NL8901639A - Simmondsine, aglyconsimmondsine, een isolatiewerkwijze daarvoor, alsook het therapeutische gebruik daarvan. - Google Patents

Description

Simmondsine, Aglyconsimmondsine, een isolatiewerkwijze daarvoor, alsook het therapeutische gebruik daarvan.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op Simmondsine in in hoofdzaak zuivere vorm, dat wil zeggen vrijgemaakt van van nature aanwezige verontreinigingen, waardoor Simmondsine tot nu toe is aangeduid als een therapeutische stof met een toxische nevenwerking. Verder heeft de uitvinding betrekking op Aglyconsimmondsine, op het gebruik van beide stoffen in biologisch werkzame preparaten, met name eetlust remmende preparaten, en tenslotte op de isolatiewerkwijze voor het in zuivere vorm verkrijgen van Simmondsine, Simmondsine-2'-ferulaat, en Aglyconsimmondsine.

Jojoba (Simmondsia Chinensis) is een woestijnplant die in het wild groeit op de dorre gronden in het zuidwesten van de U.S.A. en in Mexico. Jojobazaden leveren 50% olie op die chemisch verwant is aan walvisolie. Het meel dat overblijft na ontoliën is rijk aan proteïnen en koolhydraten, maar is niet geschikt als veevoeder wegens de aanwezigheid van een aantal toxische 2-cyanomethyleencyclohexylglucosiden, die ongeveer 3% van het meel uitmaken.

Het meest voorkomende toxische glycoside is Simmondsine (2-cyanomethyleen-3-hydroxy-4,5-dimethoxycyclohexyl-p-D-glucoside). Daarnaast komt er een geringere hoeveelheid Simmondsine-2'-ferulaat (1 * — (2-cyanomethyleen-3-hydroxy-4,5-dimethoxycyclohexyl)-2'-(4-hydroxy-3-methoxycinnamaat)-p-D-glucoside) voor.

Detoxifiëren van jojobameel verhoogt de economische waarde van de jojobaplant door het valoriseren van het meel als veevoeder.

Simmondsine en Simmondsine-2'-ferulaat zijn waardevol omwille van hun potentiële fysiologische werking. Zo is van Simmondsine bekend dat het een toxische eetlustremmer is.

De tot op heden bekende methoden voor het isoleren van Simmondsine uit ontolied jojobameel zijn omslachtig en duur.

Bij de methode beschreven door ELLIGER, C.A. et al., J. Chem. Soc. Perkin I, 19:2209-2212 (1973), wordt jojoba-meel achtereenvolgens geëxtraheerd met benzeen (24 h.), ethylacetaat (136 h.) en methanol (64 h.). Het ethylacetaat extract (10 g) wordt in 20 ml. methanol gebracht en gechromatografeerd op een kolom (5 x 100 cm) gevuld met silica gel in chloroform. Elutie gebeurt met een lineaire gradiënt van 100% chloroform tot 20% methanol-chloroform (10 1.) en daarna met 5 1. 20% methanol-chloroform. Indampen van de fractie die geëlueerd wordt tussen 8,4 en 10,2 1. geeft een visceuze olie (4,6 g) die opgelost wordt in 50 ml. methanol-aceton (1:1). Na toevoegen van 5 ml water wordt de oplossing ingedampt bij kamertemperatuur hetgeen 3,42 g Simmondsine oplevert. Deze methode is omslachtig, tijdrovend en duur door het grote verbruik aan organische solventen. Daarenboven wordt er geen Simmondsine-2'-ferulaat geïsoleerd.

VERBISCAR, A.J. en BANIGAN, T.J., J. Agr. Food Chem. 26:(6) 1456-1459 (1978) beschrijven een extractie-omkristallisatie.

Ontolied jojobameel wordt twee maal geëxtraheerd met aceton gedurende 4 h. Na verdampen van aceton blijft er een geel-bruin poeder over dat opgelost wordt in een overmaat aceton en door een kolom gevuld met silica gel 60 gestuurd wordt. Het eluaat wordt geconcentreerd en na verdampen van het solvent kristalliseert een Simmondine-rijk produkt uit.

Na herhaaldelijk omkristalliseren uit aceton wordt zuiver Simmondsine bekomen. Simmondsine-2'-ferulaat wordt geïsoleerd uit het supernatans, dat nog Simmondsine bevat.

Na verwijderen van aceton wordt het residu opgelost in een overmaat ethylacetaat. De ethylacetaatoplossing wordt ingedampt waarbij er eerst Simmondsine neerslaat. Verder indampen levert een gomachtige massa. Na oplossen in aceton-nitril en toevoegen aan isopropylether slaat Simmondsine-2'-ferulaat neer.

Deze methode heeft het nadeel dat de omkristallisatie van Simmondsine een moeizaam proces is en dat de werkwijze om Simmondsine-2'-ferulaat te isoleren uit de ethylacetaat-oplossing niet praktisch is en grote hoeveelheden solvent verbruikt.

De onderhavige uitvinding beoogt een isolatiewerkwijze voor Simmondsine en Simmondsine-2'-ferulaat te verschaffen, waarbij zoveel mogelijk de bovengenoemde nadelen worden vermeden. Dit wordt overeenkomstig de uitvinding bereikt met een werkwijze voor het isoleren van Simmondsine en Simmondsine-2'-ferulaat uit jojobazaad, omvattende de stappen voor het: i) het extraheren van ontolied jojobameel met een polair, aprotisch extractiemiddel; ii) het laten uitkristalliseren van Simmondsine en Simmondsine-2'-ferulaat uit het extractiemiddel; iii) het oplossen van de kristallen in een oplosmiddel; en iv) het onderling scheiden van Simmondsine en Simmondsine-2'-ferulaat.

Ten opzichte van de bekende isolatiemethoden wordt het voordeel bereikt dat bij het kristalliseren geen gomachtig materiaal ontstaat, maar uit het jojobameel nagenoeg volledig en in hoofdzaak slechts Simmondsine en Simmondsine-2'-ferulaat als kristallen uit het extractiemiddel worden verkregen. Slechts één extractiemiddel is vereist. Bij voorkeur is het extractiemiddel een lagere dialkylketon, bijvoorbeeld aceton, dimethylketon, diehtylketon, dimethylsulfoxide of mengsels daarvan. Bij voorkeur wordt aceton gebruikt.

De vorming van een gomachtig materiaal tijdens het kristalliseren wordt vermeden, doordat bij voorkeur het uitkristalliseren van Simmondsine en Simmondsine-21-ferulaat teweeg wordt gebracht door het gecontroleerd laten verdampen van het extractiemiddel. De verkregen kristallen worden opgenomen in het geprefereerde oplosmiddel water, waarna een scheiding teweeg wordt gebracht tussen de in het oplosmiddel aanwezige Simmondsine en Simmondsine-2'-ferulaat. Bij voorkeur wordt gebruik gemaakt van een gelpermeatiemateriaal bij de scheiding, doch andere biolo gisch gebruikelijke materialen kunnen worden toegepast voor het teweeg brengen van de scheiding, zoals gelpermeatie-materiaal, adsorptiemateriaal, ion-uitwisselende materialen en dergelijke.

Het aldus verkregen Simmondsine en het Aglyconsimmondsine bezitten een sterke eetlust remmende activiteit, echter zonder waarneembare toxische zij-effecten. Deze toxische effecten zijn beschreven door A.N. Booth et al. in Life Sciences deel 15, pagina 1115-1120 (1974). Beschreven is dat Simmondsine geïsoleerd uit jojoba-meel een toxische factor bevat die naar beschreven een benzylcyanide-derivaat van Simmondsine zou zijn. Dit komt overeen met het onder basische omstandigheden gevormde afbraakprodukt, een fenylcyanide, beschreven in het hiervoor genoemde artikel van Elliger (1973).

Door toepassing van de isolatiewerkwijze volgens de uitvinding wordt Simmondsine en na glucose-afsplitsing Aglyconsimmondsine verkregen, welke verbindingen geen toxische nevenwerkingen bezitten. Dit houdt in, dat Simmondsine en Aglyconsimmondsine zuiver zijn en voldoen aan de behoeft aan eetlustremmende middelen zonder toxische nevenwerkingen en die berusten op een verminderde voedselop-name.

Ter illustratie zullen hierna in een aantal voorbeelden de isolatiewerkwijze volgens de uitvinding en de biologische en biochemische resultaten van het gebruik van Simmondsine en Aglyconsimmondsine als eetlustremmdende middelen zonder toxische nevenwerking worden vermeld. Hierbij wordt opgemerkt dat ten opzichte van Simmondsine het Aglyconsimmondsine een sterker eetlustremmend effect bezit.

VOORBEELD I

154 gram op conventionele wijze ontolied jojobameel wordt geëxtraheerd met 650 ml aceton in een zogenaamd Soxhlett-apparaat. Het verkregen acetonextract wordt bewaard in een afgedekt bekerglas, waarbij aceton op gecontroleerde wijze langzaam verdampt. Tijdens de verdamping kristalliseert 4 gram witte kristallen uit. Deze kristallen bestaan in hoofdzaak uit Simmondsine en voor een geringe hoeveelheid uit Simmondsine-2'-ferulaat. 2,1 gram van de verkregen kristallen wordt opgelost in 120 ml water. Deze oplossing wordt gebracht op een preparatieve gelpermeatiekolom (doorsnede 5 cm; lengte 60 cm; drager Pharmacia Sephadex G10; eluent water). Tijdens de elutie worden achtereenvolgens Simmondsine en Simmondsine-2'-ferulaat bevattende fracties verkregen. Door het verwijderen van het water worden de zuivere vaste stoffen verkregen, te weten 1,9 gram Simmondsine en 0,1 gram Simmondsine-2'-ferulaat. Door ÜV-detectie (218 nm) van het de kolom verlatende eluaat is het mogelijk om automatisch en continu Simmondsine en Simmondsine-2'-ferulaat onderling te scheiden.

VOORBEELD II

Zuiver Simmondsine, verkregen in voorbeeld I, werd toegediend aan jonge volwassen ratten (Wistar, lichaamsgewicht 450-500 gram), in een dosis van 100 mg Simmondsine per kg lichaamsgewicht. Deze orale toediening van Simmondsine veroorzaakte een daling van het voerverbruik tot ongeveer 10g/24 uur, welke daling overeenkomt met ongeveer 50 tot 60% van het voergebruik door controledieren die ad libitum werden gevoerd. Een zelfde daling van het voerverbruik kon teweeg worden gebracht door andere jonge volwassen ratten Simmondsine via het voer toe te dienen in een hoeveelheid van 0,5 gew.%. Het verminderde voergebruik leidt tot een gewichtsverlies van ongeveer 10% na 7 dagen. Dit gewichtsverlies is gelijk aan dat bij ratten die dezelfde beperkte hoeveelheid voer ter beschikking werd gesteld, als de hoeveelheid die de dieren spontaan minder aten als gevolg van de toediening van Simmondsine.

De resultaten zijn weergegeven in tabel 1.

Uit het verminderde voerverbruik bij gefractioneerde toediening via het voer als via gastrale intubatie, kan worden afgeleid dat de remming van de voedselopname die is teweeggebracht door Simmondsine, tenminste ongeveer 24 uur duurt. Na het stopzetten van de toediening van Simmondsine neemt het voerverbruik door de dieren toe en neemt op overeenkomstige wij ze het lichaamsgewicht toe en wordt het oorspronkelijke gewicht bereikt na circa 8-10 dagen. Deze gewichtstoename is gelijk aan die van de ratten die in eerste instantie de beperkte hoeveelheid voedsel kregen toegediend en nadien ad libitum werden gevoerd. De resultaten worden getoond in tabel 2.

VOORBEELD III

Simmondsine dat is verkregen in voorbeeld I werd rechtstreeks intraveneus toegediend aan volwassen konijnen met een lichaamsgewicht van ongeveer 3 kg in een dosis van 50 mg per kg lichaamsgewicht.

De resultaten zijn weergegeven in tabel 3.

Simmondsine dat is verkregen in voorbeeld I werd via gastrale intubatie gedurende 5 dagen toegediend aan jonge Wistar ratten (ongeveer 150 g lichaamsgewicht) in een dosis van 250 mg per kg lichaamsgewicht. Vervolgens zijn een groot aantal biochemische parameters onderzocht, die een weerspiegeling zijn van de lever en nierfunctie. Bovendien zijn de cyanide- en thiocyanaatspiegels in het bloed bepaald.

De resultaten zijn weergegeven in tabel 4. Uit tabel 4 blijkt dat tussen de controlegroep en de Simmondsinegroep geen verschillen bestaan. De pairfeeding groep onderscheidt zich slechts in de glucosespiegel, hetgeen vermoedelijk te wijten is aan een lagere glycogeenbelading van de lever, een effect dat kan worden verklaard als gevolg van het laten vasten van deze pairfeeding dieren.

Tabel 5 toont het gewicht van de lever, nier en testikels voor controledieren, dieren waaraan Simmondsine is toegediend en de pairfeeding dieren. Het verminderde gewicht van de zaadblaasjes kan een gevolg zijn van de verminderde voedselopname, terwijl het verminderde levergewicht van de pairfeedinggroep overeenkomt met de in tabel 4 getoonde lagere glucosebloedspiegel.

Tenslotte zijn alle dieren onderworpen aan een anato- misch patologisch onderzoek. Tijdens dit onderzoek zijn geen zichtbare afwijkingen in de inwendige organen gevonden, bij zowel controle-, Simmondsine toegediende en pairfeeding dieren.

Bij de pairfeeding dieren werd evenwel een lichtere glycogeenbelading van de lever gezien.

Parallelle experimenten toonden 30 dagen na het stopzetten van dezelfde behandeling geen abnormaliteiten.

VOORBEELD V

50 mg Simmondsine, dat is verkregen in voorbeeld I, werd in 1,5 ml acetaatbuffer pH5 geïncubeerd met 4,5 mg beta-glycosidase (Boehringer C3.2.1.21.), waardoor tenminste 50% van de in Simmondsine aanwezige glucose werd vrijgemaakt.

Het vrijmaken van glucose kon worden aangetoond met behulp van dunne laag chromatografie en met behulp van de test kit 716.251 van Boehringer.

Het incubatiemengsel dat is verkregen na 15 minuten werd door middel van gastrale intubatie toegediend aan jonge volwassen ratten met een lichaamsgewicht van 400-450 gram. Ter vergelijking werd aan soortgelijke ratten 50 mg zuiver Simmondsine, verkregen in voorbeeld I, door middel van gastrale intubatie toegediend.

Uit tabel 6 blijkt, dat het zuivere Simmondsine een voedselopnamedaling van 30% veroorzaakte, maar het Aglycon-simmondsine een voedselopnamedaling van 86%.

Het gezuiverde Simmondsine overeenkomstig de uitvinding vertoont een eetlustremmend effect bij gebruik in een concentratie van 20-500 mg per kg lichaamsgewicht (of in andere hoeveelheden, afhankelijk van het organisme). Voor Aglyconsimmondsine zijn bruikbare concentraties 10-250 mg per kg lichaamsgewicht. Het eetlustremmend effect treedt op na orale toediening alsook na intraveneuse toediening, en houdt tenminste 24 uur aan. De toediening van Simmondsine heeft een verminderde voedselopname en daardoor vermagering tot gevolg. Na het stopzetten van de toediening van Simmondsine treedt gewichtstoename en uiteindelijk het bereiken van het normale gewicht op.

De remming van de eetlust door het toedienen van Simmondsine gaat niet gepaard met toxische invloeden.

Orale toediening gedurende 5 dagen in een hoeveelheid van 250 mg per kg lichaamsgewicht aan jonge ratten leverde geen toxische indicaties op, terwijl geen meetbare verhogingen konden worden vastgesteld voor de cyanide en thiocyanaatspiegels in het bloed.

Het Aglycon van Simmondsine heeft ten opzichte van Simmondsine zelf een groter eetlustremmend effect.

Opgemerkt wordt dat door middel van de isolatiewerk-wijze volgens de uitvinding een jojobameel resteert, dat door het verwijderen van toxische stoffen een aanmerkelijk hogere waarde heeft verkregen.

!) p<0,01

!) p<0,01

!) significant verschillend t.o.v. controle 2) significant verschillend t.o.v. Simmondsine

1) significant verschillend t.o.v. controle 2) significant verschillend t.o.v. Simmondsine

Claims (14)

1. Simmondsine in in hoofdzaak zuivere vorm.

2. Aglyconsimmondsine.

3. Het gebruik van Simmondsine volgens conclusie 1 als biologisch werkzame stof.

4. Het gebruik van Simmondsine volgens conclusie 3 als eetlustremmend middel.

5. Het gebruik van Aglyconsimmondsine volgens conclusie 2 als biologisch werkzame stof.

6. Het gebruik van Aglyconsimmondsine volgens conclusie 5 als eetlustremmend middel.

7. Eetlustremmend middel bevattende als actief bestanddeel Simmondsine volgens conclusie 1 en een farmacologisch acceptabele drager en/of verdunmiddel.

8. Eetlustremmend middel bevattende als actief bestanddeel Aglyconsimmondsine volgens conclusie 2 en een farmacologisch acceptabele drager en/of verdunmiddel.

9. Werkwijze voor het isoleren van Simmondsine en Simmondsine-2-ferulaat uit jojobazaad, omvattende de stappen voor het: i) extraheren van ontolied jojobameel met een polair aprotisch extractiemiddel; ii) het laten uitkristalliseren van Simmondsine en Simmondsine-21-ferulaat uit het extractiemiddel; iii) het oplossen van de kristallen in een oplosmiddel; en iv) het onderling scheiden van Simmondsine en Simmondsine-2'-ferulaat.

10. Werkwijze volgens conclusie 9, waarin het extractiemiddel in stap i) een lagere dialkylketon, bijvoorbeeld aceton, dimethylketon, diethylketon, dimethylsulfoxide of mengsels daarvan omvat.

11. Werkwijze volgens conclusie 9 of 10, waarin het uitkristalliseren in stap ii) teweeg wordt gebracht door het verdampen van extractiemiddel.

12. Werkwijze volgens conclusie 9-11, waarin het oplosmiddel in stap iii) water omvat.

13. Werkwijze volgens conclusie 9-12, waarin de scheiding wordt uitgevoerd met een gelpermeatiemateriaal, bijvoorbeeld sephadex G-10.

14. Jojobameel resterend na toepassing van de isola-tiewerkwijze volgens conclusie 9-13.