NL8920011A

NL8920011A - Chemicalien voor de bescherming van planten en verwijdering van plantvirussen, en het vervaardigen voor een methode daarvan.

Info

Publication number: NL8920011A
Application number: NL8920011A
Authority: NL
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1988-01-12
Filing date: 1989-01-11
Publication date: 1990-10-01
Also published as: EP0396750B1; EP0396750A4; EP0396750A1; WO1989006493A1; ATE111306T1; DE68918269D1; DE68918269T2

Description

Titel: Chemicaliën voor de bescherming van planten en verwijdering van plantvirussen, en het vervaardigen voor een methode daarvan.

Deze uitvinding heeft betrekking op chemicaliën voor plantbescherming en virusverwijdering welke gebruikt kunnen worden in de bescherming van planten en de verwijdering van plantvirussen op het gebied van landbouw en tuinbouw, en deze heeft eveneens betrekking op het vervaardigen van een werkwijze van dergelijke chemicaliën.

Tabak, groene pepers, tomaten, komkommers,watermeloenen en dergelijke welke gebouwd worden op het veld, op sawa's en in kassen, worden vaak beschadigde door tobacco mosaic virus (waarnaar hierna verwezen wordt met TMV) , cucumber mosaic virus, cucumber green-spot mosaic virus en potato Y virus, etc.

Deze virussen komen eveneens in andere gewassen voor, zoals onkruid, zaad en zaailingen en in de bodem. Ze zijn besmettelijk en worden vaak gedragen door sap-opzuigende insecten en dergelijke.

Vroeger werden bodemontsmetting en insecticiden gebruikt als tegenmaatregelen voor plantenbescherming en de verwijdering van gewasvirussen. Deze tegenmaatregelen waren echter hoofdzakelijk een indirect middel van bescherming en technische werkwijzen voor virusverwijdering.

Er zijn een paar directe plantbeschermende en virusverwijderende chemicaliën welke "natriumalginezuur" worden genoemd (Japans octrooi Nr. 717.594, the Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries Registratienummer 13440) en kweekextract van Lentinus edodes (Japans octrooi Nr. 1.012.014, the Ministry of Agriculture Forestry and Fisheries Registratienummer 15584). Geen van deze hebben echter een systemisch effect; zij zijn daarom niet in staat om de volledige plant te bevochtigen, en het is noodzakelijk om ze over de gehele plant te verspreiden. Daarbij komt dat hun effectiviteit op het veld niet erg groot is.

Van de andere kant is recentelijk een proteïne, welke gevonden wordt in de bonte wonderbloem, gepopulariseerd als anti-virale plantverbinding welke echt systemische effectiviteit bezit [Japan TOKKYO-KOKAI-KOHO (Publicatie van niet-onderzochte octrooiaanvrage na 18 maanden) SHOWA 60 (1985)-243100 (waarnaar hierna verwezen zal worden als TOKKAISHO 60-243100)]. Jammer genoeg moet de productie van dit proteïne echter samengaan met landbouwmiddelen of plantecelkweek [Japan TOKKAISHO 61(1986)-5790). Daarom is de productiviteit automatisch beperkt, en is het onmogelijk erin te voorzien tegen lage kosten voor massaproduktie.

De onderhavige uitvinding is een verbetering voor de defecten van de vroegere plantbescherming en virusverwijderingschemicaliën op de markt. De onderhavige uitvinding heeft een meer effectieve verzadigde schuivende dominantie bereikt, en een veilige en waardevolle chemische verbinding kan verkregen worden tegen lage kosten voor massaproduktie.

Om de voornoemde opzetten te bereiken hebben de uitvinders een raster van metabole produkten gemaakt uit verschillende micro-organismen gebruikt. Als resultaat werd gevonden dat een hoogmoleculair polysaccharide, welke geproduceerd wordt in een kweekmateriaal door een schimmel behorend tot het geslacht Femes, een opmerkelijke antivirale activiteit vertoont. Schimmels behorende tot het geslacht Fomes welke gebruikt worden volgens de onderhavige uitvinding, zijn Fomes fomentarius, Forney aeotropus, Fomas, melanopprus, etc. Deze kweekoplossingen tonen anti-virale activiteit, hoewel in verschillende mate.

In aanvulling hierop zijn stammen behorende tot het geslacht Fomes, welke gebruikt worden in de onderhavige uitvinding, gescheiden van de natuurlijke Fomes., of bekende bewaarde stammen zoals Fomes fomentarius. IFO 30371, IFO 30777 (IFO staat voor Institute of Fermentation Organization) of Fomes fomentarius ATCC 26708, ATCC 34687, ATCC 46213 (ATCC staat voor American Type Culture Collection) . Feme?, geotPQPU.S.

ATCC 26709, Fomes melanoporus ATCC 26132, en andere. Hieronder is de meest bevoorkeurde stam Fomes fomentarius JTS 3046 (FERM BP-2230) welke een aanzienlijk hoge produktie van zure hoogmoleculaire polysacchariden bezit.

Incidenteel wordt de JTS 3046 stam, welke successievelijk gekweekt werd uit de IFO 8246 stam als de ouderstam, verkregen. Deze stam met een hoge produktiviteit van zuur hoogmoleculair polysaccharide is gedeponeerd als FERM P-9704 op 11 november 1987 op het Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of International Trade and Industry in Ibaraki-ken, Japan. Vervolgens is deze toen overgedragen aan het International Deposit aldaar op 5 januari 1989 en is verkrijgbaar voor gebruik onder toegangsnummer FERM BP-2230.

Besmetting door TMV, bijvoorbeeld, kan effectief voorkomen worden door de stammen en bladeren van tabak, tomaten, groene pepers, etc. te besprenkelen met een opgelost kweekfiltraat van de gekweekte stam, een hydrothermaal extract van de schimmel of zijn actieve component, hoogmoleculair polysaccharide.

In het bijzonder heeft een anti-viraal actief materiaal, welke geproduceerd wordt door een stam behorende tot het geslacht Fomes en welke verschillend is van eerder bekende polysacchariden, een aanzienlijke effectiviteit omdat het systemisch op de behandelde plant verschijnt.

Stammen welke toegepast worden volgens deze uitvinding kunnen in medium geplaatst worden of onder schudden gekweekt worden in medium dat over het algemeen gebruikt wordt voor de kweek van schimmels. De effectiviteit hangt af van de hoeveelheid hoogmoleculair polysaccharide dat als actieve component gebruikt wordt, in het bijzonder van dat van zuur hoogmoleculair polysaccharide. Het volgende heeft een gedetailleerde uitleg van de resultaten van experimenten volgens deze uitvinding.

In de onderhavige uitvinding kan een hoogmoleculair polysaccharide verkregen worden uit zowel schimmels als cultuurfiltraat door afzonderlijke extractie. De grotere hoeveelheid kan verkregen worden uit het cultuurfiltraat nadat de schimmels geproduceerd zijn uit de cultuur van hoogmoleculair polysaccharide.

Bij voorkeur wordt gebruik gemaakt van een medium samengesteld uit over het algemeen filamenteuze schimmels met toegevoegde gistextracten, maar elk samengesteld medium geschikt voor schimmelgroei kan gebruikt worden.

In de onderhavige uitvinding wordt een medium dat glucose, pepton, gistextract, moutextract, kaliumfosfaat, magnesiumsulfaat en kraanwater bevat, gebruikt voor de kweek van schimmels die hoogmoleculair polysaccharide produceren.

Geschikte kweekomstandigheden vragen een temperatuur van 20-30°C voor de staande kweek. Hieraan toegevoegd is er een voorkeur voor schudden en beluchten van de kweek, hoewel alle omstandigheden aanvaardbaar zijn zolang zij de groei van een hoogmoleculair polysaccharide voor schimmelproduktie bevorderen.

Nadat het kweekfiltraat en de schimmels verkregen zijn uit het kweekmateriaal van hoogmoleculair polysaccharide producerende schimmels door middel van de centrifugeseparatie-methode en filtreren wordt het hoogmoleculair polysaccharide, welke een anti-virale werking bezit, daarvan geëxtraheerd.

Verschillende methodes kunnen gebruikt worden om een hoogmoleculair polysaccaride van het kweekfiltraat te extraheren. Dit zijn dialyse, ultrafiltratie, fractionele precipitatie, uitzouten, oplosmiddelpartitie, ionenuitwisse-lingschromatografie, gelfiltratiechromatografie, en absorp-tiechromatografie. Deze werkwijzen kunnen zowel individueel als gezamenlijk in een experiment gebruikt worden.

Om een hoogmoleculair polysaccharide uit de schimmels te extraheren zou dezelfde methode gebruikt voor het kweekfil gevolgd moeten worden nadat vaste stoffen geëlimineerd zijn met behulp van hydrathermale extractie.

De actieve component blijft binnen membranen wanneer dialyse gebruikt wordt. Een fenolische sulfaatreactie en een carbazoolsulfaatreactie zijn positief, maar de ninhydrinereactie is negatief. Daarom is aangetoond dat de hoogmoleculair polysaccharide geen aminozuur, proteïnen of aminosuikers bevat.

Bovendien is de actieve component verdeeld in een neutraal polysaccharide, waarvan het molecuulgewicht meer dan of gelijk aan 0,1 miljoen is, en het zure polysaccharide waarvan het molecuulgewicht minder dan 0,1 miljoen is. Deze polysacchariden kunnen dan gemeten worden door fenolische sulfaatmehode.

Beide polysacchariden vertonen een effectiviteit in plantbescherming en virusverwijdering; de systematische effectiviteit echter wordt alleen bij het zuur hoogmoleculair polysaccharide waargenomen.

In de onderhavige uitvinding wordt een hoogmoleculair polysaccharide over het algemeen gekweekt door het te schudden in het medium dat glucose bevat, "evios" (handelsnaam van de Evios Pharmaceutical Co.), kaliumfosfaat, magnesiumsulfaat en kraanwater. Nadat de kweek voltooid is, kan het kweekfiltraat verkregen worden door filtreren.

Vervolgens worden kweekfiltraat en de oplossing van de hydrothermaal geëxtraheerde schimmel verdund. Ethanol wordt in een hoeveelheid tweemaal zo groot als de verdunde oplossing toegevoegd aan de verdunde oplossing, en het neerslag dat gevormd wordt wordt vervolgens geëxtraheerd.

Dit neerslag wordt opgelost in water en wordt vervolgens toegevoegd aan trichloorazijnzuur. Nadat het nieuwe sediment zoals proteïne, etc. verwijderd is door de centrifugeseparatiemethode, moet dialyse uitgevoerd worden om een fosforzuurbufferoplossing te vormen.

Ingrediënten in de dialysemembranen worden geabsorbeerd in ionenuitwisselingsmateriaal dat een diëthylaminoethylgroep bevat, en vervolgens worden zij afzonderlijk vloeibaar gemaakt, door geleidelijk de NaCl-concentratie te laten stijgen.

Het effluence wordt afgescheiden in vastgestelde hoeveelheden, en de suikerhoeveelheid wordt bepaald met behulp van de fenolische sulfaatmethode.

De inhoud van elke geëxtraheerde vloeistof wordt geanalyseerd met behulp van chromatografie. De geëxtraheerde vloeistof, welke alleen hoogmoleculair polysaccharide als suiker bevat, wordt vervolgens gekozen.

Weer wordt ethanol toegevoegd aan de vloeistof en proteïnen etc. verwijderd na verwijdering van het neerslag. Dialyse wordt uitgevoerd tegen gedemineraliseerd water, en na vriesdrogen kan een gevriesdroogde hoolmoleculair polysaccharide verkregen worden.

Het gevriesdroogd hoogmoleculair polysaccharide moet gezuiverd worden door gelfiltratiechromatografie, en tenslotte wordt een hoogmoleculair polysaccharidemonsterzout verkregen.

In aanvulling worden kationen zoveel mogelijk verwijderd uit het hoogmoleculair polysaccharide monsterzout door middel van ionenuitwisselingshars, en een hoogmoleculair polysaccharidemonster kan verkregen worden.

Tussen deze hoogmoleculaire polysacchariden wordt een hoogmoleculair polysaccharide F-B verkregen door een hoogmoleculair polysaccharide F-B producerend schimmel te kweken, en een hoogmoleculair polysaccharide F-Ab wordt verkregen door het kweken van een hoogmoleculair polysaccharide F-Ab producerende schimmel. Beide zijn nieuwe hoogmoleculaire polysacchariden en tonen de volgende fysisch-chemische eigenschappen: (1) Elementenanalyse [hoogmoleculair polysaccharide F-B monsterzout] C : 34,8% H : 5,5% N : 0,6%

Asgehalte : 11,6% [hoogmoleculair polysaccharide F-B monster] C : 37,1% Η : 5,9% N : 0,5%

Asgehalte : 5,2% [hoogmoleculair polysaccharide F-Ab monsterzout] C : 36,0% H : 6,0% N : 0,5%

Asgehalte : 9,0% [hoogmoleculair polysaccharide F-Ab monster] C : 37,9% H : 5,9% N : 0,4%

Asgehalte : 3,9% (2) Molecuulgewicht [hoogmoleculair polysaccharide F-B]

De verkregen resultaten bij het uitvoeren van gelfiltratiechromatografie zijn getoond in figuren la en 2a.

Bereik van de gelfiltratiemethode : 7.000 - 17.000

Gemiddeld molecuulgewicht : 12.000 [hoogmoleculair polysaccharide F-Ab]

De verkregen resultaten bij het uitvoeren van gelfiltratiechromatografie zijn getoond in fig. lb en 2b.

Bereik van de gelfiltratiemethode : 10.000 - 20.000

Gemiddeld molecuulgewicht : 15.000 - 16.500 (3) Optische rotatie [hoogmoleculair polysaccharide F-B] [α]2^ = -39° (C=0,53%; waterige oplossing) [hoogmoleculair polysaccharide F-Ab] r l25 LCCJ D = -34° (C=0,52%, waterige oplossing) (4) ultraviolet absorptiespectrum [hoogmoleculair polysaccharide F-B]

Getoond in figuur 3a [hoogmoleculair polysaccharide F-Ab]

Getoond in figuur 3b (5) infrarood absorptiespectrum [hoogmoleculair polysaccharide F-B]

Getoond in figuren 4a en 5a [hoogmoleculair polysaccharide F-Ab]

Getoond in figuren 4b en 5b [hoogmoleculaire polysacchariden F-B, F-Ab]

Deze hoogmoleculaire polysaccharide monsterzouten verto- -1 nen een sterke C00 absorptie bij 1612 cm .

-1

Verder neemt de absorptie bij 1612 cm van de hoogmoleculaire polysaccharide-monsters, waarvan het kation verwijderd is door ionenuitwisselingshars af, aan de anderekant, wordt absorptie van COOH groep bij 1725 cm"1 bevestigd.

(6) Oplosbaarheid in oplosmiddelen [hoogmoleculaire polysacchariden F-B, F-AB]

Beide kunnen opgelost worden in water en dimethylsulfoxy— de. Geen van beide kan echter opgelost worden in methylalcohol, ethyl-alcohol, aceton of ether.

(7) Kleurreactie [hoogmoleculaire polysacchariden F-B, F-Ab] fenolische sulfaatreactie positief (beide) carbazool sulfaatreactie positief (beide) ninhydrine-reactie negatief (beide) (8) Onderscheid van basisch, zuur en neutraal (hoogmoleculaire polysacchariden F-B, F-Ab]

De pH van 0,1% waterige oplossing van hoogmoleculaire polysaccharide-monsters zijn beide zuur.

(9) Kleur [hoogmoleculaire polysacchariden F-B, F-Ab]

Beide zijn wit.

(10) Suikersamenstelling en hun formatie [hoogmoleculaire polysaccharideb F-B, F-Ab]

Elk hoogmoleculair polysaccharide werd gehydrolyseerd in 2N-trifluoracetaat gedurende één uur bij 121°C. ALs resultaat werden glucose en glucuronzuur gedetecteerd door dunnelaagchromatografie welke uitgevoerd werd op inzetplaten.

Glucuronzuur in elk hoogmoleculair polysaccharide werd bepaald door de carbazoolsulfaat-methode (bijvoorbeeld, T. Bitter, H. Muir, Anal. Biochem., 4, 330, 1962).

Verder nadat elk hoogmoleculair polysaccharide gehydrolyseerd was, werd het gedeoxydiseerd in alditol-acetaat op de gebruikelijke wijze (b.v. comprehensive polysaccharide chemistry vol. I, p. 68. door Atsuya Harada, Takeo Koizumi; gepubliceerd door Kodan-sha 1973) en werd geanalyseerd door gaschromatografie.

In dit geval waren reacties met ninhydrinereagens beide negatief, en werden noch aminozuren, noch aminosuikers gedetecteerd, [hoogmoleculair polysaccharide F-B]

Als resultaat was de verhouding van de samenstelling van glucose ten opzichte van glucuronzuur 3,4 : 1.

[Hoogmoleculair polysaccharide F-AB]

Als resultaat was de verhouding van de samenstelling van glucose tot glucuronzuur 9 : 2,0 - 1,8.

(11) Detectie van het proteïne [Hoogmoleculaire polysacchariden F-B, F-Ab]

Proteïne werd gedetecteerd in een 0,1 ml oplossing met behulp van de Lowry methode, in welke oplossing 20 mg hoogmoleculair polysaccharide opgelost was in 1 ml water. Proteïne werd niet aangetoond en kleur werd niet gevormd.

(12) Detectie van pyro-druivenzuur [Hoogmoleculaire polysacchariden F-B, F-Ab] Hydrolysematerialen van elk van beide hoogmoleculaire polysaccharide werden bepaald met een melkzuur-meetkit, welke geproduceerd wordt door Bellinger-Manheim Co. Pyrodruivenzuur werd echter niet gedetecteerd.

(13) Methyleringsanalyse [Hoogmoleculair polysaccharide F-B] (a) Na de methylering van hoogmoleculair polysaccharide F-B, werd dit gehydrolyseerd tot alditolacetaat. Het volgende resultaat werd verkregen bij gebruikmaking van gaschromatografieanalyse: 1.5 - di - 0 - acetyl - 2,3,4,6 - tetra - 0 - methyl glycitol: 1.3.5 - tri - 0 - acetyl - 2,4,6 - tri - 0 - methyl glycitol: 1.5.6 - tri - 0 - acetyl - 2,3,4 - tri - 0 - methyl glycitol: 1.3.5.6 - tetra - 0 - acetyl - 2,4 - di - 0 - methyl glycitol = 1:1.5:4:2 (b) Het residu van het glucuronzuur in hoogmoleculair polysaccharide werd gereduceerd om het residu van het glucose op de gebruikelijke wijze te verkrijgen (b.v. H. Minakami et al·., Agric. Biol. Chem., 48, 2405-2414, 1984). Vervolgens werd het residu gemethyleerd en gehydrolyseerd tot alditolacetaat. Het volgende resultaat werd verkregen onder gebruikmaking van gaschromatografieanalyse.

1.5 - di - 0 - acetyl - 2,3,4,6 - tetra - 0 - methyl glycitol: 1.3.5 - tri - 0 - acetyl - 2,4,6, - tri - O - methyl glycitol: 1.5.6 - tri - 0 - acetyl - 2,3,4 - tri - 0 - methyl glycitol: 1.3.5.6 - tetra - O - acetyl - 2,4 - di - O - methyl glycitol = 2:3:4:2 [Hoogmoleculair polysaccharide F-Ab] (a) Hoogmoleculair polysaccharide F-Ab werd gemethyleerd, en vervolgens gehydrolyseerd tot alditolacetaat. Het volgende resultaat werd verkregen onder gebruikmaking van gaschromatografieanalyse.

1.5 - di - 0 - acetyl - 2,3,4,6 - tetra - 0 - methyl glycitol: 1.3.5 - tri - 0 - acetyl - 2,4,6 - tri - 0 - methyl glycitol: 1.5.6 - tri - 0 - acetyl - 2,3,4 - tri - 0 - methyl glycitol: 1.3.5.6 - tetra - 0 - acetyl - 2,4 - di - 0 - methyl glycitol = 1:2:4:2 (b) Het residu van glucuronzuur in het hoogmoleculair polysaccharide F-Ab werd gereduceerd om residu van glucose op de gebruikelijke wijze te verkrijgen (b.v. H. Minakami et al., Agric. Biol. Chem., 48, 2405-2414, 1984). Vervolgens werd het residu gemethyleerd en gehydrolyseerd tot alditol-acetaat. Het volgende resultaat werd verkregen onder gebruikmaking van gaschromatografieanalyse.

1.5 - di - 0 - acetyl - 2,3,4,6 - tetra - 0 - methyl glycitol: 1.3.5 - tri - 0 - acetyl - 2,4,6 - tri - 0 - methyl glycitol: 1.5.6 - tri - 0 - acetyl - 2,3,4, - tri - 0 - methyl glycitol: 1.3.5.6 - tetra - 0 - acetyl - 2,4, - di - 0 - methyl glycitol = 2:3:4:2

De chemicaliën voor de bescherming van planten en de verwijdering van plantvirussen volgens de onderhavige uitvinding hebben grote effectiviteit in preventie en verwijdering van plantvirussen getoond.

Hun effectiviteit laat een prominente verzadigde schuivende dominantie zien.

Verder kunnen de chemicaliën voor de bescherming van planten en verwijdering van plantvirussen volgens de onderhavige uitvinding tegen lage kosten voor massaproduktie verschaft worden, omdat zij gemakkelijk geproduceerd kunnen worden in de fermentatie-industrie door het kweken van schimmels.

Pig. la toont het gelfiltratie-chromatogram van het hoog-moleculaire polysaccharide F-B onder gebruikmaking van TSK gel G3000 PWXL kolom. In de figuur, toont een doorgetrokken lijn moleculair gewichts-standaardmateriaal pullulan, en een gestippelde lijn toont het hoogmole-culaire polysaccharide F-B.

Fig. 1b soont het gel-filtratiechromatogram van het hoog-moleculair polysaccharide F-Ab onder gebruikmaking van een TSK gel G3000 PWXL kolom. In de figuur, toont een doorgetrokken lijn moleculair ge-wichtsstandaardmateriaal pullulan, en een gestippelde lijn toont het hoogmoleculair polysaccharide F-Ab.

Fig. 2a toont het gelfiltratie-chromatogram van het hoogmoleculair polysaccharide F-B onder gebruikmaking van een Asahipak GS-510 kolom. In de figuur toont een doorgetrokken lijn moleculair ge-wichtsstandaardmateriaal pullulan, en een gestippelde lijn toont hoogmoleculair polysaccharide F-B.

Fig. 2b toont het gelfiltratie-chromatogram van het hoogmoleculair polysaccharide F-Ab onder gebruikmaking van een Asahipak GS-510 kolom. In de figuur toont een doorgetrokken lijn moleculair ge-wichtsstandaardmateriaal pullulan, en een gestippelde lijn toont hoogmoleculair polysaccharide F-Ab.

Fig. 3a toont het ultraviolet absorptiespectrum van het hoogmoleculair polysaccharide F-B.

Fig. 3b toont het ultraviolet absorptiespectrum van het hoogmoleculair polysaccharide F-Ab.

Fig. 4a toont het infrarood absorptiespectrum van het hoogmoleculair polysaccharide-monsterzout F-B.

Fig. 4b toont het infrarood absorptiespectrum van het hoogmoleculair polysaccharide-monsterzout F-Ab.

Fig. 5a toont het infrarood absorptiespectrum van het hoogmoleculair polysaccharide-monster F-B.

Fig. 5b toont het infrarood absorptiespectrum van het hoogmoleculair polysaccharide-monster F-Ab.

Fig. 6 toont de oplosbaarheidskromme voor de absorptie van het hoogmoleculair polysaccharide, waaruit het kweekmateriaal van Fomes fomentarius JTS3046 stam ZETA-Prep 100 DEAE kolom is verkregen.

Het lineair laten stijgen van de NaCl-concentratie van 0 tot 400 mM, het afscheiden van de oplossing, en het gebruik van een beetje suiker in de geëxtraheerde vloeistof wordt gemeten en vervolgens uitgezet.

De onderhavige uitvinding wordt verder gedetailleerd uitgelegd door de volgende voorbeelden, de onderhavige uitvinding is echter niet beperkt tot deze voorbeelden.

(1) Kweek van schimmels

Fomes fomentarius JTS 3046 stam (FERM-BP 2230) werd ge-inoculeerd op medium van aardappelen, glucose en Japanse gelatine in een reageerbuis, en de schimmels werden gedurende 10 dagen bij 28°C gekweekt om het te verduurzamen.

Deze stock-stam werd geïnoculeerd op 100 ml van het volgende medium A in een driehoekskolf met een inhoud van 500 ml. Vervolgens werd het gekweekt onder draaien en schudden gedurende 10 dagen bij 28°C en 200 toeren/minuut, en werd vervolgens bewaard als zaadschimmels.

Medium A

Glucose 50 g

Pepton 2 g

Gistextract 2 g

Moutextract 10 g KH2P04 5 g

MgS04 - 7H20 2,5 g

Kraanwater 1000 ml 100 ml Zaadschimmel kweekmateriaal werd gehomogeniseerd in een menger. 50 ml van de 100 ml zaadschimmel kweekmateriaal werd ge-inoculeerd op 100 ml van het volgende medium B in een driehoekskolf met een inhoud van 3 1. Het werd vervolgens gekweekt onder draaien en schudden gedurende 10 dagen bij 28°C en 200 toeren/minuut om schimmelkweekmate-riaal te verkrijgen.

Medium B

Glucose 50 g

Evios 6 g KH2P04 2 g

MgS04 - 7H20 1 g

Kraanwater 1000 ml

Andere stammen zoals Fomes fomentarius IFO 8246, IFO 30371, ATCC 26708, enz. worden gekweekt op dezelfde wijze om het schimmel-kweekmateriaal te verkrijgen.

(2) yoorproces van de zuivering 8 1 Schimmelkweekmateriaal van Fomes fomentarius JTS 3046 stam, welke verkregen was volgens (1) hierboven, werden gefiltreerd onder gebruikmaking van een Toyo filterpapier nr. 5C. (acht 3-1 driehoeks-kolven werden gebruikt). Schimmels en kweekfiltraat werden verkregen.

Vijfmaal de hoeveelheid schimmels aan water werd toegevoegd aan de schimmels, en de oplossing werd gedurende 10 minuten bij 60°C verhit om vloeistof te extraheren.

16.000 ml Ethanol werd toegevoegd aan 8000 ml kweekfiltraat en geëxtraheerde vloeistof, en de oplossing werd gedurende 2 dagen bij 10°C met rust gelaten tot neerslag optrad. Het neerslag werd afgescheiden van de oplossing door de centrifuge-separatiemethode.

Het neerslag werd vervolgens toegevoegd aan 800 ml water en werd als oplossing gebruikt.

Aan de oplossing werd 40% (w/v) van 240 ml van een tri-chloorazijnzuuroplossing toegevoegd, en na schudden werd dit overnacht bij 10°C met rust gelaten. Om neerslag zoals proteïne, etc. te verwijderen welke verschenen, werd een centrifuge-separatiemethode gebruikt gedurende 15 minuten bij 12.000 toeren/minuut, en de supernatant-vloei-stof werd verzameld.

De supernatant-vloeistof werd op een dialysemembraan (spectrobore 3) aangebracht en werd herhaaldelijk geëquilibreerd met 10 mM fosfaatbufferoplossing (pH 6,0).

De binnenoplossing in het dialysemembraan werd geabsorbeerd op een drager type Zeta-Prep 100 DEAE (geproduceerd door LKB) welke een diëthylaminoethylgroep bezat na beladen, en vervolgens werd de inhoud van de buis gespoeld met 3000 ml 10 mM fosfaatbufferoplossing.

Het merendeel van neutrale hoogmoleculair polysaccharide F-N werd niet geabsorbeerd in de buis, maar werd slechts vloeibaar gemaakt.

Vervolgens werd om de concentratie van NaCl van 0 tot 400 mM lineair te laten stijgen 1500 ml effluens geëxtraheerd met een snelheid van 25 ml/'min.

Onder gebruikmaking van een fractieverzamelaar werd het effluent gescheiden in 10 ml hoeveelheden in reageerbuizen. De suiker-hoeveelheid in het geëxtraheerde vloeistof in elke reageerbuis werd gemeten met behulp van de fenolische sulfaatmethode.

Verder werd de zuiverheid van het geëxtraheerde vloeistof in elke reageerbuis onderzocht met hoge snelheidsvloeistofchromatografie uitgevoerd op een Toso's TSK gel G3000 PW kolom.

Vloeistof welke dezelfde ingrediënten bevatten werd onderzocht door gelfiltratiechromatografie onder gebruikmaking van een Asahipal GS-510, en de moleculaire gewichtsverdeling werd bepaald.

Tegelijkertijd werd de zuiverheid van elke ingrediënt onderzocht door dunnelaagchromatografie met gebruikmaking van inzetpla-ten.

De vastgestelde hoeveelheidswaarde van elke geëxtraheerde vloeistof welke gedetecteerd werd door de fenolische sulfaatmethode werd uitgezet als getoond in fig. 6.

De geëxtraheerde vloeistof in reageerbuizen nr. 8 tot nr. 11 bevatte neutraal hoogmoleculair polysaccharide F-N.

Geëxtraheerde vloeistof in reageerbuizen nr. 12 tot nr.

19 bevatte neutraal hoogmoleculair polysaccharide F-N en zuur hoogmoleculair polysaccharide F-Ab.

Geëxtraheerde vloeistof in reageerbuizen nr. 20 tot nr.

27 bevatte zuur hoogmoleculair polysaccharide F-Ab.

Geëxtraheerde vloeistof in reageerbuizen nr. 28 tot nr.

42 bevatte zuur hoogmoleculairepolysacchariden F-Ab en F-B.

Geëxtraheerde vloeistof in reageerbuizen nr. 43 tot nr.

56 bevatte zuur hoogmoleculair polysaccharide F-B.

Geëxtraheerde vloeistof in reageerbuizen nr. 57 tot nr.

62 bevatte zuur hoogmoleculaire polysacchariden F-B en F-C.

Geëxtraheerde vloeistof in reageerbuizen nr. 63 tot nr.

76 bevatte zuur hoogmoleculair polysaccharide F-C.

(3) Werkwijze voor de zuivering van hoogmoleculair polysaccharide F-B

Geëxtraheerde vloeistof uit reageerbuizen nr. 43 tot nr.

56 welke verkregen waren in (2) hierboven werd verzameld. Ethanol werd vervolgens in een hoeveelheid van 0,8 maal de hoeveelheid van de geëxtra- vloeistof toegevoegd aan vloeistof · Ds oplossing hleef overnacht bij 10°C staan en de supernatant-vloeistof werd verzameld met behulp van een centrifuge-separatiemethode.

Ethanol werd in een hoeveelheid van 0,7 maal de hoeveelheid geëxtraheerde vloeistof toegevoegd aan de supernatant-vloeistof, en het neergeslagen polysaccharide werd verzameld. Zelfs eiwit, welke in een uitermate kleine hoeveelheid aanwezig was werd volledig verwijderd.

Het verzamelde polysaccharide werd in een buis voor dialyse gedaan en werd gedurende 2 dagen in gedemineraliseerd water gedia-lyseerd.

Nadat de dialyse voltooid was werd de oplossing gevriesdroogd, en werd 600 mg gevriesdroogd hoogmoleculair polysaccharide F-B monster verkregen.

Het gevriesdroogde monster van hoogmoleculair polysaccha-£.^{j0 p—b werd gebruikt om 500 mg van een hoogmoleculair polysaccharide F-B monsterzout te verkrijgen onder gebruikmaking van LC-09 model type geëxtraheerde vloeistofchromatografie welke was geproduceerd door de Japan Analysis Industry en welke kolommen bezit. Deze Asahipak GS-510 kolommen werden verbonden aan GS-320 in serie.

Kweekmaterialen van de andere stammen zoals Fomes fomentarius IFO 8246, IFO 30371, ATCC 26708, etc. werden op dezelfde wijze gezuiverd, en hoogmoleculair polysaccharide F—B monster en monster— zout werden verkregen.

(4) Vbrkwijze voor de zuivering van hoogmoleculair polysaccharide F-Ab

Geëxtraheerde vloeistof uit reageerbuizen nr. 20 tot nr. 27 welke verkregen waren volgens (2) hierboven werden verzameld. Ethanol werd in een hoeveelheid van 0,8 maal de hoeveelheid van geëxtraheerde vloeistof vervolgens toegevoegd aan de vloeistof. De oplossing bleef overnacht bij 10°C staan en de supernatant-vloeistof werd verzameld onder gebruikmaking van een centrifuge-separatiemethode.

Ethanol werd in een hoeveelheid van 0,7 maal de geëxtraheerde vloeistof toegevoegd aan de supernatant-vloeistof, en hét neergeslagen polysaccharide werd verzameld. Zelfs proteïne, welke in een uitermate kleine hoeveelheid aanwezig was, werd volledig verwijderd.

Verzameld polysaccharide werd in een buis voor dialyse gezet en werd gedurende 2 dagen in gedeloniseerd water gedialyseerd.

Nadat dialyse uitgevoerd was werd de oplossing gevriesdroogd, en 600 mg van gevriesdroogd hoogmoleculair polysaccharide F-Ab monster werd verkregen.

Het gevriesdroogde monster hoogmoleculair polysaccharide F-Ab werd gebruikt om 500 mg hoogmoleculair polysaccharide F-Ab mon-sterzout te verkrijgen onder gebruikmaking van LC-09 model type geëxtraheerd vloeistofchromatografie, welke was geproduceerd door de Japan Analysis Industry en welke kolommen bezat. Deze kolommen bezaten Asahipak GS-510 welke gebonden was aan GS-320 in serie.

Kweekmaterialen van de andere stammen zoals Fomes Fomentarius IFO 8246, IFO 30371, ATCC 26708, etc., werden op dezelfde wijze gezuiverd, en hoogmoleculair polysaccharide F-Ab monsters en monsterzout werden verkregen.

(5) Chemische eigenschappen van hoogmoleculair polysaccharide [Hoogmoleculair polysaccharide F-B]

Het infrarood absorptiespectrum van het hoogmoleculair polysaccharide F-B monsterzout welke was verkregen volgens (3) hierboven, zoals getoond in fig. 4a, vertoonde een sterke absorptie van COO -groep -1 bij 1612 cm en bevatte een kation zoals natriumion.

Verwijdering van kation van het hoogmoleculair polysaccharide F-B monsterzout door een ionen-wisselingsharskolom verminder- -1 de de absorptie bij 1612 cm ? van de andere kant werd deze van de COOH-groep bij 1725 cm * duidelijk zichtbaar.

Volgens het infrarood absorptiespectrum is het echter nogal moeilijk het kation volledig te verwijderen. Daarom werd aangenomen dat het gezuiverde monster, als getoond in fig. 5a een hoogmoleculair polysaccharide F-B monster was.

Het werd bevestigd dat de verkregen monsters klaarblijkelijk een enkel materiaal waren als resultaat van de voornoemde verscheidenheid van chromatografie. Zij waren alle wit en werden transparant wanneer ze opgelost werden in water.

(a) Elementenanalyse

Analytische resultaten van hoogmoleculair polysaccharide F-B monsterzout welke was verkregen uit het kweekmateriaal voor Fomes fomentarius JTS 3046 stam volgens (2) en (3) hierboven zijn als volgt.

C : 34,8% H-: 5,5% N : 0,6%

Asgehalte : 11,6%

Analytische resultaten van hoogmoleculair polysaccharide F-B monster zijn als volgt.

C : 37,1% H : 5,9% N : 0,5%

Asgehalte : 5,2%

In de bovenstaande analyse fluctueerde, wanneer dezelfde geteste monsters gebruikt werden, de waarden van stikstof en asgehalte vaak. Met deze fluctuatie fluctueerden de waarden van C en H eveneens licht.

Er wordt aangenomen dat de fluctuatie van de hoeveelheid asgehalte, zoals de ammonium-ionen en natrium-ionen welke combineren om een zout te vormen, in elke zuivering verscilden vanwege het feit dat hoogmoleculair polysaccharide F-B een zuur materiaal is.

Verder omdat de verwijderingssnelheid van kation door ionenuitwisselingshars in elk experiment verandert, kon de complete verwijdering van N en asgehalte niet uitgevoerd worden.

(bj Molecuulgewichtsbepaling

Testresultaten van molecuulgewicht van hoogmoleculair polysaccharide F-B, welke verkregen was uit Fomes fomentarius JTS 3046 stam door gelfiltratie-chromatografie worden getoond in figuren la en 2a. Toso's TSK gel G3000 PWXL kolom of Asahikasei's Asahipak GS-510 kolom zijn uitgerust met hoge snelheid-vloeistofchromatografie (verbonden aan een Rï detector) en gebruikte pullulan als standaard molecuul-gewichtsmateriaal (Pullulan Shodex STANDARD P-82; geproduceerd door Showadenko Co., Ltd.).

Het verdelingsbereik van het molecuulgewicht bij een gelfiltratiemethode was 7000 - 17.000, en het gemiddelde molecuulgewicht was 12.000 bij gebruikmaking van de eerstgenoemde kolom. Dezelfde waarde werd verkregen wanneer zelfs de laatstgenoemde kolom gebruikt werd.

Het verdelingsbereik van het molecuulgewicht van hoogmoleculair polysaccharide F-B monster welke verkregen was uit de kweek- materialen van andere stammen was 7000 - 17.000.

[Hoogmoleculair polysaccharide F-Ab]

Het infrarood absorptiespectrum van het hoogmoleculair polysaccharide F-Ab monsterzout welke verkregen was volgens (4) boven genoemd, zoals getoond in fig. 4b, toonde een sterke absorptie van de C00 -groep bij 1612 cm * en bevatte een kation zoals natriumion.

Verwijdering van het kation van het hoogmoleculair polysaccharide F-Ab monsterzout door een ionenuitwisselingsharskolom, ver- -1 minderde de absorptie bij 1612 cm ; van de andere kant werd die van een COQH-groep bij 1725 cm * duidelijk getoond.

Volgens het infrarood absorptiespectrum is het echter nogal moeilijk het kation volledig te verwijderen. Daarom werd aangenomen dat het gezuiverde monster, zoals getoond in fig. 5b, een'hoogmoleculair polysaccharide F-Ab monster is.

Het werd bevestigd dat de verkregen monsters klaarblijkelijk als enkelvoudig materiaal als resultaat van de voornoemde verscheidenheid van chromatografie.

Ze waren allemaal, wit en Werden transparant wanneer ze opgelost waren in water.

(a) Elementenanalyse

Analytische resultaten van hoogmoleculair polysaccharide F-Ab monsterzout welke was verkregen uit het kweekmateriaal van Fomes fomentarius JTS 3046 stam volgens (2) en (4) hierboven zijn als volgt.

C : 36,0% H : 6,0% N : 0,5%

Asgehalte : 9,0%

Analytische resultaten van hoogmoleculair polysaccharide F-Ab monsters waren als volgt.

C : 37,9% H : 5,9% N : 0,4%

Asgehalte : 3,9%

In de bovenstaande analyse fluctueerde, wanneer dezelf- de geteste monsters gebruikt werden, de waarden van N en asgehalte vaak. In deze fluctuatie, fluctueerden de waarden van C en H eveneens licht.

Er wordt aangenomen dat de fluctuatie van de hoeveelheid asgehalte, zoals de ammoniumionen en de natriumionen welke combineren om een zout te vormen, verschilden in elke zuivering, vanwege het feit dat hoogmoleculair polysaccharide F-Ab een zuur materiaal is.

Verder omdat de verwijderingssnelheid van kationen door ionenuitwisselingshars in elke experiment verandert, kon de volledige verwijdering van N en asgehalte niet uitgevoerd worden.

(b) Molecuulgewicht-bepaling

Testresultaten van molecuulgewicht van hoogmoleculair polysaccharide F-Ab, welke was verkregen uit Fomes fomentarius JTS 3046 stam door gelfiltratie-chromatografie zijn getoond in de figuren lb en 2b. Toso's TSK gel G3000 PWXL kolom of Asahikasei’s Asahipak GS-510 kolom zijn uitgerust met hoge snelheid-vloeistofchromatografie (gekoppeld aan een RI detector) en pullulan werd gebruikt als standaard mole-cuulgewichtmateriaal (Pullulan Shodex STANDARD P-82; geproduceerd door Showadenko Co., Ltd.).

Het verdelingsbereik van molecuulgewicht door een gel-filtratiemethode was 10.000 - 20.000, en het gemiddeld molecuulgewicht was 15.500 bij de eerstgenoemde kolom en 16.500 bij de laatstgenoemde kolom.

Het verdelingsbereik van het molecuulgewicht van hoogmoleculair polysaccharide F-Ab monster welke was verkregen uit kweekmate-rialen van andere stammen zoals Fomes fomentarius IFO 8246, IFO 30371, ATCC 26708, etc., was eveneens 10.000 - 20.000.

(6) Testmonsters

De volgende uitleg wordt getoond als testmonsters om de effectiviteit van een plantbescherming en virusverwijdering chemicaliën volgens de onderhavige uitvinding te tonen.

[Testmonster 1]

De antivirale werkingen van het kweekfiltraat van verscheidene stammen welke verkregen was volgens (1) boven en hun verdun-ningswater werden onderzocht in elke TMV.

Tabaksoort (Xanthin NC) welke locale lesies ontwikkelde vanwege inoculatie van virussen werden gebruikt in de test.

Tabaksplanten voor de test werden gekweekt in een pot met een diameter van 12 cm. Zes bladeren in twee potten (drie bladeren in elke bak) werden getest als monster .

Met betrekking tot het geteste blad, werd een geopend blad begrensd door het centrale vat (zowel bovenoppervlak als het on-deroppervlak van het blad kan gebruikt worden), en de ene helft van het blad werd bedekt met een geteste vloeistof onder gebruikmaking van een verfkwast. De andere helft van het blad werd bekleed met water als controle.

Eén dag nadat het monster behandeld was, werd het volledige bovenoppervlak van het blad besprenkeld met siliciumcarbide en gezuiverd TMV (0,05 ' ug/ml) werd zeer precies geinoculeerd.

Drie of vier dagen na de virusinoculatie, werden het aantal lesies welke verschenen op het geïnoculeerde blad geteld, en de preventiegraad werd berekend met behulp van de volgende formule. De testresultaten staan getoond in tabel A.

Inhibitiegraad (%) _ aantal lesies op behandelde helft aantal lesies op controlehelft ^ TABEL A (Plant virus-inhibitie-effectiviteit van schimmels)

Geteste Kweek- Behandeling Inhibitie- schimmels filtraat graad (%) (verdunnings- graad)

Fomes fomentarius 200 boven oppervlak bekleed 100 JTS 3046 10 onder oppervlak bekleed 86

Fomes fomentarius 20 boven oppervlak bekleed 100 IFO 8246 1 onder oppervlak bekleed 87

Fomes fomentarius 20 boven oppervlak bekleed 98 IFO 30371 1 onder oppervlak bekleed 72

Fomes fomentarius 20 boven oppervlak bekleed 96 ATCG 26708 1 onder oppervlak bekleed 33

Fomes geotropus 10 boven oppervlak bekleed 100 ATCC 26709 1 onder oppervlak bekleed 56 TABEL A (Vervolg) Q0-j-gg-f-g Kweek- Beiiendeling Inhibitie schimmels filtraat graad (%) (verdunnings-graad)

Fomes melanoporus 10 boven oppervlak bekleed 95 ATCC 26132 1 onder oppervlak bekleed 32

Als getoond in tabel A was er nagenoeg 100% inhibitie-graad bij bijna alle geteste monsters waar het bovenoppervlak van het blad behandeld werd.

[Testmonster 2]

De antivirale werkingen van het kweekfiltraat van Fomes fomentarius 3046 stam welke getoond werd met de hoogste effectiviteit in testmonster 1 en zijn verdunningswater werd nog zorgvuldig onderzocht in TMV. De werkwijze welke gebruikt werd was in overeenstemming met die van testmonster 1. De testresultaten worden getoond in tabellen B en C.

TABEL B (Plantvirus-inhibitie-effectiviteit van kweekfiltraat; No. 1)

Concentratie kweekfiltraat verdund in gedestilleerd water xx Gemiddelde waarde van aantal lesies van 6 bladeren xxx Kweekfiltraat TABEL C (Plantvirus-inhibitie-effectiviteit van kweekfiltraat; No. 2)

x Concentratie kweekfiltraat verdund in gedestilleerd water XX Gemiddelde waarde van aantal lesies van 6 bladeren XXX Kweekf iltraat

Als getoond in tabel B voor de bladeren behandeld op het bovenoppervlak, vertoonden alle geteste monsters nagenoeg 100% inhi-bitiegraad.

Van de andere kant zoals getoond in tabel C werd de inhibitiegraad eveneens bewezen, wanneer het onderoppervlak van het blad behandeld werd. Eveneens werd zelfs de niet-behandelde helft van het blad beïnvloed.

Met andere woorden vergeleken met een blad waarop virussen geïnoculeerd werden zonder bekleding door enig testmonster, werd een significant aantal minder necrotische lesies op de controle-bladhelft welke bekleed was met testmonster aangetroffen.

Deze resultaten tonen dat de actieve materialen systemisch effectief waren in de onderhavige uitvinding.

[Testmonster 3]

Kweekfiltraat van Fomes fomentarius JTS 3046 stam werd in een dialysemembraan (Spectrobore 3) gedaan. Na de volledige dialyse onder gebruikmaking van water als buitenvloeistof werd het kweekfiltraat blootgesteld aan Japan Analysis Industry's LC-09 model type geëxtraheerd vloeistof-chromatografie met kolommen met behulp van de binnenste vloeistof van het membraan. Deze kolommen hebben een Asahipak GS-510 welke verbonden is met een GS-320 in 'serie. De binnenvloeistof van dialysemembraan werd geëxtraheerd met behulp van een 50 mM fosfaatbuffer-oplossing (pH 7,0), en vervolgens werden neutraal hoogmoleculair polysaccharide waarvan het molecuulgewicht meer is dan of gelijk is aan 0,1 miljoen (bij benadering 200 mg / filtraat 1.000 ml) en zuur hoogmoleculair polysaccharide waarvan het molecuulgewicht minder is dan of gelijk is aan 0,1 miljoen (bij benadering 100 mg / 1.000 ml filtraat) verkregen.

Verder werden tests van het kweekfiltraat, neutraal hoogmoleculair polysaccharide en zuur hoogmoleculair polysaccharide uitgevoerd op dezelfde wijze als voor testmonster 1.

Van de andere kant werden 5 lage bladen van de tabaks-plant (Xanthin NC) van 55 dagen na zaaien, hoogte 45 cm, besproeid door het kweekfiltraat en hoogmoleculair polysaccharide welke verkregen was door het kweekfiltraat. Een dag later werden drie bovenste gesloten bladeren zeer zorgvuldig geïnoculeerd met 0,05 ^ug/ml TMV.

Gedestilleerd water werd in het gebied van niet-be handeld controledeel gesproeid.

Drie of vier dagen na de TMV inoculatie werden necro- tische lesies welke op geïnoculeerde bladeren verschenen geteld, en de inhibitiegraad werd berekend op dezelfde wijze als voor testmonster 1. De resultaten staan getoond in tabel D en E.

TABEL D (Plantvxrus-inhxbxtxe-effeetivxteit van kweekfiltraat en hoogmoleculaire polysaccharide)

TABEL E (Systemische inhibitie-effectiviteit van kweekfiltraat en hoogmoleculair polysaccharide)

Als getoond in de tabellen D en E werkt de inhibitie-effectiviteit op de bladhelft zonder behandeling. Daarnaast vermindert de behandeling door kweekfiltraat en zuur hoogmoleculair polysaccharide op deel van tabaksblad het aantal necrotische lesies in de bovenste helft van het blad welke niet behandeld is.

Uit het bovenstaande kan geconcludeerd worden dat de effectiviteit van het kweekfiltraat en zuur hoogmoleculair polysaccharide systemisch is. Uit de gecontroleerde resultaten kan eveneens beredeneerd worden dat de systemische en effectieve verbinding in het kweekfiltraat zuur hoogmoleculair polysaccharide is.

[Testmonster 4]

Het kweekfiltraat van Fomes fomentarius JTS 3046 stam als reagens en de antivirale werking tegen TMV werd getest met behulp van verschillende planten.

Het virus werd gebruikt met betrekking tot geteste planten.

Het kweekfiltraat werd verdund tot een gematigde concentratie door water en verdeeld. Het virus werd bekleed en geinoculeerd de eerste dag na verdeling. De ziekte werd onderzocht op de 14de dag na inoculatie. De resultaten staan getoond in tabel F.

TABEL F (Plantvirus-inhibitie-effectiviteit van kweekfiltraat m.b.t. verschillende planten)

x 2,5 verdunning met kweekfiltraat

De effectiviteit werd niet alleen in de combinatie van Xanthin NC en TMV gevonden, maar eveneens in combinatie met andere planten en TMV.

[Testmonster 5J

De filtratie van hyfen-cultuur in Fomes fomentarius JTS 3046 stam leverde kweekfiltraat en schimmels op.

Terwijl antivirale werking in dit kweekfiltraat gecontroleerd werd in het TMV, werden verschillende hoogmoleculaire poly-sacchariden, hoogmoleculair polysaccharide F-B en hoogmoleculair polysaccharide F-Ab onderzocht.

De tabakssoort (Xanthin NC) welke plaatselijk necroti-sche lesies ontwikkelde vanwege de geïnoculeerde virussen werden in de test gebruikt.

De tabaksplanten voor de test werden gekweekt in een pot met een 12 cm diameter.

Een geopend blad werd begrensd door het centrale vat (zowel bovenoppervlak als onderoppervlak van het blad kunnen gebruikt worden), en een helft van het blad werd bekleed met een testvloeistof met behulp van een verfkwast. De andere helft van het blad werd bekleed met water als controle.

Eén dag na behandeling werd het volledige bovenoppervlak van het blad geinoculeerd met het virus.

De concentratie van het inoculatievirus was 0,05 ug/ml TMV.

Het aantal necrotische lesies welke verschenen op het geïnoculeerde blad werden geteld op de 3de tot 7de dag na inoculatie.

De inhibitiegraad werd berekend met behulp van de formule voor het monster in test 1.

De resultaten staan getoond in de tabellen G, Η, I en J.

TABEL G (Plantvirus-inhibitie-effectiviteit van verschillende extracties)

TABEL H (Plantvirus-inhibitie-effectiviteit van hoogmoleculair polysaccharide F-B)

Η

Gemiddelde waarde van aantal lesies van 6 bladeren.

TABEL I (Plantvirus-inhibitie~effectiviteit van hoogmoleculair polysaccharide F-Ab; No. 1)

a.

Gemiddelde waarde van aantal lesies van 6 bladeren.

TABEL J (Plantvirus-inhibitie-effectivitelt van hoogmoleculair polysaccharide F-Ab; No. 2)

Gemiddelde waarde van aantal lesies van 6 bladeren.

Volgens de tabellen G en I toonden bijna alle testmonsters voor de oladeren behandeld op het bovenoppervlak, een 100%'s inhibitiegraad.

Volgens de tabellen H en J toonde behandeling met zuur hoogmoleculair polysaccharide F-B, zuur hoogmoleculair polysaccharide F-Ab of kweekfiltraat daarvan effectiviteit niet alleen in de inhibitiegraad maar zelfs voor het onder-oppervlak van het blad, maar eveneens toonde het effectiviteit op de niet-behandelde bladhelft.

Met andere woorden vergeleken met een blad waarop virussen geïnoculeerd werden zonder bekleding van enig testmonster, was er een significant aantal minder necrotische lesies op de gecontrasteerde bladhelft welke bekleed was met het testmonster.

Deze resultaten tonen dat zowel zuur hoogmoleculair polysaccharide F-B en zuur hoogmoleculair polysaccharide F-Ab systemisch werkzaam waren volgens de onderhavige uitvinding.

[Testmonster 6]

Aan de andere kant werden 5 lagere bladen van tabaksplant (Xanthin NC) van 60 dagen na zaaien, 45 cm hoog, besproeid door het kweekfiltraat en hoogmoleculair polysaccharide welke verkregen was door het kweekfiltraat. Een dag later werden drie bovenste gesloten bladeren zeer precies geïnoculeerd met 0,05 ^ug/ml TMV.

Gedestilleerd water werd op het gebied van het niet-behandelde controledeel gesproeid.

Drie dagen na de TMV inoculatie werden necrotische lesies die optraden op de geïnoculeerde bladeren geteld, en de inhibitiegraad werd berekend op dezelfde wijze als in testmonster 1. De resultaten worden getoond in tabel K.

TABEL· K (Systemische inhibitie-effectiviteit van verschillende extracties)

Zoals getoond in tabel K kan geconcludeerd worden dat de effectiviteit van dit geactiveerd ingrediënt systemisch is vanwege het feit dat het aantal lesies afnam zelfs in een niet-behandeld blad van identieke individuele organismen tengevolge van de behandeling van een deel van de tabaksbladeren met behulp van dit geactiveerde ingrediënt.

Claims

1. Chemische samenstelling voor de bescherming van planten en verwijdering van plantvirussen, die een plantvirus preventief werkzame verbinding als effectief ingrediënt bevat, welke gekweekt werd met behulp van een schimmel gekozen uit het geslacht Fomes en dat geproduceerd werd in schimmels of medium.

2. Chemische samenstelling voor de bescherming van planten en verwijdering van plantvirussen volgens conclusie 1, waarin de schimmel gekozen uit het geslacht Fomes Fomes fomentarius is.

3. Chemische samenstelling voor de bescherming van planten en verwijdering van plantvirussen volgens conclusie 1, waarin de schimmel gekozen uit het geslacht Fomes Fomes geotropus is.

4. Chemische samenstelling voor de bescherming van planten en verwijdering van plantvirussen volgens conclusie 1, waarin de schimmel gekozen uit het geslacht Fomes Fomes melanoporus is.

5· Een produktiewerkwijze voor een chemische samenstelling voor de bescherming van planten en verwijdering van plantvirussen waarin de schimmel gekozen uit het geslacht Fomes gekweekt wordt en een plantvirus preventieve werkzame verbinding geproduceerd wordt in schimmels of medium en dat genoemde verbinding gebruikt wordt.

6. Produktiewerkwijze voor een chemische samenstelling voor bescherming van planten en verwijderen van plantvirussen volgens conclusie 5, waarin de schimmel gekozen uit het geslacht Fomes Fomes fomentarius is.

7. Een produktiewerkwijze voor een chemische samenstelling voor de bescherming van planten en verwijdering van plantvirussen volgens conclusie 5, waarin de schimmel gekozen uit het geslacht Fomes Fomes geotropus is.

8. Produktiewerkwijze voor een chemische samenstelling voor de bescherming van planten en verwijdering van plantvirussen volgens conclusie 5, waarin de schimmel gekozen uit het geslacht Fomes Fomes melano-porus is.

9. Chemische samenstelling voor bescherming van planten en verwijdering van plantvirussen welke hoogmoleculair polysaccharide F-B bevat met de volgende chemische eigenschappen als een effectief ingrediënt: (a) Elementen-analyse [hoogmoleculair polysaccharide F-B monsterzout] C : 34,8% H : 5,5% N : 0,6% Asgehalte : 11,6% [hoogmoleculair polysaccharide F-B monster] C : 37,1% H : 5,9% N : 0,5% Asgehalte : 5,2% (b) Moleculairgewicht De resultaten verkregen door het uitvoeren van gel-filtratie-chromatografie zijn getoond in figuren la en 2a. Bereik van gelfiltratiemethode ; 7000 - 17.000 Gemiddeld molecuulgewicht van de gelfiltratiemethode : 12.000 (c) Suikercompositie en diens samenstelling glucose : glucuronzuur =3,4:1

10. Produktiewerkwijze voor een chemische samenstelling voor de bescherming van planten en verwijdering van plantvirussen waarin hoogmoleculair polysaccharide F-B producerende schimmels behorende tot het geslacht Fömes gekweekt wordt en hoogmoleculair polysaccharide F-B uit het kweekmateriaal gebruikt wordt.

11. Chemische samenstelling voor de bescherming van planten en verwijdering van plantvirussen welke hoogmoleculair polysaccharide F-Ab bevat met de volgende chemische eigenschappen als een effectief ingrediënt: (a) Elementenanalyse [hoogmoleculair polysaccharide F-Ab monsterzout] C : 36,0% H : 6,0% N : 0,5% Asgehalte : 9,0% [hoogmoleculair polysaccharide F-Ab monster] C : 37,9% Η : 5,9% Ν : 0,4% Asgehalte : 3,9% (b) Moleculairgewicht De resultaten verkregen door het uitvoeren van gel-filtratie-chromatografie staan getoond in de figuren 1b en 2b. Bereik van gelfiltratiemethode : 10.000 - 20.000 Gemiddeld molecuulgewicht van gelfiltratiemethode: 15.000 - 16.500 (c) Suikercompositie en diens samenstelling glucose : glucuronzuur = 9 : 2,0 - 1,8.

12. Produktiewerkwijze voor een chemische samenstelling voor de bescherming van planten en verwijdering van plantvirussen waarin hoogmoleculair polysaccharide F-Ab producerende schimmels behorerdtot het geslacht Fomes gekweekt wordt en hoogmoleculair polysaccharide F-Ab uit het kweekmateriaal gebruikt wordt.

13. Hoogmoleculair polysaccharide F-B met de volgende chemische eigenschappen: (a) Elementenanalyse [hoogmoleculair polysaccharide F-B monsterzout] C : 34,8% H : 5,5% N : 0,6% Asgehalte : 11,6% [hoogmoleculair polysaccharide F-B monster] C : 37,1% H : 5,9% N : 0,5% Asgehalte : 5,2% (b) Molecuulgewicht Het resultaat verkregen voor het uitvoeren van gelfil-tratie-chromatografie is aangetoond in de figuren la en 2a. Bereik van gelfiltratiemethode : 7000 - 17.000 Gemiddeld molecuulgewicht van gelfiltratiemethode : 12.000 (c) Suikercompositie en diens samenstelling glucose : glucuronzuur =3,4 : 1.

14. Hoogmoleculair polysaccharide F-Ab met de volgende che mische eigenschappen: (a) Elementenanalyse [hoogmolecilair polysaccharide F—Ab monsterzout] C : 36,0% H : 6,0% N : 0,5% Asgehalte : 9,0% [hoogmoleculair polysaccharide F-Ab monster] C : 37,9% H : 5,9% N : 0,4% Asgehalte : 3,9% (b) Molecuulgewicht De resultaten verkregen door het uitvoeren van gel-filtratie-chromatografie staan getoond in figuren lb en 2b. Bereik van gelfiltratiemethode : 10.000 - 20.000 Gemiddeld molecuulgewicht van gelfiltratiemethode : 15.500 - 16.500 (c) Suikercompositie en diens samenstelling glucose : glucuronzuur =9 : 2,0-1,8.