NO139683B - Fremgangsmaate for isolering av 3-(3,4-dihydroksyfenyl)-l-alanin fra en vannopploesning - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse angår en fremgangsmåte for isolering

av 3(3,4-dihydroksyfenyl)L-alanin (L-dopa) fra en vannoppløsning.

L-dopa er en i biologisk materiale temmelig almindelig forekommende forbindelse som anvendes for behandling av Parkinsons sykdom. Ifølge en tidligere kjent metode kan L-dopa isoleres fra malte frø av visse belgvekster ved ekstrahering med fortynnet svovelsyrling, hvorefter et overskudd av blyacetatoppløsning tilsettes ekstrakten. Blyacetatet feller ut proteiner og andre forurensninger fra ekstrakten. Felningen frafiltreres, og opp-løsningen gjøres svakt alkalisk, hvorved L-dopaen faller ut i form av blysalt. L-dopaen frigjøres fra blysaltet ved oppløsning i hydrogensulfid. Ifølge en nyere metode for fremstilling av L-dopa fra belgveksters frø (US patent 3253023) isoleres L-dopa fra de malte bønner ved at pulveret ekstraheres med en l-10%ig vannoppløsning av en organisk syre hvis pH er 2-6, og oppløsningen separeres fra den uoppløselige rest og konsentreres i nitrogen-atmosfære. Derefter behandles oppløsningen med kull og kiselgur. Filtratet erholdt ved kiselgurbehandlingen konsentreres samt avkjøles i flere timer, hvorved L-dopa krystalliserer. Ifølge vår henlagte norske søknad 2994/72 isoleres L-dopa fra den som utgangsmateriale anvendte ekstrakt ved adsorbsjon til aktivt kull, fra hvilket den derefter elueres til en ionebytterharpiks. L-dopaen fortrenges fra ionebytteren med en hydrazinholdig ammoniakkoppløsning. Ved nøytralisering av denne oppløsning faller L-dopaen ut.

En ulempe ved disse kjente metoder er anvendelsen av

aktivt kull og kiselgur som medfører betraktelige omkostninger. Formålet med foreliggende oppfinnelse er således å tilveiebringe

en ny fremgangsmåte for fremstilling av L-dopa, som er enklere og billigere enn de tidligere kjente. Denne fremgangsmåte karakteriseres ved at en L-dopaholdig vannoppløsning først ekstraheres med et organisk oppløsningsmiddel og derefter ekstraheres med det samme oppløsningsmiddel tilsatt en ionebytter i væskeform. Ionebytteren utgjøres av en sulfonsyre som er oppløst i det organiske oppløsningsmiddel og til hvilken L-dopaen bindes i form av et sulfonsyresalt. L-dopaen frigjøres fra saltet ved nøytralisering med en base som feller ut L-dopaen, og den erholdte feining skilles fra oppløsningen. Sulfonsyreoppløsningen anvendes på nytt for å binde L-dopa.

I henhold til oppfinnelsen kan L-dopa isoleres fra alle slags vannoppløsninger eller ekstrakter av biologisk eller annen opprinnelse. Slike ekstrakter eller oppløsninger er f.eks. et vekstsubstrat av en L-dopaproduserende mikrobe, en L-dopaholdig oppløsning som er erholdt fra en passende forløper ved en biokjemisk reaksjon ved hjelp av et dyrevevs-, vekst- eller mikrobehomogenat, en vekstekstrakt - spesielt en oppløsning som er erholdt ved ekstraksjon av vekster eller vekstdeler av slektene Mucuna, Stizolobium, Lupinus eller Vicia, som er kjent for å inneholde L-dopa, samt en oppløsning som er erholdt ved syntetisk fremstilling av L-dopa på en eller annen måte og som inneholder forurensninger.

Som L-dopabindende ionebytter egner seg prinsipielt alle slike sulfonsyrer som ved fordeling mellom de ulike væskefaser favoriserer det organiske oppløsningsmidlet og som sammen med en passende base, så som ammoniakk, hydrazin, metyl-, etyl- eller et annet alkylamin eller alkanolamin, danner et salt som er opp-løselig i det anvendte organiske oppløsningsmidlet og som spaltes ved vaskning med en syre, hvorved sulfonsyren i det organiske oppløsningsmidlet frigjøres og ionebyttervæsken således regenereres. Som eksempel på anvendbare sulfonsyrer kan nevnes alkyl- og aryl-sulfonsyrer. En slik billig og lett tilgjengelig sulfonsyre er dodecylbenzensulfonsyre. Også estersulfonsyrer kan anvendes,

f.eks. laurylsulfonsyre, som er en alkoholsvovelsyreester, men med hensyn til spaltning er disse ufordelaktigere enn alkyl- og arylsulfonsyrene.

Som organisk oppløsningsmiddel kan anvendes en alkohol,

et keton eller en ester som er uoppløselig eller bare til en viss grad oppløselig i vann. Metylisobutylketon ("hekson") er med fordel anvendt som organisk oppløsningsmiddel.

Ifølge oppfinnelsen er det også fordelaktig å surgjøre den L-dopaholdige oppløsningen og derefter utføre den første ekstraksjon med samme organiske oppløsningsmiddel som anvendes for ionebyttingen,

men uten tilsetning av sulfonsyre. Denne ekstraksjon fjerner forurensninger fra oppløsningen som ellers ville opphopes i ionebyttervæsken og med tiden vanskeliggjøre krystallisasjon av L-dopaen. Den rensede vannoppløsning som fåes ved denne første ekstraksjon og som ennu inneholder L-dopa, ekstraheres derefter på nytt med samme organiske oppløsningsmiddel, til hvilket det er satt, den sulfonsyre som virker som ionebytter. Begge ekstraksjonene skjer best ifølge motstrømsprinsippet i et automatisk væske-væske-ekstraksjonsanlegg slik at den første ekstraksjonen er så fullstendig som mulig, og i den andre ekstraksjonen er ionebytterens belastning og L-dopautbyttet så store som mulig uten at ekstrakten inneholder større mengder forurensninger som for-

sinker L-dopaens krystallisasjon.

På denne måte får man en oppløsning av L-dopaens sulfonsyresalt i det anvendte organiske oppløsningsmiddel. L-dopaen fri-

gjøres fra saltet ved hjelp av en passende base som sammen med vedkommende sulfonsyre danner et salt som løser seg i det anvendte organiske oppløsningsmidlet. Av den frigjorte L-dopaen er største-delen krystallinsk. Felningen filtreres eller sentrifugeres fra oppløsningen. Moderoppløsningen vaskes i et væske-væske-ekstraksjonsapparat med et overskudd av mineralsyreoppløsning,

i hvilken den for nøytraliseringen anvendte basen og den

ukrystalliserte delen av L-dopaen løser seg. Denne oppløsning settes til den som utgangsmateriale anvendte vannoppløsningen. Når moderoppløsningen vaskes med mineralsyre efter at L-dopaen

er fraskilt, frigjøres den i det organiske oppløsningsmidlet inngående sulfonsyren fra- sitt salt, og den således erholdte opp-løsningen kan anvendes på nytt for å binde L-dopa. Det i den første ekstraksjonen, uten sulfonsyretilsetning, anvendte opp-løsningsmidlet vaskes med et overskudd av lutoppløsning som fjerner forurensninger som er oppløst i oppløsningsmidlet. Derefter vaskes oppløsningsmidlet igjen med vann og anvendes derefter på nytt. Den mengde uorganisk oppløsningsmiddel og sulfonsyre som går tapt med avfallsvannet, erstattes på et passende punkt i systemet.

I det følgende beskrives oppfinnelsen mer i detalj i tilknytning til vedlagte skisse, som illustrerer ekstraksjons-forløpet og viser et eksempel på en apparatur i hvilken fremgangs-måten ifølge oppfinnelsen kan gjennomføres.

Kar nr. 1 er en beholder i hvilken vekstekstrakten eller en annen som utgangsmateriale anvendt L-dopaholdig oppløsning pumpes inn, og eventuelt grums som stammer fra utgangsmaterialet, fraskilles med en klarningssentrifuge eller ved filtrering.

Inn i denne beholder, der omrøring pågår, renner fra væske-væske-kontaktor nr. 8 den vannoppløsning som ble erholdt da den efter L-dopaens krystallisasjon gjenværende moderoppløsning ble vasket med en syre i kontaktor nr. 8. Den mineralsyreholdige vaske-oppløsningen inneholder ennu ukrystallisert L-dopa samt mineral-syresaltet av den for nøytraliseringen anvendte basen. Til beholder nr. 1 settes natriumhydroksydoppløsning efter behov slik at den oppløsning som kommer ut fra beholderen har pH 1,0-3,5 eller helst 1,5-2,5. NaOH-tilsetningen skjer best automatisk ved hjelp av en pH-stat. Væsken fra beholder nr. 1 renner til væske-væske-kontaktor nr. 2 der den ekstraheres med et organisk oppløsningsmiddel. Fra ekstraktor nr. 2 renner det organiske oppløsningsmiddel til vaskeapparat nr. 4 der vasking med et overskudd av lutoppløsning pågår som en kontinuerlig prosess. Lutoppløsningen fjerner fra det organiske oppløsningsmidlet størstedelen av forurensningene som er tilstede deri.

Fra vaskeapparat nr. 4 renner oppløsningsmidlet til vaskeapparat nr. 5 der det vaskes med vann. Også dette skjer som en kontinuerlig automatisk prosess. Fra vaskeapparat nr. 5 renner det organiske oppløsningsmidlet til beholder nr. 6, en beholder for lagring, pumpning og svelning, dit oppløsningsmiddel tilsettes efter behov. Lutoppløsningens og vannets tilstrømning til vaskeapparatene 4 resp. 5 besørges med passende doserings-pumper. Apparat nr. 7 er en pumpe som løfter det organiske oppløsningsmidlet til ekstraktor 2 og ved hjelp av hvilket opp-løsningsmidlets tilstrømningshastighet reguleres. Vannoppløsningen som kommer fra vaskeapparatene nr. 4 og 5 er mettet med organisk oppløsningsmiddel og det samme er tilfellet med den vannoppløsning som kommer fra væske-væske-ekstraktorene nr. 2 og 3 og som ennu inneholder L-dopa. Det organiske oppløsningsmidlet sirkulerer kontinuerlig gjennom apparatene nr. 2, 4, 5, 6 og 7. I væske-væske-kontaktor nr. 2 ekstraherer oppløsningsmidlet forurensninger fra den innkommende vannoppløsningen, hvilke forurensninger skilles fra oppløsningsmidlet i vaskeapparatene nr. 4 og 5, hvorefter pumpe nr. 7 gjeninnfører oppløsningsmidlet i sirkulasjonen.

I væske-væske-kontaktor nr. 3 ekstraherer det organiske oppløsningsmidlet L-dopa fra vannoppløsningen som kommer fra kontaktor nr. 2. Den på denne måte erholdte organiske oppløsningen som inneholder L-dopa i form av sulfonsyresalt, renner til kar nr. 9 der omrøring pågår og der den erholdte oppløsningens pH reguleres til 4-5 med en passende base. Den anvendte basen bør være slik at den sammen med den anvendte sulfonsyren danner et salt som er oppløselig i det organiske oppløsningsmidlet. Salt-dannelsen får på den andre side ikke forårsake at vannet i opp-løsningen separeres i forskjellige væskefaser. Beholder nr. 10

er et større kar der oppløsningen oppbevares i den tid som kreves for L-dopaens krystallisasjon, dvs. 2-4 timer. Denne beholder er forsynt med et nedsenket filter og en omrører, og i beholderens konformige nedre del finnes en kran. Omrøring er nødvendig for å påskynde krystallisasjonen. L-dopaens separering fra moder-oppløsningen skjer ved at krystallsuspensjonen nå og da tappes fra beholderen via kranen i den nedre del, hvorefter den filtreres og moderoppløsningen føres tilbake til beholderen. Pumpe nr. 11 pumper moderoppløsningen fra beholderen nr. 10 gjennom det ned-senkede filter til væske-væske-kontaktor nr. 8. Her skjer regenerering av ionebyttervæsken og vasking på nytt av den ukrystalliserte L-dopaen. Vaskingen utføres med en mineralsyre-oppløsning av passende konsentrasjon, som fra den organiske fasen ekstraherer, foruten L-dopa, også den for nøytraliseringen i

beholderen nr. 9 anvendte basen. Vaskesyreoppløsningen føres tilbake til beholder nr. 1 og den regenererte sulfonsyreoppløsningen til væske-væske-ekstraktor nr. 3. Før det tilsettes sulfonsyre efter behov. Av sulfonsyren avgår fra systemet den mengde som er oppløst i avfallsvannet som renner ut fra ekstraktor nr. 3.

Væske-væske-kontaktorene nr. 2, 3 og 8 har vært av typen "mixer-settler-box". Hver og en har bestått av 10 enheter med en ekstraksjonseffekt på 70-80%.

Prinsipielt kan man anvende en hvilken som helst type væske-væske-ekstraksjonsapparat, forutsatt at ekstraksjons-kapasiteten er tilstrekkelig. Ved hver ekstraksjon har man til-strebet fordelingstallet G 1,2-1,3 med en ekvilibrering, som garanterer et 90% utbytte ved ekstraksjon i et 10 enheters apparat. Vaskeapparatene nr. 4 og 5 er separate enheter i ekstraksjons-anlegget.

Man kan følge med i prosessen ved å ta en prøve av den

med mineralsyre vaskede moderoppløsningen fra ekstraktor nr. 8

og en prøve av vannoppløsningen fra ekstraktor nr. 2, ryste dem sammen i en skilletrakt og måle L-dopaens fordeling mellom væske-fasene. På grunnlag av målingen settes efter behov sulfonsyre til det organiske oppløsningsmidlet, slik at dets evne til å ekstrahere L-dopa forblir tilfredsstillende til tross for tapet av sulfonsyre med avfallsvannet, ionebytterens strømnings-hastighet til ekstraktor nr. 3 kan også økes i forhold til vann-oppløsningens ifall man vil anvende et lavere sulfonsyreinnhold i ionebytteren.

Eksempel

Som utgangsmateriale ble anvendt en i henhold til norsk patent 125.344 erholdt vannekstrakt av hele

vekstbestanden av nyhøstet hestebønneplante (Vicia faba). Oppløsningen inneholdt tørrstoff 75 g/l og L-dopa 2,4 g/l. Eventuelt grums ble skilt fra oppløsningen med en filtrerings-sentrifuge. Til filtratet ble satt til å begynne med svovelsyre slik at oppløsningens pH var 1,5. Senere, når L-dopaen hadde krystallisert og moderoppløsningen var vasket med svovelsyre,

ble denne svovelsyreholdige vaskeoppløsning satt til vekstekstrakten efter sentrifugering av grumset, og derefter ble opp-løsningens pH regulert til 1,5 ved tilsetning av NaOH (700 g/l). Denne oppløsning ble ekstrahert i væske-væske-ekstraktor nr. 2 med metyl-isobutylketon. Ekstraktor nr. 2 var en kontaktor av den

såkaldte "mixer-settler-box" type bestående av 10 enheter. Hver enhet hadde en blandingsdel med 5 liters volum og en klarningsdel med 20 liters volum. Det organiske oppløsningsmidlets strømnings-hastighet gjennom ekstraktoren var 120 l/time og vannoppløsningens 90-120 l/time. Metylisobutylketonekstrakten som inneholdt 3,0-

3,5 g tørrstoff pr. liter, ble vasket i vaskeapparat nr. 4 med 2N natriumhydroksydoppløsning hvis strømningshastighet var 6 l/time. Derefter ble metyl-isobutylketonet vasket i vaskeapparat nr. 5 med vann, hvor strømningshastigheten var 6 l/time. Vaskeapparatene nr. 4 og 5 var hver en separat enhet med en 5 liters blandingsdel og en 20 liters klarningsdel. Det vaskede, sirkulerende metyl-isobutylketonets tørrstoffinnhold var 0,3-0,4 g/l. Pumpe nr. 7

var en stempelpumpe, hvis slaglengde og frekvens kunne reguleres slik at man fikk ønsket strømningshastighet. En likedan pumpe anvendes for dosering og regulering av strømningshastigheten av alle oppløsningene som anvendes ved ekstraksjonen. Pumpebeholder nr. 6 rommet 50 liter.

Ekstraksjon av den på forhånd rensede vannoppløsningen med sulfonsyreholdig metyl-isobutylketon gikk for seg i ekstraktor-nr.. 3 som var likedan som ekstraktor nr. 2. Metyl-isobutylketonet inneholdt dodecylbenzensulfonsyre i en mengde på 40-50 g/l. Vann-oppløsningens strømningshastighet var 90-120 l/time. Svoveldioksyd i form av en natriumbisulfitt-vannoppløsning ble tilført den første enheten i ekstraksjonsapparatet i en mengde av 1 g/l vannoppløsning som skulle ekstraheres. Metyl-isobutylketon-dodecylbenzen-sulfonsyreekstrakten som kom fra ekstraktor nr. 3, hadde et L-dopainnhold på gjennomsnitlig 3,7 g/l, og oppløsningens tørrstoff-innhold var 65-75 g/l. Kar nr. 9, der nøytralisasjonen fant sted, rommet 25 liter. Nøytraliseringen ble utført med ammoniakk. Ammoniakken var i gassform og ble tilført ekstrakten fra en gass-bombe. Oppløsningens pH ble holdt ved 4,5 og kontrollert kontinuerlig med en pH-måler. I krystallisasjonsbeholder nr. 10 var væske-volumet 500 liter, dvs. væsken oppholdt seg der gjennomsnitlig i

4 timer. Sluttproduktet ble separert fra moderoppløsningen ved at nå og da ble krystallsuspensjonen tappet gjennom kranen nedentil i beholderen, hvorefter feiningen ble frafiltrert og moder-oppløsningen ført tilbake til beholderen. Pumpe nr. 11 suget kontinuerlig oppløsning fra beholderen gjennom det nedsenkte

filteret og pumpet den til ekstraksjonsapparat nr. 8 der moder-oppløsningen ble vasket med 2,5N svovelsyreoppløsning. Moder-

oppløsningen inneholdt gjennomsnitlig 2,0 g L-dopa pr. liter. Den til vaskningen anvendte svovelsyreoppløsningens volum var 1/4 av moderoppløsningens. Vaskeoppløsningens L-dopainnhold var 5,2 g/l og den vaskede moderoppløsningens 0,5 g/l. Avfallsvannet som ble ført ut av ekstraksjonsapparatet nr. 3, inneholdt L-dopa 0,24 g/l, dodekylbenzensulfonsyre 1 g/l og metyl-isobutylketon 15 g/l.

Fra 1000 liter ekstrakt som inneholdt 2,4 kg L-dopa,

ble det isolert 2,3 kg av et produkt hvis L-dopainnhold var 90%. Foruten L-dopa inneholdt produktet tyrosin ca. 3%, leucin, fenylalanin og asparaginsyre mindre enn 1% hver samt ammonium sulfat og -sulfitt og dodecylbenzensulfonsyresalt.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte for isolering av 3 (3,4-dihydroksyfenyl)-L-alanin (L-DOPA) fra en vannoppløsning, karakterisert ved at oppløsningen først ekstraheres med et organisk opp-løsningsmiddel og derefter ekstraheres den med det samme oppløsnings-middel tilsatt en væskeformig ionebytter som utgjøres av en sulfonsyre oppløst i det organiske oppløsningsmiddel og til hvilken L-DOPA bindes i form av et sulfonsyresalt, fra hvilket L-DOPA frigjøres ved nøytralisasjon med en base, hvorved L-DOPA utfelles, den dannede felning separeres fra oppløsningen som derefter regenereres ved vaskning med en mineralsyreoppløsning, og den erholdte sulfonsyreoppløsningen anvendes på nytt for å binde L-DOPA.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som ionebytter anvendes en alkyl- eller arylsulfonsyre eller en estersulfonsyre.

3. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, kr a rakterisert ved at sulfonsyren er oppløst i en i vann uoppløselig eller begrenset oppløselig alkohol, ester eller keton.

4. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at det som ionebytter anvendes dodecylbenzensulfonsyre oppløst i metyl-isobutylketon.

5. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at frigjøringen av L-DOPA fra sulfonsyresaltet skjer med en base som med den anvendte sulfonsyren danner et i det anvendte oppløsningsmiddel oppløselig salt.