NO157723B

NO157723B - Filterelement eller filter.

Info

Publication number: NO157723B
Application number: NO822283A
Authority: NO
Inventors: Ernest Brian Hayes
Original assignee: Cigarette Components Ltd
Priority date: 1981-07-06
Filing date: 1982-06-30
Publication date: 1988-02-01
Also published as: BE893751A; AU8503482A; SE8204080D0; SE453251B; ATA261782A; IT8222125A0; DK161423C; NO157723C; AU559296B2; IT8222125A1; HK87089A; DK287582A; DK161423B; IE821499L; FR2508814B1; NL8202556A; IT1151965B; IE53211B1; CH660835A5; ZA824769B

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av L-glutaminsyre.

Foreliggende oppfinnelse vedrorer en fremgangsmåte til fremstilling av L-glutaminsyre ved fermentering med mikroorganismer i nærvær av spesielle organiske syreestere.

I den senere tid er det utviklet en rekke fremstillingsmåter

for L-glutaminsyre ved fermentering, og disse fremgangsmåter er blitt overfort til industriell skala på grunn av det store forbruk av L-glutaminsyre. Dog er det enda mange ukjente faktorer som gjor seg gjeldende ved fremstillingen av L-glutaminsyre ved fermentering, og det gjenstår derfor en lang rekke problemer å lose når det gjelder fermenteringsbetingelser ved disse metoder. Et studium og en anvendelse av disse faktorer er derfor meget viktig når det gjelder å be-stemme optimum betingelser ved fremstilling av L-glutaminsyre med

hoyt utbytte i industriell skala.

Siden Kinoshita et al ved fremstilling av L-glutåminsyre ved fermentering (britisk patent nr. 849 280), fant at en betraktelig stor mengde L-glutaminsyre 'kan fremstilles fra sukker bare når det forekommer biotin i en mengde på mindre enn det som er nodvendig for maksimal vekst av mikroorganismen i et' dyrkningsmedium, har.det blitt ansett for å være av vesentlig betydning å foreta en■regulering av biotinmengden i dyrkningsmediet, og det har blitt foretatt store an-strengelser i denne forbindelse. Fransk patent nr. 1 335 176 beskriver således at oljesyreester av sorbitan, f.eks. sorbitanmonooleat eller sorbitantrioleat, kan benyttes istedenfor biotin. Fransk patent nr. 1 342 365 beskriver videre at når billig melasse anvendes som karbonkilde, blir slike ikke-ioniske overflateaktive midler av ester-typen som polyoksyetylensorbitanmonooleat, polyoksyetylenmonooleat, sorbitanmonolaurat og glycerolmonostearat, etc. benyttet for. å regu-lere overdreven vekst av mikroorganismer på grunn av overskudd av biotin som forekommer i melassen tilsatt til mikroorganismen. Bruk av de fermenteringsmetoder som er beskrevet i nevnte patenter medforer imidlertid et lavt utbytte av L-glutaminsyre.

Hensikten med foreliggende oppfinnelse er å oppnå en forbed-ret fremgangsmåte til fremstilling av L-glutaminsyre ved en fermentering som kan utfores effektivt og lett, som gir et rent og hoyt utbytte, og som dessuten fordelaktig kan utfores i industriell måle-stokk .

På grunnlag av den antagelse at den forbedrede fremstilling av L-glutaminsyre ved fermentering ikke bare oppnåes ved regulering av veksten av mikroorganismen med biotin, har man lett etter faktorer som gir foroket produksjon av bare L-glutaminsyre i dyrkningsmedier hvor det forekommer en optimal mengde biotin eller hvor veksten av mikroorganismen reguleres under anvendelse av velkjente vekstinhibi-torer. Ved leting etter nevnte forskjellige faktorer i forbindelse med fermenteringsprosesser hvor det anvendes mikroorganismer for opp-nåelse av L-glutaminsyre, ble det funnet at det dannes en betydelig mengde L-glutaminsyre i dyrkningsmediet hvis en ester av en en-verdig alkanol inneholdende 3 - 10 karbonatomer med en spesiell lavere mettet karboksylsyre tilsettes til et slikt dyrkningsmedium inneholdende karbonkilde, nitrogenkilde og uorganiske salter. If.olge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt en fremgangsmåte til fremstilling av L-glutaminsyre ved dyrkning av mikroorganismen Micrococcus glutamicus i et vandig næringsmedium inneholdende karbonkilde, nitrogenkilde, uorganiske salter og biotin under aerobe betingelser, kjennetegnet ved at fermenteringen foretas i nærvær av 0.01 - 1.0 vektprosent av minst en ester av en en-verdig alkanol inneholdende 3-10 karbonatomer med en lavere, mettet karboksylsyre valgt fra sitronsyre, ravsyre, eplesyre, malonsyre, adipinsyre, glukonsyre, acétylsitronsyre og acetyleplesyre.

Som eksempler på noen estere som er effektive i fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen kan nevnes: mono-, di- og tri-estere av propylcitrat, isopropyl-, butyl-, isobutyl-, amyl-, isoamyl-, heksyl-, heptyl-, oktyl-, nonyl- og decyl-citrat, mono- og di-estere av ravsyre, som propyl-, isopropyl-, butyl-, isobutyl-, åmyl-, isoamyl-, heksyl-, heptyl-, oktyl-, nonyl- og decyl-succinat, samt blandinger av to eller flere av disse forbindelser.

For å demonstrere effekten av tilsetningen av forskjellige

av de nevnte estere i varierende mengder til et dyrkningsmedium som benyttes i foreliggende oppfinnelse, vil folgende eksperimenter bli beskrevet som eksempler på fremstillingen av L-glutaminsyre ved fermentering og ved bruk av'Micrococcus glutamicus. Hvis intet annet er sagt er de gitte prosentsatser vektprosent.

Fksperiment 1

Dette eksperiment viser forholdet mellom den type alkylradi-kal som kan inngå i en ester av en en-verdig alkohol med 3-10 karbonatomer med ravsyre som benyttet i oppfinnelsen - og de mengder som kan brukes og effekten av disse.

Fermenteringskaret som ble brukt under alle fermenterings-forsok var et 5 liters kar.

270 ml inokuleringsvæske som inneholdt en L-glutaminsyreproduserende bakterie av typen Micrococcus glutamicus ATCC nr.

13032, ble tilsatt 2730 ml dyrkningsmedium som inneholdt 13% stivelse hydrolysert med syre (som glukose), 0.1 % ammoniumhydrogenfosfat, 0. 1 % diammoniumhydrogenfosfat, 0.05 / magnesiumsulfat, 0.004 % mangansulfat, 0.002 % ferrosulfat, 0.3 & kaliumsulfat, 0.5 % urinstoff og 3 mikrogram/ liter med biotin. Det inokulerte medium ble inkubert i 48 timer under disse betingelser:

Under inkuberingen ble pH-verdien stilt til 7. 0 med 30 % vandig urinstoffopplosning.

Resultatene var fSigende:

Eksperiment 2

Dette eksperiment viser effekten av den type karboksylsyre som inneholdes i nevnte estere, hvilke tilsettes til dyrkningsmediet som benyttes i foreliggende oppfinnelse.

Fermenteringsproven ble utfort på samme måte som i eksperiment 1. Resultatene var folgende:

Eksperiment 3

Fermenteringsprovene ble utfort på samme måte som angitt i eksperiment 1.

F.ksperimentresultatene var f olgende :

Som vist i eksperimentene 1, 2 og 3 oker mengden med L-glutaminsyre ganske betydelig i de tilfeller hvor fermenteringen er fore-gått i nærvær av nevnte ester.

Fgnede mengder av nevnte ester som kan tilsettes fermenteringsmediet, . r..;'.., .: varierer fra 0.1 til 1.0 vektprosent, skjont dette varierer noe med den type L-glutarainsyre-produserende bakterie som anvendes, dyrkningsmediets sammensetning, sukkerkonsentrasjonen og spesielt med den type ester som benyttes. Det skulle likevel være innlysende for fagfolk at tilsetning av optimale mengder av nevnte ester er nodvendig for å oppnå den mest effektive produksjon av L-glutaminsyre ved fermenteringen så snart de forskjellige dyrknings-betingelser er fastlagt.

De bakteriologiske egenskaper ved de mikroorganismer som faller inn under begrepet Micrococcus glutamicus, og som er brukt i ovennevnte eksperimenter, er beskrevet i japansk patent nr. 243 3^2. Den gang disse mikroorganismer ble isolert, fikk de dette navnet for-di de er mikroorganismer som tilhorer slekten Micrococcus ifolge den beskrivelse som er gitt i femte og sjette utgave av Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Siden den gang, som et resultat av isolering av aminosyre-produserende bakterier ved en-trinns metoder, har mikroorganismer som tilhorer slektene Brevibacterium, Aerobacter, Microbacterium, etc. blitt rapportert som navn på slike mikroorganismer i forskjellige arbeider.

Når det gjelder sammensetningen av dyrkningsmediet, så er både et syntetisk og et. organisk medium egnet så lenge det inneholder de essensielle næringsstoffer som er nodvendige for mikroorganismenes vekst. Slike næringsstoffer er velkjente og innbefatter stoffer som en karbonkilde, en nitrogenkilde, uorganiske forbindelser og lignende, etc, som brukes av de anvendte bakterier i visse mengder.

Som eksempler på karbonkilder kan nevnes: glukose, sucrose, stivelseshydrolysatopplosning, forskjellige melassetyper og lignende. Disse stoffer kan brukes hver for seg eller som blandinger av.to eller flere. Som nitrogenkilde kan benyttes uorganiske og organiske ammoniumsalter, ammoniakk, urea, peptoner, kjottekstrakt, gjæreks-trakt, maisblotningsvæske og forskjellige proteinhydrolysater. Det er dessuten nodvendig å tilsette dyrkningsmediet visse essensielle næringsstoffer for å fremme bakterieveksten, slik som aminosyrer og/eller vitaminer, spesielt biotin. Uorganiske forbindelser som kan tilsettes innbefatter kaliumdihydrogenfosfat, kaliummonohydrogenfosfat, magnesiumsulfat, kalsiumkarbonat, mangansulfat, etc.

Ved utforelse av foreliggende oppfinnelse er det foretrukket å foreta dyrkningen ved mellom 20° og 40°C> mens pH-verdien i dyrkningsmediet holdes i området 5 - 9'

De folgende eksempler illustrerer foreliggende oppfinnelse og hvis intet annet er sagt, er alle prosentsatser vektprosent.

Det bor bemerkes at de bemerkelsesverdige resultater som oppnås ved denne oppfinnelse og som er illustrert i dé folgende eksempler også kan oppnås med bruk av blandinger av to eller'flere av nevnte estere.

Eksempel 1

2730 ml dyrkningsmedium som inneholdt 12 % glukose, 0.1 % ammoniumhydrogenfosfat, 0.1 % diammoniumhydrogenfosfat, 0.05 % magnesiumsulfat, 0.004 % mangansulfat, 0.002 % ferrisulfat, 0.3 % kaliumsulfat, 0.5 % urinstdff, 5-5 mikrogram biotin per liter væske, 0. 1'% casaminosyre, 10 mikrogram tiamin per liter og 0.1 % di-isobutylsuccinat ble helt i et 5-liters fermenteringskar og sterilisert under trykk. Etter dette ble det inokulert med 270 ml som inneholdt Micrococcus glutamicus ATCC nr. I3O32, og som hadde vært dyrket ved rysting i 12 timer i et medium som inneholdt 5% glukose, 1 % pepton, 0.5 % kjottekstrakt, 0.5 % ammoniumsulfat,. 0.05 % kaliumhydrogenfosfat, 0.05 % dikaliumhydrogenfosfat, 0.025 % magnesiumsulfat, 0.001 % mangansulfat, 0.001 % ferrisulfat, 0.5 % urinstoff og 10 mikrogram biotin per liter væske. Fermenteringsmediet ble så inkubert i 48 timer under folgende betingelser:

pH ble justert til 7.0 med en 30 % vandig urinstoffopplesning.

Etter at fermenteringen var ferdig, inneholdt væsken 55*5 mg/ml L-glutaminsyre, og utbyttet av sukker var 49»0 % (bare 44«9 mg/ml L-glutaminsyre og 39«7 % utbytte av sukker hvis ikke di-isobutylsuccinat tilsettes til det medium som er benyttet i dette eksempel) . 44 g uren, krystallisert L-glutaminsyre ble innvunnet ved å konsentrere 1 liter av fermenteringsvæsken under redusert trykk:og fjerne bakteriecellene etter saltsyrebehandling og krystallisering ved pH 3.2 med HC1.

Eksempel 2

2730 ml av et næringsmedium som inneholdt sot potetstivelse hydrolysert med saltsyre (innhold på 13.5 % direkte reduserende sukker), 0.1 % ammoniumhydrogenfosfat, 0.1 % diammoniumhydrogenfosfat, 0.05 % magnesiumsulf at, 0.004 % mangansulf at, 0.3 % > kaliumsulf at, 10 mikrogram biotin per liter og 0.2 % di-isoamylsuccinat ble plasert i et 5-liters fermenteringskar og sterilisert under trykk.

270 ml inokuleringsvæske med Micrococcus glutamicus ATCC nr.

130 32 ble tilsatt. Det inokulerte fermenteringsmedium ble så dyrket i 48 timer ved folgende betingelser: temperatur 34°C, rotasjonshas-tighet 550 omdr./min., lufttilførsel 3 liter/minutt. pH ble justert til 7*0 med en 15 % vandig ammoniakkopplosning. Etter 10 timer ble

5 enheter per ml kaliumpenicillin G tilsatt kulturen.

Mengden L-glutaminsyre i fermenteringsvæsken, etter at fermenteringen var ferdig, var 64.6 mg/ml, og utbytte av sukker*f47.2 %.

(Bare 52.5 mg/ml med L-glutaminsyre og 38.4 $ utbytte av sukkerrfble oppnådd når di-isoamylsuccinat ikke ble tilsatt og betingelsene for-ovrig var de samme).

Det ble oppnådd 57.2 g urene krystaller av L-glutaminsyre ved å konsentrere 1 liter av fermenteringsvæsken under redusert trykk, fjerne cellene etter behandling med HC1 og krystallisere ved pH 3-2 med saltsyre.

Eksempel 3

På lignende måte som i eksempel 1 ble det utfort en dyrkning med det unntak at man anvendte hvetestivelse hydrolysert med syre (innhold på 12.1 % direkte reduserende sukker) samt 0.1 % di-n-heksylsuccinat som organisk syreester. Dyrkningen foregikk i 40 timer.

Mengden av L-glutaminsyre i væsken etter fermenteringens full-førelse var 58.2 mg/ml" og utbyttet av sukkervar 45«7 %. (Bare 49-8 mg/ml L-glutaminsyre samt 39-1 % utbytte av sukker**ble oppnådd når det ikke ble tilsatt di-n-heksylsuccinat).

Det ble oppnådd 53«4 g urene krystaller av L-glutaminsyre ved å konsentrere 1 liter av fermenteringsvæsken under redusert trykk og fjerne bakteriecellene etter behandling med HC1 og krystallisering ved pH 3.2 med saltsyre.

Eksempel 4

Den samme fermentering som beskrevet i eksempel 1 ble utfort med det unntak 'at det ble tilsatt 0.2 % di-n-butylmalat istedenfor di-isobutylsuccinåt.

Etter fermenteringens utlop var det fremstilt 69.0 mg/ml med L-glutaminsyre i fermenteringsvæsken. Et utbytte på 46.0 % av sukkeret ble oppnådd. (Bare 58.5 mg/ml L-glutaminsyre og 39«0 % utbytte av sukkentble oppnådd hvis man ikke tilsatte di-n-butylmalat).

Det ble oppnådd 5°.5 g urene krystaller/L-glutaminsyre ved å konsentrere 1 liter av fermenteringsvæsken under redusert trykk, fjerne bakteriecellene etter behandling med HC1 samt krystallisering ved pH 3*2 med saltsyre.

Eksempel 5

Den samme fermentering som er beskrevet i eksempel 1 ble utfort bortsett fra at det ble benyttet 0.1 % di-n-butylmalonat istedenfor di-isobutylsuccihat.

Etter at fermenteringen var ferdig hadde væsken et innhold på 65.5 mg/ml L-glutaminsyre og utbyttet av sukkerrfvar 46.8 %. (Uten tilsetning av di-n-butylmalonat oppnådde man derimot bare 57.5 mg/ml L-glutaminsyre og et utbytte av sukkertfpå 41*1 %).

Det ble innvunnet 54 g uren, krystallinsk L-glutaminsyre etter at 1 liter fermenteringsvæske var konsentrert under redusert trykk og bakteriecellene var fjernet etter HCl-behandlingen. Krystalliseringen foregikk ved pH 3.2 med saltsyre.

Eksempel 6

Samme fermentering som i eksempel 2 ble foretatt, bortsett

fra at det ble anvendt 0.1 % n-butyladipat istedenfor di-isoamylsuccinat.

Etter at fermenteringen var ferdig var innholdet av L-glutaminsyre 62.0 mg/ml og utbyttet av sukker4var 4L3 %• (Det ble kun oppnådd 58.O mg/ml L-glutaminsyre og et utbytte på 38.7 %'sukkerdnår det ikke ble anvendt n-butyladipat).

Det ble innvunnet 52-2 g uren, krystallisert L-glutaminsyre ved at 1 liter fermenteringsvæske ble konsentrert ved vakuumbehandling og etter å ha fjernet bakteriecellene etter HCl-behandlingen. Krystalliseringen foregikk ved pH 3-2 med saltsyre.

Eksempel 7

Samme fermentering som i eksempel 2 ble utfort med det unntak at det ble brukt 0.2 % n-butylglukonat istedenfor di-isoamylsuccinat.

Etter at fermenteringen var ferdig, inneholdt væsken 64.5 mg/ml L-glutaminsyre og utbyttet av sukkerrfvar 43-0 %. (Det ble kun oppnådd 57-2 mg/ml L-glutaminsyre og et sukkerutbytte på 38.1 % når det ikke ble tilsatt n-butylglukonat).

Det ble oppnådd 53-3 g uren, krystallisert L-glutaminsyre ved å konsentrere 1 liter av fermenteringsvæsken under redusert trykk og fjerne bakteriecellene etter HCl-behandling, Krystalliseringen foregikk ved pH 3«2 med saltsyre.

Eksempel 8

Samme fermentering som beskrevet i eksempel 1 ble foretatt, men 0.1 % tri-n-amylcitrat ble benyttet istedenfor di-isobutylsuccinat.

Etter at fermenteringen var ferdig inneholdt væsken 60.4 mg/ml L-glutaminsyre og restsukkeret var 0.8 %. (Bare 48.2 mg/ml L-glutaminsyre ble fremstilt mens restsukkeret var 0.7 % når det ikke ble tilsatt tri-n-amylcitrat).

Det ble oppnådd 55«0 g uren, krystallisert L-glutaminsyre ved å konsentrere 1 liter av fermenteringsvæsken ved redusert trykk og fjerne bakteriecellene etter saltsyrebehandling. Krystalliseringen

foregikk med HC1 ved pH 3.2.

Eksempel 9

Samme fermentering som beskrevet i eksempel 2 ble foretatt, men 0.2 % tri-n-butylacetylcitrat ble benyttet istedenfor di-isoamylsuccinat.

Etter at fermenteringen var ferdig inneholdt væsken 68.7 mg/ml "L-glutaminsyre. Restsukkeret var 0.6 % direkte reduserende sukker.

(Det ble bare oppnådd 51-2 mg/ml med L-glutaminsyre samt 1.1 % rest-' sukker når det ikke ble tilsatt tri-n-butylacetylcitrat).

Det ble innvunnet 5^ g med uren, krystallisert L-glutaminsyre ved å konsentrere 1 liter av fermenteringsvæsken under redusert trykk, fjerne bakteriecellene etter saltsyrebehandling og krystallisere ved pH 3.2 med HC1.

Eksempel 10

2730 ml dyrkningsmedium ble fremstilt som i eksempel 2, men med det unntak åt det ble tilsatt hvetestivelse hydrolysert med syre (innhold på 12.1 % direkte reduserende sukker) samt 0.15 % tri-n-heksylcitrat. Mediet ble sterilisert under trykk i en 5-liters fermenteringsbeholder. Dyrkningen ble utfort i 40 timer på samme måte som nevnt i eksempel 2.

Etter at fermenteringen var ferdig, inneholdt fermenteringsvæsken 59-8 mg/ml L-glutaminsyre og restsukkeret var 0.4 %. (Bare 50.2 mg/ml L-glutaminsyre ble oppnådd mens restsukkeret var 0.7 % uten tilsetning av tri-n-heksylcitrat).

Det ble innvunnet 53«1 g uren, krystallisert L-glutaminsyre ved å konsentrere 1 liter fermenteringsvæske under redusert trykk og fjerne bakteriecellene etter saltsyrebehandling samt krystallisering ved pH 3.2 med HOI. Eksempel 11

2730 ml av samme dyrkningsmedium som i eksempel 2, men som inneholdt mais-stivelse hydrolysert med syre (12.7 % direkte reduserende sukker) og 0.1 % oktylcitrat ble tilsatt en 5-liters fermenteringsbeholder og sterilisert under trykk. Dyrkningen ble utfort i 42 timer på samme måte som i eksempel 2.

Etter at fermenteringen var ferdig inneholdt væsken 59•3 mg/ml L-glutaminsyre og restsukkeret var 0.9 %• (Det ble kun oppnådd 49•! mg/ml L-glutaminsyre og restsukkeret var 1 % når det ikke ble brukt tri-n-oktylcitrat).

Det ble innvunnet 53«7 g uren, .krystallisert L-glutaminsyre ved å konsentrere 1 liter av fermenteringsvæsken under redusert trykk og å fjerne bakteriecellene etter behandling med saltsyre og krystallisering ved pH 3.2 med HC1.

Eksempel 12

Fermenteringen ble utfort'som beskrevet i eksempel 1, men med tilsetning av 0.15 % di-n-propylcitrat. Mengden L-glutaminsyre i fermenteringsvæsken ved fermenteringens slutt var 59•5 mg/ml, °g restsukkeret var 0.8 (Mengden L-glutaminsyre var kun 49-0 mg/ml og restsukkeret var 0.7 % hvis det ikke ble tilsatt di-n-propylcitrat).

Eksempel 13

Fermenteringen ble utfart som beskrevet i eksempel 1 med det unntak at man anvendte 0.1 % mono-n-oktylcitrat som organisk syreester. Mengden L-glutaminsyre i fermenteringsvæsken ved fermenteringens slutt var 60.8 mg/ml og restsukkerinnholdet var 0.7 %• (Kun 48.5 mg/ml L-glutaminsyre ble fremstilt og restsukkeret var 0.7 % hvis mono-n-oktylcitrat ikke ble tilsatt).

Fremgangsmåten ifolge denne oppfinnelse utfores ved en dyrk-ningstemperatur på mellom 20° og 40°^, mens pH-verdien holdes innen området 5 til 9«

Det tidligere nevnte franske patent nr. 1 335 176 angår fermentering av L-glutaminsyre under anvendelse av Mikrobacterium ammo-niaphilum hvorved en oljesyreester av sorbitan tilsettes til mediet istedenfor biotin. Patentet anvender altså nevnte ester for å utnytte dens virkning som en erstatning for biotin, dvs. dens evne til å fremme veksten av mikroorganismer. Het har vært lenge kjent, at en slik hoyere fettsyre som oljesyre virker fremmende på veksten av mikroorganismer, og det ligger nær å slutte at den ovenfor nevnte ester ville vise en slik virkning.

Estrene som benyttes i foreliggende oppfinnelse omfatter ikke estere av slike hoyere fettsyrer og det er derfor helt umulig å forut-si virkningene av estrene på L-glutaminsyrefermentering. Det vil si, hvis endog estrene som benyttes i foreliggende oppfinnelse tilsettes til dyrkningsmedia, viser de ingen forbedring av veksten av mikroorganismene. Estrene som benyttes i foreliggende oppfinnelse er derfor såkalte "produksjonsstimulerende faktorer", som bare påvirker den L-glutaminsyreproduserende og akkumulerende evne til mikroorganismene, og har således én helt annen virkning enn de estere som er beskrevet i nevnte patent.

Sammenligningsforsok

Forsoket ble foretatt på.folgende måte: (1) Som grunnmedium ble benyttet det medium som ble anvendt i

eksempel 1, idet biotin og ester var fjernet.

(2) Biotin og ester ble tilsatt til grunnmediet som vist i tabellen nedenfor.

(3) De andre betingelser var noyaktig som i eksempel 1.

I tabellen ovenfor viser forsok 3 °g 4 prosessen i det franske patent nr. 1 335 176 og forsok 7 viser foreliggende oppfinnelse. De andre forsokene er sammenligningsforsok foretatt for å vise den spesielle virkning ved foreliggende fremgangsmåte. Dvs., i forsok 1 inneholdt mediet intet biotin og heller ingen erstatning for dette, som er vesentlig for formering av L-glutaminsyreproduserende mikroorganismer, og derfor ble det ikke observert noen mikroorganismevekst og mengden av dannet L-glutaminsyre var meget liten. Det samme var tilfelle i forsok 2. Det er således klart at "CAB" ikke har noen virkning på fremmelsen av veksten og formeringen av mikroorganismer, dvs. ingen biotin-substituerende virkning. I forsok 3 °g 4 hvor egnede mengder "Span 80" og "Tween 60" ble tilsatt ifolge fremgangsmåten i nevnte patent, ble det observert en betydelig biotin-substituerende virkning, men virkningene var utilfredsstillende sammenlignet med det som var tilfelle for forsok 6 og 7, hvor biotin ble benyttet i egnede mengder, og videre var mengden av dannet L-glutaminsyre i forsokene 3 °g 4 meget liten. I forsok 5 ble "CAB" tilsatt ifolge oppfinnelsen til "mediet benyttet i forsok 3 hvorved mengden av dannet L-glutaminsyre i stor grad ble foroket sammenlignet med forsok 3> skjont den absolutte verdi for mengden av dannet L-glutaminsyre var lav, og således kan det fast-slåes at "CAB" har virkning som en produksjonsstimulerende faktor. Forsok 7 ble utfort i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse under anvendelse av "CAB" i tillegg til en egnet mengde biotin. Fra forsok 7 er det klart at foreliggende oppfinnelse kan gi en overrask-ende stor mengde L-glutaminsyre. I forsok 7.ble mengden av dannet L- ' glutaminsyre oket betraktelig sammenlignet med forsok 6 til tross for : at det ble observert liten okning i myceliummengden. Dette viser at estrene som benyttes i foreliggende fremgangsmåte ikke gir noen biotin-substituerende virkning.

Det tidligere omtalte franske patent nr. 1 342 3^5 angår fremstilling av L-glutaminsyre ved fermentering fra et saccarid inneholdende en stor mengde biotin under anvendelse av en L-glutaminsyreproduserende mikroorganisme (spesielt en stamme av slekten Brevibacterium), og det benyttes et ikke-ionisk overflateaktivt middel som tilsettes til mediet. Dette overflateaktive middel tilsettes for å hindre overdreven vekst av mikroorganismen på grunn av innvirkningen av biotin som inneholdes i en stor mengde i melasse.

Estrene som benyttes i fremgangsmåten i foreliggende oppfinnelse viser imidlertid ingen slik inhiberende virkning på veksten og formeringen av mikroorganismen. En altfor stor vekst av mikroorganismen kan inhiberes mer effektivt enn i nevnte patent ved anvendelse av et antibiotikum slik som penicillin eller lignende som vist i eksemp-lene 2 og 9«

Sammenligningsforsok

2000 ml av et medium inneholdende 4 % mork melasse (slik som glukose), 0.05 % (NH^lgHPO^, 0.05 % (NH^HgPO^ og 0.05 % MgSO^HgO, ble benyttet sammen med hver av estrene som vist i tabell 2 nedenunder. Mediet ble fylt i en 5-liters fermenteringsbeholder og sterilisert. Deretter ble 250 ml av en podningsvæske av Micrococcus glutamicus ATCC nr. 13032 inokulert i mediet og ble dyrket. Dyrkningen ble foretatt ved en temperatur på 34°C, en omdreiningshastighet på 600 omdreininger per minutt og en lufttilf5rsel på 3 liter per minutt. pH-verdien i fermenteringsvæsken ble stilt til 7.5 - 0-1 med 17 % ammoniakkvann.

I hvert av forsokene 5 °g 6, ble 5/u/ml penicillin tilsatt når den optiske tetthet ved 700 n<y>u av dyrkningsvæsken hadde nådd 16.0 (omtrent 4 timer etter påbegynnelse av dyrkningen), og 30 minutter etter penicillintilsetningen ble 1 liter mork melasse (45 % glukose) kontinuerlig innfort i en mengde på 40 ml/time. I forsokene 1, 2, 3 og 4 ble det ikke tilsatt noe penicillin, mens 1 liter av nevnte melasse ble tilfort kontinuerlig i den ovenfor angitte mengde etter at den optiske tetthet ved 700 nyu av dyrkningsvæsken hadde nådd 16.0.

Mengdene av dannet L-glutaminsyre etter 30 timers dyrkning er vist i tabell 2.

Mengden av hver tilsatt ester er 0.1 % (den optimale mengde). Mengden av mycelium er verdien for optisk tetthet ved 700ryu.

I tabellen ovenfor viser forsok 6 foreliggende oppfinnelse og forsok 3 viser fremgangsmåten i det sistnevnte franske patent. De andre forsokene er sammenligningsforsok utfort for å indikere spesielle virkninger under anvendelse av oppfinnelsen.

I forsok 1 fikk man en overvekst av mikroorganismen på grunn av overskudd av biotin fra melassen, og mengden av dannet L-glutaminsyre var ubetydelig. Det samme var tilfelle for forsok 2. Det er således klart at "CAB" ikke har noen inhiberende virkning på mikroorganismens vekst. I forsok 3, dvs. patentets metode, ble det observert en viss inhiberende virkning på mikroorganismens vekst, men virkningen var utilfredsstillende sammenlignet med forsokene 5 og 6 hvor penicillin var tilsatt, og mengden av dannet L-glutaminsyre var meget liten.

I forsok 4 ble "CAB" tilsatt i overensstemmelse med foreliggende fremgangsmåte, til mediet i forsok 3j °g mengden av dannet L-glutaminsyre ble oket i betydelig grad sammenlignet med forsok 3> skjont den absolutte verdi av mengden av dannet L-glutaminsyre var liten. Forsok 5 viser den inhiberende virkning av penicillin på veksten og formeringen av mikroorganismen og denne inhibering er meget effektiv sammenlignet med forsok 3« net er imidlertid klart at når det i likhet med forsok 6 tilsettes "CAB" i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse, til mediet i forsok 3, okes mengden av dannet L-glutaminsyre meget uavheng-ig av veksten og formeringen av mikoorganismen.

Claims

Fremgangsmåte til fremstilling av L-glutaminsyre ved dyrkning av mikroorganismen Micrococcus glutamicus i et vandig næringsmedium inneholdende karbonkilde, nitrogenkilde, uorganiske salter og biotin under aerobe betingelser, karakterisert ved at fermenteringen utfores i nærvær av 0.01 - 1.0 vektprosent av minst en ester av en en-verdig alkanol inneholdende 3-10 karbonatomer med.en lavere mettet karboksylsyre valgt fra sitronsyre, ravsyre, eplesyre, malonsyre, adipinsyre, glukonsyre, acetylsitronsyre og acetyleplesyre.