MXPA99002267A - Uso de antagonistas de leptina para tratar resistencia a la insulina en diabetes de tipo ii - Google Patents

Abstract

L a presente invención se refiere a agentes farmacéuticos que contienen antagonistas de leptina para tratar diabetes de tipo II. Un antagonista de leptina se basa en un fragmento de leptina murino que comprende los aminoácidos 116 a 167 o de 116 a 166. Se dan también a conocer los métodos para tratar la diabetes de tipo II.

Description

'USO DE ANTAGONISTAS DE LEPTINA PARA TRATAR RESISTENCIA A LA INSULINA EN DIABETES DE TIPO II" ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el uso de antagonistas de leptina para tratar resistencia a la insulina en diabetes del Tipo II y a un compuesto farmacéutico para tratar esta resistencia. La diabetes es una de las enfermedades metabólicas que ocurren más frecuentemente en los países industrializados. Hay más o menos 110 millones de diabéticos en el mundo; mientras que aproximadamente 10 millones de estos son diabéticos de Tipo I, la mayoría abrumadora (aproximadamente 100 millones) son diabéticos de Tipo II. La enfermedad es ocasionada mediante regulación defectuosa del metabolismo de glucosa en diabetes de Tipo I, la falla de las células beta en el páncreas da por resultado que ya no se forme la insulina. Esta falta de insulina conduce a un aumento en la glucosa de la sangre y, si no se trata suministrando insulina, a cetoacidosis, diabética y muerte del paciente. En diabéticos del Tipo II, las relaciones casuales son diferentes y están caracterizados por el desarrollo inicial de resistencia a la insulina, es decir, disminución en la capacidad de las células para responder adecuadamente a la insulina. El peso excesivo y la falta de actividad física, en particular, se considera como siendo responsables para inducir la resistencia a la insulina. La última condición no se percibe inicialmente puesto que se contrarresta mediante una secreción aumentada de insulina. Sin embargo, la resistencia continua a la insulina conduce, en un proceso que se extiende a través de muchos años, a la falla del mecanismo de compensación endógeno y el desarrollo consecuente de la diabetes del Tipo II. Aún cuando la dieta y la actividad física pueden retardar esta secuencia de eventos, frecuentemente son incapaces de impedir la manifestación de la enfermedad. Se requiere entonces la intervención medicinal a fin de controlar adecuadamente la glucosa de la sangre. Es de importancia crucial para el éxito a largo plazo de la terapia, que la glucosa de la sangre se mantenga lo más críticamente posible dentro de la escala fisiológica. La mira actual es que los niveles de glucosa que se han elevado durante décadas, como se encuentran en diabéticos deficientemente controlados (tanto diabéticos de Tipo I como del Tipo II, hagan una contribución importante a las complicaciones tardías en diabetes. Estas complicaciones tardias constituyen, en particular, daño a vasos sanguíneos que conduce a enfermedades del riñon, pérdida de vista y enfermedades cardiovasculares. El llamado daño tardio es un factor importante que contribuye a la mortalidad en diabéticos. En 1994, se describió una nueva hormona, la leptina, que se forma en las células grasas que falta en ratones genéticamente de sobrepeso (ratones ob/ob) (Y. Zhang, R. Proenca, M. Maffei, M. Barone, L. Leopold y J.M. Friedman (1994) . La clonación de posición del gen obeso de ratón y su homólogo humano. Nature 372, 425-432) . La leptina humana y la leptina murino son idénticas hasta un grado considerable. Inyectando los ratones ob/ob con leptina preparada recombinantemente conduce a una reducción en la ingestión de substancias nutritivas y a una disminución en peso (M.A. Pelleymounter, M.J. Cullen, M.B. Baker, R. Hecht, D. Winters, T. Boone, y F. Collins (1995) . Los efectos de este producto de gen obeso en la regulación del peso del cuerpo en ratones ob/ob. Science 269, 540-543) . Esto hasta ahora no ha sido una indicación de que las mutaciones en el gen ob podrían ser responsables de la ocurrencia frecuente de obesidad en seres humanos (aproximadamente 30 por ciento de la población es notablemente de sobrepeso en los Estados Unidos de América) . Las investigaciones sistemáticas han demostrado que los niveles de suero de la leptina están aumentados en humanos obesos como están en varios modelos de obesidad animales (S. Dagogo-Jack, C. Fanelli, D. Paramore, J. Brothers y M. Landt, (1996). Las relaciones de leptina de plasma y de insulina en estos humanos obesos y no obesos. Diabetes 45, 695-698; R.V. Considine, M.K. Shinha, M.L. Hei an, A. Kriauciunas, T. . Stephens, M.R. Nyce, J.P. Ohannesian, C.C. Marco, L.J. McKee, T.L. Bauer, y J.F. Caro, (1996). Las concentraciones de leptina inmunorreactiva de suero en seres humanos de peso normal y obesos. N. Engl. J. Med. 334, 292-295). Debido a esta razón, se supone que la leptina es una señal de realimentación que informa al cerebro de la cantidad de energia que se almacena en el tejido graso. De acuerdo con esta suposición, entonces la función del cerebro es disminuir la admisión de alimento inhibiendo el apetito, por una parte, y para estimular el metabolismo basal por otra parte. En la obesidad humana, este circuito de regulación parece que se interrumpe. Además de esto, se supone que la leptina también actúa directamente en tejidos fuera del cerebro. Tres estudios relacionados con el efecto directo de la leptina en las células aisladas hasta ahora se han publicado: Kroder y otros (G. Kroder, M. Kellerer y H. Háring (1996) Exp. Crin. Endocrin Diabetes 104 Suppl. 2, 66 (Compendio) ) hechos sobre la suposición de que la leptina establece una conexión entre la resistencia a la insulina y la obesidad y el informe de que la leptina disminuye la fosforilación inducida por insulina del receptor de insulina en el substrato 1 receptor de insulina (IRS-1) en los fibroblastos de la rata 1 que están sobreexpresando el receptor de insulina humano. El grado hasta el cual la leptina también ejerce una influencia en los puntos finales del efecto de insulina, por ejemplo el estimulo del transporte de glucosa o sintasa de glicógeno, no se investigó ni se discutió. Se ha demostrado que la sensibilidad a las hormonas lipogénicas (dexametasona y la insulina) se disminuye en preadipocitos 30A5 transformados que están sobreexpresando la leptina (Y. L. Bai, S. Y. Zhang, K. S. Kim, J. K Lee, y K. H. Kim (1966) J. Biol. Chem. 271, 13939-13942) . La síntesis de ácido graso y la síntesis de lípidos neutrales disminuyeron mediante la sobreexpresión de leptina aún en el estado no estimulado. Aún cuando las células de control exhibieron un aumento notable en el régimen de síntesis de lípido después de que las células se habían tratado con dexametasona o insulina, o una combinación de las dos hormonas, las células que no sobreexpresaban la leptina difícilmente se estimularon bajo estas circunstancias. Además de ésto, se llevó a cabo también una investigación de la inhibición de la actividad de dehidrogenasa de glicerofosfato y de la expresión de carboxilasa de acetilo CoA que ocurre después de tratar las células con una combinación de dexametasona e insulina. Se encontró que no era posible estimular las células que expresen la leptina. Los efectos que se observaron indican que la leptina suprime el metabolismo lípido de manera general. No se mencionó ninguna relación posible entre la obesidad y la resistencia a la insulina. En otro sistema modelo, es decir, miotubos de ratón C2C12 se encontró que la leptina exhibe efectos semejantes de insulina (L. Berti, M. Kellerer, y H. Háring (1996) Diabetologia 39 Suppl. 1, A59 (Resumen de la Invención) ) . Este estudio da a conocer que tanto el transporte de glucosa como la síntesis de glicógeno se estimulan mediante leptina. Estos descubrimientos están en conflicto con aquellos dados a conocer por otros autores y los resultados que se presentan aquí. Involucran posiblemente un efecto que es específico para este tipo de célula. En nuestras investigaciones acerca del efecto de la leptina en adipocitos de rata aislados, un sistema modelo para el tejido graso se ha encontrado ahora sorprendentemente, que la sensibilidad a la insulina de trayectorias metabólicas importantes de la celda grasa tal como el estímulo de lipogénesis del transporte de glucosa y de glicogénesis, se reduce drásticamente (Ejemplo 4) mientras que los valores básicos permanecen inalterados. Lo mismo se aplica para la inhibición de lipólisis estimulado por isoproterenol . El transporte de glucosa en adipocitos de rata aislados se estimula en aproximadamente 14 veces añadiendo insulina (10 nM) . Esta capacidad para estimularse se reduce de una manera que depende la dosis preincubándose con leptina a concentraciones diferentes durante 15 horas. La leptina desensibiliza las células, es decir, se produce una resistencia de insulina. Las curvas de dosis/efecto para insulina a concentraciones de leptina diferentes (Ejemplo 5) demuestran que las concentraciones a las cuales pueden detectarse los efectos in vitro, tanto con respecto a insulina (0.1 - 0.2 nM) y como con respecto a leptina (0.5 - 1 nM) , quedan dentro de la escala fisiológica (Dagogo-Jack y otros, 1996; Considine y otros) . Los niveles de leptina más elevados (2-4 nM) (Dagogo-Jack y otros, 1996; Considine y otros, 1996) , se encuentran en humanos obesos de manera que es posible el efecto de la insulina sea deteriorado de manera más intensa en estos pacientes. La conclusión por lo tanto sugiere que la leptina crónicamente elevada como puede vese en sujetos obesos, conduce a resistencia a la insulina. Como ya se ha explicado en lo que antecede, la resistencia a la insulina es un factor importante en la patogénesis de la diabetes Tipo II. Por lo tanto, un objeto de la invención es proporcionar antagonistas de leptina novedosos que pueden formularse en composiciones farmacéuticas. Otro objeto de la invención es proporcionar métodos para tratar diabetes de Tipo II y otros trastornos relacionados con la insulina. La invención consecuentemente se relaciona con el uso de antagonistas de leptina en particular aquellos que se derivan de la leptina misma, para preparar un compuesto farmacéutico para usarse en la diabetes de Tipo II. Los antagonistas de leptina para este uso se describen en mayor detalle a continuación.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN De conformidad con un primer objeto de la invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una antagonista de leptina. De conformidad con este mismo objeto, se dan a conocer composiciones farmacéuticas que comprenden antagonistas de leptina que se derivan de leptina. Además, de conformidad con este objeto, se revelan composiciones farmacéuticas que comprenden un antagonista de leptina que es un receptor de leptina soluble o un derivado del mismo.

De conformidad con un segundo objeto de la invención, se proporcionan métodos que utilizan las composiciones farmacéuticas de la invención en el tratamiento de diabetes de Tipo II. Asimismo, de conformidad con este objeto, se proporcionan métodos para restablecer o amplificar los efectos fisiológicos de la insulina.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Cuadro 1: Inhibición de transporte de glucosa inducido por insulina mediante leptina en adipocitos de rata. El experimento se describe en detalle en el Ejemplo 8. Cuadro 2: Ingestión de 2-Deoxiglucosa mediante adipocitos de rata como una función de la concentración de leptina. El experimento se describe en detalle en el Ejemplo 9. Cuadro 3: Antagonismo del efecto de leptina mediante el fragmento de leptina 116-167 en relación en el transporte de glucosa inducido por insulina en adipocitos de rata. El experimento se describe en detalle en el Ejemplo 10. Cuadro 4: La secuencia de aminoácido de la leptina humana. La dos cisteinas están enlazadas por un puente de disulfuro. Cuadro 5: La secuencia de aminoácido de la leptina urino. Las dos cisteinas están enlazadas por un puente de disulfuro. Cuadro 6: La secuencia de aminoácido del fragmento 116, 167 de la leptina murino. Las dos cisteinas están enlazadas mediante un puente de disulfuro.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención que se presenta aquí está dirigida hacia composiciones y métodos para reducir o completamente eliminar la resistencia a la insulina inhibiendo el efecto de leptina. Para este objeto, puede hacerse uso de péptidos que actúan como antagonistas de leptina y que conducen, en las células grasas aisladas in vitro, con la abolición de resistencia a la insulina inducida por leptina. Estos péptidos son consecuentemente apropiados para la terapia de resistencia a la insulina, de preferencia en pacientes obesos.

Antagonistas de Leptina Los antagonistas de leptina de conformidad con la invención incluyen específicamente antagonistas de péptido. Los citados péptidos se derivan de fragmentos de leptina y pueden obtenerse por ejemplo, disociando química o enzimáticamente la leptina intacta (v.g. con endopeptidasa de lisilo, tripsina, endo-Arg C o bromuro de cianógeno) o pueden prepararse expresándose directamente o como una proteína de fusión en microorganismos. En relación con la preparación de péptidos en microorganismos, no hay compulsión para depender de la presencia de sitios de disociación naturales cuando se seleccionan los fragmentos que van a expresarse. La leptina humana y animal, por ejemplo, leptina de rata, ratón, cerdo o de mono humanoide, son apropiadas para derivar los péptidos. Un péptido ejemplar apropiado se extiende desde el aminoácido 116 al aminoácido 167 o desde el aminoácido 116 al aminoácido 166 (Cuadro 6, SEQ ID NO.:4) de acuerdo con la secuencia que es publicado en Zhang y otros (1994) (Ejemplos 3 y 6) . En el Ejemplo 6, los adipocitos se incubaron durante aproximadamente 15 horas en presencia de nM de leptina y concentraciones diferentes del fragmento de leptina antagonistico 116-167. Las células luego se estimularon con 5 nM de insulina. En este experimento, se encontró que el aumento de las cantidades en el antagonista condujo a restablecimiento de la capacidad para estimularse mediante insulina y no se desarrolla ninguna resistencia en la presencia de altas concentraciones del antagonista de leptina. Por lo tanto, usando estos y ensayos semejantes, una persona experta en la técnica puede asegurarse de que las propiedadea antagonisticas de cualquier antagonista de leptina que serían útiles de acuerdo con la presente invención. Además de esto, pueden también usarse análogos de los fragmentos de leptina antagonísticos en donde uno o más de los aminoácidos es/son reemplazados o suprimidos. De preferencia las reposiciones son substituciones de aminoácido conservadoras. Estas substituciones conservadoras incluyen substituciones de aminoácido cargadas-cargadas, polares-polares e hidrofóbicas-hidrofóbicas . Por ejemplo, uno o más de los residuos de aspartato se puede reemplazar mediante residuos de gluta ato y/o viceversa y/o uno o más residuos de leucina se pueden reemplazar mediante residuos de isoleucina y/o viceversa. Pueden hacerse otras substituciones y supresiones de manera razonable basándose en consideraciones esféricas y estructurales tales como el tamaño del aminoácido y la propensión para producción de hélice o rotura. Pueden usarse métodos moleculares biológicos y biotecnológicos para alterar y llevar al óptimo las propiedades antagonistas de los péptidos de una manera especifica. Además de esto, los péptidos pueden modificarse químicamente, por ejemplo por medio de acetilación, carba oilación, for ilación, biotinilación, acilación, o derivación con polietilenglicol o polímeros hidrofílicos a fin de aumentar su estabilidad o modular su media vida de plasma y farmacocinética. Los anticuerpos contra leptina, en particular los dominios de ligazón de leptina, también son apropiados como antagonistas de leptina, para ese objeto. Además de esto, son también apropiados receptores de leptina solubles y/o fragmentos receptores de leptina y fusiones de los mismos con otras proteínas (v.g. la región de IgG Fe). Al igual que los antagonistas de péptido, cualquier antagonista de leptina que sea una proteína puede alterarse mediante medios biológicos moleculares. De manera semejante, estos antagonistas pueden prepararse expresándose directamente o como una proteína de fusión, en los microorgnaismos o cualquier número de sistema de expresión normales.

Composiciones Farmacéuticas La invención además se relaciona con una composición farmacéutica que comprende los antagonistas de leptina que se describen en esta solicitud de patente. Los compuestos farmacéuticos, se pueden usar, por ejemplo, en la forma de preparaciones farmacéuticas que pueden administrarse oralmente, por ejemplo en la forma de pastillas, pastillas recubiertas, cápsulas de gelatina duras o suaves, soluciones, emulsiones o suspensiones. Pueden administrarse también rectalmente, por ejemplo en la forma de supositorios, o parenteralmente por ejemplo en la forma de soluciones de inyección. Los compuestos farmacéuticos pueden también administrarse a través de las membranas mucosas de la nariz, o la boca o del pulmón. A fin de producir preparaciones farmacéuticas, estos compuestos pueden tratarse en excipientes terapéuticamente inertes orgánicos e inorgánicos. La lactosa, el almidón de maíz o derivados de los mismos, talco y ácido esteárico o sales de los mismos, son ejemplos de estos excipientes para pastillas, pastillas recubiertas y cápsulas de gelatina duras. El agua, polioles, sucrosa, azúcar invertido y glucosa son excipientes apropiados para preparar las soluciones. El agua, los alcoholes, los polioles, glicerol y aceites vegetales apropiados como excipientes para soluciones de inyección. Los aceites vegetales y endurecidos, ceras, grasas y polioles semi-líquidos son excipientes apropiados para supositorios. Las preparaciones farmacéuticas también pueden comprender agentes de conservación, solventes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, edulcorantes, colorantes, agentes de sabor, sales para alterar la presión osmótica, estabilizadores, agentes de revestimiento, antioxidantes y, cuando sea apropiado otros compuestos terapéuticos activos.

Se prefiere la administración oral e inyecciones. Para inyección, los antagonistas de leptina novedosas se formulan en una solución líquida, de preferencia en un estabilizador fisiológicamente aceptable, por ejemplo la solución de Hank o la solución de Ringer. Sin embargo, los antagonistas de leptina novedosos pueden también formularse en forma sólida y disolverse o suspenderse antes del uso. Las formulaciones típicas contienen una cantidad terapéuticamente benéfica de un antagonista de leptina. Una cantidad terapéuticamente benéfica puede ser igual a una cantidad terapéuticamente efectiva como se discutirá a continuación. Además, una cantidad terapéuticamente benéfica puede ser una dosis unitaria que ya sea sola o en múltiplos se puede usar para proporcionar una cantidad terapéuticamente efectiva del antagonista de leptina. Por lo tanto, una cantidad terapéuticamente benéfica dependerá entre otras cosas, de la naturaleza del trastorno que se esté tratando.

Método de Tratamiento Los métodos de la invención son útiles para trarar cualquier trastorno en donde está implicada la acción de leptina. En vista de la exposición presente y la observación de que la leptina inhibe algunas de las actividades fisiológicas de la insulina, los métodos de la invención son particularmente útiles en el tratamiento de trastornos que involucran alteraciones de la actividad de la insulina y especialmente de la diabetes de Tipo II. Estas alteraciones en la actividad de la insulina incluyen alteraciones en lipogénesis, glicogénesis de transporte de glucosa y lipólisis. Por consiguiente, los métodos de la invención incluyen métodos para tratar diabetes de Tipo II y métodos para restablecer o amplificar los efectos fisiológicos de la insulina. Un método típico involucra administrar a un paciente que necesita un tratamiento, una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de leptina. Un paciente en necesidad del tratamiento cuando padece de un trastorno en el cual está implicada la acción de la leptina. El tratamiento es especialmente indicado cuando un paciente adolece de diabetes de Tipo II. El tratamiento es también indicado cuando un paciente está creciendo de un trastorno caracterizado por una perturbación en la actividad de insulina, tal como alteraciones en lipogénesis, transporte de glucosa, glicogénesis y lipolisis. En trastornos en donde esta perturbación está implicada, son útiles los métodos para restablecer o amplificar el efecto fisiológico de la insulina. Una cantidad terapéuticamente efectiva dependerá, por ejemplo, de la naturaleza del trastorno que se esté tratando, la vía de administración, las características específicas del antagonista seleccionado y especialmente el criterio del clínico o médico a cargo del caso. Una cantidad terapéuticamente efectiva generalmente es una cantidad suficiente para efectuar el tratamiento de la enfermedad o para lograr la mira citada del método, por ejemplo, restablecer o amplificar el efecto fisiológico de la insulina. Finalmente la cantidad terapéuticamente efectiva dependerá de la eficacia clínicamente determinada y la toxicidad de cada antagonista de leptina. Estas determinaciones se hacen de manera rutinaria y quedan dentro del conocimiento del médico. El término "tratar" en sus distintas formas gramáticas con relación a la presente invención se refiere para impedir, curar, invertir, atenuar, aliviar, reducir al mínimo suprimir o detener los efectos perjudiciales de un estado de enfermedad, avance de la enfermedad, agente causante de la enfermedad u otra condición anormal. Las dosis que se prefieren para administración sistemática son de aproximadamente 0.01 miligramo por kilogramo hasta aproximadamente 50 miligramos por kilogramo de peso de cuerpo y por dia. La invención se aclarará a continuación por medio de los Cuadros y Ejemplos sin quedar restringida los mismos. - lí Ejemplos Ejemplo 1: Clonación de leptina murino Aislamiento de ARN — se removieron las almohadillas de grasa epididimarias de ratones adultos y se congelaron por choque en nitrógeno liquido. 1 gramo de ese tejido graso se muele en un mortero bajo nitrógeno líquido, después de lo cual se añaden 15 mililitros de una solución de 5 M de tiocianato de guanidinio en 50 mM Tris (pH de 7.5), 10 mM de EDTA y de 0.1 M de DTT en el conjunto se homogeniza vigorosamente a fin de obtener una dispersión fina. Después de que las partículas del tejido se han disipado completamente, se añaden 10 gramos de CsCl sólido y la mezcla se agita a temperatura ambiente. Después de añadir 10 mililitros de H20, 9 mililitros de una solución de 5.7 M de CsCl se colocan por encima con 25 mililitros de esta solución en un tubo de centrifuga. Después de centrifugarse durante 15 horas, en una rotor SW28 a 25,000 revoluciones por minuto (18°C) , el tubo se congela en nitrógeno liquido y la cuarta parte del fondo del tubo se corta usando una cuchilla de escalpelo caliente; el contenido congelado se saca del granulo de ARN se raspa de su extremo inferior. El ARN se disuelve y luego se precipita con etanol.

Síntesis de ADNc -- En una mezcla, 1 microgramo del ARN total del tejido de grasa y 1 microgramo del oligonucleótido de cebador específico 5'-GAATGCAGAATAAATAAATA (SEQ ID NO.: 1); Zhang y otros, 1994) se disuelven en 10 microlitros de H20 y luego se desnaturalizan térmicamente y se incuban a 65°C durante 5 minutos. Después de añadir 0.5 microlitro del inhibidor RNase, en cada caso 5 nmoles de dNTP y 0.5 microlitro de transcriptasa inversa AMV (Boehringer Mannheim) , la mezcla se incuba a 42°C durante 1 hora. Después de esto, el ADNc se constituye con 200 microlitros con H2O y se almacena a -20°C. PCR - 3 microlitros del ADNc especialmente cebado se amplifican con 0.5 microgramo cada uno de dos cebadores 5'GAAAGAAGGATCCAGTGCCTATCCAGAAAGTCCA (SEQ ID NO.: 2) Y 5'GGAGAGAAGCTTGAGGGAGAGAAATGAATGATGG (SEQ ID NO . : 3. Zhang y otros, 1994) y 2.5 U de polimerasa de Taq (Perkin Elmer) durante 30 ciclos en el estabilizador de reacción recombinado por el fabricante (1.5 mM de MgCl2, 200 micrómetros de dNTPs en 100 microlitros) . El ciclo comprende 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 55°C. y 2 minutos a 72°C. Ligazón -- El producto de PCR amplificado específicamente (583 bp) de una preparación de PCR, se disocia, en cada caso a 37°C durante 2 horas y bajo condiciones de estabilización de acuerdo con las instrucciones del fabricante con las enzimas de restricción Ba HI y HindIII (Boehringer Mannheim) , después de lo cual el fragmento de 564 bp se purifica mediante electroforesis y se aisla. Se incuba a 30°C durante 2 horas y en 20 microlitros junto con 0.1 microgramo del vector de BamHI- y HindIII - disociado pQE31 (Qiagen) y 20 unidades de ligasa de ADN T4 (New England Biolabs) . Clonación - 5 microlitros de la mezcla de ligazón se mantuvieron en hielo durante 30 minutos junto con 100 microlitros de las células E. coli competentes para transformación de la cepa HB101 y la mezcla luego se agita suavemente durante 5 minutos en un baño de agua a 37 °C. Después de la adición de 0.9 mililitro del medio nutritivo que contiene 10 mM de MgCl2, la mezcla se agita a 37°C durante 1 hora. Volúmenes de 100 microlitros de esta mezcla en cada caso se colocan en placas de agar que contienen ampicilina (100 microgramos por mililitro) . Identificación de las clonas — Las clonas que se han hecho crecer durante la noche a 37°C se inoculan en cultivos líquidos de volumen de 2 mililitros que contienen ampicilina, se cultivan hasta la fase estacionaria y luego se centrifugan. Las células se suspenden en 0.1 mililitro de 25 mM Tris (pH 8) 50 mM de glucosa, 10 mM de EDTA y lisozima (2 miligramos por mililitro) y, después de haberse incubado a temperatura ambiente durante 5 minutos, se someten a lisis añadiendo 0.2 mililitro de 0.2 M NaOH, 1 por ciento de SDS. El ADN cromosomal se precipita añadiendo 150 microlitros de 3 M de acetato de Na/ácido acético (pH de 5.2) y se centrifuga durante 5 minutos a 4°C (10,000 revoluciones por minuto en un Sigma 2MK) . El ADN de plás ido se precipita con 2.5 volúmenes de etanol, se centrifuga (véase lo anteriormente expuesto) y, después de un lavado con etanol se recogen en 100 microlitros de H20; 10 microlitros de la solución de RNase (10 miligramos por mililitro) y se añaden luego. El ADN del plásmido se digiere con enzimas de restricción (Bgll, Xhol + Pvull; Boehringer Mannheim) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y los fragmentos de ADN resultantes se miden entre el marcador AD en gel de agarosa después de la electroforésis y teñido con bromuro de etidio. Las clonas que tienen el patrón de fragmento correcto se examinan de la misma manera usando la enzima de restricción AflIII (New England Biolabs) para la presencia del residuo de glutamina 49. La identidad en cada caso una clona de E. coli que contiene Gln49 (pQEob3-9) y una que no contiene Gln49 (pQEob3-4) se confirmó por medio de secuencia de ADN. La producción de leptina reco binante que contiene la presecuencia MetArgGlySer (His) 6ThrAspPro (del vector pQE31) seguida por aminoácidos 22 a 167 de leptina murino se comprobó en cultivos pequeños. Aún cuando pueden emplearse ambas leptinas recombinantes (con y sin Gln49) en los experimentos que se describirán a continuación, los ejemplos se relacionan específicamente a leptina que contiene Gln49 que se obtiene expresando qQEob3-9.

Ejemplo 2 - Preparación de leptina Disrupción -- Las bacterias de una fermentación 10 1 se centrifugaron a 4800 revoluciones por minuto durante 20 minutos. El sedimento se congeló a -20°C y subsecuentemente se suspendió en el estabilizador de lisis ( 6M cloruro de guanidinio, 0.1 M de NaH2P04, 10 mM de Tris/HCl, pH de 8) (5 mililitros del estabilizador de lisis/gra o de sedimento), después de lo cual la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una hora y luego se centrifugó a 4800 revoluciones por minuto durante 30 minutos. Cromatografía de Ni-NTA — Se añadieron 100 mililitros de agarosa Ni-NTA FF (Qiagen, Hilden) al extracto crudo que contiene aproximadamente 800 miligramos de leptina y el conjunto se agitó a 4°C durante la noche. La suspensión se succionó a través de una columna de vidrio (o 5 centímetros) que posee una frita. La columna, junto con la agarosa de Ni-NTA que está contenida en la misma, se lavó con 300 mililitros del estabilizador de lisis y luego con 100 mililitros del estabilizador de lisis que contiene 10 mM de imidazol (5 mililitros/minuto) . La elución fraccionada de la leptina luego se lleva a cabo aplicando un gradiente lineal de 10 a 200 mM de imidazol en estabilizador de lisis (volumen del gradiente: 300 mililitros a 5 mililitros por minuto) . Las fracciones se analizan mediante RP-HPLC y aquellas que son de pureza de concentración adecuadas se combinan (eluado de = Ni-NTA) . Doblez - El eluado de Ni-NTA se diluye en el estabilizador de lisis a una concentración de 1 - 3 miligramo por mililitro y se ajusta a un pH de 9 con una solución de hidróxido de sodio. Después de añadir beta-mercaptoetanol (de 4 a 6 moles de beta-mercaptoetanol por mol de leptina) , la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas en segundo envase sellado. Para reoxidación y redoblez, la solución se vació en 9 veces el volumen del estabilizador de doblez (0.1 M Tris/HCl, pH de 9) y el conjunto se agitó a 16°C durante de 16 a 24 horas mientras que se admitia aire. Cualquier turbidez que aparece se centrifuga (4,000 revoluciones por minuto, 45 minutos) .

HPLC de fase inversa — La mezcla de doblez se ajusta a un pH de 3 con HC1 y se bombea hacia una columna de 2.5 x 30 centímetros de RP (PLRPS 300 A, 10 µ, Polymer Laboratories, de Amherst, USA) son de 20 mililitros por minuto. La columna se lava subsecuentemente con 300 mililitros del eluyente A (0.1 por ciento de TFA acuoso). La leptina se eluye en 100 minutos (régimen de flujo: 7 mililitros por minuto) aplicando un gradiente de 25 por ciento a 50 por ciento del eluyente B (0.09 por ciento de TFA en acetonitrilo) . Las fracciones se analizaron por medio de HPOLC analítico. Las fracciones de pureza y concentración adecuadas se combinaron (depósito de RP) . El depósito se trató con 7 milimoles de Na2HP04/l y se ajustó a un pH de 3 con NaOH, y el solvente se removió en un evaporador rotatorio. La solución de leptina acuosa luego se neutralizó con NaOH (pH de 7.4) y se almacenó a 4°C durante la noche. Cualquier turbidez resultante se centrifuga (4,000 revoluciones por minuto, 10 minutos). Cromatografía de permeación de gel -- La solución de leptina neutralizada y se centrifugada se concentra hasta 10-15 miligramos por mililitro mediante ultrafiltración y luego se esteriliza mediante filtración. Se cargan de 50 a 75 miligramos en una columna Superdex 75 (2.6 x 60 centímetros, Pharmacia, Suecia) , Se usó PBS (154 mM de NaCl, 10 M de fosfato de sodio, de pH de 7.4), como el estabilizador de elución, a un régimen de flujo de 3 mililitros por 3 minuto. La leptina que se purificó de esta manera se filtró luego de nuevo a través de una membrana de 0.22 micrómetros y se almacenó a -70°C.

Ejemplo 3 - Preparación del fragmento antagonístico 116-167 Se añadió 1 mililitro de 1 M Tris/HCl, de pH de 8, a 40 mililitros de la solución de leptina (1 miligramo/ mililitro en PBS) y, después de haberse añadido 160 microgramos de la endopeptidasa de lisilo, la leptina se digirió a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla se ajustó a un pH de 3 y se fraccionó mediante RP-HPLC como se describe en el Ejemplo 2. El fragmento de 116-167 se identificó mediante espectrometría de masa de electrorrociadura (5532D), se liberó del solvente, como se describe en el Ejemplo 2, se concentró y se purificó por medio de cromatografía de permeación de gel.

Ejemplo 4: Aislamiento de adipocitos Se prepararon adipocitos del tejido graso epididi ario de las ratas Wistar macho (140-160 gramos, estación de crianza Hoechst AG, Kastengrund) por medio de digerirse con colagenasa (Rodbell, 1964, J. Biol. Chem. 239, 375-380), se lavaron dos veces con KRH (25 mM de ácido libre Hepes, 25 mM de sal de sodio Hepes, 80 mM de NaCl, 1 mM de MgS04, 2 mM de CaCl2, 6 mM de KC1, 1 mM de' piruvato de sodio, 0.5 por ciento de BSA) y una vez con DMEM (medio esencial mínimo de Dulbecco) , suplementado con 5.5 mM de glucosa, 20 mM de Hepes (pH de 7.4), 2 por ciento de suero de ternera fetal, 1 por ciento de BSA, 50 unidades de penicilina/mililitro, 10 miligramos de estreptomicina/ mililitro por medio de flotación (800xg, 1 minuto, en tubos de plástico pequeños), y finalmente se diluyó hasta un volumen de 20 mililitros de DMEM/gramo de peso en húmedo del tejido graso (evaluación de célula: aproximadamente 2.5 x 10 células por mililitro) .

Ejemplo 5: Cultivo primario de adipocitos e incubación con leptina Los adipocitos se incubaron a 37°C durante de 15 a 18 horas bajo una atmósfera de 5 por ciento de C02 con agitación leva en DMEM suplementado (véase lo anterior) en presencia de 100 mM de fenilisopropiladenosina (4 mililitros de DMEM a 1 mililitro de células, evaluación de célula, de aproximadamente 5 x 10 célula/mililitro, en tubos de polipropileno estériles de 50 mililitros) y en presencia o ausencia de leptina. Los adipocitos subsecuentemente se elaboran tres veces con KRH frió y se ajustaron a una evaluación de célula de aproximadamente 3x10 células por mililitro añadiendo 0.7 mililitro de KRH exenta de glucosa a la capa de la célula que permaneció después de la remoción completa de la última solución de lavado. A fin de determinar la capacidad de los adipocitos que van a estimularse mediante insulina, y su sensibilidad a la insulina, después del cultivo primario, los adipocitos lavados se incubaron a 37°C durante 20 minutos en ausencia o presencia de insulina humana (de 0.02 a 50 nM de concentración final) , y luego se midió el transporte de glucosa o lipogénesis.

Ejemplo 6: Transporte de glucosa El transporte de glucosa se midió como la ingestión especifica de 2-deoxiglucosa analógica de glucosa no meetabolizable (Müller y Wid, 1993, Diabetes 42, 1852-1867) . 50 microlitros de la suspensión de adipocito en KRH, cuya suspensión se había o no preincubado con insulina (véase lo anterior) , se incubó a 25°C durante 5 minutos, con 50 microlitros de KRH y se suplemento con 2-deoxi-D- 3 [2,6- Hglucosa (0.5 microCi, 0.2 mM) . Las mezclas de incubación se transfirieron hacia tubos de centrífuga de plástico suave cada uno de los cuales contenía ya 200 microlitros del aceite de ftalato de dinonilo, e inmediatamente se centrifugaron (2,000xg, 30 segundos). Usando cortadores especiales los tubos se cortaron dentro de la capa de aceite (en la proximidad de la orilla superior) y las mitades superiores de los tubos junto con las capas de la célula que en cada caso se hablan hecho flotar hacia la capa de aceite se transfirieron a frascos pequeños de escintilación. Después de haberse añadido 10 mililitros del fluido de escintilación (a base de agua) la radioactividad asociada con las células se midió. A fin de corregirse para 2-deoxiglucosa que se había encerrado en los intersticios de la célula, o que se había difundido hacia las células con una manera no específica, la radioactividad de las células que se hablan preincubado con citocalasina B (20 micrómetros) se restó de la radioactividad asociada con la célula total de cada mezcla de incubación individual (Gliemann y otros, 1972, Biochim. Biophys. Acta 286, 1-9).

Ejemplo 7: Lipogénesis La lipogenesis se midió como la incorporación de D-glucosa en lípidos extraíbles con tolueno (Moody y otros, 1974, Horm. Metab. Res. 6, 12-16). 200 microlitros de la suspensión de adipocito en KRH se incubaron en frascos pequeños de escintilación, a 37°C durante 20 minutos, en 680 microlitros de KRH que se suplemento con 3.5 mililitros de glucosa y 20 microlitros de la solución de insulina. Se inició la lipogénesis añadiendo 100 microlitors de D-[3- H] glucosa (25 microCi/mililitro KRH. Después de incubarse a 37°C y agitación leve bajo una atmósfera de 5 por ciento de C02, durante 90 minutos, se añadieron 10 mililitros del fluido de escintilación (a base de tolueno) y se determinó la radioactividad en la fase de tolueno después de agitarse vigorosamente y de una aceptación de base subsecuente (por lo menos 4 horas de incubación) . La radioactividad de los lípidos en la fase de tolueno se corrigió para la radioactividad de una mezcla de incubación que contenía la misma cantidad de [ H] glucosa pero ningunas células.

Ejemplo 8: Inhibición mediante leptina de transporte de glucosa inducido por insulina y de lipogénesis inducida por insulina Se incubaron adipocitos de rata aislados durante horas en un cultivo primario en presencia o ausencia de concentraciones aumentadas de leptina. Las células luego se lavaron y se probaron para transporte de glucosa y lipogénesis en estado básico estimulado con insulina (10 nM) . El factor de estímulo para la insulina se calculó como la relación entre las actividades estimuladas por insulina y básicas. Cada valor representa el medio de dos cultivos de adipocito independientes con la actividad habiéndose terminado dos o tres veces en cada caso.

Cuadro 1 Concentración de insulina: 5 nM Leptina Glucosa Concentracion [nM] Transporte* lipogénesis* 0 13.4 3.9 0.3 13.4 3.9 1 11.75 3.2 3 7.4 2.15 10 3.5 1.5 30 2.35 1.15 100 1.5 1.05 * Los factores son los cocientes de los valores después del estimulo y valores básicos.

Los resultados se resumen en el Cuadro 1.

Ejemplo 9: Influencia de leptina en la curva de la dosis/ efecto de insulina Se incubaron los adipocitos de rata aislados durante 16.5 horas en un cultivo primario en presencia o ausencia de concentraciones aumentadas de leptina. Las células luego se lavaron y se probaron para el estimulo del transporte de glucosa mediante diferentes concentraciones de insulina. La actividad del transporte de glucosa se proporciona con un "valor de dpm" de 2-deoxi-[ H] glucosa que está asociada específicamente con las células. Cada valor representa el medio de dos cultivos de adipocito independientes con la actividad determinándose cuatro veces en cada caso.

Cuadro 2 : Parámetro medido : transporte de glucosa Leptina [nM] Insulina [nM] 0 0.05 1 10 30 100 671 654 634 688 712 755 688 747 0.02 784 735 678 704 734 773 704 766 0.05 1285 1025 824 755 798 802 745 780 0.1 2406 1674 1189 860 883 856 789 803 0.2 4762 3320 1587 1006 923 941 852 813 0.5 6976 5138 2180 1377 1167 1209 943 883 7981 6834 3904 1916 1583 1573 1183 896 3576 7942 5510 2680 2140 2061 1374 1034 5 ¡956 8794 6985 4323 2950 2476 1782 1205 9064 9134 8241 6107 3682 2710 1972 1451 50 9072 9189 8932 7032 4031 2967 2114 1723 El valor proporcionado en cada caso es la ingestión de 2- 3 deoxiglucosa irradiada con H que se mide en dpm (desintegraciones por minuto) Los resultados se compendian en el Cuadro 2.

Ejemplo 10: El antagonismo de fragmento 116-167 con respecto al efecto de leptina.

Se incubaron los adipocitos de rata aislados durante 17.5 horas en cultivo primario en presencia o ausencia de leptina (10 nM) y concentraciones aumentadas del fragmento de leptina 116-167. Las células luego se lavaron y se probaron para estímulo de transporte de glucosa o lipogénesis mediante 5 nM de insulina. El factor de estímulo para insulina se calculó como la relación entre la actividad estimulada por insulina y la actividad básica.

Cada valor representa el medio de dos cultivos de adipocito independientes cuya actividad se determina tres veces en cada caso.

Cuadro 3 : Leptina: 10 nM Insulina: 5 nM Fragmento Glucosa Concentración [nM] Transporte* Lipogénesis 0 3.55 1.5 0.3 3.65 1.65 1 4.5 2.15 3 5.75 2.65 10 7.75 3.1 30 10.8 3.6 100 12.55 4 300 13.2 4 Solamente insíalina 13.4 3.9 * Los factores son los cocientes de los valores después del estímulo y valores básicos Los resultados se resumen en el Cuadro 3.

Apéndice: Cuadro 4: SEQ ID NO. :4 Leptina humana 1- Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu Phe Tyr Val Gln Ala Val Pro lie Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro Gly Leu His Pro lie Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln lie Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val lie Gln lie Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys-167 Cuadro 5: SEQ ID NO.: 5 Leptina murino 1- Met Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu Ser Tyr Val Gln Ala Val Pro lie Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ala Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro Gly Leu His Pro lie Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Val Leu Gln lie Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro Glu Ser Leu Asp Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Glu Gly Ser Leu Gln Asp lie Leu Gln Gln Leu Asp Val Ser Pro Glu Cys-167 Cuadro 6: SEQ ID NO. : 6 Fragmentos 116-167 de leptina murino 116-Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro Glu Ser Leu Asp Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp lie Leu Gln Gln Leu Asp Val Ser Pro Glu Cys-167 Las dos cisteinas presentes en las secuencias mostradas en los Cuadros 4 a 6 están enlazadas mediante un puente de disulfuro.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: Hoechst Aktiengesellschaft (B) CALLE: - (C) CIUDAD: Frankfurt (D) ESTADO FEDERAL: - (E) PAÍS: Alemania (F) CÓDIGO POSTAL: 65926 (G) TELEFONO: 069-305-3005- (H) TELEFAX: 069-35-7175 (I) TELEX: (Ü) TITULO DE LA SOLICITUD: Uso de Antagonistas de Leptina para tratar resistencia a la insulina en diabetes de tipo II (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 6 (iv) FORMA LEÍBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disquete (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA DE FUNCIONAMIENTO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.25 (EPO) (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) PARTICULARIDADES: (A) NOMBRE/CLAVE: exon (B) UBICACIÓN: 1..20 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1: GAATGCAGAA TAAATAAATA 20 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 34 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) PARTICULARIDADES: (A) NOMBRE/CLAVE: exon (B) UBICACIÓN: 1..34 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: GAAAGAAGGA TCCAGTGCCT ATCCAGAAAG TCCA 34 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 34 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) PARTICULARIDADES: (A) NOMBRE/CLAVE: exon (B) UBICACIÓN: 1..34 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: GGAGAGAAGC TTGAGGGAGA GAAATGAATG ATGG 34 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 167 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) PARTICULARIDADES: (A) NOMBRE/CLAVE: Péptido (B) UBICACIÓN: 1..167 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu 1 5 10 15 Phe Tyr Val Gln Ala Val Pro lie Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys 29 25 30 Thr Leu lie Lys Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro 50 55 60 Gly Leu His Pro lie Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala 65 70 75 80 Val Tyr Gln Gln lie Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val lie Gln 85 90 95 lie Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala 100 105 110 Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu 115 120 125 Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val 130 135 140 Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln 145 150 155 160 Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys 165 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 167 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (Ü) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) PARTICULARIDADES: (A) NOMBRE/CLAVE: Péptido (B) UBICACIÓN: 1..167 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: Met Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu 1 5 10 15 Ser Tyr Val Gln Ala Val Pro lie Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys 20 25 30 Thr Leu lie Lys Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr 40 45 Gln Ser Val Ser Ala Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro 50 55 60 Gly Leu His Pro lie Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala 65 70 75 80 Val Tyr Gln Gln Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Val Leu Gln 85 90 95 lie Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala 100 105 110 Phe Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro 115 120 125 Glu Ser Leu Asp Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val 130 135 140 Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp lie Leu Gln Gln 145 150 155 160 Leu Asp Val Ser Pro Glu Cys 165 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 52 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) PARTICULARIDADES: (A) NOMBRE/CLAVE: Péptido (B) UBICACIÓN: 1..52 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro Glu Ser Leu 1 5 10 15 Asp Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu 20 25 30 Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp lie Leu Gln Gln Leu Asp Val 35 40 45 Ser Pro Glu Cys 50

Claims (21)

REIVINDICACIONES:

1. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad de antagonista de leptina terapéuticamente benéficos para el tratamiento de diabetes del Tipo II.

2. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, en donde el antagonista de leptina se deriva de una leptina humana o animal.

3. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 2, en donde el antagonista de leptina se deriva de una leptina que se selecciona del grupo que consiste de leptina humana, de rata, de ratón de cerdo y de mono antropoide.

4. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 3, en donde el antagonista de leptina se deirva de la leptina murino.

5. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 4, en donde el antagonista de leptina es ya sea un fragmento interno o de carboxi-terminal de la leptina murino.

6. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 5, en donde el antagonista de leptina es un fragmento de leptina murino que comprende la secuencia de aminoácido del Cuadro 6 (SEQ ID NO.: 6).

7. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 6, en donde el antagonista de la leptina contiene una o más substituciones de aminoácido conservadoras .

8. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 7, en donde la substitución de aminoácido conservadora ya sea intercambia un aminoácido iónico por otro aminoácido iónico o intercambia un aminoácido hidrofóbico por otro aminoácido hidrofóbico.

9. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, en donde la substitución del aminoácido conservador se selecciona del grupo que consiste de aspartato para substituciones de glutamato, glutamato para substituciones de aspartato, leucina para substituciones de isoleucina, e isoleucina para substituciones de leucina.

10. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 6, en donde el antagonista de leptina se modifica mediante una modificación química que se selecciona del grupo que consiste de acetilación, carbamoilación, formilación, biotinilación, acilación, derivación con polietilenglicol y derivación con polímeros hidrofílicos .

11. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, en donde el antagonista de leptina se selecciona del grupo que consiste de un receptor de leptina soluble, un fragmento del receptor de leptina, una fusión con un receptor de leptina soluble, y una fusión con un fragmento receptor de leptina.

12. Un método para tratar la diabetes de tipo II, que comprende administrar a un paciente en necesidad de ese tratamiento, una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de conformidad con la reivindicación 1.

13. Un método de conformidad con la reivindicación 12, en donde la composición comprende un antagonista de leptina que es un fragmento de leptina murino que comprende la secuencia de aminoácido del Cuadro 6 (SEQ ID NO. :6) .

14. Un método de conformidad con la reivindicación 13, en donde el antagonista de leptina contiene uno o más substituciones de aminoácido conservadoras .

15. Un método de conformidad con la reivindicación 12, en donde la composición comprende un antagonista de leptina que se selecciona del grupo que consiste de un receptor de leptina soluble, un fragmento receptor de leptina, una fusión con un receptor de leptina soluble y una fusión con un fragmento del receptor de leptina.

16. Un método para restablecer o amplificar el efecto fisiológico de insulina, que comprende administrar un paciente que necesita el restablecimiento o amplificación de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de conformidad con la reivindicación 1.

17. Un método de conformidad con la reivindicación 16, en donde la composición comprende un antagonista de leptina que es un fragmento de leptina murino de la secuencia de aminoácido del Cuadro 6 (SEQ ID NO. : 6) .

18. Un método de conformidad con la reivindicación 17, en donde el antagonista de leptina contiene uno o más substituciones de aminoácido conservadoras .

19. Un método de conformidad con la reivindicación 16, en donde la composición comprende un antagonista de leptina que se selecciona del grupo que consiste de un receptor de leptina soluble, un fragmento receptor de leptina, un receptor de leptina soluble y una fusión de un fragmento del receptor de leptina.

20. Un fragmento de leptina murino que comprende aminoácidos 116 a 167 o de 116 a 166 de la leptina murino.

21. Un proceso para la preparación de fragmento de leptina de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 2 a 11 y 20, en donde (a) un gen que codifica el fragmento de leptina se expresa haciendo uso de un vector apropiado/ sistema huésped; y (b) el fragmento de leptina se aisla del sistema huésped.