NO161886B

NO161886B - Proeveinnretning for vurdering av en flytende proeve for naervaer av en analytt, og fremgangsmaate for dens fremstilling.

Info

Publication number: NO161886B
Application number: NO823518A
Authority: NO
Inventors: Ronald G Sommer
Original assignee: Miles Inc
Priority date: 1981-11-06
Filing date: 1982-10-22
Publication date: 1989-06-26
Also published as: US4562148A; ATE21174T1; DK494582A; JPH0627732B2; IE822645L; CA1179261A; EP0078965B1; FI823786L; IE54067B1; FI823786A0; FI78360B; AU551143B2; EP0078965A1; IL66289A0; DE3272353D1; AU8624282A; GR77058B; FI78360C; NO823518L; JPS5887461A

Description

Foreliggende oppfinnelse gjelder forbedringer på området testanordninger eller -elementer for vurdering av en væskeprøve, som f.eks. en biologisk væske, og mer spesielt angår oppfinnelsen en prøveinnretning for vurdering av en flytende prøve for nærvær av en analytt, samt fremgangs-

måte for fremstilling av en slik innretning. Nevnte innretning inneholder prøvereagenser omfattende dem som er beregnet for homogene spesifikke bindingsanalyser.

Testremser og lignende faste analytiske elementer har blitt vanlige ved analyse av forskjellige typer av væskeprøver, spesielt biologiske væsker. De har eksempelvis vært fordel-aktige ved diagnoser av sykdommer. De har vært kjent og brukt i mange år på forskjellige områder, spesielt som anordninger for in vitro-diagnose for bestemmelse av forskjellige urin- og blodkomponenter som f.eks. glukose, protein, skjult blod o.l. Se eksempelvis US patenter 3.012.976, 3.164.534 og 3.485.587.

Det er fremstilt testanordninger som kan anvendes for å utføre spesifikke bindingsforsøk. Spesifikke bindingsforsøk er anvendbare for å bestemme forskjellige organiske substanser av diagnostikk, medisinsk, miljømessig og industriell betyd-ning som opptrer i væskemedier i meget lave konsentrasjoner. De er basert på den spesifikke reaksjon mellom den bindbare analytt som skal bestemmes, også referert til som en ligand, og en bindingspartner for denne. Når den ene analytten og dens bindingspartner er et hapten eller antigen, og den andre er et tilsvarende antilegeme, er forsøket kjent som et immunoforsøk, kfr. eksempelvis US patenter 4.447.526; 4.668.619; og 4.442.204, som hver beskriver en slik spesifikk bindingsforsøksanordning.

Disse testremser og lignende anordninger er et kompromiss

når det gjelder påliteligheten til de resultatene de gir, når påføring av en prøve har forårsaket migrering av reagenser vekk fra prøveappliseringspunktet på anordningen.

Dette forårsaker en ujevnhet av reagenskonsentrasjoner gjennom hele anordningen og resulterende ujevnhet i bestembart signal- eller responsnivå. P.g.a. dette kan en enkelt anordning som har vært i kontakt med en enkelt prøve, oppvise en uendelig variasjon av signalnivåer av-hengig av hvilken del av anordningsoverflaten som brukes for avlesning.

Den metode som hittil har vært brukt i forsøk på å unngå hva som er referert til som en "ringings"-effekt, har vært bruken av spredningssjikt. Se eksempelvis US patenter 3.992.158 og 4.292.272. De hevder at fordi spredning opptrer i spredningssjiktet, og den spredte prøve overføres til det reagensholdige sjiktet uten tverrhydrostatisk trykk, unn-gås "ringings"-fenomenet. Disse sjikt medfører vanskeligheter og utgifter ved fremstilling av testanordningene.

Foreliggende oppfinnelse angår og løser problemet med reagensmigrering og unngår også behovet for spredningssjikt. En jevn konsentrasjon av reagens i hele anordningen bibeholdes selv etter påføring av væskeprøven. Pålitelige jevne og nøyaktige signalnivåer kan oppnås uten hensyn til hvilken del av anordningens overflate som avleses og med anordninger som er vesentlig enklere enn de som krever spredningssjikt.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en prøveinnretning for vurdering av en flytende prøve for nærvær av en analytt, kjennetegnet ved et enkelt analyttpåvisningslag inkorporert med et analyttpåvisningssystem, buffer for tilveiebringelse av en pH ved minst 5, og et ikke-ioniserbart reagensmigreringshindrende stoff, valgt blant kopolymerer av maleinsyre og sulfonsyrepolymerer.

Videre er det ifølge oppfinnelsen tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av et analytisk element for bestemmelse av nærværet av en analytt i en væskeprøve, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved følgende trekk: inkorporering av et enkelt analyttpåvisningslag ved en vandig oppløsning av minst et reagens av et analyttpåvisende system, og en buffer tilveiebringende en pH på minst 5, tørking av det enkle analyttpåvisningslag og inkorporering av det tørkede, enkle analyttpåvisningslag med en oppløsning omfattende et oppløsnings-middel, et reagens eller reagenser forskjellig fra det forannevnte reagens inneholdt i analyttpåvisningssystemet og et ikke-ionisert ioniserbart reagensmigreringshindrende stoff, valgt fra gruppen bestående av kopolymerer av maleinsyre eller sulfonsyrepolymerer i det nevnte oppløsningsmiddel er et hvori stoffet er uoppløselig i sin ioniserte form, men oppløselig i dets ikke-ioniserte form. M.a.o. omfatter fremgangsmåten (a) å blande en bærer med et preparat i en væske, idet preparatet omfatter minst en reagens i et analyttbestemmende system, under betingelser som er effektive for å ionisere en substans som hindrer reagensmigrering, hvilken substans er uløselig i nevnte væske når den er i ikke-ionisert form og oppløselig i nevnte væske når den er ionisert, og tørke bæreren, og så (b) blande bæreren fra (a) med et annet preparat i en væske som er forskjellig fra den i (a), idet preparatet omfatter de gjenværende reagenser i det analyttbestemmende systemet, som kan reagere med minst et reagens i (a) og en substans som kan hindre reagensmigrering, som er løselig i nevnte væske når den er i sin ikke-ioniserte form, hvilken væske er effektiv for å hindre reaksjon mellom det andre preparatet med minst det ene reagenset i (a) før kontakt mellom elementet og prøven og for å hindre den migreringsinhiberende substansen fra å ionisere før kontakt med prøven, og tørke bæreren.

Fortrinnsvis er substansen som hindrer reagensmigrering, en monoester-maleinsyrepolymer som f.eks. hindrer en kopolymer av metylvinyleter og maleinsyremonometylesteren. Væsken i

(b) er fortrinnsvis en organisk væske, som f.eks. aceton.

De fordeler som oppnås ved hjelp av oppfinnelsen, er spesielt verdifulle i spesifikke bindingsforsøk, f.eks. immunoforsøks-elementer. Når en vandig prøve i dette foretrukne utførelses-formen tilsettes til en spesifikk bindingsforsøksremse fremstilt ifølge oppfinnelsen, oppfanges konjugatet, beskrevet i detalj nedenfor, straks i den vannløselige, ikke-ioniserte syreformen av den reagensmigreringshindrende substansen og hindres fra migrering mens prøven sprer seg. Så snart bufferen i trinn (a) har hatt tid til å utøve sin ioniserende effekt, omdannes imidlertid den reagensmigreringshindrende substansen til dens ioniske, løselige form, og konjugatet frigjøres for å delta i den analytt-responsive reaksjonen.

Testanordningen eller prøveinnretningen har alle hensikts-messig trekk hos konvensjonelle testremser og andre analytiske elementer av lignende design. Det medium som skal undersøkes, kan være en naturlig opptredende eller kunstig dannet væske, som mistenkes å inneholde analytten, og er vanligvis en biologisk væske eller en fortynning derav. Biologiske væsker som kan undersøkes, omfatter serum, plasma, urin, salin og fostervann og cerebrospinalvæske.

Forsøkselementet ifølge oppfinnelsen kan omfatte reagens-blandinger, som her kalles analyttdetekterende systemer som de som er kjent for å bestemme blod-, plasma-, serum- og urinbestanddeler (analytter). Disse omfatter ofte et enzym eller substrat som er spesifikt for analytten og i tillegg nødvendige reagenser, omfattende redoks-indikatorer og fluor, som undergår en merkbar forandring. De kan også omfatte systemer for oppdagelse av en analytt (ligand)

for hvilken det er en spesifikk bindingspartner og, omvendt systemer for oppdagelse av kapasiteten til et væskemedium for å binde analytten eller liganden (vanligvis på grunn av nærvær av en bindingspartner for den i mediet). Bedøm-melsen av en væskeprøve når det gjelder en spesiell analytt menes å omfatte alle disse forsøkssystemer. Analytten er vanligvis et peptid, polypeptid, protein, karbohydrat, glykoprotein, steroid eller andre organiske molekyler for hvilke det foreligger en spesifikk bindingspartner i biologiske systemer eller kan syntetiseres. Terapeutisk medisinprøving er en verdifull anvendelse av disse spesifikke bindingsforsøkselementer.

Den bærer som brukes for analytiske elementer ifølge oppfinnelsen kan ha mange former og er ment å ha bred omfatning. Den kan omfatte et eller flere passende materialer eller medier med like eller forskjellige absorptive eller andre fysikalske egenskaper. Se eksempelvis US patenter nr. 3.552.928, 4.046.514 og 4.845.247. Bæreren omfatter fortrinnsvis et porøst materiale, som f.eks. filtrerpapir,

som en løsning eller suspensjon av reagensene i det analytt-oppdagende systemet impregneres i. Alle disse bærertypene kan anvendes i foreliggende oppfinnelse, så vel som andre bærere. Uavhengig av hvilket materiale som velges som bærer, og hva slags sammensetning eller utforming den har, vil valget av den dikteres av reagenssystemet og den ventede bruken av anordnignen.

Anordninger som har disse forsøkssystemer tilveiebringer en oppdagbar respons, primært elektromagnetiske strålings-signaler som f.eks. fluorescens, fosforescens, kjemilumi-nescens og en forandring i lysabsorpsjonen eller reflektans i eller utenfor det synlige sprektrum i forhold til nærværet eller mengden av analytten (liganden) som undersøkes i væskeprøven. Den oppdagbare respons kan observeres direkte av sansene eller ved bruk av hjelpbestemmelsesmidler, som f.eks. et sprektrofotometer, ultrafiolett lysfølsomt utstyr, fluorometer eller andre føleanordninger.

I løpet av utstrakte undersøkelser for å overvinne de vanskeligheter som forårsakes av reagensmigrering ble mange forbindelser vurdert. Disse forbindelser omfatter Kluce^ LF og Klucel^ G hydroksy-propyl-cellulose (Hercules, Inc., Wilmmgton, DE) , Gafquat 734 kopolymer av kvaternisert dimetylaminoetylmetakrylat og vinylpyrrolidon (GAF Corp., New York, NY), Gantrez AN-139 kopolymer av metylvinyleter og maleinsyreanhydrid (GAF Corp., se ovenfor), cellulose-acetat (Eastman Chemical Products, Inc., Kingsport, TN) og Natrosol MR og Natrosol LR hydroksyetylcellulose (Hercules, Inc., se ovenfor). Ingen viste evne til å løse problemet.

Som for konvensjonelle anordninger tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fast bærer av en annen type som er tilsatt alle de reagenser som er nødvendig for å utføre et gitt forsøk, hvorved brukeren bare har den oppgave å bringe testanordningen i kontakt med den prøve som skal testes og måle den resulterende respons. Til forskjell fra slike konvensjonelle anordninger har anordningene ifølge foreliggende oppfinnelse den fordel at den har reagens-migreringsinhibering som beskrevet og demonstrert i detalj i den følgende beskrivelse og i eksemplene.

I en foretrukket utførelsesform er den reagensmigreringshindrende substans en kopolymer av (1) metylvinyleter og monometylesteren av maleinsyre, (2) metylvinyleter og monoetylesteren av maleinsyre, (3) metylvinyleter og en mo.no-propylester av maleinsyre, (4) metylvinyleter og en monobutylester av maleinsyre, (5) vinylacetat og monometylesteren av maleinsyre, (6) vinylacetat og monoetylesteren av maleinsyre, (7) etylen og monometylesteren av maleinsyren, (8) etylen og monoetylesteren av maleinsyre, (9) oktadecylvinyleter og monometylesteren av maleinsyre og (10) oktadecylvinyleter og monoetylesteren av maleinsyre.

De betingelser som er effektive for å ionisere karboksylsyre-polymeren, oppnås ved å bruke i trinn (a) en vandig væske, hvis pH er ca. 5. Dette oppnås ved bruk av en passende buffer omfattende natriumbicin [bicin er N,N-bis-(2-hydroksy-etyl)glycin], glycylglycin, AMP-buffer [2-amino-2-metyl-l-propanol], TAPS [N-tris-(hydroksymetyl)-metyl-3-aminopropan-sulfonsyre] og TRIS [tris-(hydroksyemtyl)aminometan].

I en annen utførelsesform er dens reagensmigreringshindrende substans en sulfonsyrepolymer. Slike sulfonsyrepolymerer kan eksempelvis være polystyrensulfonat, kopolymeren av 2-akrylamido-2-metylpropansulfonsyre og styren og polyvinylsulfonsyre.

Betingelser som er effektive for å ionisere polysulfonsyrene oppnås eksempelvis ved bruk av i trinn (a) en vandig væske hvis pH holdes i et område som er forbundet med pKa til den spesielle polysulfonsyren som brukes slik at sulfon-syregruppene ioniseres.

Slik det er meningen i foreliggende oppfinnelse, krever ikke løseligheten til den migreringshindrende substans at det opptrer fullstendig solubilisering. Solubilisering av til og med en liten prosentdel, som f.eks. 10%, av den migreringshindrende substans som foreligger, kan være tilstrekkelig til å oppnå det ønskede resultat. Den grad av solubilisering som tillater reaksjon mellom bestanddelene idet analytt-oppdagende systemet, er alt som kreves.

Uløseligheten til den ikke-ioniserende form av den migreringshindrende substansen i væsken i (a) må være slik at løse-lighetsgraden og -hastigheten minskes meget sammenlignet med den ioniserte form.

Slik det er meningen i foreliggende oppfinnelse, krever ikke ionisering av den migreringshindrende substans at hver eller flesteparten av de ioniserbare funksjonalitetene til den migreringshindrende substansen ioniseres. Med passende sammensetning av bestanddelene i anordningen kan praktisk en ionisering av til og med en liten prosentdel, som f.eks. 10%, av de ioniserbare funksjonalitetene i den migreringshindrende substansem være tilstrekkelig til å oppnå den ønskede jevnhet av reagenskonsentrasjonen og signalnivået gjennom anordningen.

Reagensen i (a) kan eksempelvis omfatte (i) en spesifikk bindingspartner for analytten eller (ii) spesifikk bindingspartner for analytten og en bestanddel som er reaktiv med et merkekonjugat, omfattende en merkebestanddel koblet til en analyttdel eller en spesifikk bindingsanalog derav, for å spalte merkebestanddelen.

En utførelsesform av dette er en metode for fremstilling av en homogen spesifikk bindingsforsøksanordning for bestemmelse av en analytt i en væskeprøve, hvilken metode omfatter (a) å impregnere en bærer med en blanding i en vandig væske, idet blandingen omfatter P-galaktosidase, og antilegeme til analytten, under betingelser som er effektive for å ionisere karboksylsyregrupper i en monoestermaleinsyrepolymer, og tørke bæreren, og så (b) impregnere bæreren i (a) med en blanding i en organisk væske, idet blandingen omfatter B-galaktosyl-umbelliferon-analytt eller analyttanalogt konjugat og en monoestermaleinsyrepolymer, og tørke bæreren.

Et spesielt eksempel er en fremgangsmåte for fremstilling

av et homogent, spesifikt bindeforsøkselement for bestemmelse av gentamicin i en væskeprøve hvilken fremgangsmåte omfatter (a) å impregnere en bærer med en blanding i en vandig væske, idet blandingen omfatter B-galaktosidase og antilegeme til gentamicin, under betingelser som er effektive for å ionisere karboksylsyregruppen i monoestermalein-syrepolymeren og tørke bæreren, og så (b) impregnere bæreren i (a) med en blanding i en acetonholdig væske, idet blandingen omfatter B-galaktosyl-umbelliferon-sisomicin-konjugat og en monoestermaleinsyrepolymer, og tørke bæreren.

En annen utførelsesform er en fremgangsmåte for fremstilling av et homogent, spesifikt bindeforsøkselement for å bestemme en analytt i en væskeprøve, hvilken fremgangsmåte omfatter (a) å impregnere bæreren med en blanding i en vandig væske, idet blandingen omfatter glukose, peroksydase, glukoseoksy-dase-apoenzym og antilegeme til analytten, under betingelser som er effektive for å ionisere karboksylsyregruppen i en monoestermaleinsyrepolymer, og tørke bæreren, og så (b) impregnere bæreren med en blanding i en aceton-holdig væske, idet blandingen omfatter flavin-adenin-dinukleotid-analytt eller som analyttanalogt konjugat et tetraalkyl-benzidin som f.eks. 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin og en mono-

estermaleinsyrepolymer, og tørke bæreren.

En annen utførelsesform er en fremgangsmåte som, før (a)

og (b), omfatter det ytterligere trinn å blande bæreren med et indikatorreagens i en væske som er effektiv for å hindre reaksjon mellom indikatorreagensen og reagensen i (a) før kontakt mellom elementet og prøven og tørke bæreren. Dette indikatorreagens omfatter fortrinnsvis et tetraalkyl-benzidin som f.eks. 3,3 ' ,5,5'-tetrametylbenzidin.

Et spesielt eksempel på denne utførelsesform er en fremgangsmåte for fremstilling av et homogent, spesifikt binde-forsøkselement for å bestemme teofyllin i en væskeprøve, hvilken fremgangsmåte omfatter (1) å impregnere en bærer med en blanding i en aceton-holdig væske, idet blandingen omfatter 3,3<1>,5,5<1->tetrametylbenzidin, og tørke bæreren,

så (2) impregnere bæreren med en blanding i en vandig væske, idet blandingen omfatter glukose, peroksydase, glukoseoksy-dase-apoenzym og antilegeme til teofyllin, under betingelser som er effektive for å ionisere karboksylsyregruppen i en monoestermaleinsyrepolymer, og tørke bæreren, og så (3) impregnere bæreren med en blanding i en aceton-holdig væske, idet blandingen omfatter flavin-adenin-dinukleotid-teofyllin-konjugat og en monoestermaleinsyrepolymer, og tørke bæreren.

Etter å ha gjort forsøk med en rekke konsentrasjoner av migreringsinhiberende substanser, er det fastslått at området for konsentrasjonene ikke er kritisk bortsett fra at en tilstrekkelig minimumsmengde innblandes slik at den ønskede effekt oppnås. Dette minimum må finnes å være forenelig med det spesifikke, analytt-oppdagende system som anvendes.

Anordningen kan være selvbærende eller festet til en bærer. Bæreren kan være opak eller gjennomskinnelig for lys eller annen energi. Et valgt underlag for en spesiell bærer vil være forenelig med den tenkte signalbestemmelsesmåte. Underlag omfatter opake underlag og gjennomskinnelige underlags-materialer som er i stand til å overføre elektromagnetisk stråling av den bølgelengde innen området mellom ca. 200 nanometer (nm) og ca. 900 nm. Det kan også være ønskelig å ha et underlag som overfører et eller flere smale bølge-lengdebånd og er opakt mot nærliggende bølgelengdebånd. Dette kan eksempelvis gjennomføres ved å impregnere eller belegge underlaget med et eller flere fargestoffer med passende absorpsjonsegenskaper. Typiske underlag frem-stilles av polystyren, papp eller forskjellige andre struk-turelt stabile materialer.

Følgende eksempler beskriver forsøk som er utført for å komme frem til foreliggende oppfinnelse.

I eksemplene I-VI ble fluorescens målt ved å bruke et fiberoptisk fluorometer som er spesielt konstruert (av Ames Company, Division of Miles Laboratories, Inc., Elkhart,

IN) for å måle fluorescerende utstrålinger fra analytiske elementer som hodles i en horisontal stilling. Instrumentet brukte en kontinuerlig emisjonskvikksølvlampe som eksitasjonslyskilde, fiberoptisk avleserhode, fotomultiplikater for fluorescens bestemmelse og en mekanisk holder for det analytiske element som skal avleses. Denne mekaniske ele-mentholder er lik den i reflekt anse fotometeret Seralyze (Ames Company, se ovenfor). Elementet holdes stasjonært

i en horisontal stilling med den eksponerte overflate som skal avleses oppadrettet og avleses ovenfra. Fluorometeret har bølgelengdeinterferensfiltere for å tilveiebringe en eksitasjonslyskilde på 405 nanometer (nm) bølgelengde,

som treffer elementets overflate i en 90° vinkel på overflaten. Forsidemålinger av fluorescerende lys, emittert ved en bølgelengde på 450 nm, utføres også i en 90° vinkel

på overflaten av underlaget.

Eksempel I - Element fremstilt uten polymer

Dette eksempel angir forsøk hvori et element ble fremstilt uten en reagensmigreringshindrende substans ifølge oppfinnelsen .

Ved fremstillignen av elementet er det nødvendig å innføre en gitt mengde fluorescerende konjugat B-galaktose-umbelliferon-fenobarbital (B-GUPB) i hvert element. B-GUPB konjugatet som ble brukt i dette eksempel ble fremstilt som beskrevet i eksempel 9 i US patent 4.279.992. Fenobarbital er anvendbar som antikrampemiddel, hypnotikum og sedativ.

De løsninger som brukes ved fremstilling av de elementer som er testet i disse forsøkene inneholdt følgende bestanddeler :

Vandig løsning

En Ames-enhet B-galaktosidase er den mengde enzym som hydro-lyserer 1,0 mikromol ortonitrofenyl-B-D-galktopyranosid (ONPG) til ortonitrofenol pr. minutt i en vandig buffer, 0,05 M natriumbicin, pH 8,5, inneholdende 0,003 M ONPG ved 25°C.

Organisk løsning

Et 7,5 x 15 cm stort stykke Whatman 31ET papir (Whatman, Inc.

Clifton, NJ) ble impregnert til metning med den ovenfor fremstilte vandige løsning og tørket i en konveksjonsovn ved 50°C i 15 minutter. Den organiske løsning ble så impregnert til metning i papiret inneholdende den tørkede rest av den vandige løsning på samme måte og papiret ble igjen tør-ket i en konveksjonsovn ved 50°C i 15 minutter.

Dette impregnerte papirstykket ble montert på den kleb-

ende siden av en forsølvet Mylarw (R) polyesterfilm (3M Company, St. Paul, MN), hvilket dannet et laminat som videre ble montert på klebestoffet Y915 (3M Company, se ovenfor) med et avtagbart ark på en side. Dette ferdige laminatet ble oppdelt i 1 cm brede strimler, som etter fjerning av det avtagbare papiret, ble montert 0,6 cm fra sidekanten av et 8,3 cm bredt bånd av Trycitew (5) polystyrenfilm (3M Company, se ovenfor). Trycite^-monterte laminatet ble på tvers oppdelt i 5 mm brede strimler, slik at hvert av de ferdige strimlene derfor inneholdt en bit på 5 mm x 10 mm impregnert papir.

Alle anordninger som ble fremstilt på denne måten ble

testet ved å bringe dem i kontakt med en 30 \ il aliqout destillert vann.

Etter plassering av anordningen i instrumentets strimmelhol-der, ble aliquoten med testløsningen pipettert på anordningens eksponerte overflate og strimmelholderen ble inn-ført i fluorescens-bestemmelsesintrumentet.

De fluorescerende bestanddelenes migrering ble målt etter

3 minutters reaksjon mellom konjugatet og B-galaktosidase, ved å avsøke den fluorescens som ble emittert i forskjellige deler av det impregnerte papirets eksponerte overflate-arealet. En migreringsindeks, Rm, ble beregnet å være forholdet mellom fluorescenssignalet i sentrum av reagens-platen (ved punktet for prøveamppliseringen) og middel-tallet mellom fluorescenssignalene ved for- og bak-kantene til hver anordning. Resultater

De elementer som ble fremstilt som beskrevet i foreliggende eksempel oppviste vesentlige variasjon i fluorescens emittert ved forskjellige deler av det impregnerte papirets ekponerte overflate, slik det fremgår av migreringsindek-sen. Dette fenomen forårsaker en mangel på pålitelighet som er uakseptabel.

Eksempel II - Polymer bare i den første impregnering ( vandig) Dette eksempel gjengir forsøk i hvilke et element ble fremstilt med en monoestermaleinsyrepolymer innblandet i den vandige løsning som ble brukt for den første impregnering, men som ikke ble innblandet i den andre, organiske løsning som ble brukt for den andre impregnering, ved hvilken 6-GUS-konjugatet ble tilsatt.

570 ml absolutt metanol ble plassert i et 1-liters beger-glass, og 50 g "Gantrez" AN-139 ble tilsatt med rask om-røring med magnetrører. Konsentrert svovelsyre, 10 fil,

ble tilsatt og oppslemmingen omrørt ved romtemperatur i en time. Temperaturen ble hevet til 55-60°C i tre timer med en liten åpning på begerglassets lokk. I løpet av denne tiden gikk det meste av det faste materialet i opp-løsning og etterlot en svakt uklar løsning. Denne løs-

ning ble avkjølt til romtemperatur og ytterligere omrørt i 18 timer. Ingen av de resterende faststoffene gikk i oppløsning. Den omtrentlige 10% vekt/vekt-oppløsning av monometylesteren av "Gantrez" AN-139 ble lagret ved 4°C

og brukt etter behov.

Ved fremstillingen av elementet er det nødvendig å innføre en gitt mengde fluorescerende konjugat, 6-galaktose-umbelliferon-sisomicin (B-GUS), i hvert element. Det B-GUS-konjugat som ble brukt i dette eksempel ble fremstilt som beskrevet i eksempel 1 i US patent 4.279.992. Sisomicin er en analog av gentamicin med en spesifikk binding. Gentamicin er et vannløselig, bredsprekret aminoglykosid-antibiotikum. Antiserum mot gentamicin ble fremstilt som beskrevet i "Nature New Biol." 239:214 (1972).

Løsningene som ble brukt for å fremstille de elementer

som ble testet i disse forsøkene inneholdt følgende bestanddeler :

Vandig løsning

Organisk løsning

Ved å bruke den ovenstående vandige løsning ble en 10 cm bred rull av Whatman 31ET papir (Whatman, Inc., Clifton, NJ) impregnert til metning og tørket i 7,5 minutter i en Overly (Overly Inc., Neenah, WI) trykklufttørker ved 50°C. Det andre badet (organisk løsning) ble impregnert på lignende måte. Deretter ble anordningene fremstilt som beskrevet i eksempel I.

De anordninger som er fremstilt som beskrevet i dette eksempel ble testet ved å bruke analytiske fremgangsmåter som var de samme som de som er beskrevet i eksempel I bortsett fra at prøven som ble påført var 25^1 av en løsning av 6-galaktosidase (2 enheter/ml) i 0,3M natriumbicin-buffer, pH 8,5.

R esultater

De elementer som er fremstilt som beskrevet i dette eksempel oppviste betydelig variasjon i fluorescens emittert ved forskjellige deler av den eksponerte overflaten til det impregnerte papiret, slik det er fastslått ved migreringsindeks. Dette fenomen forårsaker en mangel på pålitelighet som er uakseptabel.

Eksempel III - Polymer i begge impregneringer

Dette eksempel rapporterer forsøk i hvilke et fluorescerende element ble fremstilt med en monoestermaleinsyrepolymer innblandet både i den vandige løsnignen som ble brukt for den første impregnering og i den andre, organiske løsning som ble brukt for den andre impregnering, ved hvilken S-GUPB-konjugat ble tilsatt.

De løsninger som ble brukt for fremstilling av elementene som er testet i disse forsøkene inneholdt følgende bestanddeler :

Vandig løsning

"Gantrez ES-225 er den kommersielt tilgjengelige monoetyl-ester av "Gantrez" AN-119.

Organisk løsning

Ved å bruke de ovenstående løsning, var elementfremstillingsfremgangsmåten deretter den samme som beskrevet i eksempel II bortsett fra at det ble brukt en 5 cm bred rull av "Whatman" 31ET papir og den totale tørketiden var 5 minutter .

De anordninger som ble fremstilt som beskrevet i dette eksempel, ble testet ved å bruke analytiske fremgangsmåter som var de samme som de som er beskrevet i eksempel I.

Resultater

De elementer som er fremstilt som beskrevet i dette eksempel oppvist neglisjerbare variasjoner i fluorescens emittert ved forskjellige deler av den eksponerte overflaten av det impregnerte papir, slik det er kvantifisert ved hjelp av migreringsindeks. Dette demonstrerer at forbedringen ifølge oppfinnelsen overvinner mangelen på pålitelighet som var en plage hos kjente anordninger, slik det vises i eksemplene I og II, og demonstrerer også at denne forbedring ikke minskes ved innblanding av den migreringshindrende

substans i begge impregneringer.

Eksempel IV - Polymer bare i den andre impregnering

Dette eksempel gjengir forsøk i hvilke et substratmerket, fluorescerende immunoforsøkselement ble fremstilt med en monoester av maleinsyrepolymer innblandet bare i den andre, organiske løsning som brukes for impregnering av B-GUPB-konjugatet. Polymeren ble ikke innblandet i den vandige løsning som ble brukt for den første impregnering.

De løsninger som ble brukt ved fremstilling av elementene som ble testet i disse forsøkene inneholdt følgende bestanddeler:

Vandig løsning

Organisk løsning

Ved å bruke de ovenstående løsninger ble anordninger fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten som er beskrevet i eksempel

I.

De anordninger som er fremstilt som beskrevet i dette eksempel ble testet ved å bruke testløsninger og analytiske fremgangsmåter som var de samme som de som er beskrevet i eksempel I.

Resultater

De elementer som er fremstilt som beskrevet i dette eksempel oppviste neglisjerbare variasjoner i fluorescens emittert ved forskjellige deler av den eksponerte overflaten til det impregnerte papir, slik det er kvantifisert ved hjelp av migreringsindeks. Dette viser at forbedringen ifølge oppfinnelsen overvinner mangelen på pålitelighet som var plagsom i kjente anordninger slik det er vist i eksemplene I og II, så vel som at det viser at den migreringshindrende substans bare behøver innblandes i den andre impregneringen.

Eksempel V - Alternativ polymer bare i den andre impregneringen. Substratmeket, fluorescerende immuno-f orsøkselement for fenobarbital

Dette eksempel angir forsøk i hvilke et substratmerket, fluorescerende immunoforsøkselement ble fremstilt med en monoestermaleinsyrepolymer innblandet bare i den andre, organiske løsning som ble brukt for impregnering av 3-GUPB-konjugatet. Polymeren ble ikke innblandet i den vandige løsningen som ble brukt for første impregnering.

De løsninger som ble brukt ved fremstilling av de elementer som ble testet i disse forsøkene inneholdt følgende bestanddeler :

Vandig løsning

Organisk løsning

Antiserum mot fenobarbital ble oppsamlet fra kaniner som var immunisert med et immunogent fenobarbital-konjugat

fra kuserumalbumin. Ved å bruke de ovenstående løsninger var elementfremstillingsfremgangsmåten deretter den samme som beskrevet i eksempel II bortsett fra at det ble brukt en 5 cm bred rull av "Whatman" 31 ET-papir.

De anordninger som er fremstilt som beskrevet i dette eksempel ble testet ved å bruke analytiske fremgangsmåter som var de samme som de som er beskrevet i eksempel I, bortsett fra at prøvene var 30 ul av en vandig løsning inneholdende 5% (volum/volum) normalt humanserum og fenobarbital (3ug/ml).

Resultater

De elementer som er fremstilt som beskrevet i dette eksempel oppviste neglisjerbar variasjon i fluorescens emittert ved forskjellige deler av den eksponerte overflaten til det impregnerte papir, som kvantifisert ved migreringsindeks. Dette viser at forbedringen ifølge oppfinnelsen overvinner den mangel på pålitelighet som var plagsom hos kjente anordninger som vist i eksemplene I og II, så vel som at det viser bruken av en annen migreringshindrende substans. Videre viser forsøkene i dette eksempel foreneligheten mellom den migreringshindrende substans og et fullstendig substratmerket immunoforsøkssystem.

Eksempel VI - Substratmerket, fluorescerende immunoforsøks-e lement for gentamicin

Dette eksempel viser forsøk i hvilke et substratmerket, fluorescerende immunoforsøkselement for gentamicin ble fremstilt med en monoestermaleinsyrepolymer innblandet bare i den andre organiske løsning som ble brukt for impregnering av B-GUS-konjugatet. Polymeren ble ikke innblandet i den vandige løsningen som ble brukt for den første impregnering .

De løsninger som ble brukt for fremstilling av elementene som ble testet i disse forsøkene, inneholdt følgende bestanddeler :

Vandig løsning

Organisk løsning

Ved å bruke de ovenstående løsninger, ble det fremstilt anordninger ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet i eksempel III.

De anordninger som er fremstilt som beskrevet i dette eksempel ble testet ved å bruke testiøsninger og analytiske fremgangsmåter som var de samme som de som var beskrevet i eksempel I, bortsett fra at prøvene var 30 (il av en vandig løsning inneholdende 10% normalt humanserum og gentamicin (4 ug/ml).

Resultater

Den forbedring som oppnås ifølge oppfinnelsen var også demonstrert av dette eksempel i hvilket et fullstendig substratmerket, fluorescerende immunoforsøkssystem er innblandet i det analytiske elementet.

Forsøk hvor det brukes et organisk fargestoff istedenfor konjugatene som ble brukt i de tidligere eksempler har vist anvendbarheten av migreringen med oppfinnelsen med et bredt sprektrum av reagenssystemer. Dette er vist i de følgende eksempler.

Eksempel VII - Fargestoffet bromfenol-blått i det andre

badet uten polymer i noen av badene.

Dette eksempel rapporterer forsøk i hvilke strimler inneholdende en buffer og bromfenol-blått ble fremstilt hvor den første vandige løsning inneholdt en buffer og den andre organiske løsning inneholdt bromfenol-blått, en velkjent pH-indikator, men ingen løsning inneholdt en migreringshindrende substans ifølge oppfinnelsen.

Løsningene som ble brukt for fremstilling av elementene som ble testet i disse forsøkene, inneholdt følgende bestanddeler:

Vandig løsning Organisk løsning

Ved å bruke de ovenstående løsninger var elementfremstillingsfremgangsmåten den samme som beskrevet i eksempel II bortsett fra at en 5 cm bred rull av 'Whatman" 54-papir ble brukt.

Tre strimler ble plassert på en laboratoriebenkeplate og

20 ul vann ble langsomt pipettert på sentret av det impregnerte papiret, med omsorgsfull observasjon av strimmelen på fargejevnhet.

På hver av de tre strimlene ble det meste av bromfenol-blått vasket vekk fra senteret av det impregnerte papiret mot kantene og etterlot minsket farge i senteret.

Visuell undersøkelse alene var tilstrekkelig til å observere fargeujevnheten i strimlene som er fremstilt som angitt i dette eksempel.

Eksempel VIII - Bromfenol-blått i det andre badet med

polymer bare i det andre badet.

Dette eksempel rapporterer forsøk i hvilke strimler inneholdende en buffer og bromfenol-blått ble fremstilt, hvor den første vandige løsning inneholdt en buffer og den andre organiske løsning inneholdt bromfenol-blått og en monoester av maleinsyrepolymer.

Løsningene som ble brukt for fremstilling av de elementer som er testet i disse forsøkene, inneholdt følgende bestanddeler :

Vandig løsning

Organisk løsning

Ved å bruke de ovenstående løsninger var elementfremstillingsfremgangsmåten deretter den samme som beskrevet i eksempel II, bortsett fra at det ble brukt en 5 cm bred rull av "Whatman" 54-papir.

Den analytiske fremgangsmåte var den samme som for eksempel

VII.

På hver av de tre strimlene var lite eller intet av bromfenol-blått vasket vekk fra senteret mot kantene, og etterlot en impregnert strimmel som visuelt ble observert å ha jevn fargeintensitet hele veien.

Dette eksempel viser forbedringen som oppnås ifølge oppfinnelsen med en signifikant forskjell type reagens, dvs. bromfenol-blått, i den impregnerte strimmel.

Claims

1. Prøveinnretning for vurdering av en flytende prøve for nærvær av en analytt, karakterisert ved et enkelt analyttpåvisningslag inkorporert med et analyttpåvisningssystem, buffer for tilveiebringelse av en pH-verdi ved minst 5, og et ikke-ionisert ioniserbart reagensmigreringshindrende stoff valgt blant kopolymerer av maleinsyre og sulfonsyrepolymerer.

2. Prøveinnretning ifølge krav 1, karakterisert ved at det reagensmigreringsinhiberende stoff er en kopolymer av metylvinyleter og monometylesteren av maleinsyre, metylvinyleter og monoetylesteren av maleinsyre, metylvinyleter og monopropylesteren av maleinsyre, metylvinyleter og en monobutylester av maleinsyre, vinylacetat og monometylesteren av maleinsyre, vinylacetat og monoetylesteren av maleinsyre, etylen og monometylesteren av maleinsyre, etylen og monoetylesteren av maleinsyre, oktadecylvinyleter og monometylesteren av maleinsyre eller oktadecylvinyleter og monoetylesteren av maleinsyre.

3. Prøveinnretning ifølge krav 1, karakterisert ved at det reagensmigreringshindrende stoff er polystyrensulfonat, en kopolymer av 2-akrylamid-2-metylpropan-sulfonsyre og styren, polyvinylsulfonsyre.

4. Fremgangsmåte for fremstilling av et analytisk element for bestemmelse av nærværet av en analytt i en væske-prøve, karakterisert ved følgende trekk: inkorporering av et enkelt analyttpåvisningslag med en vandig oppløsning av minst et reagens av et analyttpåvisende system, og en buffer tilveiebringende en pH på minst 5, tørking av det enkle analyttpåvisningslag og inkorporering av det tørkede, enkle analyttpåvisningslag med en oppløsning omfattende et oppløsningsmiddel, en reagens eller reagenser forskjellig fra det forannevnte reagens inneholdt i analyttpåvisningssystemet og et ikke-ionisert ioniserbart reagensmigreringshindrende stoff, valgt fra gruppen bestående av kopolymerer av maleinsyre eller sulfonsyrepolymerer i det nevnte oppløsningsmiddel er et hvori stoffet er uoppløselig i sin ioniserte form, men oppløselig i dets ikke-ioniske form.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at det anvendes kopolymerer av maleinsyre valgt fra gruppen bestående av kopolymerer av (1) metylvinyleter og monometylester av maleinsyre, (2) metylvinyleter og monoetylesteren av maleinsyre, (3) metylvinyleter og monopropylesteren av maleinsyre, (4)metylvinyleter og en monobutylester av maleinsyre, (5) vinylacetat og monometylesteren av maleinsyre, (6) vinylacetat og monoetylesteren av maleinsyre, (7) etylen og monometylesteren av maleinsyre,

(8) etylen og monoetylesteren av maleinsyre, (9) oktadecylvinyl-ester og monometylesteren av maleinsyre og (10) oktadecyl-vinylester og monoetylesteren av maleinsyre.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at det anvendes sulfonsyrepolymerer valgt fra gruppen bestående av polystyrensulfonat, kopolymerer av 2-akrylamido-2-metylpropansulfonsyre og styren, og polyvinylsulfonsyre.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 4 eller 6, karakterisert ved at det anvendes betingelser for å bevirke ionisering av sulfonsyrepolymeren oppnådd ved bruk av en vandig væske, ved at pH holdes i området i forhold til pKa for den spesielle sulfonsyrepolymer som benyttes, således at sulfon-syregruppen ioniseres.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at det anvendes oppløsningsmiddel valgt blant toluen, aceton, kloroform, n-propan, metylenklorid og etylen-diklorid.