dette væskeutløp i forhold til den nominelle verdi bør være innenfor 15%. ;En slik fordeling garanterer en stabil fluidisering av den kromatografiske harpiks uten risiko for tilfeldig medførsel av korn. ;Fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse er generelt anvendbar for separasjon av alle typer biologiske makromolekyler og fagmannen skulle være istand til, i hvert enkelt tilfelle, å velge en egnet selektiv kromatografisk harpiks (avhengig av massen og granulometrien som fremgår av diagrammet på fig. 1) og deretter et gjennomhullet distribusjonssystem som tilsvarer granulometrien til den aktuelle harpiks (betingelsene er allerede omtalt når det gjelder diameteren av de åpne seksjoner). ;Særlig kan fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendes ved kromatografisk separasjon av proteinene i et lactoserum, her kan den aktuelle harpiks særlig være en harpiks "résine Sphérosil" markedsført under dette navn av firmaet "Rhone Poulenc" og omtalt i FR PS 2 321 932. Denne harpiks tilsvarer de spesifikasjoner som fremgår av diagrammet på fig. 1. ;I den etterfølgende beskrivelse som ikke er ment å være begrensende, er vist utførelseseksempler for utførelsen av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, på den ene side i en diskontinuerlig installasjon (eksemplene 1 og 2) og på den annen side i en installasjon for kontinuerlig drift (eksempel 3). I de ledsagende illustrasjoner for disse installa-sjoner er fig. 1, allerede omtalt, et diagram som gir spesi-fikasjonene for egnede harpikser, fig. 2 er en skjematisk oversikt over en installasjon beregnet på diskontinuerlig drift for utførelse av fremgangsmåten, fig. 3 er et vertikalt detalj utsnitt av søylen i denne installasjon, fig. 4 er en skjematisk oversikt over installasjonen beregnet på kontinuerlig drift, fig. 5 er et vertikalt detaljutsnitt av søylen i denne installasjon, fig. 6 er et tverrsnitt representert ved snittlinjen A-A' på fig. 5, og figurene 7, 8 og 9 er diagrammer som viser forløpet for konsentrasjonen av oppløsningen ved dennes utgang som funksjon av tiden for hvert av de gitte eksempler 1 til 3. ;Den installasjon som er vist med utførelseseksemplene ifølge fig. 2 og 3 er tiltenkt utførelsen av en kromatografisk separasjon av biologiske makromolekyler ifølge en prosess med syklisk drift hvor det veksles mellom en fikseringsfase, en vaskefase, en elueringsfase og en gjentatt vaskefase. ;I løpet av disse forskjellige faser lukkes den spesifikke kromatografiske harpiks inne i en vertikal søyle 1 med flere etasjer, såsom 3 eller 4. Tre eller fire etasjer kan være aktuelt i praksis. ;Søylen 1 omfatter et bunnparti 2 som muliggjør en distribusjon av oppløsning i retning av den nederste etasje 3 via et gjennomhullet distribusjonssystem. Dette system er det samme for alle etasjene og er vist med henvisningstallet 5 og sees best fra den forstørrede målestokk på fig. 3. Dette distribusjonssystem 5 omfatter to sylindriske gjennomhullete plater 6 og 7 (eller et større antall plater i gitte tilfeller) som er anordnet over hverandre med et mellomrom dannet ved hjelp av klosser 8. ;Platene 6 og 7 er forsynt med perforeringer 6a og 7a og er plassert slik at disse perforeringer ligger forskjøvet på den ene plate i forhold til den andre. ;Fordelingen og størrelsen av disse perforeringer over platene er slik at åpningene utgjør prosentvis mellom 0,1% og 10% av platens areal, og spesielt lik 5% i de eksempler som beskrives senere. Ved denne angitte prosentfordeling menes nærmere bestemt åpningenes areal i et rett tverrsnitt i forhold til platens nytteareal. ;Dessuten er hver plates perforeringer anordnet slik at diameteren er større enn 300 nm. Over denne grense tilpasses så diameteren til den midlere granulometri Gm for den anvendte harpiks: en verdi i størrelsesordenen 4 Gm til 6 Gm later til å gi de beste resultater. Eksempelvis er det for den anvendte harpiks "Sphérosil" i eksempelet benyttet plater med perforeringer som har en diameter på 1 mm. ;Platene 6 og 7 holdes på plass ved hjelp av ringformede flenser 9 med gjennomgående bolter. De sylindriske elementer 3 eller 4 eller bunnen 2 er festet ved omkretsen til de indre ringformede flater av disse flenser 9. Dessuten finnes boringer 10 for å sikre tetthet rundt omkretsen, på den ene side mellom platene og på den annen side mellom flensene og platene. ;Oppløsningen (prøveoppløsningen som benyttes under fikseringsfasen, det destillerte vann som benyttes under vaskeoperasjonene eller gjenvinningsoppløsningen som benyttes under elueringsfasen) trenger inn i bunnen 2 via et rør 11. For å sikre et tilnærmet konstant utløpsvolum, er disse opp-løsninger anordnet i beholdere 12 (prøveoppløsningen eller gj envinningsoppløsningen) og 13 (det destillerte vann) som befinner seg i en passende høyde over søylen 1 for å kunne gi den ønskede gjennomstrømning. En strømningsmåler 14 og et diafragma 15 er innrettet slik at gjennomstrømningen kan finreguleres. ;Prøveoppløsningen lagres i en beholder 16 hvor den omrøres og holdes ved en regulert temperatur. Gjenvinnings-oppløsningen lagres under tilsvarende forhold i en beholder 17. Det destillerte vann lagres i en beholder 18, mens den oppløsning som kommer ut av søylen kan føres til en oppsam-lingsbeholder 19. En pumpe 20 og et system av rør og ventiler muliggjør en væsketilførsel under hver av de aktuelle faser til beholderne 12 eller 13 av de respektive oppløsninger fra beholderne 16-18, slik at nivået i beholderne 12 eller 13 holdes tilnærmet konstant. ;Det system som her er beskrevet sikrer en væsketil-førsel til søylen 1 hvor utstrømningen har variasjoner som i praksis ligger under i 5%. ;Ved utgangen av søylen 1 samles væsken opp ved delvis overflømming i den øverste del av den øverste etasje for så eventuelt å føres tilbake til lagring i oppsamlings-beholderen 19. ;Videre viser fig. 4 skjematisk en installasjon som er noe modifisert i forhold til den som er omtalt i det foregående med hensyn til dens kontinuerlige drift. Ellers er søylen, de perforerte distribusjonssystemer og organene for væsketilførsel med konstant utstrømningsvolum helt tilsvarende. ;Imidlertid er den kromatografiske harpiks i denne installasjon ført til kontinuerlig sirkulasjon fra en etasje til etasjen under og fasene for vaskeprosessen og elueringen utføres utenfor selve søylen, idet denne da utgjør den kontinuerlige kromatografiske fiksering. ;De virkemidler som er benyttet ved denne installasjon er følgende: Som fig. 5 viser er det mellom to overliggende etasjer i søylen anbragt et føringsrør 21 for harpiksgjennom-strømning som går gjennom det perforerte distribusjonssystem. Føringsrøret strekker seg mellom et øvre parti 21a i sjiktet i etasjen ovenfor og et nedre parti 21b i sjiktet i etasjen under. Således kan harpiksen sirkulere ved overflømming i de forskjellige føringsrør 21 fra den ene etasje til etasjen under. ;For å virkeliggjøre en slik overflømming går hvert føringsrør 21 i sin respektive etasje et stykke Hg under høyden Hg for det ikke benyttede parti i den aktuelle etasje. Således vil den fluidiserte harpiks som befinner seg i det indre av hvert føringsrør 21 ikke stige opp av det føringsrør som stikker opp fra etasjen under, og dette medfører at harpiksens sirkulasjon kan foregå fra den ene etasje til etasjen under ved hjelp av tyngdens påvirkning. ;Videre finnes i hver etasje en innsnevring 22 mellom de to åpninger av føringsrørené 21 som munner ut i denne etasje (den nedre åpning 21'b av føringsrøret som kommer fra den overliggende etasje og den øvre åpning 21a av det rør som har forbindelse med etasjen under). Hver innsnevring 22 kan bestå av en rørformet hylse som omslutter føringsrøret 21 , idet denne hylse strekker seg oventil ovenfor høyden for åpningen 21a og ved sin nedre ende danner en passasje 22a for harpiksen. ;Harpiksen som befinner seg i etasjen ovenfor og munner ut ved åpningen 21'b er lavere ladet og således generelt lettere og har derfor en tendens til å stige innenfor sjiktet, innsnevringen 22 forhindrer imidlertid at det dannes en slags kortslutning av harpiks mellom åpningene 21 'b og 21a ved at den hindrer dannelsen av dødsoner i sjiktet hvor harpiksen ellers ikke ville fornyes, og det sikres derved en fullstendig fornyelse av denne. (Det skal bemerkes at det for visse harpikser og visse makromolekyler som skal fikseres ikke foregår noen spesiell masseendring for harpiksen under ioneutvekslingen, og i slike tilfeller har tilstedeværelsen av innsnevringen mindre betydning, men bedrer likevel den totale ensartethet for fikseringen.) ;Nederst i søylen er et nedre føringsrør 23 ført gjennom søylens bunn for tilførsel av oppløsning, og dette føringsrør er tilkoblet hydrauliske organer som fører med seg harpiksen 24, i eksempelet vist til en uttaksboks 25. Harpiksen fra denne uttaksboks gjenvinnes i en utvendig søyle som kan arbeide på samme måte med fluidiserte sjikt, og føringen til denne andre søyle kan foregå kontinuerlig. ;Den regenererte kromatografiske harpiks føres til en lagringstank 26 enten kontinuerlig fra den andre søylen for regenerasjon eller ved manuell tilførsel. Denne lagringstank er hermetisk lukket og fylt av destillert vann og kan tilføres nytt destillert vann via et rør 27 som omfatter en ventil og en væskestrømsmåler. ;Harpiksen kan transporteres på hydraulisk måte gjennom et rør 28 til et transportbelte 29 forbundet med en vakuumpumpe for uttrekk av det vann som omslutter harpiks-kornene. ;Transportbeltet 29 avgir den regenererte harpiks ved en innstillbar innretning til et øvre transportrør som øverst er forsynt med en trakt. ;Eksemplene 1 og 2 er medtatt for å vise en installasjon av den type som er vist på fig. 2 og eksempel 3 vedrører en installasjon av den type som er vist på fig. 4 og 5. ;Eksempel 1 ;Installasjonssøylen omfatter her tre etasjer hvis høyde er ca. 50 cm og hvor søylens diameter er ca. 5 cm. ;Eksempelet tar sikte på uttrekk av albuminer av typen B-lactoglobuliner (molekylvekt i sin dimeriske form: 34.000) og a-lactalbumin (14.000) fra et mykt lactoserum som er en rest ved fremstillingen av ost ved fabrikken "Fromageries Bel". ;Den anvendte kromatografiske harpiks er harpiksen "Sphérosil QMA" fremstilt av "Rhone Poulenc". Den opprinnelige granulometriske fordeling er mellom 100 og 300 nm. Først foretas en tørrsammenpressing for å holde tilbake de kornfore-komster som ligger mellom 200 og 250 nm, dvs. som har en midlere granulometri av Gm på 225 pm. Egenvekten for harpiksen "Sphérosil QMA" er Mv = 1.400 kg/m<3>. Parameterparet (Gm, Mv) som kjennetegner denne harpiks representeres ved punktet R på diagrammet på fig. 1 . ;Harpiksen er en kromatografisk harpiks som består av sfæriske korn av silicium og med en spesifikk overflate på 25 m^/g, en midlere porediameter på 1250 Å og et porevolum på ;1 cm<3>/g. Disse korn er omsluttet av en retikulert polymer av triethoxysilan-vinylstyren med følgende prinsipielle gruppering: ;Fluidiseringens minimalhastighet ved en slik harpiks er vmf =1,4* 10~<4>m/s.

Den midlere diameter av de åpne sektorer i distribusjonssystemet for hver etasje i søylen tilsvarer ved disse betingelser ca.: 4 Gm.

Mengden harpiks i hver etasje er ca. 130 cm<3>.

Søylen tilføres nederst lactoserumet med en tilfør-selshastighet av oppløsningen på 9 l/h og med en variasjon som er lavere enn 5% i forhold til den nominelle verdi grunnet de innretninger for væsketilførsel som forefinnes (tilførsels-beholdere i bestemt høyde).

Denne utstrømning som foregår i en søyle med tverrsnitt 1,96 • 10~<3> m^ tilsvarer en væskehastighet på 1,3 • 10~<3> m/s, eller 9 Vmf.

Når denne utstrømning er etablert vil man konstatere at sjiktet i hver etasje undergår en utvidelse på 64% og fremviser en høyde på 20 cm. Man kan visuelt forsikre seg om at det er etablert en god og stabil fluidisering.

Ved tilførselen fremviser lactoserumet følgende konsentrasjoner: 3,0 g/l av S-lactoglobulin og 1,2 g/l av a-lactalbumin.

Denne prosess tar ca. to timer. Fig. 7 viser et sett kurver for sammenhengen som funksjon av tid mellom konsentrasjonen C ut fra hver etasje i forhold til begynnelses-konsentrasj onen Cø, kurvene a-| , ct2 og 03 gir da konsentrasjons-forholdet C/Cø for a-lactalbumin henholdsvis ved utgangen av den nedre, den mellomste og den øvre etasje. Kurvene B-| , B2 og B3 viser variasjonen i C/Cq for B-lactoglobulin henholdsvis ved utgangen av den nedre, den mellomste og den øvre etasje. Målingene er utført ved prøver tatt hvert tredje minutt ved hjelp av soneelektroforese på en membran av celluloseacetat.

Man finner at i løpet av 30 minutter fikseres fullstendig B-lactoglobulinet og a-lactalbuminet til harpiksen (det første flate parti på kurvene 03 og 63) og videre at kun S-lactoglobulinet fortsetter med å være adsorbert under ca. 15 minutters tid, mens a-lactalbuminet da finnes i utløpsstrøm-men fra søylen.

Når fikseringsprosessen er avsluttet (C/Cq = 1) tilsier fremgangsmåten at det fortsettes med en vaskeprosess i destillert vann under ca. 20 minutters tid.

Harpiksen elueres derved ved hjelp av en saltsyre-oppløsning på 0,1N i løpet av to timer.

Videre fortsettes med en ny vaskeprosess med destillert vann med én times varighet, og deretter er søylen klar for en ny syklus.

Under alle disse prosesser (vasking, eluering) fluidiseres søylens harpiks på lignende måte.

Proteinmengden ved slutten av elueringsfasen er for B-lactogiobulinet ca. 10,5 g, hvilket tilsvarer en fiksering på 102 mg pr. g tørr harpiks og for a-lactalbuminet ca. 1,7 g, tilsvarende 16,5 mg pr. g tørr harpiks. Eluatet (dvs. det stoff som er uttrukkét ved elueringen eller utvaskingen) omfatter således 86,1% 8-lactoglobulin og 13,9% a-lactalbumin. Imidlertid er de relative mengder av disse proteiner i det endelige produkt (lactoserumet) 71% 6-lactoglobulin og 29% a-lactalbumin. Det har således foregått en anrikning av S-lactoglobulinet.

Elueringsproduktet inneholder proteiner som har avgitt lactose, caseinderivater og mineralsalter som til å begynne med fantes i lactoserumet, og derved kan proteinene betraktes som rene og i naturlig tilstand (ikke denaturert).

Fikseringskapasiteten for harpiksen "Sphérosil QMA" i fluidiserte sjikt i tre etasjer er hovedsakelig identisk med den kapasitet som oppnås ved hjelp av et fast sjikt ifølge tidligere arbeider, hvilket fremgår av følgende publikasjoner:

SKODDER P.J.

"Recovery and Fractionation of Proteins from Cheese when using a Porous Silica - Based Ion Exchange Medium" Chemistry

and Industry, 21, 810-814 (1983),

BOURGEOIS CM. et LEROUX P.

"Protéines Animales (extraits concentrés et isolats en alimentation humaine), kap. 3, Collection Sciences Tech-niques agro-alimentaires, Lavoisier (DR).

De forsøk som er beskrevet i disse publikasjoner er blitt fornyet et titall ganger uten at man har kunnet konstatere noen som helst tendens til tilstopping, hverken ved sjiktenes høyde eller ved distribusjonssystemenes. Det skal bemerkes at det anvendte lactoserum var i rå form og inneholdt faste urenheter i suspensjon. Dessuten har heller ingen reduksjon i virkningsgrad for harpiksen kunnet observeres, og man har heller ikke merket noen degradering av denne.

Eksempel 2

Dette eksempel tilsvarer de betingelser som er omtalt i eksempel 1 , med unntak av at mengden utplassert harpiks i hver etasje nå er 110 cm<3>. Når utstrømningen nå er bragt tilveie, finner man at sjiktet i hver etasje undergår en utvidelse på 69% og derved fremviser en høyde på 18 cm. Man kan visuelt konstatere at det er etablert en god og stabil fluidiseringsprosess.

Lactoserumet har til å begynne med de samme konsentrasjoner som i eksempel 1 (3,0 g/l av B-lactoglobulin og 1,2 g/l av ct-lactalbumin).

Også denne prosess tar ca. to timer. Fig. 8 viser tilsvarende kurver som på fig. 7, forholdet mellom konsentrasjonen C ved utløpet for hver etasje og begynnelseskonsentrasjonen Cq som funksjon av tiden.

Man legger merke til at mengden harpiks i hver etasje er mindre viktig enn i eksempel 1 , og adsorberingsvarig-heten hvor på den ene side totalt begge proteintyper og på den annen side B-lactoglobulinet alene blir adsorbert er betydelig kortere enn i eksempel 1 (en varighet på hver ca.

15 minutter).

Forløpet med etterfølgende vaskeprosess, eluering og gjentatt vaskeprosess foregår på samme måte som i eksempel 1 .

Proteinmengden som oppnås ved denne eluering tilsvarer en fiksering av 110 mg pr. g tørr harpiks for B-lactoglobulinet og 19,5 mg pr. g tørr harpiks for a-lactalbuminet. Eluatet inneholder altså 84,9% B-lactoglobulin og 15,1% a-lactalbumin. Når det ses bort fra feil som kan ha oppstått under disse eksperimenter og under analysen, er disse forhold analoge til de man har observert i eksempel 1.

Eksempel 3

Dette eksempel er tatt fra en installasjon som er beskrevet ovenfor og er representert ved fig. 4 og 5, idet søylen nå omfatter tre etasjer hver på 60,5 cm høyde.

Eksempelet tar sikte på å trekke ut albuminer av typen B-lactoglobulin og a-lactalbumin fra et mykt lactoserum som er et restprodukt fra osteproduksjonen ved fabrikken "Fromageries Bel".

Den anvendte harpiks ("Sphérosil QMA") har de samme kjennetegnende egenskaper som i eksempel 1.

Den midlere diameter av de åpne seksjoner i distribusjonssystemet for hver etasje i søylen er 4 Gm.

Forbindelsesrørene som tjener til å føre frem harpiksen ovenfra og nedover i søylen har en innerdiameter på 1,4 cm og stikker et stykke Hg = 25 cm utenfor hver etasje.

Fremføringen av harpiks til søylen holdes på 0,14 l/h.

Uttrekkssystemet for harpiks nederst i søylen omfatter tre elektromagnetisk styrte ventiler i forbindelse med et tidsrelé. De faste partikler passerer den øvre åpne ventil og samles opp i et mykt plastrør. Hvert 20. sekund lukkes den øvre ventil samtidig med at den ventil som ligger på siden åpnes og dens nederste ventil tilføres destillert vann som fører med seg partiklene nedover.

Søylen tilføres lactoserumet ved bunnen med en strømningshastighet på 9 l/h, og denne strømningshastighet styres på samme måte som i eksempel 1.

Når denne hastighet er etablert vil man se at sjiktet i hver etasje fremviser en høyde på 25 cm, og denne høyde tilsvarer høyden Hg som forbindelsesrøret rager ut over hver enkelt etasje.

Hver etasje har selv en høyde på 60,5 cm, slik at høyden for det fluidiserte sjikt som holdes igjen i forbin-delsesrøret for denne etasje, fremviser et nivå som er lavere enn det for det fluidiserte sjikt for den etasje som ligger umiddelbart ovenfor, og derved hindres altså overflømming av harpiks til den overliggende etasje.

Visuelt kan man konstatere at det er etablert en god og stabil fluidisering og en korrekt sirkulasjon mellom de to faser, henholdsvis den faste og den væskeformede.

Til å begynne med har lactoserumet følgende konsentrasjoner: 3,0 g/l e-lactoglobulin og 1,2 g/l ct-lactalbumin.

Prosessen foregår kontinuerlig, men for det aktuelle eksempel anvendes en prosesstid på tre timer. Fig. 9 viser et sett kurver som funksjon av tiden for forholdet mellom hver etasjes utgangskonsentrasjon C og begynnelseskonsentrasjonen C0.

Man legger merke til at prosessen omfatter en over-gangsfase før den når den stasjonære tilstand.

Videre fremgår det at a-lactalbuminet (a-j, 02, 03) holdes tilbake i mindre kvanta i harpiksen enn B-lactoglobulinet (Bi, B2, <8>3).

Ved utgangen av søylen (tredje etasje) inneholder væsken til å begynne med omtrent 50% a-lactalbumin, slik at den ikke inneholder mer enn 25% B-lactoglobulin og resten er følgelig bundet til harpiksen.

Claims (11)

1. Fremgangsmåte for kromatografisk separasjon av biologiske makromolekyler med molekylvekt over 5000 i en oppløs-ning, ved å føre oppløsningen til kontakt med et sjikt av kromatografisk selektiv harpiks, spesifikk for de makromolekyler som skal separeres og således bevirke en selektiv adsorpsjon, karakterisert ved anvendelse av en kromatografisk harpiks med midlere granulometri Gm og tetthet Mv og hvis verdier ligger i et område Z som i et diagram over G = f(M ) ligger utenfor en kurve som har asymptotelinjer ved m v z. Mv = 1050 kg/m og Gm = 30 jxm. (fig. 1), som plasseres i en søyle som omfatter i det minste én etasje, og som ved bunnen har en gjennomhullet fordelingsanordning som fremviser følg-ende egenskaper: de åpne seksjoner utgjør tilnærmet mellom 0,1% og 10%, den midlere diameter av de åpne seksjoner er over ca. 300 ^um, den midlere diameter av de åpne seksjoner ligger mellom 2 G m og J 20 G m, det tilføres en oppløsning til hver etasje i søylen via søylens distribusjonssystem, og det kromatografiske harpikssjikt gjøres flytende ved å innstille den utgående strøm av oppløsning slik at det oppnås en lineær midlere væskestrømningshastighet i søylens rette seksjon på mellom 1,5 V c og 12 V ,, hvor V c er den minimale hastighet ' mf ^ mf mf ^ for harpiksens fluidisering.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den kromatografiske harpiks som anvendes plasseres i en søyle med hovedsakelig vertikal utstrekning og som omfatter mellom to og fem etasjer som suksessivt gjennomstrømmes av oppløsningen, idet tappingen av denne oppløsning utføres med overflømming ved den øverste etasjes øvre parti og hvor hver etasje (med unntak av denne øverste) er begrenset ved to gjennomhullete fordelingssystemer hvor det ene fordeler oppløsning til den nederste del i sin respektive etasje, mens det andre system fordeler oppløsning mot den etasje som befinner seg rett ovenfor.

3. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 eller 2, karakterisert ved at søylen tilføres væske slik at utstrømningen av oppløsning i søylen holdes tilnærmet konstant i det minste under syklusene for selektiv fiksering, idet variasjonen i denne utstrømning i forhold til den nominelle verdi er mindre enn ± 5%.

4. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1, 2 eller 3, karakterisert ved at hvert gjennomhullet distribusjonssystem som anvendes er utført med i det minste to perforerte plater som ligger overfor hverandre med en gitt avstand og hvor platenes perforeringer er fordelt slik at de ligger forskjøvet på den ene plate i forhold til den andre plate eller de nærliggende plater.

5. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1, 2 eller 4, karakterisert ved at den kromatografiske harpiks som anvendes,hvis midlere granulometri og tetthet ligger innenfor området Z, innesluttes i hver av søylens etasjer og uten sirkulasjon fra den ene etasje til den neste, og at separasjonen i fluidiserte sjikt utføres i sykluser for selektiv fiksering, vasking, eluering og gjentatt vasking i søylen.

6. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1, 2, 3 eller 4, karakterisert ved at den kromatografiske harpiks som anvendes,hvis midlere granulometri og tetthet ligger innenfor området Z, kan føres i kontinuerlig sirkulasjon ovenfra og nedover i søylen og med en kontinuerlig tilførsel til harpiksen ovenfra og en likeledes kontinuerlig tapping i den nedre del, idet separasjonen i det fluidiserte sjikt derved kan foregå kontinuerlig i søylen med en samtidig utførelse av vasking, eluering og rensing utenfor selve søylen.

7. Fremgangsmåte ifølge kombinasjonen av krav 2 og 6, karakterisert ved at det mellom to overliggende etasjer i søylen er anordnet et føringsrør for harpiks og som er ført gjennom distribusjonssystemet og strekker seg mellom det øvre parti av etasjen under og det nedre parti av den overliggende etasje, idet harpiksen sirkulerer ved overfløm-ming i føringsrøret fra den nedre etasje mot den overliggende etasje.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at det i hver etasje og i harpikssjiktet i det minste er anordnet én innsnevring mellom enden av det førings-rør som leder til etasjen under og enden av det føringsrør som leder til etasjen over, slik at det sikres en fullstendig fornyelse av etasjens harpiks.

9. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 7 eller 8, karakterisert ved at føringsrørene er anordnet slik i søylen at det fluidiserte harpikssjikt som dannes i ett rør i én etasje ikke flømmer over fra røret til etasjen over.

10. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 9, karakterisert ved at det separeres et lactoserums proteiner, med molekylvekt i størrelsesorden 20000.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved uttrekking av albuminer av typen /Q-lactoglobuliner med dimerisk molekylvekt ca. 3400 og £|f-lactalbuminer med molekylvekt ca. 14000 i et lactoserum, idet det benyttes en kromatografisk harpiks med tetthet ca. 1400 kg/m 3 og midlere granulometri Gm ca. 225 ^im, og at denne harpiks på forhånd er sammenpresset slik at fordelingen av kornstørrelser om den midlere verdi for granulometrien høyst er lik 50%.