MXPA06014090A - 2-desoxi-d-ribosa 5-fosfato aldolasas mejoradas, y para uso en la produccion de 2,4,6-tridesoxihexosas y derivados 6-halogeno o 6-ciano-sustituidos de los mismos. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a mutantes aislados de enzimas del grupo de enzimas de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa de tipo silvestre que tienen un factor de productividad (segun se determina mediante una prueba especifica) el cual es por lo menos 10% mas alto que el factor de productividad para la enzima de tipo silvestre correspondiente a partir de la cual esta es un mutante. Los mutantes tienen por lo menos una sustitucion de aminoacidos en una mas de las posiciones correspondientes a K13, T19, Y49, N80, D84, A93, E127, A128, K146, K160, I166, A174, M185, K196, F200, y S239 en la secuencia de enzima de tipo silvestre de Escherichia coli K12 (EC 4.1.2.4), y/o una delecion de por lo menos un aminoacido en las posiciones correspondientes a S258 y Y259 en la misma, opcionalmente combinado con extension del extremo C-terminal y/o extension del extremo N-terminal especifica. La invencion tambien se refiere a procedimientos de tamizaje para encontrar enzimas 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa (ya sea como tales o como mutantes) que tengan un factor de productividad (segun se determina mediante dicha prueba especifica, la cual forma parte esencial del tamizaje) que sea por lo menos 10% mas alto que el valor de referencia. Asimismo, la invencion se refiere a enzimas mutantes que se obtienen mediante el procedimiento de tamizaje y a los acidos nucleicos que codifican para dichos mutantes, y a vectores y celulas hospederas que comprenden, respectivamente, dichos acidos nucleicos o mutantes. Por ultimo la invencion se refiere al uso de dichas enzimas (de preferencia mutantes) acidos nucleicos, vectores y celulas hospederas en la produccion de, por ejemplo, 6-cloro-2,4,6-tridesoxi-D-eritrohexapiranosido.

Description

2-DESOXI-D-RIBOSA 5-FOSFATO ALDOLASAS MEJORADAS, Y PARA USO EN LA PRODUCCIÓN DE 2 , , 6-TRIDESOXIHEXOSAS Y DERIVADOS 6- HALOGENO O 6-CIANO-SUSTITUIDOS DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a mutantes aislados de enzimas del grupo de enzimas de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa de tipo silvestre provenientes de fuentes naturales que pertenecen al grupo que consiste de especies eucariotas y procariotas, cada una de dichas enzimas de tipo silvestre tiene un factor de productividad especifico, según se determina mediante la prueba de factor de productividad de DERA, en la producción de 6-cloro-2, 4,6-tridesoxi-D-eritrohexapiranósido (de aqui en adelante también conocido como CTeHP) a partir de una mezcla por lo menos equimolar de acetaldehido y cloroacetaldehido.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Tal como se utiliza en la presente invención, un factor de productividad mejorada significa el resultado combinado (y favorable) de cambio en la resistencia, actividad catalítica y afinidad de dichas aldolasas hacia un acetaldehido sustituido con grupo saliente en la posición a y acetaldehido. El método para determinar dicho factor de productividad se describe en la sección experimental de la misma, y de aqui en adelante será denominado como la "prueba de factor de productividad de DERA" (algunas veces también referida de aqui en adelante en la presente invención como DPFT) . Las enzimas de tipo silvestre son enzimas que se pueden aislar a partir de fuentes naturales o de muestras ambientales; mutantes normalmente presentes en la naturaleza de dichas enzimas (es decir mutantes que también se pueden aislar a partir de fuentes naturales o muestras ambientales, dentro del campo de esta solicitud de patente también se consideran como enzimas de tipo silvestre) . El término mutantes, para esta solicitud de patente, únicamente pretende, por lo tanto, indicar que estos se han obtenido o se obtienen a partir de enzimas de tipo silvestre mediante mutaciones intencionales del ADN (ácido nucleico) que codifica para dichas enzimas de tipo silvestre (ya sea mediante mutagénesis aleatoria, por ejemplo con ayuda de PCR o por medio de irradiación UV, o mediante mutación dirigida a sitio, por ejemplo mediante métodos de PCR, mutagénesis por saturación, como son bien conocidos para el experto en la técnica, opcionalmente con recombinación de dichas mutaciones, por ejemplo mediante una técnica de recombinación como la descrita en el documento WO/010311) . En la naturaleza, se sabe que las 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasas, por ejemplo la 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa provenientes de E . coli K12 (DERA, EC 4.1.2.4), catalizan de manera enantioselectiva la reacción aldólica (reversible) entre acetaldehido y D-gliceraldehido 3-fosfato para formar 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato. Cualquier enzima que pueda catalizar esta reacción en forma enantio-selectiva, para los propósitos de esta solicitud de patente, o que pueda catalizar de manera enantio-selectiva la formación de una 2, , 6-tridesoxihexosa a partir de un acetaldehido sustituido con grupo saliente en la posición y acetaldehido se dice que tiene actividad de DERA. Como se describe en - por ejemplo- el documento US-A-5, 795, 749, se puede lograr la síntesis de algunas 2, , 6-tridesoxihexosas mediante el uso de una 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa como un catalizador enantio-selectivo. En dicho procedimiento se utiliza acetaldehido y un aldehido sustituido en la posición 2 como reactantes, y la reacción procede a través de un intermediario 3-hidroxibutanal sustituido en la posición 4. Por consiguiente, por ejemplo, se puede utilizar 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato - en la forma descrita por Gijsen & Wong en JACS 116 (1994), página 8422 - en un procedimiento para la síntesis del hemiacetal 6-cloro-2 , , 6-tridesoxi-D-eritrohexapiranósido. Este compuesto hemiacetal es conocido también en la presente invención, como se mencionó anteriormente, como CTeHP. Este es un intermediario apropiado en la producción de algunos derivados de ácido (4R, 6S) -2- (6-sustituido-l, 3-dioxan-4-il) -acético, por ejemplo el éster t-butilico del mismo, el cual en la presente solicitud será mencionado como CtBDAc. Dichas 2, , 6-tridesoxihexosas y derivados 6-halógeno- o 6-ciano sustituidos de las mismas, asi como dichos derivados de ácido (4R, 6S) -2- ( 6-substituido-l, 3-dioxan-4-il) -acético, y compuestos adicionales que se puedan considerar como equivalentes a los mismos, son considerados como bloques de construcción quirales valiosos en la producción de grupos importantes de productos farmacéuticos que tienen propiedades para reducir colesterol o propiedades anti-tumor. Ejemplos importantes de dichos productos farmacéuticos son las denominadas estatinas tales como, por ejemplo, las vastatinas rosuvastatina (Crestor®; una marca comercial de Astra Zeneca) o atorvastatina (Lipitor®; una marca comercial de Pfizer). Otros ejemplos de estatinas son lovastatina, cerivastatina, simvastatina, pravastatina y fluvastatina. Generalmente se sabe que las estatinas funcionan como los denominados inhibidores de HMG-CoA reductasa. Asimismo, se sabe que varios derivados de dichos compuestos farmacéuticos (o intermediarios de los mismos) también son interesantes, por ejemplo el hemiacetal 6-ciano-2, , 6-tridesoxi-D-eritrohexapiranósido, el cual en la presente solicitud será mencionado como CyTeHP, el cual posiblemente es un intermediario alternativo para la producción de atorvastatina. Como se mencionó en el documento WO 03/006656, una desventaja conocida de las condensaciones aldólicas catalizadas con enzima del documento US-A-5, 795, 749 (citado anteriormente) es que la capacidad de producción es baja. Por lo tanto, en el documento WO 03/006656 se ha intentado con éxito superar dichos problemas de baja capacidad de producción efectuando la reacción a concentraciones de reactantes relativamente altas y mediante el uso preferido de la 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa proveniente de E . coli K12 (DERA, EC 4.1.2.4) en combinación con a-cloroacetaldehido como substrato preferido después del acetaldehido. No obstante, como lo observaron los presentes inventores en sus estudios que conducen a la presente invención, las enzimas de DERA hasta la fecha, por desgracia, muestran resistencia bastante baja hacia los substratos tipo aldehido (especialmente hacia acetaldehido e - incluso más pronunciado - hacia acetaldehido a-L-sustituido) . En particular, si el grupo saliente L es cloro se observa desactivación muy alta de las enzimas de DERA a concentraciones útiles para la biosintesis de tridesoxihexosas . Asimismo, como descubrieron los inventores, las enzimas 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa conocidas parecen tener muy baja afinidad y actividad hacia el substrato cloroacetaldehido . Por dichas razones, de hecho, se requieren cantidades relativamente altas de enzimas de DERA (costosas) para obtener buenos rendimientos de la reacción de síntesis. Por consiguiente, existe una necesidad sustancial respecto a encontrar enzimas de DERA que tengan un factor de productividad mejorado (es decir el resultado combinado de los cambios en resistencia, actividad catalítica de dichas aldolasas hacia acetaldehido a-L-sustituido y acetaldehido debe ser favorable) . Y desde luego, de preferencia también se debe mejorar la capacidad de producción de las rutas de síntesis para tridesoxihexosas. Se debe mencionar que un articulo reciente de W. A. Greenberg et al., en PNAS, vol. 101, p.5788-5793 (2004) describe intentos para encontrar enzimas de DERA de tipo silvestre con productividad volumétrica mejorada en la reacción de DERA y describe la secuencia de aminoácido de una DERA de tipo silvestre proveniente de un organismo fuente desconocido. Como se discute con mayor detalle más adelante en la presente invención, el articulo también describe maneras especificas para los métodos de tamizaje para encontrar enzimas de DERA. Sin embargo, los autores se enfocan en la inhibición del substrato y no enfrentan realmente los problemas inherentes al uso de enzimas de DERA en combinación con concentraciones (relativamente altas) de, por ejemplo, cloroacetaldehido, en especifico desactivación intensa de las enzimas. De hecho, los autores tratan de reducir al minimo los problemas de inhibición del substrato suministrando los substratos a la misma velocidad con la que estos son consumidos por la reacción.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Como se mencionó anteriormente, en la naturaleza la 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa cataliza de manera enantioselectiva la reacción aldólica (reversible) entre acetaldehido y D-gliceraldehido 3-fosfato para formar 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato. Para los propósitos de la presente solicitud de patente esta reacción natural, y de manera más precisa la reacción inversa de la misma (es decir la degradación de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato en acetaldehido y D-gliceraldehido 3-fosfato) será utilizada como una de las reacciones de referencia para establecer datos de resistencia, estabilidad c.q., para las enzimas mutantes provistas. Por lo tanto, esta reacción de degradación será denominada de aqui en adelante en la presente invención como la reacción de substrato natural de DERA. Sin embargo, además de la reacción de substrato natural de DERA, para evaluación de la productividad de las enzimas mutantes también se utilizará una reacción de análisis de prueba adicional, en especifico la Prueba de Factor de Productividad de DERA (DPFT), con cloroacetaldehido y acetaldehido como substratos. Como se indicó anteriormente, la productividad representa los efectos combinados (es decir netos) de los cambios en actividad, resistencia (estabilidad) y afinidad. En el contexto de la presente invención, se comparan la resistencia y productividad de los mutantes de DERA en cada ocurrencia en particular con las de la enzima de tipo mutante a partir de la cual se deriva el mutante, y/o se comparan con aquellas de DERA de E . coli K12 (una DERA de tipo silvestre) , en dicha reacción de substrato natural de DERA y/o reacción de QPFT. De preferencia, en la comparación de los factores de productividad específicos de dos enzimas, se utilizan condiciones idénticas. Con "condiciones idénticas" se quiere decir que excepto por las diferentes secuencias de ácido nucleico que codifican para las dos enzimas diferentes, sustancialmente no existen diferencias en las condiciones entre las dos Pruebas de Factor de Productividad de DERA. Esto significa que parámetros, tales como por ejemplo temperatura, pH, concentración de extracto libre de células (ele) , cloracetaldehido y acetaldehido; antecedentes genéticos tales como un sistema de expresión, es decir vector de expresión y célula hospedera, etc, de preferencia se mantienen todos idénticos. Tal como se utiliza en la presente invención, el término factor de productividad mejorado es por lo tanto la resultante (favorable) de los cambios en resistencia, actividad catalítica y afinidad, bajo condiciones de prueba estándar como se describe en la sección experimentadle la presente invención, especialmente tomando en consideración los resultados de la reacción de DPFT. El factor de productividad tal como se utiliza en la presente solicitud, corresponde, por lo tanto, de manera más precisa al valor de formación de CTeHP. Los mutantes de DERA provistos de conformidad con la presente invención son por lo menos 10% más productivos que la enzima DERA de tipo silvestre a partir de la cual estos son mutantes, y/o que DERA de E . coli K12, en la reacción de substrato natural de DERA y/o reacción de DPFT. Por consiguiente, estos tienen una resistencia sustancialmente mejor (es decir estos permanecen en un porcentaje más alto de su nivel de actividad durante un intervalo de tiempo dado) en presencia de un acetaldehido sustituido en la posición a con un grupo saliente y acetaldehido, o por lo general son sustancialmente más activos en la reacción de substrato natural de DERA. La presente invención también se refiere en particular a un procedimiento para la selección respecto a enzimas de tipo silvestre proveniente del grupo de enzimas de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa que tienen un factor de productividad, según se determina mediante la Prueba de Factor de Productividad de DERA, en la producción de 6-cloro-2, , 6-tridesoxi-D-eritrohexapiranósido (CTeHP) a partir de una mezcla por lo menos equimolar de acetaldehido y cloroacetaldehido, el cual es por lo menos 10% más alto que el factor de productividad para la enzima 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa proveniente de Escherichia coli K12 (EC 4.1.2.4) que tiene una secuencia de enzima de tipo silvestre de [SEQ ID No.l]. La presente invención de manera más particular también se refiere a un procedimiento para el tamizaje respecto a enzimas mutantes provenientes del grupo de enzimas de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa que tienen un factor de productividad, según se determina mediante la Prueba de Factor de Productividad de DERA, en la producción de 6-cloro-2, 4 , 6-tridesoxi-D-eritrohexapiranósido (CTeHP) a partir de una mezcla por lo menos equimolar de acetaldehido y cloroacetaldehido, el cual es por lo menos 10% más alto que el factor de productividad para la enzima de tipo silvestre correspondiente. De manera más particular, ésta también se refiere a un procedimiento para el tamizaje respecto a enzimas provenientes del grupo de enzimas de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa que tienen dicho factor de productividad, que es por lo menos 10% más alto que el factor de productividad para la enzima 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa proveniente de Escherichia coli K12 (EC 4.1.2.4) que tiene una secuencia de enzima de tipo silvestre de [SEQ ID No.l]. Esta secuencia de [SEQ ID No.l] se muestra posteriormente en la presente invención en el listado de secuencias con la entrada <400> 1. Tal como se utiliza en la presente invención, el término (enzima) mutante pretende abarcar mutantes tales como aquellos que se obtienen mediante manipulación genética del ADN (ácido nucleico) que codifica para una enzima de DERA de tipo silvestre y que resulta por ejemplo en reemplazos o sustituciones, deleciones, truncamientos y/o inserciones en la secuencia de aminoácido, por ejemplo en el ácido nucleico de [SEQ ID No.6] (véase listado de secuencias, bajo la entrada <400> 6) que codifica para la enzima de DERA de tipo silvestre proveniente de E . coli K12) de una enzima DERA de tipo silvestre, por ejemplo la DERA de E . coli K12. La presente invención incluso se refiere también a ácidos nucleicos aislados que codifican para dichas 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasas mutantes que tienen un factor de productividad más alto y mejorado cuando se comparan con la enzima DERA de tipo silvestre a partir de la cual ésta es un mutante, y/o se compara con la DERA de E . coli K12; y a vectores que comprenden dichos ácidos nucleicos aislados que codifican para las 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasas mutantes de conformidad con la invención; y a células hospederas que comprenden dichos ácidos nucleicos y/o vectores. Por último, la presente invención también se refiere a la síntesis mejorada de productos farmacéuticos como se mencionó anteriormente en la presente invención, y de sus derivados e intermediarios, utilizando 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasas mutantes de conformidad con la invención, o utilizando ácidos nucleicos que codifican para dichos mutantes, o utilizando vectores que comprenden dichos ácidos nucleicos, o utilizando células hospederas que comprenden dichos ácidos nucleicos y/o vectores.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los presentes inventores, después de estudios detallados, han descubierto que se ha hecho accesible una enorme cantidad de enzimas DERA mutantes que tienen un factor de productividad mejorado cuando se utilizan en la producción de 6-cloro-2, , 6-tridesoxi-D-eritro-hexapiranósido (CTeHP) . En especifico, los inventores han descubierto que se pueden obtener mutantes aislados de enzimas provenientes del grupo de enzimas de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa de tipo silvestre a partir de fuentes naturales que pertenecen al grupo que consiste de especies eucariotas y procariotas, dichas enzimas de tipo silvestre tienen cada una un factor de productividad especifico, según se determina mediante la Prueba de Factor de Productividad de DERA, en la producción de CTeHP a partir de una mezcla por lo menos equimolar de acetaldehido y cloroacetaldehido, en el cual los mutantes aislados tienen un factor de productividad el cual es por lo menos 10% más alto que el factor de productividad para la enzima de tipo silvestre correspondiente a partir de la cual ésta es un mutante y en el cual los factores de productividad tanto de la enzima mutante como de la enzima de tipo silvestre correspondiente se miden bajo condiciones idénticas . Los mutantes aislados de enzimas provenientes del grupo de enzimas de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa de tipo silvestre (DERAs) de conformidad con la invención se pueden obtener ya sea a partir de DERAs de origen eucariota o, como es más preferido, de origen procariota. Cuando las DERAs son de origen eucariota, éstas se pueden obtener a partir de organismos que consisten de una o más células eucariotas que contienen núcleos encerrados en membranas asi como organelos . Las células eucariotas, por ejemplo, pueden ser células provenientes de humanos, animales (por ejemplo ratones), plantas y hongos y a partir de muchos otros grupos, cuyos otros grupos son conocidos en forma colectiva como "Protista". Las DERAs apropiadas, por ejemplo, se pueden obtener a partir de fuentes eucariotas que pertenecen a los Metazoa, es decir a partir de animales excepto esponjas y protozoarios, por ejemplo a partir de nemátodos, artrópodos y vertebrados, por ejemplo a partir de Caenorhabdi tis elegans, Drosophila melanogaster, Mus musculus, y Homo sapiens . Sin embargo, de manera más preferida, las DERAs mutantes aisladas de conformidad con la presente invención son de origen procariota, es decir provienen de organismos unicelulares sin un núcleo que generalmente pertenecen a los reinos de Archaea (que comprende los phyla Crenarchaeota y Euryarchaeota) y Bacteria. En la tabla 1 se presenta una reseña del árbol filogenético para especies que pertenecen al reino de los Archaea, a partir de las cuales se pueden obtener mutantes de DERA apropiados de conformidad con la invención. De manera más preferida, las DERAs mutantes aisladas de conformidad con la presente invención son de origen bacteriano. En la tabla 2 se presenta una reseña del árbol filogenético para especies que pertenecen al reino de Bacteria, a partir de cuyas especies se pueden obtener mutantes de DERA apropiados de conformidad con la invención. En las tablas 1 y 2 Gl significa identificador genérico para la recuperación de secuencias de aminoácido a partir del navegador Entrez del NCBl; se puede utilizar el número después de Gl: para accesar a las secuencias de aminoácido de las DERAs de tipo silvestre y a las secuencias de ácido nucleico que codifican para dichas secuencias de aminoácido, por ejemplo utilizando los números en una base de datos a la que se puede tener acceso a través del siguiente sitio/ máquina de búsqueda: NCBl (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) . El experto en la técnica está consciente que se pueden encontrar fácilmente las secuencias de aminoácido de DERA de tipo silvestre y las secuencias de ácido nucleico que codifican para estas DERAs de tipo silvestre además de aquellas mencionadas en las tablas 1 y 2 en una manera conocida per se en bases de datos de proteina y ácido nucleico, utilizando por ejemplo el sitio/ máquina de búsqueda antes mencionado. Dentro del reino Bacteria, las DERAs mutantes de manera más preferida se basan en DERAs de tipo silvestre que se originan a partir del phylum Proteobacteria, y de manera más especifica a partir de la clase de Gamma-proteobacteria, especialmente a partir del orden Enterobacteriales a las cuales pertenece también la familia de Enterobacteriaceae. Dicha familia, entre otras, incluye al género Escherichia. Por consiguiente, las DERAs mutantes apropiadas para uso en el contexto de la presente invención, por ejemplo, se pueden obtener mediante mutaciones intencionales del ADN que codifica para dichas enzimas de tipo silvestre provenientes de las fuentes procariotas que se presentan en forma resumida en la tabla 3, en - casi -un porcentaje de identidad cada vez mayor (desde 20% de identidad hasta 100% de identidad aproximadamente) con Escherichia coli K12.

TABLA 1 Archaea Phylum Clase Orden Familia Género Especies Identificado genérico (Gl) Euryarchaeota Termoplasmata Thermoplasmatales Thermoplasmataceae Thermoplasma Volcanium 24636808 Thermoplasma Acidophilum 13878466 Thermococci Thermococcales Termococcaceae Thermococcus Kodakaraensis 34395642 Methanobactepa Methanobacteriales Methanobacteriaceae Methanothermobacter Thermoautotrophicus 3913443 Halobacteria Halobacteriales Halobacteriaceae Halobactepum sp. NRC-1 24636814 Crenarchaeota Thermoprotei Desulfurococcales Desulfurococcaceae Aeropyr?m Pernix 24638457 Thermoproteales Thermoproteaceae Pyrobacul um Aerophilum 24636804 10 TABLA 2 Bacteria Phylum Clase Orden Familia Género Especies Cepa Identificado genérico (Gl Aquificae Aquificae Aquifleales Aquificaceae Aquifex Aeolicus VF5 3913447 Thermotogae Thermotogae Thermotogales Thermotogaceae Thermotoga marítima MSB8 7674000 Spirochaetes Spirochaetes Spirochaetales Spirochaetaceae Treponema Pallidum Nichols 767 994 Deinococcus- Rl Thermus Deinococci Deinococcales Demococcaceae Deinococcus Radiodurans 24636816 Cianobacteria Chroococcales Synechocystis sp PCC 6803 3913448 Nostocales Nostocaceae Nos toe sp PCC 712Q 24636799 Actinobactena Actmobacteria Actmomycetales Streptomycetaceae Streptomyces Coel color A3(2) 13162102 Corynebacteriaceae Corynebactepum Clutamicum ATCC 13032 24636791 Mycobacteriaceae Mycobacterium Tuberculosis H37Rv 1706364 Mycobacterium Leprae TN 13878464 Firmicutes Bacilli Bacillales Bacillaceae Bacillus Subtilis 168 1706363 Bacilus Halodurans JCM 9153 13878470 Bacillus Cereus ATCC 14579 38372184 10 Bacillus Anthracis Ames 38372187 Listeria Innocua CLIP 11262 22095578 Listepa Monocytogenes EGD-e 22095575 Oceanobac llus Iheyensis HTE831 Por ejemplo 38372231 Staphylococcaceae Staphylococcus Aureus M 2 Por ejemplo 24636793 Staphylococcus Epidermis ATCC 12228 38257566 Lactobacillales Lactobacillaceae Lactobacillus Plantarum WCFS1 38257534 Streptococcaceae Streptococcus Pyrogenes SF370 24636813 Streptococcus Pneumoniae ATCC BAA-334 22095579 Lactococcus Lactis, IL1403 13878 65 subsp lactis Enterococcaceae Enterococcus Faecalis V583 46576519 Clostridia Clostridiales Clostridiaceae Clostridiu Perfringens 13 22095574 Clostpdium Acetobutylicum VKM B-1787 24636809 15 Thermoanaerobacteriales Thermoanaerobacteriaceae Thermoanaerobacter Tengcongensis MB4 2S095572 TABLA 2 (cont.) Phylum Clase Orden Familia Género Especies Cepa Identificador genérico (Gl) Mollicutes Mycoplasmatales Mycoplasmataceae Mycoplasma Pneumoniae Ml29 118445 UAB CTIP Mycoplasma pulmoms 24636810 Mycoplasma Pirum BER 1352232 Mycoplasma Genitalium G-37 1352231 Mycoplasma Hom ms FBG 1169269 Ureplasma Parvum Serovar 3 13878474 Proteobactepa Alphaproteobacteria Rhizobiales Rhizobiaceae Agrobacterium Tumefaciens C58 24636797 Betaproteobacteria Burkholderiales Burkholderiaceae Burkholderia Malleí ATCC 23344 Burkholdepa Pseudomalleí ATCC 23343 Neisseriales Neissepaceae Chromobactepum Violaceum DSM 30191 39930965 Gammaproteobacteria Pseudomonadales Pseudomonaceae Pseudomonas Sypngae DC3000 28851430 Alteromonadales Alteromonadaceae Shewanella Oneidensis MR-1 39931142 Pasteurellales Pasteurellaceae Pasteurella Mul ticoda Pm70 13431461 Haemophilus Influenzae Rd 1169268 Haemophilus Ducreyi 35000HP 39931016 10 Vibrionales Vibrionaceae Vibrio Cholerae El Tor N16961 13878471 Vibrio Vulnificus CMCP6 39931134 Vibrio Parahae olyticus RIMD 2210633 39931108 Enterobacteriales Enterobacteriaceae Yersima Pestis CO-92 Por ejemplo 24636801 Photorhabdus ummescens TT01 39930948 Sh gella Flexnep 2457T 39931101 Salmona lia Typhi Ty2 24636800 Salmonalla Typhimupum LT2 24636803 Escherichia Coll Kl2 729314 Escheric ia Coll CFT073 26251271 15 Eschepchia Coll 0157 H7 24636798 TABLA 3 Fuentes procariotas para DERAs mutantes apropiadas Thermoplasma volcanium, Thermoplasma acidophilum, Aeropyrum pernix, Aquifex aeolicus, Sinorhizobium meliloti, Oceanobacillus iheyensis, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus kodakaraensis, Lactobacillus plantarum, Methanothermobacter thermoautotrophicus, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma pirum, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma pulmonis, Thermotoga marítima, Synechocystis sp. PCC 6803, Treponema pallidum, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Nostoc sp. PCC 7120, Halobacterium sp. NRC-1, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Yersinia pestis, Ureaplasma parvum, Staphylococcus aureus subsp. aureus Mu50, respectivamente subsp. aureus MW2, Staphylococcus epidermidis, Pasteurella multicoda, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Lactococcus lactis subsp. lactis, Enterococcus faecalis , Corynebacterium glutamicum, Thermoanaerobacter tengcongensis , Bacillus subtilis, Bacillus halodurans, Bacillus cereus, Bacillus anthracis cepa Ames, Listeria innocua, Listeria monocytogenes , Clostridium perfringens, Clostridium acetobutylicum, muestras ambientales como se mencionó en el articulo de W. A. Greenberg et al, en PNAS, vol.101 , p.5788-5793 (2004), Deinococcus radiodurans, Pseudomonas syringae, Streptomyces coelicolor, Agrobacterium tumefaciens cepa C58, Burkholderia mallei , Burkholderia pseudomallei , Chromobacterium viola ceum, Shewanella oneidensis, Vibrio cholerae, Vibrio vulnificus, Vibrio parahaemolyti cus, Photorhabdus l uminescens, Salmonella typhi , Salmonella typhimuri um, Shigella flexneri , Escherichia coli 0157 :H7, Escherichia coli CFT073, Escheri chia coli K12.

Una DERA de referencia de tipo silvestre muy apropiada para comparar el factor de productividad especifico de las DERAs mutantes como las que se obtienen de conformidad con la presente invención, es la 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa proveniente de Escherichia coli K12 (EC 4.1.2.4) que tiene, desde el extremo N-terminal hacia el extremo C-terminal, una secuencia de enzima de tipo silvestre de [SEQ ID No.l]: ?o 20 30 40 50 60 MTDLKASSLR ALKLMD NTL NDDDTDEKVI ALCHQAKTPV GNTAAICIYP RFIPIARKTL 70 80 90 100 110 120 KEQGTPEIRI ATVTNFPHGN DDIDIALAET RAAIAYGADE VDVVFPYRAL MAGNEQVGFD 130 140 150 160 170 180 LVKACKEACA AANVLLKVII ETGELKDEAL IRKASEISIK AGADFIKTST GKVAVNATPE 190 200 210 220 230 240 SARIMMEVIR DMGVEKTVGF KPAGGVRTAE DAQKYLAIAD ELFGADWADA RHYRFGASSL 250 259 LASLLKALGH GDGKSASSY Por lo tanto, la invención también se refiere a mutantes aislados de enzimas del grupo de enzimas de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa de tipo silvestre provenientes de fuentes naturales que pertenecen al grupo que consiste de especies eucariotas y procariotas, cada una de dichas enzimas de tipo silvestre tiene un factor de productividad especifico, según se determina mediante la Prueba de Factor de Productividad de DERA, en la producción de cloro-2, , 6-tridesoxi-D-eritrohexapiranósido (CTeHP) a partir de una mezcla por lo menos equimolar de acetaldehido y cloroacetaldehido, en la cual los mutantes aislados tienen un factor de productividad el cual es por lo menos 10% más alto que el factor de productividad para la enzima de tipo silvestre correspondiente a partir de la cual ésta es un mutante y en la cual los factores de productividad tanto de la enzima mutante como de la enzima de tipo silvestre correspondiente se miden bajo condiciones idénticas y en la cual los mutantes aislados tienen un factor de productividad el cual es por lo menos 10% más alto que el factor de productividad para la 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa proveniente de Escheri chia coli K12 (EC A . 1 . 2 . ) que tiene la secuencia de enzima de tipo silvestre de [SEQ ID No. 1] y en la cual los factores de productividad tanto de la enzima mutante como de la enzima de Escherichia coli K12 se miden bajo condiciones idénticas . Se debe mencionar, que la secuencia de tipo silvestre de la enzima DERA de E . coli K12 (W3110) (259 aminoácidos; [SEQ ID No.l]), asi como la secuencia de nucleótido que codifica para dicha enzima DERA (780 nucleótidos, [SEQ ID No.6]; véase listado de secuencias), han sido descritas por P. Valentin-Hansen et al. en "Nucleotide sequence of the deoC gene and the amino acid sequence of the enzyme", Eur. J. Biochem . 125 (3), 561-566 (1982). DeSantis et al . , 2003, Bioorganic & Medicinal Chemistry 11 , pp 43-52 describen el diseño de cinco mutaciones especificas de sitio de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa de E . coli (EC 4.1.2.4) en la cavidad de unión a fosfato de la DERA de E. coli : K172E, R207E, G205E, S238D y S239E. De estas enzimas mutantes de DERA, S238D y S239E demuestran tener una actividad más alta hacia su substrato natural no fosforilado (2-desoxi-D-ribosa) que la enzima de tipo silvestre. Estos mismos mutantes de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa de E . coli también se describen en el documento US 2003/0232416. Los presentes inventores han descubierto, en estudios de alineación de secuencia utilizando alineación de secuencia múltiple ClustalW, versión 1.82 http://www.ebi.ac.uk/clustalw en los parámetros predeterminados (matriz: Gonnet 250; ABERTURA DE ESPACIO: 10; ESPACIOS DE EXTREMO: 10; EXTENSIÓN DE ESPACIO: 0.05; DISTANCIAS DE ESPACIO: 8), que las DERAs de origen eucariota y procariota como las que se pueden utilizar para obtener los mutantes aislados de conformidad con la invención pueden variar sobre un intervalo amplio de porcentaje de identidad con la secuencia de enzima de tipo silvestre de [SEQ ID No.l] de la 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa de Escherichia coli K12 (EC 4.1.2.4). Incluso a un porcentaje de identidad de 20% aproximadamente aún se siguen encontrando DERAs muy apropiadas que se pueden utilizar como punto de partida para obtener los mutantes de conformidad con la presente invención. Los inventores han descubierto, que todas las DERAs como las que se pueden utilizar en la presente invención (y los mutantes obtenidos a partir de las mismas) tienen todas en común, que éstas tienen por lo menos ocho aminoácidos conservados, en especifico F76, G79, E100, D102, K167, T170, K201, y G204, cuando se comparan con la secuencia de enzima de tipo silvestre de [SEQ ID No.l]. Por consiguiente, todas las mutaciones como las descritas más adelante están en posiciones diferentes de estas posiciones. Se puede mencionar, que K167 es la lisina de sitio activo esencial la cual forma el intermediario tipo base de Schiff con acetaldehido; K201 y D102 están implicados en el sistema de relevo de protón catalítico que "activa" a K167 de conformidad con Heine et al . en "Observation of covalent intermediates in an enzyme mechanism at atomic resolution", Science 294, 369-374 (2001) . No se descrito que los otros cinco residuos se conserven o que sean importantes para por ejemplo reconocimiento o catálisis del substrato, hasta la fecha. De preferencia, las DERAs mutantes aisladas tienen un factor de productividad el cual es por lo menos 10% más alto que el factor de productividad para la enzima de tipo silvestre correspondiente a partir de la cual ésta es un mutante. El factor de productividad es de preferencia por lo menos 20%, más preferido por lo menos 30%, incluso más preferido por lo menos 40%, incluso con mayor preferencia por lo menos 50%, más preferido por lo menos 100%, incluso más preferido por lo menos 200%, incluso más preferido por lo menos 500%, incluso más preferido por lo menos 1000%, incluso más preferido por lo menos 1500% más alto que para la enzima de tipo silvestre correspondiente. De manera más preferida, las DERAs mutantes aisladas tienen un factor de productividad el cual es por lo menos 10% más alto que el factor de productividad para DERA de E . coli K12. El factor de productividad es de preferencia por lo menos 20%, más preferido por lo menos 30%, incluso más preferido por lo menos 40%, incluso con mayor preferencia por lo menos 50%, más preferido por lo menos 100%, incluso más preferido por lo menos 200%, incluso más preferido por lo menos 500%, incluso más preferido por lo menos 1000%, incluso más preferido por lo menos 1500% más alto que el factor de productividad para DERA de E . coli K12. Un grupo muy importante de mutantes aislados, que han demostrado ser muy efectivos en la reacción pretendida, son los mutantes aislados de la 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa proveniente de Escherichia coli K12 (EC 4.1.2.4) que tiene una secuencia de enzima de tipo silvestre de [SEQ ID No.l]. Estas DERAs mutantes aisladas tienen un factor de productividad el cual es por lo menos 10% más alto que el factor de productividad para la secuencia de enzima de [SEQ ID No.l]. El factor de productividad es de preferencia por lo menos 20%, más preferido por lo menos 30%, incluso más preferido por lo menos 40%, incluso con mayor preferencia por lo menos 50%, e incluso más preferido por lo menos 100%, incluso más preferido por lo menos 200%, incluso más preferido por lo menos 500%, incluso más preferido por lo menos 1000%, incluso más preferido por lo menos 1500% más alto que el factor de productividad para la secuencia de enzima de [SEQ ID No.l]. Los presentes inventores han descubierto que se pueden obtener DERAs mutantes aisladas muy apropiadas cuando los mutantes tienen por lo menos una sustitución de aminoácido en una o más de las posiciones K13, T19, Y49, N80, D84, A93, E127, A128, K146, K160, 1166, A174, M185, K196, F200, o S239 en [SEQ ID No.l], o en posiciones correspondientes a las mismas, de preferencia en la posición F200 o en una posición correspondiente a la misma, y/o una deleción de por lo menos un aminoácido en una de las posiciones S258 o Y259 en [SEQ ID No.l], opcionalmente en combinación con extensión en el extremo C-terminal, de preferencia mediante uno de los fragmentos TTKTQLSCTKW [SEQ ID No.2] y KTQLSCTKW [SEQ ID No.3] y/o en combinación con extensión en el extremo N-terminal. Un ejemplo de una secuencia de ácido nucleico que codifica para [SEQ ID No. 2] se da en [SEQ ID No. 7]. Un ejemplo de una secuencia de ácido nucleico que codifica para [SEQ ID No. 3] se da en [SEQ ID No. 8]. En una modalidad de la invención, las mutaciones dirigidas a sitio se pueden elaborar mediante mutagénesis por saturación efectuada en una de las posiciones antes mencionadas en o que corresponda a [SEQ ID No. 1], por ejemplo en (la) posición (que corresponde a la posición) F200. Con mutagénesis por saturación se quiere decir que el aminoácido se sustituye con cada aminoácido proteinogénico posible, por ejemplo con alanina, arginina, ácido aspártico, asparagina, cisteina, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina o valina, por ejemplo generando una genoteca de enzimas variantes, en la cual cada variante contiene un intercambio de aminoácido especifico en la posición 200 de [SEQ ID No. 1]. De preferencia, la mutagénesis por saturación se efectúa intercambiando el triplete de ácido nucleico que codifica para el aminoácido que se va a sustituir por cada triplete de ácido nucleico posible, por ejemplo como se describe en el ejemplo 4. Por consiguiente, estos mutantes tienen una secuencia que difiere de la secuencia de [SEQ ID No. 1] (o de cualquier otra secuencia de aminoácido de enzima de tipo silvestre proveniente de otra fuente natural que corresponda con la misma en el porcentaje de identidad como las que se encuentran de conformidad con el programa ClustalW antes descrito) en una o más de las posiciones indicadas, mientras que tenga por lo menos los ocho aminoácidos conservados, en especifico F76, G79, E100, D102, K167, T170, K201, y G204, discutidos anteriormente. Por lo tanto, como se utiliza en la presente invención, "mutaciones correspondientes" pretende indicar que estas mutaciones se presentan en una "secuencia de aminoácido de enzima de tipo silvestre correspondiente" (es decir una secuencia de una enzima que tenga actividad de DERA) . Los residuos de aminoácido de las secuencias de proteina de tipo silvestre o mutadas que corresponden a las posiciones de los residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácido de tipo silvestre de la DERA de E. coli K12 [SEQ ID No.l] se pueden identificar efectuando alineaciones de secuencia múltiples ClustalW versión 1.82 (http://www.ebi.ac.uk/clustalw) en los parámetros predeterminados (matriz: Gonnet 250; ABERTURA DE ESPACIO: 10; ESPACIOS DE EXTREMO: 10; EXTENSIÓN DE ESPACIO: 0.05; DISTANCIAS DE ESPACIO: 8) . Los residuos de aminoácido que se colocan en la misma hilera que la de un residuo de aminoácido de la secuencia de DERA de tipo silvestre de E. coli K12 como la que se provee en [SEQ ID No.l] en dichas alineaciones son definidos como posiciones correspondientes a su residuo de aminoácido respectivo de la DERA de tipo silvestre de E . coli K12 [SEQ ID No.l]. Tal como se utiliza en la presente invención, los aminoácidos en las secuencias y en las diversas posiciones en las mismas, se indican mediante su código de una letra (respectivamente mediante su código de tres letras) de la siguiente manera: Los aminoácidos listados anteriormente se pueden diferenciar de conformidad con diversas propiedades, según pudieran ser importantes en posiciones especificas en la secuencia. Algunos de los aminoácidos, por ejemplo, pertenecen a la categoría de aminoácidos con carga positiva, a saber especialmente lisina, arginina e histidina. Otra categoría de aminoácidos es aquella de los aminoácidos hidrofilicos, que consiste de serina, treonina, cisteina, glutamina, y asparagina. Los aminoácidos hidrofóbicos son isoleucina, leucina, metionina, valina, fenilalanina, y tirosina. Existe también una categoría de aminoácidos aromáticos, en especifico fenilalanina, tirosina y triptófano. Incluso otra posibilidad para clasificar los aminoácidos es de conformidad con su tamaño: en orden de tamaño decreciente los aminoácidos se pueden listar de la siguiente manera W > Y > F > R > K > L, I > H > Q > V > E > T > N > P > D > C > S > A > G. por lo tanto, cada uno de los mutantes reclamados, se va a comparar con la secuencia de tipo silvestre a partir de la cual éste se derive. Esto significa que un mutante de conformidad con la invención solamente puede ser considerado como un mutante cuando se cumplen por lo menos los dos primeros de los siguientes criterios : (a) la mutación debe corresponder a una de las mutaciones indicadas para E. coli K12; (b) la mutación no está presente en la enzima de tipo silvestre a partir de la cual se deriva el mutante; (c) por lo menos ocho aminoácidos conservados, en especifico F76, G79, E100, D102, K167, T170, K201, y G204, todavía están presentes en las posiciones correspondientes. De manera más preferida, las DERAs mutantes aisladas de conformidad con la presente invención tienen por lo menos una de las sustituciones de aminoácido en, o que corresponda a las sustituciones en, [SEQ ID No.l] que se selecciona a partir del grupo que consiste de: a. K13 y/o K196 reemplazados con un aminoácido con carga positiva, de preferencia con R o H; b. T19 y/o M185 reemplazados con otro aminoácido, de preferencia con otro aminoácido que se selecciona a partir de los grupos que consisten de aminoácidos hidrofilicos, que consisten en particular de S, T, C, Q, y N, y/o aminoácidos hidrofóbicos, que consisten en particular de V, L e í; c. Y49 reemplazados con un aminoácido aromático que se selecciona a partir del grupo que consiste de F y W; d. N80 y/o 1166 y/o S239 reemplazados con otro aminoácido que se selecciona a partir del grupo de aminoácidos hidrofilicos que consiste de T, S, C, Q y N; e. D84 y/o A93 y/o E127 reemplazados con otro aminoácido, de preferencia más pequeño, que se selecciona a partir del grupo de aminoácidos pequeños que consiste de, en orden de tamaño decreciente, E, T, N, P, D, C, S, A, y G; f. A128 y/o K146 y/o K160 y/o A174 y/o F200 reemplazados con otro aminoácido que se selecciona a partir del grupo de aminoácidos hidrofóbicos que consiste de I, L, M, V, F, y Y; y/o que tienen una deleción de por lo menos un aminoácido en las posiciones S258 y Y259 en [SEQ ID No.l], o en posiciones que correspondan a las mismas, opcionalmente en combinación con extensión en el extremo C-terminal, de preferencia mediante uno de los fragmentos TTKTQLSCTKW [SEQ ID NO.2] y KTQLSCTKW [SEQ ID No.3] y/o en combinación con extensión en el extremo N-terminal . En una modalidad de la invención, en los mutantes aislados de la invención el extremo C-terminal se puede truncar mediante deleción de por lo menos de por lo menos un residuo de aminoácido, por ejemplo mediante deleción de S258 y/o Y259 o de posiciones correspondientes a los mismos y después se extiende, de preferencia mediante uno de los fragmentos TTKTQLSCTKW [SEQ ID No.2] y KTQLSCTKW [SEQ ID No.3] . Para mayor claridad, la frase "sustituciones de aminoácido en, o que corresponda a las sustituciones en, [SEQ ID No.l]" significa que dichas sustituciones pueden ser sustituciones en [SEQ ID No.l], o pueden ser sustituciones en una secuencia de tipo silvestre diferente de aquella de E . coli K12 en posiciones correspondientes a aquellos que en E . coli pudieran estar en las posiciones numeradas.

De manera más preferida, la DERA mutante aislada tiene una o más de las mutaciones en, o que correspondan a las mutaciones en, [SEQ ID No.l] que se seleccionan a partir del grupo de K13R, T19S, Y49F, N80S, D84G, A93G, E127G, A128V, K146V, K160M, I166T, A174V, M185T, M185V, K196R, F200I, F200M, F200V, S239C, ?S258, ?Y259, extensión en el extremo C-terminal con TTKTQLSCTKW [SEQ ID No.2], y extensión en el extremo C-terminal con KTQLSCTKW [SEQ ID No.3] . Como se indicó en la presente invención, el código de una letra que precede al número de posición del aminoácido en [SEQ ID No.l] indica el aminoácido que está presente en la enzima de E. coli de tipo silvestre, y el código de una letra después del número de posición del aminoácido en [SEQ ID No.l] indica el aminoácido como está presente en el mutante. El número de posición del aminoácido refleja el número de posición en la DERA de [SEQ ID No.l] y cualquier posición correspondiente a la misma en otros tipos silvestres de DERA provenientes de otras fuentes. De manera más particular, la DERA mutante aislada tiene por lo menos las siguientes dos mutaciones en, o que corresponden a las dos mutaciones en, [SEQ ID No. 1] que se seleccionan a partir del grupo de F200I y ?Y259; F200M y ?Y259; F200V y ?Y259; F200I y extensión en el extremo C-terminal con KTQLSCTKW [SEQ ID No.3]; F200M y extensión en el extremo C-terminal con KTQLSCTKW [SEQ ID No.3]; y F200V y extensión en el extremo C-terminal con KTQLSCTKW [SEQ ID No.3] . La invención también se refiere a un procedimiento para el tamizaje respecto a enzimas de tipo silvestre provenientes del grupo de enzimas de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa que tienen un factor de productividad, según se determina mediante la Prueba de Factor de Productividad de DERA, en la producción de 6-cloro-2, 4 , 6-tridesoxi-D-eritrohexapiranósido (CTeHP) a partir de una mezcla por lo menos equimolar de acetaldehido y cloroacetaldehido, el cual es por lo menos 10% más alto que el factor de productividad para la enzima 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa proveniente de Escherichia coli K12 (EC 4.1.2.4) que tiene una secuencia de enzima de tipo silvestre de [SEQ ID No.l], en la cual (A) posteriormente (i) se aisla ADN y/o ADNc total y/o genómico; (ii) se prepara una genoteca de expresión de dicho ADN aislado, que consiste de clones individuales que comprenden dicho ADN aislado; (iii) los clones individuales provenientes de la genoteca de expresión obtenida se incuban con una mezcla de los substratos acetaldehido y cloroacetaldehido; (iv) se aislan uno o más de los genes provenientes de uno o más de los clones que muestran conversión de estos substratos en 4-cloro-3- (S) -hidroxi-butiraldehido (CHBA) y/o 6-cloro-2, 4 , 6-tridesoxi-D-eritrohexapiranósido (CTeHP) y se vuelven a clonar en el mismo antecedente genético que aquel para [SEQ ID No.6] ; y en el cual (B) las enzimas de DERA codificadas por los genes vueltos a clonar obtenidos en el paso (iv) se expresan y analizan por medio de la Prueba de Factor de Productividad de DERA, con lo cual se obtiene un factor de productividad para cada una de dichas enzimas de tipo silvestre; y en la cual (C) el factor de productividad para estas enzimas de tipo silvestre proveniente del paso (B) se compara con el factor de productividad de la enzima de tipo silvestre proveniente de Escheri chia coli K12 (EC 4.1.2.4) que tiene una secuencia de [SEQ ID No.l], y se seleccionan y se aislan uno o más de los genes que codifican para la enzima DERA que tenga un factor de productividad por lo menos 10% más alto en dicha comparación. El aislamiento de ADN y/o ADNc total y/o genómico, como se menciona en el paso (i) anterior, se puede efectuar, por ejemplo, a partir de microorganismos o a partir de muestras ambientales tales como suelo o agua. La genoteca de expresión de ADN aislado tal como se prepara en el paso (ii) consiste de clones individuales, que comprenden dicho ADN aislado, cuyo ADN codifica para una o más enzimas diferentes. La incubación con una mezcla de acetaldehido y cloroacetaldehido en el paso (iii) anterior, para la evaluación de la presencia de actividad de DERA, se puede efectuar con dichas mezclas en un intervalo de relación molecular amplio de estos substratos, por ejemplo desde 0.2:1 hasta 5:1. Es evidente, que la evaluación cualitativa anticipada de la conversión de estos substratos en 4-cloro-3- (S) -hidroxi-butiraldehido (CHBA) y/o 6-cloro-2, 4 , 6-tridesoxi-D-eritrohexapiranósido (CTeHP) puede proveer una primera indicación de la efectividad de los genes presentes en los clones individuales provenientes de la genoteca de expresión del paso (ii) . Por lo tanto, ya en esta etapa, se puede establecer cierta clasificación en cuanto a actividad de los diversos genes que codifican para las enzimas de DERA. Está evaluación permite el aislamiento de los genes más prometedores. Sin embargo, debido a que el objetivo final del procedimiento de tamizaje es encontrar DERAs (tipo silvestre) que tienen un factor de productividad, según se determina mediante la DPFT, en la producción de 6-cloro-2, 4, 6-tridesoxi-D-eritrohexapiranósido (CTeHP) a partir de una mezcla por lo menos equimolar de acetaldehido y cloroacetaldehido, que sea por lo menos 10% más alto que el factor de productividad para la enzima 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa proveniente de Escherichia coli K12, estos genes seleccionados, o un número más pequeño de los mismos según se desee, se aislan y se vuelven a clonar en el mismo antecedente genético que aquel para [SEQ ID No.6]. Este paso asegura la expresión apropiada de las enzimas a ser evaluadas en una manera comparable con la expresión de la enzima DERA de tipo silvestre proveniente de Escherichia coli K12. Después de tamizar y analizar por medio de la DPFT, y de efectuar la comparación apropiada con los resultados de la DPFT para la enzima DERA de tipo silvestre proveniente de Escherichia coli K12, es muy fácil encontrar DERAs de tipo silvestre apropiadas, por ejemplo dichas DERAs se pueden utilizar después como punto de partida para obtener mutantes de conformidad con la presente invención. La invención, además, se refiere a un procedimiento para el tamizaje respecto a enzimas mutantes provenientes del grupo de enzimas de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa que tienen un factor de productividad, según se determina mediante la Prueba de Factor de Productividad de DERA, en la producción de 6-cloro-2, 4 , 6-tridesoxi-D-eritrohexapiranósido (CTeHP) a partir de una mezcla por lo menos equimolar de acetaldehido y cloroacetaldehido, que puede ser por lo menos 10% más alto que el factor de productividad para la enzima de tipo silvestre correspondiente o por lo menos 10% más alto que el factor de productividad para la enzima 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa proveniente de Escherichia coli K12 (EC 4.1.2.4) que tiene una secuencia de enzima de tipo silvestre de [SEQ ID No.l]. En dicho procedimiento (A) posteriormente (i) se mutan y clonan genes que codifica para una enzima 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa de tipo silvestre, en una manera conocida per se, en el mismo antecedente genético que aquel para el gen que codifica para DERA de E . coli K12 que tiene [SEQ ID No. 6], respectivamente en el mismo antecedente genético que aquel para el gen de tipo silvestre correspondiente a partir del cual ésta es un mutante, con lo cual se obtiene una genoteca de expresión de clones a partir de los mutantes preparados de esta manera; y en el cual (B) las enzimas de DERA en los clones se expresan y analizan por medio de la Prueba de Factor de Productividad de DERA, con lo cual se obtiene un factor de productividad para cada una de las enzimas mutantes; y en el cual (C) el factor de productividad para las enzimas mutantes se compara con aquel para la enzima de tipo silvestre correspondiente, o con aquel de la enzima de tipo silvestre proveniente de Escherichia coli K12 (EC 4.1.2.4) que tiene una secuencia de [SEQ ID No.l], y se seleccionan y aislan uno o más genes que codifican para una DERA mutante que tiene un factor de productividad por lo menos 10% más alto en la comparación respectiva . De manera más particular, la invención se refiere a un procedimiento en el cual (A) posteriormente (i) se mutan y se clonan genes que codifican para una enzima 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa de tipo silvestre, en una manera conocida per se, en el mismo antecedente genético que aquel para DERA de E. coli K12, respectivamente para el gen de tipo silvestre correspondiente a partir del cual ésta es un mutante, con lo cual se obtiene una genoteca de expresión de clones a partir de los mutantes preparados de esta manera; (ii) los clones individuales provenientes de la genoteca de expresión obtenida se incuban con una mezcla de los substratos acetaldehido y cloroacetaldehido; (iii) se seleccionan uno o más de los clones que muestran la conversión más alta de estos substratos en 4-cloro-3- (S) -hidroxi-butiraldehido (CHBA) y/o 6-cloro-2 , , 6-tridesoxi-D-eritrohexapiranósido (CTeHP) ; (B) las enzimas de DERA en los clones seleccionados provenientes del paso (iii) se expresan y analizan por medio de la Prueba de Factor de Productividad de DERA, con lo cual se obtiene un factor de productividad para cada una de las enzimas mutantes; y (C) se compara el factor de productividad para las enzimas mutantes seleccionadas con aquel para la enzima de tipo silvestre correspondiente, o con aquel de la enzima de tipo silvestre proveniente de Escherichia coli K12 (EC 4.1.2.4) que tiene una secuencia de [SEQ ID No.l], y se seleccionan y aislan uno o más genes que codifican para una DERA mutante que tiene un factor de productividad por lo menos 10% más alto en la comparación respectiva. Este segundo tipo de tamizaje, para mutantes, comienza a partir de genes que se sabe codifican para una enzima 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa de tipo silvestre que se obtiene, por ejemplo, utilizando el procedimiento para el tamizaje respecto a enzimas de DERA de tipo silvestre de conformidad con la invención o a partir de genes que codifican para enzimas de DERA de tipo silvestre por ejemplo como las referidas en las tablas 1 ó 2. Estos genes primero se mutan y se clonan, en una manera conocida per se, en el mismo antecedente genético que aquel para DERA de E . coli K12, respectivamente para el gen de tipo silvestre correspondiente a partir del cual ésta es un mutante. Dichos genes, por ejemplo, se pueden obtener a partir de microorganismos o a partir de muestras ambientales tales como suelo o agua. La mutación y clonación antes mencionadas da como resultado una genoteca de expresión de clones a partir de los mutantes preparados de esta manera. De hecho, como es bien sabido por el experto en la técnica, dicha genoteca de expresión se prepara preparando posteriormente una genoteca de ADN de los mutantes, clonando cada una de las moléculas de ADN individuales en un vector, y transformando los vectores en un hospedero de expresión apropiado. La incubación con una mezcla de acetaldehido y cloroacetaldehido en el paso (ii) anterior, para establecer la presencia de actividad de DERA, de nuevo, se puede efectuar con dichas mezclas en un intervalo de relación molecular amplio de estos substratos, por ejemplo desde 0.2:1 hasta 5:1. La evaluación cualitativa de la conversión de estos substratos en 4-cloro-3- (S) -hidroxi-butiraldehido (CHBA) y/o 6-cloro-2, 4 , 6-tridesoxi-D-eritrohexapiranósido (CTeHP) da como resultado después una primera clasificación del grado de conversión de estos substratos en 4-cloro-3- (S) -hidroxi-butiraldehido (CHBA) y/o 6-cloro-2 , 4 , 6-tridesoxi-D-eritrohexapiranósido (CTeHP) , y se puede seleccionar uno o más de los clones que muestren la conversión más alta para evaluación posterior por medio de la DPFT. No es necesario decir que se debe asegurar la expresión apropiada de las enzimas con el fin de que se puedan comparar fácilmente los resultados de la prueba con aquellos para la expresión de la enzima DERA de tipo silvestre proveniente de Escherichia coli K12, respectivamente para el gen de tipo silvestre correspondiente a partir del cual ésta es un mutante. De esta manera es muy fácil encontrar y aislar genes apropiados que codifican para DERAs mutantes, que después se puede utilizar de manera apropiada en la producción comercial de productos farmacéuticos valiosos tales como estatinas . Se debe mencionar que el procedimiento de tamizaje antes descrito es diferente del utilizado por W. A. Greenberg et al . , en PNAS, vol. 101, p.5788-5793 (2004), citado anteriormente. Los autores de dicho articulo utilizan específicamente una prueba de detección fluorescente, como la descrita por R. Pérez Carlón et al . en Chem. Eur. J. , 6, p. 4154- 4162 (2000). Dicha prueba de detección es un método muy indirecto en el cual la actividad de DERA se determina por medio de un derivado fluorescente de umbeliferona del substrato 2-desoxi-D-ribosa. Sin embargo, dicho método es menos apropiado (debido a que requiere de una prueba adicional para determinar la actividad deseada en la reacción deseada con aldehidos sustituidos) para la determinación de productividad de DERA (asi como de la actividad) en la producción de 6-cloro-2, 4 , 6-tridesoxi-D-eritrohexapiranósido (CTeHP) a partir de una mezcla por lo menos equimolar de acetaldehido y cloroacetaldehido, debido a que en primera instancia únicamente se obtienen enzimas, las cuales presentan una reacción retroaldólica muy similar a la reacción de substrato natural de DERA y dichas enzimas se analizan respecto a la reacción objetivo en un segundo tamizaje adicional. Para superar dichos problemas, los presentes inventores han desarrollado su propio método de tamizaje, directo, y también desarrollaron la denominada Prueba de Factor de Productividad de DERA. De manera apropiada, en dicho tamizaje respecto a mutantes en el primer paso se mutan los genes que codifican para una enzima 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa de tipo silvestre, que se originan a partir de una de las fuentes indicadas en las tablas 1, 2 y 3. Por consiguiente, la presente invención La presente invención también se refiere a ácidos nucleicos aislados que se pueden obtener mediante cualquiera de dichos procedimientos de tamizaje, en particular aquellos que se pueden obtener utilizando el procedimiento de tamizaje aplicado a genes mutados que codifican para una enzima 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa de tipo silvestre, que se originan a partir de una de las fuentes indicadas en las tablas 1, 2 y 3. La presente invención también se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica para una enzima 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa mutante, en el cual el ácido nucleico aislado codifica para un mutante que tiene un factor de productividad el cual es por lo menos 10% más alto que el factor de productividad para la enzima de tipo silvestre correspondiente a partir de la cual ésta es un mutante y en el cual los factores de productividad tanto de la enzima mutante como de la enzima de tipo silvestre correspondiente se miden bajo condiciones idénticas. Asimismo, la presente invención se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica para una enzima 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa mutante, en el cual el ácido nucleico aislado codifica para un mutante que tiene un factor de productividad el cual es por lo menos 10% más alto que el factor de productividad para la enzima de tipo silvestre correspondiente a partir de la cual ésta es un mutante y en el cual los factores de productividad tanto de la enzima mutante como de la enzima de tipo silvestre correspondiente se miden bajo condiciones idénticas y que tienen un factor de productividad el cual es por lo menos 10% más alto que el factor de productividad para la 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa proveniente de Escherichia coli K12 (EC 4.1.2.4) que tiene la secuencia de enzima de tipo silvestre de [SEQ ID No. 1] y en el cual los factores de productividad tanto de la enzima mutante como de la enzima de Escherichia coli K12 se miden bajo condiciones idénticas. Asimismo, la invención también se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica para un mutante de Escherichia coli K12 (EC 4.1.2.4) que tiene la secuencia de enzima de tipo silvestre de [SEQ ID No. 1] . Además, la invención también se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica para una enzima 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa mutante que tiene por lo menos una sustitución de aminoácido en una o más de las posiciones, o en una o más de las posiciones K13, T19, Y49, N80, D84, A93, E127, A128, K146, K160, 1166, A174, M185, K196, F200, y S239 en [SEQ ID No.l] o en posiciones que correspondan a las mismas, de preferencia en la posición F200 o en una posición correspondiente a la misma, y/o una deleción de por lo menos un aminoácido en una de las posiciones S258 o Y259 en [SEQ ID No.l] o en posiciones que correspondan a las mismas, opcionalmente en combinación con extensión en el extremo C-terminal, de preferencia mediante uno de los fragmentos TTKTQLSCTKW [SEQ ID No.2] y KTQLSCTKW [SEQ ID No.3] y/o en combinación con una extensión en el extremo N-terminal. De preferencia, dicho ácido nucleico aislado codifica una enzima 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa mutante que tiene por lo menos una de las sustituciones de aminoácido en, o que corresponda a las sustituciones en, [SEQ ID No.l] que se selecciona a partir del grupo que consiste de: a. K13 y/o K196 reemplazados con un aminoácido con carga positiva, de preferencia con R o H; b. T19 y/o M185 reemplazados con otro aminoácido, de preferencia con otro aminoácido que se selecciona a partir de los grupos que consisten de aminoácidos hidrofilicos, que consisten en particular de S, T, C, Q, y N, y/o aminoácidos hidrofóbicos, que consisten en particular de V, L e I; c. Y49 reemplazado con un aminoácido aromático que se selecciona a partir del grupo que consiste de F y W; d. N80 y/o 1166 y/o S239 reemplazados con otro aminoácido que se selecciona a partir del grupo de aminoácidos hidrofilicos que consiste de T, S, C, Q y N; e. D84 y/o A93 y/o E127 reemplazados con otro aminoácido, de preferencia más pequeño, que se selecciona a partir del grupo de aminoácidos pequeños que consiste de, en orden de tamaño decreciente, E, T, N, P, D, C, S, A, y G; f. A128 y/o K146 y/o K160 y/o A174 y/o F200 reemplazados con otro aminoácido que se selecciona a partir del grupo de aminoácidos hidrofóbicos que consiste de I, L, M, V, F, y Y; y/o que tienen una deleción de por lo menos un aminoácido en las posiciones S258 y Y259 en [SEQ ID No.l], o en posiciones que correspondan a las mismas, opcionalmente en combinación con extensión en el extremo C-terminal, de preferencia mediante uno de los fragmentos TTKTQLSCTKW [SEQ ID No.2] y KTQLSCTKW [SEQ ID No.3] y/o en combinación con extensión en el extremo N-terminal. De manera más preferida, el ácido nucleico aislado de conformidad con la presente invención codifica para una enzima 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa mutante que tiene por lo menos una o más de las mutaciones en, o que correspondan a las mutaciones en, [SEQ ID No.l] que se seleccionan a partir del grupo de K13R, T19S, Y49F, N80S, D84G, A93G, E127G, A128V, K146V, K160M, I166T, A174V, M185T, M185V, K196R, F200I, F200V, F200M y S239C, y/o una deleción de por lo menos un aminoácido en las posiciones ?S258 y ?Y259 en [SEQ ID No.l], o en posiciones que correspondan a las mismas, opcionalmente en combinación con extensión en el extremo C-terminal mediante uno de los fragmentos TTKTQLSCTKW [SEQ ID No.2] y KTQLSCTKW [SEQ ID No.3]. De manera más particular, el ácido nucleico de conformidad con la presente invención codifica para una enzima 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa mutante que tiene por lo menos las siguientes dos mutaciones en, o que corresponden a las dos mutaciones en, [SEQ ID No. 1] que se seleccionan a partir del grupo de F200I y ?Y259; F200M y ?Y259; F200V y ?Y259; F200I y extensión en el extremo C-terminal con KTQLSCTKW [SEQ ID No.3]; F200M y extensión en el extremo C-terminal con KTQLSCTKW [SEQ ID No.3]; y F200V y extensión en el extremo C-terminal con KTQLSCTKW [SEQ ID No.3] . Además, la invención se refiere a vectores que comprenden cualquiera de dichos ácidos nucleicos como los descritos anteriormente en la presente invención, asi como a células hospederas que comprenden un mutante del grupo de enzimas de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa de tipo silvestre como el descrito anteriormente, o a dichas enzimas mutantes que se pueden obtener de conformidad con los procedimientos de tamizaje como se describió anteriormente en la presente invención, y/o a células hospederas que comprenden un ácido nucleico aislado como el descrito anteriormente y/o que comprenden dichos vectores como los antes descritos. De igual manera, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasas mutantes que tienen un factor de productividad el cual es por lo menos 10% más alto que el factor de productividad para la enzima de tipo silvestre correspondiente y/o para la enzima 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa proveniente de Escherichia coli (EC 4.1.2.4) que tiene una secuencia de enzima de tipo silvestre de [SEQ ID No.l], en el cual se utilizan ácidos nucleicos como los descritos anteriormente en la presente invención, o vectores como los descritos anteriormente, o células hospederas como las descritas anteriormente.

La presente invención también se refiere a un procedimiento mejorado para la preparación de una 2,4-didesoxihexosa o una 2, 4 , 6-tridesoxihexosa de la fórmula 1 en la cual R1 y Rx representan cada uno de manera independiente H o un grupo protector y en la cual X representa un halógeno; un grupo tosilato; un grupo mesilato; un grupo aciloxi; un grupo fenilacetiloxi; un grupo alcoxi o un grupo ariloxi a partir de acetaldehido y el acetaldehido sustituido correspondiente de la fórmula HC(0)CH2X, en la cual X es como se definió anteriormente, en el cual se utiliza una enzima DERA mutante de conformidad con la presente invención, o que se produce utilizando un procedimiento de conformidad con la presente invención, o que se puede obtener mediante el procedimiento de tamizaje de enzimas mutantes de conformidad con la presente invención, y en el cual - en caso que R1 y/o Rx representen un grupo protector, el grupo o grupos hidroxi en el compuesto formado está/están protegidos con el grupo protector en una manera conocida per se . De preferencia, X representa un halógeno, más preferido Cl, Br o I ; o un grupo aciloxi, más preferido un grupo acetoxi. La enzima DERA mutante se puede utilizar en la reacción antes descrita utilizando condiciones de reacción como las descritas en la técnica para estas reacciones empleando enzimas DERA de tipo silvestre, por ejemplo utilizando condiciones de reacción como las descritas en el documento US 5,795,749, por ejemplo en la columna 4, lineas 1-18 o por ejemplo utilizando condiciones de reacción de lote alimentado como se describe en W. A. Greenberg et al . , PNAS, vol. 101, pp 5788-5793, (2004). De preferencia, la enzima DERA mutante de la invención se emplea en la reacción antes descrita utilizando condiciones de reacción como las descritas en el documento WO03/006656. La concentración de carbonilo, es decir la suma de la concentración de aldehido, aldehido sustituido en la posición 2 y el producto intermediario que se forma en la reacción entre el aldehido y el aldehido sustituido en la posición 2 (en especifico un intermediario 4-sustituido-3-hidroxi-butiraldehido) , de preferencia se mantiene en un valor por debajo de 6 moles/1 durante el procedimiento de síntesis. Será evidente para el experto en la técnica que una concentración ligeramente más alta durante un tiempo (muy) corto tendrá poco efecto. De manera más preferida, la concentración de carbonilo se elige entre 0.1 y 5 moles por litro de mezcla de reacción, más preferido entre 0.6 y 4 moles por litro de mezcla de reacción . La temperatura y el pH de la reacción no son críticos y ambos se eligen como una función del substrato. De preferencia, la reacción se efectúa en fase liquida. La reacción se puede efectuar, por ejemplo, a una temperatura de reacción entre -5 y +45°C, y a un pH entre 5.5 y 9, de preferencia entre 6 y 8. La reacción de preferencia se efectúa a un pH más o menos constante, utilizando, por ejemplo, una solución reguladora o titulación automática. Como solución reguladora, por ejemplo, se puede aplicar bicarbonato de sodio y potasio, fosfato de sodio y potasio, trietanolamina/HCl, bis-tris-propano/HCl y HEPES/KOH. De preferencia se aplica una solución reguladora de bicarbonato de potasio o sodio, por ejemplo en una concentración entre 20 y 400 mmoles/l de mezcla de reacción. La relación molar entre la cantidad total de aldehido y la cantidad total de aldehido sustituido en la posición 2 no es muy critica y de preferencia está entre 1.5:1 y 4:1, en particular entre 1.8:1 y 2.2:1. La cantidad de enzima DERA mutante utilizada en el procedimiento de la invención en principio no es critica. Es experimentación de rutina determinar la concentración óptima de enzima para una reacción enzimática y por lo tanto el experto en la técnica puede determinar fácilmente la cantidad de enzima DERA mutante que será utilizada . En una modalidad preferida de la invención, R1 y Rx representan ambos H. En una modalidad incluso más preferida de la invención, el compuesto de la fórmula (1) está enantioméricamente enriquecido. Los grupos protectores que pueden ser representados por R1 y Rx incluyen grupos protectores de alcohol, ejemplos de los cuales son bien conocidos en la técnica. Un ejemplo particular incluye grupos tetrahidropiranilo. Los grupos protectores preferidos son grupos sililo, por ejemplo grupos triarilsililo y de preferencia grupo trialquilsililo y grupos hidrocarbilo. Los grupos protectores incluso más preferidos son grupos bencilo, metilo, trimetilsililo, t-butilmetilsililo y t-butildifenilsililo. Los grupos protectores que pueden ser representados por R1 y Rx pueden ser iguales o diferentes. Cuando los grupos protectores R1 y Rx son diferentes, esto puede permitir de manera conveniente la remoción selectiva de únicamente R1 y Rx . De preferencia, cuando los grupos protectores R1 y Rx son diferentes, R1 es un grupo bencilo o sililo y Rx es un grupo metilo.

El compuesto de la fórmula (1), en la cual Rx representa H, se puede utilizar en un procedimiento (análogo al procedimiento) como el descrito en los documentos WO04/096788, WO05/012246 o WO04/027075. Por lo tanto, la invención también se refiere a un procedimiento, en el cual el compuesto de la fórmula (1), en la cual X y R1 son como se definieron anteriormente y en la cual Rx representa H se produce de conformidad con la invención y se hace reaccionar posteriormente cono un agente oxidante para formar el compuesto correspondiente de la fórmula (2) en la cual X y R1 son como se definieron anteriormente y en la cual el compuesto de la fórmula 2 se hace reaccionar posteriormente con un ion cianuro para formar un compuesto de la fórmula (3) en la cual R1 es como se definió anteriormente. Para esta reacción se pueden utilizar condiciones de procesamiento como las descritas para este paso del procedimiento en el documento WO 04/096788 en la página 2, linea 10 - página 3, linea 13. De manera alternativa, se pueden utilizar condiciones de procesamiento como las descritas en el documento WO 05/012246 (véase por ejemplo página 5, lineas 19-26) o como las descritas en el documento WO 04/027075 (por ejemplo las descritas en el ejemplo 2) . En una modalidad diferente de la invención, el compuesto de la fórmula (1) se puede hacer reaccionar primero con un ion cianuro, por ejemplo bajo condiciones de procesamiento como las descritas en el documento WO 05/012246 o utilizando las condiciones de procesamiento de los documentos WO 04/096788 ó WO 04/027075, para formar un compuesto de la fórmula (4) en la cual R1 y Rx representan cada uno de manera independiente H o un grupo protector, después de lo cual el compuesto de la fórmula (4), - en caso que Rx represente un grupo protector después de la remoción del grupo protector -, se puede hacer reaccionar con un agente oxidante para formar el compuesto correspondiente de la fórmula (3), en la cual R1 es como se definió anteriormente . Para las reacciones de cianuración anteriores, se puede utilizar agua como un solvente en combinación con otros solventes, por ejemplo con tetrahidrofurano, CH3CN, alcoholes, dioxano, sulfóxido de dimetilo, dimetilformamida, N-metil-pirrolidona, tolueno, éter dietilico y/o éter metil-t-butilico . De preferencia se utiliza por lo menos 5% p/p, más preferido por lo menos 10% p/p, incluso más preferido por lo menos 20 % p/p, incluso más preferido por lo menos 30% p/p, incluso más preferido por lo menos 40% p/p, incluso más preferido por lo menos 50% p/p, incluso más preferido por lo menos 60% p/p, incluso más preferido por lo menos 70% p/p, incluso más preferido por lo menos 80% p/p de agua, de manera más preferida por lo menos 90% p/p de agua en otro solvente. Por razones practicas, se prefiere en particular utilizar agua como el único solvente. Utilizando las condiciones de reacción y procesamiento descritas en el documento WO 04/096788 (por ejemplo en la página 5, linea 14 - página 7, linea 3), el compuesto de la fórmula (4) se puede convertir posteriormente en un compuesto de la fórmula (5) (5) en la cual R , R y R representan cada uno de manera independiente un alquilo con, por ejemplo, 1 a 12 átomos de carbono, de preferencia 1-6 átomos de carbono, un alquenilo con, por ejemplo, 1 a 12 átomos de carbono, de preferencia 1-6 átomos de carbono, un cicloalquilo con, por ejemplo, 3-7 átomos de carbono, un cicloalquenilo con, por ejemplo, 3-7 átomos de carbono, un arilo con, por ejemplo, 6-10 átomos de carbono o un aralquilo con, por ejemplo, 7 a 12 átomos de carbono, cada uno de R2, R3 y R4 puede estar sustituido y en la cual R2 y R3 pueden formar un anillo junto con el átomo de carbono al cual estos están unidos, utilizando un agente formador de acetal apropiado, en presencia de un catalizador ácido, por ejemplo como los descritos en el documento WO 02/06266. De conformidad con el documento WO 04/096788, el compuesto de la fórmula 5, en la cual R2, R3 y R4 son como se definieron anteriormente se puede hidrolizar posteriormente para formar la sal correspondiente de la fórmula 6, (6) en la cual Y representa un metal alcalino, por ejemplo litio, sodio, potasio, de preferencia sodio; un metal alcalinotérreo, por ejemplo magnesio o calcio, de preferencia calcio; o un grupo amonio sustituido o no sustituido, de preferencia un grupo tetra-alquilamonio, por ejemplo como se describe en el documento WO 04/096788 en la página 7, linea 4 - página 8, linea 16) . De manera opcional, la hidrólisis es seguida por conversión al compuesto correspondiente de la fórmula (6), en la cual Y es H, por ejemplo como se describe en el documento WO 02/06266. De conformidad con el documento WO 04/096788, la sal de la fórmula (6) también se puede convertir en el éster correspondiente de la fórmula 7 (7) en la cual R2 y R3 son como se definieron anteriormente y en la cual R5 puede representar los mismos grupos indicados anteriormente para R2 y R3, en una manera conocida per se (por ejemplo como se describe en el documento WO 02/06266). Por ejemplo, R5 puede representar un grupo metilo, etilo, propilo, isobutilo o ter-butilo. Un grupo importante de esteres de la fórmula 8 que se pueden preparar con el procedimiento de conformidad con la invención son los esteres ter-butilicos (R5 representa terbutilo) . En un aspecto especial de la invención la sal de la fórmula (6) se convierte en el éster correspondiente de la fórmula (7) poniendo en contacto la sal de la fórmula (6) en un solvente inerte, por ejemplo tolueno, con un agente formador de cloruro de ácido para formar el cloruro de ácido correspondiente y poniendo en contacto el cloruro de ácido formado con un alcohol de la fórmula R5OH, en la cual R5 es como se definió anteriormente, en presencia de N-metil-morfolina (NMM) de conformidad con el procedimiento descrito en el documento WO 03/106447 y en el documento WO 04/096788, página 9, linea 2- página 10, linea 2. Los compuestos que se preparan utilizando el procedimiento la invención son particularmente útiles en la preparación de un ingrediente activo de un preparado farmacéutico, por ejemplo en la preparación de inhibidores de HMG-CoA reductasa, de manera más particular en la preparación de estatinas, por ejemplo, lovastatina, cerivastatina, rosuvastatina, simvastatina, pravastatina y fluvastatina, en particular para ZD-4522 como se describe en "Drugs of the future" (1999), 24(5), 511-513 por M. Watanabe et al., Bioorg & Med. Chem. (1997), 5(2), 437-444. Por lo tanto, la invención provee una ruta novedosa, económicamente atractiva para la preparación de compuestos, en particular el compuesto de la fórmula (1), que se puede utilizar para la síntesis de estatinas. Un ejemplo particularmente interesante de dicha preparación es la preparación de Atorvastatina calcica en la forma descrita por A. Kleemann, J. Engel; pharmaceutical substances, synthesis, patents, applications 4a edición, 2001 Georg Thieme Verlag, p. 146-150. Por lo tanto, la invención también se refiere a un procedimiento, en el cual un compuesto obtenido en un procedimiento de conformidad con la invención se convierte posteriormente en una estatina, de preferencia atorvastatina o una sal de la misma, por ejemplo su sal calcica, utilizando el procedimiento de la invención y pasos de procesamiento adicionales conocidos per se . Dichos procedimientos son bien conocidos en la técnica. A continuación se explica la invención mediante los siguientes resultados experimentales sin estar restringidos a los mismos en forma alguna.

SECCIÓN EXPERIMENTAL GENERALIDADES Métodos para identificar mutantes de DERA que tienen resistencia o productividad mejoradas Se pueden utilizar dos métodos para identificar mutantes de DERA que tienen resistencia o productividad mejorada. Un método examina la resistencia de mutantes de DERA hacia cloroacetaldehido, el otro evalúa la productividad de los mutantes de DERA en la producción de 6-cloro-2, 4, 6-tridesoxi-D-eritrohexapiranósido (CTeHP) utilizando cloroacetaldehido y acetaldehido como substratos. El primer método examina la resistencia de mutantes de DERA hacia cloroacetaldehido utilizando una forma basada en micro-titulo de la prueba de actividad de substrato natural de DERA estándar, empleando el substrato natural de DERA, 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato como substrato. El segundo método analiza la productividad de los mutantes de DERA sobre acetaldehido y cloroacetaldehido como substratos en la producción de 4-cloro-3- (S) -hidroxi-butiraldehido (CHBA) , el cual es el producto de la reacción aldólica catalizada con DERA con una molécula de cada uno de acetaldehido y cloroacetaldehido y por lo tanto un intermediario en la reacción para CTeHP, utilizando un método de análisis de cromatografía de gases de alto rendimiento acoplado a espectrometría de masas (GC/MS) .

Determinación de concentraciones de proteina en solución Se determinan las concentraciones de proteínas en soluciones tales como extractos libres de célula (ele) utilizando un método de unión a proteina-colorante modificado como el descrito por Bradford en Anal . Biochem . 72:248-254 (1976). De cada muestra, se incuban 50 µl en una dilución apropiada con 950 µl de reactivo (100 mg de Azul Brillante G250 disuelto en 46 ml de etanol y 100 ml de ácido orto-fosfórico al 85%, que se lleva hasta 1,000 ml con agua milli-Q) durante por lo menos cinco minutos a temperatura ambiente. Se mide la absorción de cada muestra a una longitud de onda de 595 nm en un espectrómetro UV/VIS Lambda20 de Perkin Elmer. Utilizando una curva de calibración que se determina con soluciones que contienen concentraciones conocidas de seroalbúmina bovina (BSA, que varian desde 0.025 mg/ml hasta 0.25 mg/ml) se calcula la concentración de proteina en las muestras.

Prueba de Factor de Productividad de DERA Los clones seleccionados a partir de ambos métodos, los cuales muestran resistencia mejorada hacia cloroacetaldehido o formación incrementada de CHBA se pueden caracterizar con respecto a su productividad en la formación de CTeHP utilizando la Prueba de Factor de Productividad de DERA. Para esta caracterización se incuba un volumen de ele que contiene entre 1.0 y 1.4 mg de ele con 0.04 mmoles de cloroacetaldehido y 0.093 mmoles de acetaldehido en solución reguladora de NaHC03 0.1 M (pH final = 7.2) en un volumen total de 0.2 ml con agitación. Después de 16 horas las reacciones se detienen mediante adición de 9 volúmenes de acetona o acetonitrilo y se centrifugan durante 10 minutos a 16,000 x g. El sobrenadante se analiza mediante cromatografía de gas en una columna Chrompack CP-SIL8CB (Varian) utilizando un detector FID detector para su contenido de CTeHP y CHBA. El "Factor de Productividad de DERA" se define como la cantidad de CTeHP en mmoles formada por 1 mg de proteínas de extracto libre de células que contienen DERA de tipo silvestre o mutada dentro de 16 horas a pH 7.2 a temperatura ambiente (25°C) a concentraciones de substrato de cloroacetaldehido 0.2 M y acetaldehido 0.4 M.

Prueba de actividad de substrato natural de DERA Para la estimación de la actividad de DERA, se puede determinar la actividad inicial en la reacción de substrato natural de DERA, el corte aldólico de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato hasta acetaldehido y D-gliceraldehido 3-fosfato, a temperatura ambiente (t. amb . ) . Se transfieren 10 µl de extracto libre de célula a 140 µl de solución reguladora de trietanolamina 50 mM (pH 7,5). La prueba de actividad se inicia agregando 50 µl de solución mixta de enzima auxiliar y substrato (NADH 0.8 mM, 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato 2 mM, triosa fosfato isomerasa (30 U/ml, Roche Diagnostics) y glicerol fosfato deshidrogenasa (10 U/ml, Roche Diagnostics) ) . La reacción se detienen después de 30 segundos agregando 50 µl de solución para detención (clorhidrato de guanidina 6 M, hidrogenofosfato de sodio 100 mM, TrisHCl 10 mM pH 7.5). La actividad inicial presente de DERA se determina midiendo la absorbancia en UV de la muestra a una longitud de onda de 340 nm. El consumo de una molécula de NADH corresponde a la disociación de una molécula de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato.

EJEMPLO 1 Mutantes de DERA con resistencia mejorada para cloroacetaldehido Construcción de genoteca de deoC variante de E . coli mediante mutagénesis aleatoria Para la construcción de una genoteca de mutagénesis aleatoria del gen deoC de E . coli K12 [SEQ ID No.6], el cual codifica para la enzima DERA de E . coli K12 [SEQ ID No. 1], se utiliza el estuche para mutagénesis aleatoria Diversify PCR de Clonetech. Se efectúan varias reacciones con concentración variable de MnS0 (con lo cual se introducen más mutaciones a medida que se eleva dicha concentración) de conformidad con el manual del proveedor lo que da como resultado 1 a 3 mutaciones de punto en el gen deoC de Escherichia coli K12, lo que da como resultado 1 a 2 intercambios de aminoácido en la secuencia de aminoácido de la enzima DERA. Para la amplificación del gen deoC de E . coli [SEQ ID No.6], que codifica para la 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa de E. coli [SEQ ID No.l], se utilizan los iniciadores DAI 13600 y DAI 13465 (que corresponden a [SEQ ID No .4 ] y [SEQ ID No.5], respectivamente) como el iniciador hacia el extremo 5' y hacia el extremo 3', respectivamente. Ambos iniciadores contienen sitios compatibles para clonar el fragmento obtenido del gen deoC amplificado mediante PCR mediante recombinación especifica de sitio utilizando Tecnología de Compuerta [Gateway Technology (Invitrogen)].

Secuencia del iniciador hacia el extremo 5' (DAI 13600) 5' GGG GAC AAG TTT GTA CAÁ AAA AGC AGG CTT CGA AGG AGA TAG AAC CAT GAC TGA TCT GAA AGC AAG CAG CC 3' [SEQ ID No.4] Secuencia del iniciador hacia el extremo 3' (DAI 13465) 5' GGG GAC CAC TTT GTA CAÁ GAA AGC TGG GTC TTA GTA GCT GCT GGC GCT C 3' [SEQ ID No.5] La amplificación con PCR propensa a error utiliza el siguiente programa de temperatura: 94 °C durante 2 minutos, 25 ciclos con 94 °C durante 30 segundos y 68°C durante 1 minuto, seguido por 68 °C durante 10 minutos. Los fragmentos de PCR propensa a error se clonan primero en un vector pDONR (Invitrogen) y se elaboran preparaciones de plásmido del clon pENTR a gran escala iniciando con más de 20,000 colonias. Estas preparaciones de pENTR se utilizan después para la construcción de construcciones de expresión utilizando el vector pDEST14 (Invitrogen) . Las construcciones de expresión se transforman después en Star (DE3) de E. coli BL21 químicamente competentes para expresión del gen deoC de E. coli K12 mutado que codifica para mutantes de enzima DERA.

Expresión de genes deoC mutados en placas de microtitulación de cavidad profunda Se recolectan colonias a partir de charolas Q (Q-trays) utilizando el dispositivo Q-pics de Genetix y se inoculan cultivos de 200 µl de medio 2*TY (que contiene 100 µg/ml de ampicilina) en placas de microtitulación (MTP) , estos pre-cultivos se dejan desarrollar después en un agitador giratorio ya sea a 25°C durante 2 dias, o a 37°C durante la noche. A partir de los pre-cultivos se utilizan 100 µl para inocular cultivos de expresión de 500 µl (2*TY, 100 µg/ml de ampicilina, IPTG 1 mM) en placas de cavidad profunda; estos cultivos de expresión se dejan desarrollar después en un agitador giratorio a 37°C durante 24 horas.

Prueba de estabilidad de DERA en placa de microtitulación Se puede utilizar una prueba para examinar la resistencia hacia cloroacetaldehido de enzimas DERA mutadas, la cual se basa en la reacción de substrato natural de DERA. Los cultivos de expresión en cavidad profunda se centrifugan a 4,000 rotaciones por minuto (rpm) durante 15 minutos y los comprimidos celulares de E. coli obtenidos se lisan en 400 µl de solución reguladora para lisis B-PER (B-PERII al 25% v/v (Pierce), solución reguladora de trietanolamina 50 mM al 75% (v/v), pH 7.5 más 100 mg/1 de ARNasa A) . Para concentraciones de cloroacetaldehido mayores de 120 mM de cloroacetaldehido, se utiliza trietanolamina 200 mM. Los restos celulares se eliminan mediante centrifugación (4,000 rpm, 4°C durante 15 minutos) y se transfieren 210 µl de extracto libe de células proveniente de cada cavidad a una placa de microtitulación nueva. Para la estimación de actividad de DERA se determina la actividad inicial en la reacción de substrato natural de DERA utilizando la Prueba de Actividad de Substrato Natural de DERA como se describió anteriormente. La resistencia de los mutantes de DERA hacia cloroacetaldehido se examina tomando los 200 µl de volumen remanente del extracto libre de células y agregando 50 µl de solución de cloroacetaldehido. En la primera ronda de tamizaje se utiliza una solución de cloroacetaldehido de reserva de 600 mM, para tamizar la primera genoteca mutante recombinada se utiliza una solución de reserva 1.0 M, y para la segunda genoteca mutante recombinada se utiliza una solución de reserva 1.5 M, lo que da como resultado concentraciones finales de 120, 200, y 300 mM de cloroacetaldehido, respectivamente. En todos los casos el tiempo de exposición es de 2 minutos. Después de esto se toman muestras de 50 µl (genoteca de PCR propensa a error) , muestras de 30 µl (primera genoteca mutante recombinada) o muestras de 25 µl (segunda genoteca mutante recombinada) , respectivamente, y se transfieren a una placa de micro-titulación que contiene solución reguladora de trietanolamina 50 mM (pH 7.5, volumen final de 200 µl) . Se determina la actividad de DERA remanente para la reacción de substrato natural de DERA, similar a la actividad de DERA inicial, agregando 50 µl de la mezcla de enzima auxiliar/substrato. Se permite que la prueba de reacción natural de DERA proceda durante 30 segundos antes de agregar 50 µl de solución de detención. Para determinar la cantidad de NADH consumida, se mide la absorbancia en UV de las muestras a 340 nm.

Recombinación de mutaciones favorables utilizando recombinación con enzima de restricción con extremo despuntado (BERE) (de conformidad con el documento WO03/010311) Se utilizan clones mutantes, seleccionados a partir de la genoteca de PCR propensa a error como una base para mejoramiento adicional de DERA mediante recombinación de sus mutaciones. Se aisla ADN plásmido de los mutantes seleccionados a partir de los cultivos de reserva y se utiliza como plantilla para amplificar los genes mutados. Los fragmentos de PCR del gen mutante resultantes se digieren con endonucleasas de restricción para corte del extremo despuntado, los fragmentos de gen obtenidos se vuelven a ensamblar como genes de longitud completa utilizando "ampligase" y Hercules ADN polimerasa. Para la recombinación se elaboran dos mezclas de fragmento de gen utilizando las endonucleasas de restricción fíaelll, fíinCII y FspI (mezcla A) y Cacl8 o BstUI (mezcla B) . Para la reacción de ampligase (volumen total 50 µl), con 0.5 µg de ADN del fragmento de gen proveniente de cada mezcla, se utiliza el siguiente programa de temperatura: 94°C durante 2 minutos, 30 ciclos de 94°C durante 30 segundos y 60°C durante 1 minuto, y un ciclo final de 10 minutos a 60°C. Se precipitan con etanol 20 µl de la reacción de ampligase, el comprimido de ADN (aproximadamente 0.4 µg de DNA) se disuelve en 40 µl de agua estéril y se utiliza como plantilla para amplificación mediante PCR de los genes mutantes recombinados. Para la reacción de PCR (volumen de 50 µl) utilizando Hercules ADN polimerasa (5 U) , se utilizan los iniciadores DAI 13600 ([SEQ ID No. 4]) y DAI 13465 ([SEQ ID No. 5]) como iniciadores de avance y de retroceso, respectivamente. Se utiliza el siguiente programa de PCR: 72°C durante 5 minutos, 15 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 50°C durante 30 segundos, y 72°C durante 45 segundos, ciclo final de 72°C durante 10 minutos. Los fragmentos de gen mutante de longitud completa obtenidos se purifican, utilizando el estuche de purificación para PCR Qiagen, y se clonan en el vector pDEST14 utilizando recombinación especifica de sitio como se describió anteriormente.

Segundo análisis de mutantes de DERA con resistencia mejorada a cloroacetaldehido Los pre-cultivos de mutantes de enzima DERA se inoculan a partir de la placa maestra de glicerol congelada y se incuban durante la noche con agitación a 180 rpm y a 25°C. Se utilizan alícuotas del pre-cultivo para inocular cultivos de expresión de 25 ml (medio 2*TY, 100 µg/ml ampicilina, 1 mM de IPTG) y se incuban durante 36 horas a 25°C (agitando con 180 rpm) . Las células se recolectan mediante centrifugación (5,000 rpm, 15 minutos) y el comprimido de células se lisa utilizando 2.5 ml de B-PER II. Los restos celulares se eliminan mediante centrifugación primero durante 15 minutos a 5,000 rpm, y después utilizando una centrifuga de escritorio Eppendorf durante 15 minutos a 14,000 rpm (4°C). Los extractos libres de células obtenidos se utilizan para examinar la resistencia de las enzimas mutantes de DERA expresadas hacia cloroacetaldehido en experimentos con seguimiento de tiempo y a través de intervalos de concentración. Para los experimentos con seguimiento de tiempo, se determina la actividad inicial de la reacción de substrato natural de DERA presente en la muestra por cuadruplicado. Se expone un volumen definidor extracto con una cantidad de actividad de DERA a 200 mM de cloroacetaldehido y en los puntos de tiempo t=l, t=5, t=10, t=15, y t=20 minutos después de la adición de cloroacetaldehido, se retiran alícuotas y se mide la cantidad residual de actividad de DERA, utilizando la prueba de actividad de substrato natural de DERA por cuadruplicado. La actividad de substrato natural de DERA inicial determinada se fija en 100% y las actividades determinadas en los puntos de tiempo indicados se expresan como porcentaje relativo a dicha actividad inicial de substrato natural de DERA de partida.

Resultados del método de resistencia a cloroacetaldehido Utilizando el método de resistencia antes descrito se examinan alrededor de 10,000 clones. En la campaña de estabilidad inicial, los mutantes obtenidos mediante PCR propensa a error, las enzimas de DERA se expone a cloroacetaldehido 150 mM durante 2 minutos. Para el tamizaje de las variantes recombinadas, se incrementa la concentración de cloroacetaldehido hasta 200 mM en la primera ronda de recombinación y a 300 mM en la segunda ronda de recombinación, respectivamente. Los clones mutantes seleccionados se vuelven a investigar por triplicado utilizando las mismas condiciones. Se seleccionan y aislan los clones que se desempeñan en forma similar a los resultados iniciales.

Los genes deoC mutados mezclados de estos genes seleccionados se recombinan en forma aleatoria utilizando el método BERE (como se describió anteriormente) . En la primera ronda de recombinación se analizan 1,000 clones a 200 mM de cloroacetaldehido. Se aislan 22 clones, los cuales presentan una resistencia incrementada de por lo menos 50% contra cloroacetaldehido. Estos clones mutantes de nuevo se aislan a partir de las placas maestras, se purifican en vectores de expresión, los genes mutados se amplifican mediante PCR, y se mezclan. En la segunda ronda de recombinación se identifican 41 mutantes de enzima DERA, que presentan una resistencia incrementada por lo menos dos veces a 300 mM de cloroacetaldehido en comparación con DERA de tipo silvestre de E. coli K12 después de un tiempo de incubación de 2 minutos. Los mejores 10 mutantes de la segunda ronda se vuelven a analizar provenientes de cultivos de expresión de 25 ml respecto a su resistencia a cloroacetaldehido 200 mM en paralelo a DERA de tipo silvestre de E . coli K12 aplicando la prueba de actividad de reacción de substrato natural de DERA. Los resultados son el promedio de tres experimentos independientes y se dan como por ciento de actividad residual de DERA en comparación con los valores respectivos a 0 mM de cloroacetaldehido en la tabla 4 incluyendo la designación y los intercambios de aminoácido de los mutantes de enzima DERA.

TABLA 4 Resistencia a cloroacetaldehido y Factor de Productividad de DERA de mutantes de enzima DERA de Escherichia. coli K12 y DERA de tipo silvestre de E. coli K12 EJEMPLO 2 Enzimas mutantes de DERA con productividad mejorada para CHBA Para el tamizaje de mutantes de DERA con productividad incrementada de 4-cloro-3- (S) -hidroxi-butiraldehido (CHBA) formado mediante aldolización de una molécula de cada uno de acetaldehido y cloroacetaldehido, se construye una genoteca de aproximadamente 3,000 clones mutantes. Se efectúan PCR propensa a error, clonación de compuerta (Gateway cloning) , y expression de mutantes de DERA como se describe en el ejemplo 1, excepto que los fragmentos de PCR propensa a error se clonan directamente en el vector pDEST14 sin aislamiento de los vectores pENTR, para elevar al máximo la diversidad genética de la genoteca de expresión.

Preparación de la muestra para el método de productividad con GC/MS Para el método de productividad basado en GC/MS que examina la formación del producto CHBA utilizando 200 mM de cloroacetaldehido y acetaldehido como substratos, se pueden preparar extractos libres de células a partir de cultivos de expresión de 600 µl, en forma similar al tamizaje para resistencia a cloroacetaldehido. Se centrifugan (4000 rpm durante 15 minutos) los cultivos de expresión que se han incubado en placas de cavidad profunda en un agitador giratorio durante 24 horas. Los comprimidos de célula obtenidos se usan en 350 µl de B-PER II 50% (v/v), NaC03 250 mM, 50% (v/v), pH 7.5. Los restos celulares se eliminan mediante centrifugación como se indicó anteriormente. Se mezclan 100 µl de los extractos libres de célula que contienen las enzimas DERA mutadas de E . coli K12 con 100 µl de una solución 400 mM tanto de acetaldehido como de cloroacetaldehido. Después de incubar 1 hora a temperatura ambiente, se agregan 100 µl de cada reacción 900 µl de acetonitrilo que contiene 0.05% (p/p) de ciclohexilbenceno, el cual sirve como patrón de preferencia interno (IS por sus siglas en inglés) para la cuantificación del producto. El precipitado de proteina se eliminan mediante centrifugación y se transfieren 500 µl de cada muestra a una placa nueva de micro-titulación de cavidad profunda.

Análisis de 4-cloro-3-hidroxi-butiraldehido mediante GC/MS de alto rendimiento Las muestras se analizan rspecto a su contenido de CHBA en un cromatógrafo de gases Hewlett Packard tipo 6890 acoplado a un detector de masas HP 5973 (Agilent) . Las muestras se inyectan en una columna Chrompack CP-SIL13CB (Varian) mediante un inyector automatizado directamente a partir de las placas de microtitulación. Se efectúa un programa de temperatura desde 100°C hasta 250°C dentro de un tiempo de dos minutos con Helio como el gas portador a un flujo constante de 1.1 ml/min. Se detectan los iones característicos del patrón de referencia interno (M = 45 desde t = 0 hasta 2.80 minutos) y CHBA (M = 160 desde t = 2.80 minutos hasta la conclusión del método) mediante monitoreo de ion individual (SIM por sus siglas en inglés) . El tiempo del ciclo total para una muestra (de una inyección a la otra) es menor de cinco minutos. El método de productividad suministra 7 mutantes de enzima DERA de E. coli K12 con concentraciones de CHBA incrementadas por lo menos 3 veces en comparación con DERA de tipo silvestre de E . coli K12. Los clones mutantes seleccionados se vuelven a analizar utilizando la Prueba de Factor de Productividad de DERA como se describió anteriormente para compararlos con DERA de tipo silvestre de E. coli K12 y para determinar su Factor de Productividad de DERA (en mmoles de CTeHP producido por mg de proteina en el extracto libre de células en 16 horas) . Se inoculan pre-cultivos de 2.5 ml de medio de Luria Bertani (LB) (que contiene 100 µg/ml de carbenicilina) con una sola colonia de cada clon retransformado, y se incuban durante la noche con agitación a 180 rotaciones por minuto (rpm) y a 28°C. De estos pre-cultivos se inoculan cultivos de expresión LB de 50 ml que contienen 100 µg/ml de carbenicilina hasta una densidad celular de D062o nm de 0.05 y se cultivan a 28°C en un agitador giratorio (180 rpm) . La expresión de los mutantes de las DERAs se induce mediante adición de 1 mM de isopropil-ß-D-tiogalactopiranósido (IPTG) después de tres horas de incubación y a una densidad óptica de 0.4 aproximadamente. Las células se recolectan mediante centrifugación (5 minutos a 5,000 x g) después de 21 horas y se vuelven a suspender en 1 ml de una solución reguladora de trietanolamina 50 mM (pH 7.2). El extracto libre de células se obtiene aplicando energía sónica a la suspensión de células durante 5 minutos (pulso de 10 segundos seguido por una pausa de 10 segundos) y centrifugación durante una hora a 4°C y 16,000 x g. Los extractos libres de células se almacenan a 4°C hasta uso posterior en la Prueba de Factor de Productividad de DERA. La designación y los intercambios de aminoácido de las enzimas mutantes de DERA encontrados utilizando el método de productividad se listan en la tabla 5.

TABLA 5 Formación de CHBA y Factor de Productividad de DERA de los mutantes de enzima DERA de Escherichia. coli K12 y la DERA de tipo silvestre de E. coli K12 TABLA 5 (cont.) EJEMPLO 3 Escalamiento de la sintesis de CteHP con el mutante 9-11H de DERA Star (DE3) (Invitrogen) de E . coli BL21 químicamente competente se transforma al momento del experimento como se describe en el ejemplo 2 con los plásmidos pDEST14-Ecol-deoC y pDEST14_9-ll H (mutante F200I), respectivamente. Se inoculan dos pre-cultivos LB de 50 ml (que contienen 100 µg/ml de carbenicilina) con colonias individuales provenientes de las placas de agar de transformación respectivas, y se incuban durante la noche en un agitador giratorio (180 rpm) a 28°C. Al siguiente dia se inoculan matraces Erlenmeyer estériles que contienen 1 litro de medio LB cada uno con 100 µg/ml de carbenicilina con los pre-cultivos de 50 ml hasta una densidad celular inicial de DOß2o = 0.05 y se incuban con agitación (180 rpm) a 28 °C. A densidades celulares de D?62o 0-6 aproximadamente, se induce la expresión de DERA de tipo silvestre de E. coli K12 y el mutante derivado de la misma DERA 9-11 H, que contiene el intercambio de aminoácido F200I, mediante adición de IPTG 1 mM. Los cultivos se incuban adicionalmente bajo las mismas condiciones hasta un tiempo total de cultivo de 21 horas. En este punto de tiempo se recolectan ambos cultivos mediante centrifugación (5 minutos a 5000 x g) y los comprimidos de células se vuelven a suspender en 25 ml de una solución reguladora de trietanolamina 50 mM (pH 7.2). Los extractos libres de células se obtienen aplicando energía sónica a las suspensiones celulares 2 veces de 5 minutos (pulso de 10 segundos seguido por pausa de 10 segundos, sonda larga) y centrifugación durante una hora a 4°C y 39,000 x g. Los extractos libres de células se mantienen a 4°C hasta uso posterior. Las actividades especificas para ambos extractos libres de células, determinadas con la Prueba de Actividad de Substrato Natural de DERA como se describió anteriormente pero con 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato 5 mM, están en el mismo rango. Para las reacciones escaladas, se incuban 10 mmoles de cloroacetaldehido y 23 mmoles de acetaldehido con 1.5 kU de DERA de tipo silvestre y DERA F200I mutante, respectivamente, en un volumen total de 50 ml que contiene solución reguladora de NaHC03 0.1 M (pH 7.2) a temperatura ambiente y con agitación suave. Las reacciones se corren durante un tiempo de cinco horas y se extraen muestras de 100 µl en diferentes puntos de tiempo en el curso de las reacciones. La reacción enzimática en las muestras se detiene después de estas 5 horas mediante adición de 900 µl de acetonitrilo y centrifugación durante 10 minutos a 16,000 x g. Los sobrenadantes se analizan respecto a su contenido de CTeHP y CHBA mediante cromatografía de gases en una columna Chrompack CP-SIL8CB (Varian) utilizando un detector FID. Las concentraciones respectivas determinadas en estas muestras se pueden encontrar en la tabla 6. El mutante F200I de DERA de E. coli K12 presenta 81 y 86 por ciento de conversión del presente cloroacetaldehido hasta CTeHP después de dos y cuatro horas, respectivamente, cuando se utilizan 150 U por mmol de cloroacetaldehido. Con "U" se quiere decir una Unidad de enzima, la cual es la cantidad de enzima necesaria para convertir 1 µmol de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato dentro de un tiempo de 1 minuto bajo las condiciones de la Prueba de Actividad de Substrato Natural de DERA. Únicamente en el inicio de la reacción se pueden detectar cantidades pequeñas del intermediario CHBA. No se detecta CHBA y solamente se detectan cantidades pequeñas de CTeHP en la reacción con 150 U de DERA de tipo silvestre de E . col i K12 por mmol de cloroacetaldehido. Para DERA de tipo silvestre se encuentran conversiones de siete y ocho por ciento de cloroacetaldehido a CTeHP después de un tiempo de incubación de dos y cuatro horas, respectivamente. Por lo tanto, dentro del mismo marco de tiempo, el mutante F200I de DERA de E . coli K12 descubierto muestra conversiones aproximadamente 11 a 12 veces más altas que la DERA de tipo silvestre de E . coli K12.

TABLA 6 Formación de CteHP y CHBA mediante DERA de tipo silvestre y mutante F200I de E. coli K12 con 150 U por mmol de cloroacetaldehido, respectivamente (- = por debajo del limite de detección) EJEMPLO 4 Mutagénesis por saturación de F200 de DEA de tipo silvestre de E. coli K12 Introducción de mutaciones de punto F200X Se efectúa el intercambio de la secuencia de ADN que codifica para el residuo de aminoácido fenilalanina en la posición 200 de la secuencia de aminoácido de DERA de tipo silvestre de E. coli K12 [SEQ ID No.l] en el gen deoC de tipo silvestre de E. coli K12 [SEQ ID No.6] para todas las 64 posibles secuencias codificadoras (X definida como los 20 aminoácidos generadores de proteina como los enumerados anteriormente y 3 codones de terminación) utilizando el estuche para mutagénesis dirigida a sitio QuikChange (Stratagene) de conformidad con el manual del proveedor con los iniciadores para mutagénesis F200X_for43 5' GC GTA GAA AAA ACC GTT GGT NNN AAA CCG GCG GGC GGC GTG CG 3' [SEQ ID No.9] F200X_rev43 5' CG CAC GCC GCC CGC CGG TTT NNN ACC AAC GGT TTT TTC TAC GC 3' [SEQ ID No.10] (en los que N representa cualquiera de los 4 nucleótidos A, C, G y T) . Como plantilla se utiliza el gen deoC de tipo silvestre de E . coli K12, el cual ha sido clonado en los sitios de restricción Ncol y EcoRI del sitio de clonación múltiple del plásmido pBAD//Myc-HisC (Invitrogen) de conformidad con el procedimiento descrito en el documento WO03/006656. Los productos de PCR resultantes se digieren con Dpnl en la forma descrita en el protocolo del fabricante y se utiliza posteriormente para transformar células de E . col i químicamente competentes OneShot TOP10 (Invitrogen) . Después de sembrar en medio LB selectivo que contiene 100 µg/ml de carbenicilina, se utilizan colonias independientes, elegidas al azar, para inocular placas de micro-titulación de 4 cavidades profundas que contienen 1 ml de medio 2*TY complementado con 100 µg/ml de carbenicilina utilizando una colonia independiente por cavidad. En cada placa tres cavidades se inoculan con colonias de E . col i TOP10 que alojan a pBAD//Myc-HisC con el gen deoC de tipo silvestre de E . coli [SEQ ID ?o.6] clonado y el gen deoC de E . col i se muestra la mutación T706A de [SEQ ID ?o.6] lo que da como resultado el intercambio de aminoácido de fenilalanina a isoleucina en la posición 200 de la secuencia de aminoácido de DERA de E . col i [SEQ ID No.l], respectivamente, sirviendo como controles.

Cultivo, expresión y tamizare de la genoteca de F200X Las placas de micro-titulación de cavidad profunda inoculadas se incuban en un agitador giratorio Kuhner ISF-l-W (50 mm de amplitud de agitación) a 25°C y 300 rpm durante 2 dias y se utilizan como pre-cultivos para los cultivos de expresión de las variantes de deoC mutado en placas de micro-titulación de cavidad profunda. Para este propósito se transfieren 65 µl de cada cavidad en la cavidad correspondiente de placas de micro-titulación de cavidad profunda que contienen 935 µl de medio 2*TY estéril complementado con 100 µg/ml de carbenicilina y 0.02% (p/v) de L-arabmosa para inducir la expresión del gen. Los cultivos de expresión se incuban posteriormente en un agitador giratorio Kuhner ISF-l-W durante 24 horas (50 mm de amplitud de agitación; 37°C; 300 rpm) . La recolección y lisis de las células se efectúan como se describe en el ejemplo 2, excepto que se utiliza un volumen total de 500 µl de solución reguladora para lisis por cavidad. La incubación del substrato se efectúa en la forma descrita en el ejemplo 2, pero durante 20 horas. Las reacciones se detienen mediante adición de 1 ml de acetonitplo que contiene 1000 ppm de ciclohexilbenceno, el cual sirve como patrón de referencia interno para la cuantificación de producto en el análisis de GC/MS, a cada cavidad. Antes de la cuantificación de producto mediante análisis de GC/MS que se efectúa en la forma descrita en el ejemplo 2, las proteínas se precipitan mediante centrifugación (5,000 rpm a 4°C durante 30 minutos). En total se identifican 14 clones con una formación de CteHP elevada por lo menos 2.5 veces (véase tabla 7). De estos 14 clones, 7 clones contienen mutaciones de F200 para valina, 6 para isoleucina y 1 para metionina, con todos los posibles codones para cada uno de los tres aminoácidos, respectivamente. De conformidad con los resultados de la determinación de secuencia de ADN de todos estos 14 clones, no ocurren mutaciones adicionales en los genes deoC.

Reevaluación de los "aciertos" de F200X con la Prueba de Factor de Productividad de DERA Estos 14 clones se vuelven a evaluar en comparación con DERA de tipo silvestre de E . coli K12 de conformidad con la Prueba de Factor de Productividad de DERA como se describió anteriormente. Para este propósito, los 14 clones se cultivan a una escala de 50 ml y el extracto libre de células se prepara como se describe en el ejemplo 2 excepto que se utiliza el sistema basado en E. ¡7 coli TOP10 / pBAD//Myc-HisC y la expresión de las variantes del gen deoC de E. coli K12 se induce mediante adición de L-arabinosa al 0.02% (p/v) en la fase de crecimiento semi-logaritmica en lugar de IPTG 1 mM. Las variantes F200V muestran formación de CTeHP comparable en el tamizaje y factores de productividad de DERA como los de las variantes F200I obtenidas de este tamizaje. La variante F200M presenta un factor de productividad de DERA ligeramente menor que el de las variantes F200V y F200I, pero que sigue estando incrementado más de 10 veces (más del 1000%) en comparación con el factor de productividad de DERA de tipo silvestre de E. coli K12.

TABLA 7 Tamizaje para formación de CTeHP y Factor de Productividad de DERA de los mutantes de la enzima DERA F200X de Escherichia coli K12y la DERA de tipo silvestre de E. coli K12 TABLA 7 (cont . ) Escalamiento de reacciones de F200X Para investigar las tres sustituciones de aminoácido F200I, F200V y F200M encontradas mediante mutagénesis por saturación de la posición F200 de DERA de tipo silvestre de E . coli K12 con mayor detalle, se investigan, respecto a su desempeño en la formación de CTeHP a concentraciones de cloroacetaldehido de 0.6 M con concentraciones de acetaldehido de 1.2 M, cantidades definidas de extractos libres de célula de los clones seleccionados. Los clones 1-D10 (F200M), 2-H8 (F200V) y 3-C10 (F200I) se investigan respecto a su nivel de expresión mediante análisis SDS-PAGE de 15 µg de proteina en sus extractos libres de células respectivos. Los niveles de expresión de las enzimas mutantes demostraron ser idénticos a DERA de tipo silvestre de E . coli K12. La actividad enzimática en la reacción de substrato natural de DERA con 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato es de 29 U/mg para F200M, 38 U/mg para F200V, 36 U/mg para F200I, y 54 U/mg para DERA de tipo silvestre de E . coli K12, respectivamente . Para la reacción de CIAA, se utilizan 3 mg de proteina total provenientes de los extractos libres de célula respectivos en un volumen total de 1 ml . Todas las reacciones se efectúan en solución reguladora de NaHC03 0.1 M (pH 7.2) a temperatura ambiente y con agitación suave. Para la cuantificación de formación de CteHP, se extraen muestras de 100 µl en diferentes puntos de tiempo en el curso de las reacciones. Las reacciones enzimáticas en las muestras se detienen mediante adición de 900 µl de acetonitrilo (que contiene 1,000 ppm de ciclohexilbenceno como patrón de referencia interno) y centrifugación durante 10 minutos a 16,000 x g. Los sobrenadantes se analizan respecto a su contenido de CTeHP mediante cromatografía de gases en una columna Chrompack CP-SIL8CB (Varian) utilizando un detector FID. Los resultados de este análisis se muestran en la tabla 8.

TABLA 8 Curso de tiempo de la formación de CteHP (en moles/1) a partir de CIAA 0.6 M y acetaldehido 1.2 M por parte de extractos libres de células que contienen DERA de tipo silvestre y mutantes de DERA F200M (clon I-DIO, F200V (clon 2-HB) , y F200I (3-C10) a 3 mg de proteina por ml de volumen de reacción (- = por debajo del limite de detección) Estos resultados demuestran que las sustituciones F200I, la F200V y la F200M son mutaciones benéficas en la posición de aminoácido F200 para la conversión de CIAA y acetaldehido hasta CTeHP.

EJEMPLO 5 Mutación F200I combinada con ?Y259; mutación F200I combinada con ?259 y extensión en el extremo C-terminal con [SEQ ID No. 3] El intercambio F200I se recombina con (i) la deleción del residuo Y259 C-terminal y (ii) su sustitución más la extensión del extremo C-terminal de DERA de E . coli K12 mediante la secuencia de aminoácido KTQLSCTKW [SEQ. ID No. 3], respectivamente, utilizando una estrategia de mutagénesis dirigida a sitio basada en PCR. Se sintetizan iniciadores de PCR de aproximadamente 30 a 50 nucleótidos que comprenden las mutaciones respectivas en las direcciones hacia el extremo 5' (de avance) y hacia el extremo 3' (de retroceso), respectivamente. En dos reacciones de PCR separadas se utilizan estos iniciadores de mutagénesis en el gen deoC de tipo silvestre proveniente de E . coli K12 [SEQ ID No.6] clonado en pDEST14 (Invitrogen) en combinación con los iniciadores hacia el extremo 5' y hacia el extremo 3' específicos del sistema Gateway (Invitrogen) o con los iniciadores hacia el extremo 5' y hacia el extremo 3' de mutagénesis adicionales, respectivamente .

Secuencia del iniciador hacia el extremo 5' especifico del sistema Gateway 5' GGG GAC AAG TTT GTA CAÁ AAA AGC AGG CTT CGA AGG 3' [SEQ ID No. 11] Secuencia del iniciador hacia el extremo 3' especifico del sistema Gateway 5' GGG GAC CAC TTT GTA CAÁ GAA AGC TGG GTC 3' [SEQ ID No. 12] F200I hacia el extremo 5' 5' CCG TTG GTA TCA AAC CGG CGG GCG G 3' [SEQ ID No. 13] F200I hacia el extremo 3' 5' CCG CCC GCC GGT TTG ATA CCA ACG G 3' [SEQ ID No. 14] ?Y259 hacia el extremo 3' 5' GGG GAC CAC TTT GTA CA GAA AGC TGG GTC TTA GTA GTG CTG GCG CTC TTA CC 3' [SEQ ID No. 15] C-Extension3 hacia el extremo 3' 5' GGG GAC CAC TTT GTA CA GAA AGC TGG GTC CTA TTA GTT AGC TGC TGG CGC TC 3' [SEQ ID No. 16] Los fragmentos del gen deoC parcial generados se purifican en gel, para evitar la contaminación de reacciones de PCR posteriores con plantillas de ADN del fragmento deoC. Los fragmentos obtenidos se utilizan en una reacción de PCR para volver a ensamblar los fragmentos del gen deoC variante de longitud completa que contiene las mutaciones deseadas. Los fragmentos deoC variantes de longitud completa se sub-clonan después en el vector pDEST14, de conformidad con el protocolo de un tubo del proveedor. Se determina completamente la secuencia de los insertos para confirmar que no han ocurrido alteraciones no deseadas en las construcciones de expresión del mutante deoC de E. coli K12 deseadas. Las variantes F200I/?Y259 y F200I/?Y259+SEQ ID No.3 de DERA de E. coli K12 obtenidas muestran muy poca actividad catalítica hacia 2-desoxi-D- ribosa 5-fosfato de conformidad con la Prueba de Actividad de Substrato Natural de DERA en ausencia de cloroacetaldehido. Por lo tanto, las variantes de DERA sobre-expresadas se purifican mediante cromatografía de intercambio iónico y fraccionamiento con sulfato de amonio de conformidad con un procedimiento como el descrito por Wong y colaboradores en J. Am . Chem . Soc. 117 (12) , 3333-3339 (1995) . Las variantes recombinadas F200I + ?Y259 y F200I + ?Y259 + SEQ ID No.3 se comparan con la variante F200I de DERA y DERA de tipo silvestre de E . coli K12 respecto a la síntesis de CteHP como se describe en el ejemplo 3, excepto que se utiliza una cantidad definida de 2.5 mg de las DERAs purificadas respectivas (de tipo silvestre o variante) por ml de volumen de reacción en lugar de extractos libres de células como se describe en los ejemplos 3 y 4. A concentraciones de substrato de 0.5 M de CIAA y 1.0 M de acetaldehido, se obtiene 61 y 70 por ciento de conversión en CTeHP de los aldehidos suministrados con F200I/?Y259 y F200I/?Y259+SEQ ID No .3 purificados después de 8 horas, respectivamente (tabla 9) . Con F200I purificada se obtiene una concentración de CTeHP de 0.11 M después de 8 horas, lo que corresponde a 23 por ciento de conversión en el producto deseado. Con DERA de tipo silvestre de E. coli K12 purificada se forma muy poco CTeHP. En este caso se convierte menos del siete por ciento de los aldehidos suministrados.

TABLA 9 Comparación de las variantes F200I, F200I/?Y259 y F200I/?Y259+SEQ ID No .3 de DERA con DERA de tipo silvestre de E . coli K12 respecto a la formación de CteHP (en moles/1) con 0.5 M de CIAA y 1.0 M de acetaldehido y 2.5 mg de DERAs purificadas por ml de volumen de reacción EJEMPLO 6 Tamizaje de DERAs de tipo silvestre respecto a la producción de CTeHP Clonación de genes deoC de tipo silvestre Los genes deoC que codifican para las DERAs de tipo silvestre de Aeropyrum pernix Kl (Gl : 24638457 ) , Bacillus subtilis cepa 168 (Gl: 1706363), Deinococcus radiodurans Rl (Gl : 24636816) , y Thermotoga marí tima MSB8 (Gl: 7674000) se amplifican mediante PCR utilizando iniciadores específicos del gen que contienen las secuencias de reconocimiento attB para la donación Gateway.

A. pernix 5' de avance 5' GGG GAC AAG TTT GTA CAÁ AAA AGC AGG CTT CGA AGG AGA TAG AAC CAT GAG AGA GGC GTC GGA CGG 3' [SEQ ID No.17] A . pernix 3' de retroceso 5' GGG GAC CAC TTT GTA CA GAA AGC TGG GTC TTA GAC TAG GGA TTT GAA GCT CTC CA AAC C 3' [SEQ ID No. 18] B . s?btilis 5' de avance 5' GGG GAC AAG TTT GTA CAÁ AAA AGC AGG CTT CGA AGG AGA TAG AAC CAT GTC ATT AGC CA CAT A AT TGA TCA TAC AG 3' [SEQ ID No.19] ß. subtilis 3' de retroceso 5' GGG GAC CAC TTT GTA CA GAA AGC TGG GTC TTA ATA GTT GTC TCC GCC TGA TGC 3' [SEQ ID No. 20] D. radiodurans 5' de avance 5' GGG GAC AAG TTT GTA CAÁ AAA AGC AGG CTT CGA AGG AGA TAG AAC CAT GTC ACT CGC CTC CTA CAT CGA CC 3' [SEQ ID No. 21] D. radiodurans 3' de retroceso 5' GGG GAC CAC TTT GTA CAÁ GAA AGC TGG GTC TCA GTA GCC GGC TCC GTT TTC GC 3' [SEQ ID No. 22] T. mari tima 5' de avance 5' GGG GAC AAG TTT GTA CAÁ AAA AGC AGG CTT CGA AGG AGA TAG AAC C ATG ATA GAG TAC AGG ATT GAG GAG G 3' [SEQ ID NO. 23] T. mari tima 3' de retroceso 5' GGG GAC CAC TTT GTA CA GAA AGC TGG GTC TCA ACC TCC ATA TCT CTC TTC TCC 3' [SEQ ID NO. 24] Los cuatro genes deoC de tipo silvestre se clonan en pDEST14 de conformidad con el protocolo del proveedor y E . col i Rosetta (DE3) químicamente competentes (Novagen) transformadas con las construcciones pDEST14-deoC respectivas. Las cepas de E . col i Rosetta (DE3) que portan a pDEST14-EcoI-deoC y pDEST14_9-HH, que contienen el gen deoC de tipo silvestre de E . coli K12 y el gen deoC mutado de E coli K12 muestran la mutación T706A de [SEQ ID No.6] que da como resultado el intercambio de aminoácido de fenilalanina a isoleucina en la posición 200 de la secuencia de aminoácido de DERA de E . col i [SEQ ID No.l], respectivamente, sirven como controles. Se utilizan ocho colonias independientes, elegidas al azar, de cada una de estas seis cepas provenientes de placas de agar LB (que contiene 100 µg/ml de carbenicilina y 35 µg/ml de cloranfenicol) para inocular una placa de microtitulación de cavidad profunda que contiene 1 ml de medio 2*YT complementado con 100 µg/ml de carbenicilina y 35 µg/ml de cloranfenicol.

Cultivo, expresión y tamizaje de DERAs de tipo silvestre Las placas de microtitulación de cavidad profunda inoculadas se incuban en un agitador giratorio Kúhner ISF-l-W (50 mm de amplitud de agitación) a 20°C y 300 rpm durante 2 dias y se utilizan como pre-cultivos para los cultivos de expresión de las variantes de deoC mutado en placas de microtitulación de cavidad profunda. Para este propósito, se transfieren 65 µl de cada cavidad en la cavidad correspondiente de placas de microtitulación de cavidad profunda que contienen 935 µl de medio 2*TY complementado con 100 µg/ml de carbenicilina, 35 µg/ml de cloranfenicol y 1 mM de IPTG para inducir la expresión del gen. Los cultivos de expresión se incuban posteriormente en un agitador giratorio K?hner ISF-l-W durante 24 horas (50 mm de amplitud de agitación; 25°C; 300 rpm) . La recolección y lisis de las células se efectúa como se describe en el ejemplo 2, excepto que se utiliza un volumen total de 500 µl y la solución reguladora para lisis consiste de solución reguladora MOPS 50 mM, pH 7.5, que contiene 0.1 mg/ml de ADNasa I (Roche) , 2mg/ml de lisozima (Sigma) , 10 mM de ditiotreitol (DTT) y 5 mM de MgS04. La incubación del substrato se efectúa como en el ejemplo 2, pero durante 2.5 horas y con concentraciones de substrato de 0.2 M de cloroacetaldehido y 0.4 M de acetaldehido. Las reacciones se detienen mediante adición de 1 ml de acetonitrilo que contiene 1000 ppm de ciclohexilbenceno, el cual sirve como patrón de referencia interno para la cuantificación de producto en el análisis de GC/MS, a cada cavidad. Antes de la cuantificación de producto mediante el análisis de GC/MS efectuado como se describe en el ejemplo 2, las proteínas se precipitan mediante centrifugación (5,000 rpm a 40°C durante 30 minutos) . Bajo las condiciones de tamizaje empleadas se puede detectar actividad de DERA y formación de CHBA significativas en las cavidades con DERA de tipo silvestre de E . col i K12, la variante F200I de DERA de E . col i K12 y DERA de Ba cill us subtilis cepa 168. Bajo estas condiciones de tamizaje, las otras DERAs de tipo silvestre no presentaron actividad en la prueba de substrato natural de DERA ni tampoco producción de CHBA o CTeHP en el método de tamizaje respecto a productividad. El valor promedio de formación de CHBA para la variante F200I de DERA de E . coli K12 es un factor aproximadamente 4 veces más alto que el de la formación de CHBA por parte de DERA de tipo silvestre de E . coli K12 y por lo tanto es comparable a los valores obtenidos en el mismo antecedente de la cepa en el ejemplo 2. De manera adicional, la DERA de tipo silvestre de B . subtilis cepa 168 presenta una producción de CHBA 50% más alta que la DERA de tipo silvestre de E . col i K12 con actividad de substrato natural de DERA ligeramente más baja (tabla 10) . Esto significa que también se pueden encontrar DERAs de tipo silvestre con productividad más alta que DERA de E . col i K12 que tenga SEQ ID NO.l y que puedan sintetizar CHBA y CTeHP utilizando el método de productividad basado en GC/MS como se utiliza y describe en el ejemplo 2.

TABLA 10 Tamizaje de DERAs de tipo silvestre respecto a una mejor formación de CHBA: actividad de substrato natural de DERA y formación relativa de CHBA

Claims (15)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1.- Mutantes aislados de enzimas provenientes del grupo de enzimas de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa de tipo silvestre a partir de fuentes naturales que pertenecen al grupo que consiste de especies eucariotas y procariotas, cada una de dichas enzimas de tipo silvestre tiene un factor de productividad especifico, según se determina mediante la Prueba de Factor de Productividad de DERA, en la producción de 6-cloro-2, 4 , 6-tridesoxi-D-eritrohexapiranósido (CTeHP) a partir de una mezcla por lo menos equimolar de acetaldehido y cloroacetaldehido, caracterizado porque los mutantes aislados tienen un factor de productividad el cual es por lo menos 10% más alto que el factor de productividad para la enzima de tipo silvestre correspondiente a partir de la cual ésta es un mutante y porque los factores de productividad tanto de la enzima mutante como de la enzima de tipo silvestre correspondiente se miden bajo condiciones idénticas.

2.- Los mutantes aislados provenientes del grupo de enzimas de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa de tipo silvestre de conformidad con la reivindicación 1, caracterizados porque los mutantes aislados tienen un factor de productividad el cual es por lo menos 10% más alto que el factor de productividad para la 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa provenientes de Escherichia coli K12 (EC 4.1.2.4) que tiene la secuencia de enzima de tipo silvestre de [SEQ ID No. 1], y porque los factores de productividad tanto de la enzima mutante como de Escherichia coli K12 se miden bajo condiciones idénticas.

3.- Los mutantes aislados provenientes del grupo de enzimas de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa de tipo silvestre de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizados porque los mutantes son mutantes de la 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa de Escherichia coli K12 (EC 4.1.2.4) que tiene la secuencia de enzima de tipo silvestre de [SEQ ID No.l].

4.- Los mutantes aislados del grupo de enzimas de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa de tipo silvestre de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizados porque los mutantes tienen por lo menos una sustitución de aminoácido en una o más de las posiciones K13, T19, Y49, N80, D84, A93, E127, A128, K146, K160, 1166, A174, M185, K196, F200, o S239 en [SEQ ID No.l] o en posiciones que correspondan a las mismas, y/o una deleción de por lo menos un aminoácido en una de las posiciones S258 o Y259 en [SEQ ID No.l] o en posiciones que correspondan a las mismas, opcionalmente en combinación con extensión en el extremo C-terminal y/o en combinación con extensión en el extremo N-terminal.

5.- El mutante aislado del grupo de enzimas de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa de tipo silvestre de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque los mutantes tienen por lo menos una de las sustituciones de aminoácido en, o que corresponda a las sustituciones en, [SEQ ID No.l] que se selecciona a partir del grupo que consiste de: a. K13 y/o K196 reemplazados con un aminoácido con carga positiva, de preferencia con R o H; b. T19 y/o M185 reemplazados con otro aminoácido, de preferencia con otro aminoácido que se selecciona a partir de los grupos que consisten de aminoácidos hidrofilicos, en particular que consisten de S, T, C, Q, y N, y/o aminoácidos hidrofóbicos, en particular que consisten de V, L e í; c. Y49 reemplazado con un aminoácido aromático que se selecciona a partir del grupo que consiste de F y W; d. N80 y/o 1166 y/o S239 reemplazados con otro aminoácido que se selecciona a partir del grupo de aminoácidos hidrofilicos que consiste de T, S, C, Q y N; e. D84 y/o A93 y/o E127 reemplazados con otro aminoácido, de preferencia más pequeño, que se selecciona a partir del grupo de aminoácidos pequeños que consiste de, en orden de tamaño decreciente, E, T, N, P, D, C, S, A, y G; f. A128 y/o K146 y/o K160 y/o A174 y/o F200 reemplazados con otro aminoácido que se selecciona a partir del grupo de aminoácidos hidrofóbicos que consiste de I , L, M, V, F, y Y; y/o que tienen una deleción de por lo menos un aminoácido en las posiciones S258 y Y259 en [SEQ ID No.l], o en posiciones que correspondan a las mismas, opcionalmente en combinación con extensión en el extremo C-terminal y/o en combinación con extensión en el extremo N-terminal .

6.- El mutante aislado de conformidad con la reivindicación 4 ó 5, caracterizado porque el extremo C terminal está extendido con uno de los fragmentos TTKTQLSCTKW [SEQ ID No.2] y KTQLSCTKW [SEQ ID No.3].

7.- El mutante aislado del grupo de enzimas de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa de tipo silvestre de conformidad con la reivindicación 5 ó 6, caracterizado porque el mutante tiene una o más de las mutaciones en, o que correspondan a las mutaciones en, [SEQ ID No.l] que se seleccionan a partir del grupo de K13R, T19S, Y49F, N80S, D84G, A93G, E127G, A128V, K146V, K160M, I166T, A174V, M185T, M185V, K196R, F200I, F200M, F200V, S239C, ?S258, ?Y259, extensión en el extremo C-terminal con TTKTQLSCTKW [SEQ ID No.2], y extensión en el extremo C-terminal con KTQLSCTKW [SEQ ID No.3].

8.- El mutante aislado del grupo de enzimas de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa de tipo silvestre de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el mutante tiene por lo menos las siguientes dos mutaciones en, o que corresponden a las dos mutaciones en, [SEQ ID No. 1] que se seleccionan a partir del grupo de F200I y ?Y259; F200M y ?Y259; F200V y ?Y259; F200I y extensión en el extremo C-terminal con KTQLSCTKW [SEQ ID No.3]; F200M y extensión en el extremo C-terminal con KTQLSCTKW [SEQ ID No.3]; y F200V y extensión en el extremo C-terminal con KTQLSCTKW [SEQ ID No.3].

9.- Un procedimiento para el tamizaje respecto a enzimas de tipo silvestre del grupo de enzimas de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa que tengan un factor de productividad, según se determina mediante la Prueba de Factor de Productividad de DERA, en la producción de 6-cloro-2, 4, 6-tridesoxi-D-eritrohexapiranósido (CTeHP) a partir de una mezcla por lo menos equimolar de acetaldehido y cloroacetaldehido, el cual es por lo menos 10% más alto que el factor de productividad para la enzima 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa proveniente de Escherichia coli K12 (EC 4.1.2.4) que tiene una secuencia de enzima de tipo silvestre de [SEQ ID No.l], caracterizado porque (A) posteriormente (i) se aisla ADN y/o ADNc total y/o genómico; (ii) se prepara una genoteca de expresión de dicho ADN aislado, que consiste de clones individuales que comprenden dicho ADN aislado; (iii) los clones individuales provenientes de la genoteca de expresión obtenida se incuban con una mezcla de los substratos acetaldehido y cloroacetaldehido; (iv) se aislan uno o más de los genes provenientes de uno o más de los clones que muestran conversión de estos substratos en 4-cloro-3- (S) -hidroxi-butiraldehido (CHBA) y/o 6-cloro-2, 4 , 6-tridesoxi-D-eritrohexapiranósido (CTeHP) y se vuelven a clonar en el mismo antecedente genético que aquel para [SEQ ID No.6]; y porque (B) las enzimas de DERA codificadas por los genes vueltos a clonar obtenidos en el paso (iv) se expresan y analizan por medio de la Prueba de Factor de Productividad de DERA, con lo cual se obtiene un factor de productividad para cada una de dichas enzimas de tipo silvestre; y porque (C) el factor de productividad para estas enzimas de tipo silvestre proveniente del paso (B) se compara con el factor de productividad de la enzima de tipo silvestre proveniente de Escherichia coli K12 (EC 4.1.2.4) que tiene una secuencia de [SEQ ID No.l], y se seleccionan y aislan uno o más de los genes que codifican para una enzima DERA que tenga un factor de productividad por lo menos 10% más alto en dicha comparación.

10.- Un procedimiento para tamizaje respecto a enzimas mutantes del grupo de enzimas de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa que tienen un factor de productividad, según se determina mediante la Prueba de Factor de Productividad de DERA, en la producción de 6-cloro-2, 4 , 6-tridesoxi-D-eritrohexapiranósido (CTeHP) a partir de una mezcla por lo menos equimolar de acetaldehido y cloroacetaldehido, el cual puede ser por lo menos 10% más alto que el factor de productividad para la enzima de tipo silvestre correspondiente o puede ser por lo menos 10% más alto que el factor de productividad para la enzima 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa proveniente de Escherichia coli K12 (EC 4.1.2.4) que tiene una secuencia de enzima de tipo silvestre de [SEQ ID No.l], caracterizado porque (A) posteriormente (i) se mutan y se clonan los genes que codifican para una enzima 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa de tipo silvestre, en una manera conocida per se, en el mismo antecedente genético que aquel para el gen que codifica para DERA de E. coli K12 que tiene [SEQ ID No. 6], respectivamente en el mismo antecedente genético que aquel para el gen de tipo silvestre correspondiente a partir del cual ésta es un mutante, con lo cual se obtiene una genoteca de expresión de clones a partir de los mutantes preparados de esta manera; y porque (B) se expresan y analizan las enzimas DERA en los clones por medio de la Prueba de Factor de Productividad de DERA, con lo cual se obtiene un factor de productividad para cada una de las enzimas mutantes; y porque (C) el factor de productividad para las enzimas mutantes se compara con aquel para la enzima de tipo silvestre correspondiente, o con aquel de la enzima de tipo silvestre proveniente de Escherichia coli K12 (EC 4.1.2.4) que tiene una secuencia de [SEQ ID No.l], y se seleccionan y aislan uno o más genes que codifican para un mutante de DERA que tiene un factor de productividad por lo menos 10% más alto en la comparación respectiva.

11.- Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque después del paso (A) (i) , en el paso A (ii) los clones individuales provenientes de la genoteca de expresión obtenida se incuban con una mezcla de los substratos acetaldehido y cloroacetaldehido, después de lo cual en el paso (iii) se seleccionan uno o más de los clones que muestran la conversión más alta de estos substratos en 4-cloro-3- (S) -hidroxi-butiraldehido (CHBA) y/o 6-cloro-2 , 4 , 6-tridesoxi-D-eritrohexapiranósido (CTeHP) y porque los clones seleccionados se utilizan en el paso B.

12.- Un ácido nucleico aislado que se puede obtener utilizando el procedimiento de tamizaje de conformidad con la reivindicación 10 u 11. 13.- Un ácido nucleico aislado que codifica para una enzima 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8. 14.- Un vector que comprende un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12 ó

13. 15.- Una célula hospedera que comprende un mutante del grupo de enzimas de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa de tipo silvestre de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o dichas enzimas mutantes que se pueden obtener de conformidad con el procedimiento de tamizaje de conformidad con la reivindicación 10 ó 11, y/o células hospederas que comprenden un ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 12 ó 13 y/o que comprenden un vector de conformidad con la reivindicación

14. 16.- Un procedimiento para la preparación de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa mutante que tiene un factor de productividad el cual es por lo menos 10% más alto que el factor de productividad para la enzima de tipo silvestre correspondiente y/o para la enzima 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa proveniente de Escherichia coli (EC 4.1.2.4) que tiene una secuencia de enzima de tipo silvestre de [SEQ ID No.l], caracterizado porque se utiliza un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12 ó 13, o un vector de conformidad con la reivindicación 14, o células hospederas de conformidad con la reivindicación

15. 17. - Un procedimiento para la preparación de una 2, 4-didesoxihexosa o una 2 , 4 , 6-tridesoxihexosa de la fórmula 1 en la cual R1 y Rx representan cada uno de manera independiente H o un grupo protector y en la cual X representa un halógeno; un grupo tosilato; un grupo mesilato; un grupo aciloxi; un grupo fenilacetiloxi; un grupo alcoxi o un grupo ariloxi a partir de acetaldehido y el acetaldehido sustituido correspondiente de la fórmula HC(0)CH2X, en la cual X es como se definió anteriormente, caracterizado porque se utiliza una enzima DERA de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una enzima DERA mutante que se puede obtener mediante expresión del ácido nucleico que se puede obtener utilizando el procedimiento de conformidad con la reivindicación 10 o la reivindicación 11, o una enzima DERA mutante que se produce mediante el procedimiento de conformidad con la reivindicación 16, y porque - en caso que R1 y/o Rx representen un grupo protector, el grupo o grupos hidroxi en el compuesto formado está/están protegidos con el grupo protector en una manera conocida per se . 18.- Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la concentración de carbonilo, la cual es la suma de la concentración de aldehido, aldehido sustituido en la posición 2 y el producto intermedio formado en la reacción entre el aldehido y el aldehido sustituido en la posición 2 (en especifico un intermediario 4-sustituido-3-hidroxi-butir-aldehido) , se elige entre 0.1 y 5 moles por litro de mezcla de reacción. 19.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 17 ó la reivindicación 18, caracterizado porque R1 y Rx representan H. 20.- El procedimiento para la preparación una estatina utilizando un procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17-19 y pasos de procesamientos adicionales conocidos per se . RESUMEN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a mutantes aislados de enzimas del grupo de enzimas de 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa de tipo silvestre que tienen un factor de productividad (según se determina mediante una prueba especifica) el cual es por lo menos 10% más alto que el factor de productividad para la enzima de tipo silvestre correspondiente a partir de la cual ésta es un mutante. Los mutantes tienen por lo menos una sustitución de aminoácidos en una más de las posiciones correspondientes a K13, T19, Y49, N80, D84, A93, E127, A128, K146, K160, 1166, A174, M185, K196, F200, y S239 en la secuencia de enzima de tipo silvestre de Escherichia coli K12 (EC 4.1.2.4), y/o una deleción de por lo menos un aminoácido en las posiciones correspondientes a S258 y Y259 en la misma, opcionalmente combinado con extensión del extremo C-terminal y/o extensión del extremo N-terminal especifica; La invención también se refiere a procedimientos de tamizaje para encontrar enzimas 2-desoxi-D-ribosa 5-fosfato aldolasa (ya sea como tales o como mutantes) que tengan un factor de productividad (según se determina mediante dicha prueba especifica, la cual forma parte esencial del tamizaje) que sea por lo menos 10% más alto que el valor de referencia. Asimismo, la invención se refiere a enzimas mutantes que se obtienen mediante el procedimiento de tamizaje y a los ácidos nucleicos que codifican para dichos mutantes, y a vectores y células hospederas que comprenden, respectivamente, dichos ácidos nucleicos o mutantes. Por último la invención se refiere al uso de dichas enzimas (de preferencia mutantes) ácidos nucleicos, vectores y células hospederas en la producción de, por ejemplo, 6-cloro-2, 4 , 6-tridesoxi-D-eritrohexapiranósido.