NO151201B - Fremgangsmaate for fremstilling av terapeutisk virksomme antigenderivater. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører fremgangsmåte til fremstilling av farmakologisk virksomme antigenderivater som består av et antigen, hvortil det pr. antigenmolekyl er bundet minst et og maksimalt så mange muramylpeptidmolekyler at den antigene karakter bibeholdes, samt eventuelt en bærer, idet disse komponenter sammenknyttet med hverandre kovalent enten direkte over oksykarbonyl-, iminokarbonyl- eller karbonyltiogrupper eller eventuelt indirekte over som broledd tjenende rester av en alifatisk forbindelse med minst to aminogrupper, minst en amino- og minst en karboksygruppe eller minst to karboksylgrupper, idet bindingen mellom broledd og antigen samt broledd og muramylpeptid likeledes foregår over oksykarbonyl-, iminokarbonyl- eller karbonyltiogrupper, og idet muramylpeptidet i ubundet form har den i formel Ila angitte struktur

hvori

X betyr en karbonyl- eller karbonyloksygruppe,

R^, R^ og Rg betyr uavhengig av hverandre hydrogen, trimetylsilyl eller alkanoyl,

R2 betyr en fenylrest eller usubstituert eller med hydroksy, karboksy, laverealkoksy og/eller laverealkoksykarbonyl substituert laverealkyl,

R^, Ry og Rg betyr uavhengig av hverandre hydrogen eller laverealkyl,

Rg betyr en fenylrest eller usubstituert eller med hydroksy, halogen , amino, merkapto, laverealkyltio eller en fenylrest, substituert laverealkyl, eller

Ry og Rg betyr sammen alkylen med 3 eller 4 karbonatomer, og

<r>esten<e> R1Q , r^ og R^2 betyr uavhengig av hverandre karboksy, trimetyl-silyloksykarbonyl, usubstituert eller med en tenylrest substituert laverealkoksykarbonyl eller karbamoyl, som er usubstituert eller substituert med nitrogenatornet med usubstituert eller med karboksy, laverealkoksykarbonyl eller karbamoyl substituert laverealkyl, eller

R^^ betyr også hydrogen,

med den forholdsregel at minst en fri hydroksy-, amino, merkapto- eller karboksygruppe er tilstede i en utgangsforbindelse med formel Ila, idet fremgangsmåten er karakterisert ved at man kondenserer et eventuelt med broledd sammenknyttet antigen med eventuelt med broledd sammenknyttede muramylpeptider med formel Ila, idet en av de to reaksjonskomponenter minst har en fri amino-, hydroksy- og/eller merkaptogruppe og den andre har minst en karboksylsyregruppe, og hvis ønskelig, påkondenseres en dannet forbindelse analogt til ovennevnte til en eventuelt med broledd forbundet bærer, idet en av dé to reaksjonskomponentene minst har en fri amino-, hydroksy- og/eller merkaptogruppe, og den andre har minst en karboksylsyregruppe.

Med antigen forstår man her et organisk stoff som av et fysiologisk medium, dvs. et menneskelig eller dyre-organisme erkjennes som immunologisk fremmed eller som under egnede forutsetninger kan erkjennes som fremmed.

Til antigenene tilhører i første rekke samtlige stoffer som forårsaker spesifikk immunisering av en levende organisme mot smittsomme sykdomsfrembringere eller uønskede reaksjoner såsom allergisk sensibilisering eller abstosering av transplantert fremmedvev. Spesielt er her antigen som innholdsstoff i vaksiner innbefattet.

Som vaksiner kommer spesielt slike i betraktning som innenfor rammen av klassisk podningsteknikk anvendes for spesifikk immunologisk beskyttelse mot infeksjonssykdommer. Som antigen, som inneholdes i slike vaksiner, kommer de svek-kede levende eller døde, modifiserte eller avbyggede frembringere av infeksjonssykdommer, toksoider eller naturlige eller syntetiske fremstilte delkomponenter av frembringerne og toksoidene på tale. Som klassé åv sykdomsfrembringere nevnes spesilet: virus, chlamydier, rikettsier, bakterier, protozoer og metazoiske parasitter. Foretrukne antigener er slik som er egnet som bestanddeler i vaksiner som anvendes til behandling til f. eks. influensa A og B, parainfluensa 1-3, respira-toriske sykdommer som skyldes respiratorisk synkytialvirus, rhinovirus eller adenovirus, cytomegali, røde hunder, meslinger, kusma, pertussis, polomylitt, herpes simpleks 1 og 2, vari-zella; og herpes zoster, rotavirus-sykdommer, hepatitt A, B og andre, hundegalskap, munn- og klovsyke, trakom, karies, menin-gitider som er forårsaket av meningokokker A, B og C, sykdommer som skyldes pneumokokker, H. influensa, streptokokker (spesielt reumatisk feber), pseudomonas og proteus, tyfus, paratyfus og andre tarmsykdommer som skyldes enterobakterier, gonorre, syfilis, malaria, trypanosomiaser (sovesykdommer og Chagas-sykdom), leishmaniose, filrariose, schistosomiase, ankylostom-iaser og andre sykdommer.

På den annen side skal det nevnes nye vaksiner

som ikke vender seg mot frembringere av infeksjonssykdommer, men mot legemsegne bestanddeler, dvs. normale og avvikende autoantigener eller mot sensibiliserende omverdensantigener, dvs. mot allergener.

I noen tilfeller tilstrebes det å oppheve funk-sjonen av legemsegne molekyler (f. eks. av hormoner, av andre mediatorer og av humorale og cellestående reseptorer) mot normale eller avvikende autoantigener eller å oppheve utbre-delsen eller persistensen av avvikende, spesielt neoplastiske cellelinjer. Foretrukne antigener som bestanddeler for slike vaksiner er f. eks.: delsekvenser av menneskelig' choriongonado-tropin eller deler av spermatozoer for immunisering mot mediatorer for fertilitet og dermed til immonologisk utsjalting av reproduksjonsfunksjonen, mediatorer for betennelsesprosesser, og spesielt i ren form, derunder lymfokiner som avsondres av lymfocytter og spesielt MIF (macrophage migration inhibitory factor) for immunologisk undertrykkelse av betennelsessykdommer, immunologisk spesifikk antigenreseptorer fra lymfocyter og antistoff (fraksjonerte antigenspesifikke lymfocyter, antigenreseptorer som er ekstrahert fra disse lymfocyttene, fraksjonerte, antigenspesifikke antistoffer eller antistoff-fragment-er) til antiidiotype-immuniserung (immunisering mot de auto-antigene som er karakteristiske for antigenreseptor-strukturene) med de formål å sjalte ut spesifikke immunreaksjoner for å eliminere sykdomsfremkallende immunoprosesser' såsom autoimmuni-tet (f. eks. mot synovialantigener og immunglobulin ved den primære kroniske polyartritis, mot myelinkomponentene ved degenerative sykdommer i sentralnervesystemet, mot TSH-reseptorer ved autoimmun tyreoidititt, mot acetylcholinreseptorer i den tverrstripede muskulatur ved myasthenia gravis, mot enkeltcellekomponenter ved juvenil diabets etc.) eller allergi (f. eks. mot gresspollen, støv eller medikamenter ved allergisk astma, allergisk rhinitt eller legemiddeloverømfintlighet) eller for reduksjon av i og for seg normal, men uønsket immunreaksjoner (f. eks. induksjon av immuntoleranse for å hindre ut-støtning av transplanterte, fremmede organer og vev), autologe eller med disse kryssreagerende homologe eller heterologe tumorceller, tumorcellefragmenter eller tumorcellemembran-komponenter deriblant onkornavirus-kodierte glykoproteiner såsom GP 70, for tumorspesifikk immunisering innenfor rammen av profylaks og terapi ved kreftsykdommer.

I alle tilfeller er det ønsket ved hjelp av immunisering mot allergenene i stedet å indusere det patogenetisk relevante IgE-antistoffsvar overveiende eller i den omgivende masse av IgG- og IgA-antistoff mot de sensibiliserende omverdensantigener og dermed fange opp i sirkulasjon og i sekretene allergenene ved spesifikke antistoffer, før de reage-rer med IgE-antistoffer som er bundet med fettceller og dermed kan utløse frigjøringen av allergiske mediatorer. Ved denne antigenspesifikke desensibilisering er allergenene selv, dvs. f. eks. gresspollen, støv eller medikamenter, antigenbe-standdelene i vaksinen.

Antigenene kan, spesielt når de er lavmolekylære, gjennomgående også med fordel, være kovalent bundet til en høymolekylær bærer. Som bærere skal spesielt nevnes polymere av melkesyrer og dens derivater som har en fri karboksylgruppe i kjedeenden, såsom dens estere med glykolsyre, polymelkesyre-amider eller melkesyrepolyesteramider såsom de som f. eks. er beskrevet i engelsk patent nr. 9 32 382, videre alginsyre, poly-galakturonsyre, pektinsyre, karboksymetylcellulose eller agarose. Videre kommer basiske, nøytrale eller sure polyaminosyrer som ikke selv er immunogene såsom polyasparaginsyre, polyglutamin-syre, polylysin eller polyornitin på tale som bærere. Som bærere kommer også forøvrig passende andre antigener innenfor rammen av den definisjon som er gitt foran eller som er gjengitt i de angitte eksempler i betraktning, i den utstrekning som en immunreaksjon mot disse kommer på kjøpet eller er ønsket. Således kan f. eks. et HCG-peptid være kovalent bundet til tetanustoksoid som bærer.

De forskjellige deler av de nye antigenderivater

er bundet kovalent med hverandre, dvs. at antigenet er forbundet med minst en av sine funksjonelle grupper direkte eller gjennom et broledd (Spacer) forbundet med resten av muramylpeptidet ved slik forbindelse som er vanlig i peptidkjemien.

Som broledd skal det i første rekke nevnes a,fi-diamino-alkaner, spesielt a,fi-diamino-laverealkaner,

såsom etylendiamin, propylendiamin, tetrametylendiamin, alkyl-dikarbonsyrer, såsom ravsyre eller glutarsyre, a,8 eller y-aminoalkankarbonsyrer fortrinnsvis a-amino-laverealkan-karbonsyrer og spesielt de naturlige a-amino-laverealkan-karbonsyrer såsom glycin, 3-alanin, L-alanin, a-amino-iso-smørsyre, valin eller leucin.

De nevnte antigenderivater kan f. eks. ha den følqende formel hvor A betyr resten av antigenet, T betyr resten av bærereren, MP betyr resten av muramylpeptidet, Z' og Z"<1> bivalente broledd og hvor X<1>,X",X"<1> og X»<v> er kovalente forbindelsestyper, q, r, og t betyr uavhengig av hverandre 0 eller 1, og m og n er hele tall større enn 0.

Alkyl er rett eller forgrenet alkyl med opptil

18 karbonatomer som er bundet i passende stilling, men i første rekke laverealkyl.

Fenyl, kan f. eks. være mono-, di- eller polysubsti-tuert f. eks. med laverealkylgrupper, hydroksy, laverealkoksy, laverealkylendioksy, halogenatomer og/eller med trifluormetyl-grupper.

I første rekke er fenyllaverealkyl benzyl eller fenyletyl, hvor fenylkjernen kan være mono-, di- eller poly-substituert.

Alkanoyl har fremfor alt 2-18 karbonatomer og er i første rekke laverealkanoyl.

De rester som i forbindelse med den foreliggende beskrivelse og patentkravene benevnes som "lavere" er rester og forbindelser som fortrinnsvis inneholder opptil 7 og i første rekke opptil 4 karbonatomer.

I det foranstående og i det etterfølgende har de alminnelige begreper følgende betydning: Laverealkyl er f. eks. n-propyl, n-butyl, isobutyl, sek.-butyl eller tert.-butyl, videre n-pentyl, n-heksyl, isoheksyl eller- n-heptyl og i første rekke metyl eller etyl. Fenyl-laverealkyl er laverealkylresten spesielt metyl eller etyl, hvor fenylresten har den ovennevnte betydning.

Laverealkoksy er f. eks. n-propoksy, n-butoksy, iso-butoksy, sek.-butoksy eller tert.-butoksy og i første rekke metoksy eller etoksy.

Laverealkylmerkapto er f. eks. n-propyl-, n-butyl-, isobutyl, sek.-butyl eller tert.-butylmerkapto og i første rekke metylmerkapto eller etylmerkapto.

Laverealkylendioksy er spesielt metylendioksy, etylen- eller propylendioksy.

Halogen er fluor eller brom, fortrinnsvis klor.

Laverealkanoyl er spesielt propionyl eller

butyryl, og i første rekke imidlertid acetyl.

De nye antigenderivater ifølge oppfinnelsen kan foreligge i form av blandinger av isomerer eller av rene isomerer.

Det er kjent at muramylpeptider er gode tilsats-stoffer som i egnet blanding med antigener kan øke deres immunogenitet. Det har imidlertid vist seg at de bare har en meget kort virksomhetstid, da de relativt raskt utskilles av den menneskelige eller dyre-organismen. Fremfor alt kan de bare anvendes under bestemte betingelser som ikke er spesielt egnet for kliniske formål, nemlig i blanding med antigen i en emulsjon med mineralolje for å indusere en in vivo celleformidlet immunitet mot løselige antigener. De nye antigenderivater ifølge oppfinnelsen bringer ikke bare en utpreget stig-ning i immunitetsevnen hos antigenet, men også en celleformidlet immunitet under kliniske akseptable betingelser som vil bli vist i de etterfølgende eksempler.

1. Potensiering av celleformidlet immunitet in vivo: Økning av sen-overømfintlighet som bovintserumalbumin (BSA)

og mot schaferytrocyter ( SRBC) i marsvin.

Pifbright marsvin immuniseres på dag 0 med 1 mg BSA eller 1 mg SRBC-"Ghosts" (SRBCG) (ytre membran av SRBC)

i fullstendig Freundsk adjuvans ved injeksjon hos hver på 0,1 ml av en antigen-adjuvans-blanding i begge bakpoter. 3 uker senere utløses hudreaksjonen ved intrakutan injeksjon av 100

yg BSA eller 100 pg SRBCG i 0,1 ml buffert fysiologisk salt-oppløsning og kvantifisert på grunnlag av reaksjonsvolumet beregnet etter erytemflaten og tykkeIsesøkningen i huden 24 timer senere. Det observerte antigenspesifikke økning i reaksjonsvolumet etter 24 timer (senreaksjonen) gjelder som et mål for den celleformidlede immunitet. BSA og SRBCG er for svake immunogene for alene eller i en vann-i-olje-emulsjon med ufullstendig Freundsk adjuvans (10 deler BSA-løsning eller SRBCG-suspensjon i 0,9 % NaCl blandet med 8,5 deler "Bayol F" (parafinolje, hydrokarbonfraksjon fra jordolje) og 1,5 deler "Arlacel A "(manniton-monooleat) å indusere sen-reaks jon, men må, for en effektiv immunisering i fullstendig

adjuvans tilsettes mycobakterier (5 mg avlivede og lyofili-serte M, butyricum pr. 10 ml "Bayol F"/"Arlacel A").

I stedet for mycobakterier tilføres de nye antigenderivater som inneholder som antigen BSA (1 mg BSA, 60 ug MDP pr. dyr) eller som antigen SRBCG (1 mg SRBCG, 25 ug pr. dyr) enten som en antigen-olje-blanding eller suspendert i karboksymetylcellulose (CMC). De nye antigenderivater indu-serer i fravær av mycobakterier i den beskrevne forsøksmeto-dikk sentypereaksjoner.

En signifikant potensiering av sentypereak-tiviteten mot BSA og mot SRBCG kan også oppnås om man ikke inkorporerer de nye antigenderivater i fullstendig Freundsk adjuvans, men tilføres suspendert i CMC. Spesielt virksomt viser den intramuskulære tilførsel å være i dette tilfellet. Under disse omstendigheter var en tilsvarende mengde fri muramylpeptid som ble tilført CMC-blandingen, vesentlig mindre aktiv enn den nye virksomme substans. Dermed er det vist at de nye forbindelser er i stand til å indusere celleformidlet immunitet under klinisk akseptable betingelser,

dvs. ved tilførsel med legemsvennelige følgestoffer, sågar overfor et løselig proteinantigen. 2. Potensiering av celleformidlende immunitet in vivo: Økning av sen- overømfintlighet mot BSA og mot SRBCG i mus.

MAG-hannmus immuniseres pa dag 0 med trinnvise doser med antigen som ikke er konjugert med muramylpeptid (BSA-agarose eller SRBCG) eller med antigener som er konjugert med muramylpeptid (BSA-agarose eller SRBCG). BSA-agarose -prepara ter tilføres subkutant i en dosering på fra 0,1 til 100 vig (tilsvarer ved de nye forbindelser med muramylpeptider en dosering på den virksomme substans på fra 0,0029-6 pg pr dyr) i et volum på 0,2 ml puffret fysiologisk koksaltoppløsning. SRBCG-preparatet ble tilført i en dosering på fra 0,01 - 3 mg (tilsvarende ved de nye antigenderivater med muramylpeptider en dosering på den virksomme substans på fra 0,25 - 75 pg pr. dyr) i et volum på 0,5 ml i puffret, fysiologisk saltoppløsning intraperitonealt eller 0,05 ml intradermalt eller fordelt i 3 fotpoter.

4 til 20 dager senere utløses sentypereaksjonen

ved injeksjon av 100 yg BSA eller 10 Q SRBCG i 20 yg puffret fysiologisk saltløsning i den venstre bakpote og reaksjonsvolumet ble kvantifisert etter 24 og 48 timer på grunn av oppsugningen i poten.. Den observerte, antigenspesifikke økning av volumet i poten er et mål for den celleformidlede immunitet.

Fra dag 14 etter immunisering med BSA-agarose-MDP-forbindeIse opptrer også den meget lave dosering (0,1 yg, tilsvarende 0,006 yg virksomt substans( utpreget sentype-reaksjoner. I motsetning til dette er fri BSA-agarose ikke i stand til å sensibilisere for sentype-reaksjoner. SRBCG-MDP-forbindelser (MDP = muramylpeptid), og fremfor alt intradermal tilførsel, er i stand til å indusere sentypereaktivitet som er vesentlig tydeligere enn den man får etter sensibilisering med SRBCG som ikke er forbundet med muramylpeptid.

Dermed er det vist at de nye antigenderivater i vesentlig grad er i stand til å øke den cellepregede immunitet.

3. Potensiering av humoral immunitet in vivo:

Økning av antistoffproduksjon mot BSA i mus.

NMRI-mus immuniseres ved intraperitoneal injeksjon av 0,1 til 100 yg BSA forbundet med muramylpeptider (0,0014 til 6,0 yg virksom substans) på dag 0. 10, 17 og 28 dager senere tas serumprøver og innholdet av anti-BSA antistoff undersøkes med en passiv hemaglutinasjonsteknikk. I den anvendte dosis er fri BSA for forsøksdyrene subimmunogen, dvs. en formår å utløse enten ingen eller bare en ganske liten produksjon av antistoff. Antigenderivatet av BSA med et muramylpeptid gjør det mulig med 2-3 gangers økning av antistoff-tallet i serum (tallsummen av log2 talldifferansen ved tre blodprøver). Videre er det bemerkelsesverdig at de nye antigenderivater som er koplet bare til agarose som bærer,

er ennå sterkere immunogen etter intraperitoneal eller subkutan tilførsel.

På grunn av de angitte forsøk er det vist at antigenderivatene fremstilt ifølge oppfinnelsen også er i stand til i vesentlig grad å øke den humorale immunitet.

De nye antigenderivater er nye eller forbedrede kjente vaksinas jonsstof f er og tjener til nye vaksinas jonsrne-toder eller til forenkling av anvendte metoder (idet f. eks. antallet innsprøytninger som er nødvendig for å opprettholde beskyttelsen over et lengre tidsrom, kan senkes).

Oppfinnelsen vedrører spesielt fremstillingen av

nye antigenderivater som inneholder antigen som innholdsstoff i vaksine mot parasitter, bakterier, virus, tumorceller, fysiologisk legemsegne bestanddeler, deres modifiserte former eller underenheter av disse som eventuelt er kovalent bundet over et broledd til et muramylpeptid med formel II, hvor R^, R^, R^,

Rg og Ry er hydrogen, X er karbonyl og R2 er eventuelt laverealkyl som er substituert med hydroksy eller laverealkoksy eller eventuelt fenyl som er substituert med hydroksy, laverealkoksy, laverealkyl eller halogen og hvor Rg, R^, R1Q/R^i' Ri2 og R13 har den ovenfor angitte betydning.

Oppfinnelsen vedrører spesielt fremstilling av

nye antigenderivater som inneholder antigen som innholdsstoff i vaksine mot parasitter, bakterier, virus, tumorceller, fysiologisk legemsegne bestanddeler, deres modifiserte former eller underenheter som kovalent er bundet over et broledd til et muramylpeptid med formel II, hvor R^, R^, Rg og R? er hydrogen,

X er karbonyl, R2 er laverealkyl som eventuelt er substituert med hydroksy eller laverealkoksy eller fenyl som eventuelt er substituert med hydroksy, laverealkoksy, laverealkyl eller halogen og hvori R3 er metyl og Rg, Rg, R1Qf Rn' Ri2 og R13 har den ovenfor angitte betydning.

Oppfinnelsen vedrører i første rekke fremstilling av nye antigenderivater som inneholder antigen som innholds-stof f i vaksine mot parasitter, bakterier, virus eller tumorceller, fysiologisk legemsegne bestanddeler, deres modifiserte former og underenheter og som eventuelt er kovalent bundet over et broledd til muramylpeptid med formel II, hvor R^, R4,

Rg og R13 er hydrogen, X er karbonyl, R2 er eventuelt laverealkyl som.er substituert med hydroksy eller metoksy og fenyl som eventuelt er substituert med hydroksy/ metoksy, metyl, etyl eller halogen, R, er hydrogen eller metyl, Ry og Rg er hydrogen, Rg er laverealkyl, laverealkylmerkapto-laverealkyl, hydroksy-laverealkyl, benzyl, p-hydroksybenzyl eller fenyl og hvor R-^q/ R1^<p>g R^2 er karboksyl, laverealkoksykarbonyl eller karbamoyl og hvor R^1 også er hydrogen.

Oppfinnelsen vedrører fremfor alt fremstillingen av nye antigenderivater som inneholder antigener som innholds-stof f i vaksine mot parasitter, bakterier, virus, tumorceller, fysiologisk legemsegne bestanddeler, deres modifiserte former og underenheter, som eventuelt er bundet over et broledd til muramylpeptidet med formel II hvor R.. , R4, Rg og R13 er hydrogen,

X er karbonyl, R2 er laverealkyl som eventuelt er substituert med hydroksy eller metoksy eller fenyl som eventuelt er substituert med hydroksy, metoksy, metyl, etyl eller halogen,

R3 og Rg er hydrogen eller metyl, Rg er metyl, etyl, n-propyl, i-propyl, 2-metylpropyl, metylmerkaptometyl, hydroksymetyl, hydroksyetyl, fenyl, benzyl, eller p-hydroksybenzyl og hvor <R>10' <R>ll°g R12 er karboksv' laverealkoksykarbonyl eller karbamoyl, og hvor R^ også er hydrogen.

Oppfinnelsen vedrører også fremstillingen av nye antigenderivater som inneholder antigen som innholdsstoff i vaksine mot bakterier, virus, tumorceller, fysiologisk legemsegne bestanddeler, deres modifiserte former og underenheter av disse kovalent bundet eventuelt over et broledd til muramylpeptidet med formel II hvor R^, R^, Rg og R13 er hydrogen, X er karbonyl, Ry og Rg er sammen propylen eller butylen og hvor R2, R3, Rg, R"lq/ R^^°9 Rj2 ^ar ^en ovenfor angitte betydning.

Broledd i de ovennevnte definisjoner er spesielt 01,0, -diamino-laverealkaner, laverealkyl-dikarbonsyre, naturlige a-amino-laverealkankarboksylsyrer.

Spesielt vedrører oppfinnelsen fremgangsmåte til fremstilling av de nye antigenderivater som er beskrevet i eksemplene.

De nye forbindelsene kan fremstilles på i og for seg kjent måte.

Kondensasjonen ifølge oppfinnelsen ved fremstilling av antigenderivatene foregår ved at man f. eks. omsetter den ene reaksjonskomponent i form av en aktivert karbonsyre med den andre reaksjonskomponent som fri amino-, hydroksy- eller mer-kaptoforbindelse. Den aktiverte karboksylgruppen kan f. eks. være et syreanhydrid, fortrinnsvis et syreazid, et syreamid, såsom et imidazolid, isooksazolid eller en aktivert ester. Som aktivert ester skal spesielt nevnes: cyanmetylester, karboksymetylester, p-nitrofenyltioester, metoksyetyltioester, acetyl-aminoetyltioester, p-nitrofenylester, 2,4,5-triklorfenylester, N-hydroksysuccinimidester, N-hydroksyftalimidester, 8-hydroksykinolinester, N-hydroksypiperidinester. Aktive estere kan også eventuelt tilveiebringes med et karbodiimid under tilsats av N-hydroksysuccinimid eller en usubstituert N-hydroksybenzotriazol eller 3-hydroksy-4-okso-3, 4-dihydro-benzoi/~d7-l, 2 , 3-triazon eller disse forbindelser substituert med f. eks. halogen, metyl eller metoksy.

De avgangsgrupper som anvendes under kondensasjonen må være ugiftige eller også godt fjernbare, for å forhindre at de mest høymolekylære forbindelser holder tilbake giftige del-stykker ved adsorpsjonen.

Man foretrekker av denne grunn som aktive estere slike med N-hydroksysuccinimid og deres C-substitusjonsprodukter såsom N-hydroksy-metyl- eller -dimetylsuccinimid eller omset-ning med karbodiimid, såsom karbodiimid selv eller l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid.

Den ovennevnte reaksjonen gjennomføres på kjent måte i fravær eller nærvær av fortynnings-, kondensasjons-og/eller katalytiske midler, og om nødvendig, ved oppvarming eller avkjøling. Fortrinnsvis arbeider man i vandig miljø i et pH-område fra 6-9, og i første rekke fra 7-8 for ikke å nedbryte antigenene.

Oppfinnelsen omfatter også slike utføringsformer

for fremgangsmåten hvor man avbryter fremgangsmåten på et hvilket som helt trinn og går ut fra en forbindelse som opp-står som et mellomprodukt og gjennomfører de etterfølgende reaksjonstrinn, eller hvor man fremstiller utgangsstoffene under reaksjonsbetingelsene eller hvor man anvender reaksjonskomponenter i form av isomérblandinger eller rene isomerer.

For gjennomføring av kondensasjonen ifølge oppfinnelsen anvender man fortrinnsvis slike utgangsmaterialer som med en gang fører til spesiélt ønskede grupper endestoffer og fremfor alt til de spesielt beskrevne eller foretrukne endestoffer .

De anvendte utgangsstoffer er kjent eller kan fremstilles på i og for seg kjent måte.

De nye muramylpeptider med formel Ila som anvendes som utgangsstoffer, hvor X er en karbonylgruppe, minst en av restene , Rg og R^^ er laverealkyl, og i første rekke metyl og de andre hydrogen, og hvori de øvrige substituentene har ovennevnte betydning, kan fåes når man på i og for seg kjent måte kondenserer en forbindelse med formelen

hvor X, R2, R3 og R^ har den ovenfor angitte betydning og hvor R°, R° og R° er restene R^, R^ eller Rg eller er en lett avspaltbar beskyttelsesgruppe eller et derivat av dette med en forbindelse med formelen

hvori Rg, R-|.o' Rll og R12 * iar ^en sairane betydning som Rg, R-^ q/ <R>ll og R12 mec^ det ti1!6?? at tilstedeværende karboksy- og, om ønskelig, frie hydroksylgrupper i disse restene er beskyttet med lett avspaltbare beskyttelsesgrupper og eventuelt avspaltede tilstedeværende beskyttelsesgrupper.

Kondensasjonen foregår derved at man f. eks. omsetter forbindelsen med formel IV i form av den aktiverte karbonsyre med aminoforbindelsen V eller ved at man omsetter syren IV med forbindelsen V, hvor aminogruppen foreligger i aktivert form. Den aktiverte karboksylgruppen kan f. eks.

være et syreanhydrid, fortrinnsvis et blandet syreanhydrid såsom et syreazid, et syreamid, såsom et imidazolid, isoksa-zolid eller en aktivert ester. Som aktiverte estere skal spesielt nevnes: cyanmetylester, karboksymetylester, p-nitrofenyltioester, p-nitrofenylester, 2,4,5-triklorfenylester, pentaklorfenylester, N-hydroksysuccinimidester, N-hydroksyftalimidester, 8-hydroksykinolinester, 2-hydroksy-l,2-di-hydro-l-karbetoksy-kinolinester, N-hydroksypiperidinester eller enolester, som fremstilles med N-etyl-5-fenyl-isoksa-zolium-3<1->sulfonat. Aktiverte estere kan også tilveiebringes med et karbodiimid under tilsats av N-hydroksysuccinimid eller et usubstituert 1-hydroksybenzotriazol eller denne forbindelsen substituert med halogen, metyl eller metoksy og 3-hydroksy-4-okso-3,4-dihydro-benzo/ d/-l,2,3-triazin.

Aminogruppen er f. eks. aktivert ved reaksjon med et fosfitamid.

Av disse metodene er reaksjonen med aktiverte estere og spesielt de med N-etyl-5-fenyl-isoksazolium-31 - sulfonat (Woodward Reagens K) eller 2-etoksy-l,2-dihydro-l-karbetoksy-kinolin eller karbodiimid foretrukket.

Lett avspaltbare beskyttelsesgrupper er slike som er kjent fra peptid- eller sukkerkjemien. For karboksygrupper skal spesielt nevnes tertiær -butyl, benzyl ellerbenzhydryl og for hydroksygrupper spesielt acylrester, f. eks. laverealkanoyl-rester, såsom acetyl, aroylrester såsom benzoyl og fremfor alt rester som kan avledes fra karbonsyre såsom benzyloksykarbonyl eller laverealkoksykarbonyl eller alkyl, spesielt tert.-butyl, benzyl eller tetrahydropyranyl som eventuelt er substituert med nitro, laverealkoksy eller halogen eller eventuelt substi-tuerte alkylidenrester som forbinder oksygenatomene i 4- og 6-stilling. Slike alkylidenrester er spesielt en laverealky-lidenrest og i første rekke etyliden-, isopropyliden- eller propylidenrester eller også en benzylidenrest som eventuelt er substituert og fortrinnsvis i p-stilling.

Disse beskyttelsene kan avspaltes på i og for

seg kjent måte. Således kan de fjernes hydrogenol ytisk, f. eks. med hydrogen i nærvær av en edelmetall-, såsom palladium-eller platin-katalysator eller ved syrehydrolyse.

De anvendte utgangsstoffer er kjent eller kan fremstilles på i og for seg kjent måte.

En annen fremgangsmåte for fremstilling av disse

nye utgangsstoffene består i at man kondenserer en forbindelse

med formel VI

hvor R2, R°, R3, R°, R°, R^ og Rg har den ovennevnte betydning med en forbindelse med formelen

hvori R-^Q/ R-^° og R^° har den ovennevnte betydning med det tillegg at karboksylgrupper og, om man ønsker dette, frie hydroksygrupper som er til stede i restene R?, R, ° og Rn° og R12 er beskyttet med lette avspaltbare beskyttelsesgrupper

og eventuelt avspaltede beskyttelsesgrupper.

Kondensasjonen foregår ved at man .f. eks. omsetter forbindelsene VI i form av den aktiverte karbonsyre med aminoforbindelsen med formel VII eller at man omsetter syren VI med forbindelsen VII, hvor aminogruppen foreligger i aktivert form. Den aktiverte karboksylgruppe kan eventuelt være et syreanhydrid, fortrinnsvis et blandet syreanhydrid, et syreamid eller en aktivert ester. Som slike kommer i første rekke de ovennevnte syreanhydrider, amider eller estere på tale. Aminogruppen er fortrinnsvis aktivert f. eks. ved en reaksjon med et fosfitamid.

Også de lett avspaltbare beskyttelsesgrupper tilsvarer de som nettopp er nevnt. De kan avspaltes på i og for seg kjent måte, f. eks. hydrogenolytisk, f. eks. med hydrogen i nærvær av en edelmetallkatalysator såsom palladium- eller platinakatalysator eller ved syrehydrolyse.

Utgangsstoffene kan fremstilles på i og for seg kjent måte. Således kan f. eks. et i 3-stilling usubstituert sukker omsettes med et halogen-R^-acetamido-R^g-eddiksyre eller en forbindelse med formel IV med en amino-R,0-eddiksyre, hvor karboksylgruppen er beskyttet på den ovenfor angitte måte og beskyttelsesgruppen avspaltes.

En annen fremgangsmåte for fjernelse av en sidekjede som sitter i 3-stilling på sukkerresten består i at man omsetter en forbindelse med formel VIII. hvor X, R2, R°, R°, R° og R. , har den ovennevnte betydning og hvor eventuelt tilstedeværende hydroksygrupper er beskyttet med en lett avspaltbar beskyttelsesgruppe med en forbindelse med formelen

hvor Z er en reaksjonsvillig, forestret hydroksygruppe og R^, Ry, Rg, Rg, R-^Q» R-^° og R^2 har ^en ovenfor angitte betydning,

og eventuelt avspaltede tilstedeværende beskyttelsesgrupper.

En reaksjonsvillig, forestret hydroksygruppe er spesielt hydroksygengruppen som er forestret med en sterk uorganisk eller organisk syre, i første rekke en som er forestret med halogenhydrogensyrer, såsom klor-, brom- eller jodhydrogensyre.

De lett avspaltbare beskyttelsesgruppene tilsvarer de som allerede er nevnt. De kan avspaltes på i og for seg kjent måte, f. eks. hydrogenolytisk f. eks. med hydrogen i nærvær av en edelmetallkatalysator såsom en palladium- eller platinakatalysator eller med syrehydrolyse.

De nye muramylpeptider med formel Ila som anvendes som utgangsstoffer hvor X er en karbonylgruppe, og R^,

R^ og Rg er trimetylsilyl, og de øvrige substiutenter har overnevnte betydning, kan fåes som angitt i norsk søknad 793993.

De etterfølgende eksempler illustrerer den ovenfor beskrevne oppfinnelse, og temperaturen angis i Celsius-grader .

Eksempel 1

Til en oppløsning av 1 g okseserumalbumin i

100 ml av en 0,1 M natriumhydrogenkarbonat-0,5 M koksaltopp-løsning tilsettes under omrøring 500 mg 2-acetamido-3-0- \^~ L- 1-(D-l-karbamoyl-3-succinimidooksykarbonyl-propyl)-karbamoyl-etyl/-karbamoyl-metylJ -2-deoksy-D-glukose. Oppløsningen om-røres i 4 timer ved værelsestemperatur og deretter sterilfiltreres (MF-Milipore, 0,45 ym filter). Det konjugerte okseserumalbumin skilles i dialfiltrasjonsmetoden med et Amikon UM-10-filter fra lavmolekylære reaksjonsprodukter eller fra salter og frysetørkes.

Den kvantitative bestemmelse til det muramylpeptid som er bundet til okseserumalbumin foregår etter Morgan-Elson reaksjon etter modifikasjnen av J.M. Ghuysen

et al (1 "Methods in Enzymology" 8,(1966) 629). Gjennom-snittlig finnes 6 yg muramylpeptid i 1 mg okseserumalbumin-forbindelse.

Succinimidoesteren som anvendes som utgangs-

stof f skal fremstilles på følgende måte:

1 mmol 2-acetamido-3-0- [/~L-1-(D-l-karbamoyl-3-karboksy-propyl) -karbamoyl-etyl7-karbamoyl-metyl ) -2-deoksy-D-glukose, 1 mmol dicykloheksylkarbodiimid og 1,1 mmol N-hydroksysuccinimid oppløses i 3 ml absolutt dimetylformamid og omrøres i et lukket kar under utelukkelse av vann i 2 0 timer. Det utfelte dicykloheksylurinstoff fraskilles, løs-ningsmidlet avdampes i høyvakuum og resten behandles med eter, avsuges og tørkes. Den tilveiebragte succinimidooksyester kan oppbevares under utelukkelse av fuktighet f. eks. i en nitrogenampulle.

Eksempel 2

Kondensasjonen av antigenderivatet fra eksempel 1 på aktivert agarose; derved anvender man et kommersielt til-gjengelig agarosederivat fra BIO-RAD, Affi-Gel 10. På et agaroseskjelett inneholdende eter-sidekjede ("spacer arms")

av N-alkyl-succinamider som er forestret med N-hydroksysuccinimid .

Man oppløser 120 mg okseserumalbumin-derivat ifølge eksempel 1 i 12,5 ml 0,1 M fosfatpuffer, pH 7,3 ved 4°C. 500 mg Affi-Gel 10 suspenderes deretter i oppløsningen ved omrysting og rystes 4 timer ved 4°C. De ennå gjenværende, aktive estergrupper omsettes ved 3 0 minutters behandling med en 1 M etanolamin.HCl-0,1 M fosfatpufferløsning (pH 7,3). Deretter fylles gelen i en kolonne og vaskes først med 200 ml 0,1 M fosfatpuffer-1 M koksaltløsning (pH 7,3) deretter med 20 ml fysiologisk koksaltoppløsning.

Bestemmelsen av okseserumalbumin-muramylpeptid-forbindelser som er kondensert til Affi-Gel 10 foregår ved kvantitativ analyse av representative okseserumalbuminamino-syrer i totalhydrolysater av definerte gel-prøver. Gjennom-snittlig ble 9-10 mg okseserumalbumin-muramylpeptid-derivater bundet til 1 ml svellet Affi-Gel 10.

Eksempel 3

Scaferytrocyttmembraner fremstilles av friskt Schafsblod etter metoden av Dodge, J.I. et al (Arch. Biochem. Biophys. 100, (1963) p. 114-180). Til en suspensjon av 500 mg Schaferytrocyttmembraner i 5 0 ml 0,1 M natriumhydrogenkarbonat - 0,1 M koksaltoppløsning tilsettes under omrøring 4 00 mg 2-acetamido-3-0- L-l-(D-l-karbamoyl-3-succinimido-oksykarbonyl-propyl)-karbamoyl-etyl7_karbamoyl-metyl j - 2-deoksy-D-glukose og blandingen omrøres i 4 timer ved værelsestemperatur. Deretter sedimenteres erytrocyttmembran-konjugatet ved en times ultrasentrifugering ved 90.000 g og 4°C. Sedimentet vaskes tre ganger - hver gang fulgt av suspendering og ultrasentrifugering - med fosfatpuffret koksaltoppløsning og en gang med destillert vann. Det vaskede erytrocyttmembran-kon jugat suspenderes i 100 ml destillert vann og frysetørkes.

Den kvantitative bestemmelse av muramylpeptid

som er bundet til schaferytrocytter foregår med Morgan-Elsons reaksjon og gir 25 yg muramylpeptid pr. 1 mg erytrocyttmembran.

Eksempel 4

100 mg gruppe C polysakkarid av Neisseria meningi-tidis og 110 mg (0,2 mol) 2-acetamido-3-0- [/~L-1-(D-l-karbamoyl-3-N-aminoetyl-karbamoyl-propyl)-karbamoyl-etyl/-karbamoyl-metylJ -2-deoksy-D-glukose-HCl oppløses i 10 ml destillert vann pg pH-verdien i oppløsningen innstilles på 5 med fortynnet saltsyre.

19,2 mg l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid. HC1 tilsettes under omrøring til oppløsningen. Blandingen omrøres i en time ved værelsestemperatur, pH-verdien holdes på 5 under tilsats av fortynnet natronlut, deretter tilsettes 5 ml 2 M natriumacetat-pufferoppløsning, pH 5, og blandingen omrøres i ytterligere 30 minutter. Derved innstilles pH-verdien med natronlut på 7. Løsningen sterilfiltreres og dialyseres ved 4°C mot destillert vann og frysetørkes deretter.

Den kvantitative bestemmelse av desmetylmuramyl-dipeptid som er koplet til C-polysakkarid foregår som i eksempel 1 med Morgan-Elsons reaksjon og gir 80 yg desmetylmura-myldipeptid pr. 1 mg polysakkarid.

Det anvendte 2-acetamino-3-0- L-l-(D-l-karbamoyl-3-N-aminoetyl-karbamoyl-propyl)-karbamoyl-etyl/-metyl J-2-desoksy-D-glukose-hydroklorid kan f. eks. fremstilles på

følgende måte:

1 mmol 2-acetamlno-3-0- [/~L-1-(D-l-karbamoyl-3-karboksy-propyl)-karbamoyl-etyl7-karbamoyl-metylJ -2-desoksy-D-glukose og 2 mmol N-etyl N1 -(3-dimetyl-aminopropyl)-karbodiimid. HC1 oppløses i 10 ml vann og pH innstilles på 5,0 med saltsyre, deretter tilsettes en oppløsning av 5 mmol etylen-diamindihydroklorid i 10 ml vann. Blandingen omrøres ved pH 5,0 og værelsestemperatur i 6 timer. Blandingen tas opp på en svak sur kation-ionebytterkolonne-Amberlite CG 50 II,

2,5 x 45 cm- og elueres med c;n lineær gradient av 0,05 M pyridinacetat, pH 6 (300 ml) til 0,5 M pyridinacetat, pH 3,7 (300 ml). Fraksjonene som inneholder 2-acetamino-3-0- f/~L-l-(D-l-karbamoyl-3-N-aminoetyl-karbamoyl-propyl)-karbamoyl-etyl7-karbamoyl-metylJ -2-desoksy-D-glukose-acetat - disse fraksjoner prøves og karakteriseres mot ninhydrin eller høyspenningselektroforese - frysetørkes. Omdannelsen til hydrokloridform foregår på følgende måte: Lyofilisatet løses opp i 6 ml 0,2 N HC1 og kromatograferes på en Bio-Gel P2-kolonne, 2,5 x 90 cm, med vann som elueringsmiddel. Fraksjoner som inneholder 2-acetamino-3-0- ^~L-1-(D-l-karbamoyl-3-N-aminoetyl-karbamoyl-propyl)-karbamoyl-etyl7_karbamoyl-metylJ-2-desoksy-D-glykose-hydroklorid frysetørkes. Preparatet er enhetlig i høyspenningselektroforesen. Ved bestemmelse av kontinuitetene i totalhydrolysatene finnes molforholdet 1 muramylsyre : 1 L-alanin : 1 D-glutaminsyre : 1 etylendiamin.

Eksempel 5

Umiddelbart etter utvinning suspenderes merozoitter av malariafrembringeren Plasmodium knowlesi - det totale ut-byttet fra blodet av en infisert Rhesus-ape (Metode for utvinning av merozoitter: se G.H. Mitchel et al. (1975), Immuno-logy 29, 397) - i en løsning av 100 mg (0,17 mmol) 2-acet-amino-3-O- L-l-(D-l-karbamoyl-3-succinimidooksy-karbonyl-propyl)-karbamoyl-etyl7-karbamoyl-metylJ -2- deoksy-D-glukose i 15 ml fysiologisk pufferoppløsning, pH 7,2. Suspensjonen inkuberes i en time ved 37°C. Deretter sedimenteres konjugatet ved sentrifugering. Sedimentet vaskes ved resuspensjon i fysiologisk pufferoppløsning, fulgt av ny sentrifugering.

Det vaskede merozoitt-konjugat suspenderes etter G.H. Mitchel (ref. se ovenfor) i 10 %-ig autolog Rhesusapeserum og fryse-tørkes.

Den kvantitative bestemmelse av muramyldipeptid som er koplet til merozitter foregår med Morgan-Elsons reaksjon og gir 4 0-6 0 ug muramylpeptid pr. 1 mg merozoitt.

Eksempel 6

I en oppløsning av 200 mg (0,34 mmol) 2-acetamino-3-0- \ l_ L-l- (D-l-karbamoyl-3-succinimidooksy-karbonyl-propyl) - karbamoyl-etyl7-karbamoyl-metylj -2- deoksy-D-glukose i 20 ml fosfat-puffret fysiologisk koksaltoppløsning, pH 7,2, suspen-derer man 10 qT-lymfoblaster av CBA/J mus. (T-lymfoblastene utvinnes i en "mixed lymphocyte culture" mot C57BL/6 mus sti-mulatorceller etter L.C. Anderson et al., (1977), The Journal og Experimental Medicine, 146, 1124). Suspensjonen inkuberes i 90 minutter ved værelsestemperatur. Deretter sedimenteres lymfoblast-konjugatet ved sentrifugering og vaskes ved ny suspendering i fosfat-puffret, fysiologisk koksaltoppløsning, fulgt av ny sentrifugering.

Den kvantitative bestemmelse av muramyldipeptid som er koplet til T-lymfoblaster følger av Morgan-Elsons reaksjon (se eksempel 1) og gir 6 0-70 ug muramylpeptid pr. IO<7> T-lymfoblaster.

Eksempel 7

På tilsvarende måte som i eksempel 1 får man okseserumalbumin koplet med

2-acetamido-3-0- \ D-l-^L-l-(D-l-karbamoyl-3-karboksy-propyl)-karbamoyl-etyl7-karbamoyl-etylJ -2-deoksy-D-glukose,

2-benzoylamino-3-0-[D-l-^~L-l-(D-l-karbamoyl-3-karboksy-propyl)-karbarir)yl-etyl7-karbarrDyl-etyl J -2-deoksy-a, B-D-glukose,

2-benzoylamino-3-0- [ /~L-1-(D-l-karbamoyl-3-karboksy-propyl)-karbamoyl-etyl7-karbamoyl-metyl} -2-deoksy-a,6-D-glukose,

2-acetamido-3-0-|^ L-l-(D-l-karbamoylmetyl-karbamoyl-3-karboksypropyl)-karbamoyletyl7-karbamoylmetylJ - 2-deoksy-D-glukose,

2- benzmido-2-deoksy-3-0- £ (L-l-(D-l-karbamoyl-3-karboksy-propyl)-karbamoyl-propyl/-karbamoylmetyl J -D-glu-kopyranose,

3- 0- [ /~L-1-(D-l-karbamoyl-3-karboksypropyl)-karbamoyletyl/-karbamoylmetyl ]-2- oksy-2-propionamido-D-glukose og

2-acetamido-3-0- L-l-(D-l-karbamoyl-3-karboksy-propyl)-karbamoylpropyiy-karbamoylmetyl J -2-desoksy-D-glukose. 2-acetamido-3-0- f/ L-l-(D-l-karbamoyl-3-karboksypropyl)-karbamoyl-2-hydroksyetyl/-karbamoylmetyl J -2-desoksy-D-glukose, 2-propionylamino-3-0- ^/_ L-l-(D-l,3-dikarboksy-propyl)-karba-moyletyl7_karbamoylmetylJ -2-desoksy-D-glukose,

2-benzoylamino-3-0-£ L-l- (D-l-N-karbamoylmetyl-karbamoyl-3-karboksy-propyl)-karbamoyl-etyl/-karbamoylmetylJ -2-desoksy-D-glukose ,

2-acetamino-3-0-{D-l-^ L-l-karbamoyl-3-karboksy-propyl7~karbamoyl-2'-metyl-propyl7_karbamoyletyl J-2-desoksy-D-glykose, 2-benzoylamino-3-0-f/~L-l-(d, 1,3-dikarboksy-propyl)-karbamoyl-etyl7-karbamoylmetylJ -2-desoksy-D-glukose,

2-acetamido-3-0- L-l-(D-l-karbamoyl-3-karboksy-propyl)-karbamoyl-21-metyl-propyl7-karbamoylmetyl^-2-desoksy-D-glukose, 2-acetamino-3-0- { D-1-/~L-1-(D-l-karbamoyl-3-(L-l-karboksy-etyl)-karbamoyl-propyl)-karbamoyletyl7_karbamoyletyl ^-2-desoksy-glukose,

2-acetamino-3-0- \/_ L-l-(D-l,3-dikarboksy-propyl)-karbamoyl-2'-metyl-propyl7-karbamoyl-metylj -2-desoksy-D-glukose, 2-acetamino-3-0- \ /~L-1-(D-l-karbamoyl-3-karboksy-propyl)-karbamoyl-N,N-tetrametylen7-karbamoyl-metyl J*-2-desoksy-D-glukose ,

2-acetamino-3-0- £ /~L-1-(D-l-karbamoyl-3-karboksy-propyl)-karbamoyl-metyl7-N-metyl-karbamoyl-metyl ] -2-desoksy-D-glukose, eller 2-benzoylamino-3-0- [ £ L-l-(D-l-karbamoyl-3-karboksy-propyl)-karbamoyl-2<1->metyl-propyl7-karbamoyl-metylJ-2-desoksy-D-glukose.

Med Morgan-Elson reaksjonen finner man hver gang ca. 60 vg av det angjeldende muramyleptid i 1 mg av den angjeldende okseserumalbumin-forbindelse.

Eksempel 8

På tilsvarende måte som i eksempel 3 får man schaferytrocyttmembraner koplet med

2-acetamino-3-0- \ D-l-/ L-l-(D-l-karbamoyl-3-karboksy-propyl)-karbamoyl-etyl/-karbamoyl-etyl J -2-desoksy-D-glukose, med Morgan-Elson-reaksjonen finner man 25 yg muramylpeptid pr. 1

mg erytrocytmembran.

Eksempel 9

I en løsning av 100 mg 2-acetamido-3-0- £D-l-/ L-l-(D-l-karbamoyl-3-succinimidooksykarbonyl-propyl)-karbamoyl-etyl)-karbamoyl-etyl J-2-desoksy-D-glukose i 10 ml fosfat-puffret fysiologisk koksaltoppløsning, pH 7,2, suspen-derer man 10 g mammacarzinomceller av hund. (tumorcellene utvinnes etter H,H. Sedlacek, H. Messmann og F.R. Seiler, Behring Inst. Mitt. nr. 55, 349-355 (1974)). Suspensjonen inkuberes

i 90 minutter ved værelsestemperatur. Deretter sedimenteres tumorcelle-muramyldipeptid-kon jugatet med sentrif ugering og vaskes ved ny suspendering i fosfatpuffret fysiologisk koksalt-oppløsning, fulgt av sentrifuqering.

Den kvantitative bestemmelse av muramyldipeptid koplet med tumorceller følger med Morgan-Elsons reaksjon (se eksempel 1) og gir 60-80 yg muramylpeptid pr. 10 7-mamma-carcinomceller.

Eksempel 10

På tilsvarende måte som i eksempel 6 får man T-lymfoblaster av CBA/J mus koplet med

2-acetamino-3-0- £d-1-/ L-l-(D-l-karbamoyl-3-karboksy-propyl)-karbamoyl-etyl7-karbamoyl-etylJ-2-desoksy-D-glukose.

Med Morgan-Elson reaksjonen finnes 60-70 yg muramylpeptid pr.

7

10 T-lymfoblaster.

På mus, rotter og bavianer, bevirker deres immunisering med antigenderivatet bestående av 2-acetylamino-3-0-£ D-1-/ L-l-(D-l-karbamoyl-3-karboksy-propyl)-karbamoyl-etyl7-karbamoyl-etyl J -2-desoksy-D-glucose og bestemte T-lymfoblaster en spesifikk transplantasjonstoleranse, dvs. at derved kan f. eks. etter organtransplantasjon avstøpningen av det omplantede organ hindres.

Eksempel 11

Til 2 ml av en oppløsning av tetanustoksoid i fosfat-puffret fysiologisk koksaltoppløsning tilsettes 10 mg 2-acetamido-3-0- £ L-1-(D -l-karbamoyl-3-succinimidoksy-karbonyl-propyl)-karbamoyl-etyl7-karbamoyl-metylJ-2-deoksy-D-glukose. Toksoidkonsentrasjonen utgjør 3 mg/ml. Løsningen omrøres ved 4°C i 4 timer. Deretter fraskilles lavmolekylære reaksjonsprodukter fra tetanustoksoid-muramylpeptid-konjugatet ved ultrafiltrering, den ultrafiltrerte løsning fryses og lagres før bruk ved -20°C. Den kvantitative bestemmelse (Morgan-Elson reaksjon) gir 5 0 yg muramylpeptid pr. 1 mg tetanustoksoid-muramylpeptid-konj ugat.

Eksempel 12

Til 10 ml av en oppløsning av koleratoksoid av Vibrio kolera i fosfat-puffret fysiologisk koksaltoppløsning tilsettes 50 mg 2-acetamido-3-0- [/"l-1-(D-l-karbamoyl-3-succinimidooksykarbonyl-propyl)-karbamoyl-etyl7-karbamoyl-metyl J -2-deoksy-D-glukose. Proteinkonsentrasjonen i løsningen utgjør 0,6 mg/ml. Oppløsningen omrøres i 4 timer ved 4°C. Deretter fraskilles de lavmolekylære reaksjonsprodukter fra koleratoksoid-muramylpeptid-konjugatet ved ultrafiltrering,

den ultrafiltrerte løsning innfryses og lagres før bruk ved -20°C. Den kvantitative bestemmelse (Morgan-Elson reaksjon) gir 4 0-5 0 yg muramylpeptid pr. 1 ml koleratoksoid-muramyldipeptid-konjugat.

Albino-marsvin immuniseres en gang subkutant med 22,2 ug/ml koleratoksoid-(2-acetylamino-3-0-f/"L-l-^D-l-karbamoyl-3-karboksy-propyl)-karbamoyl-etyl7-karbamoylmetylJ -2-desoksy-D-glukose) konjugat og belastes deretter med 4,8 ganger mengden av Blauungsdosen i.c. Av en gruppe av 12 immuniserte dyr viser seg 3 som beskyttet. Derimot er under samme betingelser ingen av 10 dyr av en gruppe beskyttet som bare er blitt podet med 22,2 ug/ml koleratoksoid.

Eksempel 13

2 0 mg av et syntetisk eicosapeptid, som med den C-terminale sekvens er identisk med menneskelig choriongonada-tropin (HCG) referanse: C.H. Schneider, K. Blaser, Ch. Pfeuti og E. Gruden, Febs Lettecs 50, 272 (1975)) og 30 mg 2-acet-amido-3-O-£/~L-l-(D-l-karbamoyl-3-succinimidooksy-karbonyl-propyl)-karbamoyl-etyl/-karbamoyl-metylJ -2-deoksy-D-glukose oppløses i 2 ml natriumfosfat-pufferløsning, pH 7,2. Oppløs-ningen omrøres i 6 timer ved værelsestemperatur. Deretter isoleres eicosapeptid-muramyldipeptid-konjugatet ved kroma-tografering på en Sephadex G-25 kolonne (1,4 x 40 cm) med vann som elueringsmiddel og frysetørkes. Den kvantitative aminosyreanalyse viser at 1-muramyldipeptid-molekylet er bundet til 1-eicosapeptid-molekylet.

Eksempel 14

På tilsvarende måte som i eksempel 13 får man

det C-terminale eicosapeptid-fragment i menneskelig chorion-gonadotropin koplet med

2-acetamino-3-0- \D-1-/~L-1-(D-l-karbamoyl-3-karboksy-propyl)-karbamoyl-etyl7-karbamoyl-etyl ] -2-desoksy-D-glukose. Den kvantitative aminosyreanalyse viser at 1-muramyldipeptid-molekylet er bundet til 1-eicosapeptid-molekylet.

Forskjellige av de ovennevnte muramylpeptider eller former av disse koplet med Spacere er nye. De kan fremstilles etter følgende eksempler:

Eksempel A

En oppløsning av 3,4 g benzyl-2-acetamino-3-0-{D-l- l L-l-/ D-l-karbamoyl-3-(L-l-karboksy-etyl-karbamoyl)-propyl/-karbamoyl-etylJ -karbamoyl-etylj -2-desoksy-a-D-gluko-pyranosid-benzylester i 100 ml metanol/destillert vann 2/1 hydreres i nærvær av 0,3 g 10 % palladium på kull ved normal-trykk og 45°C i 24 timer. Katalysatoren frafiltreres, og filtratet inndampes. Resten oppløses i 40 ml vann og denne løsningen ekstraheres 3 ganger med 4 0 ml vann som er mettet med sekundær-butanol. Den organiske fase vaskes ytterligere 3 ganger med 4 0 ml vann som er mettet med sekundær-butanol. Vannløsningene inndampes etter å være slått sammen, resten løses opp i noe destillert vann og frysetørkes. Dette gir 2-acetamino-3-0-£ D-l-£ L-l-/~D-l-karbamoyl-3-(L-l-karboksy-etyl-karbamoyl )-propyl7-karbamoyl-etyl j-karbamoyl-etylJ -2-desoksy-D-glukose som et hvitt pulver med / <*7n^ = + 9° + 1°

(destillert vann, c = 1,090).

Det anvendte utgangsmaterialet fremstilles på følgende måte: En oppløsning av 6,1 g bensyl-2-acetamino-3-0- [ D-l-/ L-l-(D-l-karbamoyl-3-karboksypropyl)-karbamoyl-etyl_/- karbamoyl-etylj -2-desoksy-a-D-glukopyranosid-monohydrat og 3,5 g L-alaninbenzylester-p-toluensulfonat i 30 ml N,N-dimetylformamid tilsettes 1,4 ml trietylamin, 1,1 g N-hydroksysuccinimid og 2,3 g dicykloheksylkarbodiimid og omrøres i 48 timer ved værelsestemperatur. Det utkrystallisert dicykloheksylurinstoff avsuges og vaskes med 10 ml N,N-dimetylformamid og filtratet inndampes til tørrhet. Resten suspenderes i 100 ml vann, omrøres i en time ved 0°C, de uløselige deler avsuges, vaskes med noe isvann og tørkes. Produktet oppløses i metanol, utfelles med dobbelt så stor mengde eddikester, avsuges, vakses med noe eddikester og tørkes:

/"a/^0 = + 72° + 1° (metanol, c = 0,998).

Eksempel B

En 5 %-ig oppløsning av benzyl-2-acetamido-3-0-£(L-l-/ D-l-(L-l-karboksy-etyl)-karbamoyl-3-karboksypropyl7~ karbamoyl-etylJ -karbamoyl-metylj -2-desoksy-a-D-glukopyrano-sid i tetrahydrofuran/vann 2/1 hydreres i nærvær av 10 %-ig palladium på kull ved normalt trykk og værelsestemperatur. Etter at den teoretiske mengde hydrogen er tatt opp, frafiltreres katalysatoren og filtratet frysetørkes. Dette gir 2- acetamido-3-0-£{l-1-/ D-l-(L-l-karboksy-etyl)-karbamoyl-3- karboksypropyl/-karbamoyl-etylJ -karbamoyl-metyl^ -2-desoksy-D-glukose som et hvitt pulver. Rf-verdien i tynnsjikts-kromatogrammet = 0,21 (eddiksyreetylester/n-butanol/pyridin/ eddiksyre/vann 42:21:21:6:10).

På tilsvarende måte får man derivatet med den ekte muraminsyre.

Utgangsmaterialet fremstilles på følgende måte: 5,68 g N-tert.-butoksykarbonyl-L-alanyl-D-y-benzyl-glutamyl-L-alaninbenzylester oppløses i en blanding av 5 ml trifluoreddiksyre og 5 ml 1,2-dikloretan og hensettes under fuktighetsutelukkelse i 16 timer ved værelsestemperatur.

Oppløsningen fortynnes med 5 0 ml tetrahydrofuran, avkjøles

på isbad og nøytraliseres med trietylamin. Etter tilsats til oppløsningen av 3,7 g benzyl-2-acetamido-3-karboksymetyl-2-desoksy-ot-D-glukopyranosid og 1,38 ml trietylamin i 100 ml tetrahydrofuran, tilsettes blandingen 2,6 9 2-etoksy-N-etoksykarbonyl-1,2-dihydrokinolin og blandingen hensettes i 24 timer ved værelsestemperatur. Etter avdampning av løsnings-midlet oppløses resten i kloroform/metanol 9/1, vaskes med vann, iskald 2N saltsyre, vann, en mettet natriumhydrogen-karbonatoppløsning og vann, filtreres og befries for løsnings-middel. Dette gir benzyl-2-acetamido-3-0-£(l-1-/~D-1-(L-l-karboksy-etyl )-karbamoyl-3-karboksy-propyl7-karbamoyletyl^-karbamoyl-metyl } -2-desoksy-a-D-glukopyranosid som et farge-løst pulver. Rf-verdi =0,48 ( i et identisk system).

Det anvendte utgangsmateriale kan fremstilles

på følgende måte:

7,15 g N-tert.-butoksykarbonyl-L-alanyl-D-glutaminsyre-y-benzylester og 6,15 g L-alaninbenzylester-p-tolulsulfonat oppløses i 100 ml vannfri dimetylformamid. Blandingen avkjøles i isbad og tilføres under omrøring etter hverandre 4,03 g N-hydroksysuccinimid, 3,61 g dicykloheksylkarbodiimid og endelig 1,95 ml N-metylmorfolin. Etter 6 timers omrøring ved 0°C og 15 timer ved værelsestemperatur avkjøles suspensjonen, utfellingen (dicykloheksylurinstoff og morfolinhydroklorid) frafiltreres og filtratet inndampes. Resten tas opp i eddiksyreetylester, vaskes flere ganger med vann, IN sitronsyre og IN natriumhydrogenkarbonat og ende-

lig med vann. Eddikesterløsningen tørkes, inndampes, og den krystallinske rest omkrystalliseres fra eddester/petroleter 1/1. Sm.p. 135-136°C, Z~a/D° = "9° + 1° (c = 1, metanol), Rf-verdi = 0,82 ( i det ovenevnte system) og 0,86 (acetonitril/ vann 3:1).

I stedet for alanin kan det benyttede dipeptid

på tilsvarende måte forlenges med andre naturlige L-amino-syrer.

Eksempel 15

7,5 x 10 g avlivede tripanosoma cruzi parasitter (frembringer av Chagas-sykdommen) suspenderes i en oppløsning av 5 0 mg 2-acetamino-3-0-L-l-(D-karbamoyl-3-karboksypropyl)-karbamoyletyl/-karbamoylmetylJ-2-desoksy-D-glukose-N-hydroksysuccinimidester i 6 ml fysiologisk pufferløsning. Suspensjonen inkuberes i to timer ved 37°C. Deretter sedimenteres parasittene som er konjugert med muramyldipeptid ved sentrifugering. Sedimentet vaskes med ny suspensjon i fysiologisk pufferløsning og ny sentrifugering. Det vaksede parasitt-muramyldipeptid-konjugat suspenderes i fysiologisk puffer-løsning og anvendes til immunisering.

Den kvantitative bestemmelse av muramyldipeptid koplet til trypanosomer foregår som angitt i eksempel 1 med Morgan-Elsons reaksjon og gir 50-70 mg muramyldipeptid pr. mg trypanosomer.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av terapeutisk virksomme antigenderivater som består av et antigen, hvortil det pr. antigenmolekyl er bundet minst et og maksimalt så mange muramylpeptidmolekyler at den antigene karakter bibeholdes, samt eventuelt en bærer, idet disse komponenter sammenknyttet med hverandre kovalent enten direkte over oksykarbonyl-, iminokarbonyl- eller karbonyltiogrupper eller eventuelt indirekte over som broledd tjenende rester av en alifatisk forbindelse med minst to aminogrupper, minst en amino- og minst en karboksygruppe eller minst to karboksygrupper, idet bindingen mellom broledd og antigen samt broledd og muramylpeptid likeledes foregår over oksykarbonyl-, iminokarbonyl- eller karbonyltiogrupper, og idet muramylpeptidet i ubundet form har den i formel Ila angitte struktur X betyr en karbonyl- eller karbonyloksygruppe, Rl' R4 og R6 betyr uavhengig av hverandre hydrogen, trimetylsilyl eller alkanoyl, R2 betyr en fenylrest eller usubstituert eller med hydroksy, karboksy, laverealkoksy og/eller laverealkoksykarbonyl substituert laverealkyl, R^, Ry og Rg betyr uavhengig av hverandre hydrogen eller laverealkyl , Ro0 betyr en fenylrest eller usubstituert eller med hydroksy, halogen, amino, merkapto, laverealkyltio eller en fenylrest substituert laverealkyl, eller R_ og R0 betyr sammen alkylen med 3 eller 4 karbonatomer, og restene R-^gf R-^ og R.^ betyr uavhengig av hverandre karboksy, trimetylsilyl-silyloksykarbonyl, usubstituert eller med en fenylrest substituert laverealkoksykarbonyl eller karbamoyl, som er usubstituert eller substituert med nitrogenatomet med usubstituert eller med karboksy, laverealkoksykarbonyl eller karbamoyl substituert laverealkyl eller R^^ betyr også hydrogen, med den forholdsregel at minst en fri hydroksy-, amino, merkapto- eller karboksygruppe er tilstede i en utgangsforbindelse med formel Ila, karakterisert ved at man kondenserer et eventuelt med broledd sammenknyttet antigen med eventuelt med broledd sammenknyttede muramylpeptider med formel Ila, idet en av de to reaksjonskomponenter minst har en fri amino-, hydroksy- og/eller merkaptogruppe og den andre har minst en karboksylsyregruppe, og hvis ønsket, påkondenseres en dannet forbindelse analogt til ovennevnte til en eventuelt med broledd forbundet bærer, idet en av de to reaksjonskomponentene minst har en fri amino-, hydroksy- og/eller merkaptogruppe, og den andre har minst en karboksylsyregruppe.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man anvender 2-acetamin-3-0- (d-1-/ L-l-(D-l-karbamoyl-3-karboksylpropyl)-karbamoyletyl/-karbamoyletylJ -2-desoksy-D-glukose eller 2-acetamido-3-0- £/~L-l-(D-l-karbamoyl-3-karboksypropyl)-karbamoyletyl,7-karbamoylmetyl J -2-desoksy-D-glukose som mura-mylpeptidkcmponent, syntetisk eicosapeptid, som er identisk med den C-terminale sekvens av det humane Horiongonadotropin (HCG) som antigenkomponent og eventuelt tetanustoksoid som bærer.