NL8004699A

NL8004699A - Furocoumarine, farmaceutische samenstellingen met furocoumarine als actieve stof en werkwijze ter bewerkstelliging van een fotochemotherapeutische behandeling.

Info

Publication number: NL8004699A
Application number: NL8004699A
Authority: NL
Original assignee: Consiglio Nazionale Ricerche
Priority date: 1979-08-20
Filing date: 1980-08-20
Publication date: 1981-02-24
Also published as: IT1166343B; DE3031164C2; GB2061726A; NL190448B; US4312883A; NL190448C; JPS5630982A; FR2463616A1; BE884813A; JPS5919957B2; GB2061726B; IE51692B1; CA1162929A; FR2463616B1; IE801747L; DE3031164A1; IT7984134A0

Description

. . . . · ‘ -1- 21466/Vk/mv

Aanvrager: Consiglio Nazionale Delle Ricerche, Rome, Italië.

Korte aanduiding: Furocoumarine, farmaceutische samenstellingen met furo-coumarine als actieve stof en werkwijze ter bewerkstelliging van een fotocheraotherapeutische behandeling.

5

De uitvinding heeft betrekking op furocoumarine voor fotcr chemische therapie van psoriasis en andere huidziekten die gevoelig zijn voor een dergelijke behandeling. De uitvinding heeft verder betrekking op een furocoumarine houdende samenstelling en op een fotochemothera-10 peutische behandeling op basis van een dergelijke furocoumarine houdende samenstelling.

Met name heeft de uitvinding betrekking op een furocoumarine voor de fotochemotherapeutische behandeling van psoriasis en andere huidziekten die gevoelig zijn voor een dergelijke behandeling en tot uiting 15 komen door een cellulaire hyperproliferatie of door 'gebrek van huid-pigment.

De furocoumarinenzijn algemeen bekend en ver 'dóórgedrongen in de plantenwereld. Deze kunnen worden verdeeld in psoralens of lineaire furocoumarines en angelicinen of vertakte furocoumarineverbindingen 20 De meest karakteristieke eigenschappen van de lineiare en vertakte furocoumarineverbindingen is hun lichtgevoelige activiteit, die wordt aangetoond op verschillende biologische substraten, welke activiteit zoals algemeen bekend, wordt verkregen door de gecombineerde werking van het furocoumarine en langgolvig ultra-violet licht (UV-A).

25 De lineiare furocoumarineverbindingen (psoralens) zijn al

gemeen bekend door hun cutane lichtgevoelige werking. Wanneer bijvoorbeeld de huid van een mens of een guineas biggetje eerst wordt behandeld met lineaire furocoumarineverbindingen en daarna bestraald met langgolvige ultra-violet licht (UV-A) verschijnt na een periode van ongeveer 12-24 50 uren een cutane erythema en dit wordt gevolgd door een donkere pigmentatie na enkele dagen. Deze eigeiteohap is reeds toegepast sinds 1948 (El Mofty) onder toepassing van natuurlijke psoralen, xantotoxine (8~methoxypsoralen) geëxtraheerd uit een Egyptische plant de Ammi Majus voor een behandeling van leucodermia of vitiligo (A.M.Kl. Mofty "Vitiligo and psoralens',' uit-^ gegeven door A.M.E1. Mofty, Pergamon Oxford 1968). De genezing van huidziekten, die wordt aangetoond door de aanwezigheid op de huid van de vlekken die niet hun natuurlijke pigmentatie aannemen zelfs niet wanneer deze blootgesteld worden aan zonlicht wordt bewerkstelligd door het beft/} Ω A fiO Q

-2- 21466/Vk/mv behandelen van dergelijke vlekken met p8oralenverbindingen en het daarop volgend blootstellen aan UV-A-licht. Deze behandeling herstelt de pigmen-tering.

Meer recentelijk zijn psoralenverbindingen ontwikkeld in de 5 fotochemotherapie van psoriasis en andere huidziekten, die tot uiting komen door hyperproliferatie van de cutane cellen door orale toediening topicale toediening zoals beschreven door H. Tronnier, R. LShning: about the current status of the methoxsalen UV-A-therapy in Dermatology, Castellania 2, 267 (1974), J.A. Parrish, T.B. Fitzpatrick, L. Tanenbaum, 10 M.A. Pathak: Photochemotherapy of psoriasis with oral methoxsalen and longwave ultraviolet light, N.Eng. J. Med. 291, 1207 (1974).

De orale toediening is eenvoudiger dan de plaatselijke toediening. Het maakt het mogelijk om een betere controle van de huid-fototoxiciteit te onderzoeken en een makkelijker controle op de huid-15 pigmentatie die goed homogeen is. Een nadeel is dat bij orale toediening een mogeli$ke hepatoxiciteit kan worden bewerkstelligd zoals aangegeven door H. Tronnier, L. Lohning'in Photochemotherapy in Dermatology, in "Photochemotherapy: basic thegnique and side effects". Over lezingen van het Duits-Zweedse Symposium on Photomedicine in Oberursul (ty. Duitsland) 20 gehouden op 23-25 april 1975 is een artikel verschenen van E.G. Jung, Schattauer Verlag, Stuttgart-New York bladzijde 71 (1976), E. Wolff:

Report on Round Table Photochemotherapy (PUVA.) of psoriasis, in "Research on Photobiology", uitgegeven door A. Castellani, Proceedings of the VI Int. Congress on Photobiology, Rome 29/9-3/10, 1976, Plenum Press, 25 New York ,bladzijde 751 (1977) eneen bepaald risico van de cataract doordat de psoralensverbindingen zich ophopen in de lenzen van de ogen, die blootgesteld zijn aan de werking van het zonlicht zoals aangegeven door S. Lerman en R.F. Borkman: A method for detecting 8-methoxypsoralen in the ocular lens, in Science 197, 1287 (1977).

50 Anderzijds is de plaatselijke toepassing van psoiral ene verbindingen minder eenvoudig en gevaarlijker om andere redenen omdat het moeilijker is. ^gebleken na te gaan of er een fotoxische werking is op de huid, vanwege de niet homogene verdeling van de stof waardoor een minder homogene pigmentering wordt verkregen en bovendien loopt men een hoger 55 risico van huidkanker zoals aangegeven door T.B. Fitzpatrick in

Discussion, gepubliceerd in "Phototchemotherapy: basic technique and side effect^',lezingen van het Duis-Zweeds symposium met betrekking tot Photomedicine in Oberursel (W. Duitsland) 23-25 april 1975 uitgegeven door 80 04 69 9 , t * 4 -3- 21466/Vk/mv E.G. Jung Schattauer Verlag, Stuttgart-New York, bladzijde 12Ο, (1976), G, Rodighiero: The problem of the carcinogenic risk by furocoumarins,

Prog, Biochem. Pharmacol. 14 94 (1978), J.H. Epstein:-Risk and benefits of the treatment of psoriasis, N. Eng. J. Med, 300 852 (1979), R.S.

5 Stem, L.A, Thibodeaux, R.A. Kleinerman, J.A. Parrish, T.B. Fitz-

Patrick: Risk of curaneous carcinoma in patients treated with oralmethox- · salen pfcotochemotherapy for psoriasis, N. Eng. J. Med. 300 .852 (1979).

Ondahks deze nadelen echter is de fotochemotherapie met 10 psoralensverbindingen bij de huidige stand van zaken beter gebleken dan andere minder effectieve en .-meer gevaarlijke therapie vormen zoals bijvoorbeeld het gebruik van alleen bestraling met kortgolvig ultraviolet licht (UV-B) of het gebruik van geneesmiddelen hetgeen typische anti-tumormiddelen zijn of preparaten op een teerbasis.

15 In elk geval geldt dat onafhankelijk van de aard van de toediening het basisprincipe van de fotochemotherapie bestaat uit het gebruik maken van de karakteristieke eigenschappen van de psoralêns-verbindingen om de DNA en RNA-synthese en de cellulaire reproductie te remmen. Bij de psoralensverbindingen zijn deze remmende eigenschappen 20 echter nauw samenhangend met dë fytotoxische eigenschappen die tot uiting komen op de huid door de vorming van erythema en de daarop volgende hyperpigmentatie en tot nu is het zeer moeilijk gebleken met psoralensverbindingen om de therapeutische activiteit te scheiden van de fototoxische werking.

25 Het is ook bekend dat :iangelicine (vertakt fucocoumarine) hoewel het in staat ia om de synthese van nucleïnezuren te remmen en de cellulaire verdeling te belemmeren geen erythema of hyperpigmentatie van de huid bewerkstelligt (F. Bordin, S. Marciani, G. Baccichetti, F.

Dall’Aqqua, G. Rodighiero: Studies on the photosensitizing properties

30 of angelicin: contribution of monofunctional adducts furocoumarin- DNA

to the production of the photosentisized effects. Ital. J. Biochem.

24, 258 (1975), M.A. Pathak, T.B. Fitzpatrick: Bioassay of natural and synthetic furocoumarins (psoralens), J, Inv. Dermatol, 3¾ 509 (1959). Niettemin is de fotobiologische activiteit van angelicine zeer 35 zwak en praktisch niet te gebruiken in een therapie vanwege de lage capaciteit van de fotobinding tot DNA (G. Rodighiero, L. Musajo, F.

Dall'Acqua, S. Marciani, S Caporale, L. Ciavatta: Mechanism of skin photosensitization by furocoumarins: photoreactivity of various furo- o λ n /. fin n -4- 21466/Vk/mv coumarins with native DNA and with ribosomal SNA, Biochim.Biophys. Acta 217 ,40 (1970).

Uit tabel A blijken de eigenschappen van enkele lineaire furocoumarineverbindingen of psoralensverbindingen (8-methoxypsoralen 5 (8-MOP)^ 5?methoxypsoralen (5-MOP) en 4,5',8-trimethylpsoralien (TMP)) in vergelijking met de lineaire furocoumarineverbindingen 0f angelicine.

Volgens de uitvinding kan fotochemotherapie van psoriasis en andere huidziekten worden bewerkstelligd door een zeer effectieve vorm van furocoumarine welke hierdoor wordt gekenmerkt dat dit een 10 angelicine is, gemodificeerd door het invoeren van alkylgroepen en de farmaceutische toepasbare zouten hiervan.

Het is gebleken dat de invoering van alkylgroepen en bij voorkeur de methylgroepen in het angelicinemolecuul een duidelijke toename bewerkstelligt in de capaciteit van het intercalation in het duplex 15 DNA en van de fotoadditie tot de pyrimidine basen van het macromolecuul en zodoende een paralelle toename van de remmingscapaciteit van de cellulaire splitsing.

De alkylangelicineverbindingen verkregen volgens de uitvinding hebben naast de therapeutische werking die analoog is aan die van de 20 psoralensverbindingen bovendien het voordeel dat Ze de nadelen van deze laatste verbindingen niet hebben. Met name geldt: 1) zij bewerkstelligen geen fototoxische werking op de huid zodat de patient beveiligd is tegen het risico-van erythema en in het ‘.algemeen ook van de daaropvolgende hyperpigmentatie, 25 2) rze vergemakkelijken de bewerkstelliging van de plaatselijlfe therapie omdat ze geen zeer nauwkeurige onderzoekingen vereisen met betrekking tot de huidfototoxiciteit, hetgeen absoluut noodzakelijk is voor de psoralensverbindingen en dit feit kan de doordringing van deze therapie buiten de Iklinische toepassing vergemakkelijken,.

30 3) 3eze verbindingen hebben een lage mutagene activiteit en daardoor verminderen ze de mogelijkheid om cutane tumoren te bewerkstelligen. In dit· verband zijn angelicine en 4,5'-dimethylangelicine onderzocht in vergelijking met enkele psoralensverbindingen bij verschillende E. coli stammen. Een zeer 'lage mutagene activiteit is hierbij waarge-35 nomen, die aanzienlijk lager is dan die van psoralensverbindingen, bij stammen waarvan het bekend is dat ze niet in staat zijn om bekende her-stellings functies te hebben terwijl de mutagene activiteit niet bepaalbaar was bij de gevonden stammen zoals beschreven door S. Venturini, M. Tamaro, 80 0 4 69 9 -5- 21466/Vk/mv

• » I

C. Monti-Bragadin, P. Bordin,.F. Baccichetti, F. Carlassare: Comparative mutagenicity of linear and angular furocoumarins in E. Coli strains deficient is known repair functions, Chem.-Biol. Interactions, 30, 203 (1980)

5 TABEL A

Informatie met betrekking tot bekende furocoumarineverbindingen eigenschap lineaire furocoumarine niet lineaire furocou- verbindingen (8-MOP. marineverbindingen 10 ____________________ 5-MOP, TMP) (angelicine) lichtgevoelige ac- bekend, sterk bekend, afwezig tiviteit ____ stimulering van sterk, goed bekend afwezig, niet goed bepaald, nelamine pigmente- onbekend 15 ring____ carcinogeniciteit bekend, onbekend (plaatselijk en sterk (plaatselijk) oraal) zwak (oraal)__ nutageniciteit_bekend, sterk bekend .zwak 20 DNA-intercalatie- sterk en goed duidelijk en bekend sigenschap bekend__ DNA-synthese remmen- bekend, sterk bekend, zwak ie eigenschap lichtbindende eigen- bekend, sterk bekend, zwak 25 3 chap tot DNA_____________________ nonoadductvormende bekend,sterk bekend, zwak eigens chap____________ tussenstrengverkno- sterk en goed afwezig en bekend aingsinductie in DNA bekend 50 therapeutische effec- bekend, goed tot onbekend en niet bepaald tiviteit in Vitiligo voortreffelijk_______________________________ therapeutische effec- bekend, goed tot onbekend en niet bepaald tiviteit in psoriasis voortreffelijk____________________________ therapeutische effec- bekend onbekend 55 tiviteit bij andere ziekten _______________________ 8004 69 9 -6- 21466/Vk/rav

Het mechanisme van de werking van furocoumarineverbindingen (psoralens en anigelicineverbindingen) is bekend. Het hangt samen met de lichtbeschadiging_ die bewerkstelligd wordt in DNA. In feite vertonen deze stoffen een opmerkelijke activiteit ten opzichte van DMA en werken 5 hierop selectief. Wanneer bijvoorbeeld een furocoumarineverbinding wordt u toegevoegd aan een waterige oplossing van DNA wordt een complex in de grondtoestand gevormd waarbij het planaire furocoumarinemolecuul wordt gehouden tussen de twee basis paren van DNA. Wanneer het complex wordt bestraald met langgolvig ultra-violet licht (UV-A) absorbeert het 10 tu§sengelegen furocoumarine-molacuul dit licht en onder bewerkstelliging van een fotoreactie met de 5,6-dubbele binding van de pyrimidine-basen van DNA door C-vier-cycloadditiereacties. Bij het niveau van deze fotoreactie is het mogelijk om een sterk verschil op te merken tussen de lineaire en de vertakte furocoumarineverbindingen.

15 In feite zijn twee verschillende fotoreactieve sites, te weten de 3,4- en 4',5'- dubbele bindingen aanwezig in de furoKoumarine-verbindingen ( zowel psoralensverbindingen en angelicineverbindingen) en via deze sites hebben de C-vier-fotocycloadditiereacties plaats met de 5,6- dubbele binding van de pyrimidine basen van het macromolecuul.

20 Met name kunnen de ps or dene verb indingen vanwege de lineaire structuur of alleen een van de twee lichtgeovelige dubbele bindingen - koppelen onder vorming van monofuctionele adducten, of een koppeling aangaan met beide, waarbij twee cycloaddities worden bewerkstelligd met 2 pyrimidine basen die zich uitstrekken naar de complementaire banden 25 van DNA, onder vorming ’op deze manier van een inter-bandverknoping zoals beschreven door F. Dall'Acqua, S. Marciani, G. Rodighiero: Inter-strand cross-linkages occuring in the photoreaction between psoralen and DNA. FEBS letters 9, 121 (1970). Anderzijds kan de angelicine-verbinding door de hoekvormige structuur een koppeling i vormenn van 30 de twee lichtgevoelige sites, waarbij een koppeling wordt bewerkstelligd met een van de twee complementaire banden van DNA zoals beschreven door F. Dall'Acqua, S. Marciani, L. Ciavatta, G. Rodighiero: Formation of

inter-strand cross-linkings in the photoreactions between furocoumarins and DNA. Z. Naturforsch. 26b, 561 (1971). Met andere woorden kan gesteld 35 worden dat terwijl de* psoralensverbindingen in de fotoreactie met DNA

zowel de monofunctionele als bifunctionele adducten vormt, het angelicine alleen het monofunctionele adduct vormt.

Biologisch gezien is de consequentie van de mogelijke bi- ΑΠ (U 69 9 f « , 1 -7- 21466/Vk/mv functionele beschadiging dat deze ennstiger en gevaarlijker is dan de consequentie die bewerkstelligd wordt door de monofunctionele beschadiging. Het is in feite bekend dat in levende cellen DNA, hetgeen een macromolecuul is dat niet kan worden vervangen door een '"ex novo" 5 gesynthetiseerde copy, omdat het enkel kan reproduceren door zich zelf te copiëren, hetgeen een essentieel patrimonisch verschijnsel is dat de cellen probeert te bewaren op de best mogelijke manier, omdat het namelijk meestal waarschijnlijk is dat middelen aanwezig., zijn die in staat zijn om DNA te beschadigen door bestraling, chemische 10 middelen en dergelijke,waarbij de cellen worden bewerkstelligd met systemen die in staat zijn tot "reparatie" van de mogelijke beschadiging bij deze macromoleculen, hetgeen uit het bovenvermelde een absolute noodzakelijkheid is. In het geval van licht-beschadiging/bewerkstelligd in de DNA door de furocoumarineverbindingen is het bekend dat de verknoping die ge-15 induceerd wordt door de lineaire furocoumarineverbindingen (psoralens) noodzakélijk moet worden gerepareerd door zeer ingewikkelde processen die een genetische reconibinatie inhouden of door nood-procédé' s die sterk onderhevig kunnen zijn aan fouten, zoals de zogenaamde S.O.S. reparatie beschreven door R.S. Cole: Repair of DNA containing interstrand 20 crosslinks in Escherichia coli:sequential excision and recombination,

Proc.Nat.Acad.Sci.USA 70 ,1064 (1973), A. Belogurov, G.B. Zavilgelsky: A

mechanism of inactivation effect of photosensitizing 8-methoxypsoralen on bacteria and bacteriophages, Mol. Biol. (URSS) 12, 886 (1978) . Het DNA datop deze wijze is gerepareerd kan worden gemodificeerd in de 25 basis volgorde en de van belang zijnde cellen kunnen mutaties ondergaan of afsterven zoals beschreven door F. Bordin, F. Carla'.ssare, F.

Baccichetti, L. Anselmo,: DNA repair and recovery in Escherichia coli after psoralen and angelicin photosensitization, Biochim. Biophys.

Acta 447, 249 (1976). Wanneer het DNA niet betouwbaar is gerepareerd 30 kunnen de hiermee samenhangende cellen een neoplastische transformatie ondergaan en dit verschijnsel draagt in het algemeen bij tot de carcinogene activiteit voorkomend in bepaalde lineaire furocoumarineverbindingen zoals beschreven door D.L. Evans, K.J. Morrow: 8-methoxypsoralen induced alteration of mammalian cells, J. Inv. Dermatol. 72 35 (1979); J.E.

35 Trosk> and Chia-Chang, Relationship between mutagenesis and carcinogenesis, Photochem. Photobiol. 28, 157 (1978).

Anderzijds geldt dat bij angelicineverbindingen (Vertakte furocoumarineverbindingen) dus bij de monoadducten de beschadiging kan α η n l e oo -8- 21466/Vk/mv worden gerepareerd via eenvoudigere en storingsvrije mechanismen zoals het bekende "excision repair" zoals beschreven door R.S. Cóle: Repair of DNA containing interstrand crosslinks in Escherichia coli: sequential excision and recombination. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 70 1064 (1973), 5 F. Bordin, F. Carlassare, F. Baccichetti, L. Anselmo: DNA repair and recovery in Escherichia coli after psoralen and angelicin photosensitiza-tion, Biochem. Biophys Acta '447,249 (1976). Hieruit volgt dat de capaciteit van de inducerende mutaties aanzienlijk sterker tot uiting komen bij de psoralens ten opzichte van de angelicineverbindingen en de noodzakelijkheid van de betrokkenheid hiervan voor de voor fouten vatbare enzymatische systemen bij de reparatie van DNA hetgeen leidt tot psoralens hetgeen eveneens een bepaalde cancerogene activiteit is, hetgeen tot uiting komt bij bepaalde experimenten die uitgevoerd zijn op laboratoriumdieren door herhaalde plaatselijke cutane toepassingen en de daaropvolgende bestraling 15zoals beschreven door D.D. Grube, R.D. Ley, RrJ’M· Fry : Photosensitizing effects of 8-methoxypsoralen on the skin of hairless mice. -11- Strain and * spectral differences for tumorigenesis, Photochem. Photobiol. 25 269 ’(1977). Anderzijds wordt met de angelicineverbindingen het risico van cancerogenese aanzienlijk verlaagd door de wijze van reparatie van het 20betrokkken DNA en de daardoor verlaagde mutagene activiteit zoals beschreven door S. Venturini, N. Tamaro, C. Monti-Bragadin, F. Bordin, F.

Baccichetti, F. Carlassare: comparative mutagenicity of lineair and angular furocoumarins in E. coli strains deficient in known repair functions, Chem.-biol. Interactions 30, 203 (1980). In feite zijn de invloe-25den van de angelicineverbindingen in hoofdzaak de volgende: 1) de remming van de DNA en RNA-systese en de cellulaire splitsing, maar met een lagere sterfte ten opzichte van psoralens zoals aangetoond bij zowel bacteriele als celsystemen bij zoogdieren, 2) het herstellen van de fotobeschadiging met foutvrije mecha-30nismen en de daaropvolgende mogelijkheid van mutaties en van cancerogenesis hetgeen aanzienlijk minder is,ten opzichte van psoralens, waarbij het herstel van de fotobeschadiging plaats heeft met systemen die fouten bevatten zoals beschreven door E.M. Witkin: Ultraviolet mutagenesis and inducible DNA repair in Escherichia coli,· Bacteriol. Rev. 40, 869 (1976).

35 3) het absoluut ontbreken van fototoxiciteit op de normale huid van de mens en van guinese biggetjes en zodoende in tegenstelling tot psoralens het elimineren van erythema en inhet.algemeen van de daaropvolgende cutane hyperpigmentatie, 80 04 69 9 k * -9- 21466/Vk/tnv 4) het remmen van de systhese van epidermale DNA bij muizen in vivo.

Niettemin heeft angelicine een lage fotobindingsmogelijkheid ten opzichte van DNA en een daarmee samenhangende lage fotobiologische ^ activiteit, waardoor dit geneesmiddel niet geschikt is voor therapeutische toepassing. Deze beperking wordt volgens de uitvinding overwonnen door angelicine te modificeren door het invoeren van alkylgroepen. Op deze wijze zijn nieuwe verbindingen verkregen die een sterke verhoging hebben met betrekking tot de capaciteit van de intercalatie in duplex DNA en een sterke verhoging van de fotobinding tot de pyrimidinebasen van het macromolecuul hetgeen samenhangt met een verhoogde lichtgevoeligheids-activiteit. Op basis van de verhoogde lichtgevoeligheidsactiviteit en zodoende van de capaciteit om de sythese van DNA en RNA te remmen en de cellulaire splitsing te blokkeren zijn deze verbindingen zeer geschikte 1^ middelen gebleken voor de fotochemotherapie van psoriasis en andere huidziekten die gevoelig zijn voor deze behandeling.

De fotochemotherapie met alkylangelitineverbindingen geeft een verbetering ten opzichte van de fotochemotherapie met psoralens. In feite wordt dit bewerkstelligd omdat nagenoeg dezelfde therapuetische 9Π invloed wordt verkregen als bij psoralens ( het blokkeren van de cellulaire splitsing bij de huid ) waarbij het echter niet de nadelen van deze stoffen heeft.

Alkylangelicineverbindingen en methylpsoralens geeft een uitgesproken neiging om in vetten op te lossen en deze stoffen zijn 25 · » daarom «3zeer weinig oplosbaar m water. Met het oog op een fciogelijke therapeutische verbetering zijn ook in water oplosbare derivaten van alkylangelicineverbindingenbereid.

De bereiding van alkylangelicineverbindingen.

In het algemeen kan de bereiding van alkylangelicineverbindingen 30 volgens de uitvinding plaats hebben via verschillende werkwijzen in afhankelijkheid van het feit 'o'f de alkylgroep al of niet in de furaanring aanwezig is. De bereiding van de alkylangelineverbindingen begint door het condenseren van resorcine of 5-methylresorcine met maleïnezuur of ethvjacetoacetaat >ter verkrijging van de methylderivaten van 7-hydroxy-35 .

coumarine, welke verbindingen worden omgezet tot ether met allyl-bromide ter verkrijging van 7-allylethers.

De daaropvolgende Claison-transpositie van de allylethers geven als hoofdproduct de 8-allylderivaten samen met een kleine hoeveelheid Q n A L ft O fl -10- 21466/Vk/mv van de 6-isomeren. Met name moet er voor worden gezorgd dat de zuivering van de 8-allylcoumarineverbinding plaats heeft zodat sporen 6-isomeren worden verwijderd, omdat tijdens de volgende synthetische stappen deze verbindingen leiden tot de vorming van lineaire furocoumarineverbindingen 5 die volgens de uitvinding volledig afwezig moeten zijn omdat .deze een fototoxiciteit hebben ten opzichte van de huid en in staat zijn om inter-strengverknopingen te vormen.

De werkwijze voor de bereiding van de diverse verbindingen zal nader worden toegelicht.

10 Een mengsel van 25,0 g 5-methylresorcine, 26,0 g maleinezuur en 55 ml geconcentreerd H^SO^ wordt langzaam verwarmd tot de gasontwikkeling nagenoeg is beëindigd. Het reactiemengsel werd vervolgens uitgegoten onder sterk roeren in een mengsel van 700 ml water en ijs en dit werd geroerd tot een gomachtige massa werd verkregen die in het begin 15 werd gevormd en volledig dispergeerde.Het precipitaat werd verzameld door filtratie, gewassen met water en 2 keren herkristalliseerd met Me2C0 ter verkrijging‘van 15 g 5-methyl-7-hydroxycoumarine (C^HgO^) op het formuleblad aangegeven met formule 1, welke stof een smeltpunt heeft van 256 °C, welke stof vrij is van het isomeer 5-hydroxy-7-methylcoumarine 20 (C10Rg03) welke stof is aangegeven op het formuleblad met formule 2.

Een mengsel van 10,0 g 5-methylresorcine, 10 ml ethylaceto-acetaat en 10,0 g watervrij ZnC^ werd gedurende 1 uur verwarmd bij een temperatuur van 100 °C ter verkrijging van een halfzachte massa waaraan 10 ml 5Z HC1 werd toegevoegd. Het mengeel werd gedurende nogmaals 1 25 uur verwarmd.

Het mengsel werd afgekoeld en afgefiltreerd, het precipitaat gewassen met ^0 en herkristalliseerd uit MeOH ter verkrijging van 8,6 g 4,5-dimethyl-7-hydroxycoumarine welke stof op het formuleblad is aangegeven*’met formule 3 en een smeltpunt heeft van 257-258 °C.

30 Een oplossing van 250 ml Me2C0 van 15,0 g 5-methyl-7-hydroxy- coumarine, aangegeven op het formuleblad met formule 1 werd in reactie gebracht met 20 ml allylbromide in aanwezigheid van 5,0 g I^CO^ door het mengsel gedurende 5 uren te koken onder terugvloeikoeling. Na afkoelen werd afgefiltreerd en gewassen met vers Me2C0. Het afgekoelde 35 filtraat en het acetonhoudende wasmiddel werd ingedampt tot droog en het residu werd herkristalliseerd uit cyclohexaan ter verkrijging van 13,8 g 5-methyl-7-allyloxycoumarine wei^e stof is aangegeven op het formuleblad met formule 4 en een smeltpunt heeft van 83 °C.

80 0 4 69 9 -11- 21446/Vk/mv • *

Op dezelfde wijze werden de volgende verbindingen bereid: uit 7-hydroxycoumarine als uitgangsmateriaal werd 7-allyl-oxycoumarine bereid, welke stof overeenkomt met cj2H10°3 en ^et forraule" blad is aangegeven als formule 5 en een smeltpunt heeft van 88-89 °C na 5 herkristallisatie uit cyclohexaan, door uit te gaan van 4-methyl-7-hydroxycoumarine werd 4-methyl-7-allyloxycoumarine verkregen (C^H^Og) welke stof is aangegeven op het formuleblad met formule 6 en een smeltpunt heeft van 107-108 C na herkristallisatie uit cyclohexaan.

10 Uit 4,5-dimethyl-7-hydroxycoumarine (formule 3) werd 4,5-di- methyl-7-allyloxycoumarine verkregen welke stof is aangegeven met formule 7 op het formuleblad'(C^H^O^) en deze stof heeft een smeltpunt van 140 °G na herkristallisatie uit MeOH.

Een oplossing van 13,8 g 5-methyl-7-allyloxycoumarine (for-15 mule 4 aangegeven op het formuleblad) in 60 ml diemthylaniline werd gedurende 5 uren gekookt onder terugvloeikoeling. Na afkoelen werd 250 ml ..EtOAc toegevoegd en het mengsel werd enkele keren gewass'en met verdund HC1 en vervolgens met water. Het oplosmiddel werd verdampt na te zijn gedroogd over Na^SO^ en het residu werd door herkristallisatie uit 20 EtOAc verkregen zodat 4,5 g 5 -methyl-7-hydroxy-8-allylcoumarine werd verkregen welke stof overeenkomt met formule en op het formule blad is aangegeven als formule 8. Deze stof heeft een smeltpunt van 177 °C. Na chromatografische zuivering over silicagel en elueren met CBCl^ werd een moedervloeistof bereid waaruit verder 5-methyl-7-25 hydroxy-8-allylcoumarine werd verkregen in een hoeveelheid van 4,9 g (formule 8) vrij van het isomeer 5-methyl-6-allyl-7-hydroxycouimarine aangegeven met formule 9 op het formuleblad door dunne laag chromatogra-fie.

Analoog werd uit 7-allyoxycoumarine (formule 5) werd het 30 7-hydroxy-8-allylcoumarine ^C^2H10°3^ ver^reSen welke stof overeenkomt met formule 10 en een smeltpunt heeft van 165 °C na herkristallisatie uit EtOAc, welke stof vrij is van het isomeer 6-allyL-7-hydroxycoumarine (formule 11) ^^2^10^3^ aanSetoond door dunne laag chromatografie. Uit het 4-methyl- 7? ally loxycoumarine (formule 6) werd 4-methyl-7-hydroxy- 8- ally 1-35 coumarine verkregen (C^H^*^) we^e st°f overeenkomt met formule 12, aangegeven op het formuleblad en een smeltpunt heeft van 195 °C*na herkristallisatie uit EtOAc en vrij is van het isomeer 4-methy1-6-ally1- 7-hydroxycoumarine welke stof overeenkomt met formule 13, aangegeven op 8004699 -12- 21466/Vk/mv het formuleblad (C^H^Og)» hetgeen is aangetoond door dunne laag chro-matografie. Uit 4,5-dimethyl-7-allyloxycoumarine (formule 7) werd 4,5-dimethyl-7-hydroxy-8-allylcoumarine (O^H^O^) verkregen, welke stof overeenkomt met formule 14, aangegeven op het formuleblad en een smelt-5 punt heeft van 178 °C (MeOH) en volgens een dunne laag chromatografische bepaling vrij is van het isomeer 4,5-dimethyl-6-allyl-7-hydroxycoumarine * (C14H14O3) welke stof overeenkomt met formule 15 aangegeven op het formuleblad.

Ter bereiding van de alkylangelicineverbindingen met een alkyΙ-ΙΟ groep op de furanring werden 8-allyleoumarineverbindingen geacetyleerd en gebromeerd ter verkrijging van 8-(2',3'-dibroompropyl)derivaten, welke stoffen werden gecycliseerd met ethanolhoudende KOH ter verkrijging van de 5-methylangelicineverbindingen.

Op deze manier werd 5-methyl-7-hydroxy-8-allylcoumarine 15 (formule^) in een hoeveelheid van 4,5 g in 30 ml azijnzuuranhydride onder terugvloeikoeling gekookt welk mengsel 1,0 g watervrij AcONa bevatte gedurende 1 uur. Het ceactiemengel werd verdund met water en gedurende 10 minuten gekookf onder terugvloeikoeling, afgekoeld, ge -neutraliseerd met NaHCO^ en geëxtraheerd met EtOAc. Uit de over Na^SO^ 20 gedroogde organische fase werd het oplosmiddel verdampt en het residu herkristalliseerd uit MeOH ter verkrijging van 4,3 g 5-methyl-7-acetoxy-8 allylcoumarine (OjjH^O^) welke sotf overeenkomt met formule 16, aangegeven op het formuleblad en een smeltpunt heeft van 113 °C.

Analoog werd uit 7-hydrqxy-8-allylcoumarine met formule 10 25 het 7-acetoxy-8-allylcoumarine verkregen (C^H^O^) we^e st°f overeenkomt met formule 17 , aangegeven op het formuleblad en een smeltpunt heeft van 93-93,5 °C na herkrsitallisatie uit ligroine.

Uit 4-methyl-7-hydroxy-8-allylcoumarine met formule 12, werd .4-methyl-7-acetoxy-8-allylcoumarine verkregen (C^H^O^) welke stof 30 overeenkomt met formule 18, aangegeven op het formuleblad en een smeltpunt heeft van 101-102 °C na- herkristallisatie uit MeOH.

Uit 4,5-dimethyl-7-hydroxy?8-allylcoumarine met formule 14 werd 4,5-dimethyl-7-acetoxy-allylcoumarine verkregen (C^H^gO^) welke stof overeenkomt met. formule 19 aangegeven op het formuleblad en 55 een smeltpunt heeft van 166 °C na herkristallisatie uit MeOH.

Aan een oplossing van 4,5 g 5-methyl-7-acetoxy-8-allylcoumarine met formule 16, in 100 ml azijnzuur werd een azijnzure oplossing met een stoechiometische hoeveelheid broom druppelsgewijs toegevoegd bij kamertem- 8004 69 9 -13- 21466/Vk/mv peratuur. Op het einde van de toeyoeging werd de oplossing verder geroerd gedurende 30 minuten, het oplosmiddel verdampt tot een droog residu werd verkregen dat werd herkristalliseerd uit MeOH ter verkrijging van 5,2 g 5-raethyl-7-acetoxy-8-(2',3'-dibroompropyl)couraarine (Ci5Hi4°4Br2^ 5 welke .stof overeenkomt met formule 20 aangegeven op het formuleblad, en een smeltpunt heeft van 139 °C.

Analoog hieraan werd uit 7-acetoxy-8-allylcoumarine (formule 17) 7-acetoxy-8-(2' ,3'-dibroompropyl)coumarine bereid ^i4H^2°4Br2^ welke stof overeenkomt met formule 21 een een smeltpunt heeft van 123-10 123,5 °C na herkristallisatie uit MeOH.

Uit 4-methyl-7-acetoxy-8-aïlylcoumarine (formule 18) werd 4“ methyl-7-acetoxy-8-(2' ,3'-dibroompropyl)coumarine verkregen (C^^H^O^Br^) welke stof overeenkomt met formule 22, aangegeven op het formuleblad en een smeltpunt heeft van 156-157 °C na herkristallisatie uit MeOH.

15 Uit 4,5-dimethyl-7-acetoxy-8-allylcoumarine (formule 19) werd 4,5“dimethyl-7-acetoxy-8-(2,,31-dibroompropyl)coumarine verkregen ^16H16°4Br2^ we^e st°£ overeenkomt met formule 23, aangegeven op het formuleblad en een smeltpunt heeft van 148 °C na herkristallisatie uit MeOH,

Aan een ethanol houdende oplossing van 5,2 g 5-methyl-7-20 acetoxy-8-(2',3'-dibroompropyl)coumarine (formule 20) in 100 ml ethanol werd een 4% ethanol oplossing van KOH toegevoegd equivalent aan een molaire coumarine/KOH verhouding van 1:10. Het mengsel werd gedurende 80 minuten onder uitsluiting van licht onder terugvloeikoeling gekookt, af gekoeld, verdund met twee keren het volume aan ^0 en aange-25 Zurd met 10% HCl ter verkrijging van een neerslag dat werd verzameld door filtratie en herkristalliseerd uit EtOH ter verkrijging'van 1,3 g 5,5'-dimethylangelicine (C^H^qO^) welke stof overeenkomt met formule 24 ,aangegeven op het formuleblad en een smeltpunt heeft van 204-205 C.

Analoog hieraan werd uit 7-acetoxy-8-(2*,3'-dibroompropyl) 30 coumarine (formule 21) 5-methylangelicine verkregen (C^HgO^) welke stof overeenkomt met formule 25y' aangegeven op het formuleblad en een smeltpunt heeft van 149-150 na herkristallisatie uit MeOH.

Uit 4-methyl-7-acetoxy-8-(2',3f-dibroompropyl)coumarine (formule 22) werd 4,5'-dimethylangelicine verkregen (C^H ^Oj) we^e 35 stof overeenkomt met formule 26, aangegeven op het formuleblad en een smeltpunt heeft van 185 °C na herkristallisatie uit MeOH.

Uit 4,5-dimethyl-7-acetoxy-8-(2',3'-dibroompropyl)coumarine (formule 23) werd A^jS'-trimethylangelicine verkregen (C^H^Og) welke ΑΛΑ/. C Λ Λ -14- 21466/Vk/mv stof overeenkomt met formule 27 en een smeltpunt heeft van 203-204 °C na herkristallisatie uit MeOH.

Ter bereiding van de alkylangelicineverbindingen zonder alkylgroepf op de furanring volgens de uitvinding werden de 8-allylderi-5 vaten van coumarine bereid zoals boven is aangegeven en geozoniseerd tot de corresponderende 8-coumarinylacetaldehyden, die werden gecycliseerd met 85% H^PO^ ter verkrijging van de corrresponderende angelicinever-bindingen,. Deze werkwijze wordt hieronder nader toegelicfit.

Hiertoe werd 5-methyl-7-hydroxy-allylcoumarine (formule 8) 10 in een hoeveelheid van 3,0 g opgelost in 200 ml EtOAc en door decplossing, die afgekoeld werd in een ijsbad werd een stroom sozon houdende zuurstof geleid totdat 1,1 keren de stoechiometrische hoeveelheid was toegevoegd. De oplossing werd vervolgens onmiddellijk gehydroganeerd in aanwezigheid van 0,3 g 10% Pd op CaCO^ en het mengsel werd geroerd totdat de 15 snelle absorptie van waterstof beëindigde . De katalysator werd verwijderd door filtratie , het oplosmiddel verdampt ,60 ml 85% H^PO^ toegevoegd en het mengsel gedurende 20 minuten verwarmd bij een temperatuur van 100 °C. Het mengsel werd afgekoeld, verdund met 2 keren het volume aan water en geëxtraheerd met CHCl^. De organische fase werd gedroogd over 20 Na^SO^ en het oplosmiddel werd verdampt en het residu chromatografisch gezuiverd over een kolom met silicagel onder toepassing van CHCl^ waar-döor 5-methylangelicine werd verkregen wel^e 3t°f overeenkomt met formule 28, aangegeven op het formulbblad. De hoeveelheid verkregen 5-methylangelicine was 0,63 g en het smeltpunt na herkristallisatie uit 25 MeOH was 191-192 °C.

Analoog hieraan werd uit 4-methyl-7-hydroxy-8-allylcoumarine (formule 12) 4-methylangelicine (C._HQ0 ) verkregen welke stof overeenkomt I* o j met formule 29, aangegeven op het formuleblad en een smeltpunt heeft van 194-195 °C na herkristallisatie uit MeOH.

50 Uit 4,5-dimethyl-7-hydroxy-8-allylcoumarine (formule 14) werd 4,5-diaeithylangelicine'.(0^2^10^3^ ver^regen welke stof overeenkomt met formule 30' aangegeven op het formuleblad een een smeltpunt heeft van 211-212 °C na herkristallisatie uit MeOH.

De 8-coumarininylaceetaldehyden (tussenstof voor de synthese 55 van angelicine zonder alkylgroep op de furanring) kunnen ook worden bereid volgens een andere werkwijze waarbij de epoxydering wordt uitgevoerd van het eerder geacetyleerde 8-allylderivaat van de coumarinever-bindingen _(zoals boven is aangegeven) en door de daaropvolgende hydro- 80 0 4 69 9 -15- 21466/Vk/mv lyse van de epoxydaat-derivaten tot diolen en het vervolgens oxyderen van deze stoffen met loodtetraacetaatDeze werkwijze zal hieronder nader worden toegelicht.

Hiertoe werd 0,7 g 5-qiethyl-7-acetoxy-8-allylcoumarine (for-5 mule 16) opgelost in 50 ml CIC1 ^ en in reactie gebracht met een stoe-chiometrische hoeveelheid van een 2% chloroform-oplossing van perbenzoë-zuur. Het mengsel werd gedurende 1 nacht bij kamertemperatuur bewaard t gewassen met een verzadigde oplossing van NaHCO^ en vervolgens werd het oplosmiddel afgedampt van de over ^£§0^ gedroogde organische fase ter 10 verkrijging van 5-methyl-7-acetoxy-8-(2',3'-dipropyl)couinarine (C^H^O^) welke stof overeenkomt met. formule 31, aangegeven op het formuleblad-en een smeltpunt heeft van 126-127,5 °C na herkristallisatie uit een mengsél van EtOAc-cyclohexaan. Van het verkregen 5-methyl-7-acetocy-8-(2',3'-diepoxjpropyDcoumarine (formule 31) werd 0,5 g gesuspendeerd in 200 ml 15 1% oxaalzuur-oplossing en de suspensie werd gedurende 10 minuten gekookt onder terugvloeikoeling. Na afkoelen werd het reactiemengsel geëxtraheerd _____met. CHClg en het over ^£80^ gedroogde chloormierenzuur houdende extracten werd afgëdampt tot droog. Aan het residu werd 20 ml benzeen toegevoegd en 1,0 g loodtetraacetaat in kleine hoeveelheden waarbij de temperatuur gehou-den werd op 30 °C of lager.

Nadat de toevoeging was beëindigd werd het mengsel gedurende 1 uur geroerd en het anorganische materiaal afgefiltreerd en ingewassen met benzeen. De organische oplossingen gaven na verdamping van het oplosmiddel 0,31 g 8-(5-methyl-7-acetoxy)coumarineaceetaldehyde (C^H^Og) welke stof overeenkomt met formule 32, aangegeven op het formuleblad, welke stof na reactie- met 85% H^PO^ zoals boven is aangegeven 0,1 g 5-methyl-angelicine (formule 28) gaf· Analoog hieraan werd uit 4-methyl-7-acetoxy-8-allylcoumarine (formule 18) en uit 4,5-diemthyl-7-acetoxy-8- allylcoumarine (formule 19) 4-methylangelicine (formule 29) en respec- 30 tievelijk 4,5-dimethylangelicine (formule 30) verkregen.

De angelicineveïbindingen met een methoxygroep op plaats 5 werden bereid door uit te gaan van 5-methoxy-7-hydroxycoumarine of door uit te gaan van 4-methylr-5-methoxy-7-hydroxycoumarine (C^jH^qO^) overeenkomend met formule 35, aangegeven op het formuleblad. Deze bereiding 35 zal hieronder nader worden toegelicht.

Floroglucine werd in een hoeveelheid van 20,0 g gecondenseerd met 40 ml ethylacetoacetaat in een ethanoloplossing door het toevoegen van 10 ml geconcentreerd: HC1 en het mengsel werd gedurende 2 uren gekookt -16- 21466/Vk/mv onder terugvloeikoeling. Na afkoelen werd een afgescheiden hoeveelheid witte vaste stof verkregen die door filtratie werd verzameld en her-kristalliseerd uit MëOH ter verkrijging van 24,0 g 4-methyl-5,7-dihydroxy-coumarine (C^HgO^) welke stof overeenkomt met formule 33 aangegeven op 5 he formuleblad en een smeltpunt heeft van 300-302 °C.

Een mengsel van 3#o g 4-methyl-5,7-dihydroacycoumarine (formule 33), 20 ml azijnzuuranhydride en 5,0 g droog natriumacetaat werd gedurende 1 uur gekookt onder terugvloeikoeling. Hieraan werd 300 ml water toegevoegd en het mengsel werd gedurende 1 uur gekookt onder 10 terugvloeikoeling,. Het neerslag verkregen door afkoelen, werd verzameld en hedcr istalliseerd uit MeOH zodat 24,8 g 4-methyl-5,7-di-acetoxycoumarine werd verkregen '’(C^H.^Og) wel,ke stof overeenkomt met formule 34, aangegeven op het formuleblad en een smeltpunt heeft van 148-149 °C.

15 Het aldus verkregen 4-methyl-5,7-diacetoxycoumarine (for mule 34) werd opgelost~in 80 ml dimethoxyethaan en aan de oplossing werd 6,6 g droog toegevoegdi en 3 ml methyljodide. Het mengsel werd gedurende 6 uren gekookt onder terugvloeikoeling, het oplosmiddel verdampt en het residu na toevoegen van 80 ml 50:50 ^O/MeOH gekookt onder 20 terugvloeikoeling geduredde 20 minuten. Na afdampen van MeOH onder verlaagde druk en door afkoelen werd een neerslag gevormd dat na her-kristallisatie uit MeOH en vervolgens uit Me2C0 1,52 g 4-methyl-5r methoxy-7-hydroxycoumarine (Cj^H^qO^) gaf, welke stof overeenkomt met formule 35, aangegeven op het formuleblad en een smeltpunt heeft van 25 261-263 °C.

Van het verkregen 4-methyl-5-methoxy-7-hydroxycoumarine (formule 35) werd 6,0 g onder terugvloeikoelen in reactie gebracht gedurende 4 uren in 120 ml acetonoplossing met 12 ml allylbromide in aanwezigheid van 4 g ^ΟΟ^. Na afkoelen werd de vaste stof afgefiltreerd, gewassen 50 met een overmatige hoeveelheid vers Me2C0 en het verzamelde filtraat en waswater werd ingedampt-ter verwijdering van het oplosmiddel. Het residu werd 2 keren herkristalliseerd ui MeOH ter verkrijging van 4,40 g 4-methyl-5-methoxy-7-allyloxycoumarine (C^H^O^) welke stof overeenkomt met formule 36, aangegeyen op het formuleblad en · een smeltpunt heeft 55 van 141 °C.

Een oplossing van 4,0 g 4-methyl-5-methoxy-7-allyloxycouraarine (formule 36) in 80 ml diethylamiline werd gedurende 3 uren gekookt onder terugvloeikoeling. Na afkoelen werd 400 ml n-hexaan toegevoegd en het 80 0 4 69 9 -17- 21466/Vk/mv neerslag werd verzameld, enkële keren gewassen met n-hexaan en twee keren herkristalliseerd uit EtOAc ter verkrijging van 2,8 g 4-methyl-5-methqKy 7-hydroxy-8-allylcoumarine welke stof overeenkomt met formule 37 aangegeven op het formuleblad en een smeltpunt heeft van 198 °C, 5 welke stof vrij is van de isomeer 4-methyl-5-methoxy-6-allyl-7- hydroxycoumarine, welke isomeer tijdens de hierna volgende stappen kan leiden tot de vorming van lineair furocoumarine.

Van het 4-methyl-5-methoxy-7-hydroxy-8-allylcouraarine met formule 37 werd 3,0 g in reactie gebracht met azijnzuuranhydride in 10 aanwezigheid van 4,0 g natriumacetaat door het mengsel gedurende 1 uur te koken onder terugvloeikoeling.Water 'werd toegevoegd en het mengsel nogmaals gedurende 20 minuten gekookt onder terugvloeikoeling. Verder werd 200 ml water toe gevoegd en het gevormde neerdlag na afkoelen verzameld en herkristalliseerd uit MeOH ter verkrijging van 2,4 g 4-methyl- 5-methoxy-7-acetoxy-8-allylcoumarine (C^H^O,.) welke stof 15 overeenkomt met formule 38, aangegeven op het formuleblad en een smeltpunt heeft van 143-144 °C.

Van het 4-methyl-5-methoxy-7-acetoxy-8-allylcoumarine (formule 38) werd 2,5 g opgelost in 150 ml AcOH en aan deze oplossing werd een azijnzure oplossing van broom toegevoegd onder roeren, die de 20 stoechiometrische hoeveelheid broom bevatte. Het roeren werd gedurende 20 minuten voortgezet nadat de toevoeging was beëindigd en vervolgens werd het oplosmiddel afgedampt onder verlaagde druk . Het residu door herkristallisatie uit MeOH gaf 2,12 g 4-methyl-5-methoxy-7-acetoxy-8-(2', 3’-dibroompropyl)coumarine (C^gH^gB^O^) welke stof overeenkomt met 25 formule 39, aangegeven op het formuleblad en een smeltpunt heeft van 184-185 °C.

Aan 150 ml ethanoloplossing van het 4-methyl-5-methoxy-7-acetoxy-8-(2',S’-dibrooropropyOcoumarine (formule 39) werd 35 ml 4% Κ0Η ethanoloplossing toegevoegd en het mengsel werd gedurende 1,5 uren 50 onder uitsluiting van licht*gekookt onder terugvloeikoeling. Na afkoelen werd het mengsel aangezuurd met verdund HC1, werd EtCH verwijderd door verdampen bij verlaagde druk en het residu werd enkele keren geëxtraheerd met EtOAc. Het verkregen residu werd na drogen over Na2SO^ ingedampt zodat het oplosmiddel werd verwijderd, gezuiverd door het te leiden over een 55 kolom gevuld met silicagel en door elueren met CHCl^ ter verkrijging van 0,062 g 4,5*-dimethyl-5-methoxyangelicine welke stof overeen

komt met formule 40, aangegeven op het formuleblad en een smeltpunt heeft O AA/, COQ

-18- 21466/Vk/mv van 226 °C na herkristallisatie uit MeOH. Door O-demethylering van de verbinding 4,5'-dimethyl-5-raethoxyangelicine (formule 40) en het invoeren van Ν,Ν-dialkylaminoalkyl of atninoalkylgroepen kunnen verbindingen worden verkregen waarvan de farmaceutische zouten oplosbaar zijn in 5 water.

De chloormethylering van de methylangelicineverbindingen geven de 4'-chloormethylderïvaten, waaruit hydroxymethyl, methoxymethyl en aminomethylaminoalkoxymethyl en N, N-dialkylaminoalkoxymethylderivaten kunnen worden bereid. Zodoende werd aan 150 ml AcOh-oplossing van 10 3,0 g 4,5’-dimethylangelicine (formule 26) 23 ml chloormethylmethyl-ether toegevoegd, en het mengsel bleef bij kamertemperatuur staan om te reageren gedurende 13' uren. Twee keren werd nogmaals 10 ml chloormethyl-methylether toegevoegd met tusseppozen van 8 uren en na de laatste toevoeging bleef het mengsel staan gedurende 36 uren om te reageren 15 en werd gedurende 1 nacht bewaard bij 0 °C. Het aldus gevormde neerslag werd verzameld, herkristalliseerd uit AcOH ter verkrijging van 1,2 g 4,5,-dimethyl-4'-chloorraethylangelicine (C^H^O^Cl) welke stof overeenkomt met formule 41, aangegeven op het formuleblad , en een smeltpunt heeft van 213-214 °C. Uit de moedervloeistöf werd na indampen en afkoelen 20 bij 0 °C nogmaals 1,5 g van het product verkregen. Het verkregen 4,5'-dimethyl-4'--chloormethylangelicine (formule 41) werd in een hoeveelheid van 0,50 g gekookt onder terugvloeikoeling met water gedurende 4 uren waarna het mengsel werd afgekoeld en geëxtraheerd met CHCl^. De over Na2S0^ gedroogde organische fase gaf na afdampen van het oplosmiddel 25 0si37 g 4,5'-dimethyl-4,-hydroxymethylangelicine (C^H^O^). welke stof overeenkomt me formule 42, aangegeven op het formuleblad en een smeltpunt heeft van 202 °C na herkristallisatie uit EtOAc.

Het verkregen 4,5,-dimethyl-4'-chloormethylangelicine (formule 41) werd in een hoeveelheid van 0,5 g gekookt onder terugvloeikoeling 30 met azijnzuur gedurende 2 uren. Vervolgens werd het mengsel afgekoeld verdund met water , geneutraliseerd door het toeveogen van vast NaHCO^ en geëxtraheerd met CHCl^. De over Na2SO^ gedroogde organische fase gaf na verdampen van het oplosmiddel 0,39 g 4,5'-dimethyl-4'-acetoxymethyl arigelicine ( C^H^O^) welke stof overeenkomt met formule 43, aange-35 geven op het formuleblad en een smeltpunt heeft van 109 °C na herkristallisatie uit cyclohexaan/AcOEL.

4,5,-Dimethyl-4'-chloormethylangelicine (formule 41) werd in een hoeveelheid van 0,20 g gekookt onder terugvloeikoeling met 80 0 4 69 9 -19- 21466/Vk/mv 75 ml MeOH gedurende 3 uren en uit de oplossing werd na indampen 0,14 g 4,5,-dimethyl-4'-methoxymethylangelicine (C^H^O^) verkregen welke stof overeenkomt met formule 44 aangegeven op het formuleblad en een smeltpunt heeft van 137 °C na herkristallisatie uit MeOH.

5 In 120 ml N,N-dimethylfornand.de werd 1,2 g 4,5'”dimethyl-4'~ chloormethylangelicine (formule 41) en 1,0 g kaliumfthalimide (gezuiverd volgens Gilman) gesuspendeerd en het mengsel werd gedurende 5 uren verwarmd bij 100 °C. Vervolgens werd het oplosmiddel ingedampt bij verlaagde druk. Het residu werd geëxtraheerd met CHCl^, het chloroform 10 houdende extract drie keren gewassen met HgO en gedroogd over Na2S0^. De organische laag gaf na verdampen van het oplosmiddel 0,9 g 4,5'-dimethyl-4'-fthalimidomethylangelicine (C22^i5°5^)welke stof overeenkomt met formule 45 aangegeven op het formuleblad en een smelttraject heeft van 271-275 °C na herkristallisatie uit een mengsel van CHCl^ en CCl^.

15 In 25 ml 95% EtOH werd 0,17 g 4,5*-dimethyl-4,-fthalimidomethyl“ angelicine (formule 45) gesuspendeerd en aan de suspensie werd 0,3 ml 85% suspensie van hydrazindhydraat in water toegevoegd. Het mengsel werd gedurende 4 uren gekookt onder terugvloeikoeling en vervolgens werd verder 0,3 ml hydrazinehydraat toegevoegd en het mengsel werd opnieuw 20 gedurende 2 uren gekookt onder terugvloeikoeling. Het oplosmiddel werd afgedampt, aan het residu 70 ml 0,1 M NaOH toegevoegd, en de alkalische oplossing werd drie keren gewassen met 150 ml CHCl^. De over Na2S0^ chloormierenzure oplossing werd afgescheiden van het oplosmiddel, het residu opgelost in 40 ml 1,2M HC1 en de zure oplossing enkele keren . 25 gewassen.met CHCl^. De waterige fase werd ingedampt tot droog en het residu opgelost in droog EtOH. Aan deze oplossing werd droge ether toegevoegd tot een dikker wordende vleoistof werd verkregen. Na het mengsel te hebben bewaard en afgekoeld werd 0,065 g 4,5'-dimethyl-4'-aminomethyl-angelicinehydrochloride (C^H^O^NCl) verkregen welke stof overeenkomt 5® met formule 46 aangegeven op het formuleblad en ontleedt bij 300 °C.

Deze stof is oplosbaar, in Vater.

Op analoge wijze werd 4'-hydroxymethyl-, 4'-methoxymethyl-en 4'-aminomethyl verkregen door uit te gaan van andere alkylangelicine-verbindingen.

55 In 10 ml dimethylarainoethanol werd 0,20 g fijn verdeelde natrium opgelost en aan dit mengsel werd 0,50 g 4,5'-dimethyl-4'-chloor-methylangelicine (formule 41), opgelost in 100 ml tetrahydrofuran, toegevoegd, Het mengsel werd in reactie gebracht in het donker en bij kamer- βηηίrq o -20- 21466/Vk/mv temperatuur gedurende 4 uren waarna 200 ml verdund HC1 werd toegevoegd en het mengsel werd drie keren geëxtraheerd net 300 ml EtOAc. De waterige laag werd geneutraliseerd door het toevoegen van NaHCO^ en geëxtraheerd met EtOAc. Van de over Na2S0^ gedroogde organische laag werd het oplos" 5 middel en de overmaat dimethylaminoethanol verwijderd door afdampen onder verlaagde druk'.en het residu werd kolomchromatografisch gezuiverd over een kolom silicagel door elueren met MeOH. Zodoende werd 0,075 g 4,5'-dimethyl-4'-N,N-diraethylaminoethoxymethylangelicine (C^g^jO^N) verkregen welke stof overeenkomt met formule 47, aangegeven op het formule-blad en omgezet tot het in wateroplosbare corresponderende hydrochloride door het op te lossen in een kleine hoeveelheid verdund HCl en vervolgens onder verlaagde druk water en de overmaat HCl af te dampen.

Op analoge wijze werden andere N,N-dialkylaminoalkoxymethyl- en aminoalkoxyraethylderivaten verkregen.

15 De eigenschappen van de alkylangelicineverbindingen. De in voering van 1 of meer alkylgroepen, met name de invoering van methylgroepen in het angelicinemolecuul verhoogt/in het algemeen de mogelijkheid tot vorming van het donkere complex waarmee het mogelijk is om onder invloed van licht te binden aan DNA en hierdoor een fotobiologische activiteit te bewerkstelligen.

De vorming van het donkere complex.

Het is bekend uit een publicatie van F. Dall'Acqua, M.Terbo-jevich, S. Marciani, D. Vedaldi en M. Recher: Chem.-Biol. Interactions 21, 103 (1978) dat het tussengevoegde complex gevormd door furocoumarine . 25 met DNA sterk de daaropvolgende fotoadditie bewerkstelligt waarbij de mate van fotobinding wordt verhoogd. Uit tabel B blijken de bindingspara-meters van de complexen .gevormd tussen de alkylangelicineverbindingen en DNA, waarbij K (associatieconstante van het complex met betrekking tot een afgescheiden site) en .1/n (de frequentie van de bindingsites 50 of het aantal moleculen angelicine gebonden op elk nucleotide) welke parameters zijn bepaald volgens McGhee en Von Hippel, J. Hól' Biol.

86, 469 (1974).

De invoering van 1, 2 of 3 methylgroepen bewerkstelligt , een sterke verhoging van de affiniteit ten opzichte van DNA zoals weer- 55 gegeven door de sterke verhoging van zowel de associatieconstante als het toegenomen aantal bindingsites. De invoering van een kationische groep naast de twee methylgroepen ter vorming van bijvoorbeeld 4'-amino-methoxymethyl-4,5'-dimethylangelicine en het 4'-N,N-dimethylaminomethoxy- 80 0 4 69 9 -21- 21466/Vk/mv methyl-4,5'-dimethylangelicine verhoogde zeer sterk de affiniteit (K is met meer dan een factor 20 verhoogd).

Dit is te wijten aan het feit dat naast de tussenvoeging een tweede type binding plaats heeft, hetgeen een ionische binding is tus-5 sen de kationische groep en een fosfaatgroep van DNA, bij de vorming van het complex, waardoor de affiniteit van deze in water oplosbare kationische verbindingen ten opzichte van DNA wordt verhoogd.

Capaciteit van de fotobinding ten opzichte van DNA

De invoering van 1 of 2 methylgroepen in het angelicinemole-10 cuul leidt tot een sterke verhoging van de fotobinding ten opzichte van BNA (zoals aangegeven in tabel B) . Alleen bij 4,5,5'-trimethyl-angelicine waarbij drie methylgroepen zijn ingevoerd is de fotobindings-capaciteit dicht bij J deze eigenschap van angelicine gelegen.

Van de twee in water opolosbare kationische derivaten vertoont 15 verbinding 46 een fotobindingecapaciteit ten opzichte van DNA die lager ~ is dan die van angelicine terwijl verbinding met formule 47 een sterke verhoging geeft ven de fotobindingscapaciteit. In tabel B zijn de snelheidsconstanten aangegeven van de fotoreacties bepaald volgens Dall' Acqua et al beschreven in Fhotochem. Photobiol. 29, 489 -(1979).

ZO Al deze verbindingen waren niet geschikt om in DNA interne verknopingen te bewerkstelligen door fotoinductie, In feite onderging DNA, bestraald in aanwezigheid hiervan, niet de renaturatie na warmte-denaturatie en bovendien bleef het molecuulgewicht, bepaald volgens sedimentatieexperimenten onveranderd. Deze experimenten zijn 55 uitgevoerd volgens F. Bordin, F. Carlassare, F. Baccichetti, A.

Guiotto, P. Rodighiero, D. Vevaldi en F. Dall'Acqua, Photochem, Photobiol, 29, 1063 (1979).

Fotobiologische activiteit.

Een significante test voor het onderzoeken van de fotobiolo-50 gische activiteit van alkylangelicine is het onderzoek naar de capaciteit om de DNA- en RNA-synthese’in Ehrlich ascites tumorcellen te remmen. In tabel C is de mate van remming uitgedrukt als ID^, hetgeen de bestralings-dosis is in kwanta bij 365 nm, noodzakelijk om in deze cellen de . 50% DNA en RNA-systhese te remmen in aanwezigheid van een constante 55 heoveelheid alkylangelicine. De alkylangelicineverbindingen volgens de utivindingen vertonen in het algemeen een sterk verhoogde capaciteit om de DNA- en RNA-synthese te remmen, waarbij de in water oplosbare kationische verbinding met formule 46 en de verbinding met formule 47

Aam Λ λ!· ^ ♦· Am A 1 MMAW « n J __ _ _____ _ 1 · « -22- 21466/Vk/mv

« TABEL B

fysisch — chemische parameters van de interactie-tussen de methylangeli’ cineverbindingen en DNA en vitro beide in de grondtoestand en in de geactiveerde toestand r- r~ ; * pindingsparaaeters van de complexen met DNA 1) K 1/n i iseociatie- relatieve frequentie relatieve furocoumarineverbindingen constante waarde van de bin- waarde waarbij dingssites waarbij angelici- angelici- ne is 100 ne is 100 _ lineaire stoffen ter vergelijking i psoralen____400__71,4__Q,108__171 ixanthotoocine (8-MOP)_ 740 __132__0,128__203 , vertakte verbindingen 4-N,N*dimethylaminoethoxy- methyl-4,5'-dimethylangeli- )10000 >1700 _>0,15 ^230 cine _ 3- methvlaneelicine 1560 278 0,071 112 x '4·' -hydroxymethyl-4,5- di- methylangelicine 1250 __223_ 0,087 138 4,5l-dimethylangelicine 1410 252_ 0.094 149 5,5-dimethylangelicine__1750__312 0.085 135 5 -methylangeli cine 1200 214 0,073 1.16 4' -methoxymethyl-4,5'-di- methylangelicine 700 125__0,050__80 4- methylangelicine__1400__250__0,076__120 angelicine__560 100__0,063__100_ . ·* 4 -aminomethyl-4,5'-di- .

methylangelicinéhydrochlorLé 16300 2910 0,255 404 80 0 4 69 9 -23- 21466/Vk/rav TABEL B (Vervolg) * — τ ; ' Γ snelheidsconstante van de capaciteit fotoreacties met DNA 12) ter vorming ! relatieve van inwendige - . t· ,· . -2 . -1 waarde waar- verknopingen furocoumanneverbxndxngen KxlO min bij angeli- (relatief ten cine is 100 opzichte van psoralen waarbij spo-ralen is 10C& : _ lineaire stoffen ter vergelijking_ : psoralen 318__345__100 13)' xanthotQBcine (8-MOP) 2,3__209__63 13) _-^vertakte verbindingen _ 4- N, N-diraethy laminoethoxy- methyl-4,5,-dimethylangeli- ^3,6 ^330 0 cine 5- methylangelxcine_ 3,41__298 0 '4'-hydroxymethyl-4,5-dime thy langeli cine__^3,2__2,81__0__ 4,5'-dimethylangelicine 4,0__363__0__

5,5-dimethylangelicine 2,73 248 Q

5^-methylangelicine_ 2,11__191 0 4'-methoxyraethy1-4,5’-di- methylangelicine__1>6__145__0_ 4-methylangelicine__la61__1^6__2__ angelicine 1»1 1QQ_ β__ A'-aminomethyl-AjS'-di- 0,8 72 0 me thylange1i cinehydro- chloride 1) bepaald volgens McGhee en Von Hippel- ·1· Mol. Biol. 86, 469 (1974)' *^2) bepaald volgens F. Dall'Acqua, S. Marciani, F. Zambon en G. Rodighiero, Photochem. Photobiol. 29, 489 (1979) *3) F. Dall'Acqua, S. Marciani, D. Vedaldi en G. Rodighiero, Z.

Naturforsch, 29c, 635 (1974).

Im:abel C,'betrekking hebbende op de fotobiologiscbe eigenschappen van de methylangelicineverbindingen, volgens de uitvinding, gelden voor 1),^2)

*3) dezelfde opmerkingen als voor tabel B

* _24_ 21466/Vk/mv

OJ

*

-P C

Φ I -Η Φ (d > Ο Φ > > Φ -P Φ Φ

•Η Ο *P Ή Φ Η O

•p <t-i Ο -P Ό Λ O

£Ö 'ty 1-1 Id i-* ' fy~\ Η Ή bd pH CÖ Ο φ

Φ 3 Ο Φ (d W Ώ O *- O OOOOOOOOO

C X! 4-> C 5 Q. Ή o c- r— * c φ Φ H ^ Φ C „ Η * > Ή ^ Φ td Φ c O “ ο ή φ * ή o vo on cv '-(jicuin^rcncnooo

SUCO p Ό > H O VO ON VO oovot-iom«oc\ioc\J

O W id & -<|>»— «- T- CM'-’-OO»-»-»-'- S H Id 0 60 3 00 φ (d * c « •P ti t< S P (d rl •rd a) ^ 4j *m »r-i ___________ _______ _________ __________ . ... - w a ————— id <d ^ *μ t~vo a·®'·. < onovN vo Ö Jg T-“ on CM r-~ t-” evT 1- T-“ 1- r- «-

g 2 +1+1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 O

l§ jj 0:5 ^rmootr>vo=rao,-f,ri crrio rroo'ononvot^onoot^

« »- <\J *- <- r-r-T-CM

+ ! a Φ >“) ......................:____

CQ *H

Φ 00 H .

X3 *- Φ •P I 60 CO u >, v- φ Φ OJ Φ C >

Ο X > Ή C

, < ©COS* Φ -J 2 Id -Η Φ · -Η Φ 60 „ _ W os+j +> Ό > η ο -P in o\ c o inc\joooo-3;oio ffl c id c · φ o o- .p σ> c^c-mcom’-oocvj < C Id H Id O 60 C CM CM Ό OJ CNJCMCU’-'-’-’-'^

E-> Φ 3 © Id · C ©' C

C C St .p (d II <m *H

<J v_/ jQ

2 0 Q ·Ρ Φ O to > c in.......— - . I- -———·. —.......——......1 — — — (3 Q Φ © > H 5 s £P ajcoiop’-CMcninCM^.a^in*-^*^ d ° o' o' (j> r r I- r r- W rn r- ^ ‘I < H +1 +1 > +| +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 o ^ ° oo =r t— c— lo , OO Ό O CM 30 CO VO C— σν .O CO OvovO^OWf.li;

t·* -r· t— t— C\J CM CM

pH

* I

I ϊ Λ a >> s +> © . X fH Φ 60 Ο Φ Φ Ό 8 ©

C XJ C C I -H -O

>p P I I ·Η -H -a -H

•O φ iP - OOITJ f C

3 £li o >» LfJ © «Η *H © ·* - o

• H Q ex;(l>"-Cf-lrHC-=»·® lO rP

XI 2 -Η P C Λ- -H © Φ-Hl C - S3

μ I g φ *H I ü Ö£ M Οι-H ·Η ί O

Φ 00 a a Or-lHC C -H>) O Ip

' b> rd*H Ή >ί ιΗ a CO rl Jj ID H iHC

φ >, TJ ιΗ^φ,ρ ,-) φΡ>ΟΗ >> Ό C Φ £ I Φ·ΡΜ>>Ϊ>>Μ©·ΗΦ t .5 ©^©|§ls £ §>,^1 ω||

3 x S-C«1R|<ü®HXfH(ÜCBC

e βΟ ·Η^3··ΗιΗΧιΗΒΘ>>ΟΦγ-Ι·ΗΟ·Η

3 Φ-Ρ 'ploi^Oï^vH-HXJXittï'ïOCO

o 1-IO TrH.HXJCXJ'n T) -P+JCjO ·Η·Η·Η

n (dj3 2 >ι Η 4-)·α-Ρ T T φ Φ (fl .p r-Η S rP

o u 4J -X! Φ Φ >> Φ - - S S rH Φ Φ(3φ c oc Zp ï s na in lo T i>a ωιδ 3 n id ip c< x iBiioffdd· in mïpï iü=rid 80 0 4 69 9 “25- 21466/Vk/mv

Bovendien kan in het algemeen worden waargenomen dat in dit eenvoudige biologische systeem een nauwe correlatie bestaat tussen de fotobiologische activiteit en de capaciteit om fotochemische beschadigingen 5 in DNA (fotoreactiviteit) te bewerkstelligen.

Mutagene activiteit

De mutagene activiteit van 4,5’-dimethylangelicine is nader onderzocht met betrekking tot twee E. coli stammen WP2 trp en WP2 trp uvrA , waarbij als vergelijkende stoffen ook twee lineaire furocoumarine -10 verbindingen te weten psoralen en 8-methylpsoralen zijn onderzocht onder dezelfde omstandigheden '/als beschreven door S. Venturini, M. Tamaro, C. Montin Bragadin, F. Bordin, F. Baccichetti en F. Carlassare "Comparative Mutagenicity of linear and angular furocoumarins in E. coli strains deficient in known repair functions, Chem.-Biol. Interactions, 30,, 15 203 (1980).

De mutatiefrequentie die wordt waargenomen is zeer .hoog bij de twee lineaire furociumarine verbindingen terwijl er geen aanzienlijk niveau wordt verkregen met 4,5-dimethylangelicine. De mutagene activiteit wordt alleen bepaalbaar bij de uvrA -stam die het nadeel heeft dat 20 deze slechter is bij de DNA-herstelfuncties.

De mutagene activiteit voor 5-methylangelicine, onderzocht in Salmonella typhimurium TA 100 his G 46 (missense mutatie) (uvrB rfa) pKMIOl (Ames test) resulteerde in dezelfde volgorde van werking als bij 4,5*-dimethylangelicine.

25 Therapeutische toepassing.

De therapeutische toepassing van deze verbindingen betreft huidziekten met name hyperproliferatie van de huidcellen zoals psoriasis mycosis fungoides en exceem of het ontbreken van huidpigmentatie zoals vitiligo.

30 De werking van deze verbindingen om in zeer selectieve mate richtbeschadiging ten opzichte van epidermaal DNA te realiseren bewerkstelligt de remming van de celdeling met als gevolg dat de huidziekten kunnen worden ópgeheven. De alkylangelicineverbindingen volgens de uit-35 vinding kunnen in therapeutische"· vorm worden gebruikt op twee manieren te weten de plaatselijke toediening en de orale toediening,plus UV-A bestralen.

De plaatselijke toepassing van alkylangelicineverbindingen geeft een eenvoudigere en veiligere toepassing dan de plaatselijke toe- 8004699 -26- 21466/Vk/mv passing van psoralensverbindingen. In samenhang met het ontbreken van huid-fototoxiciteit zijn dan ook geen problemen aanwezig met betrekking tot de huid-lichtgevoeligheid, welke problemen steeds gevonden zijn bij het plaatselijk gebruik van psoralensverbindingen. Bovendien zijn 5 andere nevenwerkingen zoals het risico van hepatoxiciteit en van cataract, samenhangend met het systemetische gebruik van psoralens ook verdwenen bij het plaatselijk gebruik van alkylangelicineverbindingen. Samen met de lage mutagene activiteit wordt het risico van huidkanker verminderd ten opzichte van psoralens. Voordat klinische experimenten werden uitge-10 oefend direct op mensen om de therapeutische werking te bepalen van alkylangelicineverbindingen volgens de uitvinding zijn eerst experimenten uitgevoerd op laboratoriumdieren.

In feite geeft de bepaling van de mate van remming van de synthese van het epidermale DNA in de huid van muizen "in vivo" na plaatselijk 15 gebruik van de verbindingen en UV-A bestraling een exacte informatie over de raogelijke therapeutische werkingen van de verbindingen bij mensen omdanks het feit dat het onmogelijk is om psoriasis en vergelijkbare huidziekten te induceren bij laboratoriumdieren.

De gegevens met betrekking tot de remmende werking zijn 20 samengevat in tabel D

TABEL D

Remming op de systhese van epidermaal DNA bij muizen in vivo na plaat-selijk aanbrengen van angelicinederivaten en bestralen met UV-A (pro-25 centuele remming + standaardafwijking).

geen geneesmiddel, alleen oplosmiddel 2,5+1,3 psoralen 47,8+7,9 r 8-methoxypsoralen . (8-MOP) 61 +1,6 30 4,5'-dimethylangelicine 37,6+4,9 5-methylangelicine * 47,5+1,19 5.5- dimethylangelicine 48,3+2,9 4.5- dimethylangelicine 36 +1,1 4-methylangelicine 68,5+19,5 35 4'-dimethylaminoethoxymethyl-4£,-dimethylangelicine 29,4+16,2 4'-acetoxymethy1-4,5'-dimethylangelicine 10,6+4,5 angelicine 17,5+2,5 80 0 4 69 9 -27- 214ë6/Vk/rav

Ter verkrijging van deze gegevens werden de geneesmiddelen aangebracht op onthaarde heid van de onderbuik van vrouwelijke muizen onder toe-passing van een 0,01 % methanoloplossing (50 jug/cm ). Nadat de muizen ge-.durende 45 minuten in een donkere kamer waren gehouden werd de onderbuik be-straald met UV-A licht (9 J/cm ) en vervolgens werd H-thymidine (70 Ci/nM 5 jïCi) i.p. geïnjecteerd. Na 30 minuten werden de muizen gedood, de bestraalde huid verwijderd en de epidermis afgescheiden zoals beschreven door T.J. Slaga, G.T.Bowden, R.G. Shapas en R.K. Boutwell, Cancer Res., 33, 769-776 (1973), gehomogeniseerd onder toepassing van een Vortex-10 menger en toegevoegd aan een DNA-extract (E. Szybalska en W. Szybalski,

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 4S, 2026-2034 (1962)). DNA-monsters werden opp gelost in water en de specifieke radio-activiteit werd bepaald.

De procentuele remming van DNA-systhese waargenomen bij elk monster werd berekend onder aanname dat als blanko de radio-activiteit werd 15 waargenomen in epidermaal DNA op de rugzijde van hetzelfde dier, dat op deze wijze is bewerkt. De specifieke activiteit waargenomen bij de blanko huid was 0,9-1,2.10^ dpm/mg DNA. Elk geneesmiddel werd ten minste bij 6 muizen toegepast.

Uit de gegevens van tabel D blijkt dat de alkylangelicineverbindingen ZO volgens de uitvinding een sterke werking hebben om de systhese van epidermaal DNA bij muizen te remmen. Deze gegeves vertonen ook een correlatie met de klinische gegevens die aantonen dat een dergelijke test belangrijke informatie geeft ten aanzien van de mogelijke therapeutische werking van deze soort verbindingen bij mensen.

25 Klinische gegevens.

De werking van verschillende alkylangelicineverbindingen volgens de uitvinding te weten 5-methylangelicine, 4,5'-dimethylangelicine, 4'-hydromethy1-4,5'-dimethylangelicine, 41-hydroxy-4,51-dimethylangelicine en 4,5-dimethylangelicine is nader onderzocht waarbij de capaciteit 30 gemeten is ten opzichte van helder psoriasis bij . verschillende patiënten. Voor een directe vergelijking is ook de werkzaamheid onderzocht van de niet-gesubstitueerde angèlicineverbindingen en die van de drie zeer effectieve lineaire furocoumarineverbindingen te weten 8-methoxypsoralen (8-MOP), 5-methoxypsoralen (5-MOP) en 4,5',8-trimethylpsoralen (TMP).

35 Voor elke behandeling werden vier gebieden van de zieke huid gebruiktj a) in het eerste oppervlak werd een alkoholische oplossing met 10% glycerine en 0,1 gew.% van de verbinding, aangebtacht in een .2 concentratie van 20 ug/cm en na aanbrengen werd het middel ingedampt ftn Ω4 69 9 -28- 21466/Vk/mv door do lichaamswarmte. Na 30 minuten werd het oppervlak bestraald met behulp van hoge intensiteit UV-A lampen, hetgeen lage druk fluorescerende lampen zijn met een golflengte van 320-400 nm. De bestralingsdosis werden gekozen bij 4,5-13 J/cm voor elke toepassing als een functie 5 van de gevoeligheid van de huid van de patiënten. Wanneer de huidgevoelig-heid hoger was, werd de lichtdosering lager en omgekeerd; b) een tweede oppervlak werd behandeld zoals aangegeven onder a), maar dit werd afgeschermd en in het donker gehouden.

c) een derde oppervlak werd gebruikt waaraan geen geneesmiddel werd toegediend en dit werd bestraald zoals aangegeven onder a), maar in 10 het algemeen met een hogere UV-A-dosis; d) een vierde oppervlak werd niet behandeld, noch met geneesmiddel noch met UV-A-bestraling.

De behandeling met de alkylangelicineverbindingen zoals boven aangegeven werd herhaald gedurende 5 keren per week gedurende 2 of 15 meer weken. Het aantal behandelingen lag tussen 8 en 20. In sommige gevallen zoals bijvoorbeeld bij het gebruik van 5-methylangelicine-werd een goede helderheid van.psoriasis waargenomen na 8 behandelingen.

Ten einde de inductie te voorkomen van lichtgevoelige procédé's (roodheid, 'erythema) werden de vergelijkende experimenten uitgevoerd met lineaire 20 furocoumarineverbindingen (8-MOP, 5-MOP, TMP) bij lagere lichtdoseringen dan bij het gebruik van alkylangelicineverbindingen en de behandelingen zijn niet meer dan drie keren per week uitgevoerd.

Een samenvattingen van deiklinische gegevens zijn vermeld in tabel E.

25 De resultaten die afgeleid kunnen worden uit tabel E zijn dat de verbindingen 1, 2 en 3 slechts gebaseerd zijn op 10-12 therapieën terwijl de resultaten van de verbindingen 4, 5, 6, 7, en 8_gebaseerd zijn op 10-18 therapieën. De aanduiding voortreffelijk betekent dat de helderheid hoger is dan 90%, goed 70-90%, redelijk 50-70% en slecht kleiner 30 dan 40%. V' 80 0 4 69 9 -29- ‘ 21466/Vk/mv

TABEL E

Resultaten van plaatselijke fotochemotherapeutische proefnemingen met alkylangelicine bij patiënten waarbij 8-MOP, 5-MOP, TMP en angelicine zijn gebruikt als vergelijkende verbindingen.

5 furocoumarine aantal voor- goed rede- slecht patien- tref- lijk 'ten felijk 10 i) 8-methoxypsoralen (8-MOP) 10 3 3 2(2 2) 5-methoxypsoralen (5-MOP) 9 0 4 1 4 3) 4,5',8-trimethylpsoralen (TMÖ 8 2 2 2 2 4) angelicine 8 0 0 0 8 5) 4,5'-dimethylangelicine 4 0 13 0 15 6) 4'-hydroxymethyl-4,5-dimethyl·· angelicine 4 0121 7) 5-methylangelicine 7 2 5 0 0 $) 4,5-dimethylangelicine 2 0 0 0 2 9) alleen UV-A-bestraling 17 0 1 1 15 20 ïo) blanko (geneesmiddel zonder bestraling ) 17 0 0 0 17 25 De afnemende volgorde van de effectiviteit van de verbindin gen is: 5-methylangelicine, 4,5'-dimethylangelicine, 4'-hydroxymethyl-4, 5’ -dimethylangelicine, 4,5-dimethylangelicine, waarbij deze laatste gelijk is aan angelicine. De verbinding 5-methylangelicine schijnt zeer actief te zijn mogelijk actiever dan 8-MOP, Naast de zeer effectieve werking 30 van 5-methylangelicine wordt ook een snellere herderheid verkregen van psoriasis dan bij 8-MOP vanwege het feit dat de behandelingen vaker kunnen worden herhaald (bijvoorbeeld één behandeling elke dag gedurende 5 dagen per week, door de afwezigheid van huid-fototoxiciteit).

Het gebruik van alleen UV-A-licht veroorzaakt zoals bekend 35 slechts een lage werking en alleen bij veel hogere lichtdo'seringen. Er wordt geen werking waargenomen bij de huid wanneer deze is behandeld met geneesmiddel en vervolgens in het donker wordt gehouden.

Analoog aan de psoralenverbindingen kunnen ook de alkylangeli- flfl Λ L fiQ 0 -30- 21466/Vk/mv cineverbindingen volgens de uitvinding oraal worden toegediend. In feite is de acute toxiciteit bij muizen van dezelfde grootte als van psoralen-verbindingen ( LD^ Van 8-MOP is 0,8 g/kg,LD^ van 5-methylangelicine is groter dan 2 g/kg en de LD^q van 4,5'-dimethylangelicine is groter dan 5 2,5 g/kg).

Alkylangelicineverbindingwn volgens de uitvinding hebben bij orale toediening een gedrag dat vergelijkbaar is met die van psoralen-verbindingen. Zij vertonen in i.feite een evident tropisme met betrekking tot de huid zoals blijkt uit de experimenten die uitgevoerd zijn bij muizen. 10 Door de lokale toediening van het geneesmiddel op de huid zal wanneer deze wordt bestraald met UV-A een fotoreactie plaats hebben tussen het geneesmiddel en het epidermale MA. De lichtbeschadiging die bewerkstelligd wordt uit deze fotoreactie veroorzaakt de remming van de celsplitsing op een wijze die vergelijkbaar is als plaats heeft bij het gebruik van psoralen-15 verbindingen. Er is echter een fundamenteel verschil tussen de werking van de psoralenverbindingen en angelicineverbindingen. Deze laatste verbindingen induceren in fèite slechts een monofunctionele beschadiging ten opzichte van DNA terwijl de psoralenverbindingen zowel mono-als bifunctionele beschadigingen induceren. Deze laatste veroorzaken meer uitgesproken biolo-20 gische gevolgen zoals een hogere mutatiefrequentie, hoger risico van huidkanker en huid-fototoxiciteit.

Wanneer in beschouwing wordt genomen dat deze experimenten worden uitgevoerd bij muizen om de effectiviteit van deze stoffen te bepalen door plaatselijke toediening is gebleken dat er een correlatie bestaat , 25 tussen de klinische gegevens zoals een experiment dat gewoonlijk gemodi ficeerd is,toegepast om de effectiviteit te bepalen van de alkyl-angeli cineverb inding waarna orale toediening gevolgd door UV-A-bestraling. In. dit verband zijn experimenten uitgevoerd onder toepassing van muizen met een gewicht van 20+ 2 g, die geen voedsel kregen toegediend gedurende 50 3 uren voor de orale toediening van de alkylangelicineverbindingen.

Muizen werden in .groepen van”5 dieren gevoed met een Suspensie van 0,5% methylcellulose in water van de alkylangelicineverbindingen volgens de uitvinding in een hoeveelheid van0,25'g/kg. De dieren werden gedurende 2 uren in het donker gehouden, welke tijd noodzakelijk is voor de absorptie, 55 systematische verdeling en lokalisering van het geneesmiddel op de huid en 2 vervolgens werd deze bestraald met UV-A-licht (9 3/cm ). De dieren werden vervolgens gedood en de remming van de epidermale DNA-aysthese werd onderzocht, welke gegevens zijn samengevat in tabel F. De huid van de rugzijde 80 0 4 69 9 21466/Vk/rav afgeschermd van het licht door donker papier werd gebruikt ais vergelijkend materiaal. Als vergelijkende stof werd 8-MOP toegepast onder de dezelfde experimentele omstandigheden.

De sterke activiteit van de alkylangelicineverbindingen volgens 5 de uitvinding (hoger dan van 8-MOP) met betrekking tot de remming van de epidermale DNA-systhese bij ..muizen na orale toediening rechtvaardigt het om deze verbindingen als effectiever te beschouwen ook na orale toediening bij mensen met betrekking tot de fotochemotherapie van psoriasis en andere huidziekten, die gekenmerkt worden door cellulaire hyperproliferatie.

10 TABEL F

Remming van de synthese van epidermaal DNA bij muizen in vivo na orale toediening van angelicinederivaten en bestraling met UV-A van de huid waarbij 8-MGP is aangegeven als vergelijkende stof (procentuele remming + standaardafwijking) .

15 _;__ geen geneesmiddel 3,2+1,8 8-methoxypsoralen (8-MOP) 39,1+3,7 4,5'-dimethylangglicine 51 +8,0 4,5-dimethylangelicine 55 +6,0 20 4'-hydroxymethyl-4,5'-dimethylangelicine 54,2+6,8 4'-acetoxymethyl-4,5'-dimethylangelicine 64,8+13,9 angelicine 28 +2 oe , , J De hieronder vermelde farmaceutische samenstellingen kunnen worden gebruikt voor orale toediening van de alkylangelicineverbindingen:

Capsules kunnen worden samengesteld uit : alkylangelicine (geneesmiddel) 30 mg lactose (verdunningsmiddel ) 70-120 mg on magnesiumstearaat (smeermiddel) 1-1,5 mg natriumlaurylsuVfaat (bevochtigingsmiddel) 1,5 rag

Deze stoffen werden in een harde of zachte gelatinecapsule gebracht.

Tabletten werden vervaardigd op basis van de volgende stoffen: 35 alkylangelicine (geneesmiddel) 30 mg lactose (verdunningsmiddel) 240 mg magnesiumstearaat (smeermiddel) 2 mg maïszetmeel (desintegratiemiddel en smeermiddel) 60 mg O Λ Λ /. n o -32- 21466/Vk/mv microkristallijne cellulose (smeermiddel en desinte- gratiemxddel) 10 mg polyvinylpyrrolidon (bindmiddel) 3% natriuralaurylsulfaat (bevochtigingsmiddel) 3 mg 5 In afhankelijkheid van het lichaamsgewicht, de leeftijd, het geslacht van de patient konden een of meer tabletten of capsules oraal worden toegediend 2 uren voor de bestraling.

10 -conclusies 80 0 4 6 9 9

Claims

1. Furocoumarine voor fotocheraische therapie van psoriasis en andere huidziekten die gevoelig zi in voor een dergelijke behandeling, 5 met het kenmerk, dat dit een angelicine is, gemodificeerd door het invoeren van alkylgroepen en de farmaceutisch toepasbare zouten hiervan.

2. Furocoumarine volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het angelcine gemodificeerd is door het invoeren van ten minste een methylgroep.

3. Furocoumarine volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat an-10 gelicine is gemodificeerd door het invoeren van ten minste een gefunctio- naliseerde methyleengroep.

4. Furocoumarine volgens conclusie 1-2, met het kenmerk, dat angelicine is gemodificeerd door het invoeren van een methylgroep in positie 5.

5. Furocoumarine volgens conclusie 1, 2 en 4, met het kenmerk, _ dat angelicine is gemodificeerd door het invoeren van twee methylgroepen waarvan een groep aanwezig is in de 5'-positie.

6. Furocoumarine volgens conclusie 1-3,.met het kenmerk, dat angelicine is gemodificeerd'door het invoeren van hydroxymethyleengroep 20 in positie 4' en van ten minste een methylgroep.

7. Furocoumarine volgens conclusie 1, 2 en 4, met het kenmerk, dat dit 5-methylangelicine is.

8. Furocoumarine volgens conclusie 1, 2 en 5, met het kenmerk, dat dit 4,5-dimethylangelicine is.

9. Furocoumarine volgens conclusie 1, 2, 4 en 5,* met het ken merk, dat dit 5,5*-diraethylangelicine is.

10. Furocoumarine volgens conclusie 1, 2, 3, 5 en 6, met het kenmerk, dat dit 4,5‘-dimethyl-4,-hydroxymethylangelicine is.

11. Furocoumarine volgens conclusie 1-3, met het kenmerk, dat 30 dit een angelicine is met een amino- of een N ,N-dialkylaminoalkoxymethy1- groep in positie 4’ en ten minste een methylgroep.

12. Furocoumarine volgens conclusie 1-3 en 11, met het kenmerk, dat dit 4,5,-dimethyl-4,-(N,N-diethyl)aminoethoxymethylangelicine is.

13. Furocoumarine volgens conclusie 1-2, met het kenmerk, dat 35 angelicine is gemodificeerd door het invoeren van een O-alkylgroep in de positie 5 en ten minste een methylgroep aanwezig is.

14. Furocoumarine volgens conclusie 1, 2 en 13, met het kenmerk, dat angelicine is gemodificeerd door het invoeren van een aminoalkoxygroep 80 0 4 69 9 -34- 21466/Vk/mv of N,N-dialkylaminoalkoxygroep in positie 5 en ten minste een methylgroep aanwezig is .

15. Furocoumarine volgens conclusie lr3 en 5-6, met het kenmerk, dat dit 4'-acetoxymethy1-4,5'-dimethylangelicine is.

16. Furocoumarine volgens conclusie 1 en 3, met het kenmerk, dat dit 4'-N,N1dimethylethoxymethyl-4,5'-dimethylangelicine is.

17. Furocoumarine volgens conclusie 1-2 , met het kenmerk, dat dit 4-methylangeiicine is.

18. Werkwijze ter bereiding van een geneesmiddel met een werking 10 zoals aangegeven in conclusie 1, met het kenmerk, dat men furocoumarine- verbindingen zoals aangegeven in conclusie 1-17 in een voor geneeskundige doeleinden geschikte toedieningsvorm brengt.

19. Werkwijze ter bereiding van geneeskrachtige furocoumarine* verbindingen geschikt voor gebruik bij de werkwijze volgens conclusie 15 18, met het kenmerk, dat men furocoumarineverbindingen zoals vermeld in conclusie 1-17 bereidt op een voor analoge verbindingen bekende wijze.

20. Farmaceutische samenstelling voor plaatselijke toepassing bereid volgens conclusie 18, met het kenmerk, dat ten minste een van de actieve verbindingen wordt gebruikt in een hoeveelheid van 0,05 tot 0,4 gew.% in 20 een glyco lalkoholotion met 5-30 volume% glycerine.

·» 21. Farmaceutische samenstelling voor orale toediening, bereid volgens de werkwijze die aangegeven is in conclusie 18, met het kenmerk, dat ten minste een aotieve verbinding volgeils conclusie 1-17 wordt verwerkt in een hieronder vermelde samenstelling: 25 geneesmiddel 30 mg verdunningsmiddel 70-200 mg smeermiddel 1-5 % bevochtigingsmiddel 1 % tot een harde of zachte gelatinecapsule.

22. Farmaceutische samenstelling voor orale toediening (tablet) bereid volgens de werkwijze.beschreven ’in conclusie 18, met het kenmerk, dat ten minste een actieve verbinding zoels aangegeven in conclusie 1-17, wordt verwerkt tot een samenstelling bestaande uit: geneesmiddel 30 mg 35 verdunningsmiddel 100-240 mg smeermiddel 2-20 mg desintegratiemiddel 15- 20 rag λ μ λ bindmiddel 3-5 % 80 0 4 69 9 bevochtigingsmiddel 1 % _35_ 21466/Vk/mv

23. Werkwijze voor fotochemotherapeutische behandeling van psoriasis en andere huidziekten die gevoelig zijn voor een dergelijke behandeling, met het ^.kenmerk, dat een farmaceutische samenstelling zoals 5 aangegeven is in conclusie 20 op het oppervlak van · de zieke huid wordt aangebracht, het preparaat wordt gedroogd door het aan de lucht te laten indampen, na ongeveer 10 minuten te bestralen met behulp van lampan die UV-A-licht geven, zodat een bestralingsdosis wordt bewerkstelligd van 3-20 2 31 cm . in afhankelijkheid van de huidgevoeligheid van de patient, welke be-handeling drie tot vijf keren per week wordt herhaald gedurende ten minste twee weken totdat genezing van de ziekte is bereikt.

24. Fotochemotherapeutische behandeling van psoriasis en andere huidziekten, door orale toediening, met het ikenmerk, dat een farmaceutische samenstelling wordt toegediend zoals aangegeven in de conclusies 15 21 of 22, in de vorm van een of meer tabletten of capsules, in afhankelijkheid van het lichaamsgewicht, de leeftijd en het geslacht van de patient, waarna twee tot drie uren wordt gewacht en de plaats op de huid wordt bestraald met behulp van lampen die UV-A-licht geven zodat een bestralingsdosis wordt verkregen van 3-20 j/cm in afhankelijkheid van de gevoeligheid van de huid 20 van de patient, welke behandeling drie tot vijf keren per week wordt herhaald gedurende ten minste 2 weken tot genezing van de ziekte is bereikt.

25. Furocoumarineverbindingen met formule 43 ^ aangegeven op het formuleblad, met het kenmerk, dat R^ en R^ die gelijk of verschillend kunnen zijn waterstof zijn of alkyl, R~ is waterstof, alkyl, methoxy, een groep 25 1 met formule -O·-(CK_) -N(Rc)(Re) en Zn j t R^ is waterstof, alkyl,metho^methyl, hydroxymethyl, acetoxy- methyl, een groep met formule -(CH„) -N-(R-)(R,) of -(CHL; -O-(CH-) -N(R.)(R,) zn 50 zn Zm 00 waarbij R^ en Rg onafhankelijk van elkaar waterstof of alkyl zijn en n en m onafhankelijk van elkaar een integer met de waarde 1-X, en de 50 farmaceutische zouten hiervan.

26. Verbinding volgens conclusie 25, met het kenmerk, dat Rj , R2, R3, R^ gelijk of verschillend zijn en wel waterstof of methyl.

27. Verbinding volgens conclusie 25, met het kenmerk, dat R^, R2, R3 gelijk of verschillend zijn en wel waterstof of methyl en R^ 55 methoxymethyl, hydro^methyl, acetoxymethyl, een groep met formule -(CHJ -N(R.)(R,) of -(CH„) -0-(CH„) -N(R,)(rJ is waarbij R_ en R. Zn 0 0 Zn z m 5 o d o onafhankelijk van elkaar waterstof of alkyl zijn en n en m onafhankelijk van elkaar een integer met de waarde 1-3. flnfu fia.Q "36- 21466/Vk/mv

28. Verbinding volgens conclusie 25 en 26, met het kenmerk, dat en Rg gelijk of verschillend zijn en wel waterstof of alkyl, R0 is methyl, is waterstof, raethoxymethyl, acetoxymethyl, hydroxymethyl, een groep met formule - (Cfl^) -N(Rj) (Rg) of - (C^^-fKR^) (Rg) waarbij Rg en Rg onafhankelijk van elkaar waterstof of alkyl zijn en 5 n en ra zijn onafhankelijk van elkaar een integer met de waarde 1-3.

29. Verbinding volgens conclusie 25, 26 en 28, waarbij R^ en R^ gelijk of verschillend zijn en wel waterstof of alkyl en Rg en Rg zijn methylgroepen.

30. Verbinding volgens conclusie 25 en 27, met het kenmerk, 10 dat Rg, Rg en Rg gelijk of verschillend zijn en wel waterstof of alkyl en is een hydroxymethylgroep. Eindhoven, augustus, 1980 15 • ' 8004699