MXPA06013743A - Composiciones de alimentos para animales con contenido incrementado de histidina. - Google Patents

Abstract

Se divulgan composiciones y metodos para complementar los alimentos de los rumiantes. Las composiciones incluyen al menos un ingrediente que tiene un contenido incrementado de histidina. Este ingrediente se deriva comunmente de una fuente no animal. Los metodos incluyen la alimentacion a rumiantes de composiciones alimenticias que incluyen el ingrediente para mejorar la produccion de leche.

Description

COMPOSICIONES DE ALIMENTOS PARA ANIMALES CON CONTENIDO INCREMENTADO DE HISTIDINA REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional Norteamericana 60/575,628, presentada el 28 de mayo de 2004; y la solicitud provisional Norteamericana 60/577,363, presentada el 4 de junio de 2004 cuyos contenidos enteros se incorporan aquí por referencia en su totalidad. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Todos los animales requieren de aminoácidos (AA) , los bloques de construcción de las proteínas necesarias para el crecimiento, reproducción, lactancia y mantenimiento óptimos. Los aminoácidos absorbidos en el intestino delgado de la vaca se derivan de proteína microbiana y de proteínas de la alimentación no degradadas en el rumen. Las proteínas digeridas en el intestino delgado deben suministrar 10 aminoácidos esenciales (EAA) , que no pueden ser fabricados por la vaca, arginina, histidina, isoleucina, leucina, usina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano,- y valina. De manera ideal, las proporciones relativas de cada uno de los aminoácidos esenciales (EAA) absorbidos deben corresponder exactamente a los requisitos de la vaca puesto que una escasez de uno de ellos puede limitar la utilización de los demás. Los rumiantes (ganado, ovejas) complican la nutrición de proteína puesto que tienen cámaras previas al estómago en donde ocurre la digestión. En las primeras dos cámaras, el rumen y el retículo, una población de bacterias simbióticas y protozoarios fermentan los alimentos y crecen a partir de fuentes de nitrógeno no proteínico tales como amoníaco o urea. Estas bacterias pueden digerir fibras en plantas lo que permite al ganado obtener energía a partir de estos alimentos. Pueden también sintetizar proteína a partir de subproductos económicos. La producción de proteína microbiana se relaciona directamente con el crecimiento microbiano el cual es determinado en gran medida por la presencia de carbohidratos tales como almidón, fibra no detergente (NDF) , azúcares, y carbohidratos no fibrosos (por ejemplo pectina y beta-glucanos) . La población microbiana es continuamente lavada fuera del rumen hacia el estómago verdadero (es decir, abomaso) en donde es digerida para suministrar aminoácidos a la vaca. Además de obtener aminoácidos a partir de proteína producida por microbios, los rumiantes obtienen también aminoácidos a partir de aminoácidos esenciales no degradados (UEAA) que pasan del rumen al abomaso. Los rumiantes lactantes excretan una mayor cantidad de ciertos aminoácidos en leche, (por ejemplo histidina) que lo que consumen en la dieta y aparecen en el intestino delgado de la vaca. Estos aminoácidos deficitarios se conocen como aminoácidos limitantes. La complementación de los aminoácidos limitantes al animal puede mejorar la producción de leche y la composición de los componentes de la leche. Los aminoácidos limitantes pueden proporcionarse en forma de aminoácidos esenciales no degradados (UEAA) . COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Composiciones y métodos dirigidos generalmente a incrementar la producción de leche en ganado lechero y otros rumiantes se proporcionan aquí. La alimentación de animales rumiantes para una producción óptima de productos animales incluye la comprensión de la nutrición de aminoácidos, ácidos grasos y carbohidratos. Se proporcionan aquí composiciones y métodos para mejorar la nutrición de animales rumiantes, en particular nutrición de aminoácidos. Se proporciona también un método para mitigar la limitación de aminoácidos y mejorar la producción de leche y la composición de componentes de leche de los rumiantes lactantes mediante la alimentación a los rumiantes de un alimento que tiene un contenido mejorado de uno o varios aminoácidos limitantes. Mediante la alimentación a una vaca lechera de una composición alimenticia particular que suministra un equilibrio mejorado de los 10 aminoácidos esenciales, la producción de leche de la vaca puede ser incrementada. En particular, la composición alimenticia puede tener un contenido mejorado de uno o varios aminoácidos limitantes, de conformidad con lo determinado por los requisitos de aminoácidos de la vaca para el mantenimiento, crecimiento, y producción de leche. Los aminoácidos limitantes puede incluir histidina, usina, metionina, fenilalanina, leucina, y/treonina. La composición alimenticia puede ser formulada para proporcionar un equilibrio mejorado de aminoácidos esenciales después del rumen. La composición alimenticia incluye típicamente al menos un ingrediente que tiene un contenido mejorado de histidina, y el ingrediente se deriva típicamente de una fuente no animal (por ejemplo, bacteria, levadura y/o planta) . La composición puede incluir una fuente de histidina que incluye L-His y una biomasa formada durante la fermentación de un microorganismo que produce histidina. En otro ejemplo, La composición alimenticia incluye una fuente de histidina que puede incluir L-His y constituyentes disueltos y suspendidos a partir de un caldo de fermentación formado durante la fermentación de un microorganismo productor de histidina. En otras modalidades, la composición alimenticia puede tener una fracción de proteína cruda que incluye al menos una proteína rica en histidina de origen no animal, (es decir, una proteína rica en histidina animal o no animal producida por bacterias, levaduras y/o plantas) . Además, la composición alimenticia puede incluir una proteína rica en histidina animal o no animal producida por bacterias, levaduras y/o plantas recombinantes (por ejemplo, por fermentación de bacterias recombinantes) . Por ejemplo, las bacterias, levaduras y/o plantas pueden ser manipuladas para producir una proteína rica en histidina presente en harina de sangre (por ejemplo la cadena de hemoglobina alfa) . Todas las composiciones alimenticias descritas incluyen comúnmente al menos un componente nutriente adicional. La composición alimenticia puede incluir al menos aproximadamente 1 g/kg de fuente de histidina. En ciertas modalidades, la composición alimenticia incluye al menos aproximadamente 2 g/kg de la fuente de histidina. La composición alimenticia puede incluir hasta aproximadamente lOg/kg de la fuente de histidina. Como se utiliza aquí, L-His incluye histidina en forma de aminoácido libre y en forma de sales de histidina (por ejemplo, His (HCl)). Cuando las cantidades de L-His se mencionan aquí, las cantidades se refieren a la histidina en base a aminoácido libre. La composición alimenticia puede incluir constituyentes de fermentación formados durante la fermentación de un microorganismo productor de histidina. Como se utiliza aquí, los "constituyentes de fermentación" pueden incluir cualquier constituyente adecuado proveniente de un caldo de fermentación. Por ejemplo, los constituyentes de fermentación pueden incluir constituyentes disueltos y/o suspendidos a partir de un caldo de fermentación. Los constituyentes suspendidos pueden incluir constituyentes solubles no disueltos (por ejemplo cuando la solución está sobresaturada con uno o varios componentes) y/o materiales insolubles presentes en el caldo de fermentación. Los constituyentes de fermentación pueden también incluir al menos una porción de la biomasa formada durante una fermentación. Los constituyentes de fermentación pueden incluir sustancialmente la totalidad de los sólidos secos presentes al final de una fermentación (por ejemplo, mediante secado por rociado de un caldo de fermentación y la biomasa producida por la fermentación) o bien pueden incluir una porción de los mismos. Por ejemplo, el producto de fermentación crudo provenientes de la fermentación de un microorganismo productor de histidina puede ser fraccionado y/o parcialmente purificado para incrementar el contenido de histidina del material que puede todavía contener constituyentes de fermentación .además de la histidina. La composición alimenticia puede contener una fracción de proteína cruda que tiene un contenido de histidina de al menos aproximadamente 2.8% en peso. En modalidades adecuadas, la fracción de proteína cruda puede tener un contenido de histidina de al menos aproximadamente 3%, al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, y en modalidades adecuadas al menos aproximadamente 20%. De manera común, la composición alimenticia puede incluir una fracción de proteína cruda que tiene un contenido de histidina de hasta aproximadamente 7% en peso. Más comúnmente, la composición alimenticia puede incluir una fracción de proteína cruda que tiene un contenido de histidina de aproximadamente 2.8 - 5.0% en peso, y de manera más común 3.0 - 4.0% en peso. La composición alimenticia puede incluir una fuente de histidina que tiene un contenido de histidina en base en aminoácidos libres de al menos aproximadamente 300 gramos por kilogramos de sólidos secos. En modalidades adecuadas, la fuente de histidina tiene un contenido de histidina en base en aminoácidos libres de al menos aproximadamente 400 gramos por kilogramo de sólido seco, al menos aproximadamente 500 gramos por kilogramo de sólido seco, al menos aproximadamente 600 gramos kilogramo de sólido seco, al menos aproximadamente 700 gramos kilogramo de sólido seco, y /o al menos aproximadamente 800 gramos kilogramo de sólido seco. La composición alimenticia puede incluir una fuente de histidina con protección para pasaje en el rumen que puede incluir L-His protegida para pasaje en el rumen y/o una proteína rica en histidina con protección para pasaje en el rumen de origen no animal. La L-His o la proteína rica en histidina puede estar protegida para pasaje en el rumen mediante la reacción de L-His y/o una proteína rica en histidina con al menos un carbohidrato reductor (por ejemplo, un azúcar reductor) . Carbohidratos reductores adecuados pueden incluir xilosa, lactosa y/o glucosa. La L-His y/o la proteína rica en histidina pueden estar protegidas para pasaje en el rumen mediante el recubrimiento de L-His y/o de la proteína rica en histidina con al menos un ácido graso. Ácidos grasos adecuados pueden incluir aceites vegetales al menos parcialmente hidrogenados tales como aceite de soya. La fuente de histidina protegida para pasaje en el rumen puede suministrar post-rumen al menos aproximadamente el 40% de la histidina protegida para pasaje en el rumen. Más comúnmente, la fuente de histidina protegida para pasaje en el rumen puede suministrar post-rumen al menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, ó 90% de la histidina protegida para pasaje en el rumen. La composición puede emplearse en varias formas incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, forma alimenticia completa. Forma concentrada, forma mezclada y forma de mezcla base. Las formas alimenticias para incrementar la producción de leche en ganado lechero mediante el equilibrio de los aminoácidos esenciales a través de una forma alimenticia completa, forma concentrada, forma mezclada o forma de mezcla base particulares de la composición se describen en la Patente Norteamericana Número 5,145,695 y en la Patente Norteamericana Número 5,219,596 cuyas divulgaciones se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Si la composición tiene la forma de una alimentación completa, el nivel porcentual de proteína (contenido de proteína cruda) puede ser de aproximadamente 10 a aproximadamente 25%, más adecuadamente de aproximadamente 14 a aproximadamente 24% (o bien de aproximadamente 14 a aproximadamente 19%); mientras que si la composición tiene la forma de un concentrado, el nivel de proteína puede ser de aproximadamente 30 a aproximadamente 50%, más adecuadamente de aproximadamente 32 a aproximadamente 48%. Si la composición tiene la forma de una mezcla, el nivel de proteína en la composición puede ser de aproximadamente 20 a aproximadamente 30%, más adecuadamente de aproximadamente a aproximadamente 26% y si la composición tiene la forma de una mezcla base, el nivel de proteína en la composición puede ser de aproximadamente 55 a aproximadamente 65%. A menos que se indique lo contrario aquí, los porcentajes se presentan en una base en porcentaje en peso. La composición de forma alimenticia completa puede contener acemite de trigo, maíz, harina de soya, harina de gluten de maíz, granos de destilador o granos de destilador con macrominerales, sales, solubles, minerales menores y/o vitaminas. Otros ingredientes pueden incluir comúnmente, sin restringirse a estos ejemplos, harina de girasol, harina de cañóla, harina de semilla de algodón, harina de algodón entero, grano cervecero, harina de semilla de lino, brotes de malta y cascara de soya. La composición de forma concentrada contiene generalmente acemite de trigo, maíz, harina de soya, harina de gluten de maiz, granos de destilador o granos de destilador con macrominerales, sales, solubles, minerales menores y vitaminas. Ingredientes alternativos podrían incluir comúnmente, sin restringirse a estos ejemplos, harina de girasol, harina de cañóla, harina de semilla de algodón, harina de algodón entero, granos de cervecero, grano de semilla de lino, y brotes de malta. La composición de forma mezclada contiene generalmente acemite de trigo, harina de gluten de maiz, granos de destilador o graos de destilador con macrominerales, sales, solubles, minerales menores y/o vitaminas. Ingredientes alternativos podrían incluir comúnmente, sin limitarse a estos ejemplos, maíz, harina de soya, harina de girasol, harina de semilla e algodón, semilla de algodón entera, granos de cervecero, harina de semilla de lino, brotes de malta y cascaras de soya. La composición de forma de base contiene generalmente acemite de trigo, harina de gluten de maíz y/o granos de destilador o granos de destilador con solubles. Ingredientes adicionales incluirían habitualmente, sin limitarse a estos ejemplos, harina de soya, harina de girasol, harina de semilla de algodón, semilla de algodón entera, granos de cervecero, harina de semilla de lino, brotes de mal, macro-minerales, minerales menores y/o vitaminas. La composición en forma de alimento completo, la composición de forma concentrada, la composición de forma mezclada y la composición de forma de base pueden también incluir un producto que tiene un contenido incrementado de aminoácidos con relación a uno o varios aminoácidos seleccionados. En particular, el producto puede tener un contenido incrementado de aminoácidos con relación a uno o varios aminoácidos limitantes para producción de leche. El producto puede tener un contenido incrementado de aminoácidos debido a la presencia de aminoácidos libres en el producto y/o debido a la presencia de proteínas o péptidos que incluyen el aminoácido en el producto. Por ejemplo, el producto puede tener un contenido incrementado de histidina presente como aminoácidos libres y/o presente en proteínas ricas en histidina. Típicamente, el producto se deriva de una fuente no animal como por ejemplo microorganismos (por ejemplo, bacterias y levadura) y/o plantas. El producto puede incluir proteínas no animales y/o proteínas animales (por ejemplo, una proteína animal rica en histidina producida en bacterias, levaduras y/o plantas recombinantes. El producto puede tener un contenido incrementado de uno o varios aminoácidos en particular, uno o varios aminoácidos esenciales determinados como limitantes para la producción de leche. Los aminoácidos limitantes pueden incluir histidina, usina, metionina, fenilalanina, treonina, leucina, isoleucina, y/o triptófano, que pueden estar presentes en el producto en forma de aminoácido libre o como proteína o péptido rico en el aminoácido seleccionado. Por ejemplo, el producto puede incluir al menos una proteína rica en histidina. De conformidad con lo definido aquí, una proteína rica en histidina tendrá típicamente al menos aproximadamente 5% de residuos de histidina por residuos de aminoácidos totales en la proteína, y más típicamente, al menos aproximadamente 10% de residuos de histidina por residuos de aminoácido totales en la proteína. En modalidades adecuadas, una proteína rica en histidina puede tener al menos aproximadamente 15% de residuos de histidina y/o al menos aproximadamente 20% de residuos de histidina por residuos de aminoácido totales en la proteína. Un producto con un contenido incrementado de histidina tiene típicamente un contenido de histidina (incluyendo histidina libre e histidina presente en una proteína o péptido) de al menos aproximadamente 2.8% en peso con relación al peso del contenido total de aminoácidos del producto, (de conformidad con lo determinado por el contenido de proteína cruda del producto), y más comúnmente al menos aproximadamente 3.0% en peso, 4.0% en peso, y en modalidades adecuadas, 5.0% en peso con relación al peso del contenido total de aminoácidos del producto. Un producto con un contenido incrementado de histidina puede ser producido en un proceso de fermentación microbiana. En un ejemplo, una bacteria o levadura que sobre produce histidina se cultiva en un sistema de fermentación y el caldo de fermentación y/o la biomasa de fermentación son procesados adicionalmente con el objeto de producir un producto que tiene un contenido incrementado de histidina. El caldo de fermentación y/o la biomasa pueden ser secados (por ejemplo, secado por rociado) , con el objeto de producir el producto con un contenido incrementado de histidina. Una histidina o un producto que tiene un contenido incrementado de histidina puede ser al menos parcialmente purificado a partir del caldo de fermentación o biomasa lisada. Por ejemplo, histidina o proteínas ricas en histidina pueden aislarse con base en el punto isoeléctrico de la histidina y/o, la histidina puede ser aislada con base en la presencia de una porción imidazol en la molécula. De manera similar, la presencia de la histidina en una proteína rica en histidina puede utilizarse con el objeto de aislar la proteína, con base en el punto isoeléctrico de la proteína. En una modalidad, el punto isoeléctrico deseado para una proteína rica en histidina puede ser variado mediante la utilización de una tecnología recombinante para alterar la composición de aminoácido de la proteína (por ejemplo, para crear una proteína que tiene un contenido seleccionado de histidina y un punto isoeléctrico deseado) . El punto isoeléctrico único (pl) de la histidina en comparación con otros aminoácidos puede permitir una precipitación selectiva de histidina, extracción preferencial en solventes orgánicos o unión con varias matrices de quelación e metal o resina de intercambio de iones. Por ejemplo, el punto isoeléctrico (pl) único de la histidina podría resultar en valores de pl específicos y únicos para proteínas ricas en histidina permitiendo así una precipitación selectiva de estas proteínas de otras proteínas celulares para uso subsiguiente en alimentos para animales o para seres humanos. Las proteínas ricas en histidina pueden presentar propiedades de unión únicas que pueden facilitar el aislamiento de las proteínas. Por ejemplo, un segmento de seis (6) residuos de histidina se conoce como etiqueta o marcador de histidina que se une a metales de transición como por ejemplo níquel (Ni) y puede utilizarse para facilitar el aislamiento de la proteína (por ejemplo, por unión de una proteína marcada con histidina con una matriz que contiene níquel) . Además de níquel, se pueden utilizar otros metales de transición como por ejemplo cobre (Cu) . La porción imidazol de histidina puede también facilitar el asilamiento de histidina y/o proteínas ricas en histidina.

Por ejemplo, la porción imidazol puede permitir el uso de combinaciones únicas de cromatografía por exclusión de tamaño y resinas de intercambio de iones para aislar la histidina del caldo de fermentación que contiene otros aminoácidos y subproductos. Las proteínas ricas en histidina pueden ser seleccionadas entre las proteínas ricas en histidina descritas en la literatura, como por ejemplo la proteína rica en histidina II de Plasmodium falciparum y/o una o más de las proteínas de la clase de proteínas conocidas como "histatinas", que demuestran actividades antibacterianas y antifungales . Una proteína rica en histidina puede también comprender fragmentos específicos de proteínas ricas en histidina conocidas que tienen un contenido incrementado de histidina en comparación con la proteína nativa de longitud completa. Por ejemplo, la proteína rica en histidina II de Plasmodium falciparum tiene una composición de histidina de aproximadamente 32%. Sin embargo, el fragmento de esta proteína desde el aminoácido 61 hasta el aminoácido 130 tiene una composición de histidina de aproximadamente 44%, y el fragmento de esta proteína desde el aminoácido 58 hasta el aminoácido 80 tiene una composición de histidina de aproximadamente 55%. Una proteína rica en histidina no requiere de conservar su función activa para que sea adecuada para las composiciones o métodos descritos aquí.

Las proteínas ricas en histidina pueden tener la forma de proteínas recombinantemente manipuladas. Por ejemplo, como se observó arriba, motivos de poli-histidina que se conocen como "etiquetas de histidina" se agregan comúnmente a las proteínas con el objeto de ayudar en la purificación puesto que los motivos de poli-histidina se unen a metales de transición tales como níquel. Sin embargo, las proteínas recombinantemente manipuladas pueden tener un contenido incrementado de otros aminoácidos además de la histidina. En particular, las proteínas pueden tener un contenido incrementado de uno o varios de los aminoácidos esenciales, o bien las proteínas pueden tener un contenido incrementado de uno o varios de los demás aminoácidos limitantes para la producción de leche, que pueden incluir usina, metionina, fenilalanina, treonina, leucina, isoleucina, y triptófano. Como tales, las proteínas recombinantemente manipuladas pueden ser diseñadas para incluir un perfil seleccionado de aminoácidos. Además de los aminoácidos limitantes para la producción de leche, las proteínas pueden ser manipuladas para contener residuos de cisteína para permitir la formación de enlaces di-sulfuro intramoleculares y/o intermoleculares. Las proporciones de los aminoácidos en las proteínas recombinantemente manipuladas pueden ser variadas o diseñadas para corresponder a las proporciones predichas como óptimas para el ganado lechero con base en estudios de alimentación o predicciones. En una modalidad, el perfil seleccionado de aminoácidos, por ejemplo, en una proteína producida recombinantemente es similar al perfil de harina de sangre. Después del diseño de una proteína y después que gen haya sido clonado en un vector de expresión, la proteína puede ser expresada (o sobre-expresada) en un sistema recombinante empleando un hospedero microbiano (tales como E. coli . , Corynebacterium , Brevibacterium . Bacillus, levadura) , plantas y similares. Con el objeto de optimizar la expresión de la proteína en el hospedero, el gen que codifica las proteínas puede ser diseñado con el objeto de utilizar ARNt específicos prevalecientes en el hospedero. Alternativamente, ARNt seleccionados pueden ser co-expresados en el hospedero con el objeto de facilitar la expresión de la proteína. Las proteínas manipuladas recombinantemente pueden incluir secuencias específicas para facilitar la purificación de las proteínas. Por ejemplo, las proteínas pueden incluir etiquetas de histidina. Las proteínas pueden también incluir "secuencias líderes" que enfocan la proteína hacia ubicaciones específicas en la célula hospedera como por ejemplo periplasma, o bien que enfocan la proteína para secreción. Por ejemplo, la célula hospedera puede ser una bacteria, y la proteína puede incluir una secuencia de señales de secreción abacteriana como por ejemplo la secuencia de señal de secreción de pectato liasa. Las proteínas recombinantemente manipuladas pueden incluir también sitios de disociación de proteasa con el objeto de facilitar la disociación de las proteínas en el abomaso e incrementar el suministro de aminoácidos en la proteína al intestino delgado. Por ejemplo, una proteasa de este tipo es pepsina, una de las enzimas de digestión de proteína del abomaso en ganado. La pepsina demuestra una disociación preferencial de péptidos en residuos hidrofóbicos, preferentemente aromáticos en las posiciones Pl y Pl' . En particular, la pepsina disocia proteínas en el lado caraboxi de residuos de fenilalanina, triptófano, tirosina, y leucina. Como tal, la proteína puede incluir uno o varios sitios de disociación de pepsina. En otro ejemplo, el producto puede incluir proteínas ricas en histidina aumentadas con péptidos o proteínas que tienen un contenido incrementado de otros aminoácidos, en particular aminoácidos limitantes. Por ejemplo, un producto puede incluir una o varias proteínas que tienen un contenido incrementado de uno o varios de los mismos aminoácidos o aminoácidos diferentes. Como tal, el producto puede incluir múltiples proteínas, péptidos, y/o aminoácidos. Las proteínas o péptidos ricos en histidina pueden ser sobre-expresados en un hospedero microbiano (como por ejemplo especies de Escherichia , Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, levadura), plantas y similares. Una biomasa microbiana entera puede ser secada por rociado y utilizada en el alimento para animales o las proteínas ricas en histidina y proteínas o péptidos relacionados pueden ser al menos parcialmente purificados a partir de la biomasa. Alternativamente, cuando el hospedero microbiano excreta histidina y/o una proteína rica en histidina, el caldo enriquecido en histidina puede ser separado de la biomasa producida por la fermentación y el caldo aclarado puede ser utilizado como ingrediente para alimentos para animales, por ejemplo, ya sea en forma líquida o bien en forma secada por rociado. En una modalidad, proteínas ricas en histidina pueden ser purificadas mediante la unión de las etiquetas en las proteínas con una matriz que incluye el metal níquel. Puede ser deseable utilizar hospederos microbianos que no contienen lipopolisacáridos ("LPS") que tienen efectos endotóxicos, por ejemplo una bacteria Gram positiva, como por ejemplo Corynebacteria y Brevibacterium . Bacterias Gram negativas tales como E. coli, incluyen frecuentemente LPS que tienen un efecto endotóxico. La selección de una bacteria, que no incluye LPS endotóxico puede ser particularmente importante cuando se debe preparar una biomasa la cual debe ser utilizada como fuente de histidina, puesto que la mayoría de LPS permanece asociado con la bacteria y no se libera sustancialmente en el caldo de fermentación a menos que se efectúe una lisis de la bacteria. Como tal, LPS endotóxico debería localizarse dentro de la biomasa después de fermentación. El producto puede incluir ingredientes que han sido tratados para facilitar la protección durante el pasaje en el rumen. Por ejemplo, el producto puede incluir histidina tratada y/o proteínas ricas en histidina tratadas. La histidina y/o la las proteínas ricas en histidina pueden reaccionar con uno o varios carbohidratos reductores (por ejemplo, xilosa, lactosa, glucosa, y similares) . En varias modalidades, la histidina y/o proteínas ricas en histidina pueden ser recubiertas con compuestos poliméricos, proteína formalizada, grasa, mezclas de grasa y calcio, mezclas de grasa proteína, o bien con sales de metales de ácidos grasos de cadena larga. La histidina y/o las proteínas ricas en histidina pueden ser recubiertas con aceites vegetales (como por ejemplo, aceite de soya), que pueden ser modificados. Por ejemplo, la histidina y/o las proteínas ricas en histidina pueden ser cubiertas con aceites vegetales al menos parcialmente hidrogenados. En particular, la histidina y/o proteínas ricas en histidina pueden ser recubiertas con una mezcla de sales de metal de un ácido graso (por ejemplo, estearato de zinc) y un ácido graso (por ejemplo, ácido esteárico) . Histidina y/o proteínas ricas en histidina pueden también estar recubiertas con polímeros sensibles al pH. Un polímero sensible al pH presenta estabilidad a pH ruminal, pero se descompone cuando se encuentra expuesto abomasal, liberando la proteína para digestión en los abomasos y absorción en el intestino delgado. En un aspecto, el método divulgado incluye varios pasos. Primero, se sintetiza un aminoácido o una proteína rica en uno o varios aminoácidos. Como se indicó arriba, un aminoácido adecuado puede ser histidina y una proteína adecuada puede ser una proteína rica en histidina. El aminoácido y/o la proteína rica en aminoácido puede ser sintetizado utilizando un sistema de fermentación microbiana, con el objeto de producir una biomasa de fermentación, la cual puede ser secada (por ejemplo, secada por rociado) con el objeto de proporcionar una biomasa de fermentación secada. Alternativamente, el aminoácido y/o la proteína pueden estar presentes en el caldo de fermentación que puede estar separado de la biomasa de fermentación (por ejemplo, a través de filtración) y secada por rociado con el objeto de producir un caldo de fermentación que tiene un contenido incrementado del aminoácido y/o proteína. Además, el aminoácido y/o la proteína rica en aminoácido puede ser aislado al menos parcialmente purificado ya sea a partir de la biomasa y/o a partir del caldo antes de la preparación de un producto secado. La biomasa de fermentación secada, caldo de fermentación secado, y/o producto secado pueden ser recubiertos con un recubrimiento con el objeto de proporcionar un producto recubierto y/o tratado (por ejemplo, por reacción de la biomasa de fermentación tratada, caldo de fermentación secado, y/o producto secado con un carbohidrato reductor por ejemplo xilosa) . El recubrimiento puede ser hidrofóbico. El recubrimiento y/o tratamiento pueden proteger el producto y permitir que pase a través del rumen con degradación reducida y suministrar al menos- una parte del producto al abomaso y/o intestino delgado. Como tal, el recubrimiento y/o tratamiento permiten que los productos recubiertos y/o tratados estén protegidos durante el pasaje en el rumen (es decir, permite un pasaje sin afectación en el rumen) . El producto recubierto y/o tratado puede ser alimentado a un rumiante con el objeto de mejorar la producción de leche así como mejorar la composición proteínica de la leche. BRVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una representación esquemática de un modelo para crecimiento microbiano. NDF - "fibra detergente neutral"; NFC - carbohidratos no fibrosos"; VFA - "ácidos grasos volátiles"; RDP - "proteína degradable en el rumen"; rH - "pH del rumen". La Figura 2 es una representación esquemática de un proceso de disco giratorio típico para encapsular productos. La Figura 3 muestra la tasa de degradación de histidina versus la concentración de histidina in vi tro para histidina libre e histidina recubierta. DESCRIPCIÓN DETALLADA La histidina se considera un aminoácido limitante de tasa primario en la alimentación de rumiantes y su concentración en alimentos para animales se correlaciona directamente con la producción de leche en vacas lecheras. Se utiliza actualmente harina de sangre en alimentos para animales y es una fuente rica de histidina. Además, la histidina presente en harina de sangre no es significativamente degradada en el rumen. Reemplazos para harina de sangre no presentan un contenido similar de histidina y un alimento sin harina de sangre debería ser complementado con histidina para satisfacer los requisitos de suministro de aminoácidos. Además, conforme se elevan los rendimientos de leche existe un incremento correspondiente en cuanto a los requisitos de otros aminoácidos además de la histidina. Este incremento en estos requisitos de otros aminoácidos debe satisfacerse también. La proteína debe escapar a la degradación ruminal y pasar al intestino delgado para suministrar cantidades suficientes de aminoácidos. Los métodos primarios desarrollados para evitar la digestión fermentativa de aminoácidos incluyen (1) recubrir un producto que tiene un contenido incrementado de aminoácidos con una composición que protege el producto contra degradación en el rumen y (2) manipulación estructural del aminoácido para producir análogos de aminoácidos que demuestran una degradación reducida en el rumen. Residuos de histidina individuales serán más fácilmente degradados en el rumen que la histidina presente en proteínas o péptidos y como tal, proteínas ricas en histidina pueden proporcionar una ventaja en comparación con residuos de histidina sola. Además, proteínas con estructura secundaria o terciaria significativa (por ejemplo, enlaces di-sulfuro) pueden presentar una mejor protección en el rumen. Además de proporcionar una fuente de histidina para alimentos para rumiantes, las proteínas ricas en histidina pueden parecerse estrechamente a las proteínas "ricas en histidina" presentes en harina de sangre. Por ejemplo, una harina de sangre puede incluir la cadena hemoglobina alfa bovina, SwissProt. No. de Acceso P01966, que tiene un contenido de histidina mayor que 7% (residuos de histidina/residuos totales) y la secuencia de aminoácidos: i pivlsaakgp vkaawgvgg haieygaaal eriflsfptt tyfphfdlG SI hgsaqtkfhg alcwaalka vehlddlpga iuelsdlhah irv?pvnfk 101 llßßllvtl ülpsftp AVasllcfl ajwstvlegk yx Otras proteínas ricas en histidina son conocidas a partir de la literatura e incluyen la proteína rica en histidina II de Plasmodium falciparum, No. de Acceso AAC47453, que tiene un contenido de histidina superior a 32% (residuos de histidina/residuos totales) y la secuencia de aminoácidos: 1 mvifakftkvl aaavfaivll ldnnfisafan plCÉk?iakfl nlfikrllhet SI qahvdaha hhvadahab haada hahh aada aha aáahhahaa 101 ddhhahhaa ahhhaaa hfthhaófc haAdfthbaay hhah ada 1S1 bahaed ' baadabaay aWiat&aada adahhac dahahaad 20i adaMmtdato ha*4al?haad ahhatd íAa adahhatda 251 aadakaad ahatdabha hhaadahas ahhatdaha tdahhaaahh 301 eaathclrh Como se observó arriba, fragmentos de proteína pueden ser adecuados como proteínas o péptidos ricos en histadina. Por ejemplo, proteínas pueden ser truncadas en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal para crear una proteína rica en histadina, en donde la proteína incluye una secuencia de aminoácidos interna rica en histadina. Fragmentos pueden ser de cualquier longitud, sin embargo, fragmentos particularmente adecuados pueden incluir al menos aproximadamente 20 aminoácidos. El fragmento desde el aminoácido 61 hasta el aminoácido 130 de la proteína II rica en histidina de Plasmodium falciparum tiene un contenido de histidina de aproximadamente 44% (residuos de histidina/residuos totales) , y el fragmento de esta proteína desde el aminoácido 58 hasta el aminoácido 80 tiene un contenido de histidina de aproximadamente 55%. Como tales, estos fragmentos pueden ser proteínas ricas en histidina particularmente adecuadas.

Otra proteína rica en histidina es la glicoproteína rica en histidina de Mus musculus, No. de Acceso AAH11168, que tiene un contenido de histidina superior al 10% (residuos de histidina/residuos totales) y la secuencia de aminoácidos: 1 fflkvlttalll vtlqcihals ptnsdatepl aekvldlín grrigvfel 51 Irvßdabldr egtatvyyla Idviesécwv latkaqddcl parwqseivi 101 ggekvlatry aneaqdlßvn gyncttesve ßalrntkdBp vlldffedse 151 lyrkqarkal dkykcd?gdf asfrveraer virarggert nyyvefßra 201 cseqhfprßp ivfgfcrall stiß&udl tpdaidince Yf?iedhkdt 251 gdm b^lic rpledklilck Itgßrdhhht hkfdklgcpp ppagkdaBdr 301 prlqegaipq Ippgypplisg anrthrpßyirheciiehpehg hrpghpbB 351 hhppgiihsg hhpghphe hhehghhppg hhphghhphg hphghhpfag 401 hhphgbdfld ygpcdppfns qelkgqyrg ygppHgsrk rgpgkglfpf 451 Ipplnigevl tlpßftfifpflf ilpncarilq peíqpfpqta 501 §rßcpgkf«s efpqiakffg ytppk El fragmento de esta proteína desde el aminoácido 331 hasta el aminoácido 446 tiene un contenido de histidina superior al 50% ( (residuos de histidina/residuos totales) y como tal este fragmento puede ser una proteína rica en histidina particularmente adecuada. Otra proteína rica en histidina es la nodulina actinorizal AgNOD-GHRP de Alnus glutinosa , No. de Acceso AAD00171, que tiene un contenido de histidina de aproximadamente 15% (residuos de histidina/residuos totales) y la secuencia de aminoácidos: i ingyakeflll glafa lll aedvaaißla vaaqtkenmq tdgvttdXyh 51 fh h g gh fhvfegsgneh ghghhfagrgh pghgaaadefc «tetttugo El fragmento de esta proteína desde el aminoácido 50 hasta el aminoácido 83 tiene un contenido de histidina superior al 44% (residuos de histidina/residuos totales) y como tal, este fragmento puede ser una proteína rica en histidina a particularmente adecuada. Otra proteína rica en histidina es la proteína de enlace con calcio rica en histidina humana, precursor, No. de Acceso AAH69795, que tiene un contenido de histidina de aproximadamente 12% (residuos de histidina/residuos totales) y la secuencia de aminoácidos: 1 raghhrpwl a ervlvagvaßl llppamttjql rgdglgfrnr nnßtgvagls 51 eeaeaelrhh Ihaprdfapde nkdvsfcengh hfvebp ?e ededvßkeyg 101 h?l gftr& g hkvgáegvsg eevfaetggq argfcrggse dte?saehr 151 hlpBhnhsh qdfidedewi ߀hhhilrb ghrghdgedd egeeeeseee 201 eeee ateyg qahrhrghg Geededvsdg hft gpsfarh qg eeddddd 251 dddddddddd dvB?eyrhqa hr qggiee dedvedghhh rdpohrhrsh 301 eßddnddddv fteyghqar faqdhrkßeve avßgetóilihv pdhrhqgíird 351 «eedtdvste hqgpqhv hglvdeatea ©eltvqfghy vaeliqprgk 401 ediedfqdey ktevphi&li rvpreedeev aaßlghqapi ferqthqdeat 451 g gqrgßike mßhhppghtv vkdrahlrkd dseeekekee dpgaheedde 9 eseqgegc ftgerdqdee deeeghglal nqeeeeeßdk eeeeeeedee 551 rrteravga plapdhsßßß eeaeegleedeprftiípnp Idrreeagga 601 ßaee.eigadt gpqdaqeygn ^alge afcnrcteco schceenrag 651 e edqcqhcq fcyicplvce tveapgßyvd yfeßBlyqal admlßtpep El fragmento de esta proteína desde el aminoácido 211 hasta el aminoácido 371 tiene un contenido de histidina superior al 22% (residuos de histidina/residuos totales) , y como tal, este fragmento puede ser una proteína rica en histidina particularmente adecuada. Otras proteínas ricas en histidina incluyen la clase de proteínas que se conocen como "histatinas". Las histatinas son proteínas ricas en histidina que ocurren en la saliva y tiene propiedades antifungales y antibacterianas. Véase por ejemplo, Neuman et al., (1996) Electrophoresis 17 : 266-270. Estas proteínas o péptidos ricos en histidina pueden utilizarse como fuente de histidina en alimentos para animales, por ejemplo alimentos para animales para ganado lechero. Puesto que las histatinas tienen propiedades antifungales y anti-antibacterianas, además de servir como fuente de histidina, las histatinas pueden proporcionar a los alimentos para animales una vida de anaquel más larga. Demanda de Aminoácidos . Se pueden suministrar aminoácidos limitantes a un animal para incrementar la producción de un producto animal seleccionado (por ejemplo, leche) mediante el hecho de suplementar el alimento para animal con el aminoácido limitante. Los aminoácidos limitantes pueden ser identificados mediante el análisis del perfil de aminoácido del producto animal seleccionado (es decir, el perfil resultante) y comparar este perfil con el perfil de aminoácidos suministrados al animal (es decir, el perfil inicial) . Métodos para determinar los requisitos de aminoácidos se conocen en la técnica y se describen en la Patente Norteamericana No. 5,145,695 y en la Patente Norteamericana No. 5,219,596, que se incorporan por referencia aquí en sus totalidades. Suministro de Aminoácidos. Los rumiantes derivan los aminoácidos de dos fuentes: (1) proteína microbiana de conformidad con lo determinado por crecimiento microbiano; y (2) proteína que permanece no degradada en el rumen (es decir, "proteína no degradada en el rumen" o "RUP") . El crecimiento microbiano puede ser predicho con base en los carbohidratos disponibles para fermentación en el rumen (por ejemplo, almidón, azúcar, fibra detergente neutral, pectina, y beta-glucano) , el suministro de proteína degradable en el rumen, y el pH del rumen. Puesto que las proteínas microbianas no son totalmente digeribles, el suministro de aminoácidos microbianos proporcionados por la proteína microbiana puede ajustarse con base en la digestibilidad de la proteína con el objeto de proporcionar un valor de aminoácidos microbianos digeribles. La segunda fuente de aminoácidos es ingredientes alimenticios que permanecen no degradados después de pasar del rumen al abomaso (es decir, la fracción de proteína de desvío) . Los aminoácidos dentro de un ingrediente alimenticios son procesados y utilizados (es decir, degradados) por microbios en el rumen a velocidades diferentes. Como tales, aminoácidos diferentes tendrán valores de aminoácidos esenciales no degradables '("UEAA") diferentes. Además, un valor de UEAA puede ser ajustado con base en la digestibilidad de un aminoácido en el intestino delgado para proporcionar un valor de UEAA digerible. La cantidad de aminoácidos esenciales que pasan del rumen puede determinarse utilizando las técnicas descritas en Craig et al., "Amino Acids Released During Protein Degradation by Rumen Microbes", (1984) Journal of Animal Science, 58:436 - 443. La suma de los aminoácidos microbianos digeribles y de los UEAA digeribles es la contribución de aminoácidos digeribles que se proporcionará al intestino delgado. En el caso de vacas lecheras, se conoce frecuentemente como aminoácido digerible lechero ("ddAA") para el aminoácido en cuestión, por ejemplo, histidina digerible lechera ("ddAA HIS") . En formulaciones para alimentación, la contribución predicha de aminoácidos microbianos de la fermentación del rumen se resta de los requisitos del animal en cuanto a aminoácidos, de conformidad con lo determinado por el perfil del animal. Las cantidades de aminoácidos que deben ser suministradas como UEAA' s a partir del alimento son la diferencia entre los requisitos del animal en cuanto a aminoácidos y los aminoácidos suministrados a partir de los aminoácidos microbianos digeribles. El perfil de aminoácidos de la leche puede compararse con el perfil de aminoácidos producidos por microbios dentro del tracto digestivo del animal (es decir, perfil de aminoácidos microbianos) . Las diferencias entre los perfiles de aminoácidos microbianos y de aminoácidos de la leche indican donde los aminoácidos pueden estar en exceso o limitantes. Sin embargo, esta comparación de perfil de aminoácidos proporciona solamente una parte de la información requerida con el objeto de incrementar la producción de un producto animal seleccionado. La eficiencia con la cual el cuerpo incorpora los aminoácidos en el intestino delgado en un producto animal seleccionado debe también tomarse en cuenta. Mediante la determinación de la proporción entre perfil de aminoácidos resultantes/perfil de aminoácidos iniciales y determinando la eficiencia de incorporación, se pueden determinar los requisitos en cuanto a aminoácidos digeribles lecheros. Se ha establecido que la histidina, usina, metionina, fenilalanina, y treonina serán probablemente los aminoácidos limitantes para la producción de leche en vacas lecheras. Una determinación similar puede efectuarse para el perfil de aminoácidos de músculo. Síntesis de productos ricos en histidina. Productos ricos en histidina pueden incluir productos que tienen un contenido mejorado de histidina en forma de aminoácido libre o en forma de productos que incluyen proteínas ricas en histidina. Los productos ricos en histidina pueden ser producidos por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo un caldo de fermentación rico en histidina puede ser utilizado como fuente de histidina. El caldo de fermentación rico en histidina puede ser producido por organismos unicelulares (por ejemplo, microorganismos tales como bacterias o levaduras) y/o plantas seleccionadas o manipuladas para sobre producir histidina. Microorganismos adecuados pueden incluir microorganismos que pertenecen al género Eschrichia , Bacillus, Microbacterium . Arthrobacter , Serra tia , y Corynebacterium . Se sabe que bacterias gram negativas producen lipopolisacáridos ("LPS"), que son endotoxinas. Como tal, puede ser deseable seleccionar una bacteria gram positiva como células hospedera (por ejemplo, Corynebacteria y jBrevijacteria) , particularmente cuando se debe preparar una biomasa. Puesto que la mayoría de LPS permanece asociada con la célula hospedera y no es liberada en el caldo de fermentación antes de la lisis de la célula hospedera, bacterias gram negativas tales como E. coli pueden ser adecuadas para la producción de un caldo de histidina. El caldo de fermentación rico en histidina puede ser secado por rociado y utilizado directamente como fuente de histidina o bien el caldo puede ser concentrado. En otra modalidad, la histidina puede estar al menos parcialmente purificada a partir del medio de fermentación y biomasa. La histidina producida por microbios puede ser entonces preparada con base en tecnología de protección durante pasaje en el rumen y agregada a la alimentación en el nivel requerido. Alternativamente, microbios pueden ser manipulados para acumular y conservar histidina y los microbios pueden ser preparados como un producto de biomasa secada por rociado. Opcionalmente, la biomasa puede ser separada por métodos conocidos como por ejemplo, separación, decantación, una combinación de separación y decantación, ultrafiltración o microfiltración. El producto de biomasa puede ser tratado adicionalmente para facilitar la protección al pasar por el rumen. En una modalidad, el producto de biomasa puede ser separado del medio de fermentación, secado por rociado, y opcionalmente recubierto para facilitar la protección durante el pasaje en el rumen, y agregado al alimento como fuente de histidina. En una modalidad adicional, microbios pueden ser manipulados para producir proteínas ricas en histidina. Las proteínas ricas en histidina pueden incluir proteínas conocidas y caracterizadas (por ejemplo, proteína II rica en histidina de Plasmodium falciparum y/o histatinas) y proteínas manipuladas (por ejemplo proteínas diseñadas de tal manera que tengan un perfil de aminoácidos seleccionados) . Por ejemplo, una proteína II rica en histidina de Plasmodium falciparum o una histatina seleccionada puede ser clonada en un vector de expresión e introducida en una célula hospedera adecuada. Alternativamente, una proteína recombinantemente manipulada que tiene un perfil de aminoácidos seleccionados puede ser clonada en un vector de expresión e introducida en una células hospedera adecuada (por ejemplo, microbio) . Las proteínas ricas en histidina pueden ser secretadas en el medio de fermentación, o bien alternativamente las proteínas ricas en histidina pueden acumularse en los microbios. Los microbios pueden ser preparados como producto de biomasa secado por rociado, o bien las proteínas o péptidos ricos en histidina pueden ser aislados de la biomasa microbiana con el objeto de proporcionar un producto rico en histidina. De cualquier manera, el producto rico en histidina puede ser tratado adicionalmente con el objeto de mejorar la protección durante el pasaje en el rumen. El producto tratado puede ser agregado al alimento como fuente de histidina. Construcción y expresión de una proteína rica en histidina (HRP) o péptido rico en histidina en un huésped microbiano, Escherichia coli . La construcción de un constructo de proteína rica en histidina HrcpET30 (Xa (LIC) , puede efectuarse de la manera siguiente. Cebadores son diseñados con salientes compatibles para el vector pET30 (Xa/LIC) (Novagen, Madison, I) para la clonación del gen de proteína de enlace con calcio rico en histidina de Mus musculus { Hrc) . El vector pET tiene un overghang de una sola cadena de 12 bases en el lado 5' del sitio Xa/LIC y una saliente de una sola cadena de 15 bases en el lado 3' del sitio Xa/LIC. El plásmido está diseñado para clonación independiente de clonación, con marcadores His y S e extremo N-terminal y un marcador His de extremo C-terminal opcional. El sitio de reconocimiento de Xa proteasa (IEGR) se encuentra delante del codón inicial del gen de interés de tal manera que se puedan remover los marcadores de proteína de fusión. Los siguientes cebadores pueden ser adquiridos para clonación pET30 Xa/LIC del gen Hrc de Mus musculus : Directo 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGGGCTTCCAGGGGCCATGG-3' y reverso 5'AGAGGAGAGTTAGAGCCTCACGACCTGTTCTGTTCTC 3' . La secuencia de ácidos nucleicos del gen Hrc de Mus musculus y secuencia de proteína correspondiente están disponibles en GenBank, No. e Acceso BC021623, de conformidad por lo presentado por Strausberg et al. Proc . Na ti . Acad. -Sci . U. S . A. 99 (26), 16899-16903 (2002), y se presentan en las Tablas 1 (secuencia de ADN del gen) y 2 (secuencia de aminoácidos de la proteína codificada) . Es posible diseñar cebadores que son internos al gen Hrc de tal manera que el péptido generado tenga un porcentaje mayor de residuos de histidina por aminoácidos totales que la secuencia de proteína nativa. TABLA 1 Secuencia de ADNc de ARNm de proteína de enlace con calcio rica en histidina de Mus musculus l ccBcg?gt'cc gceaagacct, gaggaagata ga§geaga f&gtgggag? fcafcacc&cga 51.caaaagggac aatctgaaag tcaaag??aa aaaggcacaa ggaeceatca gaggcagctg 121 aagecageet ggtcagaegc eeagctgeta aaegcecca j gcECC ggggccatgg lil ífegeicact gfcotcetttg ggccacagtg gecatcetge tfffceeefccc agtgftgacc 241 caggagttga gaggtgccgg tetgggcetg gfcddc&tgi acaacßacgc aggcatccot m ggtC?cag aggacctatc actagktt ggteaceaca tccacegggg atatcaaggt Hl gagaaggaca gaggccacagagaagagggt gaagactct eeagggaae tgge cagg 42} gescaagacc aeaggtac?c tggccgcgag gttigagagg igiattgtg tgaagaggtc 411 tteagttgge atgtagaca gctccacggg «ccgggiae agacaatg gatttagga 541 gictcggcag agaaeeaect eeeeagaeag agagccaea gccacgaaga tgaggatggc 601 attgteteea gfcgagtatea ccgtcacgte eeeaggcatg ceeaceaegg ccactgagag gaagatgatg aegatgatgg aggagaggag gaggagaggg tggatgtgat ggaggaceel 721 gatga atg aacaccaggt ccatggtcae cigagccact saaaggagag agatgaactc 111 catcatgccc acagccaeag gcaccaaggc cacagfcgatg atgacgafcga cgaLggtgtc 81 tcUctgagß aggacicca agctca?aaa ßtcggatc atgagagga sgatgatggg 90 gae&eagifcg aagaeagtca eaeeeaeaga gttcaaggcc gagaagafega asatgatgat m gaaeggtg actctggtga ataeagacac eataccca$0 accacc?gg caacaacgaa 1^)21 g&gcaagatg acgatgstgs tgatgatgat gitgatgaag ataaigaaga ctccactgag 1031 caccggcacc agaeeeaagg ccacaggaag gaagaagatg aggatgagtc agatgaagac 1141 gatearcatg rctccasgca tggacgccaa ggctafcgaag aagaagaaga tgatgatgat 1201 gatgfcgga atgatgaclc tacfcgafcat gtgcaeeaag cccacagaca eagigaccat 1261 gagcacaaag afcgatgagia tgactcagaa gaagactace ateatgtcec cggagtcctc 1321 cggafctgctc tctcgactg? eagtggggea fecgctgcct aefeeagcgcc ttgecteaac BI tccccc&tc gtaceaacae eeecfettacc cwgtgtg gg? ga aeagaacafg 1441 tcgtgaagec agcaiagasa agttcftgtog cgtttggaá eettcttttt tttttaatca 1501 aatcgacaac aaacaetaaa ae ttsct tcaaaaaf a?gttaaaaa fcfetaaaaag 1S61 tatatgiget teatgggact aactcatcgc eticcctgc gtacttcaga ttgtagccat Ull acttttaaaa aaaaaggcaa agaggataae gacattttct accagtattg egaataaaet 1611 tgaaeieaia taeagaagtt c tgtectg tcttcagtfcg tagaagttgt cccctgcaag 1741 gtacaacc&c ccacttgaác tt?ctctcat gaeacaifcce acaattetit aagggaatca lddl gcgcecacgt ewcgatat a atttat gtgtaaetta atgggafcttg aatatggt iiSi gagtctgctftaaacetttt ittatctatc tggtgatct€ gttacctec tgtetagtgg 152 gctttggatc ceecctgtta gtletectg tggtcicatt tagaaafccca ajgtttgggt lili aagietcecc cteceea c ettttetcw attcatggal ttagcccegt ggtagcatgt 2041 taaacgatfca taatgaaaca getgaiciaa aacattefcfca aggtaaaata aaaattfca&a 2101 tacaattagt aaaaaaaaaa aaaaaaa TABLA 2 Secuencia de aminoácidos de proteína de enlace con calcio rica en histidina de Mus musculus MGF?GPWLHTC WATVAI LLVPPVVTQELRGAG GLGNWNNNAG? PGSSED STEF GHHIHRSYQGEKDRGHREEGEDFSREYGHRVQDHRYPGREVGEENVSBEWRGHVRQ LHsHREHDNE sDSAßNH PRQRSH£5HEOED0IVSSEYHRKVPRKAHHGHGEEDDD D1X5GEBEERVDVMEDSDDNBHQVHGHQSHSKERDELHHAHSKRHQGHSDDDDDDGVS TEHGHQAHRYQDHEEEDDGDSDEDSHTHRVQGREDENDDEDGDSGEYRHHTQDHQGH NEEQDDDDDDDDDDEDKEDSTEKRHQTQGHRKEEDEDESDEDDHHVSRHGRQGYEEE EDDDDDDGDDDSTEHVHQAHRHRDHEHKDDEDDSEEDYHHVPGVLRIALSTASGAAA AYSAPC FP1STNTPFTLVWSLREQNRS Se reporta que alteraciones de concentraciones de ARNt y aminoacil-ARNt sintetasas influencian la biosíntesis de aminoácidos. Además, ARNt puede tener efectos importantes sobre la expresión y sobre-expresión de genes heterólogos en sistemas de expresión microbianos a través de una traducción reducida y errores en secuencias de aminoácidos de productos de proteína. (Véase, por ejemplo, O'Neill et al., J. Bacteriol . 1990 Nov; 172 (11) : 6363-71) ; Smith, et al., Biotechnol Prog. 1996 Jul-Aug; 12(4); 12 (4) : 417-22) ; Dieci et al., Protein Expr Purif. 2000 Apr;18 (3):346-54). Así, para incrementar la expresión de las proteínas ricas en histidina por ejemplo, sería benéfico expresar simultáneamente el gen histidil-ARNt correspondiente también. Es también posible diseñar cebadores para introducir el gen Mus musculus Hrc en un operon con HisSpET30 Xa/LIC de tal manera que tanto la proteína de unión con calcio rica en histidina como la histidil-ARNt sintetasa sean co-expresadas . Según la fuente de proteína rica en histidina específica, el sesgo del codón del gen respectivo podría ser cambiado para corresponder al uso de codón de microbio hospedero con el objeto de lograr una expresión más alta de proteínas heterólogas. (Véase, por ejemplo, Baca et al., Int ' l J. of Parasi tology. 30:113-118). Tablas de empleo de codón están disponibles en muchas fuentes. El ARNm de enlace con calcio rico en histidina de Mus musculus (clon de ADNc MGC: 13723 IMAGE: 3979848) se adquiere en ATCC, número de catálogo MGC-13723. Todas las enzimas de restricción se compran en New England BioLabs (Beverly, MA) . Cebadores son sintetizados por Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) a menos que se indique lo contrario. A continuación se presenta una versión de protocolo de reacción en cadena de polimerasa (PCR) que puede utilizarse para amplificar el gen Hrc de Mus musculum . En una reacción de 50 µL se agregaron 0.1-0.5 µg de templado, 1.4 µM de cada cebador, 0.4 mM de cada dNTP, 3.5 U de polimerasa Expand High Fidelity™, y amortiguador lx Expand™ con Mg2+ (Roche, Indianapolis, IN) . El programa de termociclador seleccionado incluye un arranque caliente a una temperatura de 96°C durante 5 minutos, seguido por 29 ciclos que incluyen los pasos siguientes: 94°C durante 30 segundos, 40-65°C durante 1 minuto (termociclador de gradiente) y 72°C durante 2 minutos. Después de los 29 ciclos, la muestra es mantenida a 72°C durante 10 minutos y después almacenada a 4°C. El producto de reacción en cadena de polimerasa (PCR) es purificado en gel a partir de geles de TAE agarosa al 0.8 ó 1% utilizando un kit de extracción de gel Qiagen (Valencia, CA) . El producto de reacción en cadena de polimerasa (PCR) es cuantificado por comparación con estándares en el gel de agarosa, y después tratado con T4 ADN polimerasa siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante para Clonación Independiente de Ligación (Novagen, Madison, I).

En resumen, se trata aproximadamente 0.2 pmol de producto de reacción en cadena de polimerasa purificado con 1 U T4 ADN polimerasa en presencia de dGTP durante 30 minutos a una temperatura de 22 °C. La polimerasa remueve bases sucesivas desde los extremos 3' del producto de reacción en cadena de polimerasa. Cuando la polimerasa encuentra un residuo de guanina, la actividad 5' a 3' polimerasa de la enzima contrarresta la actividad exonucleasa para evitar efectivamente una escisión adicional. Esto crea salientes de una sola cadena que son compatibles con el vector pET Xa/LIC. La polimerasa es desactivada mediante incubación a una temperatura de 75°C durante 20 minutos. El vector y el inserto tratado son fusionados de conformidad con lo recomendado por Novagen. Aproximadamente 0.02 pmol de inserto tratado y 0.01 pmol de vector son incubados durante 5 minutos a una temperatura de 22 °C; se agrega EDTA 6.25 mM (concentración final); y la incubación a 22°C es repetida. La reacción de fusión (lµL) se agrega a células competentes NovaBlue™ Singles (Novagen, Madison, WI), e incubada en hielo durante 5 minutos. Después de mezclado, las células son transformadas por choque térmico durante 30 segundos a una temperatura de 42°C. Las células se colocan en hielo durante 2 minutos y se permite su recuperación en 250 µL de SOC a temperatura ambiente durante 30 minutos a 37 °C con agitación a 225 rpm. Las células son colocadas en placas LB que contienen kanamicina (25-50 µg/mL) . El ADN de plásmido de cultivos que crecen en las placas LB con kanamicina es purificado utilizando el kit spin miniprep de Qiagen (Valencia, CA) y tamizado para determinar la presencia de insertos correctos. Las secuencias de plásmidos que parecen tener el inserto correcto son verificadas por secuenciamiento de ADN con terminación de cadena didesoxi (Seq right, Houston, TX) con etiqueta S y cebadores de terminador T7 (Novagen), y cebadores internos. La secuencia verificada HrclPET30) Xa/LIC) es transformada en el hospedero de expresión BL21(DE3) de conformidad con protocolos Novagen. La expresión de una proteína rica en histidina en células E. coli BL21 (DE3) : : HrcpET30 (Xa/LIC) puede efectuarse de la manera siguiente. Placas frescas de células de E. coli BL21(DE3):: Mus musculus Hrc/pET30 (Xa/LIC) se preparan en medio LB que contiene 50 µg/mL de kanamicina. Cultivos durante la noche (5 mL) son inoculados a partir de una colonia individual y cultivados a 30°C en medio LB con kariamicina. Típicamente, se utiliza de 1 a 5 mi de inoculo para inducción en 100 mi - 500 mi de medio LB que contiene 50 µg/mL de kanamicina. Las células son cultivadas 37°C y muestreadas cada hora hasta obtener una D06oo de 0.35-0.8. Las células son después inducidas con IPTG 0.1 mM. Todo el volumen de cultivo es centrifugado después de aproximadamente 4-10 horas de crecimiento (post inducción) , durante 20 minutos a 4°C y 3500 rpm. El sobrenadante es decantado y tanto el caldo como las células (lavadas una vez con agua destilada estéril) se congelan separadamente a -80°C, si no se anticipa un análisis inmediato. Extracto de células son preparados para análisis de proteína empleando el reactivo Novagen BugBuster™ con benzonasa nucleasa y el coctel Calbiochem III inhibidor de proteasa de conformidad con el protocolo Novagen. El nivel de expresión de proteína en los extractos celulares es analizado mediante SDS-PAGE empleando un gel de gradiente 4-15% (Bio-Rad, Hercules, CA) . Una vez determinadas las condiciones de inducción apropiadas (por ejemplo, tiempo y temperatura) que resultan en una expresión máxima de proteína rica en histidina, las células son cultivadas bajo estas condiciones y la pella de células es resuspendida en una cantidad apropiada de un amortiguador isotónico adecuado, por ejemplo, una solución salina fisiológica (NaCl al 0.85%, pH 7.0). Esta suspensión de células es después lisada empleando métodos conocidos por parte de las personas con conocimientos en la materia, como por ejemplo tratamiento en celdas de presión French. Las células usadas son centrifugadas a 10,000-15,000 rpm durante 20-30 minutos a 4°C para separar la biomasa y los residuos celulares y generar un extracto libre de células que contiene las proteínas ricas en histidina. El extracto que contiene las proteínas ricas en histidina es secado por rociado para generar un producto de proteínas ricas en histidina que puede ser agregado a alimentos para animales en el estado en el cual se encuentra, o bien después de haber sido sometido a encapsulación adecuada para asegurar supervivencia a través del rumen. La purificación y/o concentración de proteínas ricas en histidina a partir de células E. coli BL21 (DE3) : : HrcpET30 (xa/LIC) puede efectuarse empleando técnicas escritas en la literatura o presentadas con detalles abajo. Construcción y expresión de una proteína o péptido recombinante o sintético enriquecido para histidina (proteína o péptido rico en histidina - HRP) o histidina en combinación con aminoácidos seleccionados combinados con la expresión de genes de aminoacil-ARNt sintetasa apropiados. La construcción de una proteína o péptido rico en histidina sintético HEPpET30) (Xa/LIC) puede efectuarse de la manera siguiente. Una proteína o péptido sintético puede ser designado, por ejemplo, para que tenga la secuencia siguiente: HSCNÉHPMH LH PHLHHMH SHHPMGHHSH GHHLHGKiPH SHHLGHHFF GHHPHIHHPH LHHPHGKHPH FHHPHFHDR DHHHH Con un contenido de histidina (H, 44 residuos, ~ 52%), fenilalanina (F, 4 residuos, ~ 5%), y leucina (L, 7 residuos ~ 8%) . El empleo de codón del hospedero microbiano se toma en cuenta al diseñar el gen sintético que será traducido en el péptido rico en histidina deseado, de tal manera que no se utilizan codones raros. Se contempla que el empleo del codón en E. coli sea diferente de Corynebacterium por ejemplo. Tablas de empleo de codón son conocidas y disponibles en la técnica. Con base en un protocolo descrito en Stemmer et al, Gene 1995 Oct 16; 164 (1) : 49-53, es posible (1) determinar los mejores codones a utilizar para diseñar la secuencia de ácidos nucleicos que codificarán el péptido deseado, (2) diseñar el número requerido de oligonucleótidos de empalme que abarcan la longitud del ácido nucleico sintético y (3) ensamblar el gen sintético utilizando reacción en cadena de polimerasa que se basa no en ADN ligasa sino utiliza las propiedades de ADN polimerasa para construir fragmentos de ADN más largos durante la reacción de ensamblaje PCR. El ácido nucleico sintético que codifica un péptido rico en histidina puede entonces ser clonado en el vector deseado que contiene antibiótico apropiado/marcador de selección con el objeto de asegurar la expresión del péptido rico en histidina sintético en el hospedero de elección, por ejemplo, plantas, E. coli , Corynebacterium , Brevibacterium, Bacillus, y levadura. Como se observó arriba, se reporta que las alteraciones de concentraciones de ARNt y aminoacil-ARNt sintetasas influencian la biosíntesis de aminoácidos. Además, ARNt puede tener efectos mayores sobre la expresión y la sobre-expresión de genes heterólogos en sistemas de expresión microbianos a través de una traducción reducida y errores en secuencias de aminoácidos de productos proteínicos. (Véase, por ejemplo, O'Neill et al., J. Bacteriol . 1990 Nov; 172 (11) : 6363-71; Smith et al., Biotechnol Prog. 1996 Jul-Aug; 12 (4 ): 417-22) ; Dieci et al., Protein Expr Purif. 2000 Apr; 18 (3 ( : 346-54 ) . Así, para incrementar la expresión de las proteínas ricas en histidina, sintéticas o recombinantes, por ejemplo, puede ser benéfico expresar simultáneamente el histidil-ARNt correspondiente o genes aminoacil-ARNt respectivos también. Es también posible diseñar cebadores para introducir un gen sintético o recombinante para proteínas o péptidos ricos en histidina en un operon con HisSpET30 Xa/LIC de tal manera que tanto las proteínas o péptidos ricos en histidina como la histidil-ARnt sintetasa sean co-expresados permitiendo una síntesis incrementada del producto. La expresión de una proteína o péptido rico en histidina recombinante en células El coli BL21 (DE3) : : HrcpET30 (Xa/LIC) puede efectuarse de la manera siguiente. Placas frescas de células de E. coli BL21(DE3):: íí£P/pET30 (Xa/LIC) sintéticas o recombinantes se preparan en medio LB que contiene 50 µg/mL de kanamicina. Cultivos durante la noche (5 mL) son inoculados a partir de una sola colonia y cultivados a 30°C en medio LB con kanamicina. Típicamente, se utiliza de 1 a 5 mi de inoculo para inducción en 100 mi - 500 mi de medio LB que contiene 50 µg/mL de kanamicina. Las células son cultivadas a 37 °C y muestreadas cada hora hasta obtener una D06oo de 0.35-0.8. Las células son después inducidas con IPTG 0.1 mM. El volumen de cultivo entero es centrifugado después de aproximadamente 4-10 horas de crecimiento (postinducción) , durante 20 minutos a 4°C y 3500 rpm. El sobrenadante es decantado y tanto el caldo como las células (lavadas una vez con agua destilada estéril) son congelados separadamente a -80°C si no se anticipa un análisis inmediato. Extractos de células se preparan para análisis de proteína utilizando el reactivo Novagen BugBuster™ con benzonasa nucleasa y el cóctel inhibidor de proteasa Calbiochem III de conformidad con el protocolo Novagen. El nivel de expresión de proteína en los extractos de células es analizado por SDS con PAGE utilizando un gel de gradiente 4-15% (Bio-Rad, Hercules, CA) . Una vez determinado el tiempo de inducción apropiado que resulta en la expresión máxima de proteína o péptido rico en histidina, se cultivan células bajo estas condiciones y la pella de células es resuspendida en una cantidad apropiada de un amortiguador isotónico adecuado, por ejemplo solución salina fisiológica (NaCl al 0.85%, pH 7.0). Esta suspensión de células es después lisada empleando métodos conocidos por parte de las personas con conocimientos en la materia, como por ejemplo tratamiento en celdas de presión French. Las células lisadas son centrifugadas a 10,000 - 15,000 rpm durante 20 - 30 minutos a 4°C para separar la biomasa y residuo de células y para generar un extracto libre de células que contiene las proteínas ricas en histidina. Este extracto, que contiene la proteína rica en histidina puede ser secado por rociado con el objeto de generar un producto de proteínas o péptidos ricos en histidina que puede ser agregado a alimentación animal en el estado en el cual se encuentra o bien después de haber sido sometido a tratamiento adecuado y/o encapsulación para asegurar su supervivencia a través del rumen. La purificación o concentración de proteínas ricas en histidina recombinantes o sintéticas a partir de células El coli BL21 (DE3) : :HrcpET30 (Xa/LIC) puede efectuarse de la manera siguiente. Placas frescas de células de E. coli BL21 (DE3) : : HEP/pET30 (Xa/LIC) puede efectuarse en caso necesario. Las proteínas o péptidos ricos en histidina producidos pueden ser sometidos a concentración adicional y purificación empleando técnicas escritas en la literatura o presentadas con detalles abajo. La construcción de constructo de histidina-ARNt sintetasa HisSpET30 (Xa/LIC) puede efectuarse de la manera siguiente. Cebadores son diseñados con salientes compatibles para el vector pET30 (Xa/LIC) (Novagen, Madison, I) para clonación del gen de E. coli histidina-ARNt sinetasa { HisS) . El vector pET tiene una saliente de una sola cadena de 12 bases en el lado 5' del sitio Xa7LIC y una saliente de una sola cadena de bases en el lado 3' el sitio Xa/LIC. El plásmido es diseñado para clonación independiente de ligación, con etiquetas His y S N-terminales y una etiqueta His C-terminal opcional. El sitio de reconocimiento de Xa proteasa (IEGR) se coloca delante del codón inicial del gen de interés, de tal manera que las etiquetas de proteína de fusión puedan ser removidas . Los siguientes cebadores se adquieren para clonación de pET30 Xa/LIC del gen de histidina-ARNt sintetasa de E. coli: directo 5'- GGTATTGAGGGTCGCG?fíG€AAAAAACATTCAAGC-3, ? REVERSA 5 , _ ^GAGGAGAGTTAGAG€CpAACCCAGTAACGtGCGeA-3\ La secuencia de ácido nucleico del gen HisS de E. coli , No . de Acceso M11843 J01629 , se proporciona en la Figura 5 y la secuencia de aminoácidos para el péptido codificado se proporciona en la Figura 6 . TABLA 3 Secuencia de ADN de histidina-ARNt sintetasa (hisS) de E. coli l gafcitgateg á?cagctga agca?gcate egte idg ccagtesgct ggac§aagcg 5i cgtcgaat$ acgtteagc ggttgaaaaa taataaegeg eefcegeefce€ 121 cgtgtatgat tgaaeecfca tggcteeega lacatt gg .gaagcgtega ggge estet i3i ttaeactcsg aaigagaata aacg&ggeia aiaacatte§ tgcsattcgc ggcatgaacg M attacetgcc tggcgaaacg gcatcggc igogdi&ea iggcacietg aaaaacgtgc 301 tdgt?igcta cggctacagt gaaatccgct cgc gattgt agagoagacc ccgctattca 36i aacfegaga£ tggtgaagtc-acogicgegg ttgauaaga gatgtacacg tttgaggrtc 421 geaaeggca cagcctgact, cgcgccctg aagggacggc gggctgtgta cgsgceggca 411 tegageaegg teccctgcac aaecaggaac agegeetgtg gtatatcggg ccgatgttcc S1 gtcicgagcg tccgcagaaa gggcgttatc gtcagstcca fcgagttgggs tgCgaagbt 601 ecggtetgca aggteoggafe ategacgctg aaelgaltat gctcactgcc cgctggtgge idgegctgg tac ccgag eacgtawte tcgagctgaa ctctatcggt tcgctggaag 721 cacgcgceaa ttaccgcgat gcgctggtgg eattcettga gcageataai gaaaagetgg 781 acgaigaetg caaacgcege aegfcaeaeta acccgetgcg cgtgctggae teaaaaaatc 141 cggaagtgqi ggcgccccic aaegacgqfce cggcii gg ngactatcg gaegaggaat SOI ctegtgagga ttttgccggt etgtgeiaac Igqtggagag cgcggggatc gc a?agpg Hl taücca? tetggtgcgt ggtctggatt actacaaccg taccgttttc gagtgggtga 1021 cfcaacagtct cggcfccgcag ggcacegfcgt; geaggcgg ecgttlgae ggtQttgtgg 1081 aieaictggg cggtcgtgca aeseeggetg tcggwttgc tatgggcetc gaacgtcetg 1141 tattgttagc acaggeegtt aatcsggaat fetaaagccga tectgtegec gataeaeacc 1201 tggtggcctc aggegetgat acagaaecEg cggceafcggc attagctgag cftctfcgtg 1251 aegaateacc gggcggaaa tgacgacqa iceaeggcgg ggaaaettt aagaaaoagt 1321 ttgcccgtgc tgataaatgg ggtgcccgcg ttg?tgtggt gctgggtgag tctgaagtgg 1381 ctaaeggcac aggagtagtg aaggatttge gctctggtga geaaaeggqa gtfcgeggagg Mil atagcgtagc cgcgcatteg egcaegttac tgggt'eaagg aaggagaagg acagegtgga 1S01 aatttasgag aacgaaaacg agggg g geggtfcaaag gcttttttgc tgaaaatgge 15S1 aaa$caetig ctgttggggt gattttggcg ttggcgcact gaetggetgg cgctactgga m\ acagccatca ggttgaetce ggaegctceg cttcccctgc ctatcaaaat ggggetaee TABLA 4 Secuencia de aminoácidos de histidina-ARNt sintetasa (HisS) de E. coli MAKNIQAlRGMNDY KlETAIWQR?BGTL NVLGSyGYSEI LPIVEQTPLPKRAIG EVTDWEKEMYTFEDRNGDSLTLRPEGTAGCVRAGIEHGLLYNQEQRLWYIGPMFRH ERPQ GRYRQFHQLGCEVFG QGPDIDAELIMLTA WWRAIGISEHVTLEIJNSIGS EA lrcRDALVAFI-EQHKEkLDEIX:KRMYTNPI?^ I-DEESREHFAGLCKL ESAsiAY VNQRLVRGL YYNRTVFBWVTNS GSOGTVCAG GR DGLVEQLGGRATPAVGFAMGLERLV VQAVNPEFKADPVVDIYLVASGADTQS AAMAi?ERLRDE PGVKLMTmÍGGGNFKKQFARADKMGARVAVVLGESEVANGTAVV D RSGEQTAVAQDSVAAHLRTILG El ADN genómico de E. coli de Escherichia coli ATACC 10798 se compra en ATACC, número de catálogo 10798D. Todas las enzimas de restricción se compran en New England BioLabs (Beverly, A) . Los cebadores son sintetizados por Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) a menos que se indique lo contrario. A continuación se presenta una versión de un protocolo de PCR utilizado para amplificar el gen HisS de E. coli . En una reacción de 50 µL se agregan 0.1-0.5 µg de templado, 1.5 µM de cada cebador, 0.4 mM de cada dNTP, 3.5 U de polimerasa Expand High Fidelity™, y lx amortiguador Expand™ con Mg (Roche, Indianapolis, IN) . El programa de termociclador utilizado incluye un arranque caliente a 96°C durante 5 minutos, seguido por 29 ciclos que incluyen los pasos siguientes: 94°C durante 30 segundos, 40-65°C durante 1 minuto (termociclador de gradiente) y 72°C durante 2 minutos, segundos. Después de los 29 ciclos, la muestra es mantenida a 72°C durante 10 minutos y después almacenada a 4°C. El producto de reacción en cadena de polimerasa (PCR) es purificado en gel a partir de geles de 0.8 ó 1% TAE-agarosa utilizando el kit de extracción de gel Qiagen (Valencia, CA) . El producto de reacción en cadena de polimerasa es cuantificado por comparación con estándares en el gel de agarosa, y después tratado con T4 ADN polimerasa siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante para Clonación Independiente de Ligación (Novagen, Madison, WI) . Brevemente, aproximadamente 0.2 pmol de producto purificado por reacción en cadena de polimerasa se trata con 1 U T4 ADN polimerasa en presencia de dGTP durante 30 minutos a una temperatura de 22 °C. La polimerasa remueve las bases sucesivas de los extremos 3' del producto de reacción en cadena de polimerasa. Cuando la polimerasa encuentra un residuo de guanina, la actividad 5' a 3' polimerasa de la enzima contrarresta la actividad exonucleasa para evitar efectivamente una escisión adicional. Esto crea salientes de cadena simple que son compatibles con el vector pET Xa/LIC. La polimerasa es desactivada mediante incubación a 75°C durante 20 minutos. El vector y el inserto tratado son fusionados de conformidad con lo recomendado por Novagen. Aproximadamente 0.02 pmol de inserto tratado y 0.01 pmol de vector son incubados durante 5 minutos a 22°C; se agrega EDTA 6.25 mM (concentración final); y la incubación a 22°C es repetida. La reacción de fusión (1 µL) se agrega a células competentes NovaBlue™ Singles (Novagen, Madison, I), y se incuba en hielo durante 5 minutos. Después de mezclado, las células son transformadas por choque térmico durante 30 segundos a 42°C. Las células se colocan en hielo durante 2 minutos y después se permite su recuperación en 250 µL de SOC a temperatura ambiente durante 30 minutos a una temperatura de 37 °C con agitación a 225 rpm. Las células son colocadas en placas de LB que contienen kanamicina (25-50 µg/mL) . El ADN de plásmido de cultivos que crecen en las placas LB con kanamicina es purificado utilizando el kit miniprep spin de Qiagen (Valencia, CA) y tamizado para determinar los insertos correctos. Las secuencias de plásmidos que parecen tener el inserto correcto son verificadas por secuenciamiento de ADN con terminación de cadena didesoxi (Seq right, Houston, TX) con marcador S y cebadores de T7 terminador (Novagen), así como cebadores internos. La secuencia verificada HrclPET30) Xa/LIC) es transformada en el huésped de expresión BL21(DE3) de conformidad con protocolos Novagen.

La purificación de proteínas o péptidos ricos en histidina después de experimento de fermentación puede efectuarse de la manera siguiente. Células que expresan las proteínas o péptidos ricos en histidina son perturbadas primero utilizando técnicas conocidas en la literatura por ejemplo, utilizando múltiples pasajes a través de una celda de presión French a 6,614 kPa (960 psi) en medidor (aproximadamente 130,910 kPa [19,000 psi] en celda). Los residuos de células son separados de las proteínas ricas en histidina por centrifugación a 15,000 rpm a una temperatura de 4°C. El extracto libre de células o el sobrenadante contiene las proteínas ricas en histidina y es sometido a métodos adicionales para unir específicamente las proteínas ricas en histidina y separarlas de las demás proteínas en el extracto libre de células. Un método para purificar las proteínas ricas en histidina se basa en la secuencia de etiqueta de histidina para unirse con una resina de unión con histidina, mediante la unión de la proteína rica en histidina con la resina y efectuando técnicas de cromatografía de quelación de metal. Un "His Bind Kit" está comercialmente disponible en Novagen. Los residuos de histidina y/o segmentos ricos en histidina de las proteínas ricas en histidina se unen a cationes Ni2+ que están inmovilizados en la resina de unión con histidina. Las proteínas no unidas son lavadas y las proteínas ricas en histidina pueden ser recuperadas por elusión con imidazol. Las proteínas ricas en histidina pueden ser dializadas con el objeto de remover el imidazol y después concentradas o secadas por rociado para adición a una composición de alimentación en el estado en el cual se encuentran o sometiéndolas a tratamiento apropiado para minimizar la degradación en el rumen. Además de la producción de productos ricos en histidina en sistemas de fermentación, productos ricos en histidina pueden también ser producidos en sistemas de plantas transgénicas . Métodos para la producción de sistemas de plantas transgénicas se conocen en la técnica. Protección en el rumen de histidina y productos ricos en histidina. La histidina y/o productos ricos en histidina (es decir, ingredientes) pueden ser tratados y/o recubiertos o encapsulados para disminuir la degradación en el rumen (es decir, para facilitar la producción en el pasaje por el rumen) . Un recubrimiento adecuado puede tener una temperatura de fusión relativamente alta de conformidad con lo descrito abajo. Recubrimientos adecuados pueden incluir una mezcla de un compuesto hidrofóbico con alto punto de fusión y un lípido. La combinación de uno o varios compuestos de alto punto de fusión, hidrofóbicos (por ejemplo, sales de minerales de ácidos tales como estearato de zinc de grado comercial) con uno o varios tipos de lípido, forma un material de recubrimiento que puede proteger el contenido y la funcionalidad del ingrediente recubierto o de los ingredientes recubiertos. Estos recubrimientos pueden ser formulados para satisfacer las necesidades de condiciones de- procesamiento a alta temperatura y presión elevada así como protección de la carga de aminoácido contra el entorno microbiano del rumen. Recubrimientos adecuados se describen en la Publicación de Patente Norteamericana No. 2003/0148013, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Compuestos hidrofóbicos de alto punto de fusión tienen típicamente un punto de fusión de al menos aproximadamente 70°C, y con mayor preferencia, mayor que 100°C. En particular, sales de zinc de ácidos grasos que tienen un punto de fusión comprendido entre aproximadamentell5°C y 130°C, son compuestos de alto punto de fusión, hidrofóbicos adecuados . El componente de lípido tiene típicamente un punto de fusión de al menos aproximadamente 0°C y más adecuadamente no inferior a aproximadamente 40°C. El componente de lípido puede incluir aceite vegetal como por ejemplo aceite de soya. En otras modalidades, el componente de lípido puede ser un triaciglicerol con un punto de fusión de aproximadamente 45-75°C. Se puede seleccionar ácido esteárico de grado comercial como lípido representativo de un grupo que incluye, sin limitarse a estos ejemplos: ácido esteárico, grasa animal hidrogenada, grasa animal (por ejemplo, sebo animal) , aceite vegetal, (como por ejemplo aceite vegetal crudo y/o aceite vegetal hidrogenado, ya sea parcial o totalmente hidrogenado) , lecitina, ácido palmítico, aceites animales, cera, esteres de ácidos grasos (C8 a C24) , ácidos grasos (C8 a C2 ) • El recubrimiento puede estar presente en el producto recubierto en una cantidad de 1-2000% en peso con relación al peso del ingrediente recubierto. Comúnmente, el recubrimiento representa aproximadamente 15 a 85% en peso con relación al peso del ingrediente recubierto. Más comúnmente, el recubrimiento representa de aproximadamente 20 a 60% en peso y/o 30 a 40% en peso, con relación al peso del ingrediente recubierto. El recubrimiento puede prepararse a partir de una mezcla hidrofóbica. El recubrimiento puede incluir un surfactante. El recubrimiento puede utilizar uno o varios compuestos hidrofóbicos insolubles combinados con un lípido. Por ejemplo, el estearato de zinc de grado comercial es extremadamente hidrofóbico y totalmente insoluble en agua. La adición de estearato de zinc de grado comercial a la fórmula de recubrimiento puede mejorar el nivel de protección de línea de diente y su funcionalidad, significativamente en comparación con un recubrimiento de lípido solamente. Por ejemplo, mediante combinación de estearato de zinc con un lípido relativamente insoluble como por ejemplo ácido esteárico de grado comercial, el compuesto de recubrimiento puede proporcionar una mejor protección contra la lixiviación (es decir, pérdida del ingrediente activo del producto recubierto) , cuando el producto recubierto se encuentra en un medio acuoso. Como tal, el beneficio de la presente composición de recubrimiento puede utilizarse en alimentos diseñados para rumiantes para protección durante el pasaje por el rumen y suministrar el ingrediente activo al intestino delgado. Además de facilitar la protección durante el pasaje a través del rumen, el recubrimiento puede ser útil también para proteger los ingredientes activos contra el calor y la presión que experimentan durante el proceso de fabricación (formación de granos y extrusión) . La composición de recubrimiento puede ser útil en todos los tipos de procesos de producción en donde se aplica calor y en donde se utilizan ingredientes susceptibles al calor. Ingredientes que pueden beneficiarse de esta forma de protección son ingredientes sujetos a daño o degradación térmica, como por ejemplo aminoácidos, proteínas, enzimas, vitaminas, pigmentos, y atractantes . Además de proteger los ingredientes contra daño o pérdida relacionada con el calor, existe también la necesidad de proteger los ingredientes contra daño o pérdida atribuible a la asociación o reacción química con otros ingredientes. El método de encapsulación puede evitar una asociación de alanina con otros ingredientes. Como tal, el método de encapsulación ofrece la capacidad de pre-empacar o combinar los ingredientes en una formulación, en donde los ingredientes estarían habitualmente empacados individualmente . La composición de recubrimiento puede prepararse de varias formas. Preferentemente, el proceso de preparación incluye la formación de una solución sólida del componente de sal orgánica de zinc y el componente lípido. En una modalidad, la sal orgánica de zinc y el componente lípido pueden derretirse hasta que ambos se disuelvan y formen una solución. La solución puede después solidificarse para formar una solución sólida. Además del componente ácido orgánico de zinc y del componente lípido, el recubrimiento puede incluir otros ingredientes. Por ejemplo, el recubrimiento puede incluir uno o varios agentes emulsificantes tales como glicerina, polisacáridos, lecitina, agentes formadores de gel y jabones, que pueden mejorar la velocidad y efectividad del proceso de encapsulación . Además, el recubrimiento puede incluir un antioxidante para proporcionar una protección mejorada contra los efectos de la oxidación. Además, la composición de recubrimiento puede incluir otros componentes que pueden o no disolverse en el proceso de formación de solución sólida. Por ejemplo, la composición de recubrimiento puede incluir pequeñas cantidades de óxido de zinc y otros elementos o compuestos.

Un recubrimiento adecuado puede ser preparado a partir de un aceite vegetal parcialmente hidrogenado como por ejemplo aceite de soya. Otros aceites vegetales adecuados, que pueden ser parcialmente hidrogenados incluyen aceite de palma, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de cacahuate, aceite de grano de palma, aceite de babasú, aceite de girasol, aceite de cártamo, y mezclas de los mismos. Un recubrimiento adecuado puede prepararse a partir de una mezcla que incluye un aceite vegetal parcialmente hidrogenado y constituyentes adicionales, como por ejemplo una cera. Ceras adecuadas incluyen cera de abeja, cera de petróleo, cera de salvado de arroz, cera de ricino, cera microcristalina y mezclas de los mismos. En ciertas modalidades, un recubrimiento adecuado se prepara a partir de una mezcla que incluye aproximadamente 85-95% de aceite vegetal parcialmente hidrogenado (preferentemente aproximadamente 90%) y aproximadamente 5-15% de cera (preferentemente aproximadamente 10%) . El recubrimiento puede incluir un agente para modificar la densidad del sustrato recubierto, por ejemplo, un surfactante, como por ejemplo polisorbato 60, polisorbato 80, propilenglicol, dioctilsulfosuccinato de sodio, lauril sulfato de sodio, esteres lactílicos de ácidos grasos, esteres de poliglicerol de ácidos grasos y mezclas de los mismos.

Un sustrato recubierto (o sustrato pre-recubierto) puede prepararse mediante el rociado de una mezcla hidrofóbica que incluye un aceite vegetal parcialmente hidrogenado (85%-95%) y una cera (5%-15%) en un sustrato que incluye L-His y/o una proteína rica en histidina. Opcionalmente, un sustrato pre-recubierto puede ser recubierto adicionalmente mediante el rociado de la superficie del sustrato pre-recubierto con un surfactante para formar el sustrato recubierto. El sustrato recubierto puede tener la composición siguiente: sustrato (40-80%); mezcla hidrofóbica (20-60%); surfactante (0-40%) (opcional) . El sustrato recubierto puede tener una gravedad específica de aproximadamente 0.3-2.0 (más adecuadamente aproximadamente 1.3-1.5). En una modalidad, el sustrato recubierto incluye: aproximadamente 50% de sustrato; aproximadamente 35% de mezcla hidrofóbica; y aproximadamente 15% de surfactante. El sustrato recubierto puede prepararse mediante el pre-recubrimiento del sustrato con una mezcla hidrofóbica, y subsiguientemente recubriendo el sustrato pre-recubierto con un surfactante. Después de la preparación de la composición de recubrimiento, se puede utilizar para preparar el ingrediente protegido. Un procedimiento adecuado para la preparación del ingrediente protegido emplea una tecnología de encapsulación, preferentemente tecnología de microencapsulación. La microencapsulación es un proceso a través del cual cantidades diminutas de ingredientes en forma gaseosa, líquida o sólida están encerrados o rodeados por un segundo material, en este caso una composición de recubrimiento, para proteger el ingrediente contra' el entorno aledaño. Numerosos procesos de microencapsulación pueden utilizarse para preparar el ingrediente protegido como por ejemplo, métodos de disco giratorio, rociado, co-extrusión y otros métodos químicos tales como co-acerbación compleja, separación de fases, y formación de gel. Un método adecuado microencapsulación es el método de disco giratorio. En el método de disco giratorio, una emulsión y/o suspensión del ingrediente activo y de la composición de recubrimiento se preparan, y se alimentan por gravedad a la superficie de un disco giratorio calentado. Conforme gira el disco, la emulsión de la suspensión se extiende sobre la superficie del disco para formar una capa delgada debido a fuerzas centrífugas. En el borde del disco, la emulsión/suspensión es cortada en pequeñas gotas discretas en donde el ingrediente activo está rodeado por el recubrimiento. Conforme las pequeñas gotas caen del disco hacia una tolva de recolección, las pequeñas gotas se enfrían para formar un ingrediente microencapsulado (es decir, un producto recubierto) . (Véase, por ejemplo, la representación esquemática de un sistema de recubrimiento de disco giratorio adecuado mostrado en la Figura 2) . Puesto que la emulsión o suspensión no es extruida a través de orificios, esta técnica permite el uso de un recubrimiento de viscosidad mayor y permite una carga más rápida del ingrediente en el recubrimiento . La encapsulación de ingredientes para su uso en alimentos para animales se describe en la Publicación de Patente Norteamericana No. 2003/0148013, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Aminoácidos (como por ejemplo histidina) y/o proteínas (como por ejemplo proteínas ricas en histidina) pueden también ser modificadas químicamente para proteger el aminoácido en el rumen y para incrementar el suministro de aminoácidos específicos proporcionados a los abomasos e intestino delgado. Por ejemplo, un análogo de metionina hidroxilo (MHA®) ha sido utilizado como suplemento de aminoácido. Además, los aminoácidos pueden proporcionarse como quelatos aminoácido/mineral. Se ha utilizado complejos de zinc-metionina y zinc-lisina como suplementos de aminoácido. Una fuente de histidina, que puede incluir L-His o una proteína rica en histidina, puede reaccionar con un carbohidrato reductor para proteger la histidina contra degradación en el rumen (por ejemplo, mediante la realización de una reacción de Maillard) . Por ejemplo, L-His y/o una proteína rica en histidina pueden reaccionar con azúcares reductores tales como, sin limitarse a estos ejemplos, xilosa, glucosa, fructosa, lactosa, mañosa, ribosa, y mezclas de los mismos. Las fuentes de azúcar pueden incluir productos de maíz e hidrolizados de productos de maíz (por ejemplo, almidón de maíz al menos parcialmente hidrolizado y/o almidón de maíz modificado) , melaza e hidrolizados de melaza, hemicelulosas e hidrolizados de hemicelulosas, azúcares contenidos en licores de sulfito utilizados, y mezclas de los mismos. Una fuente de histidina, que incluye L-His y/o una proteína rica en histidina, puede reaccionar con un azúcar reductor en una mezcla de reacción para formar una fuente de histidina tratada. La fuente de histidina tratada puede agregarse entonces en una composición de alimento. Alternativamente, una fuente de histidina, que incluye L-His y/o una proteína rica en histidina, puede agregarse a una composición de alimento para formar una composición de alimento complementada. La composición de alimento complementada puede reaccionar con un azúcar reductor en una mezcla de reacción p ara proteger los aminoácidos presentes en la composición de alimento complementada, incluyendo aminoácidos presentes en la fuente de histidina. La mezcla de la reacción incluye típicamente al menos aproximadamente 1 mol de azúcar reductor o 1 mol de aminoácidos libres. Típicamente, la mezcla de la reacción incluye al menos aproximadamente 3-5 mol de azúcar reductor por 1 mol e aminoácidos libres. La mezcla de la reacción tiene típicamente un pH de aproximadamente 4.0-10.5, (adecuadamente aproximadamente 6.0-8.5). La mezcla de la reacción tiene típicamente un contenido de humedad de aproximadamente 6-40%, (adecuadamente aproximadamente 15-25%) . La mezcla de la reacción típicamente es calentada a una temperatura de aproximadamente 20-150°C, (adecuadamente aproximadamente 80-110°C y/o aproximadamente 90-100°C) durante un periodo de aproximadamente 0.5-72 horas, (adecuadamente aproximadamente 1-4 horas) . La mezcla de la reacción puede ser sometida a presión (por ejemplo, presiones de aproximadamente 2000-3500 KPa (aproximadamente 300-500 p.s.i.)). La mezcla de la reacción puede ser sometida a presión antes, durante o después del calentamiento de la mezcla de la reacción. La mezcla de la reacción puede ser extruida y/o formada en granulos. Desde una perspectiva de proporcionar un producto por tejido, la levadura puede ser un hospedero particularmente adecuado para la expresión de proteínas ricas en histidina y/o aminoácidos. Se ha mostrado que una levadura de acumulación de lisina acumula entre 4 y 15% de su peso seco en forma de lisina. La mayoría de la lisina está contenida en báculos estables cuando están incubados con el fluido de rumen, pero presenta una liberación inmediata cuando están expuestos a pepsina, una de las enzimas de digestión de proteína del abomaso. Así, este organismo puede ser un hospedero útil para expresar proteínas y/o aminoácidos y proporcionar un complemento alimenticio protegido que puede aumentar la cantidad de proteínas y/o aminoácidos disponibles para absorción intestinal. Formulaciones alimenticias que tienen un contenido incrementado de uno o varios aminoácidos esenciales Inicialmente, se tomó un enfoque empírico para generar requisitos de aminoácidos esenciales para vacas lactantes. La composición de aminoácidos esenciales de la proteína microbiana en el rumen fue comparada con la composición de aminoácidos esenciales de proteína de leche (Tabla 5) . (Lo mismo puede efectuarse para proteína de músculo como indicador de los requisitos de aminoácidos para crecimiento, mantenimiento y reproducción) . Tabla 5. Composición de aminoácidos esenciales de proteína de leche en comparación con proteína microbiana (gramos de aminoácido/100 gramos de proteína) . Aminoácido P:roteína Proteína Proteína Microbiana M.icrobiana de leche /proteína de leche Arginina 5.4 3.3 1.67 Histidina 2.3 2.6 0.88 Isoleucina 7.3 4.6 1.58 Leucina 9.4 9.4 1.00 Lisina 9.3 7.7 1.21 Metionina 2.6 2.5 1.06 Fenilalanina 5.1 5.3 0.96 Treonina 6.4 4.4 1.47 Tirosina 1.5 1.4 1.07 Valina 7.2 5.7 1.27 Los aminoácidos predichos como limitantes fueron después candidatos para estudio adicional. Una vez determinados los requisitos de aminoácidos, se desarrolla un método para satisfacer estos requisitos de aminoácidos. El primer paso fue tomar en cuenta la producción de aminoácidos microbianos en el rumen. Un modelo microbiano para producción de aminoácidos se proporciona en la Figura 1. La producción de aminoácidos microbianos es determinada por crecimiento microbiano que es determinado a su vez por las concentraciones de carbohidratos fermentados en el rumen incluyendo almidón, fibra detergente neutral ("NDF") , azúcares y carbohidratos no fibrosos residuales ("RNFC") tales como pectina y beta-glucano. Para determinar la contribución dé aminoácidos de proteína microbiana en rumen a la alimentación de un animal, la proteína microbiana en rumen total es multiplicada por el porcentaje de cada aminoácido específico presente en la proteína. Muchos investigadores han encontrado que la composición de aminoácidos de la proteína microbiana en rumen permanece relativamente constante. La digestibilidad de aminoácidos bacterianos se considera en 80% para cada aminoácido. Las cantidades resultantes de aminoácidos proporcionados por la proteína microbiana en rumen fueron después restadas de los requisitos de aminoácidos. Los déficits, (es decir, las diferencias entre los requisitos y los aminoácidos suministrados a partir de la proteína microbiana en rumen) indicaron las cantidades de aminoácidos que deberían ser provechosamente suministradas como aminoácidos esenciales no degradables (UEAAs) en el alimento.

Ingredientes de alimentos altos en UEAAs (o aminoácidos que resisten al pasaje en el rumen) fueron evaluados para determinar fuentes potentes de UEAAs. Se ha utilizado harina de sangre como una fuente común de UEAAs en el pasado. La harina de sangre es también una buena fuente de histidina (Tabla 6) . Tabla 6. Composición de aminoácidos esenciales de proteína de harina de sangre en comparación con proteína de leche (gramos de aminoácido/100 gramos de proteína) . Aminoácido Harina de Leche Harina de Sangre sarígre /leche Arginina 3.5 3.3 1.06 Histidina 5.2 2.6 2.00 Isoleucina 1.0 4.6 0.21 Leucina 12.8 9.4 1.36 Lisina 8.4 7.7 1.09 Metionina 1.1 2.5 0.44 Fenilalanina 6.6 5.3 1.24 Treonina 4.2 4.4 0.96 Tirosina 1.2 1.4 0.86 Valina 8.8 5.7 1.54 Requisitos de aminoácidos de los animales. Los aminoácidos requeridos en los alimentos para vacas lecheras se conocen como Aminoácidos Digeribles Lecheros ("ddAA") . La suma del aminoácido microbiano digerible más la concentración de aminoácido esencial no degradado en rumen digerible (UEAA) de este mismo aminoácido es ddAA. Los Aminoácidos Digeribles Lecheros representan el suministro de AA digeribles totales al intestino delgado. Los requisitos de aminoácidos totales de un animal lechero pueden determinarse de la manera siguiente. La cantidad total de un aminoácido requerido ("TAAR") es igual a la cantidad requerida para mantenimiento ("Aminoácido de Mantenimiento" ó "MAA") más la cantidad del aminoácido requerido para la producción de leche ("Producción de Aminoácidos de Leche" ó "MAAO") más la cantidad del aminoácido requerido para crecimiento ("Aminoácido de Crecimiento" ó "GAA") (es decir, TAAR = MAA + MAAO + GAA) .

Encapsulación. El proceso presentado en la Figura 2 muestra microencapsulación por tecnología de disco giratorio. Otros procesos de microencapsulación incluyen rociado, coextrusión centrífuga y medios químicos. El proceso empieza por la preparación del recubrimiento, por ejemplo nutriente soluble en agua que debe ser protegido contra solubilidad en agua mediante la utilización de un recubrimiento graso. El recubrimiento es derretido por calentamiento en el recubrimiento a su punto de fusión en el tanque de grasa hasta que el recubrimiento sea licuado. El nutriente es típicamente un polvo seco de un aminoácido, biomasa, péptido o proteína es preparado. (En algunos casos, si el tamaño de partícula de nutriente es excesivamente grande, el nutriente puede ser pasado a través de un tamiz (por ejemplo, un tamizador SWECO) ) . El nutriente se coloca en un alimentador volumétrico que suministra una concentración conocida exacta del nutriente (por ejemplo, en forma de un polvo seco) a una velocidad constante. La grasa líquida es agregada al recipiente de pasta a una velocidad controlada empleando una bomba medidora. La velocidad de adición se selecciona de tal manera que la grasa líquida se combine con el nutriente en una proporción seleccionada. Por ejemplo, si el producto recubierto tiene 35% de un nutriente y el producto es producido a un régimen de 45.4 kg/hora (100 libras/hora), la grasa derretida debe ser agregada a una velocidad de 29. kg/hora (65 libra/hora) y el alimentador volumétrico debe suministrar el nutriente a una velocidad de 15.9 kg/hora (35 libras/hora). La grasa derretida y el nutriente se mezclan juntos en el recipiente de pasta para crear una emulsión o suspensión. La emulsión/suspensión es descargada del fondo del recipiente y aplicada en forma de una capa a un disco giratorio debajo del recipiente. La emulsión en la suspensión se extiende a través del disco debido a las fuerzas centrífugas. Conforme la capa se acerca al borde del disco, - la capa es cortada en partículas discretas (es decir, pequeñas gotas o microcápsulas) que contienen el nutriente rodeado por el recubrimiento. Conforme a las partículas caen del disco, el recubrimiento se enfría y solidifica. La partícula recubierta cae en la tolva de recolección y a partir de la tolva de recolección hacia el transportador para transferencia. El transportador desplaza el material a granel el recubrimiento de alto punto de derretimiento se enfría y solidifica. Las cápsulas caen en la tolva de recolección, por los lados de las paredes de la tolva de recolección y hacia el transportador de transferencia. El transportador desplaza las partículas a granel hacia almacenamiento a granel para empaque posterior. Formulaciones de alimentos para animales. Los productos que tienen un contenido incrementado de histidina pueden incluirse en formulaciones de alimentos para animales. Las tablas 7-14 ofrecen ejemplos de formulaciones de alimentos que tienen un contenido incrementado de histidina. Por ejemplo, la Tabla 7 muestra un ejemplo de un alimento completo que tiene un contenido incrementado de histidina. La Tabla 7 presenta una lista de las cantidades relativas de los ingredientes de alimentos que pueden utilizarse para preparar este alimento completo de ejemplo que tiene un contenido incrementado de histidina. La composición de alimento completo incluye una proteína rica en histidina que tiene un contenido de histidina de aproximadamente 10%. La Tabla 8 presenta una lista de las cantidades de un número de nutrientes comunes presentes en la composición de alimento completa presentada en la Tabla 7. La Tabla 9 muestra un ejemplo de un concentrado de alimento que tiene un contenido incrementado de proteína. La Tabla 9 presenta una lista de las cantidades relativas de ingredientes de alimento que pueden utilizarse para preparar este concentrado de alimento de ejemplo que tiene un contenido incrementado de histidina. El concentrado de alimento incluye una proteína rica en histidina que tiene un contenido de histidina de aproximadamente 10%. La Tabla 10 presenta una lista de las cantidades de un número de nutrientes comunes que están presentes en el concentrado de alimento presentado en la Tabla 9. Tabla 7. Alimento completo que tiene un contenido incrementado de histidina, por ingrediente Ingrediente Porcentaje en peso Maíz, finamente molido 35.75 Acemite de trigo 16.54 Cascara de soya 19.95 Harina de soya, HiPro 1.88 Sal 0.5 Melaza 1.19 Grasa 1.5 Carbonato de calcio 0.715 Finas de cereal 7.58 Granos de destilador 10.01 Harina de gluten de maíz, 60% 3.03 Sesquicarbonato sódico 0.882 Premezcla de minerales menores 0.039 Premezcla de 5x vitaminas para leche 0.031 Óxido de magnesio 54 0.119 Selenio 0.06% 0.041 Proteína rica en histidina 0.26 Tabla 8. Alimento completo que tiene un alto contenido de histidina, por nutriente Nutriente Proteína cruda, % 14.6 RDP soluble, % 2.77 RUP, % 6.25 Grasa, % 4.51 ?EL, Mcal/cwt 79.7 ?FC, % 40.9 ADF, % 12.4 NDF, % 22.9 Calcio, % 0.474 Fósforo, % 0.399 Magnesio, % 0.269 Azufre, % 0.185 Sal, % 0.758 Vitamina A, Ul/g 13.9 Vitamina D, Ul/g 2.12 Vitamina E, Ul/g 35.4 ddAA HIS, g/kg 3.46 ddAA LYS, g/kg 9.02 ddAA MET, g/kg 2.90 ddAA PHE, g/kg 5.69 ddAA LEU, g/kg 12.9 ddAA THR, g/kg 9.02 Azúcar soluble en rumen, % 5.71 Almidón total ajustado, % 29.4 Almidón gelatinizado, % 9.09 NDF digerible, % 16.6 Tabla 9. Concentrado alimenticio que tiene un contenido incrementado de proteína, por Ingrediente Ingrediente Porcentaje en peso Salvado de arroz 5.0 Maíz molido 9.13 Cascaras de soya 2.00 Harina de pluma 6.367 Harina de soya, HiPro 1.701 Sal 10.437 Carbonato de calcio 1.54 Óxido de magnesio 51.81 Harina de gluten de maíz, 60% 4.25 Bicarbonato de sodio 0.291 Vitamina E 2.83 Premezcla de minerales menores 0.41 Selenio 0.06% 5.00 Proteína rica en histidina 1.631 Harina de soya calentada 0.153 Premezcla de vitaminas 5.0 Tabla 10. Concentrado alimenticio que tiene un contenido incrementado de proteína, por Nutriente Nutriente Proteína cruda, % 45.55 RDP soluble, % 3.18 RUP, % 28.55 Grasa, % 2.43 ?EL, Mcal/cwt 73.20 ?FC, % 15.21 ADF, % 3.80 ?DF, % 6.61 Calcio, % 4.35 Fósforo, % 0.36 Magnesio, % 1.05 Azufre, % 0.37 Sal, % 1.71 Vitamina A, Ul/g 81.4 Vitamina D, Ul/g , 10.1 Vitamina E, Ul/g 225.0 ddAA HIS, g/kg 10.854 ddAA LYS, g/kg 14.0 ddAA MET, g/kg 6.983 ddAA PHE, g/kg 15.2 ddAA LEU, g/kg 15.3 ddAA THR, g/kg 9.14 Azúcar soluble en rumen, % ' 2.5 Almidón total ajustado, % 9.91 Almidón gelatinizado, % 4.1 NDF digerible, % 3.5 La Tabla 11 muestra un ejemplo de un suplemento que tiene un contenido incrementado de histidina protegida para pasaje en el rumen. La tabla 11 presenta una lista de las cantidades relativas de los ingredientes alimenticios que pueden ser utilizados para preparar este suplemento de ejemplo. El suplemento incluye una fuente de histidina protegida para pasaje en rumen, como por ejemplo histidina protegida para pasaje en el rumen y/o proteína rica en histidina protegida para pasaje en el rumen que tiene un contenido de histidina de aproximadamente 10%. La Tabla 12 presenta una lista de las cantidades de numerosos nutrientes comunes presentes en el suplemento presentada en la Tabla 11. La Tabla 13 muestra un ejemplo de una composición alimenticia completa que tiene un contenido incrementado de histidina protegida para pasaje en el rumen. La Tabla 13 presenta una lista de las cantidades relativas de ingredientes alimenticios que pueden ser utilizados para preparar esta composición alimenticia de ejemplo. La composición alimenticia incluye una fuente de histidina protegida para pasaje en el rumen, como por ejemplo histidina protegida para pasaje en el rumen y/o proteína rica en histidina protegida para pasaje en el rumen que tiene un contenido de histidina de aproximadamente 10%. La tabla 14 presenta una lista de cantidades de numerosos nutrientes comunes presentes en la composición alimenticia presentada en la Tabla 13. Tabla 11. Suplemento con contenido incrementado de histidina protegida para pasaje en el rumen, por ingrediente Ingrediente Porcentaje en peso Maíz, finamente molido 10.06 Acemite de trigo 10.0 Salvado de arroz 7.5 Harina de pluma 1.5 Urea 2.8 Sal 2.72 Harina de soya 0.79 Carbonato de calcio 6.26 Óxido de magnesio 1.02 Harina de gluten de maíz, 60% 24.58 Producto de panadería 13.77 Bicarbonato de sodio 6.53 Vitamina E 1.41 Premezcla de minerales menores .044 Selenio 0.06% 0.20 Harina de soya calentada 9.32 Premezcla de 5X vitaminas para leche 0.23 Histamina protegida para pasaje en el rumen 0.58 Tabla 12. Suplemento que tiene un contenido mejorado de histidina protegida para pasaje en el rumen, por nutriente Nutriente Proteína cruda, % 34.0 RDP soluble, % 10.63 RUP, % 14.16 Grasa, % 4.79 ?EL, Mcal/cwt 71.0 ?FC, % 27.12 ADF, % 3.96 ?DF, % 9.14 Calcio, % 2.65 Fósforo, % 0.44 Magnesio, % 0.79 Azufre, % 0.23 Sal, % 2.70 Vitamina A, Ul/g 100.21 Vitamina D, Ul/g 15.77 Vitamina E, Ul/g 775.5 ddAA HIS, g/kg 5.5 ddAA LYS, g/kg 6.507 ddAA MET, g/kg 4.325 ddAA PHE, g/kg 8.175 Azúcar soluble en rumen, % 4.85 Almidón total ajustado, % 19.75 Almidón gelatinizado, % 8.56 NDF digerible, % 5.69 Tabla 13. Alimento completo que tiene un contenido incrementado de histidina, en forma de histidina protegida para pasaje en el rumen Ingrediente Porcentaje en peso Acemite de trigo 7.77 Cascaras de soya 28.65 Pulpa de betabel 11.5 Sal 0.29 Carbonato de Calcio 4.18 Granos de Destilador 13.0 Semilla de algodón entero 8.0 Harina de trigo 7.70 Harina de cañóla 5.62 Óxido de magnesio 54 0.31 Monofosfato dicálcico 0.58 Harina de gluten de maíz, 60% 0.23 Vitamina E 0.47 Premezcla de minerales menores 0.05 Selenio, 0.06% 0.06 Premezcla de 5x vitaminas para leche 0.10 Harina de soya tratada térmicamente 4.5 Histidina protegida para pasaje en el rumen 0.42 Maíz en hojuelas 10.5 Tabla 14. Alimento completo que tiene un contenido incrementado de histidina en forma de histidina protegida para pasaje en el rumen, por nutriente Nutriente Proteína cruda, % 14.5 RDP soluble, % 3.0 RUP, % 5.93 Grasa, % 4.14 NEL, Mcal/cwt 69.89 NFC, % 26.77 ADF, % 20.47 NDF, % 21.24 Calcio, % . 2.45 Fósforo, % 0.45 Magnesio, % 0.57 Azufre, % 0.68 Sal, % 0.29 Vitamina A, Ul/g 36.5 Vitamina D, Ul/g 6.67 Vitamina E, Ul/g 268.5 ddAA HIS, g/kg 3.98 ddAA LYS, g/kg 7.11 ddAA MET, g/kg 2.71 ddAA PHE, g/kg 4.73 Azúcar soluble en rumen, % 5.00 Almidón total ajustado, % 13.00 Almidón gelatinizado, % 8.23 NDF digerible, % 21.92 MODALIDADES ILUSTRATIVAS Las siguientes modalidades son ilustrativas y no deben interpretarse como limitando el alcance de las reivindicaciones. En una modalidad, se proporciona una composición alimenticia. La composición alimenticia incluye una fuente de histidina y al menos un componente de nutriente adicional. La fuente de histidina incluye L-His y constituyentes de fermentación provenientes de la fermentación de un microorganismo productor de histidina. La composición alimenticia tiene una fracción de proteína cruda que tiene un contenido de histidina de al menos aproximadamente 2.8% en peso. Comúnmente, la composición alimenticia tiene una facción de proteína cruda que tiene un contenido de histidina de aproximadamente 2.8-7.0. % en peso, 2.8-5.0 % en peso, y en modalidades adecuadas, aproximadamente 3.0-4.0% en peso. En ciertas modalidades, la fracción de proteína cruda puede representar al menos aproximadamente 10% en peso de la composición alimenticia. Comúnmente, la fracción de proteína cruda representa al menos aproximadamente 14-19% en peso de la composición alimenticia. Al menos una parte de la fuente de histidina puede estar protegida contra degradación en el rumen. Por ejemplo, la L-His presente en la fuente de histidina puede reaccionar con un carbohidrato reductor y/o ser cubierta con una mezcla de recubrimiento. La mezcla de recubrimiento puede incluir al menos un ácido graso. La mezcla de recubrimiento puede incluir aceite vegetal parcialmente hidrogenado (por ejemplo, aceite de soya) y/o un surfactante. Los constituyentes de fermentación pueden incluir constituyentes solubles y/o insolubles provenientes del caldo de fermentación formado durante la fermentación del microorganismo productor de histidina. Los constituyentes de fermentación pueden incluir constituyentes disueltos y/o no disueltos provenientes del caldo de fermentación formado durante la fermentación del microorganismo productor de histidina. Los constituyentes de fermentación, pueden incluir una biomasa formada durante la fermentación del microorganismo productor de histidina. En ciertas modalidades, el microorganismo productor de histidina es un Corynejacterium. En otras modalidades el microorganismo productor de histidina es un Brevibacterium . En ciertas modalidades, la fuente de histidina está protegida para pasaje en el rumen y la composición alimenticia puede proporcionar, post-ruminalmente, una cantidad deseable de la histidina presente en la fuente de histidina protegida para pasaje en el rumen. Por ejemplo, en ciertas modalidades, la composición alimenticia puede proporcionar al menos aproximadamente el 50% de la histidina protegida para pasaje en el rumen, post-ruminalmente. Por ejemplo, aproximadamente 1 g de histidina presente en la fuente de histidina protegida para pasaje en el rumen puede resultar en aproximadamente 500 mg de la histidina presente en la fuente de histidina protegida para pasaje en el rumen suministrándose post-ruminalmente. En otras modalidades, al menos aproximadamente 60%, 70% y en modalidades adecuadas, 80% de la histidina presente en la fuente de histidina protegida para pasaje en el rumen puede ser suministrada post-ruminalmente.

En otra modalidad, se proporciona la composición alimenticia. La composición alimenticia incluye una fuente de histidina y al menos un compuesto nutriente adicional. La fuente de histidina incluye L-His y constituyentes de fermentación provenientes de la fermentación de un microorganismo productor de histidina. La fuente de histidina tiene un contenido de histidina en base en aminoácidos libres de al menos aproximadamente 10 gramos por kilogramo de sólidos secos. Al menos una parte de la fuente de histidina puede estar protegida contra degradación en el rumen. En ciertas modalidades, al menos aproximadamente 50%, 60%, 70% y en modalidades adecuadas 80% de la histidina presente en la fuente de histidina protegida para pasaje en el rumen puede ser suministrada post-ruminalmente. En otra modalidad, se proporciona una composición alimenticia. La composición alimenticia incluye una fuente de histidina protegida para pasaje en el rumen y al menos un componente de nutriente adicional. La fuente de histidina protegida para pasaje en el rumen incluye L-His protegida para pasaje en rumen y/o una proteina rica en histidina protegida para pasaje en rumen de origen no animal. En ciertas modalidades, al menos aproximadamente 50%, 60%, 70% y en modalidades adecuadas 80% de la histidina presenta en la fuente de histidina protegida para pasaje en rumen puede ser suministrado post-ruminalmente. En ciertas modalidades, la fuente de histidina tiene un contenido de histidina en base a aminoácidos libres de al menos aproximadamente 10 gramos por kilogramo de sólidos secos. La proteína rica en histidina que puede estar presente en la fuente de histidina protegida para pasaje en el rumen puede tener un contenido de histidina de al menos aproximadamente 10% con relación al número total de aminoácidos en la proteína. En ciertas modalidades, la L-his protegida para pasaje en el rumen y/o la proteína rica en histidina protegida para pasaje en el rumen de origen no animal ha reaccionado con al menos un azúcar reductor (por ejemplo, lactosa y/o xilosa) . En ciertas modalidades, la L-His protegida para pasaje en el rumen .y/o la proteína rica en histidina protegida para pasaje en el rumen de origen no animal ha sido recubierta con una mezcla de recubrimiento que incluye al menos un ácido graso. La mezcla de recubrimiento puede incluir aceite vegetal parcialmente hidrogenado (por ejemplo, aceite de soya y/o un surfactante. En otras modalidades, se proporciona una composición alimenticia. La composición alimenticia incluye una fuente de histidina protegida para pasaje en el rumen que tiene al menos aproximadamente 40% en peso de aminoácido libre de L-His (con base en sólidos secos) . La composición alimenticia puede tener una fracción de proteína cruda que tiene un contenido de histidina de al menos aproximadamente 2.8% en peso. En una modalidad, el alimento incluye una fracción de proteína cruda que tiene un contenido de histidina de aproximadamente 2.8 a 7.0% en peso. La fuente de histidina protegida para pasaje en el rumen puede incluir constituyentes de fermentación provenientes de la fermentación de un microorganismo productor de histidina. En ciertas modalidades, la fuente de histidina está protegida para pasaje en el rumen mediante la reacción de la fuente de histidina con al menos un azúcar reductor para proporcionar una fuente de histidina protegida para pasaje en el rumen. El azúcar reductor puede incluir lactosa y/o xiloxa. La fuente de histidina puede estar cubierta con una mezcla de recubrimiento que incluye al menos un ácido graso para proporcionar una fuente de histidina protegida para pasaje en el rumen. Por ejemplo, la fuente de histidina puede estar cubierta con una mezcla hidrofóbica que incluye un aceite vegetal parcialmente hidrogenado, como por ejemplo aceite de soya. La mezcla hidrofóbica puede incluir una cera, como por ejemplo cera de abeja. La fuente de histidina puede • estar cubierta con surfactante. En ciertas modalidades, la fuente de histidina está cubierta con una mezcla hidrofóbica y después subsiguientemente cubierta con un surfactante. En ciertas modalidades, cuando la composición alimenticia es alimentada un rumiante, al menos aproximadamente el 50% de la histidina presente en la fuente de histidina protegida para pasaje en el rumen puede ser suministrada después del rumen. Más comúnmente, cuando la composición alimenticia se alimenta un rumiante, al menos aproximadamente 60%, 70% y en modalidades adecuadas 80% de la histidina presente en la fuente de histidina protegida para pasaje en el rumen puede suministrarse post-ruminalmente. EJEMPLOS Protocolos de Reacción de Maillard 1. Cantidades iguales de azúcar (1.5 g de xilosa, fructosa, lactosa, ó glucosa) y aminoácido (1.5 g de histidina o lisina) se colocan en un tubo de centrifugación de 50 mi. Se agrega agua (0.9 mi) y el tubo es tapado. Los tubos son incubados en un baño maria a una temperatura de 80° C durante hasta 2 horas. Muestras son liofilizadas, después redisueltas en 40 mi de H20. Se detectan productos de reacción de Maillard mediante la medición de la absorbancia a 420 nm. Muestras son diluidas en agua, en caso necesario para obtener una absorbancia inferior a 2.0 unidades de absorbancia. 2. Se disuelven histidina (0. g) y almidón de dialdehido (0.5 g) enlO mi de amortiguador de fosfato de sodio 0.05 M (pH 8.0) en un tubo de centrifugación de 50 mi. El tubo es tapado e incubado a una temperatura de 65° C o 100 ° C durante hasta 4 horas. Productos de Maillard solubilizados se almacenan a 4° C. Se detectan productos de reacción de Maillard mediante al medición de la absorbancia a 420 nm. Muestras son diluidas en agua, en caso necesario, para obtener una absorbancia inferior a 2.0 unidades de absorbancia. Determinación de degradación de histidina protegida por Maillard In vivo Se determinó la degradación de aminoácido libre in vivo mediante la utilización de una técnica que utilizó cobalto (CoII) como marcador de flujo nominal para seguir el flujo de histidina protegida por Maillard (que había sido tratado con lactosa) fuera del rumen. La pérdida de histidina protegida por Maillard fue evaluada con relación a la salida de CoII en vacas fistuladas. Histidina libre o histidina modificada por el protocolo de reacción de Maillard fueron introducidas en las vacas fistuladas junto con Cobalto II. Después de al introducción de la histidina o histidina modificada en las vacas, muestras de fluido de rumen fueron extraídas periódicamente y se determina la cantidad de histidina utilizando un ensayo de O-ftaldialdehído de conformidad con lo descrito por Roth (1971), Anal. Chem. 43:880. La cantidad de CoII fue determinada empleando espectroscopia de emisión de plasma acoplada inductivamente. La cantidad de histidina con relación a CoII fue graficada versus el tiempo para calcular un coeficiente de degradación (Kd) para histidina libre y protegida. El coeficiente de degradación para histidina libre fue determinado en Kd = 0.75 - 0.95 / hora. El coeficiente de degradación para histidina modificada por el protocolo de reacción de Maular fue determinado en Kd = 0.17 / hora. Preparación de la histidina recubierta Se preparó histidina recubierta mediante el rociado de L-His de grado comercial con una mezcla de aceite de soya parcialmente hidrogenada, y cera, para preparar un sustrato de L-His pre-recubierto. El sustrato de L-His pre-recubierto fue después cubierto con un surfactante utilizando la metodología sustancialmente descrita en las Patentes Norteamericanas Números 5,190,775; 6,013,286; y 6,106,871, cuyos contenidos enteros se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Determinación de la degradación de histidina recubierta In Vitro Degradación de histidina in vi tro y degradación de lisina in vitro. Varias cantidades de lisina e histidina libres (a partir de soluciones madres de 100 mM) fueron agregadas a tubos de 16 x 100 mm con tapones de caucho. Las concentraciones finales de histidina y lisina estaban dentro de un rango de 0 a 5 mM. Varias cantidades de histidina recubierta y lisina recubierta (pesadas) fueron agregadas a tubos de 25 x 150 mm con tapones de caucho. Las concentraciones finales de histidina y lisina estuvieron dentro de un rango de 0 a 5 mM. Se recogió el fluido de rumen de dos vacas, con privación de alimento y se tamizó (en C02) a través de cuatro capas de tela. En un pipeteador de repetición (mantenido a 39° C) , se agregaron 300 mi de fluido de rumen tamizado a 700 mi de amortiguador McDougall. Tubos de aminoácido libre fueron dosificados con 2 mi de solución de fluido de rumen y los tubos de aminoácido encapsulados recibieron 10 mi. Los tubos fueron apagados con C02, tapados con tapones de caucho y colocados en un baño maría a una temperatura de 39° C durante 30 minutos. Las reacciones fueron detenidas mediante adición de 0.2 mi o 1 mi de ácido metafosfórico al 55% (MPA) hasta alcanzar una concentración final de MPA de 5%. Reacciones de aminoácido libre fueron transferidas a tubos de centrifugación de 12x75 mm y sometidas a rotación a 9000 rpm, 4° C durante 10 minuto's . El sobrenadante fue transferido a tubos de 13x100 mm y almacenado a 4° C hasta que fuese sometido a ensayo. Reacciones de aminoácido recubierto: 0.2 mi fueron transferidos a un tubo de microcentrifugación y son sometidos a rotación durante 5 minutos, a temperatura ambiente, a velocidad #14. El sobrenadante fue transferido a un tubo de microcentrifugación limpio y almacenado a 4° C hasta ser sometido a ensayo (Tubo A) . La reacción restante fue incubada en un baño maría a 80° C durante 5 minutos para derretir las perla y liberar los aminoácidos protegidos. 1 mi de la reacción fue transferido a un tubo de centrifugación de 12x75 mm y sometido a rotación a 9000 rpm, 4° C, durante 10 minutos. El sobrenadante fue transferido a tubos de 13x100 mm y almacenado a 4° C hasta ser sometido a ensayo (Tubo B) . [aminoácido] en B - [aminoácido] en A = cantidad protegida. Concentraciones de histidina libre fueron determinadas utilizando el ensayo Pauly (véase SOP) . Concentraciones de lisina libre fueron determinadas utilizando el ensayo de Lys Oxidasa (véase SOP) . La velocidad de degradación de aminoácido (V, µmol/ml/hr) fue graficada contra la concentración inicial de aminoácido (So, µmol/ml) . Los datos fueron ajustados a la ecuación de Hill: v = Vma?[S]? / (K' + [S]?). La Figura 7 muestra los resultados para histidina libre e histidina recubierta. Se preparó una solución de McDougall (sin CaCl2) la noche antes de efectuar el experimento. Amortiguador de McDougall (1 Litro): S-8875 bicarbonato de sodio (NaHC03)(9.8 g) ; S-0876 fosfato de sodio dibásico (Na2HP04 * 7H20) (7.0 g ó 3.71 g anhidro); P-4504 cloruro de potasio (KC1)(0.57 g) ; S271-500 cloruro de sodio (NaCl) (0.47 g) ; M-1880 sulfato de magnesio (MgS04*7H20) (0.12 g) ; C-5080 cloruro de calcio (CaCl2) (0.04 g agregado justo antes de uso) ; burbujeo con C02 para obtener un pH de 6.8-7.2. El día del experimento, se agregaron 1.45 g de maltosa por L de solución de McDougall; se agregaron 1.45 g de celobiose por L de solución de McDougall. Se agregó aproximadamente 0.525 mL de BME por litro de SRF. La solución de dosificación incluyó 70% McDougall, 30% SRF. Determinación de la degradación de histidina recubierta In Vivo Este ensayo probó cuatro fuentes diferentes de AA para determinar su digestibilidad intestinal. Se recubrieron His y Lys cristalinos con aceite vegetal parcialmente hidrogenado para probar su digestibilidad en comparación con His (HCl) y Lys(Hcl), respectivamente. His (HCl) contiene 74.3% en peso de His, mientras que el producto recubierto contiene 40% en peso de His. Lys (HCl) contiene 78.8% en peso de Lys mientras que el producto recubierto contiene 45% en peso de Lys. Para este ensayo se agregaron los artículos de prueba en niveles muy bajos. La dieta de control fue utilizada como blanco para medir las pérdidas endógenas y para calcular la digestibilidad de His y Lys. La dieta de control fue sembrada con His o Lys mediante la utilización ya sea de His (HCl) o Lys(HCl), respectivamente (tasa de inclusión: 0.50%). Esto proporcionó His y Lys al 0.372% y 0.394%, respectivamente. Los productos His y Lys recubiertos fueron agregados para proporcionar el mismo nivel de His o Lys que el nivel proporcionado por His (HCl) o Lys (HCl), respectivamente. La digestibilidad de His y Lys en la caseína fue determinada y este efecto fue evaluado en el cálculo de la digestibilidad de His recubierta y Lys recubierta. Todas las dietas de prueba contenían la misma cantidad de caseína (la única otra fuente de His y Lys) que la dieta de control. Los resultados se ofrecen en la Tabla 15. Tabla 15. Ensayo de digestibilidad en aves Digestibilidad de Digestibilidad de His Ap. His verdadera Control 97.8 NA Histidina HCl 99.3 100.2 Histidina recubierta 94.0 95.2 Lisina HCL NA NA Lisina recubierta NA NA SEM 1.8 2.2 Pr>t 0.0689 0.1554 (Continuación Tabla 15) Digestibilidad de Digestibilidad de Lys Ap. Lys verdadera Control 96.6 NA Histidina HCl NA NA Histidina recubierta NA NA Lisina HCL 97.3 99.6 Lisina recubierta 95.5 97.9 SEM 0.4 0.5 Pr>t 0.0146 0.0341 Todas las referencias, patentes y/o solicitudes mencionadas en la especificación que indican el nivel de conocimiento de las personas con conocimientos en la materia a la cual pertenece la invención y se incorporan por referencia en sus totalidades, incluyendo tablas y figuras, de la misma manera que si cada referencia estuviese incorporada por referencia en su totalidad individualmente. Será fácilmente aparente a una persona con conocimientos en la materia que varias sustituciones y modificaciones pueden efectuarse a la invención divulgada aquí sin salirse del alcance y espíritu de la invención. La invención descrita ilustrativamente aquí puede ser practicada de manera adecuada en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones no específicamente divulgadas aquí. Los términos y expresiones que han sido empleados se utilizan como términos descriptivos y no limitativos y no hay ninguna intención en que el uso de tales términos y expresiones excluya equivalentes de las características mostradas y descritas o partes de las mismas, pero se reconoce que varias modificaciones son posibles dentro del alcance de la presente invención. Se entenderá que aún cuando la presente invención ha sido ilustrada a través de modalidades específicas y características opcionales, modificación y/o variación de los conceptos divulgados aquí pueden utilizarse por parte de las personas con conocimientos en la materia y que tales modificaciones y variaciones se consideran dentro del alcance de la invención. Además, cuando características o aspectos de la invención se describen en términos de grupos de Markush y otros grupos de alternativas, las personas con conocimientos en la materia reconocerán que la invención se describe también en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo de Markush o de otro grupo. Así mismo, a menos que se indique lo contrario, cuando varios valores numéricos se proporcionan para modalidades, se describen modalidades adicionales tomando cualquier par de valores diferentes como los puntos finales de un rango. Dichos rangos están también dentro del alcance de la invención descrita.

Claims (23)

1. REIVINDICACIONES 1. Una composición de alimento que comprende una fuente de histidina protegida para pasaje en el rumen y una fuente de lisina protegida para pasaje en el rumen.
2. 2. La composición de alimento de conformidad con la reivindicación 1, en donde la fuente de histidina protegida para pasaje en el rumen comprende un recubrimiento y la fuente de lisina protegida para pasaje en el rumen comprende un recubrimiento.
3. 3. La composición de alimento de conformidad con la reivindicación 2, en donde el recubrimiento comprende un componente de lípido.
4. 4. La composición de alimento de conformidad con la reivindicación 3, en donde el componente de lipido comprende un ácido graso.
5. 5. La composición de alimento de conformidad con la reivindicación 3, en donde el recubrimiento comprende además un surfactante.
6. 6. La composición de alimento de conformidad con la reivindicación 2, en donde el recubrimiento comprende estearato de zinc.
7. 7. La composición de alimento de conformidad con la reivindicación 1, en donde la fuente de histidina protegida para pasaje en el rumen incluye histidina que ha reaccionado con al menos un azúcar reductor.
8. 8. La composición de alimento de conformidad con la reivindicación 1, en donde la composición de alimento tiene un contenido de proteína cruda de al menos aproximadamente 14% en peso y la histidina comprende aproximadamente 3-7% en peso del contenido de proteína cruda.
9. 9. La composición de alimento de conformidad con la reivindicación 1, en donde la fuente de histidina protegida para pasaje en el rumen tiene un contenido de L-His de al menos aproximadamente 17% en peso (dsb) .
10. 10. La composición de alimento de conformidad con la reivindicación 1, en donde la composición puede suministrar al menos aproximadamente 50% de la histidina protegida para pasaje en el rumen post-ruminalmente para absorción intestinal.
11. 11. La composición de alimento de conformidad con la reivindicación 10, en donde la composición de alimento tiene un contenido de proteína cruda de al menos aproximadamente 14% en peso y la histidina comprende aproximadamente 3-7% en peso del contenido de proteína cruda.
12. 12. La composición de alimento de conformidad con la reivindicación 1, que comprende además una proteína rica en histidina protegida para pasaje en el rumen de origen no animal.
13. 13. La composición de alimento que comprende una fuente de histidina protegida para pasaje en el rumen, en donde la composición de alimento tiene un contenido de proteína cruda de al menos aproximadamente 14% en peso y la histidina comprende aproximadamente 3-7% en peso del contenido de proteína cruda.
14. 14. La composición de alimento de conformidad con la reivindicación 13, que comprende además una proteína rica en histidina protegida para pasaje en el rumen de origen no animal.
15. 15. Un método para incrementar la producción de leche en un rumiante, dicho método comprende la alimentación al rumiante de una composición que comprende una fuente de histidina protegida para pasaje en el rumen y una fuente de lisina protegida para pasaje en el rumen.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, en donde la fuente de histidina protegida para pasaje en el rumen comprende un recubrimiento y la fuente de lisina protegida para pasaje en el rumen comprende un recubrimiento.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, en donde el recubrimiento comprende un componente de lípido.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde el componente de lípido comprende un ácido graso.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde el recubrimiento comprende además un surfactante.
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 16, en donde el recubrimiento comprende estearato de zinc.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 15, en donde la composición puede suministrar al menos aproximadamente 50% de la histidina recubierta post- ruminalmente, para absorción intestinal.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 15, en donde la composición comprende además una proteina rica en histidina protegido para pasaje en el rumen de origen no animal.
23. 23. Un método para incrementar la producción de leche en un rumiante, que comprende la administración al rumiante de una composición que comprende la composición de alimento de la reivindicación 13.