NL7901200A - Werkwijze voor de koppeling van een proteien aan een geeepoxyleerde latex en de aldus verkregen produkten. - Google Patents

Description

The Dow Chemical Company te Midland, Michigan,-Ver.St,r.Amerika

Werkwijze voor de koppeling van een proteïen aan een geëpoxyleerde latex en de aldns verkregen prodokten.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de koppeling van een latex met oppervlakte-eporydegroepen aan een proteïen of proteïencomponent door vormen van een amine-binding. Dergelijke aan een drager gebonden proteïen zijn bijzonder bruikbaar bij de 5 uitvoering van immunologische proeven, die gebaseerd zijn op de anti-geen-antilichaaa-re actie.

De antigeen-antilichaaa-reactie is de basis voor alle immunologische proefmethodes. Speciale proteïenen, aangeduid als antiliehamen, worden gevormd door een dier in respons op de aanwezig-10 heid van een antigeen, dat wil zeggen een vreemde stof, gewoonlijk een proteïen, in de lichaamsvloeistoffen van het dier. Deze normale lichaams-respons op een vreemd proteïen heeft geleid tot de ontwikkeling van een aantal technieken, die worden gebruikt voor de diagnose van verschillende bij mens en dier voorkomende ziekten of stoornissen.

15 In vitro proeven op de vermeende aanwezigheid van een antigeen of antilichaam in een lichaamsvloeistof worden uitgevoerd door toevoeging van het immunologische tegengedeelte aan een flesje met de lichaamsvloeistof, dat vil zeggen dat antigeen wordt toegevoegd indien de proef dient voor het aantonen van de aanwezigheid van anti-20 lichaam of antilichaam wordt toegevoegd indien de proef dient voor het aantonen van de aanwezigheid van antigeen. Indien het vermeende proteïen aanwezig is zal de resulterende antigeen-antilichaam-reactie in het algemeen tot uiting komen door precipitatie of agglutinatie van het antigeen-antilichaam-complex. In sommige gevallen wordt bet antigeen— 25 antilichaam-complex langzaam gevormd en zijn de gevormde deeltjes te klein om met zekerheid te kunnen worden waargenomen. In dergelijke gevallen kan de aantoonbaarheid van de antigeen-antilichaam-reactie worden verbeterd door gebruik te maken van een drager. Wanneer het antigeen of antilichaam door bekleding wordt aangebracht op het oppervlak van een 7901200 2 drager resulteert de reactie, die optreedt met het immunologische tegen-gedeelte, in een zichtbare massa of agglutinaat. Eet proteïnische anti-geen of antilichaam kan worden geadsorbeerd op het oppervlak van dragers zoals erythrociten, bacteriële cellen, bentoniet, polystyreenlatex-5 deeltjes, anionische fenolharsen of fijnverdeelde gediazoteerde amino-cellulose. Gebleken is echter dat de chemische binding van het antigeen-of antilichaammolecuul aan de drager superieur is aan de fysische adsorptie. Het Amerikaanse octrooischrift 3.857*931 vermeldt dat protelnische antigenen of antilichamen chemisch kunnen worden gebonden aan een poly-10 meerlatexdrager met oppervlakte-earbonylgroepen door een amide-binding, die gevormd wordt in tegenwoordigheid van een in water oplosbaar carbodi-imide-koppelingsmiddel. Het Amerikaanse octrooischrift 3.806.U17 beschrijft een werkwijze voor de binding van een proteïen aan een verbinding, die een epoxy de groep bevat, en het verbinden van dit intermediair 15 met een dragermateriaal. Een nadeel van deze methode is dat het proteïen eerst in reactie moet worden gebracht met een verbinding met zoteLeen epoxygroep als een alkenische groep.

Het resulterende conjugaat wordt vervolgens gepoly-meriseerd met 'een ander alkenisch monomeer en een bis-alkenisch ver-20 knqpingsmiddel onder vorming van het aan de drager gebonden enzym. Werkwijzen voor het binden van een proteïen aan polymeerdragers zijn beschreven in de Amerikaanse octrooischriften 3.639.558, 3.853.708, 3.8H1.970, 3.8^.892 , 3.821.081» en U.086.199.

In het bijzonder wanneer een latexsysteem wordt 25 gebruikt als drager beschrijft de stand der techniek koppelingsmetho-des, die de toepassing vereisen van bifunctionele koppelingsmiddelen, of van koppelingsmiddelen, die een binding vormen tussen de reactieve groepen aan het proteïen en die aan de dragerdeeltjes. De moeilijkheid bij deze methodes is dat de koppelingsmiddelen geen onderscheid kunnen ma-30 ken tussen de reactieve groepen aan het proteïen en die aan «feldrager; daarom kan een proteïen-aan-proteïen-koppeling en zelfs een intramole-culaire proteïenkoppeling optreden. Een dergelijke ongewenste binding kan resulteren in conformationele veranderingen in het proteïenmolecuul, die leiden tot veranderingen in de activiteit. De uitvinding heeft 35 betrekking pp een werkwijze voor het covalent binden van een proteïen met een reactieve groep, bevattende een labiel waterstofatoom, aan een 7901200 3 latex met qppervlakte-epoxydegroepen. Bij voorkeur is de reactieve groep een vrije aminogroep, maar andere reactieve groepen,zoals carboxyl, fenol, hydroxyl en thiol, kannen eveneens worden gebruikt. Be koppeling geschiedt vanneer de aminogroepen van het proteien reageren met de epoxyde-5 groepen van de latex, gevoonlijk bij een pH van ongeveer 7,0-9,0, onder vorming van een nieuwe koolstof-stikstof-binding, hieronder aangeduid als een amine-binding, waarbij een binding van het proteien aan het oppervlak van de latex plaats vindt. Dit proces biedt een aantal voordelen in vergelijking met de tot nu toe bekende methodes voor de berei-10 ding van protelen-latex-conjugaten. Meer in het bijzonder is de werkwijze volgens de uitvinding betrekkelijk gemakkelijk uitvoerbaar. Bij de werkwijze volgens de uitvinding wordt het proteien niet blootgesteld aan drastische readtie-omstandigheden, die zouden kunnen resulteren in een verwringing of denaturatie van het protelenmolecuul. Dit is bijzonder 15 belangrijk omdat dergelijke conformationele veranderingen kunnen resulteren in verlies van activiteit. De werkwijze volgens de uitvinding maakt het eveneens mogelijk de resterende epoxygroepen na de binding aan de protelenen verwijderen. De werkwijze volgens de uitvinding heeft het verdere voordeel dat voorzien wordt in aan drager gebonden protelenen 20 met een uniforme deeltjesgrootteverdeling.

De hier gebruikte uitdrukking latex heeft betrekking op een waterige colloldale dispersie van een in water onoplosbaar polymeer. De latices, die gebruikt worden bij de werkwijze volgens de uitvinding, bestaan uit nagenoeg sferolde polymeer deeltjes met een dia-25 meter tussen 0,15 en 1,5 micrometer, waarbij een diameter van 0,1*5-0,90 micrometer (^uM ) de voorkeur geniet. De deeltjesmorfologie bestaat uit een inwendige kern en een omringende schil. De kern wordt gepolymeri-seerd of gecopolymeriseerd uit harde monomeren, zoals styreen. De schil wordt gevormd door copolymerisatie van een of meer harde monomeren met een 30 copolymeriseerbare ethenisch onverzadigde verbinding met een uit drie leden bestaande epoxy-ring. Eventueel kan zacht monomeer worden gecopolymeriseerd in de kern en/of de schil samen met het harde monomeer teneinde een breken van de deeltjes te voorkomen. De hier gébruikte uitdrukking "hard monomeer" heeft betrekking op monomeren, die polymeren vormen met 35 glasovergangstemperatuur boven kamertemperatuur. De uitdrukking "zacht monomeer" heeft betrekking op monomeren, die polymeren vormen met een 7901200 lb --¾ k glasovergangstemperatuur beneden kamertemperatuur. Emulsie-polymeriseer-bare monomeren voor de kern, die de voorkeur genieten, zijn harde mono-meren, die kunnen worden gepolymeriseerd en/of gecopolymeriseerd met elkaar in willekeurige verhoudingen en/of met andere monomeren onder 5 vorming van niet-filmvoruiende polymeren. De hier gebruikte uitdrukking "niet-filmvormend" heeft betrekking op polymeerdeeltjes van de latex, die niet - filmvormend zijn of niet samengroeien onder de gebruiksomstan-digheden. Deze monomeren omvatten carbocyclische monovinylideenmonomeren, bijvoorbeeld styreen, a-methylstyreen, ar-(t-butyl)styreen, ar-methyl-10 styreen, ar.ar-dimethylstyreen, ar-chloorstyreen, ar-(t-anyl)styreen, ar-broomstyreen, ar-fluorstyreen, ar-eyanostyreen, ar-methoxystyreen, ar-ethylstyreen, ar-hydroxymethylstyreen, ar-ethoxystyreen, ar-chloor-ar-methylstyreen, ar.ar-diehloorstyreen, ar.ar-difluorstyreen, vinyl-naftaleen, en andere dergelijke emulsie-polymeriseerbare monomeren met'' 15 niet meer dan 26 koolstof atomen, esters van α.β-ethenisch onverzadigde carbonzuren, die polymeriseren onder vorming van niet-filmvormende polymeren, bijvoorbeeld methylmethacrylaat, chloorethylmethacrylaat, n-butylmethaerylaat, ethylmethacrylaat, isobutylmethacrylaat, isopropyl» methacrylaat, fenylmethacrylaat, butylchlooracrylaat, cyclohexylchloor-20 acrylaat, ethylchlooracrylaat, methylchlooracrylaat, isopropylchloor-acrylaat en andere dergelijke esters, die kunnen worden gepolymeriseerd onder vorming van harde polymeren, α.β-ethenisch. onverzadigde esters van niet-polymeriseerbare carbonzuren, bijvoorbeeld vinylbenzoaat, vinyl-toluaat, vinyl ar-ethylbenzoaat, allyl ar-ethylbenzoaat, vinylpivalaat, 25 vinyltrichloooracetaat en andere dergelijke monomeren, waarin het onverzadigde gedeelte 2-lb koolstofatomen en het zuurgedeelte 2-12 koolstof-atomen bevat, α.β-ethenisch onverzadigde nitrillen, bijvoorbeeld nitril-len met niet meer dan 12 koolstofatomen, andere polymeriseerbare vinyl-monomeren, zoals vinylchloride,vinylbromide en dergelijke. Van de boven-30 genoemde monomeren genieten in het bijzonder de voorkeur de carbocyclische aromatische monovinylideenmonomeren, in het bijzonder styreen en mengsels van styreen, methylmethacrylaat en acrylonitril.

Zachte monomeren, die eventueel kunnen worden gebruikt, omvatten de alkylacrylaten, zoals ethylacrylaat, butylacrylaat 35 of 2-ethylhexylacrylaat, de hogere alkylmethacrylaten, zoals hexylmetha-crylaat of 2-ethylhexylmethacrylaat, en de geconjugeerde dienen, zoals 7901200 5 isopreen of butadieen.

Sen voorkeursmonomeer voor het copolymeer van de schil is een mengsel van een of meer harde monomeren als hierboven beschreven en een copolymeriseerbare ethenisch onverzadigde verbinding 5 met een uit drie leden bestaande epoxy-ring.

Representatieve epoxy-monomeren zijn onder andere onverzadigde alkylgly ci dylesters, onverzadigde alkylglycidylethers, onverzadigde cycloalkylglycidylethers, onverzadigde door alkyl gesubstitueerde fenylglycidylethers en de mono-epoxyde-verbindingen van monome-10 ren van het dieen-type.

Geschikte glycidylesters omvatten gly cidylmethacry-laat, glyci dylacrylaat, glydi cylesters van crotonzuren en onverzadigde 1angeketenvet zuren en dergelijke, onverzadigde alkylglycidylethers omvatten vinylglycidylether, isopropenylglycidylether, oleylglycidylether, 15 allyl- en aethallylglycidylethers en dergelijke, onverzadigde cyclo-alkyl- en feny1 glycidylethers omvatten ^-vinylcyclohexylglycidylether, p-vinylbenzeenglycidylether, o-allylfenylglycidylether en dergelijke, de monoepoxyde-verbindingen van de dieen-type monomeren omvatten buta-dieenmonoêpoxyde, chloropreenmonoepoxyde, 3.^-epoxy-1-penteen, U.5-epoxy-20 1-penteen, 4.5-epoxy-2-penteen, ^.5-epoxy-1-hexeen, 3.^-epoxy-1-vinyl-cyclohexeen en divinylbenzeenmonoxyde en dergelijke.

De exacte hoeveelheid van het epoxymonomeer, die nodig is voor de bereiding van de latices volgens de uitvinding, wordt bepaald dar de populatie (hoeveelheid) oppervlakte-epoxygroepen, die 25 nodig is voor een optimale koppeling met het gewenste proteïen. Bijvoorbeeld geeft bij de koppeling van menselijk chorioon gonadotropine aan een styreen-glycidylmethacrylaat-latex een koppelingsplaatsdichtheid van ongeveer een epoxy-eenheid per 5-^0 vierkante angtrom-eenheden (A ) bevredigende resultaten, waarbij ongeveer één epoxy-eenheid per 8-20 30 A de voorkeur geniet. Deze zelfde koppelingsplaatsdichtheid zou eveneens bruikbaar zijn voor andere proteïenen, zoals insuline. Bij de bereiding van aan latex gebonden proteïenen ten gebruike bij de immunologische beproeving is gebleken dat mono gedispergeerde latices, dat wil zeggen latices met nagenoeg uniforme deeltjesgrootten, de voorkeur ge-35 nieten omdat een uniformiteit van de deeltjes afmetingen een gelijkmatige statistische verdeling van antigeen- of antilichaam-moleculen op het 790 1 2 0 0 <* -¾ 6 oppervlak van de latexdeeltjes verzekert. Voor een gegeven gewicht aan polymeer zal het totale oppervlak van de latex toenemen met een verminde» ring in de grootte van de deeltjes en omgekeerd. Aldus zullen in een latex, bevattende een verdeling van variërende deeltjesgrootten, de klei» 5 nere deeltjes een groter oppervlak en bijgevolg in totaal meer reactie-plaatsen hebben dan de grotere deeltjes. De ongelijke verdeling van anti-geen of antilichaam op de latexdeeltjes zal leiden tot een ongelijke agglutinatie van deeltjes en tot slecht gedefinieerde diagnostische resultaten.

10 Een ander voordeel van de toepassing van uniforme latexdeeltjes als diagnostische middelen is dat zij heter geschikt zijn voor de instrumentele analyse. Deeltjes van dezelfde grootte zullen met dezelfde snelheid uitvlokken, agglutineren of sedimenteren, terwijl deeltjes met verschillende afmetingen met variabele snelheden zullen 15 agglutineren. Daarom zal een instrumentele methode, die gebaseerd is op de absorptie of doorlating van licht door een agglutinerende latexsuspen-sie, meer accuraat, beter reproduceerbaar en gemakkelijker te standaardiseren en af te lezen zijn met uniforme latexdeeltjes dan met latices met deeltjes van variërende afinetingen. Conjugaten van menselijk chorioon 20 gonadotropine, gebonden aan styreen-glycidylmethacrylaat-latex onder toepassing van de werkwijze volgens de uitvinding, vertoonden nagenoeg geen verandering in immunologische activiteit na een opslag van wel 12 maanden bij ongeveer H-6°C.

De volgende voorbeelden beschrijven de bereiding 25 van drie monogedispergeerde styreen-glycidylmethacrylaat-latices. In de handel verkrijgbare monogedispergeerde polystyreen-latices werden behandeld ("capped") met een mengsel van styreen en glycidylmethacrylaat. Tenzij anders is aangegeven zijn de delen gevichtsdelen.

Voorbeeld I

30 De volgende bestanddelen werden toegevoegd aan een driehalskolf van 1 liter, voorzien van roerder, een stikstofinlaatbuis en een koeler.

7901200 ö*· » 7

Droog gewicht Nat gewicht Delen Delen

Polystyreenlatex (deeltjesgrootte 0,76 micrometer) 60,5 188 5 Dihexylnatriumsulfosuccinaat 0,3 6

Kaliuapersulfaat 0,3 6

Natriumhydrogeencarbonaat 0,3 6

Styreen k5 ^5

Glycidylmethaciylaat 15 15 10 Water - 13¾

Iet mengsel werd geroerd en de kolf werd gedurende ongeveer 10-20 minuten met stikstof gespoeld. De reactietemperatuur werd op 65°C getracht en deze temperatuur werd gedurende k uren gehandhaafd terwijl gezorgd werd voor een positieve stikstof druk. De resulterende 15 latex werd af gekoeld en af gefiltreerd. De gemiddelde deeltjesgrootte van de latex wrd bepaald door elektronenmicroscopie, waarbij bleek dat de diameter ongeveer 0,91^uM was.

Voorbeeld II

De in voorbeeld I beschreven algemene procedure 20 werd herhaald onder gebruikmaking van de hieronder aangegeven bestanddelen ter bereiding van een monogedispergeerde latex met een gemiddelde deeltjesgrootte (diameter) van ongeveer 0,59yuM.

Droog gewicht Nat gewicht Delen Delen 25 Polystyreenlatex (deeltjesgrootte 0,503 micrometer) 30,1 95

Dihexylnatriumsulfosuccinaat 0,15 3

Kaliuspersulfaat 0,15 3

Natriustoydrogeenearbonaat 0,15 3 30 Styreen 15 15

Glycidylmethacrylaat 15 15

Water - 266

Voorbeeld III

De volgende bestanddelen werden gebruikt voor de 35 bereiding van een monogedispergeerde latex met een gemiddelde deeltjesgrootte (disaster) van 0,20^uM. Dezelfde algemene procedure als hierboven 790 1 2 0 0 δ r'

Tseschreven verd toegepast.

Droog gewicht Nat gewicht Pélen ' Delen

Polystyreenlatex 5 (deeltjesgrootte 0,176 micrometer) 30 300

Dihexylnatriumsulfosuccinaat 0,15 3

Kaliumpersulfaat 0,15 3

Nat ri umhy dr o geenc arb on aat 0,15 3

Styreen 15 15 10 Gly cidylmethacryl aat 15 15

Water - 61

Het epoxygehalte van de latex, uitgedrukt als /0\ milli-equivalenten oxiran-groepen per gram (-CH-CHg/gram) en als vierkante angstrom-eenheden per oxiran-groep, werd voor elke hierboven be-15 reide latex bepaald. De resultaten zijn aangegeven in onderstaande tabel A.

Tabel A

Latex van Deeltjesgrootte Μ yQx ^.0S mequiv.

voorbeeld (,uM ) Aü /-CH-CHg -GH-CHg/gram.

20 I 0,907 15,0 0,07 II 0,592 9,¾ 0,17 III 0,201 17,0 0,278

Eet aantal milli-equivalent oxiran-groepen per gram polymeer verd bepaald door behandeling van de latex, bevattende een 25 bekende hoeveelheid polymeer, met bekende equivalenten vaterst of jodide. Het resterende vaterstofjodide, achtergebleven in de latex, verd geti-treerd met gestandaardiseerde zilvernitraat-pplossing teneinde de hoeveelheid vaterstofjodide, die met de epoxygroepen had gereageerd, te bepalen. De milli-equivalenten epoxygroepen werden vervolgens uit deze 30 informatie bepaald. De hierboven bereide latices bleken geschikt te zijn voor toepassing bij de verkvijze volgens de uitvinding. Monsters van elk van de hierboven beschreven latex-preparaten werden gekoppeld met menselijk chorioon gonadotropine, hieronder aangeduid als HCG. Dit hormoon is een glycoprotelen en beheerst de vorming en afsheiding van 35 progesteron door het corpus luteum. Het wordt normaal afgescheiden door het chorione weefsel van de placenta gedurende de zwangerschap. Aan latex 7901200 ‘ Ί 9 gebonden HCG is bruikbaar voor het aantonen van zwangerschap.

Voorbeeld IV

Een oplossing, bevattende 5000 IU HCG in 7 ml fosfaatbuffer met een pH van 8,0 (I = 0,05; 0,1 M NaCl; 1:10.000 thimerosal), 5 verd onder roeren toegevoegd aan een gesiliconiseerde rondbodemkolf van 25 ml} die reeds 1,61 g styreen-glycidylmethacrylaat, bereid zoals beschreven in voorbeeld I, bevatte. De resulterende latexsuspensie werd gedurende U dagen in een koude ruimte (5°C) geroerd. Het reactiemengsel verd gewassen door membraanfiltratie gedurende ongeveer 3 uren in een 10 Diaflo (geregistreerd handelsmerk) filtered met 1^5 ml fosfaatbuffer.

De gewassen ]atex en de spoelvloeistof werden in cellofaan gedialyseerd tegen 0,1 M glycine-buffer met een pH van 8,2. Na 2 dagen dialyse werden 16,¼ g van het styreen-glycidylmethacrylaat-latex-HCG-prodükt verkregen met een detectie-gevoeligheid van 0,9 IU/HCG/ml.

15 Voorbeeld V

Dit produkt werd op dezelfde wijze als beschreven in voorbeeld IV bereid met de volgende uitzonderingen. Het reactiemengsel werd na 3 dagen behandeld met 1 ml glycine-buffer met een pH van 8,2 ter verwijdering van de resterende epoxygroepen. Na roeren gedurende 20 nog 1 dag in de koude werden 9,9 g van het reactiemengsel gewassen door membraanfiltratie onder gebruikmaking van 188 ml fosfaatbuffer met een pH van 7,0 (I = 0,05; 0,1 M NaCl). Het resulterende produkt en de spoelvloeistof werden behandeld met 13 mg natriumazide als conserveermiddel.

Het resulterende produkt bezat een detectie-gevoeligheid van 1,8 IU/HCG/ 25 ml.

Voorbeeld VT

Latex, bereid volgens de procedure van voorbeeld II (3,08 g latex, 0,h6 g polymeer), werd gebracht in een rondbodemkolf van 25 ml, voorzien van een met Teflon (geregistreerd handelsmerk) beklede 30 magnetische roerstaaf. Een oplossing, bevattende 5000 IU HCG in 8 ml koude fosfaatbuffer met een pH van 8 (I * 0,05; 0,1 M NaCl; 0,01 % thimerosal) werd langzaam toegevoegd aan de kolf. Het reactiemengsel werd kalm geroerd gedurende 90-96 uren bij ongeveer 5°C. Het latex-HCG-conjugaat werd gewassen met 110-115 ml fosfaatbuffer door ultrafiltratie 35 gedurende ongeveer 70-110 minuten. De gecombineerde latex-HCG en spoelvloeistof werden gedialyseerd in cellofaan bij 5°C gedurende 2¼ uren.

790 1 2 00 «✓ -¾ 10

Het volgens deze procedure bereide produkt vertoonde een detectie-gevoe-ligheid van 0,9-1,8 IU/HCG/ml.

Onder toepassing van de reeds beschreven procedures werd HCG gekoppeld aan de in voorbeeld III bereide latex. Onder toepas-5 sing van de reeds beschreven algemene procedures en methodes verden verdere monsters van HCG-latex-conjugaat bereid. De factoren, die de kwaliteit van het eindprodukt in aanzienlijke mate bleken te beïnvloeden, zijn hieronder vermeld.

De bovenstaande voorbeelden illustreren de uit-10 voering van de verkvijze volgens de uitvinding. Andere factoren, die zijn gebleken de koppeling te beïnvloeden van HCG aan de hierboven beschreven styreen-glycidylmethacrylaat-monogedispergeerde latices, waren de ouderdom van de latex en de wijze van de opslag van de latex voordat de koppeling werd uitgevoerd. De latex moet onder koeling worden opge-15 slagen en zo snel mogelijk bij de koppelingsreacties worden gebruikt.

De in voorbeeld II bereide latex bleek zich bevredigend te gedragen bij de koppelingsreactie met HCG na een opslag gedurende 1 maand onder koeling.

Bij de bereiding van immunologisch actieve latex-20 HCG-conjugaten bleek dat de bron van HCG een belangrijke variabele was bij de bepaling van de gevoeligheid. HCG-preparaten uit variërende technische bronnen moeten worden onderzocht teneinde te bepalen welke het meest bevredigend is voor de speciale toepassingen. Hoewel variërende hoeveelheden proteïen kunnen worden gekoppeld aan de latex gaf de vast-25 hechting van maximale hoeveelheden HCG aan de latex geen optimale resultaten. Hoewel andere hoeveelheden bruikbaar zijn is de voorkeurshoeveelheid HCG, gebruikt bij de koppelingsreactie, ongeveer 1000-25.000 I.U. per gram polymeer, waarbij een hoeveelheid van 11.000 I.U./gram polymeer in het bijzonder de voorkeur geniet. De voorkeursreactieconcen-30 tratie van vaste polymeerstoffen was ongeveer U-5 %·

In het algemeen wordt de koppelingsreactie uitgevoerd bij een pH van ongeveer 7,5-8,5, waarbij een pH van ongeveer 8,0 de voorkeur geniet. Een fosfaatbuffer wordt in het algemeen gebruikt voor de koppeling van HCG aan de latex.

35 Boraathuffers zijn in het algemeen onbevredigend met protelenen zoals HCG, die een hoog koolhydraat gehalte bezitten. Ge- 790 1 2 0 0 •e- ^ 11 vonden werd eveneens dat de koppelingsreactieduur kon vorden verminderd tot ongeveer 1 dag of minder door de reactie uit te voeren "bij kamertemperatuur in plaats van bij 5°C zoals in de bovenstaande voorbeelden.

Vaimeer echter geen speciale gekoelde faciliteiten vorden gebruikt is 5 een geschikte controle van potentiële microbiële infecties noodzakelijk.

Ha de koppeling van de latex aan HCG is het van essentieel belang dat niet-gereageerd HCG en andere verontreinigingen uit het reactiemengsel vorden vervijderd. Ultrafiltratie, gevolgd door cellofaan-dialyse of centrifugering bij hoge snelheid, gevolgd door 10 cellofaan-dialyse, gaven een bevredigend produkt. Holle vezeldialyse, hoewel nog bruikbaar, vas minder doeltreffend bij de verwijdering van de overmaat HCG uit het reactiemengsel.

Indien het latex-HCG-eindconjugaat wordt gebufferd met de voorkeurs glycine-buffer (pH 8,2) is het niet noodzakelijk de 15 resterende epoxygroepen te verwijderen. Indien echter een neutraal buf-fersysteem venselijk is is een extra trap nodig voor de verwijdering van de resterende epoxygroepen (zoals geïllustreerd in voorbeeld V).

In het algemeen bleek dat door een veroudering van het latex-HCG-eindconjugaat de immunologische activiteit van het produkt 20 in aanzienlijke mate werd verbeterd. Be verouderingsperiode, die nodig is voor het verkrijgen van een optimale immunologische activiteit, is afhankelijk van de temperatuur, waarbij de veroudering plaats vindt, dat wil zeggen dat naarmate de temperatuur lager is de verouderingsperiode langer duurt. Gebleken is dat een produkt, verouderd gedurende 25 3-5 dagen bij ongeveer 25°C, een bevredigend gedrag vertoonde. Een pro dukt, opgeslagen bij ongeveer 5°C, vereiste een opslag gedurende ongeveer 2 weken ter veikrijging van de optimale activiteit.

Het latex-HCG-conjugaat kan worden gecombineerd in een pak, bevattende alle noodzakelijke reagentia voor de immunologische 30 beproeving op zwangerschap. Een dergelijk pak kan bevatten een eerste reagenspreparaat, omvattende het hierboven beschreven latex-HCG-eonju-gaat, en een tweede reagenspreparaat, omvattende gebufferd anti-HCG serum, in het algemeen verkregen uit Nieuw Zeelandse witte konijnen (zie J. Clin. Endocr. 33, 988 (1971)}. Be basisreagentia kunnen even-35 eens vorden gecombineerd met hulpcomponenten, zoals een opaak glasplaatje met terugwijkende menggebieden en een applicatorstokje.

790 12 00 12

Wanneer het conjugaat is bedoeld voor immunologis che doeleinden kan bet eveneens wenselijk zijn de latexdeeltjes te kleuren alvorens deze te koppelen net bet protexen teneinde de detectie van de agglutinatie te vergemakkelijken. Pit kan gemakkelijk worden bewerkstel-5 ligd door menging van de latex net een kleurstof oplossing, bevattende een oplosmiddel, dat in de latexdeeltjes kan binnendringen. Bijvoorbeeld Calco Oil Blue N kleurstof (American Cyanamid), opgelost in benzeen, is gebleken bevredigende resultaten te geven. Eet benzeen werd in een verdamper verwijderd voordat de koppeling met het protexen werd uitge-10 voerd.

De volgende voorbeelden illustreren de koppeling van styreen-glycidylmethaciylaat-latex aan insuline.

Voorbeeld VIII

Latex, zoals bereid zoals beschreven in voorbeeld 15 I (2,5 g latex, 0,75 g polymeer) werd gebracht in een kolf, waaraan 2,5 ml insuline-oplossing (15 mg insuline) en 5 druppels 0,1 K natriumhydroxy-de werden toegevoegd. De eind-pR was 8. De reactiemassa werd gedurende 90 uren bij 5°C geroerd, waarna g van het latex-reactiemengsel (U,8 g) werden gewassen door membraanfiltratie in een Diaflo (geregistreerd 20 handelsmerk) filter cel onder gebruikmaking van een 0,1 ^u Millipore filter en een boraatbuffer met een pE van 8. Een bydrodynamische druk tot ongeveer 3,5 kg/cm werd toegepast en het effluent werd met ultra-violetstraling onderzocht op de aanwezigheid van niet-gekoppeld insuline. De filtratie werd voortgezet totdat geen insuline in het effluent meer 25 kon worden aangetoond. Uit de dunnelaagelektroforese bleek dat het insuline chemisch was gebonden aan de latex.

Voorbeeld IX

Latex, bereid zoals beschreven in voorbeeld I (6,3 g latex; 0,92 g polymeer), werd toegevoegd aan een oplossing, bevattende 30 7,33 mg mierikswortel-peroxydase in 10 ml fosfaat-zout-buffer met een pE van 8. Eet mengsel werd bedekt en gedurende ongeveer 5 dagen bij 5°C geroerd. Het reactiemengsel werd verdund (2-3 maal) met buffer en gecentrifugeerd bij 18.000 rpm gedurende ongeveer 35 minuten. De bovenstaande vloeistof werd verworpen en het latex-peroxydase-residu werd her-35 suspendeerd in fosfaat-zout-buffer met een pH van 7, waaraan(1 % opper-vlakactief middel was toegevoegd. De centrifugering en hersuspenderxng 79 0 1 2 0 0'

Claims (11)

1. Werkwijze voor de koppeling van een proteïen met een re actieve groep, bevattende een labiel waterstofatoom, aan een 30 latex, waarbij de latexdeeltjes in grootte (diameter) variëren van ongeveer 0,15 tot 1,5 micrometer en een inwendige kern en een buitenschil bezitten, waarbij de inwendige kern is gevormd door polymaisatie of co-polymerisatie van een of meer bar de monomeren en de buitenschil is gevormd door copolymerisatie van een of meer harde monomeren en een 35 copolymeriseerbare ethenisch onverzadigde verbinding met vrije epoxy-groepen, waarbij de kern en de schil eventueel gecopolymeriseerd zacht monomeer bevatten, met het kenmerk, dat men de latex en het proteïen bij 790 1 2 0 0 1H een pH van 7,0-9*0 met elkaar in reactie brengt gedurende een voldoende lange tijd om een covalente binding te vormen tussen de reactieve groep van het proteïen en de vrije epoxygroep van de latex en het niet-gerea-geerde proteïen uit het latex-proteïen-conjugaat verwijdert.

2. Werkwijze volgens conclusie 1. 'met het kenmerk. dat de latex een monogedispergeerde latex en de reactieve groep aan het proteïen een aminogroep is,

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de latex styreen-glycidylmethacryiaat is. 10 b. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat het proteïen menselijk chorioon gonadotropine is.

5. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat het proteïen insuline is.

6. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, 15 dat het proteïen een enzym is.

7. Werkwijze volgens conclusie U, met het kenmerk, dat de koppelingsplaatsdichtheid van de styreen-glycidylmethacrylaat-latex ongeveer een epoxy-eenheid per 5-^0 vierkante angstrom-eenheden deeltjesoppervlak is en de hoeveelheid menselijk chorioon gonadotropine, 20 gebruikt voor de bereiding van het latex-proteïen-conjugaat, 1000- 25.000 internationale eenheden per gram polymeer bedraagt.

8. Een proteïen-latex-conjugaat, verkregen volgens de werkwijze van conclusie 2. 9« Proteïen-latex-conjugaat volgens conclusie 8, 25 met het kenmerk, dat het proteïengedeelte menselijk chorioon gonadotropine en het latexgedeelte styreen-glycidylmethacryiaat is.

10. Proteïen-latex-conjugaat volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat het proteïengedeelte insuline en het latexgedeelte styreen-glycidylmethacryiaat is.

11. Proteïen-latex-conjugaat volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat de latex is gekleurd.

12. Een pak voor de immunologische bepaling van zwangerschap, dat omvat een eerste reagens, bevattende een monogedispergeerde styreen-glycidylmethacrylaat-latex met daaraan gebonden menselijk 35 chorioon gonadotropine, en een tweede reagens, bevattende anti-menselijk chorioon gonadotropineserum. 7901200 g*. ~»0«r

13· Werkwijzen, prod.uk.ten en pak als beschreven in de beschrijving en/of voorbeelden. 790 1 2 0 0