MXPA06001745A - Metodos y medios para alterar las caracteristicas de las fibras en plantas que producen fibras. - Google Patents

Abstract

Se proveen metodos y medios para modular la longitud de las fibras en plantas que producen fibras tales como el algodon, alterando la fase de elongacion de las fibras; la fase de elongacion de las fibras puede aumentarse o disminuirse interfiriendo con la deposicion de calosa en los plasmodesmos en la base de las celulas fibrosas.

Description

MÉTODOS Y MEDIOS PARA ALTERAR LAS CARACTERÍSTICAS DE LAS FIBRAS EN PLANTAS QUE PRODUCEN FIBRAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere al campo de agricultura, más específicamente al uso de técnicas de biología molecular para alterar plantas que producen fibras, en particular plantas de algodón, y/o acelerar el mejoramiento genético de dichas plantas que contienen fibras. Se proveen métodos y medios para aumentar "la longitud de las fibras, en particular la longitud de fibras de pelusa, o para disminuir la longitud de fibras de borra. Se proveen también métodos para identificar marcadores moleculares asociados con la longitud de las fibras en una población de variedades de algodón, y plantas progenitoras relacionadas.

TÉCNICA ANTECEDENTE Gran parte de las fibras de alta calidad para la industria textil, es provista por el algodón. Aproximadamente 90% del algodón cultivado mundialmente es Grossypium hirsutum L., mientras que Gossypium barbadense da razón de aproximadamente 8%. En consecuencia, la modificación de las características de las fibras de algodón para adaptar mejor los requisitos de la industria, es un esfuerzo mayor en el mejoramiento genético mediante métodos clásicos, o alterando genéticamente el genoma de las plantas de algodón. Las metas por lograr incluyen longitud incrementada de las fibras de pelusa, resistencia, afinidad por colorantes, producción disminuida de fibras de borra, relación de madurez de las fibras, contenido de fibras inmaduras, uniformidad de las fibras y micronaire. El documento WO0245485 describe métodos y medios para modular la calidad de las fibras en plantas que producen fibras, tales como el algodón, modulando la actividad y/o expresión de sacarosa sintasa en dichas plantas. Los documentos US6472588 y WO0117333 proveen métodos para aumentar la calidad de las fibras de algodón producidas por una planta de algodón mediante transformación con un ADN que codifica para sacarosa fosfato sintasa. Las cualidades de las fibras incluyen resistencia, longitud, relación de madurez de las fibras, contenido de fibras inmaduras, uniformidad de las fibras y micronaire. El documento WO9508914 describe una planta que produce fibras, que comprende en su genoma una construcción genética heteróloga. La construcción genética comprende un promotor específico de fibras y una secuencia codificante que codifica para una peroxidasa de plantas, tal como una peroxidasa de algodón. El documento W09626639 provee métodos por los cuales secuencias codificantes que dirigen preferiblemente la expresión génica en el tejido del ovario, en particular muy tempranamente en el desarrollo del fruto, se usan para expresar hormonas que modifican el crecimiento de la planta en el tejido del óvulo del algodón. Los métodos permiten la modificación de las características de la cápsula en las plantas de algodón, y proveen un mecanismo para alterar las características de calidad de las fibras, tales como dimensión y resistencia de las fibras. Los documentos US5981834, US5597718, US5620882, US5521708 y US 5495070 describen un método para diseñar genéticamente una planta que produce fibras, y la identificación de clones de ADNc útiles para identificar genes de fibras en el algodón. Los clones de ADNc son útiles en el desarrollo de clones genómicos correspondientes de plantas que producen fibras, y permiten el diseño genético del algodón y otras plantas usando estos genes. Las secuencias codificantes de estos genes aislados se usan en orientación sentido o antisentido para alterar las características de las fibras de plantas transgénicas que producen fibras. Las solicitudes de patente de E.U.A. publicadas US2002049999 y US2003074697 describen plantas de algodón del género Gossypium con características mejoradas de las fibras de algodón. Las plantas de algodón tienen un cassette de expresión que contiene un gen que codifica para una enzima seleccionada del grupo que consiste de endoxiloglucano transferasa, catalasa y peroxidasa, de modo que el gen se expresa en células fibrosas de algodón para mejorar las características de las fibras de algodón. El documento US5880110 produce fibras de algodón con características mejoradas de las fibras, mediante tratamiento con brassinoesteroides. El documento WO 01/40250 provee métodos para mejorar la calidad de las fibras de algodón, modulando la expresión génica del factor de transcripción. El documento WO 96/40924 provee construcciones de ADN novedosas que pueden usarse como sondas moleculares, o que pueden insertarse en una planta hospedera, para proveer la modificación de la transcripción de una secuencia de ADN de interés durante varias etapas de desarrollo de las fibras de algodón. Las construcciones de ADN comprenden una región reguladora del inicio de la transcripción de fibras de algodón asociada con un gen, que se expresa en fibras de algodón. Se describe también algodón novedoso que tiene fibras de algodón, que tienen un color natural, introducido por la expresión en células fibrosas de algodón, usando dicha construcción, de genes de pigmento. El documento EP0834566 provee un gen que controla el mecanismo de formación de las fibras en plantas de algodón, y que puede usarse para mejora industrialmente útil. Sin embargo, existe aún la necesidad de métodos y medios alternativos que permitan alterar las características de las fibras de plantas que producen fibras, tales como el algodón, que puedan combinarse además con cualquiera de otros métodos para alterar las características de las fibras.

Dicho método se describe en las modalidades y reivindicaciones descritas más adelante.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una modalidad de la invención, se provee un método para modificar una fibra de una planta que produce fibras, tal como el algodón, que comprende el paso de alterar la fase de elongación de una célula fibrosa modulando la deposición de calosa (ó callosa) en el cuello de los plasmodesmos en la base de la célula fibrosa. En otra modalidad de la invención, se provee un método para aumentar la longitud de una fibra de una planta que produce fibras, tales como el algodón, que comprende el paso de introducir un gen quimérico en una célula de la planta que produce fibras, en donde el gen quimérico, cuando se expresa en la célula de la planta que produce fibras, aumenta la fase de elongación de las fibras, y aumenta la deposición de calosa. El gen quimérico puede comprender los siguientes elementos de ADN enlazados operablemente: - un promotor expresable en plantas, de preferencia un promotor expresable en plantas que controla la transcripción de preferencia en las células fibrosas, tal como un promotor de beta-tubulina específico de fibras del algodón, un promotor de actina específico de fibras del algodón, un promotor específico de fibras de un gen de proteína de transferencia de lípidos del algodón, un promotor de un gen de expansína del algodón, o un promotor de un gen de quitinasa en el algodón; - una región de ADN transcrita, que cuando es transcrita, da una molécula de ARN de doble cadena capaz de reducir la expresión de un gen endógeno para la planta que produce fibras, el gen interviniendo en la remoción de calosa de los plasmodesmos, tal como un gen de 1 ,3-ß-glucanasa que se expresa en la base de la célula fibrosa, al final de la fase de elongación de la fibra en la planta que produce fibras, y la molécula de ARN comprendiendo una primera y segunda regiones de ARN, en donde: - la primera región de ARN comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 19 nucleótidos consecutivos que tiene por lo menos aproximadamente 94% de identidad de secuencias con la secuencia de nucleótídos del gen endógeno; - la segunda región de ARN comprende una secuencia de nucleótídos complementaria a los 19 nucleótidos consecutivos de la primera región de ARN; - la primera y segunda regiones de ARN son capaces de mostrar apareamiento de bases para formar una molécula de ARN de doble cadena entre por lo menos los 19 nucleótidos consecutivos de la primera y segunda regiones; y - una región de extremo 3' que comprende señales de poliadenilación y de terminación de la transcripción funcionando en las células de la planta. El gen endógeno puede codificar para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 4, o puede comprender la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 1 , o la primera región de ARN puede comprender una secuencia de nucleótidos de por lo menos 19 nucleótidos consecutivos que tiene por lo menos aproximadamente 94% de identidad de secuencias con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 1. En otra modalidad de la invención, el gen quimérico puede comprender: - un promotor expresable en plantas, de preferencia un promotor expresable en plantas que controla la transcripción de preferencia en las células fibrosas, tal como un promotor de beta-tubulina específico de fibras del algodón, un promotor de actina específico de fibras del algodón, un promotor específico de fibras de un gen de proteína de transferencia de lípidos del algodón, un promotor de un gen de expansina del algodón, o un promotor de un gen de quitinasa en el algodón; - una región de ADN que codifica para una proteína ß-1,3-glucano sintasa, tal como una región de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 2; y - una región de extremo 3' que comprende señales de poliadenilación y de terminación de la transcripción funcionando en las células de la planta. En otra modalidad de la invención, se describe un método para disminuir la longitud de una fibra de una planta que produce fibras, que comprende el paso de introducir un gen quimérico en una célula de la planta que produce fibras, en donde el gen quimérico, cuando se expresa en la célula de la planta que produce fibras, disminuye la deposición de calosa y disminuye la fase de elongación de las fibras. Es también un objetivo de la invención, proveer un método para identificar variaciones alélicas de los genes que codifican para proteínas que intervienen en la elongación de las fibras en una población de diferentes genotipos, cultivares o variedades de una especie de planta particular, de preferencia una especie de planta que produce fibras, que se correlacionan solas o en combinación con la longitud de las fibras producidas, que comprende los pasos de: (a) proveer una población de diferentes variedades o genotipos de una especie de planta particular, o hibridar especies de plantas que comprenden diferentes formas alélicas de las secuencias de nucleótidos que codifican para calosa sintasa o ß-1,3-glucanasa, en particular de SEQ ID No 1 o SEQ ID No 2; (b) determinar parámetros relacionados con la longitud de las fibras para cada individuo de la población; (c) determinar la presencia de una forma alélica particular de las secuencias de nucleótidos que codifican para calosa sintasa o ß-1 ,3-glucanasa, en particular de SEQ ID No 1 o SEQ ID No 2; (d) correlacionar la ocurrencia de la longitud de la fibra particular con la presencia de una forma alélica particular de la secuencia de nucleótidos mencionada, o una combinación particular de dichas formas alélicas. En otra modalidad, la invención provee los genes quiméricos como se describen en la presente, así como células de una planta que produce fibras, que comprenden dichos genes quiméricos. Es también un objetivo de la ¡nvención, proveer plantas que producen fibras, tales como el algodón, y semillas o progenie que comprenden un gen quimérico de conformidad con la invención, en particular plantas que producen fibras que tienen longitud incrementada de las fibras o resistencia incrementada a la sequía. La ¡nvención provee también fibras producidas de conformidad con los métodos de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 es una representación gráfica de la evolución de la longitud de las fibras con el tiempo, para tres cultivares de algodón tetraploides con fibras cortas, normales y largas (Gh-r, Gh-c y Grb, respectivamente). El eje X representa días después de la antesis (DAA), mientras que el eje Y representa la longitud de las fibras en cm. Los triángulos representan la longitud de las fibras para Gb, los círculos oscuros representan la longitud de las fibras para Gh-c, y los círculos claros representan Gh-r. El cierre de los plasmodesmos es indicado por las barras horizontales (barra clara para Gh-c; barra oscura para Gb; los plasmodesmos no se cierran en Gh-r). Las figuras 2A-2F representan la localización de la calosa en los plasmodesmos en la base de la fibra en el cultivar Gh-c, a 10 DAA (figuras 2B, 2E y 2F), cuando los plasmodesmos se cerraron; a 5 DAA (figura 2A y figura 2D) antes de que los plasmodesmos se cerraran, o a 20 DAA (figura 2C) cuando los plasmodesmos se volvieron a abrir. Figuras 2A-2C: marcación fluorescente con azul de anilina. Figuras 2A-2E: marcación immuno-gold con anticuerpo monoclonal contra calosa (microscopio óptico). Figura 2F: marcación ¡mmuno-gold con anticuerpo monoclonal contra calosa (microscopio, electrónico). Las flechas indican la base de la fibra, en donde puede ocurrir deposición de calosa, f: fibra; se: tegumento. La figura 3 representa el análisis Northern de ARN mensajero, preparado a partir de fibras en desarrollo 6, 12 y 20 DAA, y semilla de 6 días, en cultivares de algodón Gh-r, Gh-c y Gb. Las sondas usadas son un clon de ADNc de ß-1 ,3-glucanasa que comprende la secuencia de SEQ ID No 1 (parte superior), o un clon de ADNc de ß-1 ,3-glucanasa que comprende la secuencia con el número de acceso AI728205.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS DIFERENTES MODALIDADES Cada fibra de pelusa de algodón, es una célula individual que se elonga (alarga) hasta 2.5 a 3.0 cm a partir de la epidermis del tegumento, dentro de aproximadamente 16 días después de la antesis (DAA). Rúan ef al. 2001 (The Plant Cell 13: pp 47-60), encontraron que este proceso de elongación se controló mediante la activación periódica de los plasmodesmos y la expresión coordinada de los transportadores de sacarosa y K+ y expansina. Las fibras de algodón de una sola célula se interconectan con el tegumento subyacente sólo en las regiones de su base, en donde está presente un alto número de plasmodesmos. Los plasmodesmos son las conexiones citoplásmicas intercelulares que actúan como compuertas que controlan el tráfico molecular de célula a célula. Durante la fase de elongación rápida (-10 a -16 DAA), la conexión simplástica fue interrumpida, permitiendo el aumento rápido de la turgencia en la célula fibrosa, que es mayor que en las células del tegumento subyacente, por la entrada de soluto activo en la célula fibrosa. Coordinada con la relajación de la pared celular (entre otros por las expansjnas), esta mayor turgencia proyecta la célula fibrosa hacia su longitud. Rué et al., examinaron también la posibilidad de que la deposición de calosa en la región del cuello de los plasmodesmos estuviera implicada en el cierre de los mismos, pero no se encontró correlación alguna usando un anticuerpo monoclonal contra la calosa, entre el depósito de calosa y el cierre y reapertura de los plasmodesmos. La presente invención se basa en las observaciones de los inventores de que, por un lado, la duración del período de cierre de los plasmodesmos en diferentes cultivares de algodón, se correlaciona con la variación en la longitud de las fibras y, por otro, que la deposición de calosa interviene en el cierre de los plasmodesmos. Además, se observó que la duración y el nivel de expresión de un gen de ß-1 ,3-glucanasa específico de fibras entre tres cultivares de algodón que difieren en la longitud de las fibras, se correlacionaron con la degradación de calosa en los plasmodesmos.

De esta manera, en una modalidad de la invención, se provee un método para alterar la longitud de una fibra de una planta que produce fibras, tal como una planta de algodón, que comprende el paso de alterar la fase de elongación de la célula fibrosa modulando la deposición de calosa en el cuello de los plasmodesmos en la base de la célula fibrosa. Convenientemente, la deposición de calosa puede alterarse por la introducción de un gen quimérico capaz de modular la deposición de calosa en el cuello de los plasmodesmos en la base de la célula fibrosa. Esto puede lograrse, por ejemplo, aumentando el nivel de expresión y/o la actividad del producto codificado de un gen que interviene en la remoción de calosa, tal como una ß-1 ,3-glucanasa. La deposición de calosa puede alterarse también aumentando el nivel de expresión y/o la actividad del producto codificado de un gen que interviene en la síntesis y acumulación de calosa, tal como una ß-1 ,3-glucano sintasa (calosa sintasa). En una modalidad, el gen quimérico puede codificar para una molécula de ARN de silenciamiento o una molécula de ARN inhibidora, capaz de reducir la expresión de un gen que interviene en la remoción de calosa de los plasmodesmos en la base de la célula fibrosa, para aumentar la longitud de las fibras. Dicha reducción de la expresión de un gen que interviene en la remoción de calosa, debe ocurrir de preferencia a través de silenciamiento post-transcripción. Sin embargo, será claro que aún cuando una molécula de ARN inhibidora disminuya la expresión de un gen que interviene en la remoción de calosa a través de silenciamiento post-transcripción, dicha molécula de ARN puede ejercer también otras funciones dentro de una célula, tales como guiar la metilación de ADN del gen endógeno que interviene en la remoción de calosa, de nuevo llevando finalmente a la expresión disminuida de ese gen. Asimismo, la expresión de genes endógenos que intervienen en la remoción de calosa, puede reducirse mediante silenciamiento transcripcional, por ejemplo, usando ARNi o ARNds dirigido contra la región de promotor del gen endógeno que interviene en la remoción de calosa. Varios métodos están disponibles en la técnica para producir una molécula de ARN de silenciamiento, es decir, una molécula de ARN que cuando se expresa, reduce la expresión de un gen o grupo de genes particular, incluyendo las denominadas tecnologías de ARN "sentido" o "antisentído". De esta manera, en una modalidad, el gen quimérico que codifica para una molécula de ARN inhibidora, se basa en la denominada tecnología antisentido. En otras palabras, la región codificante del gen quimérico comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 20 nucleótidos consecutivos del complemento de la secuencia de nucleótidos del gen endógeno que interviene en la remoción de calosa de la planta. Dicho gen quimérico puede construirse enlazando operablemente un fragmento de ADN que comprende por lo menos 20 nucleótidos de un gen que interviene en la deposición de calosa, aislado o identificado como se describe en otra parte en esta solicitud, en orientación inversa a un promotor expresable en plantas y región de formación de extremo 3' que interviene en la terminación de la transcripción y poliadenílación. Será claro que no existe necesidad de conocer la secuencia de nucleótidos exacta o la secuencia de nucleótidos completa de dicho fragmento de ADN del gen aislado que interviene en la remoción de calosa. En otra modalidad, el gen quimérico que codifica para una molécula de ARN inhibidora, se basa en la denominada tecnología de co-supresión. En otras palabras, la región codificante del gen quimérico comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 20 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos del gen endógeno que interviene en la remoción de calosa de la planta. Dicho gen quimérico puede construirse enlazando operablemente un fragmento de ADN que comprende por lo menos 20 nucleótidos de un gen que interviene en la deposición de calosa, aislado o identificado como se describe en otra parte en esta solicitud, en orientación directa a un promotor expresable en plantas y región de formación de extremo 3' que interviene en la terminación de la transcripción y poliadenilación. De nuevo, será claro que no existe necesidad de conocer la secuencia de nucleótidos exacta o la secuencia de nucleótidos completa de dicho fragmento de ADN del gen aislado que interviene en la remoción de calosa. La eficiencia de los genes quiméricos mencionados anteriormente en la reducción de la expresión del gen endógeno que interviene en la remoción de calosa, puede mejorarse además por la inclusión de un elemento de ADN que resulte en la expresión de moléculas de ARN inhibidoras no poliadeniladas aberrantes, o que resulte en la retención de las moléculas de ARN inhibidoras en el núcleo de las células. Dicho elemento de ADN adecuado para ese propósito, es una región de ADN que codifica para una ribozima de autoempalme, como se describe en el documento WO 00/01133 (incorporado en la presente como referencia). Otro elemento de ADN adecuado para ese propósito, es una región de ADN que codifica para una señal de retención o localización nuclear de ARN, como se describe en el documento PCT/AU03/00292, publicado como documento WO03/076619 (incorporado en la presente como referencia). Una forma conveniente y muy eficiente de subregular la expresión de un gen de interés, usa el denominado ARN de doble cadena (ARNds) o ARN de interferencia (ARNi) como se describe, por ejemplo, en el documento WO99/53050 (incorporado en la presente como referencia). En esta tecnología, una molécula de ARN se introduce en una célula vegetal, por medio de la cual la molécula de ARN es capaz de formar una región de ARN de doble cadena sobre por lo menos aproximadamente 19 a aproximadamente 21 nucleótidos, y por medio de la cual una de las cadenas de esta región de ARN de doble cadena es casi idéntica en secuencia de nucleótidos al gen objetivo ("región sentido"), mientras que la otra cadena es casi idéntica en secuencia de nucleótidos al complemento del gen objetivo o de la región sentido ("región antisentido"). Se espera que para el silenciamiento de la expresión del gen objetivo, la secuencia de nucleótidos de las secuencias de 19 nucleótidos consecutivos, pueda tener un no apareamiento, o que la región sentido y antisentido pueda diferir en un nucleótido. Para lograr la construcción de dichas moléculas de ARN o los genes quiméricos codificantes, pueda hacerse uso del vector que se describe en el documento WO 02/059294. De esta manera, en una modalidad de la invención, se provee un método para aumentar la longitud de una fibra de una planta que produce fibras, tal como el algodón, que comprende el paso de introducir un gen quimérico en una célula de la planta que produce fibras, en donde el gen quimérico comprende los siguientes elementos de ADN enlazados operablemente: (e) un promotor expresable en plantas, de preferencia un promotor expresable en plantas que controla la transcripción de preferencia en las células fibrosas; (f) una región de ADN transcrita, que cuando es transcrita, da una molécula de ARN de doble cadena capaz de reducir la expresión de un gen endógeno para la planta que produce fibras, el gen interviniendo en la remoción de calosa de los plasmodesmos, y la molécula de ARN comprendiendo una primera y segunda regiones de ARN, en donde: i) la primera región de ARN comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 19 nucleótidos consecutivos que tiene por lo menos aproximadamente 94% de identidad de secuencias con la secuencia de nucleótidos del gen endógeno; ii) la segunda región de ARN comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a los nucleótidos consecutivos (por lo menos 19) de la primera región de ARN; iii) la primera y segunda regiones de ARN son capaces de mostrar apareamiento de bases para formar una molécula de ARN de doble cadena entre por lo menos los 19 nucleótidos consecutivos de la primera y segunda regiones; y (g) una región de extremo 3' que comprende señales de poliadenilación y de terminación de la transcripción funcionando en las células de la planta. Como se usa en la presente, se interpretará que la expresión "que comprende", especifica la presencia de los rasgos, entidades completas, pasos o componentes establecidos relacionados con uno o más rasgos, entidades completas, pasos o componentes (pero que no excluyen la presencia o adición de los mismos), o grupos de los mismos. De esta manera, por ejemplo, un ácido nucleico o proteína que comprenda una secuencia de nucleótidos o aminoácidos, puede comprender más nucleótidos o aminoácidos que los citados realmente, es decir, los incluidos en un ácido nucleico o proteína más grande. Un gen quimérico que comprenda una región de ADN, que esté funcionalmente o estructuralmente definida, puede comprender regiones de ADN adicionales, etc. La longitud de la primera o segunda región de ARN (región sentido o antisentido) puede variar de aproximadamente 19 nucleótidos (nt) hasta una longitud que iguale la longitud (en nucleótidos) del gen endógeno que interviene en la remoción de calosa. La longitud total de la secuencia de nucleótidos sentido o antisentido puede ser de esta manera de por lo menos 25 nt, o por lo menos aproximadamente 50 nt, o por lo menos aproximadamente 100 nt, o por lo menos aproximadamente 150 nt, o por lo menos aproximadamente 200 nt, o por lo menos aproximadamente 500 nt. Se espera que no exista límite superior para la longitud total de la secuencia de nucleótidos sentido o antisentido. Sin embargo, por razones prácticas (tales como, por ejemplo, estabilidad de los genes quiméricos), se espera que la longitud de la secuencia de nucleótidos sentido o antisentido, no deba exceder 5000 nt, en particular no deba exceder 2500 nt, y podría limitarse a aproximadamente 1000 nt. Se apreciará que mientras más larga sea la longitud total de la región sentido o antisentido, menos severos serán los requisitos para la identidad de secuencias entre estas regiones y la secuencia correspondiente en el gen endógeno que interviene en la remoción de calosa o su complemento. De preferencia, el ácido nucleico de interés debe tener una identidad de secuencias de por lo menos aproximadamente 75% con la secuencia objetivo correspondiente, en particular por lo menos aproximadamente 80%, más particularmente por lo menos aproximadamente 85%, bastante particularmente aproximadamente 90%, especialmente aproximadamente 95%, más especialmente aproximadamente 100%, bastante especialmente sea idéntica a la parte correspondiente de la secuencia objetivo o su complemento. Sin embargo, se prefiere que el ácido nucleico de interés incluya siempre una secuencia de aproximadamente 19 nucleótidos consecutivos, en particular aproximadamente 25 nt, más particularmente aproximadamente 50 nt, especialmente aproximadamente 100 nt, bastante especialmente aproximadamente 150 nt, con 100% de identidad de secuencias con la parte correspondiente del ácido nucleico objetivo. De preferencia, para el cálculo de la identidad de secuencias y el diseño de la secuencia sentido o antisentido correspondiente, el número de espacios debe reducirse al mínimo, en particular para la secuencia sentido más corta. Para el propósito de esta invención, ei término "identidad de secuencias" de dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos relacionadas, expresada como un porcentaje, se refiere al número de posiciones en las dos secuencias alineadas óptimamente que tienen residuos idénticos (x100) dividido entre el número de posiciones comparadas. Un espacio, es decir, una posición en una alineación en donde un residuo está presente en una secuencia, pero no en la otra, se considera como una posición con residuos no idénticos. La alineación de las dos secuencias se lleva a cabo mediante el algoritmo de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch 1970). La alineación de secuencias anterior asistida por computadora, puede llevarse a cabo convenientemente usando un programa de software estándar, tal como GAP, que forma parte del paquete Wisconsin, versión 10.1 (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, USA), usando la matriz de puntuación predeterminada, con una penalización de creación de espacios de 50 y una penalización de extensión de espacios de 3. Será claro que cada vez que se definan secuencias de nucleótidos de moléculas de ARN haciendo referencia a secuencias de nucleótidos de moléculas de ADN correspondientes, la timina (T) en la secuencia de nucleótidos debe reemplazarse por uracilo (U). Si se hace referencia a moléculas de ARN o ADN, será claro a partir del contexto de la solicitud. Los genes quiméricos codificantes de ARNds de conformidad con la invención pueden comprender un intrón, tal como un intrón heterólogo localizado, por ejemplo, en la secuencia de separador entre las regiones de ARN sentido y antisentido, de acuerdo con la descripción del documento WO 99/53050 (incorporado en la presente como referencia). Como se usa en la presente, un "gen endógeno que interviene en la remoción de calosa", es un gen cuyo producto de expresión regula o cataliza la degradación de calosa depositada en un sitio particular en las plantas. La "calosa" es un polímero de carbohidrato de cadena larga, que consiste de ß-1 ,3-glucano, que sella ciertas regiones, por ejemplo, elementos cribosos dañados, tubos de polen en crecimiento, o plasmodesmos. Como se usa en la presente, un "gen endógeno", es un gen que ocurre en forma natural en la especie de la planta que produce fibras, que se ha seleccionado para la modulación de las características de las fibras, o un gen que ocurre en forma natural en una especie de otra planta que produce fibras, pero que puede introducirse en la especie de la planta que produce fibras que se ha seleccionado para la modulación de las características de las fibras, mediante técnicas de mejoramiento genético convencionales.

Un gen objetivo que interviene en la remoción de calosa de los plasmodesmos en la base de las células fibrosas en plantas que producen fibras tales como el algodón, es un gen de endo-1 ,3-ß-glucanasa que se expresa en forma natural en la base de la célula fibrosa, al final de la fase de elongación de la fibra. Un ejemplo de dicho gen de 1 ,3-ß-glucanasa del algodón, es un gen que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 4, o que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 1 (o número de acceso del GenBank D88416). Shimuzu et al. (Plant Cell Physiology 38(3), pp 375-378, 1997) han descrito que el nivel de ARN mensajero para endo-1 ,3-ß-glucanasa fue muy bajo en células fibrosas en elongación, pero que aumentó gradualmente al inicio de la síntesis de la pared secundaria, acompañando a la deposición masiva de celulosa, pero caracterizaron esta actividad de endo-1 ,3-ß-glucanasa como requerida para la deposición de celulosa. La presente invención ha correlacionado la actividad de endo-1 ,3-ß-glucanasa con la remoción de calosa en diferentes variedades de algodón con diferentes duraciones de las fases de elongación de las fibras. Variantes del gen de endo-1,3-ß-glucanasa que interviene en la 1 remoción de calosa de plasmodesmos en la base de células fibrosas en elongación, tales como los genes endógenos que codifican para endo-1 ,3-ß-glucanasa de plantas que producen fibras diferentes del algodón, pueden encontrarse mediante hibridación severa usando la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 1 , o una parte de la misma, que comprenda por lo menos aproximadamente 25 ó 50 nucleótidos consecutivos de SEQ ID No 1 , o las secuencias de nucleótidos complementarias de las mismas, como una sonda. El término "condiciones de hibridación severa", como se usa en la presente, significa que ocurrirá hibridación en general si existe por lo menos 95%, y de preferencia por lo menos 97% de identidad de secuencias, entre la sonda y la secuencia objetivo. Ejemplos de condiciones de hibridación severa, son incubación durante la noche en una solución que comprende formamida a 50%, 5 x SSC (NaCI a 150 mM, citrato trisódico a 15 mM), fosfato de sodio a 50 mM (pH 7.6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrán a 10% y 20 µig/ml de ADN vehículo desnaturalizado sometido a esfuerzo cortante, tal como ADN de esperma de salmón, seguido del lavado del soporte de hibridación en 0.1 x SSC a aproximadamente 65°C, de preferencia por aproximadamente 10 minutos. Otras condiciones de hibridación y lavado son bien conocidas, y se ejemplifican en Sambrook ef al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, NY (1989), en particular el capítulo 11. Dichas secuencias variantes pueden obtenerse también mediante amplificación de ADN usando oligonucleótidos específicos para el gen de endo-1 ,3-ß-glucanasa como iniciadores tales como, pero no limitados a, oligonucleótidos que comprendan o que consistan de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 1 o su complemento. Las secuencias variantes incluyen modificaciones de una secuencia por adición, deleción o sustitución de nucleótidos. Como se usa en la presente, el término "promotor" denota cualquier ADN que sea reconocido y unido (directamente o indirectamente) por una ARN polimerasa dependiente de ADN durante el inicio de la transcripción. Un promotor incluye el sitio de inicio de la transcripción, y sitios de unión para factores de inicio de la transcripción y ARN polimerasa, y puede comprender varios otros sitios (por ejemplo, intensificadores), a los cuales pueden unirse proteínas reguladoras de la expresión génica. Como se usa en la presente, el término "promotor expresable en plantas", significa una secuencia de ADN que sea capaz de controlar (iniciar) la transcripción en una célula vegetal. Esto incluye cualquier promotor originado en plantas, pero también cualquier promotor no originado en plantas, que sea capaz de dirigir la transcripción en una célula vegetal, es decir, ciertos promotores de origen viral o bacteriano, tales como el promotor 35S del CaMV, el promotor No 4 o No 7 del virus del trébol subterráneo, o promotores génicos de ADN T, y similares. Un promotor expresable en plantas que controla el inicio y el mantenimiento de la transcripción de preferencia en células fibrosas, es un promotor que dirige la transcripción de la región de ADN enlazada operablemente a un nivel mayor en células fibrosas, y las células de epidermis subyacentes, que en otras células o tejidos de la planta. Dichos promotores incluyen el promotor del algodón del gen de beta-tubulina específico de fibras (como se describe en el documento WO0210377), el promotor del algodón de. un gen de actina específico de fibras (como se describe en el documento WO0210413), el promotor de un gen de proteína de transferencia de lípidos específico de fibras del algodón (como se describe en el documento US5792933), un promotor de un gen de expansina del algodón (WO9830698), o un promotor de un gen de quitinasa en el algodón (US2003106097), o los promotores de los genes específicos de fibras descritos en los documentos US6259003 o US6166294. Como se mencionó anteriormente, la deposición de calosa, que aumenta el cierre de los plasmodesmos en la base de la célula fibrosa, y en consecuencia aumenta la fase de elongación de las fibras, puede alterarse también aumentando el nivel de expresión y/o la actividad del producto codificado de un gen que interviene en la síntesis y acumulación de calosa, tal como una ß-1 ,3-glucano sintasa (calosa sintasa). De esta manera, en otra modalidad, se provee un método para aumentar la longitud de las fibras, que comprende la introducción de un gen quimérico en células de una planta que produce fibras, de un gen quimérico que comprende: - un promotor expresable en plantas, de preferencia un promotor expresable en plantas que controla la transcripción de preferencia en las células fibrosas; - una región de ADN que codifica para una proteína ß-1 ,3-glucano sintasa; y - una región de extremo 3' que comprende señales de poliadenilación y de terminación de la transcripción funcionando en células de la planta. Una región de ADN adecuada que codifica para una proteína ß- 1 ,3-glucano sintasa, es una región de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 2 (número de acceso del GenBank A1730469), o que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 3. Regiones de ADN alternativas que codifican para una proteína ß-1 ,3-gIucano sintasa, pueden encontrarse en bases de datos de secuencias de nucleótidos tales como las entradas con los siguientes números de identificación: AF085717 (Gossypium hirsutum), AY324384 (Oryza sativa (grupo de cultivares japónica)); NM_179940, NM_121303, NM_116593, NM 79622, NM 23045, NM_116736, NM 15772, NM_112317, NM_111596, NM_100528, NM_100436 (Arabidopsis thalianá); AY177665 (Hordeum vulgare subsp. vulgare); BQ702515 (Pinus taeda); BQ696956, BG625796, BG625791 , BG317521, BF516675 (Pinus taeda); CA935202 (Glycine max), CA900204, CA900203, CA900202 (Phaseolus coccineus); BI978498 (Rosa chinensis); BU964672, BU927399 (Glycine max); AL750522 (Pinus pinaster); BQ081239, BQ080234 (Glycine max); AJ430780 (Vitis vinifera); BM270236, BF066990, BG651282, BG509952, BG363511 , BG359433, BG157340, BM086291 (Glycine max); AF237733 (Arabidopsis thaliana); BE644560 (Suaeda marítima subsp. salsa); y BE040372 (Oryza sativa).

Variantes de estas secuencias pueden obtenerse mediante sustitución, deleción o adición de nucleótidos particulares, y dichas variantes pueden ser también adecuadas para los métodos y medios descritos actualmente, en particular si retienen actividad de endo-1 ,3-ß-glucano sintasa. Será claro que los métodos y medios descritos anteriormente para aumentar la longitud de las fibras en plantas que producen fibras, pueden combinarse entre sí para aumentar más la longitud de las fibras. Los métodos de la presente solicitud pueden combinarse de hecho con otros métodos para alterar las características de las fibras, como es sabido en la técnica. En una modalidad de la invención, los métodos de la presente solicitud se combinan con los descritos en el documento WO02/45485, por medio de los cuales se modifica la calidad de las fibras en plantas que producen fibras, tales como el algodón, modulando la actividad y/o expresión de sacarosa sintasa en dichas plantas. En una modalidad particular, se proveen plantas de algodón que comprenden un gen quimérico como se describe en la presente, que cuando se expresa en las células de las plantas que producen fibras, tales como las células de la base de la fibra, aumentan la fase de elongación de las fibras y aumentan la deposición de calosa, y que comprende además un gen quimérico como se describe en el documento WO02/45485 (incorporado en la presente como referencia), que cuando se expresa, resulta en ia expresión o actividad incrementada de sacarosa sintasa. Se espera que la expresión combinada de los genes resulte en un efecto sinergístico sobre el incremento de la longitud y/o resistencia de las fibras. Los genes quiméricos pueden introducirse mediante transformación subsecuente en células de una planta, o pueden combinarse en células de una planta mediante cruzamiento entre plantas que comprenden cada una un gen quimérico. Además, la invención provee también plantas de algodón, combinando (a) alelos de ocurrencia natural de los genes de ß-1 ,3-glucanasa preferenciales de fibras asociados con el cierre más duradero de las aberturas de los plasmodesmos y con gran longitud de las fibras, y (a) alelos de ocurrencia natural de (a) genes de sacarosa sintasa, que resulten en alta expresión de sacarosa sintasa en células fibrosas. Se espera también que los métodos descritos en la presente para aumentar la fase de elongación de las fibras y la longitud de las fibras, en particular la reducción de la expresión del gen endógeno que interviene en la remoción de calosa, lleven también a resistencia incrementada a la sequía, en particular de las fibras. Para algunas plantas que producen fibras, puede ser a veces benéfico disminuir la longitud de las fibras, en particular para eliminar la producción de fibras. Esto puede lograrse de conformidad con la invención, reduciendo la fase de elongación de las fibras a través de la deposición disminuida de calosa o la remoción aumentada de calosa. Para este fin, pueden introducirse genes quiméricos que cuando se expresan, disminuyen la deposición de calosa o aumentan la remoción de calosa. Dichos genes quiméricos pueden comprender los siguientes fragmentos de ADN enlazados operablemente: - un promotor expresable en plantas, de preferencia un promotor expresable en plantas que controla la transcripción de preferencia en células fibrosas; - una región de ADN que codifica para un gen que interviene en la remoción de calosa, tal como una proteína ß-1 ,3-glucanasa; y - una región de extremo 3' que comprende señales de poliadenilación y de terminación de la transcripción funcionando en células de esa planta; o - un promotor expresable en plantas que controla la transcripción de preferencia en células fibrosas; - una región de ADN transcrita, que cuando es transcrita, da una molécula de ARN de doble cadena capaz de reducir la expresión de un gen endógeno para la planta que produce fibras, el gen interviniendo en la deposición de calosa, tal como una calosa sintasa, en los plasmodesmos en la base de una célula fibrosa, y en donde la molécula de ARN comprende una primera y segunda regiones de ARN, en donde: - la primera región de ARN comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 19 nucleótidos consecutivos que tiene por lo menos aproximadamente 94% de identidad de secuencias con la secuencia de nucleótidos del gen endógeno mencionado; - la segunda región de ARN comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a los 19 nucleótidos consecutivos de la primera región de ARN; - la primera y segunda regiones de ARN son capaces de mostrar apareamiento de bases para formar una molécula de ARN de doble cadena entre por lo menos los 19 nucleótidos consecutivos de la primera y segunda regiones; y - una región de extremo 3' que comprende señales de poliadenilación y de terminación de la transcripción funcionando en células de la planta que produce fibras. La invención abarca también los genes quiméricos descritos en la presente, así como plantas, semillas, tejidos que comprenden estos genes quiméricos, y fibras producidas de dichas plantas. Métodos para transformar plantas son bien conocidos en la técnica. Métodos para transformar plantas de algodón, son también bien conocidos en la técnica. La transformación del algodón mediada por Agrobacterium se ha descrito, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 5,004,863, o en la patente de E.U.A. No. 6,483,013, y la transformación del algodón mediante bombardeo de partículas se reporta, por ejemplo, en el documento WO 92/15675. Los genes quiméricos pueden introducirse mediante transformación en plantas de algodón de las cuales pueden derivarse callos embriogénicos, tales como Coker 312, Coker 310, Coker 5Acala SJ-5, GSC25110, FíberMax 819, Siokra 1-3, T25, GSA75, Acala SJ2, Acala SJ4, Acala SJ5, Acala SJ-C1, Acala B1644, Acala B1654-26, Acala B1654-43, Acala B3991 , Acala GC356, Acala GC510, Acala GAM1 , Acala C1, Acala Royale, Acala Maxxa, Acala Prema, Acala B638, Acala B1810, Acala B2724, Acala B4894, Acala B5002, Siokra "picker" no Acala, variedad "stripper" FC2017, Coker 315, STONEVILLE 506, STONEVILLE 825, DP50, DP61, DP90, DP77, DES119, McN235, HBX87, HBX191 , HBX107, FC 3027, CHEMBRED A1 , CHEMBRED A2, CHEMBRED A3, CHEMBRED A4, CHEMBRED B1 , CHEMBRED B2, CHEMBRED B3, CHEMBRED C1 , CHEMBRED C2, CHEMBRED C3, CHEMBRED C4, PAYMASTER 145, HS26, HS46, SICALA, PIMA S6 y ORO BLANCO PIMA, y plantas con genotipos derivados de los mismos. El término "algodón", como se usa en la presente, incluye Gossypium hirsutum, Gossypium barbadense, Gossypium arboreum y Gossypium herbaceum. Sin embargo, los métodos y medios de la presente ¡nvención pueden usarse también para otras especies de plantas, tales como cáñamo, yute, lino y plantas leñosas que incluyen, pero no están limitadas a, Pinus spp., Populus spp., Picea spp., Eucalyptus spp., etc. La planta transformada obtenida puede usarse en un esquema de mejoramiento genético convencional para producir más plantas transformadas con las mismas características, o para introducir el gen quimérico de conformidad con la invención en otras variedades de la misma especie o una especie relacionada, o en plantas híbridas. Las semillas obtenidas de ias plantas transformadas contienen los genes quiméricos de la invención como una inserción genómica estable, y son también contempladas por la invención. En otra modalidad, se provee un método para identificar variaciones alélicas de las proteínas que intervienen en la longitud de las fibras y/o resistencia a la sequía en una población de diferentes genotipos o variedades de una especie de planta particular, de preferencia una especie de planta que produce fibras, que se correlacionan solas o en combinación con la cantidad y/o calidad de la producción de fibras. Estos métodos incluyen los siguientes pasos: a) proveer una población de diferentes variedades o genotipos de una especie de planta particular, o hibridar especies de plantas que comprenden diferentes formas alélicas de las secuencias de nucleótidos que codifican para calosa sintasa o ß-1,3-glucanasa, tales como secuencias de nucleótidos que comprenden SEQ ID No 1 ó 2. Las diferentes formas alélicas pueden identificarse usando los métodos descritos en otra parte en esta solicitud. De preferencia, se provee una población segregante, en donde están presentes diferentes combinaciones de las variaciones alélicas de las proteínas que intervienen en la deposición de calosa y/o elongación de las fibras o resistencia a la sequía. Métodos para producir poblaciones segregantes, son bien conocidos en la técnica de fitomejoramiento; b) determinar parámetros relacionados con la longitud de las fibras o la deposición de calosa en el cuello de los plasmodesmos en la base de la célula fibrosa, durante la elongación de la fibra o resistencia a la sequía para cada individuo de la población; c) determinar la presencia de una forma alélica particular de las secuencias de nucleótidos que codifican para ß-1 ,3-glucanasa o ß-1 ,3-glucano sintasa, tales como las secuencias de nucleótidos que comprenden SEQ ID No 1 ó 2, para cada individuo de la población; y d) correlacionar la ocurrencia de longitud de las fibras particular o deposición de calosa o resistencia a la sequía, con la presencia de una forma alélica particular de la secuencia de nucleótidos mencionada, o una combinación particular de dichas formas alélicas. La información resultante puede usarse para acelerar las variedades del programa de mejoramiento genético con características particulares de fibras o resistencia a la sequía, determinando la presencia o ausencia de formas alélicas, usando técnicas convencionales de biología molecular. Formas alélicas del gen de ß-1 ,3-glucanasa asociado con longitud incrementada de las fibras, pueden también identificarse, aislarse e introducirse en plantas, tales como plantas de algodón, por medio de las cuales la expresión de los genes de ß-1,3-glucanasa endógenos haya sido reducida o eliminada. Dicha reducción de la expresión de los genes de ß-1 , 3-glucanasa endógenos puede lograrse convenientemente mediante silenciamiento transcripcional o post-transcripción como se describe en la presente, o puede lograrse por inactivación, tal como mediante deleción, de los genes de ß-1 ,3-glucanasa endógenos. La introducción de las formas alélicas puede lograrse mediante técnicas de mejoramiento genético, o mediante transformación con los genes aislados. Pruebas bioquímicas para ß-1,3-glucanasa o ß-1 ,3-glucano sintasa, en particular cuando se llevan a cabo en células fibrosas o el tegumento subyacente, y en particular cuando se llevan a cabo inmediatamente antes, durante e inmediatamente después de la elongación de las células fibrosas, pueden usarse también para identificar en una población de líneas de plantas de algodón, o una población emparentada con el algodón, que sean capaces de hibridar con las líneas de plantas de algodón, o poblaciones de plantas que resulten de cruzas amplias entre el algodón y dicha población emparentada con el algodón, o en poblaciones de líneas de algodón resintetizadas, aquellas líneas con características interesantes, en particular aquellas líneas que tengan una actividad de ß-1 , 3-glucanasa relativamente baja y/o una actividad de ß-1,3-glucano sintasa relativamente alta, en particular en la base de las células fibrosas inmediatamente antes, durante e inmediatamente después de la fase de elongación de las fibras. Los siguientes ejemplos no limitativos, describen genes quiméricos para la alteración de las características de las fibras en el algodón, y usos de los mismos. A menos que se indique de otra manera en los ejemplos, todas las técnicas de ADN recombinante se llevan a cabo de acuerdo a protocolos estándar como se describe en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, y en los volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Materiales y métodos estándar para el trabajo molecular en plantas, se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R. D. D., publicado conjuntamente por BIOS Scíentific Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications, Reino Unido. A lo largo de la descripción y los ejemplos, se hace referencia a las siguientes secuencias representadas en el listado de secuencias: SEQ ID No 1 : secuencia de nucleótidos de endo-1 ,3-beta giucanasa. SEQ ID No 2: secuencia de nucleótidos del ADNc parcial que codifica para endo-1 ,3-ß-glucano sintasa. SEQ ID No 3: secuencia de aminoácidos codificada por el ADN parcial de SEQ ID No 2. SEQ ID No 4: secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID No 1.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Correlación de la duración del cierre de los plasmodesmos con la longitud de las fibras, en diferentes cultivares de algodón Se examinó el estado de activación periódica de los plasmodesmos (PD) de las fibras, en tres cultivares de algodón tetraploides, Gh-r, Gh-c y Gb, con fibras cortas, normales y largas, respectivamente, usando formación de imágenes confocal de una molécula fluorescente CF impermeable a la membrana. Como se resume en la figura 1 , el genotipo Gh-r, con la fibra más corta, no cierra los PD de sus fibras. En contraste, el genotipo de fibras largas, Gb, cierra sus PD antes y por más tiempo que la línea intermedia (Gh-c). Un mutante tetraploide carente de pelusa (fls), que produce fibras tipo borra de menos de 0.5 cm, no cierra los PD de sus fibras. Se encontró también que, entre el progenitor diploide de cultivares de algodón, una línea de genoma A Ga cierra los PD de sus fibras por aproximadamente 10 días, y produce fibras de aproximadamente 1.5 cm de longitud, mientras que una línea de genoma D, Gt, no cierra sus PD, y virtualmente no ocurre elongación de las fibras. Estos datos demuestran que las diferencias genotípicas en la duración del cierre de los PD, se correlaciona positivamente con la longitud de las fibras.

EJEMPLO 2 Análisis de la deposición de calosa en la base de las células fibrosas en diferentes cultivares de algodón La base molecular de la activación periódica de los PD es virtualmente desconocida. Sin embargo, se ha mostrado que la deposición de calosa en la región del cuello de los PD, cierra los PD en varios sistemas de plantas. Se analizó la deposición de calosa usando un colorante específico de calosa, azul de anilina. La regulación y duración de la deposición de calosa en la base de la fibra, juzgadas a partir de señales fluorescentes de azul de anilina, se compararon con las del cierre de los PD en Gh-c y Gb. Imágenes representativas del genotipo Gh-c, se presentan en las figuras 2A-2C. La calosa fue indetectable en la base de la fibra a 5 y 20 DAA cuando los PD se abrieron, pero llegó a ser fácilmente detectable a 10 DAA cuando los PD se cerraron (figuras 2A-2F). Se obtuvieron resultados similares usando anticuerpo contra calosa. Las señales de calosa marcada con ¡mmuno-gold, se detectaron en la base de la fibra a 10 DAA (figura 2E), pero no a 5 (figura 2D) o 20 DAA. Al nivel de EM, la calosa se localizó hacia los PD de la base de la fibra (figura 2F). Estos resultados muestran que la deposición de calosa se correlaciona con el cierre de los PD de las fibras.

EJEMPLO 3 Análisis de la expresión de un gen de 3-1,3-glucanasa específico de fibras (GhGlucD en el algodón Para analizar la función de la ß-1,3-glucanasa en el mecanismo molecular del cierre/reapertura de los PD, un ADNc de ß-1 ,3-glucanasa parcial (GhGlud) de ARN mensajero de fibras de algodón, fue clonado (usando la información de secuencias con el número de acceso del GenBank D88416). La figura 3 muestra que el ARN mensajero de este gen se expresa sólo a 20 DAA (correspondiendo con la regulación de la desaparición de calosa - véase la figura 2C), y no a 10-12 DAA en Gh-c, cuando la calosa estuvo presente en la base de la fibra (véase las figuras 2B y 2E). En forma consistente, el GhGlud no se expresó a -6 DAA (figura 3) cuando no se había producido calosa (figura 2A). En forma significativa, a 20 DAA, los niveles de ARN mensajero del gen son más fuertes, más débiles e indetectables en Gh-r, Gh-c y Gb que representan, respectivamente, cultivares de fibras cortas, intermedias y largas (figura 3). La expresión de este gen es específica de las fibras, ya que su ARN mensajero es indetectable en semillas jóvenes de 6 días (figura 3), embrión, brote o raíz. Tomados en conjunto, los datos muestran que la expresión de GhGlud es específica de las fibras y el desarrollo. La duración y el nivel de la expresión de GhGlud entre los tres cultivares que difieren en longitud de las fibras, sugiere que GhGlud determina la degradación de calosa en los PD, lo cual previene el cierre de los PD (por ejemplo, en Gh-r), o permite que los PD se vuelvan a abrir (por ejemplo, en Gh-c), acortando por ende el período de elongación.

EJEMPLO 4 Aumento de la longitud de las fibras silenciando la expresión de GhGlud en fibras de algodón Se construye un gen quimérico que contiene los siguientes elementos de ADN: - un promotor 35S del CaMV - una región codificante de ARN sentido que corresponde a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 1 - una región codificante de ARN antisentido que corresponde al complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 1. - una región de terminador nos 3'. Este gen quimérico se introduce en un vector de ADN T junto con un gen bar seleccionable. El vector de ADN T se introduce en Agrobacterium tumefaciens, y se usa para producir plantas de algodón transgénicas. Plantas de algodón transgénicas que comprenden el gen quimérico, se analizan como en los ejemplos 1 y 2. La fase de elongación de las fibras se prolonga cuando se compara con las plantas de algodón control no transformadas, y las fibras son más largas que en las plantas de algodón control no transformadas. Las plantas de algodón transgénicas que comprenden el gen quimérico descrito anteriormente, se cruzan con plantas que comprenden la secuencia codificante de un ADNc de sacarosa sintasa de papa (número de acceso del GenBank M18745) enlazado operablemente a un promotor del virus del achaparramiento del trébol subterráneo (S7; véase documento WO9606932), y una señal de poliadenilación y de terminación de la transcripción 3' funcional en plantas, como se describe en el documento WO 02/45485 (ejemplo 3). Plantas que comprenden ambos tipos de genes quiméricos, se seleccionan y analizan como en los ejemplos 1 y 2. La fase de elongación de las fibras se prolonga cuando se compara con las plantas de algodón control no transformadas, la expresión de sacarosa sintasa es mayor que en las plantas de algodón control no transformadas, y las fibras son más largas que en las plantas de algodón control no transformadas.

EJEMPLO 5 Aumento de la elongación de las fibras por expresión de una ß-1 ,3- glucano sintasa guimérica en fibras de algodón Se construye un gen quimérico que contiene los siguientes elementos de ADN: - un promotor de expansina del algodón; - una región codificante de ß-1 ,3-glucano sintasa que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 2; - una región de terminador nos 3'. Este gen quimérico se introduce en un vector de ADN T junto con un gen bar seleccionable. El vector de ADN T se introduce en Agrobacterium tumefaciens, y se usa para producir plantas de algodón transgénicas. Plantas de algodón transgénicas que comprenden el gen quimérico, se analizan como en los ejemplos 1 y 2. La fase de elongación de las fibras se prolonga cuando se compara con las plantas de algodón control no transformadas, y las fibras son más largas que en las plantas de algodón control no transformadas.

Claims (1)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1- Un método para modificar una fibra de una planta que produce fibras, que comprende el paso de alterar la fase de elongación de una célula fibrosa, modulando la deposición de calosa en el cuello de los plasmodesmos en la base de dicha célula fibrosa. 2.- Un método para aumentar la longitud de una fibra de una planta que produce fibras, que comprende el paso de introducir un gen quimérico en una célula de dicha planta que produce fibras, en donde dicho gen quimérico, cuando se expresa en dicha célula de dicha planta que produce fibras, aumenta dicha deposición de calosa, y aumenta dicha fase de elongación de la fibra. 3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho gen quimérico comprende los siguientes elementos de ADN enlazados operablemente: (a) un promotor expresable en plantas, de preferencia un promotor expresable en plantas que controla la transcripción de preferencia en dichas células fibrosas; (b) una región de ADN transcrita, que cuando es transcrita, da una molécula de ARN de doble cadena capaz de reducir la expresión de un gen endógeno para dicha planta que produce fibras, el gen interviniendo en la remoción de calosa de dichos plasmodesmos, y dicha molécula de ARN comprendiendo una primera y segunda regiones de ARN, en donde: i) dicha primera región de ARN comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 19 nucleótidos consecutivos que tiene por lo menos aproximadamente 94% de identidad de secuencias con la secuencia de nucleótidos de dicho gen endógeno; ii) dicha segunda región de ARN comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a dichos 19 nucleótidos consecutivos de dicha primera región de ARN; iii) dichas primera y segunda regiones de ARN son capaces de mostrar apareamiento de bases para formar una molécula de ARN de doble cadena entre por lo menos dichos 19 nucleótidos consecutivos de dichas primera y segunda regiones; y (c) una región de extremo 3' que comprende señales de poliadenilación y de terminación de la transcripción funcionando en las células de dicha planta. 4.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicho promotor es un promotor de beta-tubulina específico de fibras del algodón, un promotor de actina específico de fibras del algodón, un promotor específico de fibras de un gen de proteína de transferencia de lípidos del algodón, un promotor de un gen de expansina del algodón, o un promotor de un gen de quitinasa en el algodón. 5.- El método de conformidad con la reivindicación 3 ó 4, caracterizado además porque dicho gen endógeno es un gen de ß-1 , 3-glucanasa que se expresa en la base de dicha célula fibrosa, al final de dicha fase de elongación de la fibra en dicha planta que produce fibras. 6.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicho gen endógeno codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 4, o en donde dicho gen comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 1. 7.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, caracterizado además porque dicha primera región de ARN comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 19 nucleótidos consecutivos que tiene por lo menos aproximadamente 94% de identidad de secuencias con una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 4, o con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 1. 8.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho gen quimérico comprende (a) un promotor expresable en plantas, de preferencia un promotor expresable en plantas que controla la transcripción de preferencia en dichas células fibrosas; (b) una región de ADN que codifica para una proteína ß-1 ,3-glucano sintasa; y (c) una región de extremo 3' que comprende señales de poliadenilación y de terminación de la transcripción funcionando en las células de dicha planta. 9.- El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque dicha región de ADN que codifica para dicha proteína ß-1 ,3-glucano sintasa, comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 2. 10.- El método de conformidad con la reivindicación 8 ó 9, caracterizado además porque dicho promotor es un promotor de beta-tubuiina específico de fibras del algodón, un promotor de actina específico de fibras del algodón, un promotor específico de fibras de un gen de proteína de transferencia de lípidos del algodón, un promotor de un gen de expansina del algodón, o un promotor de un gen de quitinasa en el algodón. 11.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, caracterizado además porque dicha planta que produce fibras es algodón. 12.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque dicha fibra es una fibra de pelusa. 13.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque dicha fibra es una fibra de borra. 14.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque comprende introducir un segundo gen quimérico, en donde dicho segundo gen quimérico comprende los siguientes fragmentos de ADN enlazados operablemente: (a) un promotor expresable en plantas, de preferencia un promotor expresable en plantas que controla la transcripción de preferencia en dichas células fibrosas; (b) una región de ADN que codifica para una proteína ß-1,3-glucano sintasa; y (c) una región de extremo 3' que comprende señales de poliadenilación y de terminación de la transcripción funcionando en las células de dicha planta. 15.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado además porque comprende (a) desarrollar plantas obtenidas de conformidad con dicho método; y (b) aislar fibras de dichas plantas que producen fibras. 16.- Un método para disminuir la longitud de una fibra de una planta que produce fibras, que comprende el paso de introducir un gen quimérico en una célula de dicha planta que produce fibras, en donde dicho gen quimérico, cuando se expresa en dicha célula de dicha planta que produce fibras, disminuye dicha fase de elongación de la fibra, y disminuye dicha deposición de calosa. 17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicho gen quimérico comprende los siguientes fragmentos de ADN enlazados operablemente: (a) un promotor expresable en plantas, de preferencia un promotor expresable en plantas que controla la transcripción de preferencia en dichas células fibrosas; (b) una región de ADN que codifica para una proteína ß-1,3-glucanasa; y (c) una región de extremo 3' que comprende señales de poliadenilación y de terminación de la transcripción funcionando en las células de dicha planta. 18.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque dicha región de ADN que codifica para dicha proteína ß-1 ,3-glucanasa comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 1. 19.- El método de conformidad con la reivindicación 17 ó 18, caracterizado además porque dicho promotor es un promotor de beta-tubulina específico de fibras del algodón, un promotor de actina específico de fibras del algodón, un promotor específico de fibras de un gen de proteína de transferencia de lípidos del algodón, un promotor de un gen de expansina del algodón, o un promotor de un gen de quitinasa en el algodón. 20.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicho gen quimérico comprende los siguientes elementos de ADN enlazados operablemente: (a) un promotor expresable en plantas que controla la transcripción de preferencia en dichas células fibrosas; (b) una región de ADN transcrita, que cuando es transcrita, da una molécula de ARN de doble cadena capaz de reducir la expresión de un gen endógeno para dicha planta que produce fibras, dicho gen interviniendo en la deposición de calosa en dichos plasmodesmos, y dicha molécula de ARN comprendiendo una primera y segunda regiones de ARN, en donde: i) dicha primera región de ARN comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 19 nucleótidos consecutivos que tiene por lo menos aproximadamente 94% de identidad de secuencias con la secuencia de nucleótidos de dicho gen endógeno; ii) dicha segunda región de ARN comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a dichos 19 nucleótidos consecutivos de dicha primera región de ARN; iii) dichas primera y segunda regiones de ARN son capaces de mostrar apareamiento de bases para formar una molécula de ARN de doble cadena entre por lo menos dichos 19 nucleótidos consecutivos de dichas primera y segunda regiones; y (c) una región de extremo 3' que comprende señales de poliadenilación y de terminación de la transcripción funcionando en las células de dicha planta. 21.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque dicho promotor es un promotor de beta-tubulina específico de fibras del algodón, un promotor de actina específico de fibras del algodón, un promotor específico de fibras de un gen de proteína de transferencia de lípidos del algodón, un promotor de un gen de expansina del algodón, o un promotor de un gen de quitinasa en el algodón. 22.- El método de conformidad con la reivindicación 20 ó 21 , caracterizado además porque dicho gen endógeno es un gen de 1 ,3-ß-glucano sintasa que se expresa en dicha fibra de dicha planta que produce fibras. 23.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque dicho gen endógeno codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 3, o en donde dicho gen endógeno comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 2. 24.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado además porque dicha primera región de ARN comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 19 nucleótidos consecutivos que tiene por lo menos aproximadamente 94% de identidad de secuencias con una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 3, o con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 2. 25.- Un método para identificar variaciones alélicas de los genes que codifican para proteínas que intervienen en la elongación de las fibras en una población de diferentes genotipos, cultivares o variedades de una especie de planta particular, de preferencia una especie de planta que produce fibras, que se correlacionan solas o en combinación con la longitud de las fibras producidas, que comprende los pasos de: (a) proveer una población de diferentes variedades o genotipos de una especie de planta particular, o hibridar especies de plantas que comprenden diferentes formas alélicas de las secuencias de nucleótidos que codifican para calosa sintasa o ß-1 , 3-glucanasa, en particular de SEQ ID No 1 o SEQ ID No 2; (b) determinar parámetros relacionados con la longitud de las fibras para cada individuo de la población; (c) determinar la presencia de una forma alélica particular de las secuencias de nucleótidos que codifican para calosa sintasa o ß-1, 3-glucanasa, en particular de SEQ ID No 1 o SEQ ID No 2; (d) correlacionar la ocurrencia de la longitud de la fibra particular con la presencia de una forma alélica particular de la secuencia de nucleótidos mencionada, o una combinación particular de dichas formas alélicas. 26.- Un gen quimérico como el que se describe en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 24. 27.- Una célula de una planta que produce fibras, que comprende un gen quimérico como el que se define en la reivindicación 26. 28.- Una planta que produce fibras, que comprende un gen quimérico como el que se define en la reivindicación 26. 29.- La planta que produce fibras de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque las fibras de dicha planta se incrementan en longitud, en comparación con plantas control no transformadas. 30.- La planta que produce fibras de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque tiene resistencia incrementada a la sequía. 31.- La planta que produce fibras de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, caracterizada además porque dicha planta es algodón. 32.- Una semilla de la planta que produce fibras de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 31 , dicha semilla comprendiendo un gen quimérico de conformidad con la reivindicación 26. 33.- Fibras producidas de conformidad con los métodos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24. 34.- Un método para incrementar la resistencia a la sequía en una planta que produce fibras, dicho método comprendiendo: (a) introducir un gen quimérico en células de dicha planta que produce fibras, en donde dicho gen quimérico comprende los siguientes elementos de ADN enlazados operablemente: i) un promotor expresable en plantas que controla la transcripción de preferencia en dichas células fibrosas; ii) una región de ADN transcrita, que cuando es transcrita, da una molécula de ARN de doble cadena capaz de reducir la expresión de un gen endógeno para dicha planta que produce fibras, dicho gen interviniendo en la remoción de calosa en dichos plasmodesmos, y dicha molécula de ARN comprendiendo una primera y segunda regiones de ARN, en donde: (1) dicha primera región de ARN comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 19 nucleótidos consecutivos que tiene por lo menos aproximadamente 94% de identidad de secuencias con la secuencia de nucleótidos de dicho gen endógeno; (2) dicha segunda región de ARN comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a dichos 19 nucleótidos consecutivos de dicha primera región de ARN; (3) dichas primera y segunda regiones de ARN son capaces de mostrar apareamiento de bases para formar una molécula de ARN de doble cadena entre por lo menos dichos 19 nucleótidos consecutivos de dichas primera y segunda regiones; y iii) una región de extremo 3' que comprende señales de poliadenilación y de terminación de la transcripción funcionando en las células de dicha planta. 35.- Un método para incrementar la longitud de una fibra en el algodón, que comprende el paso de introducir un gen quimérico en una célula de dicha planta que produce fibras, en donde dicho gen quimérico, cuando se expresa en dicha célula de dicha planta que produce fibras, aumenta dicha fase de elongación de las fibras y aumenta dicha deposición de calosa, dicho gen quimérico comprendiendo: (a) un promotor expresable en plantas; (b) una región de ADN transcrita, que cuando es transcrita, da una molécula de ARN de doble cadena capaz de reducir la expresión de un gen endógeno para dicha planta que produce fibras, dicho gen interviniendo en la remoción de calosa de dichos plasmodesmos, y dicha molécula de ARN comprendiendo una primera y segunda regiones de ARN, en donde: i) dicha primera región de ARN comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 19 nucleótidos consecutivos que tiene por lo menos aproximadamente 94% de identidad de secuencias con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 1; ii) dicha segunda región de ARN comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a dichos 19 nucleótidos consecutivos de dicha primera región de ARN; iii) dicha primera y segunda regiones de ARN son capaces de mostrar apareamiento de bases para formar una molécula de ARN de doble cadena entre por lo menos dichos 19 nucleótidos consecutivos de dicha primera y segunda regiones; y (c) una región de extremo 3' que comprende señales de poliadenilación y de terminación de la transcripción funcionando en las células de dicha planta; o dicho gen quimérico comprendiendo los siguientes elementos de ADN enlazados operablemente: i) un promotor expresable en plantas, de preferencia un promotor expresable en plantas que controla la transcripción de preferencia en dichas células fibrosas; ii) una región de ADN que codifica para una proteína ß-1 ,3-glucanasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 3 o la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 2; y iii) una región de extremo 3' que comprende señales de poliadenilación y de terminación de la transcripción funcionando en las células de dicha planta.