JP2008541693A - 2,4,6−トリデオキシヘキソースおよびその6−ハロ−または6−シアノ−置換誘導体生成のための改善された2−デオキシ−d−リボース5−リン酸アルドラーゼとその使用 - Google Patents
2,4,6−トリデオキシヘキソースおよびその6−ハロ−または6−シアノ−置換誘導体生成のための改善された2−デオキシ−d−リボース5−リン酸アルドラーゼとその使用 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、それがそれから突然変異した相応する野生型酵素の生産性係数より、少なくとも10%高い生産性係数(特定試験によって判定される)を有する、2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群から単離された酵素突然変異体に関する。突然変異体は、任意に特定のC−末端延長および/またはN末端延長と組み合わさった、大腸菌(Escherichia coli)K12(EC 4.1.2.4)野生型酵素配列中のK13、T19、Y49、N80、D84、A93、E127、A128、K146、K160、I166、A174、M185、K196、F200、およびS239と相応する1つ以上の位置の少なくとも1つのアミノ酸置換、および/またはその中のS258およびY259に相応する位置の少なくとも1つのアミノ酸の欠失を有する。本発明はまた、基準値よりも少なくとも10%高い生産性係数(スクリーニングの本質的部分を形成する前記特定試験によって判定される)を有する2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素(そのもの自体または突然変異体のいずれかとして)を見いだすスクリーニングプロセスにも関する。さらに本発明は、スクリーニングプロセスによって得られる突然変異酵素、そしてこのような突然変異体をコードする核酸、そしてこのような核酸または突然変異体をそれぞれ含んでなるベクターおよび宿主細胞に関する。最後に本発明は、例えば6−クロロ−2,4,6−トリデオキシD−エリスロヘキサピラノシドの生成におけるこのような(好ましくは突然変異)酵素、核酸、ベクター、および宿主細胞の使用に関する。
Description
本発明は、真核生物および原核生物種からなる群に属する天然源からの2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群からの酵素の単離された突然変異体に関し、このような各野生型酵素は、アセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの少なくとも等モル混合物からの6−クロロ−2,4,6−トリデオキシ−D−エリスロヘキサピラノシド(以下、CTeHPとも称する)生成においてDERA生産性係数試験によって判定される、特定の生産性係数を有する。本願明細書では、改善された生産性係数とは、このようなアルドラーゼのα−脱離基置換アセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドに対する抵抗性、触媒活性および親和力における変化を組み合わせた(そして好ましい)結果を意味する。前記生産性係数を判定する方法については本願明細書の実験部分で述べられ、以下、「DERA生産性係数試験」と称する(以下、DPFTと称する場合もある)。野生型酵素は、天然源または環境サンプルから単離できる酵素である。このような酵素の自然発生的突然変異体(すなわち本特許出願の範囲内で天然源または環境サンプルから単離できる突然変異体もまた、野生型酵素と見なされる。したがって本特許出願では、突然変異体という用語は、(例えば国際公開第/010311号パンフレットで述べられるような遺伝子組み換え技術によるこのような突然変異の遺伝子組み換えを任意に伴う、当業者によく知られている、例えばPCRの助けによるランダム変異誘発と、またはUV照射手段と、または例えばPCR法、飽和変異誘発などによる部位特異的突然変異とのいずれによるものであるかどうかにかかわらず)それらが前記野生型酵素をコードするDNA(核酸)の意図的突然変異によって、野生型酵素から得られたまたは得られていることのみを示すものとする。
自然界では、例えば大腸菌(E.coli)K12(DERA、EC 4.1.2.4)からの2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼなどの2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼが、アセトアルデヒドとD−グリセルアルデヒド3−ホスフェートの間の(可逆的)アルドール反応をエナンチオ選択的に触媒して、2−デオキシ−D−リボース5−ホスフェートを形成することが知られている。本特許出願の目的では、この反応をエナンチオ選択的に触媒できる、またはα−脱離基置換アセトアルデヒドとアセトアルデヒドからの2,4,6−トリデオキシヘキソースの形成をエナンチオ選択的に触媒できるあらゆる酵素が、DERA活性を有すると述べられる。
例えば米国特許第5,795,749号明細書で述べられるように、特定の2,4,6−トリデオキシヘキソースの合成は、エナンチオ選択触媒として、2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼを使用して達成できる。前記プロセスでは、反応物質としてアセトアルデヒドおよび2−置換アルデヒドを利用し、反応は4−置換3−ヒドロキシブタナール中間体を経て進行する。したがって、例えばジイセン(Gijsen)およびウォン(Wong)がJACS 116(1994年)8422頁で述べるように、ヘミアセタール6−クロロ−2,4,6−トリデオキシ−D−エリスロヘキサピラノシドの合成プロセスにおいて、2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼを使用できる。このヘミアセタール化合物は、本願明細書では前述のようにCTeHPとも称する。これは例えば本願でCtBDAcと称する、そのt−ブチルエステルなどの特定の(4R、6S)−2−(6−置換−1,3−ジオキサン−4−イル)酢酸誘導体の生成における適切な中間体である。このような2,4,6−トリデオキシヘキソースおよびその6−ハロ−または6−シアノ−置換誘導体、ならびにこのような(4R、6S)−2−(6−置換−1,3−ジオキサン−4−イル)酢酸誘導体、およびさらにその同等物と見なせる化合物は、コレステロール低下特性または抗腫瘍特性がある医薬品の重要な群の生成における有用なキラル構築ブロックである。このような医薬品の重要な例は、いわゆるスタチン様、例えばバスタチン ロスバスタチン(アストラゼネカ(Astra Zeneca)の商品名クレスター(Crestor)(登録商標))またはアトルバスタチン(ファイザー(Pfizer)の商品名リピトール(Lipitor)(登録商標))である。スタチンのその他の例は、ロバスタチン、セリバスタチン、シムバスタチン、プラバスタチン、およびフルバスタチンである。スタチンは概して、いわゆるHMG−CoA還元酵素阻害物質として機能することが知られている。さらに例えば本願でCyTeHPと称され、おそらくアトルバスタチン生成のための代案の中間体であるヘミアセタール6−シアノ−2,4,6−トリデオキシ−D−エリスロヘキサピラノシドなどの医薬品化合物の様々な誘導体(またはその中間体)もまた、興味深いことが知られている。
国際公開第03/006656号パンフレットで言及されるように、米国特許第5,795,749号明細書(前掲)の酵素が触媒するアルドール縮合に知られている欠点は、生成能力が低いことである。したがって国際公開第03/006656号パンフレットでは、反応物質の反応を比較的高濃度で実施することで、そしてアセトアルデヒドに次ぐ好ましい基質としてα−クロロアセトアルデヒドと組み合わせた、大腸菌(E.coli)K12(DERA、EC 4.1.2.4)からの2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼの好ましい使用によって、このような低生成能力問題を克服することが成功裏に試みられた。
それにもかかわらず、本発明者らが、本発明を導いた彼らの研究において観察したように、これまでのところDERA酵素は、不運にもアルデヒド基質に対して(特にアセトアルデヒドに対して、そしてより顕著にはα−L−置換アセトアルデヒドに対して)かなり良くない抵抗性を示す。特に脱離基Lがクロロである場合、トリデオキシヘキソースの生合成に有用な濃度でDERA酵素の非常に高い不活性化が観察される。さらに発明者らが発見したように、既知の2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素は、基質クロロアセトアルデヒドに対して非常に低い親和力および活性を有するように見える。これらの理由から実際、良好な合成反応収率を得るために、比較的多量の(高価な)DERA酵素が必要とされる。したがって改善された生産性係数を有するDERA酵素を見つけることに対するかなりの必要性があった(すなわちα−L−置換アセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドに対するこのようなアルドラーゼの抵抗性、触媒活性の変化の組み合わせた結果が好ましくあるべきである)。そして当然ながら、好ましくはトリデオキシヘキソースへの合成経路の生成能力もまた改善されるべきである。
W.A.グリーンバーグ(Greenberg)らのPNAS、第101巻、5788〜5793頁(2004年)からの最近の論文が、DERA反応において改善された容積生産性がある野生型DERA酵素を見いだす試みについて述べ、未知の生物源からの野生型DERAのアミノ酸配列を開示していることが注目される。以下で考察するように、論文はまた、DERA酵素を見いだすスクリーニング法のための特定の方法についても述べる。しかし著者らは基質阻害に焦点を当てており、例えば(比較的高)濃度のクロロアセトアルデヒド、すなわち酵素の強力な不活性化と組み合わさったDERA酵素の使用に固有の問題に実際には対処してはいない。事実、著者らは、基質が反応によって取り除かれるのと同一速度で供給することによって、基質阻害の問題を最小化する事を試みている。
上述のように自然界では、2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼは、アセトアルデヒドとD−グリセルアルデヒド3−ホスフェートの間の(可逆的)アルドール反応をエナンチオ選択的に触媒して、2−デオキシ−D−リボース5−ホスフェートを形成する。本特許出願の目的では、この天然反応、そしてより正確にはその逆反応(すなわち2−デオキシ−D−リボース5−ホスフェートのアセトアルデヒドおよびD−グリセルアルデヒド3−ホスフェートへの分解)は、提供された突然変異酵素のために、抵抗性、c.q.安定性、データを確立するための基準反応の1つとして使用される。したがってこの分解反応は、以下でDERA天然基質反応と称する。しかしDERA天然基質反応に加えて、突然変異酵素の生産性のアセスメントのために、基質としてのクロロアセトアルデヒドとアセトアルデヒドと共に、さらなる試験アッセイ反応、すなわちDERA生産性係数試験(DPFT)を使用する。上で示唆したように、生産性は活性、抵抗性(安定性)と親和力の変化の組み合わせた(すなわち正味)効果を表す。
本発明の文脈で、特に各出現におけるDERA突然変異体の抵抗性および生産性は、前記DERA天然基質反応および/またはDPFT反応において、それに突然変異体が由来する野生型酵素のそれと比較され、および/または大腸菌(E.coli)K12 DERA(a野生型DERA)のそれと比較される。
好ましくは2つの酵素の特定の生産性係数の比較において、同一条件が使用される。「同一条件」とは、異なる核酸配列が2つの異なる酵素をコードする場合を除いて、2つのDERA生産性係数試験間の設定に実質的に違いがないことを意味する。これは例えば温度、pH、無細胞抽出物(cfe)濃度、クロロアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドなどのパラメーターと、発現系、すなわち発現ベクターおよび宿主細胞などの遺伝的背景とが、好ましくは全て同一に保たれることを意味する。
したがってここでの用法では、改善された生産性係数という用語は、本願明細書の実験的部分で述べられるような、特にDPFT反応の結果を考慮に入れた、標準試験条件下における、抵抗性、触媒活性、および親和力の(好ましい)変化の結果である。したがって本願で用いられる生産性係数は、より正確にはCTeHP形成値に相当する。本発明に従って提供されるDERA突然変異体は、DERA天然基質反応および/またはDPFT反応において、それがそれから突然変異した野生型DERA酵素よりも、および/または大腸菌(E.coli)K12 DERAよりも生産性が少なくとも10%高い。したがってそれらはα−脱離基置換アセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドの存在下で、実質的により良い抵抗性を有し(すなわちそれらは所定の時間にわたり、それらの活性レベル百分率が高いままである)、または通常、天然基質DERA反応において実質的に活性がより高い。
本発明はさらに、特にアセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの少なくとも等モル混合物からの6−クロロ−2,4,6−トリデオキシ−D−エリスロヘキサピラノシド(CTeHP)生成におけるDERA生産性係数試験による判定で、[配列番号1]の野生型酵素配列を有する大腸菌(Escherichia coli)K12(EC 4.1.2.4)からの2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素の生産性係数よりも少なくとも10%高い生産性係数を有する、2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素群からの野生型酵素のスクリーニングのためのプロセスに関する。
本発明はさらに、特に少なくともアセトアルデヒドとクロロアセトアルデヒドの等モル混合物からの6−クロロ−2,4,6−トリデオキシ−D−エリスロヘキサピラノシド(CTeHP)生成におけるDERA生産性係数試験による判定で、相応する野生型酵素生産性係数よりも少なくとも10%高い生産性係数を有する、2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素群からの突然変異酵素のスクリーニングのためのプロセスにも関する。より詳しくはこれはまた、[配列番号1]の野生型酵素配列を有する大腸菌(Escherichia coli)K12(EC 4.1.2.4)からの2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素の生産性係数よりも少なくとも10%高い生産性係数を有する、2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素群からの酵素のスクリーニングのためのプロセスにも関する。この配列[配列番号1]は、以下で、配列一覧中のエントリー<400>1の下に示される。
ここでの方法では、突然変異体(酵素)という用語は、野生型DERA酵素をコードするDNA(核酸)の遺伝子操作によって得られる突然変異体を包含することが意図され、例えば大腸菌(E.coli)K12 DERAなどの例えば野生型DERA酵素の[配列番号6]の核酸(配列エントリー<400>6の下の一覧参照、大腸菌(E.coli)K12からの野生型DERA酵素をコードする)に、例えばアミノ酸配列の置き換えまたは置換、欠失、切断および/または挿入がもたらされる。
本発明はなおさらに、それがそれから突然変異した野生型DERA酵素と比べて、および/または大腸菌(E.coli)K12 DERAと比べて、より高く改善された生産性係数を有する2−デオキシ−D−リボース5−ホスフェート突然変異アルドラーゼをコードする単離された核酸に関し、本発明に従った2−デオキシ−D−リボース5−ホスフェート突然変異アルドラーゼをコードする単離された核酸を含んでなるベクター、およびこのような核酸および/またはベクターを含んでなる宿主細胞に関する。
最後に、本発明はまた、上で言及したように、本発明に従った2−デオキシ−D−リボース5−ホスフェート突然変異アルドラーゼを使用した、またはこのような突然変異体をコードする核酸を使用した、またはこのような核酸を含んでなるベクターを使用した、またはこのような核酸および/またはベクターを含んでなる宿主細胞を使用した、改善された医薬品合成、それらの誘導体および中間体にも関する。
本発明者らは、詳細な研究後に、6−クロロ−2,4,6−トリデオキシ−D−エリスロヘキサピラノシド(CTeHP)の生成で使用すると、改善された生産性係数を有する莫大な量の突然変異DERA酵素が利用できるようになったことを見いだした。すなわち発明者らは、2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群からの酵素の単離された突然変異体が、真核生物および原核生物種からなる群に属する天然源から得られることを見いだし、前記野生型酵素は、それぞれアセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの少なくとも等モル混合物からのCTeHPの生成においてDERA生産性係数試験によって判定される特定の生産性係数を有し、単離された突然変異体は、それがそれから突然変異した相応する野生型酵素の生産性係数よりも少なくとも10%高い生産性係数を有し、突然変異体および相応する野生型酵素の双方の生産性係数は同一条件下で測定される。
本発明に従った2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ野生型酵素(DERA)群から単離された酵素突然変異体は、真核生物起源のまたはより好ましくは原核生物起源のDERAのいずれかに由来することができる。DERAが真核生物起源である場合、それらは膜結合核ならびに細胞小器官を含有する1つ以上の真核生物細胞からなる生物体から得られる。真核生物の細胞は、例えばヒト、動物(例えばマウス)、植物、および真菌から、および様々なその他の群の細胞であることができ、その他の群は「原生生物」と総称される。適切なDERAは、例えば後生動物に属する真核生物源、すなわち例えば線形動物、節足動物、および例えばシノラブディス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)、ハツカネズミ(Mus musculus)、およびヒト(Homo sapiens)などの脊椎動物などのスポンジおよび原生動物以外の動物から得ることができる。
しかしより好ましくは、本発明に従った単離された突然変異DERAは、原核生物起源から、すなわち概して古細菌(クレンアーキオータ(Crenarchaeota)およびユリアーキオータ(Euryarchaeota)門を含んでなる)および細菌界に属する、核のない単細胞生物体からのものである。
その種から本発明に従った適切なDERA突然変異体を得ることができる、古細菌界に属する種の系統樹の調査を表1に示す。最も好ましくは、本発明に従った単離された突然変異DERAは細菌起源のものである。その種から本発明に従った適切なDERA突然変異体を得ることができる、細菌界に属する種の系統樹の調査を表2に示す。表1および2において、GIはNCBIアントレ(Entrez)ブラウザからのアミノ酸配列の検索のための共通識別子を表し、例えば次のサイト/検索エンジンNCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)を通じてアクセスできるデータベース中の数を使用して、GI:の後ろの数を使用して野生型DERAのアミノ酸配列および前記アミノ酸配列をコードする核酸配列にアクセスできる。
当業者は、表1および2で言及されるもの以外の野生型DERAアミノ酸配列およびこれらの野生型DERAをコードする核酸配列が、例えば上述のサイト/検索エンジンを使用して、タンパク質および核酸データベース中に、それ自体に知られている様式で容易に見いだせることを認識する。
細菌界内で、突然変異DERAは、最も好ましくは、プロテオバクテリア門、その中でより具体的にはγ−プロテオバクテリア綱、特に腸内細菌科も属するエンテロバクター目に由来する野生型DERAに基づく。前記の科は、とりわけエシェリキア属を含む。
したがって本発明の文脈で使用するための適切な突然変異DERAは、表3に要約するように、例えば原核生物源からの前記野生型酵素をコードするDNAの意図的突然変異によって、大腸菌(Escherichia coli)K12とのほぼ増大する同一性百分率(約20%同一性から100%同一性まで)で、得ることができる。
表3:
突然変異DERAに適した原核生物源:サーモプラズマ・ボルカニウム(Thermoplasma volcanium)、サーモプラズマ・アシドフィラム(Thermoplasma acidophilum)、アエロピラム・ペルニクス(Aeropyrum pernix)、アクイフェックス・アエオリカス(Aquifex aeolicus)、シノリゾビウム・メリロティ(Sinorhizobium meliloti)、オセアノバシラス・イヘイエンシス(Oceanobacillus iheyensis)、ピロバキュラム・アエロフィラム(Pyrobaculum aerophilum)、サーモコッカス・コダカレンシス(Thermococcus kodakaraensis)、ラクトバシラス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、メタノバクテリア・サーモオートトロフィカス(Methanothermobacter thermoautotrophicus)、肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)、マイコプラズマ・ピルム(Mycoplasma pirum)、マイコプラズマ・ジェニタリウム(Mycoplasma genitalium)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・プルモニス(Mycoplasma pulmonis)、サーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)、シネコシスティス(Synechocystis)sp.PCC6803種、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、ノストック(Nostoc)PCC 7120種、ハロバクテリウム(Halobacterium)NRC−1種、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・デュクレイ(Haemophilus ducreyi)、ペスト菌(Yersinia pestis)、ウレアプラズマ・パルブム(Ureaplasma parvum)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)亜種アウレウスMu50、それぞれの亜種アウレウスMW2、表在性ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)、パスツーレラ・マルチコーダ(Pasteurella multicoda)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、ライ菌(Mycobacterium leprae)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)亜種ラクティス(lactis)、エンテロコッカス・フェカーリス(Enterococcus faecalis)、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、テルモアナエロバクター・テングコンゲネシス(Thermoanaerobacter tengcongensis)、枯草菌(Bacillus subtilis)、バシラス・ハロデュランス(Bacillus halodurans)、バシラス・セレアス(Bacillus cereus)、炭疽菌(Bacillus anthracis)エイムス株、リステリア・イノキュア(Listeria innocua)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、クロストリジウム・ペルフリンジェンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、W.A.グリーンズバーグ(Greenberg)ら著、PNAS、第101巻、5788〜5793頁(2004年)の論文で言及されるような環境サンプル、デイノコッカス・ラジオデュランス(Deinococcus radiodurans)、シュードモナス・シリンガエ(Pseudomonas syringae)、ストレプトミセス・コエリカラー(Streptomyces coelicolor)、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)C58株、バークホルデリア・マレイ(Burkholderia mallei)、バークホルデリア・シュードマレイ(Burkholderia pseudomallei)、クロモバクテリウム・ビオラセウム(Chromobacterium violaceum)、シュワネラ・オネイデンシス(Shewanella oneidensis)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、ビブリオ・バルニフィカス(Vibrio vulnificus)、ビブリオ・パラヘモリティカス(Vibrio parahaemolyticus)、フォトラブダス・ルミネセンス(Photorhabdus luminescens)、チフス菌(Salmonella typhi)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、フレクスナー赤痢菌(Shigella flexneri)、大腸菌(Escherichia coli)O157:H7、大腸菌(Escherichia coli)CFT073、大腸菌(Escherichia coli)K12。
突然変異DERAに適した原核生物源:サーモプラズマ・ボルカニウム(Thermoplasma volcanium)、サーモプラズマ・アシドフィラム(Thermoplasma acidophilum)、アエロピラム・ペルニクス(Aeropyrum pernix)、アクイフェックス・アエオリカス(Aquifex aeolicus)、シノリゾビウム・メリロティ(Sinorhizobium meliloti)、オセアノバシラス・イヘイエンシス(Oceanobacillus iheyensis)、ピロバキュラム・アエロフィラム(Pyrobaculum aerophilum)、サーモコッカス・コダカレンシス(Thermococcus kodakaraensis)、ラクトバシラス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、メタノバクテリア・サーモオートトロフィカス(Methanothermobacter thermoautotrophicus)、肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)、マイコプラズマ・ピルム(Mycoplasma pirum)、マイコプラズマ・ジェニタリウム(Mycoplasma genitalium)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、マイコプラズマ・プルモニス(Mycoplasma pulmonis)、サーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)、シネコシスティス(Synechocystis)sp.PCC6803種、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、ノストック(Nostoc)PCC 7120種、ハロバクテリウム(Halobacterium)NRC−1種、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・デュクレイ(Haemophilus ducreyi)、ペスト菌(Yersinia pestis)、ウレアプラズマ・パルブム(Ureaplasma parvum)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)亜種アウレウスMu50、それぞれの亜種アウレウスMW2、表在性ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)、パスツーレラ・マルチコーダ(Pasteurella multicoda)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、ライ菌(Mycobacterium leprae)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)亜種ラクティス(lactis)、エンテロコッカス・フェカーリス(Enterococcus faecalis)、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、テルモアナエロバクター・テングコンゲネシス(Thermoanaerobacter tengcongensis)、枯草菌(Bacillus subtilis)、バシラス・ハロデュランス(Bacillus halodurans)、バシラス・セレアス(Bacillus cereus)、炭疽菌(Bacillus anthracis)エイムス株、リステリア・イノキュア(Listeria innocua)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、クロストリジウム・ペルフリンジェンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、W.A.グリーンズバーグ(Greenberg)ら著、PNAS、第101巻、5788〜5793頁(2004年)の論文で言及されるような環境サンプル、デイノコッカス・ラジオデュランス(Deinococcus radiodurans)、シュードモナス・シリンガエ(Pseudomonas syringae)、ストレプトミセス・コエリカラー(Streptomyces coelicolor)、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)C58株、バークホルデリア・マレイ(Burkholderia mallei)、バークホルデリア・シュードマレイ(Burkholderia pseudomallei)、クロモバクテリウム・ビオラセウム(Chromobacterium violaceum)、シュワネラ・オネイデンシス(Shewanella oneidensis)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、ビブリオ・バルニフィカス(Vibrio vulnificus)、ビブリオ・パラヘモリティカス(Vibrio parahaemolyticus)、フォトラブダス・ルミネセンス(Photorhabdus luminescens)、チフス菌(Salmonella typhi)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、フレクスナー赤痢菌(Shigella flexneri)、大腸菌(Escherichia coli)O157:H7、大腸菌(Escherichia coli)CFT073、大腸菌(Escherichia coli)K12。
本発明に従って得られる突然変異DERAの特定の生産性係数を比較するのに非常に適した野生型参照DERAは、N−末端からC−末端に[配列番号1]の野生型酵素配列を有する大腸菌(Escherichia coli)K12(EC 4.1.2.4)からの2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼである。
したがって本発明は、さらに、真核生物および原核生物種からなる群に属する天然源からの2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群からの単離された酵素の突然変異体に関し、このような各野生型酵素は、アセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの少なくとも等モル混合物からのクロロ−2,4,6−トリデオキシ−D−エリスロヘキサピラノシド(CTeHP)生成においてDERA生産性係数試験によって判定される特定の生産性係数を有し、単離された突然変異体はそれがそれから突然変異した相応する野生型酵素の生産性係数よりも少なくとも10%高い生産性係数を有し、突然変異体および相応する野生型酵素双方の生産性係数は同一条件下で測定され、単離された突然変異体は[配列番号1]の野生型酵素配列を有する大腸菌(Escherichia coli)K12(EC4.1.2.4)からの2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼの生産性係数よりも少なくとも10%高い生産性係数を有し、突然変異体および大腸菌(Escherichia coli)K12酵素双方の生産性係数は、同一条件下で測定される。
大腸菌(E.coli)K12(W3110)DERA酵素の野生型配列(259アミノ酸、[配列番号1])、ならびに前記DERA酵素をコードするヌクレオチド配列(780ヌクレオチド、[配列番号6]、配列一覧参照)については、P.バレンティン−ハンセン(Valentin−Hansen)らによって「deoC遺伝子のヌクレオチド配列および酵素のアミノ酸配列(Nucleotide sequence of the deoC gene and the amino acid sequence of the enzyme)」、Eur.J.Biochem.125(3)、561〜566頁(1982年)で述べられることが顕著である。
デサンティス(DeSantis)ら、2003年、Bioorganic & Medicinal Chemistry 11、43〜52頁は、大腸菌(E.coli)(EC 4.1.2.4)からの2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼのホスフェート結合ポケットにおける5個の部位特異的突然変異体、大腸菌(E.coli)DERA:K172E、R207E、G205E、S238D、およびS239Eのデザインを開示する。これらの突然変異DERA酵素の内、S238DおよびS239Eは、その非リン酸化天然基質(2−デオキシ−D−リボース)に対して、野生型酵素よりも高い活性を有することが示される。これらの大腸菌(E.coli)2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼと同じ突然変異体は、米国特許出願公開第2003/0232416号明細書で開示される。
本発明者らは、デフォルト設定(マトリックス:Gonnet 250;GAP OPEN:10;END GAPS:10;GAP EXTENSION:0.05;GAP DISTANCES:8)でClustalWバージョン1.82(http://www.ebi.ac.uk/clustalw)複数配列比較を使用した配列比較研究において、本発明に従った単離された突然変異体を誘導するために使用できる真核生物および原核生物起源のDERAが、大腸菌(Escherichia coli)K12(EC 4.1.2.4)からの2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼの[配列番号1]の野生型酵素配列との広範な同一性百分率にわたって変化してもよいことを見いだした。同一性百分率が約20%でさえも、本発明に従った突然変異体を得るための出発点として使用できる、なおも非常に適切なDERAが見いだされる。
発明者らは、本発明で使用できる全てのDERA(およびそれに由来する突然変異体)が、共通して[配列番号1]の野生型酵素配列と比べて少なくとも8個の保存アミノ酸、すなわちF76、G79、E100、D102、K167、T170、K201、およびG204を有することを見いだした。したがって下で述べられる全ての突然変異は、これらの保存位置とは異なる位置にある。K167がアセトアルデヒドと共にシッフ塩基中間体を形成する必須活性部位リジンであり、K201およびD102がヘイン(Heine)ら著「原子解像度での酵素機序における共有結合中間体の観察(Observation of covalent intermediates in an enzyme mechanism at atomic resolution)」、Science 294,369〜374頁(2001年)に従って「活性化する」K167触媒の陽子リレー系に関与することが顕著である。他の5個の残基については、これまでのところ保存されている、または例えば基質の認識または触媒作用のために重要であるとは述べられていない。
好ましくは単離された突然変異DERAは、それがそれから突然変異した相応する野生型酵素の生産性係数よりも少なくとも10%高い生産性係数を有する。生産性係数は、相応する野生型酵素よりも好ましくは少なくとも20%、より好ましくは少なくとも30%、さらにより好ましくは少なくとも40%、さらにより優先的には少なくとも50%、より好ましくは少なくとも100%、さらにより好ましくは少なくとも200%、さらにより好ましくは少なくとも500%、さらにより好ましくは少なくとも1000%、さらにより好ましくは少なくとも1500%高い。
より好ましくは、単離された突然変異DERAは、大腸菌(E.coli)K12 DERAの生産性係数よりも少なくとも10%高い生産性係数を有する。生産性係数は、大腸菌(E.coli)K12 DERAよりも好ましくは少なくとも20%、より好ましくは少なくとも30%、さらにより好ましくは少なくとも40%、さらにより優先的には少なくとも50%、より好ましくは少なくとも100%、さらにより好ましくは少なくとも200%、さらにより好ましくは少なくとも500%、さらにより好ましくは少なくとも1000%、さらにより好ましくは少なくとも1500%高い。
意図される反応において非常に効果的であることが示された単離された突然変異体の非常に重要な群は、[配列番号1]の野生型酵素配列を有する大腸菌(Escherichia coli)K12(EC 4.1.2.4)から単離された2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ突然変異体である。これらの単離された突然変異DERAは、[配列番号1]の酵素配列の生産性係数よりも少なくとも10%高い生産性係数を有する。生産性係数は、[配列番号1]の酵素配列よりも好ましくは少なくとも20%、より好ましくは少なくとも30%、さらにより好ましくは少なくとも40%、さらにより優先的には少なくとも50%、そしてさらにより好ましくは少なくとも100%、さらにより好ましくは少なくとも200%、さらにより好ましくは少なくとも500%、さらにより好ましくは少なくとも1000%、さらにより好ましくは少なくとも1500%高い。
本発明者らは、突然変異体が、任意に、好ましくはTTKTQLSCTKW[配列番号2]およびKTQLSCTKW[配列番号3]の1つの断片によるC−末端延長と組み合わさった、および/またはN−末端延長と組み合わさった、[配列番号1]中のK13、T19、Y49、N80、D84、A93、El27、Al28、K146、K160、I166、A174、M185、K196、F200、またはS239の位置の1つ以上、またはそれに相応する位置、好ましくはF200の位置またはそれに相応する位置の少なくとも1つのアミノ酸置換を有すれば、および/または[配列番号1]中のS258またはY259の位置の1つの少なくとも1つのアミノ酸欠失を有すれば、非常に適切な単離された突然変異DERAが得られることを見いだした。
[配列番号2]をコードする核酸配列の例を[配列番号7]に示す。[配列番号3]をコードする核酸配列の例を[配列番号8]に示す。
本発明の一実施形態では、部位特異的突然変異は、例えばF200の位置(それに相応する位置)上などの[配列番号1]中の上述の位置、またはそれに相応する位置の1つで実施される飽和変異誘発によって作られてもよい。飽和変異誘発とは、アミノ酸が、例えばその中で各変異型が[配列番号1]の200の位置において特定のアミノ酸交換を含有する、変異型酵素のライブラリーを生成することで、例えばアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンなどの全ての可能なタンパク質新生アミノ酸で置換されることを意味する。好ましくは飽和変異誘発は、例えば実施例4で述べられるように、置換するアミノ酸をコードする核酸トリプレットを全ての可能な核酸トリプレットによって交換することで実施される。したがってこれらの突然変異体は、上述の少なくとも8個の保存アミノ酸、すなわちF76、G79、E100、D102、K167、T170、K201、およびG204をなおも有しながら、[配列番号1](または上述のClustalWプログラムに従って見いだされる同一性百分率で、それに相応する別の天然源からのあらゆるその他の野生型酵素アミノ酸配列)とは異なる配列を示された位置の1つ以上に有する。したがってここでの用法では、「相応する突然変異」とは、特定の「相応する野生型酵素アミノ酸配列」(すなわちDERA活性を有する酵素配列)で生じるこれらの突然変異を示すことが意図される。
大腸菌(E.coli)K12 DERA[配列番号1]の野生型アミノ配列中のアミノ酸残基の位置に相応する野生型または変異タンパク質配列のアミノ酸残基は、デフォルト設定(マトリックス:Gonnet 250;GAP OPEN:10;END GAPS:10;GAP EXTENSION:0.05;GAP DISTANCES:8)でClustalWバージョン1.82(http://www.ebi.ac.uk/clustalw)複数配列比較を実施することで同定できる。このような配列比較において、[配列番号1]で示される大腸菌(E.coli)K12野生型DERA配列のアミノ酸残基と同じ列に配置されたアミノ酸残基は、大腸菌(E.coli)K12野生型DERA[配列番号1]のこの各アミノ酸残基に相応する位置と定義される。
ここでの用法では、配列中、およびその中の様々な位置のアミノ酸は、次のようにそれらの一文字コードによって(それぞれそれらの三文字コードによって)示される。
上に列挙したアミノ酸は、配列中の特定の位置のように重要かもしれない様々な特性によって区別できる。例えばアミノ酸のいくつかは、正に帯電したアミノ酸のカテゴリー、すなわち特にリジン、アルギニン、およびヒスチジンに属する。アミノ酸の別のカテゴリーは、セリン、スレオニン、システイン、グルタミン、およびアスパラギンからなる親水性アミノ酸である。疎水性アミノ酸は、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、フェニルアラニン、およびチロシンである。芳香族アミノ酸のカテゴリー、すなわちフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンもある。アミノ酸を分類するさらに別の可能性は、それらのサイズに従う。アミノ酸は、大きい順に次のように列挙できる。W>Y>F>R>K>L、I>H>Q>V>E>T>N>P>D>C>S>A>G。
したがって権利請求の対象とする各突然変異体は、それが由来する野生型配列と比較される。これは本発明に従った突然変異体が、次の少なくとも最初の2つの基準を満たす場合のみに、突然変異体と見なすことができることを意味する。
(a)突然変異は、大腸菌(E.coli)K12について示される突然変異の1つに相応しなくてはならない。
(b)突然変異は、それに突然変異体が由来する野生型酵素中に存在しない。
(c)相応する位置に、少なくとも8個の保存アミノ酸、すなわちF76、G79、E100、D102、K167、T170、K201、およびG204がなおも存在する。
(a)突然変異は、大腸菌(E.coli)K12について示される突然変異の1つに相応しなくてはならない。
(b)突然変異は、それに突然変異体が由来する野生型酵素中に存在しない。
(c)相応する位置に、少なくとも8個の保存アミノ酸、すなわちF76、G79、E100、D102、K167、T170、K201、およびG204がなおも存在する。
最も好ましくは、本発明に従った単離された突然変異DERAは、任意に好ましくは断片TTKTQLSCTKW[配列番号2]およびKTQLSCTKW[配列番号3]の1つによるC−末端延長と組み合わさった、および/またはN−末端延長と組み合わさった、
a.正に帯電したアミノ酸によって、好ましくはRまたはHによって置換されたK13および/またはK196、
b.別のアミノ酸によって、好ましくは特にS、T、C、Q、およびNからなる親水性アミノ酸からなる群、および/または特にV、L、およびIからなる疎水性アミノ酸からなる群から選択される別のアミノ酸によって置換されたT19および/またはMl85、
c.FおよびWからなる群から選択される芳香族アミノ酸によって置換されたY49、
d.T、S、C、Q、およびNからなる親水性アミノ酸の群から選択される別のアミノ酸によって置換されたN80および/またはI166および/またはS239、
e.大きい順にE、T、N、P、D、C、S、A、およびGからなる小型アミノ酸の群から選択される別の、好ましくはより小型のアミノ酸によって置換されたD84および/またはA93および/またはE127、
f.I、L、M、V、F、およびYからなる疎水性アミノ酸の群から選択される別のアミノ酸によって置換されたA128および/またはK146および/またはK160および/またはA174および/またはF200
からなる群から選択されるアミノ酸置換の少なくとも1つを[配列番号1]中に有し、またはその中の置換に相応し、および/または[配列番号1]中のS258およびY259の位置、またはそれに相応する位置における少なくとも1つのアミノ酸の欠失を有する。
a.正に帯電したアミノ酸によって、好ましくはRまたはHによって置換されたK13および/またはK196、
b.別のアミノ酸によって、好ましくは特にS、T、C、Q、およびNからなる親水性アミノ酸からなる群、および/または特にV、L、およびIからなる疎水性アミノ酸からなる群から選択される別のアミノ酸によって置換されたT19および/またはMl85、
c.FおよびWからなる群から選択される芳香族アミノ酸によって置換されたY49、
d.T、S、C、Q、およびNからなる親水性アミノ酸の群から選択される別のアミノ酸によって置換されたN80および/またはI166および/またはS239、
e.大きい順にE、T、N、P、D、C、S、A、およびGからなる小型アミノ酸の群から選択される別の、好ましくはより小型のアミノ酸によって置換されたD84および/またはA93および/またはE127、
f.I、L、M、V、F、およびYからなる疎水性アミノ酸の群から選択される別のアミノ酸によって置換されたA128および/またはK146および/またはK160および/またはA174および/またはF200
からなる群から選択されるアミノ酸置換の少なくとも1つを[配列番号1]中に有し、またはその中の置換に相応し、および/または[配列番号1]中のS258およびY259の位置、またはそれに相応する位置における少なくとも1つのアミノ酸の欠失を有する。
本発明の一実施形態では、本発明の単離された突然変異体において、少なくとも1つのアミノ酸残基の欠失、例えばS258および/またはY259の、またはそれに相応する位置での欠失によりC−末端が切断され、次に好ましくはTTKTQLSCTKW[配列番号2]およびKTQLSCTKW[配列番号3]の断片の1つによって延長されてもよい。
明瞭さのために、「[配列番号1]中のアミノ酸置換、またはその中の置換に相応する」という部分は、[配列番号1]中の置換、または大腸菌(E.coli)K12以外の野生型配列中の大腸菌(E.coli)中の番号付けされた位置であっただろう、相応する位置における置換のいずれかである置換を意味する。
最も好ましくは、単離された突然変異DERAは、K13R、T19S、Y49F、N80S、D84G、A93G、E127G、A128V、K146V、K160M、I166T、A174V、M185T、M185V、K196R、F200I、F200M、F200V、S239C、ΔS258、ΔY259、TTKTQLSCTKW[配列番号2]によるC−末端延長、およびKTQLSCTKW[配列番号3]によるC−末端延長の群から選択される、[配列番号1]中の1つ以上の突然変異を有し、またはその中の突然変異に相応する。
本願明細書で示されるように、[配列番号1]中のアミノ酸位置番号に先立つ一文字コードは前記野生型大腸菌(E.coli)酵素中に存在するアミノ酸を示し、[配列番号1]中のアミノ酸位置番号に続く一文字コードは突然変異体中に存在するアミノ酸を示す。アミノ酸位置番号は、[配列番号1]のDERA中の位置番号、およびその他の供給源からのその他のDERA野生型中のそれに相応するあらゆる位置を反映する。
より具体的には、単離された突然変異DERAは、F200IおよびΔY259、F200MおよびΔY259、F200VおよびΔY259、F200IおよびKTQLSCTKW[配列番号3]によるC−末端延長、F200MおよびKTQLSCTKW[配列番号3]によるC−末端延長、F200VおよびKTQLSCTKW[配列番号3]によるC−末端延長の群から選択される、[配列番号1]中の少なくとも2つの突然変異を有し、またはその中の2つの突然変異に相応する。
本発明はまた、アセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの少なくとも等モル混合物からの6−クロロ−2,4,6−トリデオキシ−D−エリスロヘキサピラノシド(CTeHP)の生成において、DERA生産性係数試験によって判定される、[配列番号1]の野生型酵素配列を有する大腸菌(Escherichia coli)K12(EC 4.1.2.4)からの2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素の生産性係数よりも少なくとも10%高い生産性係数を有する、2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素群からの野生型酵素のスクリーニングのためのプロセスにも関し、
(A)引き続いて(i)総および/またはゲノムDNAおよび/またはcDNAが単離され、(ii)前記単離されたDNAを含んでなる個々のクローンからなる、前記単離されたDNAの発現ライブラリーが調製され、(iii)得られた発現ライブラリーからの個々のクローンが、基質アセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの混合物と共にインキュベートされ、(iv)これらの基質の4−クロロ−3−(S)−ヒドロキシ−ブチルアルデヒド(CHBA)および/または6−クロロ−2,4,6−トリデオキシ−D−エリスロヘキサピラノシド(CTeHP)への転換を示す1つ以上のクローンからの1つ以上の遺伝子が単離され、[配列番号6]と同じ遺伝的背景中に再クローンされ、
(B)ステップ(iv)で得られる再クローンされた遺伝子によってコードされるDERA酵素が発現されて、DERA生産性係数試験によって試験されることで、このような野生型酵素の各生産性係数が得られ、
(C)ステップ(B)からのこれらの野生型酵素の生産性係数が、[配列番号1]の配列を有する大腸菌(Escherichia coli)K12(EC 4.1.2.4)からの野生型酵素のそれと比較され、前記比較において少なくとも10%より高い生産性係数を有するDERA酵素をコードする遺伝子の1つ以上が選択され単離される。
(A)引き続いて(i)総および/またはゲノムDNAおよび/またはcDNAが単離され、(ii)前記単離されたDNAを含んでなる個々のクローンからなる、前記単離されたDNAの発現ライブラリーが調製され、(iii)得られた発現ライブラリーからの個々のクローンが、基質アセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの混合物と共にインキュベートされ、(iv)これらの基質の4−クロロ−3−(S)−ヒドロキシ−ブチルアルデヒド(CHBA)および/または6−クロロ−2,4,6−トリデオキシ−D−エリスロヘキサピラノシド(CTeHP)への転換を示す1つ以上のクローンからの1つ以上の遺伝子が単離され、[配列番号6]と同じ遺伝的背景中に再クローンされ、
(B)ステップ(iv)で得られる再クローンされた遺伝子によってコードされるDERA酵素が発現されて、DERA生産性係数試験によって試験されることで、このような野生型酵素の各生産性係数が得られ、
(C)ステップ(B)からのこれらの野生型酵素の生産性係数が、[配列番号1]の配列を有する大腸菌(Escherichia coli)K12(EC 4.1.2.4)からの野生型酵素のそれと比較され、前記比較において少なくとも10%より高い生産性係数を有するDERA酵素をコードする遺伝子の1つ以上が選択され単離される。
上のステップ(i)で意図される総および/またはゲノムのDNAおよび/またはcDNAの単離が、例えば微生物から、または土壌または水などの環境サンプルから行われてもよい。ステップ(ii)で調製される単離されたDNAの発現ライブラリーは、前記単離されたDNAを含んでなる個々のクローンからなり、そのDNAは1つ以上の異なる酵素をコードする。DERA活性の存在のアセスメントのための、上のステップ(iii)におけるアセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの混合物とのインキュベーションは、例えば0.2:1から5:1などの広範な分子比率のこれらの基質の混合物で実施してもよい。既に、これらの基質の4−クロロ−3−(S)−ヒドロキシ−ブチルアルデヒド(CHBA)および/または6−クロロ−2,4,6−トリデオキシ−D−エリスロヘキサピラノシド(CTeHP)への転換の定性的アセスメントが、ステップ(ii)発現ライブラリーからの個々のクローン中に存在する遺伝子の有効性の最初の指標を提供するかもしれないことは明らかである。
したがって既にこの段階で、DERA酵素をコードする様々な遺伝子の活性におけるいくらかの格付けが確立できる。このアセスメントは、最も有望な遺伝子の単離を可能にする。しかしスクリーニングプロセスの究極の目的は、アセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの少なくとも等モル混合物からの6−クロロ−2,4,6−トリデオキシ−D−エリスロヘキサピラノシド(CTeHP)の生成においてDPFTによって判定される、大腸菌(Escherichia coli)K12からの2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素の生産性係数よりも少なくとも10%高い生産性係数を有する(野生型)DERAを見いだすことなので、これらの選択された遺伝子、または必要に応じてそれらのより少ない数が単離され、[配列番号6]と同じ遺伝的背景中に再クローンされる。このステップにより、大腸菌(Escherichia coli)K12からの野生型DERA酵素の発現と比較できるやり方で試験される酵素の適切な発現が確実になる。DPFTによるスクリーニングおよび試験、そして大腸菌(Escherichia coli)K12からの野生型DERA酵素のDPFTの結果との適切な比較を行った後、例えば次に本発明に従った突然変異体を得るための出発点として使用できるDERAなどの適切な野生型DERAを見いだすことは非常に容易である。
本発明は、さらにアセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの少なくとも等モル混合物からの6−クロロ−2,4,6−トリデオキシ−D−エリスロヘキサピラノシド(CTeHP)の生成においてDERA生産性係数試験によって判定される、相応する野生型酵素の生産性係数よりも少なくとも10%高いか、または[配列番号1]の野生型酵素配列を有する大腸菌(Escherichia coli)K12(EC 4.1.2.4)からの2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素の生産性係数よりも少なくとも10%高いかのいずれかの生産性係数を有する、2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素群からの突然変異酵素のスクリーニングのためのプロセスに関する。前記プロセスでは、(A)引き続いて(i)野生型2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素をコードする遺伝子が突然変異されて、それ自体に知られている様式で[配列番号6]を有する大腸菌(E.coli)K12 DERAをコードする遺伝子と同じ遺伝的背景中に、それぞれそれがそれから突然変異した相応する野生型遺伝子と同じ遺伝的背景中にクローンされることにより、このようにして調製された突然変異体からクローンの発現ライブラリーが得られ、
(B)クローン中のDERA酵素が発現されて、DERA生産性係数試験によって試験されることにより、各突然変異酵素の生産性係数が得られ、
(C)突然変異酵素の生産性係数が相応する野生型酵素のそれ、または[配列番号1]の配列を有する大腸菌(Escherichia coli)K12(EC 4.1.2.4)からの野生型酵素のそれと比較され、それぞれの比較において少なくとも10%より高い生産性係数を有するDERA突然変異体をコードする1つ以上の遺伝子が選択され単離される。
(B)クローン中のDERA酵素が発現されて、DERA生産性係数試験によって試験されることにより、各突然変異酵素の生産性係数が得られ、
(C)突然変異酵素の生産性係数が相応する野生型酵素のそれ、または[配列番号1]の配列を有する大腸菌(Escherichia coli)K12(EC 4.1.2.4)からの野生型酵素のそれと比較され、それぞれの比較において少なくとも10%より高い生産性係数を有するDERA突然変異体をコードする1つ以上の遺伝子が選択され単離される。
より具体的には、本発明は、
(A)引き続いて(i)野生型2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素をコードする遺伝子が突然変異されて、それ自体に知られている様式で大腸菌(E.coli)K12 DERAと同じ、それぞれそれがそれから突然変異した相応する野生型遺伝子と同じ、遺伝的背景中にクローンされることにより、このようにして調製された突然変異体からクローンの発現ライブラリーが得られ、(ii)得られた発現ライブラリーからの個々のクローンが、基質アセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの混合物と共にインキュベートされ、(iii)これらの基質の4−クロロ−3−(S)−ヒドロキシ−ブチルアルデヒド(CHBA)および/または6−クロロ−2,4,6−トリデオキシ−D−エリスロヘキサピラノシド(CTeHP)への最大転換を示すクローンの1つ以上が選択され、
(B)ステップ(iii)からの選択されたクローン中のDERA酵素が発現されて、DERA生産性係数試験によって試験されることで、各突然変異酵素の生産性係数が得られ、
(C)スクリーンされた突然変異酵素の生産性係数が、相応する野生型酵素のそれ、または[配列番号1]の配列を有する大腸菌(Escherichia coli)K12(EC 4.1.2.4)からの野生型酵素のそれと比較され、それぞれの比較で少なくとも10%より高い生産性係数を有するDERA突然変異体をコードする1つ以上の遺伝子が選択され単離される、プロセスに関する。
(A)引き続いて(i)野生型2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素をコードする遺伝子が突然変異されて、それ自体に知られている様式で大腸菌(E.coli)K12 DERAと同じ、それぞれそれがそれから突然変異した相応する野生型遺伝子と同じ、遺伝的背景中にクローンされることにより、このようにして調製された突然変異体からクローンの発現ライブラリーが得られ、(ii)得られた発現ライブラリーからの個々のクローンが、基質アセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの混合物と共にインキュベートされ、(iii)これらの基質の4−クロロ−3−(S)−ヒドロキシ−ブチルアルデヒド(CHBA)および/または6−クロロ−2,4,6−トリデオキシ−D−エリスロヘキサピラノシド(CTeHP)への最大転換を示すクローンの1つ以上が選択され、
(B)ステップ(iii)からの選択されたクローン中のDERA酵素が発現されて、DERA生産性係数試験によって試験されることで、各突然変異酵素の生産性係数が得られ、
(C)スクリーンされた突然変異酵素の生産性係数が、相応する野生型酵素のそれ、または[配列番号1]の配列を有する大腸菌(Escherichia coli)K12(EC 4.1.2.4)からの野生型酵素のそれと比較され、それぞれの比較で少なくとも10%より高い生産性係数を有するDERA突然変異体をコードする1つ以上の遺伝子が選択され単離される、プロセスに関する。
突然変異体のためのこの第2のタイプのスクリーニングは、例えば本発明に従った野生型DERA酵素のスクリーニングのためのプロセスを使用して得られた野生型2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素をコードすることが知られている遺伝子に始まり、または例えば表1または2で参照されるような野生型DERA酵素をコードする遺伝子に始まる。これらの遺伝子は最初に突然変異され、それ自体に知られている様式で大腸菌(E.coli)K12 DERAと同じ、それぞれそれがそれから突然変異した相応する野生型遺伝子と同じ遺伝的背景中にクローンされる。前記遺伝子は、例えば微生物から、または土壌または水などの環境サンプルから得られてもよい。上述の突然変異およびクローニングは、このようにして調製された突然変異体からのクローンの発現ライブラリーをもたらす。事実、当業者によく知られているように、このような発現ライブラリーは、引き続いて突然変異体のDNAライブラリーを調製し、個々のDNAのそれぞれをベクター中にクローニングし、ベクターを適切な発現宿主中に形質転換することで調製される。DERA活性の存在のアセスメントのための、上のステップ(ii)におけるアセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒド混合物とのインキュベーションは、ここでも例えば0.2:1から5:1などの広範な分子比率のこれらの基質の混合物で実施してもよい。次にこれらの基質の4−クロロ−3−(S)−ヒドロキシ−ブチルアルデヒド(CHBA)および/または6−クロロ−2,4,6−トリデオキシ−D−エリスロヘキサピラノシド(CTeHP)への転換の定性的アセスメントは、これらの基質の4−クロロ−3−(S)−ヒドロキシ−ブチルアルデヒド(CHBA)および/または6−クロロ−2,4,6−トリデオキシ−D−エリスロヘキサピラノシド(CTeHP)への転換程度の最初の格付けをもたらし、DPFTによるさらなる評価のために、最大転換を示す1つ以上のクローンが選択されてもよい。言うまでもなく試験結果が、大腸菌(Escherichia coli)K12からの野生型DERA酵素の発現、それぞれそれがそれから突然変異した相応する野生型遺伝子の発現と容易に比較できるように、試験する酵素の適切な発現が確実にされなくてはならない。このようにすれば、突然変異DERAをコードする適切な遺伝子を見いだして単離することは非常に容易であり、次にスタチンなどの有用な医薬品の商業的生成において適切に使用できる。
上述のスクリーニングプロセスは、上で引用したW.A.グリーンバーグ(Greenberg)ら著、PNAS、第101巻、5788〜5793頁(2004年)で使用されるものとは異なることが顕著である。前記論文の著者らは、すなわちR.ペレツ・カーロン(Perez Carlon)ら著、Chem.Eur.J.、6、4154〜4162頁(2000年)で述べられる蛍光性検出アッセイを使用した。前記検出アッセイは非常に間接的な方法であり、DERA活性は2−デオキシ−D−リボース基質の蛍光性ウンベリフェロン誘導体によって判定される。しかし最初の事例では酵素のみが得られ、それらはDERA天然基質反応と非常に類似した逆アルドール反応を示し、それらは追加的な第2のスクリーニングにおいて標的反応について試験されるために、前記方法は、アセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの少なくとも等モル混合物からの6−クロロ−2,4,6−トリデオキシ−D−エリスロヘキサピラノシド(CTeHP)の生成におけるDERA生産性(ならびに活性)の判定では、(置換アルデヒドとの所望の反応における所望の活性を判定するために追加的アッセイを要するので)適切さに劣る。このような問題を克服するために、本発明者らは、独自の直接スクリーニング法を開発し、いわゆるDERA生産性係数試験もまた開発した。
適切に、第1のステップ中の突然変異体のための前記スクリーニングでは、表1、2および3に示す供給源の1つに由来する、野生型2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素をコードする遺伝子が突然変異される。
したがって本発明はまた、このようなスクリーニングプロセスのいずれかによって得られる、特に表1、2、および3で示される供給源の1つに由来する野生型2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素をコードする突然変異遺伝子に適用されるスクリーニングプロセスによって得られる、単離された核酸にも関する。
本発明は、さらに突然変異2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素をコードする単離された核酸に関し、単離された核酸は、それがそれから突然変異した相応する野生型酵素の生産性係数よりも少なくとも10%高い生産性係数を有する突然変異体をコードし、突然変異体および相応する野生型酵素の双方の生産性係数は同一条件下で測定される。
さらに本発明は、突然変異2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素をコードする単離された核酸に関し、単離された核酸は、それがそれから突然変異した相応する野生型酵素の生産性係数よりも少なくとも10%高い生産性係数を有する突然変異体をコードし、突然変異体および相応する野生型酵素の双方の生産性係数は同一条件下で測定され、[配列番号1]の野生型酵素配列を有する大腸菌(Escherichia coli)K12(EC 4.1.2.4)からの2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼの生産性係数よりも少なくとも10%高い生産性係数を有し、突然変異体および大腸菌(Escherichia coli)K12酵素の双方の生産性係数は同一条件下で測定される。
さらに本発明はまた、[配列番号1]の野生型酵素配列を有する大腸菌(Escherichia coli)K12(EC 4.1.2.4)からの突然変異体をコードする単離された核酸にも関する。さらに本発明はまた、任意に、好ましくは断片TTKTQLSCTKW[配列番号2]およびKTQLSCTKW[配列番号3]の1つによるC−末端延長と組み合わさった、および/またはN−末端延長と組み合わさった、1つ以上の位置、または[配列番号1]中のK13、T19、Y49、N80、D84、A93、E127、A128、K146、K160、I166、A174、M185、K196、F200、およびS239の1つ以上の位置、またはそれに相応する位置、好ましくはF200の位置またはそれに相応する位置の少なくとも1つのアミノ酸置換、および/または[配列番号1]中の位置S258またはY259またはそれに相応する位置の少なくとも1つのアミノ酸の欠失を有する、突然変異2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素をコードする単離された核酸にも関する。
好ましくは前記単離された核酸は、任意に、好ましくは断片TTKTQLSCTKW[配列番号2]およびKTQLSCTKW[配列番号3]の1つによるC−末端延長と組み合わさった、および/またはN−末端延長と組み合わさった、
a.正に帯電したアミノ酸、好ましくはRまたはHによって置換されたK13および/またはK196、
b.別のアミノ酸によって、好ましくは親水性アミノ酸からなる、特にS、T、C、Q、およびNからなる群から選択される別のアミノ酸、および/または特にV、L、およびIからなる疎水性アミノ酸によって置換されたT19および/またはMl85、
c.FおよびWからなる群から選択される芳香族アミノ酸によって置換されたY49、
d.T、S、C、Q、およびNからなる親水性アミノ酸の群から選択される別のアミノ酸によって置換されたN80および/またはI166および/またはS239、
e.別の、好ましくは大きい順にE、T、N、P、D、C、S、A、およびGからなる小型アミノ酸群から選択されるより小型のアミノ酸によって置換されたD84および/またはA93および/またはE127、
f.I、L、M、V、F、およびYからなる疎水性アミノ酸の群から選択される別のアミノ酸によって置換されたA128および/またはK146および/またはK160および/またはA174および/またはF200
からなる群から選択される、[配列番号1]中の少なくとも1つのアミノ酸置換を有し、またはその中の置換に相当し、
および/または[配列番号1]中の位置S258およびY259、またはそれに相応する位置に少なくとも1つのアミノ酸の欠失を有する、突然変異2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素をコードする。
a.正に帯電したアミノ酸、好ましくはRまたはHによって置換されたK13および/またはK196、
b.別のアミノ酸によって、好ましくは親水性アミノ酸からなる、特にS、T、C、Q、およびNからなる群から選択される別のアミノ酸、および/または特にV、L、およびIからなる疎水性アミノ酸によって置換されたT19および/またはMl85、
c.FおよびWからなる群から選択される芳香族アミノ酸によって置換されたY49、
d.T、S、C、Q、およびNからなる親水性アミノ酸の群から選択される別のアミノ酸によって置換されたN80および/またはI166および/またはS239、
e.別の、好ましくは大きい順にE、T、N、P、D、C、S、A、およびGからなる小型アミノ酸群から選択されるより小型のアミノ酸によって置換されたD84および/またはA93および/またはE127、
f.I、L、M、V、F、およびYからなる疎水性アミノ酸の群から選択される別のアミノ酸によって置換されたA128および/またはK146および/またはK160および/またはA174および/またはF200
からなる群から選択される、[配列番号1]中の少なくとも1つのアミノ酸置換を有し、またはその中の置換に相当し、
および/または[配列番号1]中の位置S258およびY259、またはそれに相応する位置に少なくとも1つのアミノ酸の欠失を有する、突然変異2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素をコードする。
最も好ましくは、本発明に従った単離された核酸は、任意に断片TTKTQLSCTKW[配列番号2]およびKTQLSCTKW[配列番号3]の1つによるC−末端延長と組み合わさった、K13R、T19S、Y49F、N80S、D84G、A93G、E127G、A128V、K146V、K160M、I166T、A174V、M185T、M185V、K196R、F200I、F200V、F200M、およびS239C、および/または[配列番号1]中の位置ΔS258およびΔY259における、またはそれに相応する位置における少なくとも1つのアミノ酸の欠失の群から選択される、[配列番号1]中の少なくとも1つ以上の突然変異を有する、またはその中の突然変異に相応する、突然変異2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素をコードする。
より具体的には、本発明に従った核酸は、F200IおよびΔY259、F200MおよびΔY259、F200VおよびΔY259、F200IおよびKTQLSCTKW[配列番号3]によるC−末端延長、F200MおよびKTQLSCTKW[配列番号3]によるC−末端延長、およびF200VおよびKTQLSCTKW[配列番号3]によるC−末端延長の群から選択される[配列番号1]中の少なくとも2つの突然変異を有する、またはその中の2つの突然変異に相応する、突然変異2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素をコードする。
さらに本発明は、上で述べられる核酸のいずれかを含んでなるベクター、ならびに上で述べられる2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群からの突然変異体を含んでなる宿主細胞、または上で述べられるスクリーニングプロセスに従って得られる突然変異酵素、および/または上で述べられる単離された核酸を含んでなる、および/または既述のベクターを含んでなる宿主細胞に関する。
本発明は、同様に、相応する野生型酵素、および/または、[配列番号1]の野生型酵素配列を有する大腸菌(Escherichia coli)(EC 4.1.2.4)からの2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素の生産性係数よりも少なくとも10%高い生産性係数を有する突然変異2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼの調製のためのプロセスに関し、上で述べられるような核酸、または上で述べられるようなベクター、または上で述べられるような宿主細胞が利用される。
本発明はまた、式1、
(式中、R1およびRxはそれぞれ独立してHまたは保護基を表し、Xはハロゲンと、トシレート基と、メシレート基と、アシルオキシ基と、フェニルアセチルオキシ基と、アセトアルデヒドおよび式、HC(O)CH2X(式中、Xは上で定義したとおりである)の相応する置換アセトアルデヒドからのアルコキシ基またはアリールオキシ基とを表す)の2,4−ジデオキシヘキソースまたは2,4,6−トリデオキシヘキソースの調製のための改善されたプロセスにも関し、本発明に従った、または本発明に従ったプロセスによって生成される、または本発明に従った突然変異酵素のスクリーニングのためのプロセスによって得られる、突然変異DERA酵素が使用され、R1および/またはRxが保護基を表す場合、形成された化合物中のヒドロキシ基は、保護基によってそれ自体に知られている様式で保護される。
(式中、R1およびRxはそれぞれ独立してHまたは保護基を表し、Xはハロゲンと、トシレート基と、メシレート基と、アシルオキシ基と、フェニルアセチルオキシ基と、アセトアルデヒドおよび式、HC(O)CH2X(式中、Xは上で定義したとおりである)の相応する置換アセトアルデヒドからのアルコキシ基またはアリールオキシ基とを表す)の2,4−ジデオキシヘキソースまたは2,4,6−トリデオキシヘキソースの調製のための改善されたプロセスにも関し、本発明に従った、または本発明に従ったプロセスによって生成される、または本発明に従った突然変異酵素のスクリーニングのためのプロセスによって得られる、突然変異DERA酵素が使用され、R1および/またはRxが保護基を表す場合、形成された化合物中のヒドロキシ基は、保護基によってそれ自体に知られている様式で保護される。
好ましくはXは、ハロゲン、より好ましくはCl、BrまたはIを、またはアシルオキシ基、より好ましくはアセトキシ基を表す。
例えば米国特許第5,795,749号明細書の例えば4欄1〜18行で述べられる反応条件を使用して、または例えばW.A.グリーンズバーグ(Greenberg)ら著、PNAS、第101巻、5788〜5793頁、(2004年)で述べられる流加反応条件を使用して、野生型DERA酵素を使用した反応について当該技術分野で述べられる反応条件を使用して、上述の反応で突然変異DERA酵素を用いてもよい。
好ましくは本発明の突然変異DERA酵素は、国際公開第03/006656号パンフレットで述べられる反応条件を使用して、上述の反応で用いられる。アルデヒドと、2−置換アルデヒドと、アルデヒドおよび2−置換アルデヒドの間の反応で形成される中間生成物(すなわち4−置換−3−ヒドロキシ−ブチルアルデヒド中間体)との濃度の合計であるカルボニル濃度は、合成プロセス中に好ましくは6モル/L未満の値に保たれる。(非常に)短時間のわずかにより高い濃度がほとんど効果がないことは、当業者には明らかである。より好ましくは、カルボニル濃度は、反応混合物1リットルあたり0.1〜5モルの間、最も好ましくは反応混合物1リットルあたり0.6〜4モルの間で選択される。
反応温度およびpHは重要でなく、双方は基質に応じて選択される。好ましくは反応は液相中で実施される。反応は例えば−5〜+45℃の反応温度、および5.5〜9の間、好ましくは6〜8の間のpHで実施できる。
反応は、例えば、緩衝液または自動滴定を利用して、好ましくはほぼ一定のpHで実施される。緩衝液としては例えば炭酸水素ナトリウムおよび炭酸水素カリウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウム、トリエタノールアミン/HCl、ビス−トリス−プロパン/HClおよびHEPES/KOHが適用できる。好ましくは例えば反応混合物1Lあたり20〜400mモル間の濃度で、炭酸水素カリウムまたは炭酸水素ナトリウム緩衝液が適用できる。
アルデヒド総量と2−置換アルデヒド総量間のモル比は非常に重要ではなく、好ましくは1.5:1〜4:1、特に1.8:1〜2.2:1の間にある。
本発明のプロセスで使用される突然変異DERA酵素量は、原則的に重要ではない。酵素反応のための酵素の最適濃度を判定することは日常的実験法であるので、当業者は使用する突然変異DERA酵素の量を容易に判定できる。
本発明の好ましい実施形態では、R1およびRxのどちらもHを表す。本発明のさらにより好ましい実施形態では、式(1)の化合物は鏡像体富化される。
R1およびRxで表されてもよい保護基としてはアルコール保護基が挙げられ、その例は部分的によく知られている。特定の例としては、テトラヒドロピラニル基が挙げられる。好ましい保護基は例えばトリアリールなどのシリル基、好ましくはトリアルキルシリル基およびヒドロカルビル基である。さらにより好ましい保護基は、ベンジル、メチル、トリメチルシリル、t−ブチルメチルシリル、およびt−ブチルジフェニルシリル基である。
R1およびRxで表されてもよい保護基は、同一または異なってもよい。保護基R1およびRxが異なる場合、有利なことにこれはR1およびRxのみの選択的除去を可能にするかもしれない。好ましくは保護基R1がRxが異なる場合、R1はベンジルまたはシリル基であり、Rxはメチル基である。
国際公開第04/096788号パンフレット、国際公開第05/012246号パンフレットまたは国際公開第04/027075号パンフレットで述べられるプロセス(プロセスと類似の)において、RxがHを表す式(1)の化合物を使用してもよい。したがって本発明はまた、XおよびR1が上で定義したとおりであり、RxがHを表す式(1)の化合物が本発明に従って生成され、引き続いて酸化剤と反応され、式(2)、
(式中、XおよびR1は上で定義されたとおりである)の相応する化合物を形成し、式2の化合物は引き続いてシアン化物イオンと反応され、式(3)、
(式中、R1は上に定義したとおりである)の化合物を形成する、プロセスにも関する。
(式中、XおよびR1は上で定義されたとおりである)の相応する化合物を形成し、式2の化合物は引き続いてシアン化物イオンと反応され、式(3)、
(式中、R1は上に定義したとおりである)の化合物を形成する、プロセスにも関する。
この反応では、このプロセスステップについて国際公開第04/096788号パンフレットの2頁10行から3頁13行で述べられるプロセス条件を利用してもよい。代案としては、国際公開第05/012246号パンフレット(例えば5頁19から26行参照)で述べられる、または国際公開第 04/027075号パンフレットで述べられる(例えば実施例2で述べられる)プロセス条件を使用してもよい。
本発明の異なる実施形態では、例えば国際公開第05/012246号パンフレットで述べられるプロセス条件下で、または国際公開第04/096788号パンフレットまたは国際公開第04/027075号パンフレットのプロセス条件を使用して、式(1)の化合物を最初にシアン化物イオンと反応させて、式(4)、
(式中、R1およびRXはそれぞれ独立してHまたは保護基を表す)の化合物を形成してもよく、その後、Rxが保護基を表す場合は保護基Rx−の除去後、式(4)の化合物を酸化剤と反応させて、R1が上に定義したとおりである相応する式(3)の化合物を形成してもよい。
(式中、R1およびRXはそれぞれ独立してHまたは保護基を表す)の化合物を形成してもよく、その後、Rxが保護基を表す場合は保護基Rx−の除去後、式(4)の化合物を酸化剤と反応させて、R1が上に定義したとおりである相応する式(3)の化合物を形成してもよい。
上のシアノ化反応では、例えばテトラヒドロフラン、CH3CN、アルコール、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、N−メチルピロリドン、トルエン、ジエチルエーテルおよび/またはメチル−t−ブチルエーテルなどのその他の溶剤と組み合わせて、水を溶剤として使用してもよい。好ましくは少なくとも5%w/w、より好ましくは少なくとも10%w/w、さらにより好ましくは少なくとも20%w/w、さらにより好ましくは少なくとも30%w/w、さらにより好ましくは少なくとも40%w/w、さらにより好ましくは少なくとも50%w/w、さらにより好ましくは少なくとも60%w/w、さらにより好ましくは少なくとも70%w/w、さらにより好ましくは少なくとも80%w/wの水、最も好ましくは少なくとも90%w/wの水が、その他の溶剤中で使用される。実用的な理由から、水を唯一の溶剤として使用することが特に好ましい。
国際公開第04/096788号パンフレット(例えば5頁14行〜7頁3行)で述べられるプロセスおよび反応条件を使用して、式(4)の化合物を引き続いて式(5)、
(式中、R2、R3、およびR4はそれぞれ独立して、例えば炭素原子1〜12個、好ましくは炭素原子1〜6個のアルキル、例えば炭素原子1〜12個、好ましくは炭素原子1〜6個のアルケニル、例えば炭素原子3〜7個のシクロアルキル、例えば炭素原子3〜7個のシクロアルケニル、例えば炭素原子6〜10個のアリール、または例えば炭素原子7〜12個のアラルキルを表し、各R2、R3、およびR4は、置換されていてもよく、例えば国際公開第02/06266号パンフレットで述べられる酸触媒の存在下で、適切なアセタール形成剤を利用して、R2およびR3は、それらが結合する炭素原子と共に環を形成してもよい)の化合物に転換してもよい。
(式中、R2、R3、およびR4はそれぞれ独立して、例えば炭素原子1〜12個、好ましくは炭素原子1〜6個のアルキル、例えば炭素原子1〜12個、好ましくは炭素原子1〜6個のアルケニル、例えば炭素原子3〜7個のシクロアルキル、例えば炭素原子3〜7個のシクロアルケニル、例えば炭素原子6〜10個のアリール、または例えば炭素原子7〜12個のアラルキルを表し、各R2、R3、およびR4は、置換されていてもよく、例えば国際公開第02/06266号パンフレットで述べられる酸触媒の存在下で、適切なアセタール形成剤を利用して、R2およびR3は、それらが結合する炭素原子と共に環を形成してもよい)の化合物に転換してもよい。
国際公開第04/096788号パンフレットに従って、R2、R3、およびR4が上で定義されたとおりであってもよい式5の化合物は、引き続いて加水分解されて、相応する式6、
(式中、Yは例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、好ましくはナトリウムなどのアルカリ金属、例えばマグネシウムまたはカルシウム、好ましくはカルシウムなどのアルカリ土類金属、または例えば国際公開第04/096788号パンフレットの7頁4行〜8頁16行で述べられるような、好ましくはテトラアルキルアンモニウム基などの置換されたまたは置換されていないアンモニウム基を表す)の塩を形成する。任意に、例えば国際公開第02/06266号パンフレットで述べられるように、YがHである場合、相応する式(6)の化合物への転換が加水分解に続く。
(式中、Yは例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、好ましくはナトリウムなどのアルカリ金属、例えばマグネシウムまたはカルシウム、好ましくはカルシウムなどのアルカリ土類金属、または例えば国際公開第04/096788号パンフレットの7頁4行〜8頁16行で述べられるような、好ましくはテトラアルキルアンモニウム基などの置換されたまたは置換されていないアンモニウム基を表す)の塩を形成する。任意に、例えば国際公開第02/06266号パンフレットで述べられるように、YがHである場合、相応する式(6)の化合物への転換が加水分解に続く。
国際公開第04/096788号パンフレットに従って、式(6)の塩を相応する式7、
(式中、R2およびR3は上で定義されたとおりであり、R5は(例えば国際公開第02/06266号パンフレットで述べられるように)それ自体に知られている様式で、上でR2およびR3について述べられたの同じ基を表してもよい)のエステルにさらに転換してもよい。
(式中、R2およびR3は上で定義されたとおりであり、R5は(例えば国際公開第02/06266号パンフレットで述べられるように)それ自体に知られている様式で、上でR2およびR3について述べられたの同じ基を表してもよい)のエステルにさらに転換してもよい。
例えばR5は、メチル、エチル、プロピル、イソブチルまたはtertブチル基を表してもよい。本発明に従ったプロセスで調製できる式8のエステルの重要な基は、tertブチルエステルである(R5がtertブチルを表す)。
本発明の特別な態様では、国際公開第03/106447号パンフレットおよび国際公開第04/096788号パンフレットの9頁2行〜10頁2行で述べられるプロセスに従って、式(6)の塩を例えばトルエンなどの不活性溶剤中で酸塩化物形成剤と接触させることで相応する酸塩化物を形成し、形成された酸塩化物をN−メチルモルホリン(NMM)の存在下で式R5OH(式中、R5は上に定義したとおりである)のアルコールに接触させることで、式(6)の塩が相応する式(7)のエステルに転換される。
本発明のプロセスを使用して調製された化合物は、医薬品の活性成分の調製において、例えばHMG−CoA還元酵素阻害物質の調製において、より具体的には、例えばロバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、シムバスタチン、プラバスタチン、およびフルバスタチンなどのスタチン、特にM.ワタナベ(Watanabe)ら著、「将来の薬剤(Drugs of the future)」(1999年)、24(5)、Bioorg & Med.Chem.(1997年)、5(2)、437〜444頁で述べられるZD−4522の調製において特に有用である。したがって本発明は、スタチン合成のために使用できる化合物、特に式(1)の化合物の調製のための新しい経済的に魅力的な経路を提供する。このような調製の特に興味深い例は、A.クリーマン(Kleemann)、J.エンゲル(Engel)著「医薬物質、合成、特許、応用(pharmaceutical substances,synthesis,patents,applications)」第4版、2001年、Georg Thieme Verlag、146〜150頁で述べられるようなアトロバスタチンカルシウムの調製である。
したがって本発明はまた、本発明のプロセスおよびそれ自体に知られているさらなるプロセス段階を使用して、本発明に従ったプロセスで得られた化合物が、スタチン、好ましくはアトルバスタチン、または例えばそのカルシウム塩などのその塩にさらに転換するプロセスにも関する。このようなプロセスは、当該技術分野でよく知られている。
ここで決して限定されることなく、次の実験的結果によって本発明について述べる。
実験
一般的部分
改善された抵抗性または生産性があるDERA突然変異体を同定する方法。
改善された抵抗性または生産性があるDERA突然変異体を同定する2つの方法を使用できる。一方法はクロロアセトアルデヒドに対するDERA突然変異体の抵抗性を調べ、もう一つは基質としてクロロアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドを使用した、6−クロロ−2,4,6−トリデオキシ−D−エリスロヘキサピラノシド(CTeHP)生成におけるDERA突然変異体の生産性を評価する。第1の方法は、天然DERA基質2−デオキシ−D−リボース5−ホスフェートを基質として使用して、標準DERA天然基質活性アッセイのマイクロタイターベースの形態を使用して、クロロアセトアルデヒドに対するDERA突然変異体の抵抗性を調べる。第2の方法は、質量分光分析(GC/MS)法に連結した高速大量処理ガスクロマトグラフィーを使用して、アセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒド各1個の分子のDERA触媒アルドール反応の生成物であり、したがってCTeHPへの反応の中間体である、4−クロロ−3−(S)−ヒドロキシ−ブチルアルデヒド(CHBA)の生成において、基質としてのアセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドに対するDERA突然変異体の生産性を分析する。
一般的部分
改善された抵抗性または生産性があるDERA突然変異体を同定する方法。
改善された抵抗性または生産性があるDERA突然変異体を同定する2つの方法を使用できる。一方法はクロロアセトアルデヒドに対するDERA突然変異体の抵抗性を調べ、もう一つは基質としてクロロアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドを使用した、6−クロロ−2,4,6−トリデオキシ−D−エリスロヘキサピラノシド(CTeHP)生成におけるDERA突然変異体の生産性を評価する。第1の方法は、天然DERA基質2−デオキシ−D−リボース5−ホスフェートを基質として使用して、標準DERA天然基質活性アッセイのマイクロタイターベースの形態を使用して、クロロアセトアルデヒドに対するDERA突然変異体の抵抗性を調べる。第2の方法は、質量分光分析(GC/MS)法に連結した高速大量処理ガスクロマトグラフィーを使用して、アセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒド各1個の分子のDERA触媒アルドール反応の生成物であり、したがってCTeHPへの反応の中間体である、4−クロロ−3−(S)−ヒドロキシ−ブチルアルデヒド(CHBA)の生成において、基質としてのアセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドに対するDERA突然変異体の生産性を分析する。
溶液中のタンパク質濃度判定
無細胞抽出物(cfe)などの溶液中のタンパク質濃度は、ブラッドフォード(Bradford)著、Anal.Biochem.72:248〜254頁(1976年)で述べられるように、変性タンパク質−染料結合法を使用して判定された。適切な希釈液中の各50μlのサンプルを950μlの試薬(46mlのエタノールおよび100mlの85%オルト−リン酸に溶解し、milli−Q水で1,000mlにした100mgのブリリアントブルーG250)と共に、室温で少なくとも5分間インキュベートした。波長595nmにおける各サンプルの吸収をパーキン・エルマー・ラムダ(Perkin Elmer Lambda)20 UV/VIS分光計内で測定した。既知濃度のウシ血清アルブミン(BSA、0.025mg/ml〜0.25mg/mlの範囲)を含有する溶液で判定された検量線を使用して、サンプル中のタンパク質濃度を計算した。
無細胞抽出物(cfe)などの溶液中のタンパク質濃度は、ブラッドフォード(Bradford)著、Anal.Biochem.72:248〜254頁(1976年)で述べられるように、変性タンパク質−染料結合法を使用して判定された。適切な希釈液中の各50μlのサンプルを950μlの試薬(46mlのエタノールおよび100mlの85%オルト−リン酸に溶解し、milli−Q水で1,000mlにした100mgのブリリアントブルーG250)と共に、室温で少なくとも5分間インキュベートした。波長595nmにおける各サンプルの吸収をパーキン・エルマー・ラムダ(Perkin Elmer Lambda)20 UV/VIS分光計内で測定した。既知濃度のウシ血清アルブミン(BSA、0.025mg/ml〜0.25mg/mlの範囲)を含有する溶液で判定された検量線を使用して、サンプル中のタンパク質濃度を計算した。
DERA生産性係数試験
クロロアセトアルデヒドに対する改善された抵抗性、または増大するCHBA形成を示す、双方の方法から選択されたクローンは、DERA生産性係数試験を使用して、CTeHPの形成におけるそれらの生産性に関して特徴付けられる。この特性決定では、1.0と1.4mgの間のcfeを含有する容積のcfeを総容積0.2ml中の0.1M NaHCO3緩衝液(最終pH=7.2)中の0.04mmolのクロロアセトアルデヒドおよび0.093mmolのアセトアルデヒドと共に、撹拌しながらインキュベートする。16時間後、9容積のアセトンまたはアセトニトリルの添加によって反応を停止させ、16,000×gで10分遠心分離する。それらのCTeHPおよびCHBA含量のためのFID検出器を使用して、バリアン(Varian)からのクロモパック(Chrompack)CP−SIL8CBカラム上でのガスクロマトグラフィーによって上清を分析する。野生型または変異DERAを含有する1mgの無細胞抽出物タンパク質によって、室温(25℃)でpH7.2において16時間内に、基質濃度0.2Mクロロアセトアルデヒドおよび0.4Mアセトアルデヒドで形成されたmmolでのCTeHP量が、「DERA生産性係数」と定義される。
クロロアセトアルデヒドに対する改善された抵抗性、または増大するCHBA形成を示す、双方の方法から選択されたクローンは、DERA生産性係数試験を使用して、CTeHPの形成におけるそれらの生産性に関して特徴付けられる。この特性決定では、1.0と1.4mgの間のcfeを含有する容積のcfeを総容積0.2ml中の0.1M NaHCO3緩衝液(最終pH=7.2)中の0.04mmolのクロロアセトアルデヒドおよび0.093mmolのアセトアルデヒドと共に、撹拌しながらインキュベートする。16時間後、9容積のアセトンまたはアセトニトリルの添加によって反応を停止させ、16,000×gで10分遠心分離する。それらのCTeHPおよびCHBA含量のためのFID検出器を使用して、バリアン(Varian)からのクロモパック(Chrompack)CP−SIL8CBカラム上でのガスクロマトグラフィーによって上清を分析する。野生型または変異DERAを含有する1mgの無細胞抽出物タンパク質によって、室温(25℃)でpH7.2において16時間内に、基質濃度0.2Mクロロアセトアルデヒドおよび0.4Mアセトアルデヒドで形成されたmmolでのCTeHP量が、「DERA生産性係数」と定義される。
DERA天然基質活性アッセイ
DERA活性の推定のために、DERA天然基質反応中の初期活性である、2−デオキシ−D−リボース5−ホスフェートのアセトアルデヒドおよびD−グリセルアルデヒド3−ホスフェートへのアルドール開裂を室温(RT)で判定できる。10μlの無細胞抽出物を140μlの50mMトリエタノールアミン緩衝液(pH7.5)中に移す。50μlの補助酵素および基質混合溶液(0.8mM NADH、2mM 2−デオキシ−D−リボース5−ホスフェート、ロシュ・ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)からのトリオースホスフェートイソメラーゼ(30U/ml)、およびロシュ・ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)からのグリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ(10U/ml)を添加して活性アッセイを開始する。30秒後に50μlの停止液(6M塩酸グアニジン塩、100mMリン酸水素ナトリウム、10mMトリスHCl pH7.5)を添加して反応を停止する。存在する初期DERA活性は、340nmの波長でサンプルのUV−吸光度を測定して判定される。1個のNADH分子の消費は、1個の2−デオキシ−D−リボース5−ホスフェート分子の開裂に相当する。実施例1−クロロアセトアルデヒドに対する改善された抵抗性があるDERA突然変異体
DERA活性の推定のために、DERA天然基質反応中の初期活性である、2−デオキシ−D−リボース5−ホスフェートのアセトアルデヒドおよびD−グリセルアルデヒド3−ホスフェートへのアルドール開裂を室温(RT)で判定できる。10μlの無細胞抽出物を140μlの50mMトリエタノールアミン緩衝液(pH7.5)中に移す。50μlの補助酵素および基質混合溶液(0.8mM NADH、2mM 2−デオキシ−D−リボース5−ホスフェート、ロシュ・ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)からのトリオースホスフェートイソメラーゼ(30U/ml)、およびロシュ・ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)からのグリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ(10U/ml)を添加して活性アッセイを開始する。30秒後に50μlの停止液(6M塩酸グアニジン塩、100mMリン酸水素ナトリウム、10mMトリスHCl pH7.5)を添加して反応を停止する。存在する初期DERA活性は、340nmの波長でサンプルのUV−吸光度を測定して判定される。1個のNADH分子の消費は、1個の2−デオキシ−D−リボース5−ホスフェート分子の開裂に相当する。実施例1−クロロアセトアルデヒドに対する改善された抵抗性があるDERA突然変異体
ランダム変異誘発による大腸菌(E.coli)変異型deoCライブラリーの構築
大腸菌(E.coli)K12 DERA酵素[配列番号1]をコードする大腸菌(E.coli)K12 deoC遺伝子[配列番号6]のランダム変異誘発ライブラリーの構築のために、クローンテック(Clonetech)多様化PCRランダム変異誘発キットを使用した。供給業者のマニュアルに従って、様々なMnSO4濃度で(それによって濃度が高いほどより多くの突然変異が導入される)いくつかの反応を実施し、大腸菌(Escherichia coli)K12 deoC遺伝子中の1〜3個の点突然変異を得て、DERA酵素アミノ酸配列中の1〜2個のアミノ酸交換を得た。大腸菌(E.coli)2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ[配列番号1]をコードする大腸菌(E.coli)deoC遺伝子[配列番号6]の増幅のために、プライマーDAI 13600およびDAI 13465(それぞれ[配列番号4]および[配列番号5]に相応する)をそれぞれ順方向および逆方向プライマーとして使用した。双方のプライマーは、インビトロジェン(Invitrogen)からのゲートウェイ(Gateway)技術を使用した部位特異的遺伝子組み換えによって、得られたPCR増幅deoC遺伝子断片をクローニングするのに適合性の部位を含有した。
大腸菌(E.coli)K12 DERA酵素[配列番号1]をコードする大腸菌(E.coli)K12 deoC遺伝子[配列番号6]のランダム変異誘発ライブラリーの構築のために、クローンテック(Clonetech)多様化PCRランダム変異誘発キットを使用した。供給業者のマニュアルに従って、様々なMnSO4濃度で(それによって濃度が高いほどより多くの突然変異が導入される)いくつかの反応を実施し、大腸菌(Escherichia coli)K12 deoC遺伝子中の1〜3個の点突然変異を得て、DERA酵素アミノ酸配列中の1〜2個のアミノ酸交換を得た。大腸菌(E.coli)2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ[配列番号1]をコードする大腸菌(E.coli)deoC遺伝子[配列番号6]の増幅のために、プライマーDAI 13600およびDAI 13465(それぞれ[配列番号4]および[配列番号5]に相応する)をそれぞれ順方向および逆方向プライマーとして使用した。双方のプライマーは、インビトロジェン(Invitrogen)からのゲートウェイ(Gateway)技術を使用した部位特異的遺伝子組み換えによって、得られたPCR増幅deoC遺伝子断片をクローニングするのに適合性の部位を含有した。
順方向プライマー(DAI13600)の配列:
5’ GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT CGA AGG AGA TAG AAC CAT GAC TGA TCT GAA AGC AAG CAG CC 3’ [配列番号4]
逆方向プライマー(DAI 13465)の配列:
5’ GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TTA GTA GCT GCT GGC GCT C 3’ [配列番号5]
5’ GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT CGA AGG AGA TAG AAC CAT GAC TGA TCT GAA AGC AAG CAG CC 3’ [配列番号4]
逆方向プライマー(DAI 13465)の配列:
5’ GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TTA GTA GCT GCT GGC GCT C 3’ [配列番号5]
エラープローンPCR増幅は、次の温度プログラムを使用した。94℃で2分間、94℃で30秒間および68℃で1分間を25サイクル、続いて68℃で10分間。エラープローンPCR断片を最初にインビトロジェン(Invitrogen)からのpDONRベクター中にクローンし、20,000個を超えるコロニーから開始して、大規模pENTRクローンプラスミド調製品を作成した。次にインビトロジェン(Invitrogen)からのpDEST14ベクターを使用して、これらのpENTR調製品を発現コンストラクト構築のために使用した。次にDERA酵素突然変異体をコードする突然変異大腸菌(E.coli)K12 deoC遺伝子の発現のために、化学的にコンピテントな大腸菌(E.coli)BL21 Star(DE3)に、発現コンストラクトを形質転換する。
ディープウェルマイクロタイタープレート内の突然変異deoC遺伝子の発現
ジェネティクス(Genetix)Q−ピックを使用して、コロニーをQ−トレーから拾い、マイクロタイタープレート(MTP)内の200μlの2*TY培地(100μg/mlのアンピシリンを含有する)培養物に接種して、次に、これらの前培養を旋回振盪機上で、25℃で2日間、または37℃で一晩のいずれかで生育させた。前培養から100μlを使用して、ディープウェルプレート内の500μlの発現培養(2*TY、100μg/ml アンピシリン、1mM IPTG)に接種した。次にこれらの発現培養を旋回振盪機上で37℃で24時間生育させた。
ジェネティクス(Genetix)Q−ピックを使用して、コロニーをQ−トレーから拾い、マイクロタイタープレート(MTP)内の200μlの2*TY培地(100μg/mlのアンピシリンを含有する)培養物に接種して、次に、これらの前培養を旋回振盪機上で、25℃で2日間、または37℃で一晩のいずれかで生育させた。前培養から100μlを使用して、ディープウェルプレート内の500μlの発現培養(2*TY、100μg/ml アンピシリン、1mM IPTG)に接種した。次にこれらの発現培養を旋回振盪機上で37℃で24時間生育させた。
マイクロタイタープレートDERA安定性アッセイ
クロロアセトアルデヒドに対する突然変異DERA酵素の抵抗性の検査のために、DERA天然基質反応に基づくアッセイを用いることができる。ディープウェル発現培養を4,000回転/分(rpm)で15分間遠心分離し、得られた大腸菌(E.coli)細胞ペレットを400μlのB−PER溶解緩衝液(ピアス(Pierce)からの25%v/v B−PERII、75%(v/v)50mMトリエタノールアミン緩衝液、pH7.5、100mg/lのRNA分解酵素A)中で溶解する。120mMクロロアセトアルデヒドを超えるクロロアセトアルデヒド濃度では、200mMトリエタノールアミンを使用する。遠心分離(4,000rpm、4℃で15分間)によって細胞残骸を除去し、各ウェルからの210μlの無細胞抽出物を新しいマイクロタイタープレートに移す。DERA活性の推定のためには、上述のようにDERA天然基質活性アッセイを使用して、DERA天然基質反応中の初期活性を判定する。残る200μlの容積の無細胞抽出物を取って、50μlのクロロアセトアルデヒド溶液を添加し、DERA突然変異体のクロロアセトアルデヒドに対する抵抗性を調べる。
クロロアセトアルデヒドに対する突然変異DERA酵素の抵抗性の検査のために、DERA天然基質反応に基づくアッセイを用いることができる。ディープウェル発現培養を4,000回転/分(rpm)で15分間遠心分離し、得られた大腸菌(E.coli)細胞ペレットを400μlのB−PER溶解緩衝液(ピアス(Pierce)からの25%v/v B−PERII、75%(v/v)50mMトリエタノールアミン緩衝液、pH7.5、100mg/lのRNA分解酵素A)中で溶解する。120mMクロロアセトアルデヒドを超えるクロロアセトアルデヒド濃度では、200mMトリエタノールアミンを使用する。遠心分離(4,000rpm、4℃で15分間)によって細胞残骸を除去し、各ウェルからの210μlの無細胞抽出物を新しいマイクロタイタープレートに移す。DERA活性の推定のためには、上述のようにDERA天然基質活性アッセイを使用して、DERA天然基質反応中の初期活性を判定する。残る200μlの容積の無細胞抽出物を取って、50μlのクロロアセトアルデヒド溶液を添加し、DERA突然変異体のクロロアセトアルデヒドに対する抵抗性を調べる。
スクリーニングの第1ラウンドでは、600mMクロロアセトアルデヒド原液、第1の遺伝子組み換え突然変異体ライブラリーのスクリーニングのためには1.0M原液、そして第2の遺伝子組み換え突然変異体ライブラリーのためには1.5M原液を使用して、それぞれ120、200、および300mMクロロアセトアルデヒドの最終濃度をもたらした。全ての場合で、曝露時間は2分間であった。その後、50μlのサンプル(エラープローンPCRライブラリー)、30μlのサンプル(第1の遺伝子組み換え突然変異体ライブラリー)または25μlのサンプル(第2の遺伝子組み換え突然変異体ライブラリー)をそれぞれ採取して、50mMトリエタノールアミン緩衝液(pH7.5、最終容積200μl)を含有するマイクロタイタープレートに移した。初期DERA活性と同様に、50μlの補助−酵素/基質混合物を添加してDERA天然基質反応に対する残るDERA活性を判定した。50μlの停止溶液を添加する前に、DERA天然反応アッセイを30秒間進行させた。消費NADH量を判定するために、サンプルのUV−吸光度を340nmで測定した。
平滑末端制限酵素(BERE)遺伝子組み換えを使用した(国際公開第03/010311号パンフレットに従った)好ましい突然変異の遺伝子組み換え
それらの突然変異の遺伝子組み換えによるDERAのさらなる改善の基礎として、エラープローンPCRライブラリーから選択された突然変異体クローンを使用した。保存培養から、選択された突然変異体クローンのプラスミドDNAを単離してテンプレートとして使用し、突然変異遺伝子を増幅した。得られた突然変異体遺伝子PCR断片を平滑末端切断制限エンドヌクレアーゼで消化して、アンプリガーゼ(Ampligase)およびハーキュリーズ(Hercules)からのDNAポリメラーゼを使用して、得られた遺伝子断片を全長遺伝子に再構築した。遺伝子組み換えのためには、制限エンドヌクレアーゼHaelll、HinCII、およびFspl(プールA)およびCacl8またはBstUl(プールB)を使用して、2個の遺伝子断片プールを作成した。各プールからの0.5μgの遺伝子断片DNAとのアンプリガーゼ(Ampligase)反応(50μl総容積)では、次の温度プログラムを使用した:94℃で2分間、94℃で30秒および60℃で1分間を30サイクル、および最終60℃サイクルを10分間。20μlのアンプリガーゼ(Ampligase)反応をエタノール沈殿させてDNAペレット(約0.4μgのDNA)を40μl滅菌水に溶解し、遺伝子組み換え突然変異体遺伝子のPCR増幅のためのテンプレートとして使用した。ハーキュリーズ(Hercules)からのDNAポリメラーゼ(5U)を使用したPCR反応(50μl容積)では、プライマーDAI13600([配列番号4])およびDAI13465([配列番号5])をそれぞれ順方向および逆方向プライマーとして使用した。次のPCRプログラムを使用した:72℃で5分間、94℃で30秒間と50℃で30秒間と72℃で45秒間とを15サイクル、最終72℃サイクルを10分間。キアジェン(Qiagen)PCR精製キットを使用して得られた全長突然変異体遺伝子断片を精製し、上述のように部位特異的遺伝子組み換えを使用してpDEST14ベクター中にクローンした。
それらの突然変異の遺伝子組み換えによるDERAのさらなる改善の基礎として、エラープローンPCRライブラリーから選択された突然変異体クローンを使用した。保存培養から、選択された突然変異体クローンのプラスミドDNAを単離してテンプレートとして使用し、突然変異遺伝子を増幅した。得られた突然変異体遺伝子PCR断片を平滑末端切断制限エンドヌクレアーゼで消化して、アンプリガーゼ(Ampligase)およびハーキュリーズ(Hercules)からのDNAポリメラーゼを使用して、得られた遺伝子断片を全長遺伝子に再構築した。遺伝子組み換えのためには、制限エンドヌクレアーゼHaelll、HinCII、およびFspl(プールA)およびCacl8またはBstUl(プールB)を使用して、2個の遺伝子断片プールを作成した。各プールからの0.5μgの遺伝子断片DNAとのアンプリガーゼ(Ampligase)反応(50μl総容積)では、次の温度プログラムを使用した:94℃で2分間、94℃で30秒および60℃で1分間を30サイクル、および最終60℃サイクルを10分間。20μlのアンプリガーゼ(Ampligase)反応をエタノール沈殿させてDNAペレット(約0.4μgのDNA)を40μl滅菌水に溶解し、遺伝子組み換え突然変異体遺伝子のPCR増幅のためのテンプレートとして使用した。ハーキュリーズ(Hercules)からのDNAポリメラーゼ(5U)を使用したPCR反応(50μl容積)では、プライマーDAI13600([配列番号4])およびDAI13465([配列番号5])をそれぞれ順方向および逆方向プライマーとして使用した。次のPCRプログラムを使用した:72℃で5分間、94℃で30秒間と50℃で30秒間と72℃で45秒間とを15サイクル、最終72℃サイクルを10分間。キアジェン(Qiagen)PCR精製キットを使用して得られた全長突然変異体遺伝子断片を精製し、上述のように部位特異的遺伝子組み換えを使用してpDEST14ベクター中にクローンした。
改善されたクロロアセトアルデヒド抵抗性があるDERA突然変異体の再検査
DERA酵素突然変異体前培養を冷凍グリセロールマスタープレートから接種し、25℃において180rpmで振盪しながら一晩インキュベートした。前培養アリコートを使用して、25mlの発現培養(2*TY培地、100μg/mlアンピシリン、1mM IPTG)を接種し、25℃で36時間(180rpmで振盪しながら)インキュベートした。遠心分離(5,000rpm、15分)によって細胞を収集し、2.5mlのB−PER IIを使用して細胞ペレットを溶解した。最初に5,000rpmで15分間、次にエッペンドルフ(Eppendorf)卓上遠心分離器を14,000rpm(4℃)で15分間使用して、細胞の残骸を遠心分離によって除去した。得られた無細胞抽出物を使用して、経時変化実験において濃度範囲にわたり、クロロアセトアルデヒドに対する発現したDERA突然変異酵素の抵抗性を検査した。
DERA酵素突然変異体前培養を冷凍グリセロールマスタープレートから接種し、25℃において180rpmで振盪しながら一晩インキュベートした。前培養アリコートを使用して、25mlの発現培養(2*TY培地、100μg/mlアンピシリン、1mM IPTG)を接種し、25℃で36時間(180rpmで振盪しながら)インキュベートした。遠心分離(5,000rpm、15分)によって細胞を収集し、2.5mlのB−PER IIを使用して細胞ペレットを溶解した。最初に5,000rpmで15分間、次にエッペンドルフ(Eppendorf)卓上遠心分離器を14,000rpm(4℃)で15分間使用して、細胞の残骸を遠心分離によって除去した。得られた無細胞抽出物を使用して、経時変化実験において濃度範囲にわたり、クロロアセトアルデヒドに対する発現したDERA突然変異酵素の抵抗性を検査した。
経時変化実験では、サンプル中に存在する初期DERA天然基質反応活性を四連で判定した。適量のDERA活性がある規定容積の抽出物を200mMクロロアセトアルデヒドに曝露し、クロロアセトアルデヒド添加後t=1、t=5、t=10、t=15、およびt=20分の時点でアリコートを採取して、DERA天然基質活性アッセイを使用して四連でDERA活性の残量を測定した。判定された初期DERA天然基質活性を100%に設定し、示した時点で判定された活性を前記初期開始DERA天然基質活性に対する百分率で表した。
クロロアセトアルデヒド抵抗法の結果
上述の抵抗法を使用して、約10,000個のクローンを調べた。初期安定性キャンペーンでは、エラープローンPCR由来突然変異DERA酵素を150mMクロロアセトアルデヒドに2分間曝露した。遺伝子組み換え変異体のスクリーニングのために、クロロアセトアルデヒド濃度を第1の遺伝子組み換えでは200mM、第2の遺伝子組み換えラウンドでは300mMにそれぞれ増大させた。選択された突然変異体クローンを同一設定を使用して三連で再調査した。初期結果と同様似に機能するクローンを選択し単離した。
上述の抵抗法を使用して、約10,000個のクローンを調べた。初期安定性キャンペーンでは、エラープローンPCR由来突然変異DERA酵素を150mMクロロアセトアルデヒドに2分間曝露した。遺伝子組み換え変異体のスクリーニングのために、クロロアセトアルデヒド濃度を第1の遺伝子組み換えでは200mM、第2の遺伝子組み換えラウンドでは300mMにそれぞれ増大させた。選択された突然変異体クローンを同一設定を使用して三連で再調査した。初期結果と同様似に機能するクローンを選択し単離した。
BERE−方法を(上述のように)使用して、これらの選択クローンのプールされた突然変異deoC遺伝子を無作為に遺伝子組み換えした。第1の遺伝子組み換えラウンドでは1,000個のクローンを200mMクロロアセトアルデヒドで調査した。クロロアセトアルデヒドに対する少なくとも50%の抵抗性増大を示す22個のクローンを単離した。これらの突然変異体クローンをマスタープレートから再度単離し、発現ベクターを精製して、PCRによって変異遺伝子を増幅しプールした。第2の遺伝子組み換えラウンドでは、300mMクロロアセトアルデヒドで2分間のインキュベーション時間後に、大腸菌(E.coli)K12野生型DERAと比べて少なくとも2倍の抵抗性増大を示す、41個のDERA酵素突然変異体を同定した。
DERA天然基質反応活性アッセイを適用して、大腸菌(E.coli)K12野生型DERAに並行して、第2ラウンドの10個の最良の突然変異体を200mMクロロアセトアルデヒドに対するそれらの抵抗性について25mlの発現培養から再試験した。結果は3個の独立した実験の平均であり、DERA酵素突然変異体の名称およびアミノ酸交換を含む表4中で、0mMクロロアセトアルデヒドにおける各値と比べた%残留DERA活性として示される。
実施例2−改善されたCHBA生産性があるDERA突然変異酵素
それぞれ1分子のアセトアルデヒドとクロロアセトアルデヒドのアルドール化によって形成される、4−クロロ−3−(S)−ヒドロキシ−ブチルアルデヒド(CHBA)の生産性増大があるDERA突然変異体のスクリーニングのために、約3,000個の突然変異体クローンのライブラリーを構築した。エラープローンPCR断片をpENTRベクターの単離なしにpDEST14ベクター中に直接クローンして、発現ライブラリーの遺伝的多様性を最大化したこと以外は、実施例1で述べられるようにしてエラープローンPCR、ゲートウェイ(Gateway)クローニング、およびDERA突然変異体発現を実施した。
それぞれ1分子のアセトアルデヒドとクロロアセトアルデヒドのアルドール化によって形成される、4−クロロ−3−(S)−ヒドロキシ−ブチルアルデヒド(CHBA)の生産性増大があるDERA突然変異体のスクリーニングのために、約3,000個の突然変異体クローンのライブラリーを構築した。エラープローンPCR断片をpENTRベクターの単離なしにpDEST14ベクター中に直接クローンして、発現ライブラリーの遺伝的多様性を最大化したこと以外は、実施例1で述べられるようにしてエラープローンPCR、ゲートウェイ(Gateway)クローニング、およびDERA突然変異体発現を実施した。
GC/MSを用いた生産性方法によるサンプル調製
200mMクロロアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドを基質として使用して、CHBA生成物形成を調べるGC/MSベースの生産性方法のために、クロロアセトアルデヒド抵抗性スクリーニングと同様に、600μlの発現培養から無細胞抽出物を調製できる。旋回振盪機上のディープウェルプレート中で24時間インキュベートされた発現培養を遠心分離する(4000rpmで15分間)。得られた細胞ペレットを350μlの50%(v/v)B−PERII、50%(v/v)250mMNaCO3、pH7.5に溶解する。上述のようにして、細胞の残骸を遠心分離によって除去する。突然変異大腸菌(E.coli)K12 DERA酵素を含有する100μlのcfeを100μlのアセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒド双方の400mM溶液と混合する。室温で1時間のインキュベーション後、生成物定量のための内部標準(IS)の役目をする0.05%(w/w)シクロヘキシルベンゼンを含有する900μlのアセトニトリルに、100μlの各反応物を添加する。タンパク質沈殿物を遠心分離によって除去し、500μlの各サンプルを新しいディープウェルマイクロタイタープレートに移す。
200mMクロロアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドを基質として使用して、CHBA生成物形成を調べるGC/MSベースの生産性方法のために、クロロアセトアルデヒド抵抗性スクリーニングと同様に、600μlの発現培養から無細胞抽出物を調製できる。旋回振盪機上のディープウェルプレート中で24時間インキュベートされた発現培養を遠心分離する(4000rpmで15分間)。得られた細胞ペレットを350μlの50%(v/v)B−PERII、50%(v/v)250mMNaCO3、pH7.5に溶解する。上述のようにして、細胞の残骸を遠心分離によって除去する。突然変異大腸菌(E.coli)K12 DERA酵素を含有する100μlのcfeを100μlのアセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒド双方の400mM溶液と混合する。室温で1時間のインキュベーション後、生成物定量のための内部標準(IS)の役目をする0.05%(w/w)シクロヘキシルベンゼンを含有する900μlのアセトニトリルに、100μlの各反応物を添加する。タンパク質沈殿物を遠心分離によって除去し、500μlの各サンプルを新しいディープウェルマイクロタイタープレートに移す。
ハイスループットGC/MSによる4−クロロ−3−ヒドロキシ−ブチルアルデヒドの分析
アジレント(Agilent)からのHP5973質量検出器に連結したヒューレット・パッカード(Hewlett Packard)6890型ガス・クロマトグラフ上で、サンプルをそれらのCHBA含量について分析した。自動化された注入器を通じて、マイクロタイタープレートから直接、バリアン(Varian)からのクロムパック(Chrompack)CP−SIL13CBカラム上にサンプルを注入した。キャリアガスとして1.1ml/分の一定流量のヘリウムと共に、100℃から250℃への温度プログラムを2分以内で実施した。単一イオンモニタリング(SIM)によって、内部標準(M=45、t=0〜2.80分)およびCHBA(M=160、t=2.80分から方法終了まで)の特徴的なイオンが検出された。1個のサンプルの総サイクル時間(注入から注入まで)は5分未満であった。
アジレント(Agilent)からのHP5973質量検出器に連結したヒューレット・パッカード(Hewlett Packard)6890型ガス・クロマトグラフ上で、サンプルをそれらのCHBA含量について分析した。自動化された注入器を通じて、マイクロタイタープレートから直接、バリアン(Varian)からのクロムパック(Chrompack)CP−SIL13CBカラム上にサンプルを注入した。キャリアガスとして1.1ml/分の一定流量のヘリウムと共に、100℃から250℃への温度プログラムを2分以内で実施した。単一イオンモニタリング(SIM)によって、内部標準(M=45、t=0〜2.80分)およびCHBA(M=160、t=2.80分から方法終了まで)の特徴的なイオンが検出された。1個のサンプルの総サイクル時間(注入から注入まで)は5分未満であった。
生産性方法は、大腸菌(E.coli)K12野生型DERAと比べて少なくとも3倍のCHBA濃度増大がある、大腸菌(E.coli)K12 DERAの7個の酵素突然変異体をもたらした。上述のようにDERA生産性係数試験を使用して、それらを大腸菌(E.coli)K12野生型DERAと比較して、それらのDERA生産性係数(16時間内にcfe中のタンパク質1mgあたり生成されたCTeHPのmmol)を判定し、選択された突然変異体クローンを再試験した。
2.5mlルリア・ベルターニ(Luria Bertani)培地(LB)前培養(100μg/mlカルベニシリンを含有する)に全ての再形質転換突然変異体クローンの単一コロニーを接種して、28℃で180rpmで振盪しながら一晩インキュベートした。これらの前培養から100μg/mlカルベニシリンを含有する50mlのLB発現培養を0.05のOD620nmの細胞密度に接種して、旋回振盪機(180rpm)上において28℃で培養した。3時間のインキュベーション後に、1mMイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)の添加によって突然変異DERAの発現を誘発し、21時間後、遠心分離(5,000×gで5分間)によって光学濃度約0.4の細胞を収集し、1mlの50mMトリエタノールアミン緩衝液(pH7.2)に再懸濁した。細胞懸濁液の5分間の超音波処理(10秒間のパルス続いて10秒間の中断)および4℃において16,000×gでの1時間遠心分離によって無細胞抽出物(cfe)を得た。後でDERA生産性係数試験において使用するまで、cfeを4℃で保存した。生産性方法によって見いだされたDERA酵素突然変異体の名称およびアミノ酸交換を表5に列挙する。
実施例3−DERA突然変異体9−11HによるCTeHP合成のスケールアップ
実施例2で述べられるようにして、それぞれプラスミドpDEST14−Ecol−deoCおよびpDEST14_9−11H(F200I突然変異体)と共に、インビトロジェン(Invitrogen)からの化学的にコンピテントな大腸菌(E.coli)BL21 Star(DE3)を新たに形質転換した。2つの50ml LB前培養(100μg/mlのカルベニシリンを含有する)に各形質転換寒天プレートから単一コロニーを接種して、28℃において旋回振盪機(180rpm)上で一晩インキュベートした。
実施例2で述べられるようにして、それぞれプラスミドpDEST14−Ecol−deoCおよびpDEST14_9−11H(F200I突然変異体)と共に、インビトロジェン(Invitrogen)からの化学的にコンピテントな大腸菌(E.coli)BL21 Star(DE3)を新たに形質転換した。2つの50ml LB前培養(100μg/mlのカルベニシリンを含有する)に各形質転換寒天プレートから単一コロニーを接種して、28℃において旋回振盪機(180rpm)上で一晩インキュベートした。
翌日、それぞれ100μg/mlのカルベニシリンを添加した1IのLB培地を含有する滅菌エルレンマイアーフラスコに、50ml前培養を開始細胞密度OD620=0.05に接種して、振盪(180rpm)しながら28℃でインキュベートした。細胞密度OD620≒0.6で1mM IPTGの添加によって、大腸菌(E.coli)K12の野生型DERAの発現、およびアミノ酸交換F200Iを含有するそれに由来する突然変異DERA9−11Hが誘導された。総培養時間21時間まで、同一条件下で培養をさらにインキュベートした。この時点で、遠心分離(5000×gで5分間)によって双方の培養を収集し、25mlの50mMトリエタノールアミン緩衝液(pH7.2)に細胞ペレットを再懸濁した。細胞懸濁液の2回5分間(10秒間パルス、続いて10秒間休止、大型プローブ)の超音波処理および4℃において39,000×gで1時間の遠心分離によって無細胞抽出物を得た。後程使用するまでcfeを4℃に保った。上述のように、しかし5mM 2−デオキシ−D−リボース5−ホスフェートを用いてDERA天然基質活性アッセイによって判定された双方のcfeの比活性は、同一範囲内であった。
スケールアップした反応のために、0.1M NaHCO3緩衝液(pH7.2)を含有する50mlの総容積中で、10mmolクロロアセトアルデヒドおよび23mmolアセトアルデヒドをそれぞれ1.5kUの野生型および突然変異DERA F200Iと共に、室温で撹拌しながらインキュベートした。反応を5時間かけて行い、100μlのサンプルを反応経路の異なる時点で採取した。これらの5時間経過後、900μlのアセトニトリルの添加、および10分間の16,000×gの遠心分離によってサンプル中の酵素反応を停止した。それらのCTeHPおよびCHBA含量のためにFID検出器を使用して、バリアン(Varian)からのクロムパック(Chrompack)CP−SIL8CBカラム上でガスクロマトグラフィーによって上清を分析した。これらのサンプル中で判定された各濃度を表6に示す。
大腸菌(E.coli)K12 DERA突然変異体F200Iは、クロロアセトアルデヒド1mmolあたり150Uを用いると、2および4時間後に、それぞれ存在するクロロアセトアルデヒドからCTeHPへの81および86%の転換を示す。Uとは1単位の酵素を意味し、それはDERA天然基質活性アッセイ条件下で、1分以内に1μmolの2−デオキシ−D−リボース5−ホスフェートを転換するのに必要な酵素量である。反応の始めにおいてのみ、少量の中間体CHBAが検出可能である。クロロアセトアルデヒド1mmolあたり150Uの野生型大腸菌(E.coli)K12 DERAとの反応においては、CHBAは検出されず少量のCTeHPのみが検出可能である。野生型DERAでは、インキュベーション時間2および4時間後に、それぞれクロロアセトアルデヒドからCTeHPへの7%および8%の転換が見いだされた。したがって同一時間枠内で、発見された大腸菌(E.coli)K12突然変異DERA F200Iは、大腸菌(E.coli)K12からの野生型DERAよりも約11〜12%高い転換を示した。
実施例4−野生型大腸菌(E.coli)K12 DERAのF200の飽和変異誘発
F200X点突然変異の導入
ストラタジーン(Stratagene)からのクイックチェンジ(QuikChange)部位特異的変異誘発キットを使用して、供給業者のマニュアルに従って以下の変異誘発プライマーにより、大腸菌(E.coli)K12野生型deoC遺伝子[配列番号6]中の大腸菌(E.coli)K12野生型DERAアミノ酸配列[配列番号1]の位置200のアミノ酸残基フェニルアラニンをコードするDNA配列の全ての可能な64コード配列(Xは上に列挙するような20個のタンパク質新生アミノ酸および3個の終止コドンを画定する)への交換を実施した。
F200X点突然変異の導入
ストラタジーン(Stratagene)からのクイックチェンジ(QuikChange)部位特異的変異誘発キットを使用して、供給業者のマニュアルに従って以下の変異誘発プライマーにより、大腸菌(E.coli)K12野生型deoC遺伝子[配列番号6]中の大腸菌(E.coli)K12野生型DERAアミノ酸配列[配列番号1]の位置200のアミノ酸残基フェニルアラニンをコードするDNA配列の全ての可能な64コード配列(Xは上に列挙するような20個のタンパク質新生アミノ酸および3個の終止コドンを画定する)への交換を実施した。
F200X_順方向43
5’ GC GTA GAA AAA ACC GTT GGT NNN AAA CCG GCG GGC GGC GTG CG 3’
[配列番号9]
F200X_逆方向43
5’ CG CAC GCC GCC CGC CGG TTT NNN ACC AAC GGT TTT TTC TAC GC 3’
[配列番号10]
5’ GC GTA GAA AAA ACC GTT GGT NNN AAA CCG GCG GGC GGC GTG CG 3’
[配列番号9]
F200X_逆方向43
5’ CG CAC GCC GCC CGC CGG TTT NNN ACC AAC GGT TTT TTC TAC GC 3’
[配列番号10]
(Nは、4個のヌクレオチドA、C、G、およびTのいずれかを表す)。テンプレートとしては、国際公開第03/006656号パンフレットで述べられる手順に従って、プラスミドpBAD/Myc−HisC(Invitrogen)の複数クローニング部位のNcolおよびEcoRl制限部位中にクローンされた大腸菌(E.coli)K12野生型deoC遺伝子を使用した。
供給業者のプロトコルで述べられるようにして得られるPCR生成物をDpnl消化し、引き続いてインビトロジェン(Invitrogen)からのワンショット(OneShot)TOP10化学的コンピテント大腸菌(E.coli)細胞を形質転換するのに使用した。100μg/mlカルベニシリンを含有する選択LB培地上に播種後、無作為に選択された独立コロニーを使用して、100μg/mlのカルベニシリンを補足した1mlの2*TY培地を含有する4つのディープウェルマイクロタイタープレートに、ウェルあたり1個の独立コロニーを使用して接種した。各プレートで、pBAD/Myc−HisCを有する大腸菌(E.coli)TOP10コロニーを3つのウェルに接種し、クローンされた大腸菌(E.coli)野生型deoC遺伝子[配列番号6]、および[配列番号6]のT706A突然変異を示し、大腸菌(E.coli)DERAアミノ酸配列[配列番号1]の位置200において、フェニルアラニンからイソロイシンへのアミノ酸交換をもたらす大腸菌(E.coli)deoC遺伝子が、それぞれ対照の役目をした。
F200Xライブラリーの培養、発現、およびスクリーニング
25℃において300rpmでキューナー(Kuehner)ISF−1−W旋回振盪機(50mm振幅)上で、接種されたディープウェルマイクロタイタープレートを2日間インキュベートし、ディープウェルマイクロタイタープレート内の突然変異deoC変異体の発現培養のための前培養として使用した。この目的のために、各ウェルの65μlを100μg/mlのカルベニシリンおよび0.02%(w/v)のL−アラビノースを補足した935μlの滅菌2*TY培地を含有するディープウェルマイクロタイタープレートの相応するウェルに移して、遺伝子発現を誘発した。
25℃において300rpmでキューナー(Kuehner)ISF−1−W旋回振盪機(50mm振幅)上で、接種されたディープウェルマイクロタイタープレートを2日間インキュベートし、ディープウェルマイクロタイタープレート内の突然変異deoC変異体の発現培養のための前培養として使用した。この目的のために、各ウェルの65μlを100μg/mlのカルベニシリンおよび0.02%(w/v)のL−アラビノースを補足した935μlの滅菌2*TY培地を含有するディープウェルマイクロタイタープレートの相応するウェルに移して、遺伝子発現を誘発した。
引き続いて発現培養をキューナー(Kuehner)ISF−1−W旋回振盪機上で24時間インキュベートした(50mm振幅、37℃、300rpm)。ウェルあたり総容積500μlの溶解緩衝液を使用したこと以外は、実施例2で述べられるようにして細胞収集および溶解を実施した。実施例2で述べられるようにして、しかし20時間、基質インキュベーションを実施した。GC/MS分析における生成物定量化の内部標準の役目をする1000ppmシクロヘキシルベンゼンを含有する1mlアセトニトリルの各ウェルへの添加によって、反応を停止した。実施例2で述べられるようにして実施されるGC/MS分析による生成物定量化に先だって、タンパク質を遠心分離(4℃において5,000rpmで30分間)によって沈殿させた。
CTeHP形成に少なくとも2.5倍の上昇がある、全部で14個のクローンが同定された(表7参照)。これらの14個のクローンの内、7個はバリンに、6個はイソロイシンに、1個はメチオニンに、それぞれ3個の各アミノ酸のための可能な全てのコドンによるF200の突然変異を含有した。これらの全14個のクローンのDNAシーケンシング結果によれば、deoC遺伝子の追加的突然変異は起きなかった。
DERA生産性係数試験によるF200X「hits」の再試験
上述のようにDERA生産性係数試験に従った大腸菌(E.coli)K12野生型DERAとの比較で、これらの14個のクローンを再試験した。この目的で、大腸菌(E.coli)TOP10/pBAD/Myc−HisCベースのシステムが使用されて、大腸菌(E.coli)K12 deoC遺伝子変異体の発現が1mMIPTGによる代わりに、対数増殖期中期の0.02%(w/v)L−アラビノースの添加によって誘発されたこと以外は、実施例2で述べられるようにして14個のクローンを50ml規模で培養し、無細胞抽出物を調製した。
上述のようにDERA生産性係数試験に従った大腸菌(E.coli)K12野生型DERAとの比較で、これらの14個のクローンを再試験した。この目的で、大腸菌(E.coli)TOP10/pBAD/Myc−HisCベースのシステムが使用されて、大腸菌(E.coli)K12 deoC遺伝子変異体の発現が1mMIPTGによる代わりに、対数増殖期中期の0.02%(w/v)L−アラビノースの添加によって誘発されたこと以外は、実施例2で述べられるようにして14個のクローンを50ml規模で培養し、無細胞抽出物を調製した。
F200V変異体は、スクリーニングおよびDERA生産性係数において、このスクリーニングから得られたF200I変異体と比較できるCTeHP形成を示した。F200M変異型は、F200VおよびF200I変異体よりもわずかに低いDERA生産性係数を示したが、それでもなお大腸菌(E.coli)K12野生型DERA生産性係数と比べて10倍を超えて増大する(1000%を超える)。
F200X反応のスケールアップ
野生型大腸菌(E.coli)K12 DERAのF200位置の飽和変異誘発によって見いだされた3個のアミノ酸置換F200I、F200V、およびF200Mをより詳しく調査するために、クロロアセトアルデヒド濃度0.6Mおよびアセトアルデヒド濃度1.2MでのCTeHP形成におけるそれらの性能について、選択されたクローンの規定量の無細胞抽出物を調査した。
野生型大腸菌(E.coli)K12 DERAのF200位置の飽和変異誘発によって見いだされた3個のアミノ酸置換F200I、F200V、およびF200Mをより詳しく調査するために、クロロアセトアルデヒド濃度0.6Mおよびアセトアルデヒド濃度1.2MでのCTeHP形成におけるそれらの性能について、選択されたクローンの規定量の無細胞抽出物を調査した。
それらの各cfe中の15μgのタンパク質のSDS−PAGE分析によって、クローン1−D10(F200M)、2−H8(F200V)、および3−C10(F200I)をそれらの発現レベルについて調査した。突然変異酵素の発現レベルは、野生型大腸菌(E.coli)K12 DERAと同一であることが検証された。2−デオキシ−D−リボース5−ホスフェートとのDERA天然基質反応中の酵素活性は、それぞれF200Mで29U/mg、F200Vで38U/mg、F200Iで36U/mg、そして大腸菌(E.coli)K12の野生型DERAで54U/mgであった。
CIAA反応では、各無細胞抽出物からの3mgの総タンパク質を総容積1ml中で使用した。全ての反応を0.1M NaHCO3緩衝液(pH7.2)中で、室温において穏やかに撹拌しながら実施した。CTeHP形成の定量化のためには、100μlのサンプルを反応経過中の異なる時点で採取した。サンプル中の酵素反応を900μlのアセトニトリル(内部標準として1,000ppmシクロヘキシルベンゼンを含有する)の添加によって停止し、16,000×gで10分間遠心分離した。それらのCTeHP含量のためにFID検出器を使用して、バリアン(Varian)からのクロムパック(Chrompack)CP−SIL8CBカラム上でガスクロマトグラフィーによって上清を分析した。この分析結果を表8に示す。
これらの結果は、CIAAおよびアセトアルデヒドからCTeHPへの転換のために、アミノ酸位置F200におけるF200I、F200V、およびF200M置換が有益な突然変異であることを検証する。
実施例5−ΔY259と組み合わさったF200I突然変異、A259および[配列番号3]によるC−末端延長と組み合わさったF200I突然変異
PCRベースの部位特異的変異誘発アプローチを使用して、F200I交換をそれぞれ、(i)C−末端Y259残基の欠失、および(ii)その置換に加えたアミノ酸配列KTQLSCTKW[配列番号3]による大腸菌(E.coli)K12 DERAのC−末端延長で遺伝子組み換えした。各突然変異体を含んでなるおよそ30〜50個のヌクレオチドのPCRプライマーをそれぞれ順方向および逆方向で合成した。2つの別個のPCR反応で、これらの変異誘発プライマーをそれぞれインビトロジェン(Invitrogen)からのゲータウェイ(Gateway)システム特異的順方向および逆方向プライマーまたは追加的変異誘発順方向および逆方向プライマーと組み合わせて、インビトロジェン(Invitrogen)からのpDEST14中でクローンされた大腸菌(E.coli)K12[配列番号6]からの野生型deoC遺伝子に使用した。
PCRベースの部位特異的変異誘発アプローチを使用して、F200I交換をそれぞれ、(i)C−末端Y259残基の欠失、および(ii)その置換に加えたアミノ酸配列KTQLSCTKW[配列番号3]による大腸菌(E.coli)K12 DERAのC−末端延長で遺伝子組み換えした。各突然変異体を含んでなるおよそ30〜50個のヌクレオチドのPCRプライマーをそれぞれ順方向および逆方向で合成した。2つの別個のPCR反応で、これらの変異誘発プライマーをそれぞれインビトロジェン(Invitrogen)からのゲータウェイ(Gateway)システム特異的順方向および逆方向プライマーまたは追加的変異誘発順方向および逆方向プライマーと組み合わせて、インビトロジェン(Invitrogen)からのpDEST14中でクローンされた大腸菌(E.coli)K12[配列番号6]からの野生型deoC遺伝子に使用した。
ゲータウェイ(Gateway)システム特異的順方向プライマー配列:
5’ GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT CGA AGG 3’
[配列番号11]
ゲータウェイ(Gateway)システム特異的逆方向プライマー配列:
5’ GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC 3’
[配列番号12]
F200I順方向
5’ CCG TTG GTA TCA AAC CGG CGG GCG G 3’
[配列番号 13]
F200I逆方向:
5’ CCG CCC GCC GGT TTG ATA CCA ACG G 3’
[配列番号 14]
ΔY259逆方向:
5’ GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TTA GTA GTG CTG GCG CTC TTA CC 3’
[配列番号 15]
C−延長3逆方向:
5’ GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC CTA TTA GTT AGC TGC TGG CGC TC 3’
[配列番号16]
5’ GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT CGA AGG 3’
[配列番号11]
ゲータウェイ(Gateway)システム特異的逆方向プライマー配列:
5’ GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC 3’
[配列番号12]
F200I順方向
5’ CCG TTG GTA TCA AAC CGG CGG GCG G 3’
[配列番号 13]
F200I逆方向:
5’ CCG CCC GCC GGT TTG ATA CCA ACG G 3’
[配列番号 14]
ΔY259逆方向:
5’ GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TTA GTA GTG CTG GCG CTC TTA CC 3’
[配列番号 15]
C−延長3逆方向:
5’ GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC CTA TTA GTT AGC TGC TGG CGC TC 3’
[配列番号16]
生じた部分的deoC遺伝子断片をゲル精製して、テンプレートdeoC断片DNAによる引き続くPCR反応の汚染を防止した。得られた断片をPCR反応で使用して、所望の突然変異を含有する変異型全長deoC遺伝子断片を再構築した。次に供給業者のワンチューブプロトコルに従って、全長変異型deoC断片をpDEST14ベクター中にサブクローンした。挿入断片を完全に配列決定して、所望の大腸菌(E.coli)K12 deoC突然変異体発現コンストラクト中に好ましくない変更が起きていなかったことを確認した。
得られた大腸菌(E.coli)K12 DERA変異体F200I/ΔY259およびF200I/ΔY259+配列番号3は、クロロアセトアルデヒドの不在下でDERA天然基質活性アッセイによって、2−デオキシ−D−リボース5−ホスフェートに対して非常にわずかな触媒活性を示した。したがって過剰発現したDERA変異体は、ウォン(Wong)および共同研究者ら、J.Am.Chem.Soc.117(12)、3333〜3339(1995年)で述べられるような手順に従って、イオン交換クロマトグラフィーおよび硫酸アンモニウム分画によって精製された。実施例3および4で述べられるような無細胞抽出物の代わりに、反応容積1mlあたり2.5mgの各精製DERA(野生型または変異体)の規定量が使用されたこと以外は、実施例3で述べられるようにして、CTeHP合成について、遺伝子組み換え変異体F200I+ΔY259およびF200I+ΔY259+配列番号3と、DERA変異型F200Iおよび大腸菌(E.coli)K12野生型DERAとを比較した。8時間後に、精製されたF200I/ΔY259およびF200I/ΔY259+配列番号3によって、0.5M CIAAおよび1.0Mアセトアルデヒドの基質濃度で、それぞれ供給アルデヒドのCTeHPへの61%および70%の転換が得られた(表9)。精製されたF200Iでは、0.11MのCTeHP濃度が8時間後に得られ、所望生成物への23%の転換に相応した。精製大腸菌(E.coli)K12野生型DERAでは、非常にわずかなCTeHPが形成された。ここでは7%未満の供給アルデヒドが転換された。
実施例6−CTeHP生成に関する野生型DERAのスクリーニング
野生型deoC遺伝子のクローニング
ゲートウェイ(Gateway)クローニングのためのattB認識配列を含有する遺伝子特異的プライマーを使用して、アエロピラム・ペルニクス(Aeropyrum pernix)K1(GI:24638457)、枯草菌(Bacillus subtilis)168株(GI:1706363)、デイノコッカス・ラジオデュランス(Deinococcus radiodurans)R1(GI:24636816)、およびサーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)MSB8(GI:7674000)の野生型DERAをコードするdeoC遺伝子をPCR増幅した。
野生型deoC遺伝子のクローニング
ゲートウェイ(Gateway)クローニングのためのattB認識配列を含有する遺伝子特異的プライマーを使用して、アエロピラム・ペルニクス(Aeropyrum pernix)K1(GI:24638457)、枯草菌(Bacillus subtilis)168株(GI:1706363)、デイノコッカス・ラジオデュランス(Deinococcus radiodurans)R1(GI:24636816)、およびサーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)MSB8(GI:7674000)の野生型DERAをコードするdeoC遺伝子をPCR増幅した。
A.ペルニクス(A.pernix)5’順方向
5’ GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT CGA AGG AGA TAG AAC CAT GAG AGA GGC GTC GGA CGG 3’
[配列番号17]
A.ペルニクス(A.pernix)3’逆方向
5’ GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TTA GAC TAG GGA TTT GAA GCT CTC CAA AAC C 3’
[配列番号 18]
枯草菌(B.subtilis)5’順方向
5’ GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT CGA AGG AGA TAG AAC CAT GTC ATT AGC CAA CAT A AT TGA TCA TAC AG 3’
[配列番号19]
枯草菌(B.subtilis)3’逆方向
5’ GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TTA ATA GTT GTC TCC GCC TGA TGC 3’
[配列番号20]
D.ラジオデュランス(D.radiodurans)5’順方向
5’ GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT CGA AGG AGA TAG AAC CAT GTC ACT CGC CTC CTA CAT CGA CC 3’
[配列番号21]
D.ラジオデュランス(D.radiodurans)3’逆方向
5’ GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TCA GTA GCC GGC TCC GTT TTC GC 3’
[配列番号22]
T.マリティマ(T.maritima)5’順方向
5’ GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT CGA AGG AGA TAG AAC C ATG ATA GAG TAC AGG ATT GAG GAG G 3’
[配列番号23]
T.マリティマ(T.maritima)3’逆方向
5’ GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TCA ACC TCC ATA TCT CTC TTC TCC 3’
[配列番号24]
5’ GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT CGA AGG AGA TAG AAC CAT GAG AGA GGC GTC GGA CGG 3’
[配列番号17]
A.ペルニクス(A.pernix)3’逆方向
5’ GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TTA GAC TAG GGA TTT GAA GCT CTC CAA AAC C 3’
[配列番号 18]
枯草菌(B.subtilis)5’順方向
5’ GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT CGA AGG AGA TAG AAC CAT GTC ATT AGC CAA CAT A AT TGA TCA TAC AG 3’
[配列番号19]
枯草菌(B.subtilis)3’逆方向
5’ GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TTA ATA GTT GTC TCC GCC TGA TGC 3’
[配列番号20]
D.ラジオデュランス(D.radiodurans)5’順方向
5’ GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT CGA AGG AGA TAG AAC CAT GTC ACT CGC CTC CTA CAT CGA CC 3’
[配列番号21]
D.ラジオデュランス(D.radiodurans)3’逆方向
5’ GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TCA GTA GCC GGC TCC GTT TTC GC 3’
[配列番号22]
T.マリティマ(T.maritima)5’順方向
5’ GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT CGA AGG AGA TAG AAC C ATG ATA GAG TAC AGG ATT GAG GAG G 3’
[配列番号23]
T.マリティマ(T.maritima)3’逆方向
5’ GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TCA ACC TCC ATA TCT CTC TTC TCC 3’
[配列番号24]
供給業者のプロトコルに従って4つの野生型deoC遺伝子をpDEST14中にクローンし、ノバジェン(Novagen)からの化学的にコンピテントな大腸菌(E.coli)ロゼッタ(Rosetta)(DE3)を各pDEST14−deoCコンストラクトで形質転換した。それぞれpDEST14−Ecol−deoCおよびpDEST14_9−11Hを有し、大腸菌(E.coli)K12野生型deoC遺伝子および突然変異大腸菌(E.coli)K12 deoC遺伝子を含有し、[配列番号6]のT706A突然変異を示して、大腸菌(E.coli)DERAアミノ酸配列[配列番号1]の位置200においてフェニルアラニンからイソロイシンへのアミノ酸交換をもたらす大腸菌(E.coli)ロゼッタ(Rosetta)(DE3)株は、対照の役目をした。LB寒天プレート(100μg/mlカルベニシリンおよび35μg/mlクロラムフェニコールを含有する)からのこれらの各6株の8個の無作為に選択した独立コロニーを使用して、100μg/mlカルベニシリンおよび35μg/mlクロラムフェニコールを補足した1mlの2*YT培地を含有するディープウェルマイクロタイタープレートに接種した。
野生型DERAの培養、発現、およびスクリーニング
20℃において300rpmでキューナー(Kuehner)ISF−1−W旋回振盪機(50mm振幅)上で接種されたディープウェルマイクロタイタープレートを2日間インキュベートし、ディープウェルマイクロタイタープレート内の突然変異deoC変異体の発現培養のための前培養として使用した。この目的のために、各ウェルの65μlを100μg/mlのカルベニシリン、35μg/mlのクロラムフェニコール、および1mMのIPTGを補足した935μlの滅菌2*TY培地を含有するディープウェルマイクロタイタープレートの相応するウェルに移して、遺伝子発現を誘発した。
20℃において300rpmでキューナー(Kuehner)ISF−1−W旋回振盪機(50mm振幅)上で接種されたディープウェルマイクロタイタープレートを2日間インキュベートし、ディープウェルマイクロタイタープレート内の突然変異deoC変異体の発現培養のための前培養として使用した。この目的のために、各ウェルの65μlを100μg/mlのカルベニシリン、35μg/mlのクロラムフェニコール、および1mMのIPTGを補足した935μlの滅菌2*TY培地を含有するディープウェルマイクロタイタープレートの相応するウェルに移して、遺伝子発現を誘発した。
引き続いて発現培養をキューナー(Kuehner)ISF−1−W旋回振盪機上で24時間インキュベートした(50mm振幅、25℃、300rpm)。総容積500μlを使用し、溶解緩衝液がロシュ(Roche)からの0.1mg/ml DNAseI、シグマ(Sigma)からの2mg/mlリゾチーム、10mMジチオスレイトール(DTT)、および5mM MgSO4を含有する50mM MOPS緩衝液、pH7.5から構成されたこと以外は、実施例2で述べられるようにして細胞収集および溶解を実施した。実施例2で述べられるようにして、しかし2.5時間で、0.2Mクロロアセトアルデヒドおよび0.4Mアセトアルデヒドの基質濃度を用いて基質インキュベーションを実施した。GC/MS分析における生成物定量化の内部標準の役目をする1000ppmシクロヘキシルベンゼンを含有する1mlアセトニトリルの各ウェルへの添加によって、反応を停止した。実施例2で述べられるようにして実施されるGC/MS分析による生成物定量化に先だって、タンパク質を遠心分離(4℃において5,000rpmで30分間)によって沈殿させた。
用いたスクリーニング条件下では、大腸菌(E.coli)K12野生型DERA、大腸菌(E.coli)K12 DERA変異型F200I、および枯草菌(Bacillus subtilis)168株DERAを入れたウェルで、顕著なDERA活性およびCHBA形成が検出できた。このスクリーニング条件下では、その他の野生型DERAは、DERA天然基質アッセイでも生産性スクリーニング法におけるCHBAまたはCTeHP生成でも活性を示さなかった。大腸菌(E.coli)K12 DERA変異型F200IのCHBA形成の平均値は、大腸菌(E.coli)K12野生型DERAによるCHBA形成よりも約4倍高く、したがって実施例2において同一株背景で得られた値と比較できた。さらに枯草菌(B.subtilis)168株野生型DERAは、わずかにより低いDERA天然基質活性と共に、大腸菌(E.coli)K12からの野生型DERAよりも50%高いCHBA生成を示した(表10)。これは、配列番号1を有してCHBAおよびCTeHPを合成できる、大腸菌(E.coli)K12 DERAより高い生産性がある野生型DERAもまた、実施例2で使用されて述べられるようなGC/MSベースの生産性方法によって見いだせることを意味する。
Claims (20)
- 真核生物および原核生物種からなる群に属する天然源からの2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群からの単離された酵素突然変異体であって、このような各野生型酵素が、少なくともアセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの等モル混合物からの6−クロロ−2,4,6−トリデオキシ−D−エリスロヘキサピラノシド(CTeHP)生成におけるDERA生産性係数試験によって判定される特定の生産性係数を有し、単離された突然変異体が、それからそれが突然変異した相応する野生型酵素の生産性係数よりも少なくとも10%高い生産性係数を有し、突然変異体および相応する野生型酵素双方の生産性係数が同一条件下で測定される、2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群からの単離された酵素突然変異体。
- 単離された突然変異体が、[配列番号1]の野生型酵素配列を有する大腸菌(Escherichia coli)Kl2(EC4.1.2.4)からの2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼの生産性係数よりも少なくとも10%高い生産性係数を有し、突然変異体および大腸菌(Escherichia coli)K12酵素双方の生産性係数が同一条件下で測定される、請求項1に記載の、2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群からの単離された突然変異体。
- [配列番号1]の野生型酵素配列を有する大腸菌(Escherichia coli)K12(EC 4.1.2.4)からの2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼの突然変異体である、請求項1または2に記載の、2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群からの単離された突然変異体。
- 突然変異体が、任意にC−末端延長と組み合わさったおよび/またはN−末端延長と組み合わさった、K13、T19、Y49、N80、D84、A93、E127、A128、K146、K160、I166、A174、M185、K196、F200、またはS239の1つ以上の[配列番号1]中の位置、またはそれに相応する位置における少なくとも1つのアミノ酸置換、および/またはS258またはY259の1つの[配列番号1]中の位置、またはそれに相応する位置における少なくとも1つのアミノ酸欠失を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の、2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群からの単離された突然変異体。
- 突然変異体が、
任意にC−末端延長と組み合わさったおよび/またはN−末端延長と組み合わさった、
a.正に帯電したアミノ酸によって、好ましくはRまたはHによって置換されたK13および/またはK196、
b.別のアミノ酸によって置換されたT19および/またはM185、好ましくは親水性アミノ酸、特にS、T、C、Q、およびNからなるもの、および/または、疎水性アミノ酸、特にV、L、およびIからなるもの、からなる群から選択される別のアミノ酸によって置換されたT19および/またはM185、
c.FおよびWからなる群から選択される芳香族アミノ酸によって置換されたY49、
d.T、S、C、Q、およびNからなる親水性アミノ酸の群から選択される別のアミノ酸によって置換されたN80および/またはI166および/またはS239、
e.サイズの大きい順に、E、T、N、P、D、C、S、A、およびGからなる小型アミノ酸の群から選択される別の、好ましくはより小型のアミノ酸によって置換されたD84および/またはA93および/またはE127、
f.I、L、M、V、F、およびYからなる疎水性アミノ酸の群から選択される別のアミノ酸によって置換されたA128および/またはK146および/またはK160および/またはA174および/またはF200
からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を[配列番号1]中に有する、またはその中の置換に相応する、
および/またはS258およびY259の位置の少なくとも1つのアミノ酸の欠失を[配列番号1]中に、またはそれに相応する位置に有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の、2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群からの単離された突然変異体。 - C−末端が、断片TTKTQLSCTKW[配列番号2]およびKTQLSCTKW[配列番号3]の1つによって延長される、請求項4または5に記載の単離された突然変異体。
- 突然変異体が、K13R、T19S、Y49F、N80S、D84G、A93G、E127G、A128V、K146V、K160M、I166T、A174V、M185T、M185V、K196R、F200I、F200M、F200V、S239C、ΔS258、ΔY259、TTKTQLSCTKW[配列番号2]によるC−末端延長、およびKTQLSCTKW[配列番号3]によるC−末端延長の群から選択される、1つ以上の突然変異を[配列番号1]中に有する、またはその中の突然変異に相応する、請求項5または6に記載の、2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群からの単離された突然変異体。
- 突然変異体が、F200IおよびΔY259、F200MおよびΔY259、F200VおよびΔY259、F200IおよびKTQLSCTKW[配列番号3]によるC−末端延長、F200MおよびKTQLSCTKW[配列番号3]によるC−末端延長、およびF200VおよびKTQLSCTKW[配列番号3]によるC−末端延長の群から選択される、少なくとも2つの突然変異を[配列番号1]中に有する、またはその中の2つの突然変異に相応する、請求項7に記載の、2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群からの単離された突然変異体。
- アセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの少なくとも等モル混合物からの6−クロロ−2,4,6−トリデオキシ−D−エリスロヘキサピラノシド(CTeHP)生成において、DERA生産性係数試験による判定で、[配列番号1]の野生型酵素配列を有する大腸菌(Escherichia coli)K12(EC 4.1.2.4)からの2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素の生産性係数よりも少なくとも10%高い生産性係数を有する2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素群からの野生型酵素のスクリーニングのための方法であって、
(A)引き続いて(i)総および/またはゲノムDNAおよび/またはcDNAが単離され、(ii)前記単離されたDNAを含んでなる個々のクローンからなる前記単離されたDNAの発現ライブラリーが調製され、(iii)得られた発現ライブラリーからの個々のクローンが、アセトアルデヒドとクロロアセトアルデヒドの基質混合物と共にインキュベートされ、(iv)4−クロロ−3−(S)−ヒドロキシ−ブチルアルデヒド(CHBA)および/または6−クロロ−2,4,6−トリデオキシ−D−エリスロヘキサピラノシド(CTeHP)へのこれらの基質の転換を示す1つ以上のクローンからの1つ以上の遺伝子が単離され、[配列番号6]と同一の遺伝的背景中に再クローンされ、
(B)ステップ(iv)で得られた再クローンされた遺伝子によってコードされるDERA酵素が発現され、DERA生産性係数試験によって試験されることで、このような野生型酵素の各生産性係数が得られ、
(C)ステップ(B)からのこれらの野生型酵素の生産性係数が、[配列番号1]の配列を有する大腸菌(Escherichia coli)K12(EC 4.1.2.4)からの野生型酵素と比較され、前記比較において少なくとも10%より高い生産性係数を有するDERA酵素をコードする1つ以上の遺伝子が選択され単離される、
方法。 - アセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの少なくとも等モル混合物からの6−クロロ−2,4,6−トリデオキシ−D−エリスロヘキサピラノシド(CTeHP)の生成において、DERA生産性係数試験による判定で、相応する野生型酵素の生産性係数よりも少なくとも10%高いか、または[配列番号1]の野生型酵素配列を有する大腸菌(Escherichia coli)K12(EC 4.1.2.4)からの2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素の生産性係数よりも少なくとも10%高いかのいずれかの生産性係数を有する2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素群からの突然変異酵素をスクリーニングする方法であって、
(A)引き続いて(i)野生型2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素をコードする遺伝子が突然変異されて、それ自体に知られている様式で[配列番号6]を有する大腸菌(E.coli)K12 DERAをコードする遺伝子と同一の遺伝的背景中に、それぞれそれがそれから突然変異した相応する野生型遺伝子と同一の遺伝的背景中にクローンされることで、このようにして調製された突然変異体からのクローンの発現ライブラリーが得られ、
(B)クローン中のDERA−酵素が発現され、DERA生産性係数試験によって試験されることで、各突然変異酵素の生産性係数が得られ、
(C)突然変異酵素の生産性係数が、相応する野生型酵素のそれと、または[配列番号1]配列を有する大腸菌(Escherichia coli)K12(EC 4.1.2.4)からの野生型酵素のそれと比較され、各比較において少なくとも10%高い生産性係数を有するDERA突然変異体をコードする1つ以上の遺伝子が選択され単離される、
方法。 - ステップ(A)(i)の後、ステップA(ii)で、得られた発現ライブラリーからの個々のクローンが基質アセトアルデヒドとクロロアセトアルデヒドの混合物と共にインキュベートされ、その後ステップA(iii)で、これらの基質の4−クロロ−3−(S)−ヒドロキシ−ブチルアルデヒド(CHBA)および/または6−クロロ−2,4,6−トリデオキシ−D−エリスロヘキサピラノシド(CTeHP)への最大の転換を示すクローンの1つ以上が選択され、選択されたクローンがステップBで使用される、請求項10に記載の方法。
- 請求項10または11に記載のスクリーニング法によって得られる単離された核酸。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の突然変異2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素をコードする単離された核酸。
- 請求項12または13に記載の核酸を含んでなるベクター。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群からの突然変異体、または請求項10または11に記載のスクリーニング法に従って得られるような突然変異酵素を含んでなる宿主細胞、および/または請求項12または13に記載の単離された核酸を含んでなる、および/または請求項14に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
- 相応する野生型酵素および/または[配列番号1]の野生型酵素配列を有する大腸菌(Escherichia coli)(EC 4.1.2.4)からの2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼ酵素の生産性係数よりも少なくとも10%高い生産性係数を有する突然変異2−デオキシ−D−リボース5−リン酸アルドラーゼの調製のための方法であって、
請求項12または13に記載の核酸、または請求項14に記載のベクター、または請求項15に記載の宿主細胞を利用する方法。 - 式1、
(式中、
R1およびRxはそれぞれ独立してHまたは保護基を表し、Xはハロゲンと、トシレート基と、メシレート基と、アシルオキシ基と、フェニルアセチルオキシ基と、アセトアルデヒドおよび式、HC(O)CH2X(式中、Xは上に定義したとおりである)に相応する置換されたアセトアルデヒドからのアルコキシ基またはアリールオキシ基を表す)の2,4−ジデオキシヘキソースまたは2,4,6−トリデオキシヘキソースの調製のための方法であって、請求項1〜8のいずれか一項に記載の突然変異DERA酵素、または請求項10または請求項11に記載の方法によって得られる核酸の発現によって得られる突然変異DERA酵素、または請求項16に記載の方法によって生成される突然変異DERA酵素が使用され、R1および/またはRxが保護基を表す場合、形成された化合物中のヒドロキシ基(群)が、保護基によってそれ自体に知られている様式で保護される)の2,4−ジデオキシヘキソースまたは2,4,6−トリデオキシヘキソースの調製のための方法。 - アルデヒド、2−置換アルデヒド、およびアルデヒドと2−置換アルデヒドとの間の反応中で形成される中間生成物(すなわち4−置換−3−ヒドロキシ−ブチルアルデヒド中間体)の濃度の合計であるカルボニル濃度が、反応混合物1リットルあたり0.1〜5モルの間で選択される、請求項17に記載の方法。
- R1およびRxがHを表す、請求項17または請求項18に記載の方法。
- 請求項17〜19のいずれか一項に記載の方法、およびそれ自体に知られているさらなる加工ステップを使用した、スタチンの調製のための方法。
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