NL8003138A - Methode voor het bepalen van lipase en reagens daarvoor. - Google Patents
Methode voor het bepalen van lipase en reagens daarvoor. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8003138A NL8003138A NL8003138A NL8003138A NL8003138A NL 8003138 A NL8003138 A NL 8003138A NL 8003138 A NL8003138 A NL 8003138A NL 8003138 A NL8003138 A NL 8003138A NL 8003138 A NL8003138 A NL 8003138A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- reagent
- mixture
- pseudocholinesterase
- lipase
- color
- Prior art date
Links
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 52
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 title claims description 29
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 title claims description 29
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 title claims description 29
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 title claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 45
- 102100032404 Cholinesterase Human genes 0.000 claims description 39
- 108010053652 Butyrylcholinesterase Proteins 0.000 claims description 29
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 28
- 239000003774 sulfhydryl reagent Substances 0.000 claims description 21
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 claims description 19
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 16
- 108090000322 Cholinesterases Proteins 0.000 claims description 15
- 229940048961 cholinesterase Drugs 0.000 claims description 14
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 13
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 13
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 claims description 13
- PIJVFDBKTWXHHD-HIFRSBDPSA-N physostigmine Chemical group C12=CC(OC(=O)NC)=CC=C2N(C)[C@@H]2[C@@]1(C)CCN2C PIJVFDBKTWXHHD-HIFRSBDPSA-N 0.000 claims description 13
- HZOTZTANVBDFOF-PBCQUBLHSA-N physostigmine salicylate Chemical group OC(=O)C1=CC=CC=C1O.C12=CC(OC(=O)NC)=CC=C2N(C)[C@@H]2[C@@]1(C)CCN2C HZOTZTANVBDFOF-PBCQUBLHSA-N 0.000 claims description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 11
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical class NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 9
- PIJVFDBKTWXHHD-UHFFFAOYSA-N Physostigmine Natural products C12=CC(OC(=O)NC)=CC=C2N(C)C2C1(C)CCN2C PIJVFDBKTWXHHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 8
- 229960001697 physostigmine Drugs 0.000 claims description 8
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 7
- 108010051152 Carboxylesterase Proteins 0.000 claims description 6
- 102000013392 Carboxylesterase Human genes 0.000 claims description 6
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 102000003914 Cholinesterases Human genes 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000000693 micelle Substances 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 claims description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000012442 inert solvent Substances 0.000 claims description 2
- DXHGQTOFBOPBNC-UHFFFAOYSA-N thiourea;dihydrobromide Chemical compound Br.Br.NC(S)=N DXHGQTOFBOPBNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical group FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 21
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 14
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 10
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 9
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- -1 amberoniimchloride Chemical compound 0.000 description 7
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N EtOH Substances CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 5
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 5
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 4
- 102100033639 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 4
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 4
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical group 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 230000000979 retarding effect Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010009043 arylesterase Proteins 0.000 description 3
- 102000028848 arylesterase Human genes 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- OSZNNLWOYWAHSS-UHFFFAOYSA-M neostigmine methyl sulfate Chemical compound COS([O-])(=O)=O.CN(C)C(=O)OC1=CC=CC([N+](C)(C)C)=C1 OSZNNLWOYWAHSS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229960002253 neostigmine methylsulfate Drugs 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 3
- PMNLUUOXGOOLSP-UHFFFAOYSA-N 2-mercaptopropanoic acid Chemical compound CC(S)C(O)=O PMNLUUOXGOOLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-L 5-[(3-carboxylato-4-nitrophenyl)disulfanyl]-2-nitrobenzoate Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)[O-])=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C([O-])=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- XDVMCVGTDUKDHL-UHFFFAOYSA-N [amino(2-azaniumylethylsulfanyl)methylidene]azanium;dibromide Chemical compound Br.Br.NCCSC(N)=N XDVMCVGTDUKDHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 2
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000012445 acidic reagent Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 2
- MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N diisopropyl fluorophosphate Chemical compound CC(C)OP(F)(=O)OC(C)C MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 229960002362 neostigmine Drugs 0.000 description 2
- LULNWZDBKTWDGK-UHFFFAOYSA-M neostigmine bromide Chemical compound [Br-].CN(C)C(=O)OC1=CC=CC([N+](C)(C)C)=C1 LULNWZDBKTWDGK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 2
- JWSLMDWREGSKAJ-UHFFFAOYSA-N (1-benzylpyridin-1-ium-3-yl) n,n-dimethylcarbamate Chemical compound CN(C)C(=O)OC1=CC=C[N+](CC=2C=CC=CC=2)=C1 JWSLMDWREGSKAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGJCBBASTRWVJL-UHFFFAOYSA-N 1,3-thiazolidine-2-thione Chemical compound SC1=NCCS1 WGJCBBASTRWVJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CMCBDXRRFKYBDG-UHFFFAOYSA-N 1-dodecoxydodecane Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCCCCCCCCCCC CMCBDXRRFKYBDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JPJDHKGZXKMWDY-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(sulfanyl)propan-1-ol;butanoic acid Chemical compound CCCC(O)=O.CCCC(O)=O.CCCC(O)=O.OCC(S)CS JPJDHKGZXKMWDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KWVPFECTOKLOBL-KTKRTIGZSA-N 2-[(z)-octadec-9-enoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCCO KWVPFECTOKLOBL-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- HQAPREJURVMGMB-UHFFFAOYSA-M 2-acetylsulfanylethyl(trimethyl)azanium;bromide Chemical compound [Br-].CC(=O)SCC[N+](C)(C)C HQAPREJURVMGMB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VFVHNRJEYQGRGE-UHFFFAOYSA-N 3-acetylsulfanyl-2-methylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)CSC(C)=O VFVHNRJEYQGRGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000613620 Homo sapiens Protein mono-ADP-ribosyltransferase PARP15 Proteins 0.000 description 1
- 239000005949 Malathion Substances 0.000 description 1
- IGFHQQFPSIBGKE-UHFFFAOYSA-N Nonylphenol Natural products CCCCCCCCCC1=CC=C(O)C=C1 IGFHQQFPSIBGKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 102100040846 Protein mono-ADP-ribosyltransferase PARP15 Human genes 0.000 description 1
- VNYBTNPBYXSMOO-UHFFFAOYSA-M Pyridostigmine bromide Chemical compound [Br-].CN(C)C(=O)OC1=CC=C[N+](C)=C1 VNYBTNPBYXSMOO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- IYFATESGLOUGBX-YVNJGZBMSA-N Sorbitan monopalmitate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O IYFATESGLOUGBX-YVNJGZBMSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005037 alkyl phenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 125000004103 aminoalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011260 aqueous acid Substances 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- JXSJBGJIGXNWCI-UHFFFAOYSA-N diethyl 2-[(dimethoxyphosphorothioyl)thio]succinate Chemical compound CCOC(=O)CC(SP(=S)(OC)OC)C(=O)OCC JXSJBGJIGXNWCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000816 ethylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229960005051 fluostigmine Drugs 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 150000002541 isothioureas Chemical class 0.000 description 1
- 108010065073 lidase Proteins 0.000 description 1
- 229960000453 malathion Drugs 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N mercaptopurine Chemical compound S=C1NC=NC2=C1NC=N2 GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001428 mercaptopurine Drugs 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- SNQQPOLDUKLAAF-UHFFFAOYSA-N nonylphenol Chemical compound CCCCCCCCCC1=CC=CC=C1O SNQQPOLDUKLAAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UYDLBVPAAFVANX-UHFFFAOYSA-N octylphenoxy polyethoxyethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(OCCOCCOCCOCCO)C=C1 UYDLBVPAAFVANX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N parathion Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008389 polyethoxylated castor oil Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 229960002151 pyridostigmine bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000007430 reference method Methods 0.000 description 1
- 229960001860 salicylate Drugs 0.000 description 1
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M salicylate Chemical compound OC1=CC=CC=C1C([O-])=O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000001374 small-angle light scattering Methods 0.000 description 1
- 235000011071 sorbitan monopalmitate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001570 sorbitan monopalmitate Substances 0.000 description 1
- 229940031953 sorbitan monopalmitate Drugs 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 229960000281 trometamol Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
* 4.
'r i 1 VG 524
Methode voor het bepalen van lipase en reagens daarvoor.
De uitvinding heeft betrekking op een verbetering van de methode voor het bepalen van lipase en reagens daarvoor, beschreven in Amerikaans octrooischrift No.3.986.930 en Kurooka et al., J. Biochem. 81, 361 - 369 (1977) alsmede Japanse octrooiaanvrage 5 Sho. 51-68342. Bij deze methode en reagens is een S-acylverbinding, als beschreven in de bovenstaande literatuur, aanwezig als een substraat. Lipase in een biologisch fluïde specimen zoals serum of plasma katalyseert de hydrolyse van de S-acylverbinding onder vrij-geving van sulfhydrylgrcepen. De vrijgekomen sulfhydrylgroepen realo geren met een chromogeen sulfhydrylreagens, zoals 5.5’-dithiobis- (2-nitrobenzoëzuur) C’DTNB” afgekort door Kurooka et al.) en de verkregen kleur wordt bepaald voor het verschaffen van een meting van de lipase-activiteit. Geschikte chromogene sulfhydrylreagentia worden geopenbaard door Kurooka et al. en Ellman (Amerikaans oc-15 trooischrift No.3.119.668).
De Kurooka-methode en reagens heeft vele gewenste eigenschappen. Echter zoals geopenbaard in de bovenvermelde Japanse octrooiaanvrage, heeft zij het nadeel van een gebrek aan gevoeligheid, die Kurooka toeschreef aan remming door serumalbumine. Haar ont-20 breekt ook specificiteit voor lipase en zij bepaalt niet steeds de ware lipase-activiteit. Bovendien vereist de methode de toevoeging van aceton om proteïne vóór de bepaling neer te slaan waardoor centrifugeren of een soortgelijke proteïneverwijderingstrap vóór de bepaling nodig is.
25 Er is nu gevonden, dat de specificiteit van de methode en reagens volgens Kurooka et al. sterk kunnen worden verbeterd door de toevoeging van een pseudocholinesterasevertrager, zodat het verkregen reagens en de verkregen methode meer echt specifiek voor lipase zijn. Er is gevonden, dat de gevoeligheid van de methode kan 30 worden verbeterd door opname van een ondergeschikte hoeveelheid al- 800 3 1 38 - 2 - bumine. De testmethode kan ook worden verbeterd door gebruik van. een nonionisch oppervlakteactief middel om de· incubatie te beëindigen en de kleur kan dan rechtstreeks worden gemeten zonder centrifugeren of andere verwijderingsbewerkingen van proteïne. Voorts 5 is gevonden dat in water oplosbare S-(aminoalkyl)isothioureumzou- ten kunnen worden toegepast als standaardoplossingen bij de Kurooka-et al-methode en reagens.Aldus omvat de uitvinding een nieuw verbeterd reagens, een methode en een diagnostische testuitrusting.
Het" reagens, de methode en de uitrusting volgens de uitvin- 10 ding omvatten alle een S-acylverbinding en een chromogeen sulfhy- drylreagens en kunnen ook bevatten een carboxylesterase- en aryl's esterasevertrager als geopenbaard door Kurooka en Kurooka et al. Dezelfde S-acylverbindingen en chromogene sulfhydrylreagentia kunnen worden toegepast en deze termen worden hierin gebruikt met de-15 zelfde betekenis als in Amerikaans octrooischrift 3.986.930. De thans geprefereerde S-acylverbinding is 2.3-dimercaptopropaan-l-ol-tributyraat, afgekort als "BAL3" door Kurooka et al. en ook door hen geprefereerd. Het geprefereerde chromogene sulfhydrylreagens is DTNB, 5.5’-dithiobis(2-nitrobenzoezuur], ook geprefereerd door 20 Kurooka et al. De geprefereerde vertrager van arylesterase- en carboxylesterase is fenylmethylsulfonylfluoride (afgekort PMSF], ook geprefereerd door Kurooka et al.
De S-acylverbindingen corresponderen met een der formules 1-4 van het formuleblad als beschreven door Kurooka et al., waar-25 in n een geheel getal is van 2 t/m 4, n’ een geheel getal van 2 t/m 4 of van 9 t/m 13, m een geheel getal van 3, 7 of 11, m’ een geheel getal van 4 of 12, y een geheel getal van 1 of 2, X een zwavel- of zuurstofatoom, Y een zwavelatoom, zuurstofatoom of ethyleengroep, met dien verstande, dat wanneer y = 1, m’ 4 en wanneer y 2, 30 m' = 12.
Gevonden is, dat de S-acylverbindingen zeer gevoelig zijn voor hydrolyse door pseudocholinesterase aangetroffen in biologische vloeistoffen zoals menselijk bloedserum. Als een gevolg kan de kleur verkregen bij reactie met het chromogene sulfhydrylreagens 35 worden verhoogd zodat valselijk verhoogde lipaseresultaten worden 800 3 1 38 «r ά - 3 - verKregen.
De vaste, in water oplosbare pseudocholinesterasevertrager Kan elKe pseudocholinesterasevertrager zijn die diagnostisch aanvaardbaar isj d.w.z.., fysisch en chemisch stabiel en oplosbaar in 5 het waterig incubatiemengsel sn χΠ staat tot het vertragen van pseudocholinesterase aanwezig in biologische vloeistoffen zonder lipase te storen of bij de Kleurreactie met het sulfhydrylreagens tussen beide te Komen. Pseudocholinesterasevertragers en cholines-terasevertragers zijn toxisch en dienen met de nodige voorzorgen 10 te worden gehanteerd. Het gebruiK van vluchtige cholinesterqsever- tragers Kan leiden tot de produKtie van giftige dampen gedurende de testbebroeding alsmede tot verlies van vertrager uit het substraat gedurende het bebroeden of de voorverhitting bij de bereiding. Bij de bereiding van gelyofiliseerd reagentia voor diagnosti-15 sche uitrustingen dient de vertrager niet vluchtig te zijn onder de omstandigheden voor het verwijderen van het water uit de andere reagentia [temperaturen in. de orde van -50 tot +35°C bij druKKen van 0,1 - 5 mm KwiK gedurende 12 - 48 uren]. Zij dienen ooK zich fysisch en chemisch te verdragen met de andere bestanddelen en ge-20 maKKelijK in water dispergeerbaar te zijn uit de droge vorm alsmede in water oplosbaar. Of een speciale cholinesterasevertrager al dan niet de vereiste eigenschappen van vertragende activiteit, inert-heid tegenover lipase, niet-vluchtigheid, lyofiliseerbaarheid en dispergeerbaarheid en oplosbaarheid in water bezit. Kan in veel 25 gevallen uit zijn beKende eigenschappen of door routineproefjes worden bepaald.
In het algemeen dient de pseudocholinesterase-vertrager een vaste staf te zijn bij temperaturen beneden 50°C, een goede in
O
water oplosbaarheid te bezitten [tenminste 0,5-25 mmol/dm ], een 30 dampdruK te bezitten die belangrijK Kleiner is dan die van water en chemisch stabiel te zijn in waterige oplossingen bij neutrale tot basische pH-waarden. Een aantal van de vloeibare fosfaatinsec-ticide cholinesterasevertragers zijn derhalve niet geschiKt. Para-thion is b.v. niet slechts een zeer toxische vloeistof, doch bezit 35 ooK een onvoldoende oplosbaarheid in water en een onvoldoende sta- 800 3 1 38 - 4 - biliteit bij alkalische pH-waarden. Isofluorfaat of dilsopropylfluo-rofosfaat ontleedt bij aanwezigheid van vocht onder vorming van waterstoffluoride en verliest van vertragende activiteit alsmede bezit van vluchtigheid, sterke toxiciteit en niet-lyofiliseer-5 baarheid. Malathion is een vloeistof met een onvoldoende oplosbaar heid in water en die hydrolyseert en activiteit verliest bij alkalische pH.
Pseudocholinesterasevertragers, die gexchikt zijn volgens de uitvinding, omvatten de vaste, in water oplosbare carbamaatcholi-10 nesterase/pseudooholinesterase-vertragers zoals fysostigmine (eserine), neostigmine, pyridostigminebromide, amberoniimchloride, benzpyriniumchloride en demecorlumbromide. Eserine (fysostigmine) en de zouten daarvan zoals het salicylaat en sulfaat zijn geprefereerd voor gebruik als pseudocholinesteraee/cholinesterasevertra-15 gers. Eserinesalicylaat is zeer specifiek voor serumpseudocholi- nesterase, en remt lipase niet onder^ de beproevingsomstandigheden. Ook stoort het de sulfhydrylkleurreactie onder de gebruiksomstan-digheden niet. Eserinesalicylaat is geprefereerd. De vertrager wordt toegepast in een voldoende hoeveelheid om pseudocholineste-20 rase en cholinesterase in het monster te remmen. De optimale in specifieke mengsels en bij speciale methoden toe te passen hoeveelheden kunnen worden bepaald door gebruikelijke proeven daarvoor.
Bij het geprefereerde eserinesalicylaat is een concentratie van tenminste 0,005 millimolair (0,005 duizendste van een gram mole- 3 25 cuulgewicht per dm ) in het mengsel van substraatreagens en mon ster geschikt en worden concentraties van 0,01 - 0,03 geprefereerd.
Hogere concentraties kunnen worden toegepast (van 0,005 -0,1 millimolair tot verzadiging) echter is weinig of geen verbetering waargenomen bij concentraties toenemend van 0,02 - 0,05 milli-30 molair en verdere hoeveelheden zijn in het algemeen nodig. Bij con centraties ver beneden 0,005 millimolair kan serumpseudocholineste-rase sulfhydrylgroepen in vrijheid stellen uit de S-acylverbinding onder oplevering van valselijk verhoogde lipasemetingen.
Albumine wordt toegepast in een de gevoeligheid verbeterende 35 hoeveelheid. De juiste hoeveelheid die in speciale gevallen moet worden toegepast, kan worden bepaald door gebruikelijke technieken 8003 1 38 m » - 5 - onder toepassing van verschillende concentraties albumine. Onvoldoende albumine, alsmede overmaat albumine, resulteert in een verlies aan gevoeligheid als blijkt uit een verlies aan kleur ontwikkeld voor een gegeven hoeveelheid lipase. In het algemeen geeft 3 5 een albumineconcentrati'e van 1 - 8 mg per cm reagens goede resulr taten. Een anionisch oppervlakteactief middel z o als natriumdode-cylsulfaat, wordt bij voorkeur opgenomen om de enzymeactiviteit te verhogen als beschreven door Kurooka et al., J. Biochem. 81, 361 - 369 (1977).
10 Volgens de uitvinding wordt een biologisch vloeistofmonster zoals serum, plasma,, pancreasvloeistof of dergelijke, bebroed met het reagens bevattend de S-acylverbinding, chromogeen sulfhydryl-reagens, eserinezout en albumine onder omstandigheden van pH en temperatuur dia de liDaseactiviteit bevorderen. Na een vooraf be-15 paalde incubatieperiode wordt de incubatie beëindigd, het troe bele mengsel geklaard en de verkregen kleur bepaald in een colorimeter of spectrofotometer. Gevonden is, dat de bebroeding kan worden beëindigd en het mengsel tezelfdertijd geklaard door toevoeging van een substraat oplossend, niet-ionogeen oppervlakteactief middel, 2D zoals een alkylfenylether van polyethyleenglycol, polyoxyethyleen- sarbitanmonavetzuuresters, of gepolyoxyethyleerde plantaardige olie.
De term "substraat oplossend" wordt gebruikt ter verwijzing naar de eigenschap van het niet-ionische oppervlakteactieve middel 25 om de S-acylverbinding in water te solubiliseren onder vorming van een heldere oplossing van de S-acylverbinding in het reagensmeng-sel en geen emulsie. Als beschreven door Kurooka et al. vormt de S-acylsubstraatverbinding een micellaire emulsie in waterige buffer zonder een oppervlakteactief middel of emulgator. Speciale 30 niet-ionogene oppervlakteactieve middelen kunnen worden beproefd op substraatsolubiliserend vermogen door hen eenvoudig toe te voegen aan de waterige gebufferde S-acylsubstraatemulsie bij een pH van 8 - 9 en na te gaan of de niet-waterige fase mengbaar wordt in een waterige fase. Geschikte niet-ionogene substraatsolubiliseren-35 de oppervlakteactieve middelen omvatten octylfenoxy-polyethoxy- 800 3 1 38 - 6 - ethanol (Triton ©X-100, Rohm & Haas, gemiddeld molecuulgewicht 646, Merck Index, 9e ed., Monograaf 7350)j nonylfenolpolyethyleen-glycolether (Tergitol©NPX, Union Carbide), gepolyoxyethyleerde plantaardige olie (Emulphor ®E1 -719, GAF Corporation),· polyoxy-5 ethyleen(20)-sorbitanmonopalmitaat (Tween ©40, ICI United State) en Cremophor^ E-L, SASF-Wyandotte). Anionische oppervlakteactie-ve middelen zoals natriumlaurylsulfaat en enkele niet-ionogene oppervlakteactieve middelen zoals polyoxyethyleen (23) laurylether laten het S-acylverbindingssubstraat in emulsievorm.
10 Het niet-ionogene substraatsolubiliserende oppervlakteactie ve middel verbreekt de substraatmicellen en lost deze op onder gelijktijdig beëindigen van de lipaseactiviteit en het klaren van het mengsel, zodat de kleur onmiddellijk kan worden bepaald zonder een bijkomende neerslag, centrifugerings- of andere scheidingstrap.
15 Ofschoon het niet-ionogene oppervlakteactieve middel alleen vol doende is om de bebroeding te beëindigen en een onmiddellijke.meting mogelijk te maken, verdient het aanbeveling ook voldoende zuur toe te voegen om de pH tot 7,0 of lager te verlagen. Het gecombineerde gebruik van aanzuren en het niet-ionogene oppervlakteactieve 20 middel, verschaft een stabielere eindkleur in het mengsel. Volgens een geprefereerde methode wordt een oplossing van ongeveer 0,5 - 2,0 /8) g van een octylfenoxypolyethoxyethanol (Triton^X-100, Rohm & 3
Haas) in 100 om van een zure oplossing, zoals 16,5 millimolair waterig chloorwaterstofzuur of tris-HCl (1,5 - 2,5 molair) toegepast 3 25 om de bebroeding te beëindigen onder toepassing van 2 cm van dit 3 zure reagens op ongeveer 1 om reactiemengsel.
Het reagenssubstraatmengsel volgens de uitvinding omvat typisch de volgende bestanddelen in de vermelde hoeveelheden: buffer voor pH 8,0 - 9,5 0,05-0,3 molair 30 anionisch oppervlaktsactief middel 1-3 millimolair (mM)
chromogeen sulfhydrylreagens 0,15 - 0,8 mM
carboxylesterase-vertrager 0,05 - 1,5 mM
eserinezout 0,005 - 0,1 mM
3 albumine 1-8 mg/cm
35 S-acylverbinding 2 - 5 mM
800 3 1 38 - 7 -
Bij de werkwijze volgens de uitvinding wordt een waterig mengsel van de bovenvermelde bestanddelen gemengd met het monster 3 in een verhouding van 2 cm van het reagenssubstraat op 10 - 100 microliter monster en het mengsel bebroed bij 20 - 25°C tot 37°C 5 gedurende 15 - 45 minuten. Het zure reagens en het niet-ionische oppervlakteactieve middel worden dan toegevoegd en de kleur wordt bepaald bij voorkeur door het bepalen van de absorptie in een spec-trofotometer met licht met een golflengte van 400 - 420 nanometer. De lipaseactiviteit kan worden bepaald door vergelijken met resul-10 taten verkregen met standaardoplossingen van bekende lipaseactivi teit, ijktabellen of dergelijke. Bij voorkeur wordt ook een blanco bepaling uitgevoerd door gebruik van duplicaatmonsters en de be-broeding vroeg beëindigd met een der duplicaten ter verkrijging van een blanco waarde.
15 Het is ook gewenst een standaardoplossing te gebruiken die een vooraf bepaalde kleur of absorptie zal geven die gerelateerd is aan een bekende hoeveelheid lipaseactiviteit. Standaardlipase-oplossingen of controlesera kunnen worden toegepast; echter zijn deze onderhevig aan wijzigingen van de ene lading tot de andere 20 en verlies van lipaseactiviteit bij opslag. Een niet-enzymatische chemische standaard maakt gewoonlijk mogelijk dat de standaardoplossing zodanig wordt samengesteld dat zij een gelijkmatige ij king geeft van lading tot lading en verbeterde opslageigenschap-pen noodzakelijk voor gebruik met voorgemengde reagentia en diag-25 nostische uitrustingen. Ofschoon vele verbindingen zullen reage ren met het chromogene sulfhydrylreagens zijn zij niet bruikbaar als standaard. B.v. reageren S-acetylthiocholinebromide en 2-methyl- 3-acetyl-mercaptopropionzuur zo langzaam met het sulfhydrylreagens dat de kleurreactie onvolledig is na het bebroeden. Mercaptopurine 30 en thiomelkzuur verschaffen een niet stabiele kleur. Andere verbin dingen zoals dithiothreitol en 2-mercaptothiazoline zijn hetzij niet stabiel hetzij onoplosbaar in het te bebroeden mengsel.
Er is nu gevonden dat de diagnostisch aanvaardbare in water oplosbare S-C2-amino-lager alkyl)isothiuroniumzouten kunnen worden 35 toegepast als chemische standaard bij de lipasebepalingsmethode.
8003138 - a -
Dergelijke zouten, waarin lager alkyl 1-3 koolstofatomen betekent, en waarin het anionische deel niet vertragend werkt, participeert in of komt anderszins bij de kleurreactie tussenbeide, bezitten de noodzakelijke stabiliteit, reactiviteit met het chromogene sulfhy-5 drylreagens en oplosbaarheid voor het verschaffen van uitstekende resultaten als chemische standaard. De geprefereerde verbinding is S-(2-aminoëthyl)isothiuroniumbromidehydrobromide. De standaardoplossing bevat het isothiuroniumzout in water in een vooraf bepaalde concentratie, aangepast voor het verschaffen van een kleur bij 10 reactie met de lipasereagentia, welke kleur overeenkomt met een vooraf bepaald bekend niveau van lipaseactiviteit. Typisch dient het isothiuroniumzout te worden toegepast in een hoeveelheid die een absorptie van 0,1 - 0,5 tot 1 in het eindreactiemengsel geeft na bebroeden en reactie met het chromogene sulfhydrylreagens. Bij i 15 voorkeur wordt het isothiuroniumzout gemengd met een buffer of zuur voor het verschaffen van een pH in waterige oplossing van 6,2 - 7,0. Voor voorgemengde reagentia of diagnostische uitrustingen kunnen het isothiuroniumzout en buffer worden samengesteld en gedroogd b.v. door lyofiliseren om hersteld te worden met gedestil-20 leerd water vóór gebruik. Ook kan het isothiuroniumzout worden ge- lyofiliseerd met een stabilisator zoals dextran, en hersteld met een waterig zuur, zoals 0,2 N chloorwaterstof. Een geschikt lipase kleurstandaardmengsel kan als volgt worden bereid:
Voor een standaardkleurmengsel corresponderend met hoge 3 25 normaal menselijke serumlipaseniveaus (ongeveer 200 I.E. per cm ]: S-(2-amino-lager alkyl3isothiuroniumzout 1,1 mg buffer (pH 6,53 3
Water q.s. aan 1 cm 20 microliter van deze oplossing is 3 een typische hoeveelheid toegepast per test met 1,1 cm van het 30 substraatreagensmengsel voor het verkrijgen van een eindabsorptie van'ongeveer 0,4. De exacte absorptie en correlatie tot een speciaal lipaseniveau zal afhangen van de exacte hoeveelheden van in het eindmengsel toegepast isothiuroniumzout.
Een geprefereerd reagenssubstraat omvat het volgende: 8003138 -9- buffer-trisbuffer 0,12 molair natriumdodecylsulfaat 2 mM (millimolair)
DTNB 0,3 mM
PMSF 0,4 mM
5 eserinesalicylaat 0,03 mM
3 albumins 7,0 mg/cm
SALS 3,0 mM
eind-pH 8,8 3
Volgens een geprefereerde methode worden 1,1 - 2,1 cm 10 van het bovenvermelde reagens toegepast met 20 - 50 microliter monster. De bebroeding geschiedt bij voorkeur bij 30°C gedurende 20 - 30 minuten waarna de reactie wordt gestopt door toevoeging van 2 cm3 0,6 - 0,8% (gewicht per volume) Triton® X-100 in 16,5 mM chloorwaterstofzuur of een zure. oplossing CpH 1-5) zoals 15 tris-HCl (1,5 - 2,5 molair, pH ongeveer 4,0). De absorptie wordt bepaald bij 412 nm en vergeleken met de resultaten verkregen met een duplicaatmonster als de absorptie wordt bepaald na 10 minuten bebroeden. Het verschil in absorptie wordt bepaald als een bepaling van lipaseactiviteit.
20 In een vorm die bijzonder geprefereerd is voor uitrustings- toepassingen worden het reagenssubstraat, een zuur niet-ionogeen oppen/lakteactief middelreagens en chemische kleurstandaard bereid als vijf afzonderlijke mengsels: a) buffer CpH 9,2 - 9,5), albumine, eserinezout, anionisch op- 25 pervlakteactief middel en carboxylesterasevertrager, eventu eel met een lyofiliseringsstabilisator zoals dextran, b.v. Dextran^-''2000, in gelyofiliseerde vorm; b) buffer (pH zodanig gekozen dat het chromogene sulfhydrylrea-gens wordt gestabiliseerd, bij voorkeur 6,8 - 7,2), chromo- 30 geen sulfhydrylreagens en dextranlyofiliseringsstabilisator in gelyofiliseerde vorm; c) S-acylverbindingsoplossing in met water mengbaar inert oplosmiddel, bij voorkeur ongeveer 33 mmol in ethanol; (r) d) niet-ionogeen oppervlakteactief middel (Triton ^X-100, 35 ongeveer 0,75%) in ongeveer 2,0 m tris-HCl (tromethamine- ftililX 1 38 - ία - HC1), als het stop-reagensj e] S-Camino-lager alKyl]isothiouroniumhalogenidehydrohalogenide zout [ongeveer 1,1 mg) in gelyofiliseerde vorm in een vat geschiKt voor herstel met 0,2 N waterig waterstofzuur tot 5 1 om3.
De relatieve concentraties en pH's toegepast in de mengsels Ca) en (b) worden zodanig gekozen, dat na herstel met gedestilleerd water en mengen voor het verkrijgen van de vereiste eindconcentra-tie de combinatie van buffers in componenten Ca), Cb) en Cc) een 10 eind-pH verschaffen die bevorderlijk is voor lipaseactiviteit, bij voorkeur een pH van 6,5 - 9,5. Het herstelde sulfhydrylreagens is stabieler wanneer afzonderlijk bereid op een pH bij neutraliteit.
□e zure, niet-ionogene oppervlakteactieve oplossing wordt aangepast wanneer gecombineerd met de andere componenten voor het inactiveren 15 van de lipase bij lage pH en micelverbreking en voor het klaren van / het mengsel zonder neerslag, zodat de kleur onmiddellijk kan worden gemeten.
, Oe uitvinding wordt nader toegelicht door onderstaande voor beelden.
20 Voorbeeld I
a) Een gelyofiliseerd substraatreagens wordt bereid zodat het bevat: trisbuffer CpH9,2-9,4) 0,11 g albumine 77 mg 25 eserinesalicylaat 0,18 mg
Dextran®2000 5 mg natriumdodecylsulfaat 6,335 mg fenylmethylsulfonylfluoride ("PMSF") 0,765 mg 3 gedestilleerd water q.s. tot 3 cm 30 gemengd en gelyofiliseerd.
b) Gelyofiliseerd DTNB wordt bereid zodat het bevat: trisbuffer CpH 6,85) 0,188 g DTNB 14,25 mg
Dextran^2Q00 5 mg 3 35 gedestilleerd water q.s. tot 3 cm gemengd en gelyofiliseerd.
8003138 Y *·> - 11 -
Cc] BALB-substraat wordt bereid door oplossen van BALB in ethanol tot een BALB-concentratie van 33 millimolair.
Cd] De stop-oplossing wordt bereid door oplossen van 0,6 g p niet-ionogeen oppEruJakteactief middel (Triton X-1QQ] in 16,5 5 millimolair chloorwaterstofzuur.
De bovenvermelde vier mengsels omvatten een diagnostische uitrusting.
Voorbeeld II
Uit vier reagentia bestaande uitrusting van voorbeeld I 10 wordt toegepast als volgt onder gebruik van duplicaatmonsterflesjes met opschrift "patiënt-blanco", "patiënt", "blanco 10 minuten" en "blanco 30 minuten" en de volgende methode: 3 a] breng 10,0 cm gedestilleerd water in gelyofiliseerd sub-straatreagensflesje en los op door omkerenj 3 15 b) breng 1,0 om van het BALB-lipasesubstraat in bovengenoemd flesje en meng goed door omkerenj c] breng 12 cm gedestilleerd water in gelyofiliseerd DTNB-reagensflesje. Los op door omkerenj 3 d] pipetteer 0,1 cm van bovengenoemde DTNB-oplossing in de 20 gemerkte flesjes,· 3 e] pipetteer 1,0 cm van het mengsel van BALB-substraat en substraat reagens in elk der gemerkte flesjes en meng onder zachtjes omzwenken. Het verkregen mengsel is een substraat bevattend een emulsie van het BALB in een oplossing van de 25 andere reagentia.
f] bebroed alle flesjes, die thans het volledige substraatrea- gensmengsel bevatten in een warmtebron van 30°C gedurende 10 minutenj 3 g] voeg bij tussenpozen 0,05 cm serum toe aan duplicaat pati- 3 30 ent-blanco-flesje en patiënt-flesjes en voeg toe 0,05 cm gedestilleerd water aan een "blanco 10 minuten"-flesje, van een geschikte etiket voorzienj hï na 10 minuten C dezelfde volgorde en tussenpozen als voor 3 trap g]) voeg toe 2,0 cm stop-reagens aan de "patiënt blan-35 co”- en "blanco 10 minuten"-flesjesj 8003138 3 - 12 - i) voeg na 30 minuten 2,0 cm stop-reagens toe aan het "patiënt" flesje en "blanco- 30 minuten"-flesje» j) stel spectrofotometer in op 412 nm en ijk het op de nul-waarde met een flesje gedestilleerd water; 5 k) registreerd de absorptie van de flesjes steeds 5 minuten na toevoeging van de stop-oplossing.
De activiteit van serumlipase is evenredig aan de absorptie bij 412 .nm en wordt als volgt berekend: lipaseactiviteit per 20 minuten a absorptie (patiënt-flesje/ 10 blanco flesje) (30 minuten) - absorptie (patiënt-flesje/blan- co flesje)'(10 minuten)
Voorbeeld III
Precisering van de methode van de bovenstaande voorbeelden werd beproefd onder toepassing van zeven bepalingen op "abnormaal" 15 verhoogde lipaseoontroleserum en een "normale” controleserum onder toepassing van een bebroedingsperiode van 35 minuten zodat het verschil in absorptie werd bepaald over een periode van 25 minuten (absorptie/25). Beide gevallen werd een uitstekende precisie ver-* kregen met standaardafwijkingen van +_ 0,028 en _+ 0,029.
20 Analyse van serummonsters van vijftien b 1 ijk baar normale mensen gaf normale resultaten (absorptie/25 « 0,2) in 93% van de gevallen vergeleken met 93% normale identificatie met een technische referentiemethode (DuPont ACA turbidometrische methode). Het hoogste blijkbaar normale resultaat gaf een absorptie/25 van 0,252. 25 Zestien serummonsters van gediagnostiseerde pancreatitis- patiënten gaven resultaten groter dan 0,3 in alle gevallen. In enkele gevallen van hoge lipaseactiviteit werd het serummonster verdund 1 : 10 vóór analyse en de resultaten vermenigvuldigd met 10.
Vijftien serummonsters van patiënten met hoge esteraseniveaus 30 waaronder negen met verhoogde cholinesterase werden geanalyseerd.
Drie daarvan gaven abnormale resultaten (absorptie/25 = groter dan 0,3) en twee van deze drie werden bevestigd als verhoogd door een turbidometrische referentie-lipasemethode en door verhoogde of grensgeval-amylaseresultaten. Een extra monster had een hoog grens-35 lijn-lipaseresultaat tussen 0,2 en 0,3 (absorptie/25).
8003138 - 13 -
Uit de bovenstaande resultaten blijkt, dat de uitvinding de lipaseactiviteit meet en resultaten geeft, die normale van abnormale niveaus onderscheidt, zelfs bij aanwezigheid van cholinesterase met een betrouwbaarheid die tenminste even groot is als bij 5 de vroegere turbidometrische methoden.
Voorbeeld IV
Een reagensmengsel wordt samengesteld uit de volgende bestanddelen: trisbuffer 0,12 molair
10 natriumdodecylsulfaat 2 mM
DTNB 0,3 mM
PMSF 0,4 mM
BALB 3 mM
De eind-pH is ongeveer 8,8. Onder toepassing van een methode 15 soortgelijk aan die van voorbeeld II, wordt het reagens toegepast voor het analyseren van oplossingen bevattend 1,17 eenheden acetylcholinesterase Ceen ware cholinesterase) of 0,36 eenheden butyryl-cholinesterase Ceen pseudocholinesterase). Acetylcholinesterase leverde een absorptiewijziging van 0,011 absorptie-eenheden en 20 butyrylcholinesterase leverde een wijziging van 0,421 absorptie- eenheden. Deze resultaten verkregen met geen lipase en geen eserine-zout geven aan dat de ware cholinesterases enig effect hebben en dat de pseudocholinesterases die in serum worden aangetroffen, valselijk verhoogde lipaseresultaten kunnen geven.
25 Onder toepassing van verse menselijke serummonsters werden verschillende hoeveelheden eserinesalicylaat toegevoegd en de absorptiewijziging tussen 10 en 30 minuten bebroeden werd opgetekend. Eserinesalicylaat werd toegevoegd als een 1 millimolaire oplossing. Toegevoegd eserinesalicylaat Absorptiewijziging 30 0 0,604 5 microliters (0,005 millimolair) 0,501 10 0,495 20 * 0,475 30 " 0,490 35 40 " 0,496 50 0,492 - 14 -
De bovenstaande resultaten geven een vertraging aan van pseu-docholinesterase door eserinesalicylaat met een specifiekere bepaling van de lipaseactiviteit.
Voorbeeld V
5 Bij een methode soortgelijk aan die van voorbeeld IV werden neostigminemethylsulfaat,eserinesalicylaat en PMSF vergeleken voor 3 het vertragen van acetylcholinesterase (10,4'eenheden per cm ); 3 de pseudocholinesterasebutyrylcholinesterase (7,2 eenheden per cm ) of menselijk serum bevatten natuurlijk voorkomende pseudocholineste-10 rases. 50 microliter serum of van de cholinesterase of pseudocho- linesterase werden toegepast, en de absorptiewijziging over een 20 minuten durende bebroedingsperiode werd opgetekend. De volgende resultaten werden verkregen:
Tabel B
15 Acetyl- Butyryl- ' Serum A Serum B
cholineste- cholinesterase rase geen vertragers 0,013 0,343 0,482 0,379 eserinesalicylaatx 0,027 0,182 0,078 0,092 20 neostigmine-methylsul- yv faat 0*025 0,187 0,098 0,081 PMSF XXX 0,021 0,338 0,487 0,383 eserineX + PMSFXXX 0,013 0,179 0,087 0,077 necstLgmineXX + PMSFXXX 0,018 0,169 0,063 0,068 25 x eserine-salicylaat - 0,037 ym (micromolair) xx neostigmine-methylsulfaat - 0,037 mM (millimolair)
xxx PMSF - 0,37 mM
De activiteit wordt uitgedrukt als Δ -absorptie per 20 minuten bebroeden.
30
De resultaten in tabel B tonen een significante toename in absorptie bij het pseudocholinesterase, butyrylcholinesterase vergeleken met de cholinesterase, acetylcholinesterase, wijzend op een belangrijke hydrolyse van het BALB-substraat door pseudo-35 cholinesterase. De getallen tonen ook een belangrijke remming door 8003138 > * - 15 - eserinesalicylaat en neostigmine alleen of in combinatie met PM5F.
In de serummonsters geven de getallen aan dat de carboxylesterase-arylesterasevertrager PMSF geen of weinig effect heeft voor het vertragen van de storende hydrolyse van de S-acylverbindine met 5 uitzondering als de pseudocholinesteraseremmer aanwezig is'ï
Voorbeeld VI
De mengsels van voorbeeld I worden bereid en verpakt als een diagnostische uitrusting die ook omvat als een standaard 5,5 mg S-(2-aminoëthyl]isothiuroniumbromidehydrobromide in een houder 3 10 geschikt voor verdunning tot 5,0 cm met 0,2 N chloowaterstofzuur.
Voorbeeld VII
De mengsels van voorbeeld I worden bereid met uitzondering dat albumine uit het mengsel Ca] wordt weggelaten en mengsel Cb] wordt bereid als volgt: 15 trisbuffer CpH 6,65] 0,0605 g DTNB , 7,18 mg albumine 0,423 g 3 gedestilleerd water q.s. tot 4 cm gemengd en gelyofiliseerd.
20 De mengsels worden toegepast zoals in voorbeeld II met uit zondering dat in trap Cc] het DTNB-reagens wordt hersteld met 5,5 3 3 cm water en in trap Cd] 1,1 cm van deze oplossing wordt toegepast.
20 microliter van de standaardoplossing van voorbeeld VI 25 worden toegepast als een standaard bij verdere flesjes met opschrift "standaard".
800 3 1 38
Claims (13)
1. Reagensmengsel voor het bepalen van de lipaseactiviteit in biologische vloeistoffen omvattend een S-acylverbinding en een ohromogeen sulfhydrylreagens, met het kenmerk, dat het reagens tevens voldoende van een diagnostisch aanvaardbare cholinesterase/ 5 pseudocholinesterasevertrager bevat voor het vertragen van de cho linesterase en pseudocholinesterase in de biologische vloeistof, ,2. Reagens volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de cholin-esterase/pseudocholinesterasevertrager een in water oplosbaar vast carbamaat is.
3. Reagens volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de carba- maatvertrager eserine is of een diagnostisch aanvaardbaar zout daarvan.
4. Reagens volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de eserine-pseudocholinesterasevertrager eserinesalicylaat is.
5. Reagens volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het 1-8 3 mg albumine per cm bevat.
6. Werkwijze voor het bepalen van de lipaseactiviteit in biologische vloeistoffen door bebroeden van een biologisch vloeistofmon-ster bij aanwezigheid van een S-acylverbinding, een chromogeen sulf- 20 hydrylreagens en een carboxyesterasevertrager gevolgd door het meten van de verkregen kleur, met het kenmerk, dat de bebroeding wordt uitgevoerd bij aanwezigheid van een diagnostisch aanvaardbare cho-linesterase/pseudocholinesterasevertrager in een voldoende concentratie dat cholinesterase en pseudocholinesterase in het monster 25 worden geremd.
7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat de bebroeding wordt beëindigd door toevoeging van een voldoende hoeveelheid van een niet-ionogeen, substraatoplosbaar makend oppervlakteactief middel om de micellen voldoende te verbreken om de lipaseactiviteit 30 in hoofdzaak te beëindigen en het bebroede mengsel te klaren, ge volgd door het rechtstreeks meten van de kleur van het verkregen mengsel. 800 3 1 38 - 17 - Θ. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat het op' pervlakteactieve middel een alkylfenolpolyethoxyethanoloppervlakte-actief middel is.'
9. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat de cho- 5 linesterase/pseudocholinestarasevertrager een vast, in wateroplos baar carbamaat is.
10. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat de pseudocholinesterasevertrager een eserinezout is.
11. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat een diag- 10 nostisch aanvaardbaar S-Camino-lager alkyl]isothiuroniumzout met genoemde S-acylverbinding, chromogeen sulfhydrylreagens en genoemde vertragers, wordt bebroed, de verkregen kleur wordt bepaald en de kleurbepalingen worden vergeleken.
12. Reagensuitrusting voor het bepalen van de lipaseactiviteit 15 in biologische vloeistoffen, omvattend Ca) een eerste substraatreagensmengsel, omvattend een buffer geschikt voor het verschaffen van een alkalische pH van 9-9,5 een eserinepseudocholinesterasevertrager en een carboxyestera-severtrager; 20 tb) een tweede reagensmengsel omvattend een chromogeen sulfhydryl reagens en een buffer voor het verschaffen van een pH die voldoende bij de pH 7 ligt om het chromogene sulfhydrylreagens te stabiliseren; Cc) een oplossing van een S-acylverbinding in een met water meng-25 baar inert oplosmiddel en Cd) een oplossing van een niet-ionogeen oppervlakteactief middel waarbij de mengsels Ca), Cb) en Cc) zijn aangepast voor het vormen van een reagensmengsel van conclusie 1, wanneer onder-' ling gemengd en de buffers van de mengsels Ca) en Cb) zijn aan- 30 gepast voor het verschaffen van een pH in het eindmengsel van Ca), Cb) en Cc) zodanig, dat de activiteit van de lipase wordt bevorderd en de oppervlakteactieve oplossing Cd) is aangepast voor het inactiveren van lipase en het klaren van genoemd mengsel in het mengsel van Ca), Cb), Cc) en Cd).
13. Reagensuitrusting volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat de 800 3 1 38 - 18 - oplossing Cd] een zure oplossing is van het niet-ionogene oppervlak-teactieve middel aangepast voor het verschaffen van een eind-pH in het mengsel van Ca), Cb), Cc] en Cd] die voldoende laag is om lipase te inactiveren en de kleur te stabiliseren.
14. Reagensuitrusting volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat zij bevat Ce] een chemisch kleurstandaardmengsel omvattend een vooraf bepaalde hoeveelheid van een diagnostisch aanvaardbaar S-Camino-lager alkyl]isothiuroniumzout aangepast voor het verschaffen van een kleur bij reactie met het chromogene sulfhydrylreagens, 10 waarbij de kleur overeenkomt met een vooraf bepaald niveau van li- paseactiviteit. v
15. Reagensuitrusting volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat het mengsel Ce] S-C2-aminoëthyl]isothiuroniumbromidehydrobromide bevat. 800 3 1 38 » X r M lCH,]n-S-ro-cmH2m+1 ch,-s-co-Wi I22 IL v CH-X-CO-V^i I I , u lCH,),-S-ra_cmH2m-1 CH2-0-M_Cn‘H2nM 2 £ CH7-S-co — CnH2n+1 S-CO-Cm«2m*1 I cH2~" 0—CO cn,H'2n’+l y CO—0 —Cm,H2m.*i
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US5752579 | 1979-07-13 | ||
US06/057,525 US4279994A (en) | 1979-07-13 | 1979-07-13 | Lipase determination method and reagent |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NL8003138A true NL8003138A (nl) | 1981-01-15 |
Family
ID=22011108
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NL8003138A NL8003138A (nl) | 1979-07-13 | 1980-05-29 | Methode voor het bepalen van lipase en reagens daarvoor. |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4279994A (nl) |
JP (1) | JPS5615698A (nl) |
BE (1) | BE883387A (nl) |
CA (1) | CA1128843A (nl) |
DE (1) | DE3020072A1 (nl) |
DK (1) | DK221380A (nl) |
FI (1) | FI801799A (nl) |
FR (1) | FR2461007A1 (nl) |
GB (1) | GB2065881B (nl) |
IT (1) | IT1209237B (nl) |
NL (1) | NL8003138A (nl) |
NO (1) | NO802092L (nl) |
SE (1) | SE8003518L (nl) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4483922A (en) * | 1982-05-14 | 1984-11-20 | Amf Inc. | Inactivation of enzymes |
US4757001A (en) * | 1984-02-16 | 1988-07-12 | Fujirebio Kabushiki Kaisha | Method of measuring biological ligand by utilizing amylase |
US6218163B1 (en) | 1995-08-07 | 2001-04-17 | Thermogen, Inc. | Stable biocatalysts for ester hydrolysis |
AU6897496A (en) * | 1996-01-11 | 1997-08-01 | Thermogen, Inc. | Stable biocatalysts for ester hydrolysis |
JP4220603B2 (ja) * | 1998-12-02 | 2009-02-04 | アルフレッサファーマ株式会社 | 血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ活性の測定方法 |
CN113533012B (zh) * | 2020-04-22 | 2024-03-12 | 上海云泽生物科技有限公司 | 用于伏立康唑血药浓度检测的样本前处理液 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3119668A (en) * | 1959-01-26 | 1964-01-28 | Dow Chemical Co | Sulfhydryl tests and compounds therefor |
FR1472956A (nl) * | 1964-07-20 | 1967-06-01 | ||
US3867259A (en) * | 1973-11-08 | 1975-02-18 | American Cyanamid Co | Lactate dehydrogenase test material |
US3875014A (en) * | 1973-12-14 | 1975-04-01 | American Cyanamid Co | Glutamic oxaloacetic transaminase test material |
US3917515A (en) * | 1974-03-13 | 1975-11-04 | Jack M Goldberg | Serum lipase method and medium |
US3986930A (en) * | 1974-05-28 | 1976-10-19 | Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. | Lipase activity determining method and reagent |
-
1979
- 1979-07-13 US US06/057,525 patent/US4279994A/en not_active Expired - Lifetime
-
1980
- 1980-05-02 CA CA351,122A patent/CA1128843A/en not_active Expired
- 1980-05-09 SE SE8003518A patent/SE8003518L/xx not_active Application Discontinuation
- 1980-05-20 BE BE0/200684A patent/BE883387A/fr not_active IP Right Cessation
- 1980-05-20 GB GB8016588A patent/GB2065881B/en not_active Expired
- 1980-05-21 DK DK221380A patent/DK221380A/da not_active Application Discontinuation
- 1980-05-27 DE DE19803020072 patent/DE3020072A1/de not_active Withdrawn
- 1980-05-27 JP JP7071980A patent/JPS5615698A/ja active Pending
- 1980-05-29 NL NL8003138A patent/NL8003138A/nl not_active Application Discontinuation
- 1980-06-04 FI FI801799A patent/FI801799A/fi not_active Application Discontinuation
- 1980-06-26 IT IT8023006A patent/IT1209237B/it active
- 1980-07-07 FR FR8015088A patent/FR2461007A1/fr active Granted
- 1980-07-11 NO NO802092A patent/NO802092L/no unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS5615698A (en) | 1981-02-14 |
DK221380A (da) | 1981-01-14 |
FR2461007B1 (nl) | 1984-09-14 |
SE8003518L (sv) | 1981-01-14 |
CA1128843A (en) | 1982-08-03 |
IT1209237B (it) | 1989-07-16 |
FI801799A (fi) | 1981-01-14 |
BE883387A (fr) | 1980-11-20 |
GB2065881B (en) | 1983-06-22 |
NO802092L (no) | 1981-01-14 |
FR2461007A1 (fr) | 1981-01-30 |
US4279994A (en) | 1981-07-21 |
GB2065881A (en) | 1981-07-01 |
IT8023006A0 (it) | 1980-06-26 |
DE3020072A1 (de) | 1981-02-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4543326A (en) | Stabilization of oxidase | |
Casida et al. | Reaction of plasma albumin with I-naphthyl N-methylcarbamate and certain other esters | |
US4067775A (en) | Process and composition for determining the activity of creatinekinase-MB | |
US4517287A (en) | Method and reagent for the enzymatic determination of enzyme substrates | |
NL8003138A (nl) | Methode voor het bepalen van lipase en reagens daarvoor. | |
US7074581B2 (en) | Reagent for assaying lipid | |
US5281536A (en) | Stable liquid control serum or calibration system for use in clinical diagnostics | |
EP0037742B1 (en) | Method for the estimation of hydroxysteroids and reagent system therefor | |
EP0513914A1 (en) | Stabilization of the enzyme urate oxidase in liquid form | |
US4184921A (en) | Process and reagent for determining cholesterol | |
JPH07155196A (ja) | 生体成分の測定法 | |
JP2007151553A (ja) | 安定化コリンエステラーゼ基質溶液 | |
JP4018237B2 (ja) | 酵素活性測定用リパーゼ基質溶液およびリパーゼ活性測定用試薬キット | |
JP4013108B2 (ja) | リパーゼの安定化方法 | |
JPH0367600A (ja) | リパーゼ定量用単一試薬系およびその製造方法 | |
Black et al. | Hemolytic anemia due to pyruvate kinase deficiency: characterization of the enzymatic activity from eight patients. | |
CA1184101A (en) | Determination of lecithin | |
WO1993013219A1 (en) | Calcium ion determining composition | |
Lorentz et al. | Continuous monitoring of arylesterase in human serum | |
US5151372A (en) | Method for determination of hydroxyacetophenone derivatives | |
JPS6349081A (ja) | アスコルビン酸オキシダ−ゼの安定化法 | |
JP3097370B2 (ja) | 過酸化水素の測定方法 | |
JP3693302B2 (ja) | カルシウムイオン測定方法および組成物 | |
EP0464388A1 (en) | Detection assays having chromogenic and nonchromogenic, hypocromogenic, bathochromogenic or hypsochromogenic substrates | |
JP2663257B2 (ja) | 生体成分測定用試薬の安定化方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
CNR | Transfer of rights (patent application after its laying open for public inspection) |
Free format text: SERAGEN DIAGNOSTICS, INC. |
|
A85 | Still pending on 85-01-01 | ||
BV | The patent application has lapsed |