MXPA98001255A - Un metodo para determinar el grado de agregaciondel peptido ba4 - Google Patents

Abstract

Se describe un método para determinar el grado de agregación del péptido 5A4. El método comprende hacer reaccionar la proteína con un agente de unión adecuado, el cual es capaz de unir el péptidoáA4 solamente en su estado no agregado para formar una cantidad de reactivo de unión unido a la proteína. La cantidad de agente de unión a la proteína después es medido.

Description

UN MÉTODO PARA DETERMINAR EL GRADO DE AGREGACIÓN DEL PÉPTIDO BA4 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 1. Campo de la Invención Esta invención se refiere a un método para determinar el grado de agregación del péptido ßA4 y, más particularmente, para detectar la proteína haciendo reacciona la proteína con un reactivo de unión adecuado y midiendo la cantidad de reactivo de unión sin reaccionar. 2. Discusión de la Técnica Anterior Se sabe que el cerebro de paciente que tienen la enfermedad de Alzheimer contiene agregaciones o grupos de un pequeño fragmento de la proteína precursora beta-amiloide, dicho fragmento es conocido como el péptido beta amiloide o péptido ßA4. La secuencia de péptido de 42-mer del péptido ßA4 es Aspartato-Alanina-Glutamato-Fenilalaninia.Arginina-Hitidina, Aspartato-Serina-Glicina-Tirosina-Glutamato-Valina-Histidina-Histi ina-Glutamina-Lisina-Leucina-Valina-Fenilalanina-Fenilalanina-Alanina-Glutamato-Aspartato-Valina-Glicina-Serina-Asparigina-Lisina-Glicina-Alanina-Isoleucina-lsoleucina-Glicina-Leucina-Metionina-Valina-Valina-Isoleucina-Alanina. (DAFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLM VGGVVIA). Para una discusión aeneral sobre el DéDtido BA4 v la enfermedad de Alzheimer, se hace referencia a Dennis J. Seiko, Scientific American , Noviembre de 1991 , 68-78 y Joseph T. Jarrett y otros, Celt. Vol 73, 1055-1058 (1993) . G. Johnson y otros, describen en WO 95/05604, publicada el 23 de Febrero de 1995, un método para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer. El método utiliza un grupo único de proteínas, las cuales se ha encontrado que son alteradas en concentración en pacientes con la enfermedad de Alzheimer. La invención de Johnson y otros también se refiere a estas proteínas y sus anticuerpos. También se describen equipos que pueden ser usados para la prueba de diagnóstico. Un tratamiento potencial para combatir el progreso de la enfermedad de Alzheimer es utilizar un fármaco que comprende un ingrediente activo, el cual evita la agregación o agrupación del péptido ßA4. Por consiguiente se necesita una prueba de clasificación para identificar dicho ingrediente activo o compuesto químico efectivo. Existen varios ensayos conocidos en la técn ica para detectar proteínas per se . Uno de estos ensayos involucra el uso de colorante de Bradford , o como es conocido también como Azul Brillante Coomassie G250. A este respecto, se hace referencia a J . J ames Sedmak y otros, Analysis Biochemistry, 79, 544-552 ( 1977) , quien describe un ensayo para proteínas pero no para el péptido A4, si está en un estado agregado o libre . Lo que se requiere y desea es un ensayo para el péptido ßA4 , el cual distinga dicha proteína en el estado agregado de cuando está en el estado libre o no agregado, y refleje el efecto de varios compuestos en dicho estado agregado. A este respecto, H . LeVine, Protein Science, 2_, 404-410 (1993) describe la detección de amiloide agregado empleando Tiofiavina T.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra el grado de no agregación del péptido ßA4 con el tiempo. La Figura 2 ilustra el grado de no agregación del péptido ßA4 en términos de una característica medible del grado de no agregación .

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a un método para determi nar el grado de agregación del péptido ßA4 y, más particularmente, el método que comprende hacer reaccionar la proteína con un agente de unión adecuado, el cual es capaz de unir el péptido ßA4 solamente en su estado no agregado para formar una cantidad de proteína unida al reactivo de unión . La cantidad de la proteína unida al agente de unión entonces es medida.

DESCRIPCIÓN DETALLADA Se sabe que el cerebro de los pacientes con la enfermedad de Alzheimer, según comparado con el cerebro de individuos sin la enfermedad de Alzheimer, ha presentado una proteína amiloide de 39-42 aminoácidos conocida como el péptido ßA4. Esta proteína se agrupa o se agrega en el cerebro de dichos pacientes con la enfermedad de Alzheimer, por lo que la proteína agregada puede ser responsable de la destrucción de células normales del cerebro. Una vez que se forman los grupos o agregados de aniquilación, la formación es casi irreversible. Por consiguiente, un tratamiento potencial para la enfermedad de Alzheimer es tratar al paciente con un compuesto o fármaco, el cual evite el grupo o la agregación del péptido ßA4. Se ha descubierto que los compuestos potenciales para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer pueden ser identificados a través de una prueba de clasificación, la cual indica si los compuestos que son seleccionados como candidatos inhiben o no la agregación del péptido ßA4, in vitro. Un agente de unión adecuado es seleccionado. Un reactivo de unión adecuado es uno que selectivamente reacciona ya sea con el péptido amiloide no agregado, es decir, ßA4, o con el péptido amiloide agregado, pero no con el compuesto candidato que se está clasificando, y el cual en su forma reaccionada, es decir, que reaccionó con el péptido, exhibe una característica medible, por ejemplo, absorbancia de luz a una longitud de onda particular. Algunos reactivos de unión adecuados incluyen el colorante Bradford, o el Azul Brillante Coomassie G250, Rojo Congo y Tioflavina T. Un reactivo de unión particularmente adecuado es el colorante Bradford. El colorante Bradford es Azul Brillante Coomassie G250. El colorante Bradford o colorante azul Coomassie se describe por M . Bradford , Anal. Biochem .. 72 , 248 ( 1976); A . H . Reisner y otros, Anal. Biochem.. 64. 509 (1975); S. Fazukes de St. Groth y otros, Biochem. Biophvs. Acta. 71 . 377 (1963) y J . J . Sedmak y otros, Anal. Biochem. 79. 544 (1977) , y está comercialmente dispon ible como un reactivo normal , (v. gr. , Protein Assay Dye Reagent Concéntrate (Concentrado de Reactivo de Colorante de Ensayo de Proteína) disponible de Bio-Rad Life Science G roup, Hercules, California) . Este colorante reacciona solamente con un ßA4 no agregado y no con ningún agregado de este péptido amiloide . El colorante Bradford ha sido descrito, como se indicó anteriormente, por Marión M. Bradford en Analvtical Biochemistrv . 72 , 248-254 (1976) , como 0.01 % (peso/volumen) (p/v) de Azul Brillante Coomassie G-250, 1 .7% (p/v) de etanol, y 8.5% (p/v) de ácido fosfórico . El Protein Assay Dye Reagent Concéntrate, comercialmente disponible de Bio-Rad como el número de catálogo 500-0006, es una versión modificada del colorante Bradford , con aproximadamente 0.04% (p/v) de Azul Brillante Coomassie G-250 disuelto en 25% de metanol, 50% de ácido fosfórico y 25% de agua. Las modificaciones lo hacen más estable, con vida al almacenamiento más larga, y menos bio-peligroso debido al contenido reducido de ácido fosfórico, sin afectar adversamente sus propiedades de unión a la proteína. También está disponible en una forma de equipo con uno de las dos normas, o como Kit I (Equipo I) (con gama globulina de bovino) número de catálogo 500-0001 , como Ki II (Equipo I I) (con albúmina de suero de bovino) número de catálogo 500-0002. Durante la práctica, se prepara una concentración conocida del péptido amiloide, es decir, el péptido ßA4 , en su forma no agregada. El péptido amiloide ßA4 en su estado no agregado, se obtiene a través de síntesis de péptido usando un sintetizador de péptido convencional , v. gr. , un sintetizador de péptido MI LLIPORE™ modelo 9050. Por ejemplo , se disuelven 10 miligramos de péptido en un solvente orgánico adecuado , tal como sulfóxido de dimetilo (DMSO) o acetonitrilo a una temperatura adecuada, por ejemplo de 20 a 25°C, para formar una solución de existencia, por ejemplo , 2,500 mM. La solución de existencia, es típicamente diluido, por ejemplo 10 veces, en salina regulada en su pH con fosfato (pH 7.4) para hacer una solución de control , por ejemplo de 250 mM. Se toma una primera alícuota, por ejemplo de 16 mi, de la solución de control , típicamente con 144 mi de la salina regulada en su pH con fosfato , y reacciona típicamente con 25 mi de un reactivo de unión adecuado, por ejemplo, colorante Bradford, por lo que el reactivo de unión reacciona con la proteína amiloide no agregada para formar una primera concentración o cantidad de reactivo de unión unido a la proteína. La reacción con el reactivo de unión es conducida bajo condiciones, por lo que el agente de unión selectivamente sólo se unirá a la proteína no agregada. Por consiguiente, las condiciones de reacción serán dictadas por el agente de unión particular empleado y qué característica va ser medida. Por ejemplo , cuando se emplea el colorante Bradford, la reacción de unión se realiza típicamente a una temperatura de 20 a 25°C durante 5 a 15 minutos n un ambiente neutro o ligeramente básico , es decir, a un pH que varía de 7.0 a 7.4. Se debe observar que la primera concentración o cantidad de reactivo de unión unido a la proteína se mide a través de medios detectores adecuados, los cuales dependen de la característica que exhibe el agente de unión ya reaccionado, por ejemplo 0.7 de absorbancia a una longitud de onda de 595 nm para el colorante Bradford, para dar un primer valor X^ Se selecciona una segunda alícuota de la solución de control. Ya que la agregación de ßA4 ocurre con el tiempo , la segunda alícuota se deja incubar a una temperatura adecuada , por ejemplo, aproximadamente 37°C, durante un período adecuado, por ejemplo de 24 a 72 horas, para formar agregados de la misma , después el reactivo de unión se añade a la misma y reacciona solamente con el péptido amiloide no agregado para formar una segunda concentración o cantidad de proteína unida o reactivo de unión . La concentración o cantidad agregada del péptido amiloide no reacciona con el agente de unión y, de esta manera, no es detectado o medido.

Otra vez, la cantidad de reactivo de unión unido a la proteína es medida, por ejemplo, a través de espectroscopia de absorbancia a una longitud de onda adecuada, por ejemplo 595 nm para el colorante Bradford, a temperatura ambiente para obtener un segundo valor X2, que representa la cantidad de reactivo de unión, el cual ha reaccionado con la cantidad no agregada de ßA4. A medida que ocurre la agregación , la concentración de la proteína unida o el reactivo de unión reaccionado, es inversa al grado de agregación que ha ocurrido. Por consiguiente, el segundo valor X2 es menor que Xi , indicando que ha ocurrido un cierto grado de agregación del péptido A4. Para propósitos de una clasificación cualitativa para compuestos candidatos para Alzheimer, se toma una tercera alícuota igual de la solución de control . La tercera alícuota otra vez se deja incubar bajo condiciones adecuadas en presencia del compuesto candidato, por ejemplo, durante 48 horas a 37°C, después el agente de unión adecuado, por ejemplo el colorante Bradford , es añadido a la misma y la solución o mezcla resultante se mide, por ejemplo, espectroscópicamente , con un espectrofotométro convencional , para obtener un valor de un reactivo de unión unido. Si el compuesto candidato no tiene ningún efecto anti-agregante entonces el valor medido X3, aproximadamente será igual al segundo valor X2. Si , por otro lado, el tercer valor X3 exhibe un incremento del treinta al cuarenta por ciento (30-40%) sobre aquel de X2, entonces el compuesto candidato se considera que es u n compuesto que inhibe la agregación del péptido amiloide . Para llevar a cabo las pruebas de clasificación anteriores , la concentración de péptido amiloide para el reactivo de unión seleccionado debe variar típicamente de 1500 a 1800 (péptido amiloide/reactivo de unión) . La concentración del péptido amiloide al compuesto candidato debe variar típicamente de 4 a 40 veces (compuesto candidato/péptido amiloide) . El grado de agregación puede ser cuantitativamente determinado de la siguiente manera. Primero, las alícuotas iguales de la solución de control son incubadas durante varios períodos. A medida que el tiempo aumenta , el grado de agregación se incrementa. El agente de unión , por ejemplo el colorante Bradford , se añade después de cada vez y de que se hace la medición , por ejemplo, midiendo la absorbancia a una longitud de onda de 595 n m para el colorante Bradford . Después, la concentración o porcentaje de la proteína amiloide agregada contra la proteína amiloide no agregada es determinado para cada período. El agente de unión mide la proteína no agregada (o agregada) . La cantidad de agregación del ß-amiloide se calcula substrayendo este número de la proteína fresca (no agregada, Xi) y se expresa como un porcentaje. Se obtiene una gráfica inversa lineal del porcentaje de péptido agregado durante varios período , por ejemplo 24, 48, 72 , 96 horas, como se muestra típicamente en la Figura 1 . El procedimiento se repitió, excepto aquel después del período de i ncubación que el agente de unión es añadido a la alícuota incubada y la mezcla resultante se mide para determinar los valores de X. Así, se puede establecer entonces una correlación entre la agregación y la no agregación, en términos de un valor de X, con relación a la lectura espectroscópica, por ejemplo, absorbancia a una longitud de onda de 595 nm para el colorante Bradford, como se ilustra en la Figura 1. Después se obtiene una gráfica normal de la lectura de X para el porcentaje de no agregación , por lo que el porcentaje de agregación es inversamente obtenido, como se muestra típicamente en la Figura 1 . Los valores de X para un compuesto candidato particu lar entonces pueden ser cuantitativamente determinados en términos de porcentaje de inhi bición de agregación comparando con el control , como se ilustra típicamente en la Figura 2.

EJEMPLO 1 Se disolvió el péptido ß-amiloide (también conocido como ßA4) en 100% de sulfóxido de dimetilo (DMSO) a una concentración de 10 mg/ml (o 2500 µM). La solución resultante se diluyó a una solución de existencia de 1 mg/ml (o 250 µ M) en salina regulada en su p H con fosfato (PBS) , pH 7.4, justo antes de realizar el ensayo y surtir en las cavidades individuales de muestra de una placa de Corning de 96 cavidades a 16 µl por cavidad (es decir, una concentración final de 25 µM). Todos los tratamientos se realizaron por triplicado. En este ejemplo, el compuesto candidato se añadió a las cavidades de prueba a tres diferentes concentraciones (250 µM, 500 µM y 1 mM). El volumen total en cada cavidad se llevó hasta 160 µl con PBS. Para cavidades de control no tratadas, no se añadió ningún compuesto al péptido ß-amiloide, y el volumen total se hizo a 160 µl con PBS. Las placas fueron selladas con parapelícula y se incubaron a 37°C durante 48 horas. Al final del período de incubación, las placas fueron sacadas y se añadieron 25 µl del reactivo de colorante del ensayo de proteína de Bio-Rad (colorante Bio-Rad) a todas las cavidades con muestras. También se fijó una curva normal en ese momento para la estimación de la absorbancia de péptido fresco (también considerado como no agregado) . El colorante se mezcló y las placas se hicieron girar rápidamente a 2500 rpm para remover las burbujas. La Absorbancia se leyó a 595 nm en un lector de placa Cynatech MR5000, 15 m inutos después de añadir el colorante. La reducción del porcentaje en la agregación de ß-amiloide debido a la adición del compuesto candidato A41920t, el cual es un péptido 8-mer de la secuencia de Glutamina- Lisina-Leucina-Valina-Treonina-Treonina-Alanina-Glutamato (QKLVTTAE) , fue calculado a partir de la d iferencia entre el péptido agregado no tratado y el péptido agregado tratado. Se encontró que la reducción del porcentaje fue de 48.1 % con 250 µM de A41920t, 52.44% con 500 µM y 32.26% con 1 µM (o 1000 µM) .

EJEMPLO 2 Se repitió el procedimiento del ejemplo 1 , excepto que se añadió peróxido de hidrógeno (10 µl de 30% de solución de existencia) a las cavidades en una placa de 96 cavidades con 16 µl de la solución de existencia de 1 mg/ml de ß-amiloide. El volumen final entonces se llevó a 160 µl añadiendo 134 µl de PBS a estas cavidades. La placa se selló y se incubó a 37°C durante 48 horas . Al término del período de incubación, las placas se sacaron y se añadieron 25 µl del reactivo de colorante del ensayo de proteína de Bio-Rad (colorante Bradford) a todas las cavidades con muestras , como en el Ejemplo 1 . Se usó otra vez una curva normal usada para la estimación de absorbancia de péptido fresco (también considerado como no agregado). El colorante se mezcló a través de una pipeta y las placas se hicieron girar rápidamente a 2500 rpm para remover las burbujas. La absorbancia se leyó a 595 nm en el lector de placa Cynatech MR5000, 15 minutos después de añadir el colorante . La cantidad de agregación se esti mó substrayendo lo anterior y tomando la diferencia entre las lecturas de ß-amiloide fresco y tratado con peróxido de hidrógeno. La diferencia fue expresada como porcentaje sobre péptido fresco o no agregado . Se encontró que el porcentaje de agregación fue de 97.7% después de 48 horas.

EJEMPLO 3 Se repitió el procedimiento del Ejemplo 2, excepto que el peróxido de hidrógeno se substituyó por glicosamin glicano, polisulfato de pentosa. Se encontró que el porcentaje de incremento de agregación fue de 40.8% con 0.5 µM, 57.1 % con 5 µM y 62.9% con 50 µM.

EJEMPLO 4 Se repitió el proced imiento del Ejemplo 1 , excepto que A41920t se substituyó por 1 -(5'-oxohexil)-3-metil-7-propil-2 ,6-(1 H , 3H)-purindiona. Se encontró que el porcentaje de reducción de agregación fue de 26.6% con 500 µM y 37.4% con 1 µM (o 1000 µM).

LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: Hoechst Marión Roussel, Inc. (B) CALLE: 2110 E. Galbraith Rd., P.O. Box 156300 (C) CIUDAD: Cincinnati (D) ESTADO: Ohio (E) PAÍS: Estados Unidos de Norteamérica (F) CÓDIGO POSTAL (ZONA): 45215-6300 (G) TELEFONO: 513-948-7369 (H) TELEFAX: 513-949-7961 (I) TELEX: 214320 (ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Un Método Para Determinar el Grado de Agregación del Péptido ßA4 (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 1 (iv) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: disco flexible (B) COMPUTADORA: IMB PC Compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (EPO) (iv) DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/515,606 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 16 de Agosto de 1995 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 42 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUCTURA DE CADENA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 1: Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie He 20 25 30

Claims (2)

REIVINDICACIONES

1.- Un método para determinar el grado de agregación de un péptido ßA4 (SEC ID NO: 1), el cual comprende: (a) hacer reaccionar una muestra que contiene un péptido ßA4 libre con un reactivo de unión adecuado, el cual es capaz de unirse al péptido ßA4 solamente en su estado no agregado ara formar una cantidad de una muestra de reactivo de unión unida a la proteína; (b) medir dicha muestra de reactivo de unión unida a la proteína para obtener una medición, la cual se correlaciona a la cantidad de reactivo de unión unido a la proteína presente.

2.- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho reactivo de unión adecuado es uno el cual exhibe una diferencia medible en características espectrales en su estado libre de proteína de aquel de su estado de unión de proteína. 3 - El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el reactivo de unión comprende un colorante Azul Brillante Coomassie G-250. 4.- Un método para determinar un compuesto, el cual inhibe la agregación de un péptido ßA4 (SEC ID NO: 1), el cual comprende: (a) hacer reaccionar una muestra que contiene el péptido ßA4 libre con un reactivo de unión adecuado, el cual es capaz de unirse al péptido ßA4 solamente en su estado no agregado durante un período adecuado para formar un reactivo de unión unido a la proteína para formar una cantidad de una muestra de reactivo de unión unido a la proteína; (b) medir dicha muestra reactivo de unión unido a la proteína para obtener una primera medición de referencia, la cual se correlaciona con la cantidad de reactivo de unión unido a la proteína presente; (c) hacer reaccionar una segunda muestra conteniendo el péptido ßA4 libre con un compuesto candidato seleccionado durante un período adecuado para formar una muestra de prueba y añadir un reactivo de unión adecuado, el cual es capaz de unirse al péptido ßA4 solamente en su estado no agregado ?a¡a formar una cantidad de una muestra de prueba de reactivo de unión unido a la proteína; y (d) medir dicha muestra de prueba para obtener una segunda medición de referencia para determinar el grado de diferencia entre dichas primera y segunda mediciones de referencia. 5 - El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicho reactivo de unión adecuado es uno que exhibe una diferencia medible en características espectrales en su estado libre de proteína de aquel de su estado de unión de proteína. 6.- El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicho reactivo de unión adecuado comprende el colorante Azul Brillante Coomassie G-250.