USO DE BENZOPIRANONAS TRISUSTITUIDAS
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere al uso de benzopiranonas trisustituidas para el tratamiento o la profilaxis de estados patológicos, que se presentan con tensión oxidativa y/o reacciones inflamatorias así como nuevas benzopiranonas trisustituidas y sus sales fisiológicamente aceptables. La invención se refiere además a los extractos vegetales, medicamentos, alimentos dietéticos y preparaciones que contienen esos compuestos. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los radicales libres son átomos o moléculas que tienen un electrón libre en la órbita exterior. El radical libre más significativo para los procesos biológicos es el oxigeno molecular, que puede formar por medio de la reducción de los metabolitos más diferentes, que por lo general se incluyen en el concepto general de compuestos reactivos de oxígeno (ROS) . A los ROS pertenecen por ejemplo los aniones de superóxido, los radicales hidroxilo, el peróxido de hidrógeno, los aniones de peróxido, el oxigeno sencillo, hipocloruro, óxido de nitrógeno y peroxinitrito . Los ROS se forman espontáneamente por medio de diferentes procesos biológicos. De significado especial es la llamada "explotación respiratoria" de los leucocitos, en los cuales después de la estimulación de las células con microorganismos, xenobióticos o materiales endógenos por medio de la activación de una oxidasa de NADPH de la membrana de oxígeno molecular se obtiene el radical superóxido y otros ROS como productos secundarios. El estallido exploratorio es uno de los mecanismos más importantes de la respuesta inmune temprana no específica y sirve sobretodo para matar a los promotores infecciosos existentes y a las células tumorales. Además ROS se forman sobretodo por medio de las fugas de electrones de reacciones insuficientemente acopladas. Esto sucede por ejemplo en la síntesis de prostaglandmas y leucotrienos de ácido araguidónico, durante la respiración mitocondrial, bajo condiciones ísguémica por medio de la oxidación catalizada por xantinoxidasa de hipoxantma o en el transcurso de la metabolización promovida por el citocroma P450 de los materiales extraños. Durante la explosión respiratoria en la cual la defensa contra la infección representa una reacción indeseable, la formación elevada y constante de ROS es por lo regular desventajosa, ya que el ataque oxidativo no solo está limitado a los microorganismos penetrantes sino también a los tejidos propios del cuerpo que libera su potencial tóxico. Esto se aplica en especial en el caso de las enfermedades infecciosas, como por ejemplo la elevada formación de ROS durante las enfermedades autoinmunes, en el caso de las enfermedades degenerativas, durante una isquemia durante la metabolización de productos farmacéuticos. Los efectos mdeseados de los radicales libres y ROS se basan en el efecto reciproco con lo ácidos nucleicos (por ejemplo la inducción de interrupciones en las tiras de ADN) , proteínas (por ejemplo desnaturalización, inactivación de sistemas enzimáticos), carbohidratos (por ejemplo despolimepzación de los ácidos hialurónicos ) y sobre todos lípidos (por ejemplo peroxidación de lípidos, daños a membranas, formación de prostaglandmas y leucotrienos proinflamatorios ) . Después de que ya hace casi 50 años se postulo la participación de los compuestos reactivos de oxígeno (ROS) sobre la patogénesis de diferentes enfermedades, hay en día se asegura gue esas moléculas tienen un papel importante en la patogénesis de numerosas enfermedades, como por ejemplo diabetes Mellitus tipo I y II, enfermedades inflamatorias (por ejemplo artritis reumatoide, asma, colitis ulcerosa, soriasis), infecciones bacterianas y virales (por ejemplo influenza, SIDA, hepatitis viral) , ateroesclerosis, isquemias, enfermedades neurológicas (por ejemplo enfermedad de Alzheimer, mal de Parkmson y otras enfermedades neurodegenerativas), cataratas, anemia falciforme y enfermedades tumorales, pero también son responsables de procesos de envejecimiento (A. Bendlich (1994) en: B. Frei "Natural Antioxidants in Human Health and Disease" Academic Press, San Diego, página 447; E. Peterhans (1997) J. Nutrí. 127, 962 S; D.V. Parke (1999) en: T.K. Basu et al. "Antioxidants in Human Health", CAB International, página 1) . Para protegerse contra los efectos dañinos de los radicales libres y ROS posee el organismo diferentes sistemas de defensa. Entre ellos se cuentan las vitaminas (por ejemplo vitamina E y C) y otros compuestos de bajo peso molecular (por ejemplo glutatión, ácido úrico) , enzimas antioxidantes (por ejemplo dismutasa de superóxido, catalasa y peroxidasa de glutation) así como proteínas formadoras de metales (por ejemplo transferrina, ceruloplasmina) . Frecuentemente los sistemas antioxidantes propios del cuerpo son efectivos durante las fases iniciales de los procesos patológicos, ya gue con las concentraciones elevadas de ROS que se forman continuamente en los procesos patológicos, aumenta ampliamente la capacidad de los mecanismos de protección endógenos. Bajo tensión oxidante se entiende así una desproporción entre la concentración de ROS y los sistemas de defensa antioxidantes. Debido a la sobresaliente importancia de ROS para numerosas enfermedades existe un interés extraordinario en las sustancias con propiedades antioxidantes, que pueden utilizarse para la profilaxis y la terapia de esos estados patológicos. Ya que ROS tiene un significado especial para las reacciones inflamatorias y la tensión oxidante frecuentemente se presenta con una síntesis elevada de los eicosanoides proinflamatorios (por ejemplo prostaglandinas, leucotrienos) y citocinas (por ejemplo IL-1, TNF-a, IL-6) , existe una necesidad especial de sustancias que no solo presentan propiedades antioxidantes sino adicionalmente inhiben la formación de esos mediadores inflamatorios . SUMARIO DE LA INVENCIÓN La tarea de la presente invención es la preparación de compuestos para el tratamiento y la profilaxis de enfermedades, que se presentan con tensión oxidantes y/o reacciones inflamatorias. Esa tarea se resuelve por medio del uso de compuestos de la fórmula general I
I
En la cual los radicales R6, R7 y R8 independientemente entre sí significan H o S03H, así como sus sales fisiológicamente aceptables para el tratamiento o la profilaxis de los estados patológicos, que se presentan con tensión oxidante y/o reacciones inflamatorias. Sorprendentemente se determino que 6,7,8-tph?drox?-2H-l-benzop?ran-2-ona (compuesto II) presenta propiedades farmacológicas ventajosas. Además de los potentes efectos antioxidantes el compuesto inhibe además la síntesis de leucotpenos y prostaglandmas así como citocinas promflamatorias Il-lß, TNF-a e IL-6. El compuesto II por lo tanto es básicamente adecuado para el tratamiento y la profilaxis de enfermedades que se presentan con la tensión oxidante como por ejemplo Diabetes Mellitus tipo I y/o II, ateroesclerosis y disfunción endotelial, isquemias, enfermedades neurológicas (por ejemplo enfermedad del Alzheimer, mal de Parkmson y otras enfermedades neurodegenerativas), cataratas y enfermedades tumorales. El compuesto II también es especialmente ventajoso para los estados patológicos con un componente inflamatorio como por ejemplo artritis reumatoide, asma, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, soriasis, neurodermatitis, así como infecciones por medio de bacterias, virus (por ejemplo influenza, SIDA, hepatitis viral) y otros promotores (por ejemplo parásitos, hongos y priones) . El compuesto II se describe ciertamente en la literatura (O. Kayser y H. Kolodziej , Phytochemistry 39, 1181-1185 (1995); S. Kumar, A.B. Ray, C. Konno, Y. Oshima y H. Hikino, Phytochemistry 27, 636-638 (1988); K.P. Latte, O. Kayeser, N.Tan, M. Kaloga y H. Lodziej, Z. Naturforsch. 55c, 528-533 (2000)) . Sin embargo no se conocen hasta ahora efectos farmacológicos de los compuestos II. En Pelargonum sidoides está contenido el compuesto II en una concentración de solo 0.0004% (Kayser et al.; Latte et al, ver arriba) y en Pelargonium reniforme solo en 0.02% (Latte et al, ver arriba), de lo cual se concluye que el compuesto II en esta concentración baja no contribuye de forma considerable a la efectividad biológica de Pelargonium sidoides o reniforme . BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra la influencia del compuesto II y Trolox sobre la auto-oxidación de los lípidos. Se muestra la inhibición porcentual de la peroxidación de los lípidos en comparación con un control de solvente de tres pruebas independientes (valor medios + SD) .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El objeto de la presente invención es por lo tanto el uso del compuesto II para el tratamiento o la profilaxis de los estados patológicos que se presentan con la tensión oxidante y reacciones inflamatorias . También es posible administrar el compuesto II en forma de esteres de ácido sulfúrico de la fórmula general I, ya que este libera el compuesto II con la administración oral. Por esta razón también son adecuados los compuestos de la fórmula general I para el tratamiento o la profilaxis de los estados patológicos antes descritos . Los compuestos preferidos de la fórmula general I son 6, 7-d?h?drox?-8-sulfox?-2H-l-benzop?ran-2-ona (R6=R7=H; R8=S03H) y
7 , 8-d?h?drox?-6-sulfox?-2H-l-benzop?ran-2-ona (R=R8=H; R6=S03H) . Especialmente se prefiere 6,8-bis (sulfoxi) -7-h?drox?-2H-l-benzop?ran-2-ona (R6=R8=
S03H; R=H; compuestos III) . Los compuestos de la fórmula general I, en la cuaJ cuando menos uno de los radicales R6,R7 o R8 es un radical S03H, son nuevos. Estos y en especial el compuesto III, asi como su uso para el tratamiento o la profilaxis de estados patológicos, que se presentan con tensión oxidativa y/o reacciones inflamatorias son por lo tanto una parte constitutiva de la presente invención.
En la fórmula general I los radicales R6, R7 y R8 independientes entre sí son un átomo de hidrógeno o un radical de S03H . Los compuestos de la fórmula general I, así como los compuestos II y II pueden encontrarse también en forma de sales alcalinas, alcalinotérreas u otras, por ejemplo sales de potasio . Una parte constitutiva de la invención son los extractos vegetales en especial del tipo de pelargonio, que contienen uno o varios compuestos de la fórmula general I, en la cual cuando menos uno de los radicales R6, R7 y R8 es un radical de S03H, así como las preparaciones farmacéuticas producidas. Se prefieren aqui aquellos extractos en los cuales la concentración de cuando menos uno de los compuestos de la fórmula general I en la parte seca de los extractos vegetales se encuentra entre 0.1% y 10% especialmente preferido entre 0.5% y 5%. La fracción seca corresponde aqui al residuo seco de acuerdo con Ph . Eur. (extractos fluidos), pudiéndose realizar los análisis también directamente por ejemplo en el extracto fluido y para el residuo seco se considera solo por medio de cálculos . La producción del compuesto II puede realizase por medio de hidrólisis y/o disociación de éter por ejemplo de Fraxin comercial o por medio de un compuesto de la fórmula I, en la cual cuando menos uno de los radicales R6, R7 y R8 es un radical de S03H. La producción de aquellos compuestos de la fórmula general I, en la cual cuando menos uno de los radicales R6, R7 y R8 es un radical de S03H, puede realizarse por medio de la reacción de compuestos II con complejo de trióxido de azufre-triemet ilamina o en caso de los compuestos III, por medio de aislado de materiales vegetales adecuados, por ejemplo de raíces secas de Pelargonio sidoides . Los compuestos 6, 7-dihidroxi-8-sulfoxi-2H-l-benzopiran-2-ona (fórmula general I, R6=R7=H; R8=S03H) y 7 , 8-dihidroxi-6-sulfoxi-2H-l-benzopiran-2-ona (fórmula general I, R7=R8=H; R6=S03H) pueden también obtenerse por medio de hidrólisis parcial de los compuestos III. Los extractos de pelargonio de acuerdo con la invención o sus fracciones vegetales pueden producirse de acuerdo con procedimientos de producción conocidos con composiciones variables con solventes como por ejemplo agua, metanol, etanol, acetona, etc., y sus mezclas a temperaturas que van desde la temperatura ambiente a 60° C bajo agitación moderada a vigorosa o por medio de percolación en el transcurso de 10 minutos a 24 horas. Los solventes de extracción preferidos son aquí agua o mezclas de etnaol y agua y cuando menos 50% de fracción de agua, especialmente en una proporción etanol/agua = 10/90 a 15/85 (p/p) . Para enriquecer los compuestos de la fórmula I de acuerdo con la invención pueden someterse a otras etapas de concentración como por ejemplo distribución de líquido en líquido con por ejemplo 1-butanol/agua o acetato de etilo (agua, adsorción-desorbción en intercambiadores iónicos, LH20, HP20 y otras resinas o la separación cromatográfica a través de RP18, gel de sílice, etc. En caso de que se desee su posterior elaboración para producir extractos secos, esto se realiza de acuerdo con un procedimiento conocido por medio de la extracción de la temperatura elevada y/o presión reducida o por medio de liofilización. Los extractos secos de acuerdo con la farmacopea europea tienen por lo general un residuo seco de cuando menos 95% en peso . Los compuestos de acuerdo con la invención de la fórmula general I o los extractos que contienen cuando menos uno de esos compuestos pueden preferentemente administrarse oralmente en forma de polvos, granulados, tabletas, grageas o cápsulas p también en forma de solución. La dosificación tiene lugar de tal forma que por día se administran 0.1 mg a 250 mg, preferentemente 0.3 mg a 50 mg de uno o varios compuestos de la fórmula general I. La producción de tabletas se utiliza cuando menos uno de los compuestos de la fórmula general I o el correspondiente extracto con aditivos farmacéuticamente aceptables como por ejemplo lactosa, celulosa, dióxido de silicio, croscaramelosa y estearato de magnesio y se comprime en forma de tabletas, que eventualmente se proveen con una cubierta adecuada, por ejemplo de hidroximetilpropilcelulosa, polietilenglicol, colorantes (por ejemplo dióxido de titanio, óxido de hierro) y talco. La efectividad del compuesto II en el caso de estados patológicos, que se presentan con tensión oxidante y/o reacciones inflamatorias, se demuestra por medio de las siguientes pruebas descritas. Propiedades Anti-oxidantes La auto-oxidación de los lípidos se asocia con la emisión de luz. La determinación de esa quimioluminiscencia ultra-débil puede también utilizarse para la cuantificación de peróxidos como también para evaluar la efectividad de los antioxidantes. Como tejido rico en lípidos sirvió en los siguientes experimentos, el tejido cerebral de ratones macho (NMRI : 20-30 g; Centre d'Elevage Janvier, Le Genest-Saint Isle, Francia) . Después de la extracción el cerebro se lavó con solución fisiológica de sal común (PBS, pH 7.4) y se retiraron las meninges y los residuos de sangre. Las muestras de tejido se homogeneizaron en un volumen cuádruple (v/p) de PBS y se centrifugaron durante 10 minutos a lOOOxg y 4o C. Las natas se diluyeron inmediatamente con el mismo amortiguador al triple de su volumen y se conservo sobre hielo. 250 µl de residuo diluido se transfirieron a un tubo de ensayo y se incubaron durante 10 minutos a 37° C en un lumino etro de 6 canales (Multi-Biolumat LB 9505 C, Berthold, Bad Wildbad) . Después de agregar 25 µl del compuesto II en PBS con 2.5% DMSO se continuo con la incubación durante otros 10 minutos. Después se determinó la intensidad de la quimiolummiscencia (CL) durante un periodo de 60 minutos. La inhibición porcentual de la auto-oxidación se calculo en comparación con un control de solvente medido simultáneamente (PBS con 2.5% de DMSO) . El compuesto II inhibido la auto-oxidación de los lipidos de una forma extremadamente potente con una concentración de inhibición máxima media de 53 ng/ml (ilustración 1) . La sustancia comparativa Trolox frecuentemente usada al determinar las propiedades antioxidantes , mostró por el contrario solo una concentración de inhibición máxima media de 1665 ng/ml. Inhibición de la Síntesis de citocmas promflamatorias : Se determinó la influencia del compuesto II sobre la síntesis de las citocmas pro-inflamatorias IL-1, TNF-a, IL-6, utilizando macrófagos perifonéales activados con murmas . Para la obtención de los macrófagos activados, ratones NMRI machos (Centre d'Elevage Janvier, Le Genest-Saint Isle, Francia) . Se inyectaron peptonealmente con 3xl09 bacterias muertas de Corynbakterium parvum (Changzhou Yanshen CO . Ltd., Changzhou, China) en 0.5 ml de PNS . La cavidad abdominal se enjuago 6 días después con 2.5 ml de solución salina balanceada de Hank (HBSS) sin calcio ni magnesio utilizando 10 U/ml de heparma. Las células se resuspendieron en una concentración de 2xl06 células /ml en medio RPMl completo con la adición de 10% de suero de bovino fetal. Cada vez 200 µl de la suspensión celular se introdujo en las cavidades de placas de microtí ulación con 96 pozos. Después de una fase de incubación de 2 horas se separaron las células no adherentes y las capas celulares restantes se lavan dos veces con medio de cultivo (37° C) . Los macrófagos se re-incubaron durante 30 minutos con el compuesto II y se indujo la síntesis de citocinas pro-mfla atorias por la adición de 1 µg/ml de liposacáridos de E. coli (Serotyp 0127 :B8, Sigma, Deisenhofen) . Después de una incubación durante 24 horas (37° C, 5% C02 al aire), las células se rompieron por medio de tres ciclos de congelación y descongelación, se recuperaron las natas celulares y se congelaron a -80° C hasta su análisis. La determinación de la concentración de citocinas en las natas celulares se realizó por medio de equipos de prueba comerciales (Duosets IL-1, TNF-a y IL-6, R&D, iesbaden) de acuerdo con las indicaciones del productor. Todas las investigaciones se realizaron por triplicado. La influencia del compuesto II sobre la síntesis de las citocinas se evalúo en comparación con los controles de solventes examinados en paralelo (0.1% DMSO en medio RPMl completo) . Como se desprende de la siguiente tabla 1, el compuesto lia una concentración de 100 µg/ml produjo una inhibición significante de la síntesis de las tres citocinas medidas, siendo el efecto sobre la producción de IL-6 la más fuertemente marcada. Tabla 1: Influencia del compuesto II sobre la síntesis de citocmas pro-inflamatorias en macrófagos activados peritoneales de ratón. Se muestran los valores medios + SD de tres cargas de prueba paralelas. El efecto del compuesto II se calculó como la modificación porcentual en comparación con un control del solvente (* posibilidad de error P<0.05, prueba t) .
Inhibición de la actividad de ciclooxigenasa y lipoxigenasa en sangre entera humana: Para las investigaciones se utilizado sangre entera humana heparinizadas . Por cavidad se introdujeron 100 µl de sangre entera en placas de microtitulación de 96 pozos. Las placas separadas se utilizaron para la determinación de la actividad de ciclooxigenasa-1 (COX1) y lipoxigenasa (LO) así como la inducción de ciclooxigenasa-2 (COX2) . El compuesto II se diluyo en medio DME
(DMED) con 1% de solución de antibióticos/antimicóticos y 2 mM de L-glutamina (Sigma, Deisenhofen) utilizando DMSO (concentración final 0.1%) como promotor de la solución. Después de la adición de 50 µl del compuesto II se incubaron las cargas de prueba durante 60 minutos a 37° C. A continuación para la estimulación de la síntesis de icosanoide se agregaron 50 µl de Calciumionophor A23187 (concentración final 50 µM) . Después de otros 30 minutos de incubación a 37° C se centrifugaron las placas de microtitulación durante 5 minutos a 4o C con 1500 g. El plasma se retiro con pipeta y se congeló a -80° C para la análisis. Para la detección de la actividad de COX2 se trataron previamente las muestras de sangre (100 µl/cavidad) primero para la inactivación de COXl durante 6 horas a 37° C con aspirina (50 µl en DMEM, concentración final de 12 µg/ml) . A continuación se agrega el compuesto II o el solvente (DMEM con 0.1 % de DMSO) en un volumen de 25 µl . Para la inducción de la expresión de COX2 además se agregaron 25 µl de lipopolisacáridos de E. coll (Serotipo 0127 :b8, concentración final 10 µg/ml) . Después de la incubación durante 18 horas a 37° C se obtuvo el plasma como se describe antes e igualmente se conservó a -80° C para su análisis. En las muestras de plasma se determinaron TXB2, PGE2 y leucotpenos de cistemlo (Cistemlo-LT) como parámetros de la actividad COXl, COX2 y LO. Para el análisis se utilizaron equipos de prueba EIA (TXB2 y PGE : Caymann/IBL, Hamburgo; Leucotrienos de cistenilo: CAST-2000, Milenia, Bad Nauheim) de acuerdo con las indicaciones del productor. De los resultados (ver tabla 2) se desprende que el compuesto II provoca una potente inhibición de la actividad de COX2 y LO. Por el contrario no tiene influencia sobre la actividad de COXl . Este espectro de acción se considera extremadamente ventajosa, ya que en el caso de la aplicación terapéutica del compuesto II por lo tanto no se presentan los efectos secundarios típicos para los inhibidores de COXl, por ejemplo complicaciones gastrointestinales, ulceraciones) o sangrados por medio de la inhibición de la agregación de trombocitos . Tabla 2: Influencia del compuesto II sobre la síntesis de cistenil-LT, TBX2 y PGE2 en sangre entera humana. Se muestran los valores medios + SD de dos cargas de prueba paralelas. El efecto del compuesto II se calculó como la modificación porcentual en comparación con un control del solvente
Ejemplo 1: Preparación de 7 , 7 , 8-trihidroxi-2H-l-benzopiran-2-ona (compuesto II) 20 g (42.7 mmol) sal potásica de 6,8-bis (sulfoxi) -7-hidroxi-2H-l-benzopiran-2-ona se agitaron en 480 ml de ácido clorhídrico aprox. 2N durante 20 horas a 40 a 50° C. Después de enfriar se separa por filtrado el producto crudo precipitado y se recristaliza desde agua (filtrado en caliente) . El cristalizado se succionó, se seco y se lavo y se seco a 100° C al vacio: 5.9 g (71%), punto de fusión: descomposición a partir de 260° C; las RMN 1H y 13C coinciden con los datos de O. Kayser y H. Klodziej (Phytochemistry 39, 1181-1185 (1995)) . Ejemplo 2: Aislado y descripción de la estructura 15 g de raices molidas de Pelargonum sidoides se percolaron dos veces a la temperatura ambiente con 75 L o 40 L de agua. El extracto acuoso se extracto a aproximadamente 1/3, se mezclo con 7 kg de sulfato de amonio y se extrajo varias veces con un a mezcla de 2-butanona/etnaol 3/2. Las fases orgánicas se purificaron y evaporaron. Este residuo se cromatografía a través de una columna HP20 (eluyente: agua) . Las fracciones de 6, 8-b?s (sulfoxi) -7-h?drox?-2H-l-benzop?ran-2-ona se concentraron se ajustaron a un pH de 8 con lejia de potasio y se diluye con etanol a una proporción 1/1. El precipitado se filtra se suspende en agua. Se ajusto a un pH de 10.7 con lejia de potasio y se diluyó con etanol a una proporción 1/1. El precipitado otra vez se diluyó con agua caliente. La solución caliente se filtra y se diluyó con etanol a una proporción 1/1. El cristalizado se succionó, se lavo y se seco al vacio a 50° C: 27.6 g (0.14% en relación al material vegetal, calculado como ácido libre) . Punto de fusión: descomposición a partir de 216° C; CH3K3OHS-; (468.55) encontrado: C 23.08 % , H 0.70 %, K 24.65 %, S 13.9 % - calculado: C 23.07 %, H 0.65 %, K 25.04 %, O 37.56 %, S 13.69 ; JH-NMR (DMSO-d6) : d = 7.62 (d, J = 9.1 Hz, H-4), 7.03 (s, II—5) , b.b9 (d, J = 9.1 Hz, H-3) ; 13C-NMR (DMSO-d6) : d = 162.9 (C-7), 161.9 (C-2), 147.7 (C-8), 145.1 (C-4), 142.2 (C-6) , 130.4 (C-8a) , 115.5 (C-5), 102.4 (C-3) , 101.5 (C-4a) . La hidrólisis acida de sal de potasio de disulfato de trihidroxicu arina conduce a 6,7,8-tr ihidroxi cumar i na (ejemplo 1) . Para explicar adicionalmente la estructura se derivó el compuesto II de acuerdo con la siguiente secuencia de reacción:
Para esto se hizo reaccionar la sal potásica de disulfato de trihidroxicumarina con yodometano en la presencia de carbonato de potasio a 60° C en DMF para formar el correspondiente éter de 7-metilo. Después de acidificar con ácido clorhídrico concentrado se agito durante 24 horas a 50° C, se extrae con acetato de etilo y se cromatografía sobre gel de sílice (eluyente: heptano/acetato de etilo 7/3): 6, 8-dihidroxi-7-metoxicumarina . Este se hizo reaccionar en la presencia de carbonato de potasio y yoduro de potasio en DMF a la temperatura ambiente con bromuro de bencilo. La mezcla se extracto y el residuo se dividió entre agua y TBME. La fase orgánica se extracto y se cromatografio sobre gel de sílice (eluyente: tolueno/etanol 95/5): 6, 8-dibenciloxi-7-metoxicumarina . El patrón de sustitución del compuesto recién mencionado se explicó con una espectroscopia de RMN en CDC13. Una correlación NOESY clara entre H-5 y una de las señales CH2 puede reducirse claramente a un radical de benciloxi en la posición 6. Además se correlaciona la señal OCH3 con ambas señales CH2, de lo que se desprende que el grupo metoxi entre ambos radicales benciloxi también está colocado en la posición 7. La correlación HMBC entre C-7 y H-5 asi como OCH3, asi como entre C-8 y H-4 asi como 8-CH2 confirman el patrón de sustitución que se desprende de NOESY. Por la trayectoria de producción de los derivados examinados y de su estructura puede concluirse fácilmente, que los radicales sulfoxi del disulfato de trihidroxicumarina están unidos en las posiciones 6 y 8.
Correlaciones NOESY
Ejemplo 3: Extracto vegetal con un contenido de 6,8-bis (sulfoxi) -7-hidroxi-2H-l-benzopiran-2-ona (compuesto III) 500 g de raices molidas de Pelargonium sidoides se extrajeron a la temperatura ambiente con 3 kg de agua durante 4 horas. El material vegetal extraído se filtro y otra vez se extrajo y filtro con 2 kg de agua como se describe antes . Los filtrados se purificaron se concentraron a aproximadamente 35° C y se secaron por congelación: 58.7 g (11.7%) extracto seco con un contenido de 1.54% del compuesto III. Ejemplo 4: Extracto vegetal con un contenido de 6,8-bis (sulfoxi) -7-hidroxi-2H-l-benzopiran-2-ona (compuesto III) Aproximadamente 1.25 kg de raices molidas de Pelargonium sidoides se extrajeron con aproximadamente 12.5 kg de etanol/agua 11/89 (p/p) a la temperatura ambiente. Después del filtrado se concentro el filtrado a aproximadamente 45° C y se liofilizo: 90.4 g (7.2%) de extracto seco con un contenido de 1.86% del compuesto III. Ejemplo 5: Tabletas Para producir tabletas que de acuerdo con la potencia deseada contienen de 5 a 250 mg de sustancia activa, se requieren Compuesto II 200 a 5000 g
Polvo de celulosa 2000 g
Almidón de maiz 1200 g Ácido silícico coloidal 80 g
Estearato de magnesio 20 g
Lactosa hasta 10000 g La sustancia activa eventualmente se muele, con el cual se mezclan homogéneamente las sustancias auxiliares, y de la manera habitual se comprimen en forma de tabletas con 250 mg en peso y un diámetro de 9 mm. En caso de dosis mayores a 125 mg se comprimen tabletas con un peso de 500 mg y 11 mm de diámetro. En caso de desearse las tabletas se proveen con un recubrimiento.