FR2461007A1 - Procede et reactif pour le dosage de la lipase dans les liquides biologiques - Google Patents
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Abstract
PROCEDE ET REACTIF POUR LE DOSAGE DE LA LIPASE DANS LES LIQUIDES BIOLOGIQUES. DANS CE PROCEDE, ON UTILISE UN COMPOSE S-ACYLE COMME SUBSTRAT ET UN REACTIF SULFHYDRYLE CHROMOGENE POUR DEVELOPPER UNE COULEUR MESURABLE. LE REACTIF COMPREND EGALEMENT UN INHIBITEUR SOLIDE ET SOLUBLE DANS L'EAU DE LA PSEUDOCHOLINESTERASE, DE PREFERENCE LE SALICYLATE D'ESERINE; ON PEUT AJOUTER DE L'ALBUMINE POUR AUGMENTER LA SENSIBILITE. ON DOSE LA LIPHASE EN METTANT D'ABORD EN INCUBATION L'ECHANTILLON A DOSER AVEC LE COMPOSE S-ACYLE, LE REACTIF SULFHYDRYLE CHROMOGENE ET L'INHIBITEUR EN QUESTION; EN ARRETANT L'INCUBATION A L'AIDE D'UN TENSIO-ACTIF NON-IONIQUE ET EN MESURANT DIRECTEMENT LA COULEUR RESULTANTE, ET EN COMPARANT CETTE COULEUR A CELLE OBTENUE AVEC UNE SOLUTION CHIMIQUE ETALON CONTENANT UN SEL DE S-(2-AMINOALKYL)ISOTHIO-URONIUM. UTILISATION DE CES REACTIFS ET DU PROCEDE POUR DOSER LA LIPASE DANS LES FLUIDES BIOLOGIQUES.
Description
"Procéd4et réactif pour le dosage de la lipase dans les
liquides biologiques."
La présente invention concerne une amélioration du pro-
cédé pour doser la lipase et du réactif de Kurooka et col. brevet US. MI 3 986 930 et Kurooka et col., J. Biochem.
SI8 361-369 (1977) et demande de bret japonaise NO Sho. 51-
68342. Dans ce procédé et le réactif, un composé S-acylé dé-
crit dans les références ci-dessus est fourni comme substrat.
La lipase dans un échantillon de fluide biologique tel que
du sérum ou du plasma catalyse l'hydrolyse du composé S-
acylé, libérant des groupes sulfhydryle. Les groupes sulfhy-
dryle libérés sont mis à réagir avec un réactif sulfhydryle chromogène tel que l'acide 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzo[que)
["DTNB" camre l'indique en abrégé Kurooka et col.] et la cou-
leur obtenue est mesurée pour fournir une mesure de l'acti-
vité de la lipase. Les réactifs sulfhydryle chromogènes ap-
propriés sont révélés par Kurooka et col. et par Ellman, dans
le brevet US NO 3 119 668.
Le procédé ét le réactif de Kurooka possèdent un grand nombre de caractéristiques souhaitables. Toutefois, comme le
révèle la demande de brevet japonaise de Kurooka, ces pro-
cédé et réactif manquent de sensibilité, que Kurooka attribue
à une inhibition par la séro-albumine. Ils manquent égale-
ment de spécificité pour la lipase, et ne mesurent pas toujours
la vraie activité de la lipase. De plus, le procédé nécessi-
te l'addition d'acétone pour précipiter la protéine avant le
dosage, ce qui nécessite une centrifugation ou un stade d'éli-
mination de la protéine similaire avant le dosage.
L'auteur de la présente invention a maintenant découvert que la spécificité du procédé et du réactif de Kurooka et
col. peut être fortement améliorée par l'addition d'un inhi-
biteur de la pseudocholinestérase, de sorte que le réactif et le procédé obtenus sont davantage vraiment spécifiques
pour la lipase. L'auteur a découvert encore que la sensibi-
lité du procédé peut être améliorée en incorporant une faible quantité d'albumine. Le mode opératoire peut également être amélioré en utilisant un tensio-actif non-ionique pour finir
l'incubation, et la couleur peut ensuite être mesurée direc-
tement sans avoir à centrifuger ou à effectuer d'autres opé-
rations d'élimination de la protéine. L'auteura encore dé-
couvert que les sels de S-(aminoalkyl)-isothio-uronium solu-
bles dans l'eau pouvaient être utilisés sous forme de solu-
tions étalons dans le procédé et le réactif de Kurooka et
col. La présente invention concerne un nouveau réactif mé-
lioré, un procédé et l'équipement de réactifs pour le dosage.
1o Le réactif, le procédé et l'équipement de la présente invention comprennent tous un composé S-acylé et un réactif sulfhydryle chromogène, et peuvent également comprendre un
inhibiteur de carboxylestérase et d'arylestérase comme ré-
vélé par Kurooka lui-même et par l'équipe Kurooka et colla-
borateurs. Les mêmes composés S-acylés et les mêmes réactifs sulfhydryle chromogènes peuvent être utilisés et ces termes
sont utilisés dans le présent mémoire avec la mèe signifi-
cation que dams le brevet US N 3 986 930 de Kurooka et col.
Le composé S-acylé préféré actuellement est le 2,3-dimercap-
topropan-1-ol-tributyrate désigné en abrégé par "BALB" par Kuroeka et col. et également préféré par eux. Le réactif sulfhydryle chromogène préféré est le "DTNI", c'est-à-dire l'acide 5,5' -dithiebis( 2-nitrobenzoeque), également préféré par Kurooka et col. L'inhibiteur préféré de l'arylestérase
et de la carboxylestérase est le fluorure de p'éhylméthyl-
sulfonyle (désigné par l'abbréviation "FPMS" également pré-
féré par Kurooka et col.).
Les composés S-acylés correspondent à une des formules suivantes révélées par Kurooka et col:
CH2S-CO-Cn"H2n + 1 (CH2)2-S-CO-CmH2m + 1.
. CH-X-C -CH2n Y+ 1 f C2-0-CO-Co2n' + 1 (CH2) 2-S-CO-CmU2m + 1
(I) (II}
S-CO-Cm2m + 1. CH2-S-CO-C nH2n + 1
! I
(C&2)y CH2-0-CO-C p2n + 1 CO-O-Cm.H2m, + 1
(III) (IV)
dans lesquelles n est un nombre entfr valant 2 à 4 inclus;
n' est un nombre entier valant 2 à 4 inclus ou 9 & 13 in-
clus; m est un nombre entier valant 3, 7 ou 11; n' est un nombre entier valant 4 ou 12; y est un nombre entier valant 1 ou 2; X est un atome de soufre ou d'oxygène; Y est un
atome de soufre, d'oxygène ou un groupe éthylène; étant don-
né que silo vaut 1, a' vaut 4 et quand y vaut 2, a' vaut 12.
L'auteur de la présente invention a également découvert
que les composés S-acylés sont tout à fait susceptibles d'&-
tre hydrolysés par la pseudocholinest$rase trouvée dans les fluides biologiques tels que le sérum sanguin humain. Il en
résulte que la couleur donnée par la réaction avec le réac-
tif sulfhydryle chromogène peut être augmentée de sorte qu'on
obtient des résultats pour la lipase erronés trop forts.
L'inhibiteur solide, soluble dans l'eau;de la pseudocho-
linestérase peut être un quelconque inhibiteur des pseudo-
cholinestérases dit Uacceptable pour le dosage"; c'est-à-dire qui est physiquement et chimiquement stable et soluble dans le mélange aqueux d'incubation et capable d'inhiber les pseudocholinestérases présentes dans les fluides biologiques sans inhiber la lipase ni interférer avec la réaction colorée obtenue avec le réactif sulfhydryle. Les inhibiteurs des pseucocholinestérases et les inhibiteurs des cholinestérases sont toxiques et doivent être manipulés avec beaucoup de précautions. L'utilisation des inhibiteurs volatils des
cholinestérases peut conduire à la production de vapeurs to-
xiques pendant l'incubation des échantillons aussi bien qu'à
des pertes d'inhibiteur à partir du substrat pendant l'incu-
bation ou le préchauffage au cours de la préparation. Dans la préparation des réactifs lyophilisés pour les équipements
de dosage, l'inhibiteur doit être non volatil dans ls condi-
tions utilisées pour éliminer l'eau des autres réactifs (tem-
pérature de l'ordre de -50 C à +35 C sous des pressions de
0,133 à 6,65 mbars pendant 12 à 48 heures). Les réactifs doi-
vent être aussi physiquement et chimiquement compatibles avec les autres ingrédients et pouvoir être facilement dispersés
dans l'eau à partir de leur forme sèche aussi bien que solu-
bles dans l'eau. Qu'il en soit ainsi ou pas, un inhibiteur
2461CG7
de cholinestérase particulier a les propriétés exigées d'activité inhibitrice, d'inertie par rapport à la lipase, de non-volatilité, d'aptitude à la tophilisation, et à la dispersion et de solubilité dans l'eau, qui peuvent être vérifiées dans un nombre de cas à partir de ses propriétés con-
nues ou par des essais de routine.
En général l'inhibiteur des pseudocholinestérases doit être un-produit solide à des températures inférieures à 50C, avoir une bonne solubilité dans l'eau (au moins 0,5 à 25 mmoles/litre, avoir une tension de vapeur sensiblement
inférieure à celle de l'eau et il doit être chimiquement sta-
ble dans la solutions aqueuses ayant un pH neutre à basique.
Un certain nombre des inhibiteurs phosphatés liquides des cholinestérases, insecticides, ne sont pas ainsi appropriés. Le parathion, par exemple, n'est pas seulement un liquide fortement toxique mais il possède également une solubilité dans l'eau insuffisante et une stabilité en pH
alcalin insuffisante. "L'Isofluorphate" ou di-isopropyl-
fluorophosphate se décompose en présence d'humidité, en don-
nant de l'acide fluorhydrique et perdant son activité inhi-
bitrice, aussi bien qu'il est volatil, fortement toxique et non lyophilisable. Le malathion est un liquide ayant une solubilité dans l'eau insuffisante, s'hydrolysant et perdant
son activité en pH alcalin.
Les inhibiteurs des pseudocholinestérases qui sont ap-
propriés dans la présente invention comprennent les inhibiteurs
carbamates solides, inhibant à la fois les pseucocholinesté-
rases et les cholinestérases et qui sont solubles dans l'eau, tels que la physostigmine (ésérine), la néostigmine, le
bromure de pyridostigmine, le chlorure d'ambénonium, le chlo-
rure de benzopyrinium, le bromure de démécorium. L'ésérine (physostigmine) et ses sels tels que le salicylate et le sulfate sont préférés pour être utilisés comme inhibiteurs des pseudocholinestérases et des cholinestérases. Le salicylate
d'ésérine est particulièrement spécifique pour la pseudocho-
linestérase du sérum et n'inhibe pas la lipase dans les con-
ditions d'essai. Egalement, ce sel n'interfère pas avec la
réaction colorée du sulfhydryle dans les conditions d'utili-
246 1vC7 sation. Le salicylate d'ésérine est préféré. L'inhibiteur
est utilisé en une quantité suffisante pour inhiber la pseu-
docholinestérase et la cholinestérase dans les échantillons.
Les quantités optimum à utiliser dans les formules et pro-
cédés spécifiques peuvent être déterminées par des sérts d'essais exploratoires classiques. Avec le salicylate
d'ésérine préféré, une concentration d'au moins 0,005 mil-
limole (0,005 millième du poids d'une molécule-gramme par
litre) dans le mélange de réactif substrat et de l'échantil-
lon est utilisée, et des concentrations de 0,01 à 0,03 sont préférées. Des concentrations plus élevées peuvent être utilisées (de 0,005 à 0,1 millimole jusqu'à la saturation), mais on
n'observe peu ou pas du tout d'amélioration avec des concen-
trations croissantes de 0,02 à 0,05 millimole, et des quan-
tités supplémentaires ne sont généralement pas nécessaires.
Avec des concentrations sensiblement inférieures à 0,005 mil-
limole, la pseudocholinestérase du sérum peut libérer des groupes sulfhydryle du composé S-acylé donnant des valeurs
pour la lipase erronées trop fortes.
L'albumine est utilisée en une quantité augmentant la
sensibilité. La quantité exacte à utiliser dans ls cas par-
ticuliers peut être déterminée par les techniques exploratoi-
res classiques en utilisant différentes concentrations d'al-
bumine. Des quantités insuffisantes d'albumine ainsi que des quantités en excès entratnent une perte de la sensibilité comme l'indique une perte dans la couleur développée pour
une quantité donnée de lipase. Généralement une concentra-
tion en albumine de 1 à 8 milligrammes par millilitre de réactif donne de bons résultats. Un tensio-actif anionique
tel que le dodécylsulfate de sodium est de préférence incor-
poré pour augmenter l'activité enzymique, comme le décrivent
Kurooka et col., dans J. Biochem. 81, 361-69 (1977).
Selon la présente invention, un échantillon de fluide
biologique tel que sérum, plasma, suc pancréatique ou pro-
duit analogue est mis en incubation avec le réactif contenant le composé S-acylé, le réactif sulfhydryle chromogène, le sel d'ésérine et l'albumine dans des conditions de pH et de
246 1' C 7
température favorables à l'activité de la lipase. Après une
période d'incubation déterminée au préalable,l'incukation est ar-
rêtée, le rélanae trouble est clarifié et la couleur résultante
est mesurée dans un colorimètre ou avec un spectrophotomè-
tre. L'auteur de la présente invention a découvert que l'on
peut arrêter l'incubation et clarifier le mélange simultané-
ment en ajoutant un produit solubilisant le substrat, un tensio-actif nonionique, tel qu'un éther alkylphénylique de polyéthylèneglycol, des esters de polyoxyéthylènesorbitane
et de monoacides gras, ou une huile végétale polyéthoxylée.
L'expression "produit solubilisant le substrat" est
utilisée pour désigner la propriété que possède le tensio-
actif non-ionique de rendre soluble dans l'eau le composé S-
acylé formant ainsi une solution claire de ce composé dans le mélange réactif plutôt qu'une émulsion. Comme le décrivent
Kurooka et col., le composé substrat S-acylé forme une émul-
sion micellaire dans un tampon aqueux sans tensio-actif ni émulsionnant. Les tensio-actifs non-ioniques particuliers peuvent être essayés pour leur aptitude à solubiliser le substrat simplement en les ajoutant à l'émulsion aqueuse du substrat S-acylé tamponné à un pH de 8 à 9 et en vérifiant que la phase non-aqueuse devient ainsi miscible avec la phase aqueuse. Des tensio-actifs non-ioniques appropriés solubilisant le substrat comprennent 1 'octylphénoxypolyéthoxy-éthanol ("Triton 'X 100"
Rohm & Haas, poids moléculaire moyen 646, Merck Index, neu-
vième édition, Monographi 7350); le nonylphénol-polyéthylè-
neglycoléther ("Tergitol NPX", Union Carbide); l'huile vé-
gétale polyoxyéthylée ("Emulphor EL-719", GAF Corporationi; le monopalmitate de polyoxyéthylène-(20)-sorbitane ("Tween
40", ICI Etats-Unis) et le "Cremophor E.L. de BASF-Wyandotte.
Des tensio-actifs anioniques tels que le laurylsulfate de sodium et certains tensio-actifs non-ioniques tels que le
polyoxyéthylène-(23)-lauryléther laissent le composé subs-
tr.t S-acylé sous forme d'émulsion.
Le tensio-actif non-ionique solubilisant le substrat rompt et dissout les micelles du substrat en même temps que
l'activité de la lipase s'arrête et que le mélange se clari-
fie, de sorte que la couleur peut être mesurée directement sans qu'il soit nécessaire d'effectuer une précipitation,
une centrifugation ou autre opération de séparation intermé-
diaire. Bien que le tensio-actif non-ionique seul soit suf-
fisant pour arrêter l'incubation et permettre les mesures di-
rectes, on préfère également ajouter une quantité d'acide
suffisante pour ramener le pH à 7 ou au-dessous. L'utilisa-
tion combinée de l'acidification et du tensio-actif non-
ionique donne une couleur finale du mélange plus stable.
Dans un mode opératoire préféré, une solution d'environ 0,5 à 2 g d'un octylphénoxypolyéthoxy-éthanol("Triton 'X 100", Rohm & Haas) dans 100 millilitres d'une solution acide telle
qu'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique à 16,5 milli-
moles, ou Tris-HCl (1,5-2,5 moles), est utilisée pour arr&-
ter l'incubation en utilisant 2 ml de ce réactif acide pour
environ 1 ml1 de mélange réactionnel.
La composition du substrat réactif de la présente invention comprend typiquement les ingrédients suivants dans les quantités suivantes: Tampon pour pH 8,0 - 9,5 0,05 - 0,3 mole Tensio-actif anionique 1 à 3 millimoles (mM) Réactif sulfhydryle chromogène 0,15 - 0,8 mN Inhibiteur de carboxylestérase 0,05 - 1,5 mM Sel d'ésérine 0,005 à 0,1 mM Albumine 1 - 8 mg/ml Composé S-acylé 2 à 5 mM Dans le procédé de la présente invention, on effectue
un mélange aqueux des ingrédients ci-dessus avec l'échantil-
lon dans un rapport de 2 millilitres du substrat réactif pour 10 à 100 microlitres de l'échantillon, et le mélange est
mis en incubation à 20- - 25- à 37-C pendant 15 à 45 minutes.
Le réactif acide et le tensio-actif non-ionique sont ensuite ajoutés et la couleur est mesurée, de préférence en mesurant l'absorbance dans un spectrophotomètre avec une lumière ayant une longueur d'onde de 400 à 420 nanomètres (nm). L'activité de la lipase peut être déterminée en comparant les résultats
obtenus avec des solutions-étalons ayant des degrés d'acti-
vité de la lipase connus, de graphiques d'étalonnage ou moyens analogues. De préférence, une mesure sur un essai à blanc est également obtenue en utilisant les échantillons en double et en arr&tant l'incubation au début pour l'un des
doubles afin d'obtenir une valeur d'essai à blanc.
Il est également désirable d'utiliser une solution étalon qui donne une couleur ou une absorbance, prédétermi- née, laquelle se rapporte à un degré connu d'activité de
la lipase. Les solutions étalons de lipase ou les sérums té-
moins peuvent &tre utilisés; toutefois, ils sont sujets
à des variations d'une charge à l'autre et à des pertes d'ac-
tivité de la lipase pendant le stockage. Un étalon chimique
sans enzyme permet normalement de coEposer la solution éta-
lon pour obtenir un étalonnage uniforme d'une charge à l1 au-
tre, et d'améliorer les caractéristiques de stockage néces-
saires en vue de l'utilisation avec les réactifs prémélan-
gés et les équipements de dosage, Bien qu'un grand nombre
de composés réagissent avec le réactif sulfhydryle chromogè-
ne, ils ne sont pas utilisables comme étalons. Par exemple
le bromure de S-acétylthiocholine et l'acide 2-méthyl-3-acé-
tylmercaptopropionique réagissent si lentement avec le réac-
tif sulfhydryle que la réaction colorée est incomplète après l'incubation. La mercaptopurine et l'acide thiolactique donnent une couleur instable. D'autres composés tels que le dithiothreitol et la 2-mercaptothiazoline sont soit instables,
soit insolubles dans le mélange d'incubation.
L'auteur de la présente invention a maintenant dé-
couvert que les sels de S-[2-amino-alkyl(inférieua]isothio-
uronium solubles dans l'eau, acceptables pour le dosage1peu-
vent être utilisés comme étalons chimiques dans le procédé
de dosage de la lipase. Ces sels, o le terme "alkyl infé-
rieur" désigne un groupe alkyle ayant 1, 2 ou 3 atomes de
carbone et o la partie anionique n'inhibe pas, ni ne parti-
cipe dans, ni autrement n'interfère avec, la réaction colo-
rée, ont la stabilité nécessaire, la réactivité avec le réactif sulfhydryle chromogène et une solubilité suffisante
pour donner d'excellents résultats en tant qu'étalons chi-
miques. Le composé préféré est le bromhydrate de bromure de S-(2aminoéthyl)-isothio-uronium. La solution étalon comprend le sel d'isothiouronium dans l'eau, à une concentration prédéterminée adaptée pour fournir une couleur en réagissant avec les réactifs de la lipase, couleur qui correspond à un
degré connu prédéterminé de l'activité de la lipase. Typi-
quement, le sl d'isothio-uronium doit être utilisé en une quantité qui donne une absorbance de 0,1 - 0,5 à 1 dans le mélange réactionnel final après incubation et réaction avec le réactif sulfhydryle chromogène. De préférence le sel d'isothio-uronium est mélangé avec un tampon ou un acide pour
donner un pH en solution aqueuse de 6,2 à 7,0. Pour les réac-
tifs prémélangés ou les équipements de dosages, le sel d'iso-
thio-uronium et le tampon peuvent être mélangés et séchés par lyophilisation, par exemple, pour être reconstitués avec
de l'eau distillée avant utilisation. Egalement le sel d'iso-
thio-uronium peut être utilisé avec un stabilisant tel que le dextrane, et reconstitué avec un acide aqueux, tel que l'acide chlorhydrique 0,2 N. Une composition étalon colorée
de la lipase,appropriée,peut être préparée de la façon sui-
vante: Pour une composition colorée étalon correspondant à des normales quantités/élevées de la lipase dans le sérum humain (environ unités internationales par millilitre), on utilise: sel de S-[2-aminoalkyl(inférieur)]isothio-uronium 1,1 milligramme de solution tampon (pH 6, 5)
eau, quantité suffisante pour 1 millilitre.
20 microlitres de cette solution sont une quantité type utilisée par essai avec 1,1 millilitre de la composition du
réactif substrat, pour donner une absorbance finale d'envi-
ron 0,4. L'absorbance exacte et son rapport avec une quan-
tité de lipase déterminée dépend des proportions exactes de
sel d'isothio-uronium utilisé dans le mélange final.
Un substrat réactif préféré comprend les produits sui-
vants: Solution tampon et tampon Tris 0,12 mole Dodécylsulfate de sodium 2 mM (millimole) DTNB 0,3 mM PMSF 0,4 mM Salicylate d'ésérine 0,03 mM Albumine 7,0 mg/ml BALB 3,0 mM pH final 8,8
Dans un procédé préféré, on utilise 1,1 à 2,1 millili-
tres du réactif ci-dessus avec un échantillon de 20 à 50 microlitres. L'incubation est effectuée de préférence à 'C pendant 20 à 30 minutes, après quoi la réaction est stoppée en ajoutant 2 ml d'une solution à 0,6 0,8 % (poids par volume)de "Triton @ X-100" dans une solution d'acide chlorhydrique à 16,5 mM ou bien dans une solution acide (pH 1 à 5), telle que le Tris-HCl (1,5 à 2,5 moles,
pH environ 4,0). L'absorbance est mesurée à 412 nm et compa-
rée aux résultats obtenus avec un échantillon en double quand
l'absorbance est mesurée après une incubation de 10 minutes.
La différence dans l'absorbance est utilisée comme mesure
de l'activité de la lipase.
Dans une forme particulièrement préférée pour les ap-
plications de l'équipement, le substrat réactif, un réactif tensio-actif non-ionique acide et un étalon chimique coloré sont préparés sous forme de cinq compositions séparées: a) tampon (pH 9,2 - 9,5), albumine, sel d'ésérine, tensio-actif anionique et inhibiteur de carboxylestérase, éventuellement avec un stabilisant de lyophilisation tel que
du dextrane, par exemple "Dextran 2000", sous forme lyo-
philisée.
b) tampon (pH choisi pour stabiliser le réactif sul-
fhydryle chromogène, de préférence pH 6,8 à 7,2), réactif sulfhydryle chromogène et stabilisant de lyophilisation
dextrane sous forme lyophilisée.
c) Solution du composé S-acylé dans un solvant inerte miscible avec l'eau, de préférence environ 33 millimoles
dans l'éthanol.
d) tensio-actif non-ionique ("Triton tX-100", environ 0,75 % dans environ 2,0 mlde Tris-HCl (chlorhydrate
de trométhamine) constituant le réactif d'arrêt.
e) Halogénohydrate d'halogénure de S-[amino-alkyl(in-
férieurU-isothio-uronium (environ 1,1 milligramme) à l'état
lyophilisé dans un récipient approprié pour pouvoir recons-
tituer une solution de 1 millilitre avec de l'acide chlorhy-
drique aqueux 0,2 N. Les concentrations et les pH relatifs utilisés dans les compositions (a) et (b) sont choisis de façon telle, qu'après
reconstitution avec de l'eau distillée et mélange pour obte-
* nir la concentration finale exigée, la combinaison des tam- pons dans les composants (a), (b) et (c) donne un pH final favorable à l'activité de la lipase, de préférence un pH de
8,5 à 9,5. Le réactif sulfhydryle reconstitué est plus sta-
ble quand il est préparé séparément à un pH proche de la neutralité. La solution acide de tensio-actif non-ionique est adaptée, en combinaison avec les autres composants,pour inactiver la lipase à pH faible et rompre les micelles et pour clarifier le mélange sans précipitation, afin que la
couleur puisse être mesurée directement.
La présente invention est illustrée par les exemples descriptifs et non limitatifs ci-après:
EXEMPLE 1
a)On prépare un réactif substrat lyophilisé en mélangeant les produits suivants: Tampon Tris (pH 9s2 - 9,4) 0,11 gramme Albumine 77 milligrammes (mrg) Salicylae d'ésérine 0,18 mg Dextran 2000 5 mg Dodécylsulfate de sodium 6,335 mg Fluorure de phénvlméthylsulfonyle ("PMSF") 0,765 mg Eau distillée q.s. pour 3 ml
puis on le lyophilise.
b) On prépare le DTNB lyophilisé en mélangeant les pro-
duits suivants: Tampon Tris (pH 6,85) 0,188 gramme DTNB 14,25 mg Dextran 200 5 mg Eau distillée q.s. pour 3 ml
puis on le lyophilise.
c) Le substrat BALB est préparé en dissolvant le BALB dans l'éthanol jusqu'à ce que la concentration de ce produit
atteigne 33 millimoles.
d) La solution d'arrêt est préparée en dissolvant 0,6 gramme de tensioactif non-ionique 'riton X-100" dans
l'acide chlorhydrique à 16,5 millimoles.
Les quatre compositions ci-dessus forment un équipemnnt
de dosage.
EXEMPLE 2
L'équipement à quatre réactifs de l'exemple 1 est utili-
sé de la façon suivante en utilisant des fioles pour échan-
tillons en double étiquetées "patient - blanc", "patient", "blanc 10 minutes" et "blanc 30 minutes' et on utilise le mode opératoire suivant: a) Placer 10,0 ml d'eau distillée dans le flacon de
réactif substrat lyophilisé et dissoudre par renversement.
b) Mettre 1,0 ml du substrat BALB pour lipase dans la
fiole ci-dessus et bien mélanger par renversement.
c) Placer 12 ml d'eau distillée dans le flacon du réac-
tif DTNB lyophilisé. Dissoudre par renversement.
d) Introduire avec une pipette 0,1 ml de la solution de
DTNB ci-dessus dans les flacons marqués.
e) Introduire au moyen d'une pipette 1,0 ml du mélange de substrat BALB et de réactif substrat dans chacune des fioles marquées et mélanger en remuant doucement. Le mélange résultant est un substrat contenant une émulsion du BALB dans
une solution des autres réactifs.
f) Mettre en incubation toutes les fioles, contenant maintenant la composition entière du réactif substrat dans
une source de chaleur à 30C pendant 10 minutes.
g) A intervalles déterminés, ajouter 0,05 ml de sérum aux fioles en double "patient-blanc" et aux fioles "patient" et ajouter 0,05 ml d'eau distillée à une fiole "blanc 10
minutes", étiquetées convenablement.
h) Après 10 minutes (avec la même série et les mêmes intervalles indiqués au stade g), ajouter 2,0 ml de réactif
d'arrêt aux fioles "patient-blanc" et "blanc 10 minutes".
i) Après 30 minutes, ajouter 2,0 ml de réactif d'arrêt
à la fiole "patient" et à la fiole "blanc 30 minutes".
j) Régler le spectrophotomètre à 412 nanomètres et
mettre l'instrument au zéro avec une fioled'eau distillée.
k) Enregistrer l'absorbance des fioles dans chaque cas 2461i07 minutes après avoir ajouté la solution d'arrêt. L'activité de la lipase du sérum est proportionnelle à l'absorbance à 412 nanomètres et est calculée de la façon suivante: Activité de la lipase par 20 minutes = Absorbance [fiole patient-fiole balnc] (30 minutes)
- absorbance [fiole patient-fiole blanc] (10 minutes).
EXEMPLE 3
La précision du procédé pour les exemples ci-dessus est
déterminée en réalisant sept essais sur un sérum témoin "anor-
mal" contenant des quantités de lipase élevées et sur un sé-
rum témoin "normal" et en utilisant une durée d'incubation de
minutes afin que la différence dans l'absorbance soit me-
surée sur une période de 25 minutes (absorbance/25). Dans les
deux cas, on obtient une excellente précision avec des écarts-
types de + 0,028 et + 0,029.
L'analyse des échantillons de sérum provenant de 15
hommes apparemment normaux donne des résultats normaux (ab-
sorbance/25 = 0,2) dans 93 % des cas comparés aux 93 % d'iden-
tification normale obtenue avec un procédé de référence clas-
sique (procédé opacimétrique ACA DuPont). Le résultat normal
apparent le plus élevé donne une absorbance/25 de 0,252. Seize échantillons de sérum provenant de malades atteints de pancréatite
donnent des résultats supérieurs à 0,3 dans tous les cas. Dans certains cas o l'activité de la lipase est élevée, l'échantillon de sérum est dilué au dixième avanti'
analyse et Es résultats sont multipliés par 10.
Quinze échantillons de sérum provenant de patients
ayant des quantités d'estérase élevées, dont 9 ont des quan-
tités de cholinestérase élevées,sont analysés. Trois de ces échantillons donnent des résultats anormaux (absorbance/25 supérieure à 0,3) et les résultats élevés pour deux de ces
trois échantillons sont confirmés par le procédé opacimétri-
que de référence pour la lipase et par des résultats élevés ou limites pour l'amylase. Un échantillon supplémentaire a
un résultat en lipase,limite,élevé, entre 0,2 et 0,3 (absor-
bance/25).
Les résultats ci-dessus indiquent que la présente in-
vention mesure l'activité de la lipase et donne des-résultats
qui différencient les quantités normales des quantités anor-
males, même en présence de cholinestérase, avec une fiabilité au moins aussi grande qu'avec les procédés opacimétriques antérieurs.
EXEMPLE 4
On prépare une composition réactive comprenant les pro-
duits suivants: Tampon Tris 0,12 mole Dodécylsulfate de sodium 2 millimoles ("mM") DTNB 0,3 mM PMSF 0,4 mM BALB 3 mM
Le pH final est environ 8,8. En utilisant un procédé identi-
que à celui de l'exemple 2, on se sert du réactif pour des
solutions d'essai contenant 1,17 unités d'acétylcholinestéra-
se (une vraie cholinestérase) ou 0,36 unité de butyryl-
cholinestérase (une pseudocholinestérase). L'acétylcholines-
térase donne un changement d'absorbance de 0,011 unité d'absorbance et la butyrylcholinestérase donne une variation de 0,421 unité d'absorbance. Ces résultats, obtenus sans
lipase et sans sel d'ésérine, indiquent que la vraie choli-
nestérase exerce une certaine action et que les pseudocholines-
térases existant dans le sérum peuvent donner des résultats
en lipase erronés trop forts.
En utilisant des échantillons de sérum frais humain, on ajoute des quantités variables de salicylate d'ésérine et on note les variations de l'absorbance entre 10 et 30 minutes d'incubation. Le salicylate d'ésérine est ajouté sous forme
d'une solution à 1 millimole.
TABLEAU I
Salicylate d'ésérine ajouté Variation de l'absor-
bance
0 0,604
microlitres (0,05 millimole) 0,501 microlitres 0,495 microlitres 0,475 microlitres 0,490 TABLEAU I (suite) Salicylate d'ésérine ajouté Variation de l'absorbance microlitres 0,496 microlitres 0,492 Les résultats cidessus montrent l'inhibition de la pseudocholinestérase par le salicylate d'ésérine avec une
mesure plus spécifique de l'activité de la lipase.
EXEMPLE 5
Dans un procédé similaire à celui de l'exemple 4, on
compare le méthylsulfate de néostigmine, le salicylate d'é-
sérine et le PMSF pour inhiber l'acétylcholinestérase (10,4
unités par ml), la pseudocholinestérase (butyrylcholinesté-
rase) (7,2 unités par ml) ou le sérum humain contenant les
pseudocholinestérases d'origine naturelle. Cinquante micro-
litres de sérum ou de cholinestérase ou de pseudocholines-
térase sont utilisés, et les variations de l'absorbance après minutes d'incubation sont enregistrées. On obtient les
résultats mentionnés dans le tableau ci-après.
uoTeqnzuT,p se;nuTw oZ Jnod aoDuveqJosqu ua al)wTdx. sa I uTATqDe 4q (a 0WTT- T w) (D (0<T1OWoz:D Tw) i-I
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1w Lú00 -
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JSWd *** auTw6Tsou op a-evTnslAH;:LW *, autp9s, p euTADTTeS, **.."SWd + *. *UTW6TSO09iN ***.dSWd + *.uT.mpçS o.*.ISJSW+ ** auTw6T&sopu ep qezlnslAq4. w * auTJpgrê,P eleTADTTWS JnerTqT4uT sues ng wnyS tun9gs wnaps ase.:. s1aUTTO 9 8*se.:94.sUTT Oi4 -T1X,.:rA:.4n -Xq.K;DV il ny3,lRvgyj - c.rJ O O -o 890'0 LLO'0 úsE 'O '0 Z60'0 6Lú'0 ú90 0 L80'O L8t'0
860 'O0
8L0'0 Z8e'0 691'0
6L8T'0
66%"O LSZ'O 8eZ '0 ú'úI0 sito 'o
úLO'O 1
t j 'O s-ZO'O Lzo0'0 úto'O Ul I I
Les résultats dans le tableau II montrent une augmenta-
tion significative de l'absorbance avec la pseudocholinesté-
rase, (butyrylcholinestérase), comparés à ceux de la choline-
-estérase (acétylcholinestérase), indiquant qu'il s'est pro-
duit une hydrolyse importante du substrat BALB par la pseudo-
cholinestérase. Les résultats montrent également une inhibi-
tion importante par le salicylate d'ésérine et la néostigmine, seuls ou combinés au PMSF. Dans les échantillons de sérum,
les résultats indiquent que le PMSF inhibiteur de carboxyles-
térase et d'arylestérase n'a que peu ou pas d'effet pour ampêcher l'hydrolyse du composé S-acylé qui se produit sauf quand
l'inhibiteur de la pseudocholinestérase est présent.
EXEMPLE 6
Les compositions de l'exemple 1 sont préparées et embal-
lées sous forme d'un équipement de dosage qui comprend égale-
ment comme étalon, 5,5 milligrammes de bromhydrate de bromure de S-(2aminoéthyl)-isothio-uronium dans un récipient prévu pour effectuer une dilution à 5,0 millilitres avec de l'acide chlorhydrique 0,2 N.
EXEMPLE 7
On prépare les compositions de l'exemple 1 mais on ne met pas d'albumine dans la composition (a) et on prépare la composition (b) de la façon suivante en mélangeant: Tampon Tris (pH 6,85) 0,0605 gramme DTNB 7,18 mg Albumine 0,423 gramme Eau distillée q.s. pour 4 ml
et en lyophilisant.
Les compositions sont utilisées comme dans l'exemple 2 sauf que dans le stade (c) le réactif DTNB est reconstitué
avec 5,5 ml d'eau et dans le stade (d), 1,1 ml de cette so-
lution est utilisé.
microlitres de la solution étalon de l'exemple 6 sont utilisés comme étalon dans une fiole supplémentaire
marquée "étalon".
Claims (15)
1.- Composition réactive pour doser l'activité de la lipase dans les fluides biologiques qui comprend un composé S-acylé et un réactif sulfhydryle chromogène, caractérisée par le fait que le réactif comprend également une quantité
suffisante d'un inhibiteur de cholinestérase et de pseudo-
cholinestérase acceptable pour le dosage, pour inhiber la cholinestérase et la pseudocholinestérase dans le fluide biologique.
2.- Réactif selon la revendication 1, caractérisé par
le fait que l'inhibiteur de cholinestérase et de pseudocho-
linestérase est un carbamate solide soluble dans l'eau.
3.- Réactif selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'inhibiteur carbamate est l'ésérine ou ses sels
acceptables pour le dosage.
4.- Réactif selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'inhibiteur ésérine de la pseudocholinestérase
est le salicylate d'ésérine.
5.- Réactif selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il contient 1 à 8 milligrammes d'albumine par millilitre.
6.- Procédé pour doser l'activité de la lipase dans les fluides biologiques en mettant en incubation un échantillon du fluide biologique en présence d'un composé Sacylé, d'un
réactif sulfhydryle chromogène, et d'un inhibiteur de carbo-
xylestérase et en mesurant la couleur résultante, ce pro-
cédé étant caractérisé par le fait qu'on effectue l'incuba-
tion en présence d'un inhibiteur de cholinestérase et de pseudocholinestérase, acceptable pour le dosage, utilisé
en une concentration suffisante pour inhiber la cholinesté-
rase et la psdocholinestérase dans l'échantillon.
7.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait qu'on arrête l'incubation en ajoutant une quantité suffisante d'un tensio-actif non-ionique, solubilisant le substrat, pour détruire les micelles d'une façon suffisante pour inactiver efficacement la lipase et pour clarifier le mélange d'incubation; et qu'on mesure ensuite directement la Z4610Gt7
couleur du mélange résultant.
8.- procédé selon la revendication 6, caractérisé par
le fait que le tensio-actif est un composé alkylphénolpoly-
éthoxy-éthanol.
9.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé par
le fait que l'inhibiteur de cholinestérase et de pseudocho-
linestérase est un carbamate solide, soluble dans l'eau.
10.- Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait que l'inhibiteur de pseudocholinestérase est un sel
d'ésérine.
11.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé par
le fait qu'on met en incubation un sel de S-[amino-alkyl-
(inférieur)]-isothio-uroniumacceptable pour le dosage> avec ledit composé S-acylé, le réactif sulfhydryle chromogène et lesdits inhibiteurs, et qu'on mesure la couleur obtenue; et
qu'on compare les mesures de couleur.
12.- Equipement de réactifs pour doser l'activité de la lipase dans les fluides biologiques, caractérisé par le fait qu'il comprend:
(a) une première composition de réactifs substratscom-
prenant un tampon prévu pour donner un pH alcalin de 9 à 9,5,
un inhibiteur, ésérine, de pseudocholinestérase et un inhi-
biteur de carboxylestérase; -(b) une deuxième composition de réactifs comprenant un réactif sulfhydryle chromogène et un tampon pour donner un pH suffisamment proche de pH 7 pour stabiliser le réactif sulfhydryle chromogène; (c) une solution d'un composé S-acylé dans un solvant inerte miscible avec l'eau; et (d) une solution d'un tensio-actif non-ionique; les compositions (a), (b) et (c) étant prévues pour former une composition réactive selon la revendication 1 quand elles sont mélangées ensemble, et les tampons dee compositions (a) et (b) étant prévus pour donner un pH dans le mélange final de (a), (b) et (c) favorable à l'activité de la lipase; et la solution de tensio-actif (d) étant prévue pour inactiver la lipase et clarifier ledit mélange dans le mélange de (a) ,
(b), (c) et (d). -
13.- Equipement de réactifs selon la revendication 12, caractérisé par le fait que la solution (d) est une solution acide d'un tensio-actif nonionique prévue pour donner un pH final dans le mélange de (a), (b), (c) et (d) suffisament faible pour inactiver la lipase et stabiliser la couleur.
14.- úquipement de réactifs selon la revendication 12, caractérisé par le fait qu'il contient (e) une composition
chimique colorée étalon qui comprend une quantité prédéter-
minée d'un sel de S-[amino-alkyl(inférieur)]isothio-uronium, acceptable pour le dosage, prévue pour donner une couleur
par réaction avec le réactif sulfhydryle chromogène, la cou-
leur correspondant à un degré prédéterminé de l'activité de
la lipase.
15.- Equipment de réactifs selon la revendication 14, caractérisé par le fait que la composition (e) comprend le
bromhydrate de bromure de S-(2-aminoéthyl)-isothio-uroniua.
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