MXPA05011022A - Profarmacos oligonucleotidos polimericos. - Google Patents

Abstract

Se exponen conjugados de polimero que contienen nucleotidos y/u oligonucleotidos.

Description

PROFÁRMACOS OLIGONUCLEÓT1DOS POLIMÉRICOS Referencia Cruzada con Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reclama el beneficio de prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de E.U. Serie No. 60/462,070, presentada el 13 de Abril del 2003, el contenido de la cual se incorpora en la presente para referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a profármacos oligonucleótidos poliméricos útiles como agentes terapéuticos. También se proporcionan las composiciones y métodos para el uso de tales profármacos.

ANTECEDENTES DE LA I NVENCIÓN Es bien sabido que la mayoría de los estados corporales en organismos multicelulares, incluyendo la mayoría de los estados de enfermedad, se efectúan mediante proteínas. Tales proteínas, ya sea que actúen directamente o a través de sus funciones enzimáticas u otras, contribuyen en proporción importante a muchas enfermedades y funciones reguladoras en animales y seres humanos. Para estados de enfermedad, los terapéuticos clásicos se han enfocado a las interacciones con tales proteínas en esfuerzos por moderar so origen de la enfermedad o funciones potenciadotas de la enfermedad . En enfoq ues terapéuticos más recientes, se desea la modulación de la producción real de tales proteínas. Al interferir con la producción de proteínas, el máximo efecto terapéutico puede obtenerse con efectos secundarios mínimos. Por consiguiente, un objeto general de tales enfoques terapéuticos es interferir o modular de otro modo la expresión genética, lo cual conduciría a la formación indeseada de proteínas. Un método para inhibir la expresión genética específica es con el uso de oligonucleótidos, especialmente oligonucleótidos q ue son complementarios a una secuencia de ARN mensajera, objetivo, específica (mARN). En general , las secuencias de ácido nucleico complementarias a los productos de transcripción genética (por ejemplo, mARN) se designan de "anti-detección", y las secuencias de ácido nucleico que tienen la misma secuencia que o se producen como la transcripción se designan de "detección". Ver, por ejemplo, Crooke, 1 992, Annu. Rev. Pharamacol. Toxicol. , 32: 329-376. Puede seleccionarse un oligonucleótido de anti-detección para hibridizar todo o parte de un gen , de tal manera que se module la expresión del gen. Los factores de transcripción interactúan con ADN de doble filamento durante la regulación de la transcripción. Los oligonucleótidos pueden servir como inhibidores competitivos de factores de transcripción a fin de modular su acción. Varios reportes recientes describen tales interacciones (ver Bielinska , A., et al. , 1990, Science, 250: 997-1 000; y Wu, H., eí al. , 1 990, Gene 89: 203-209). Se han desarrollado estrategias moleculares para sub-regular la expresión genética no deseada. Recientemente, el uso de compuestos oligonucleótidos modificados ha desarrollado un método prometedor para tratamiento contra tales enfermedades como infecciones virales, desorden inflamatorio y genético y significativamente, cáncer. Los ADNs de anti-detección se concibieron primero como oligodeoxinucleótidos complementarios de alq uilación dirigidos contra ácidos nucleicos naturalmente ocurrentes (Belikova, et al. , Tetrahedron Lett. 37:3557-3362, 1 967). Zamenick y Stephenson fueron los primeros en proponer el uso de oligonucleótidos de anti-detección sintéticos para propósitos terapéuticos. (Zamecnick & Stephenson, 1 978, Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. , 75: 285-289; Zamenick & Stephenson , 1978, Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. , 75: 280-284). Reportaron que el uso de un oiigonucleótido 1 3-rrier complementario al ARN de virus de sarcoma de Rous inhibió el crecimiento del virus en el cultivo celular. Desde entonces, se han publicado otros numerosos estudios que manifiestan la eficacia in Vitro de la inhibición de oligonucleótidos de antidetección de crecimiento viral, por ejemplo, virus de estomatitis vesicular (Leonetti et al. , 1988, Gene, 72: 323), virus simples de herpes (Smith et al. , 1987, Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. , 83: 2787) y virus de influenza (Seroa et al. , 1987, Nucleic Acids Res. , 15.: 9909). Los oligonucleótidos también han encontrado uso, entre otras cosas, en pruebas de diagnóstico, reactivos de investigación , por ejemplo, cargas de inicio en tecnología de PCR y otros procedimientos de laboratorio. Los oligonucleótidos pueden sintetizarse de manera usual para contener propiedades que encajen en un uso deseado. De este modo, se han introducido numerosas modificaciones químicas en compuestos oligoméricos a fin de incrementar su utilidad en diagnósticos, como reactivos de investigación y como entidades terapéuticas. Aunq ue los oligonucleótidos, especialmente los oligonucleótidos de anti-detección son prometedores como agentes terapéuticos, son muy susceptibles a nucleasas y pueden degradarse rápidamente antes y después de que entran a las células objetivo, haciendo a los oligonucleótidos de anti-detección no modificados, inadecuados para utilizarse en sistemas in vivo. Debido a que las enzimas responsables de la degradación se encuentran en la mayoría de los tejidos, se han hecho modificaciones a los oligonucleótidos en un intento por estabilizar los compuestos y remediar este problema. Se han hecho las modificaciones más ampliamente experimentadas a la porción estructural de los compuestos oligonucleótidos. Ver, en general, Uhlmann y Peymann, 1990, Chemical Reviews 90, en las páginas 545-561 y las referencias citadas en la presente. Entre las muchas diferentes estructuras elaboradas, solo el fosforotioato mostró una actividad de anti-detección significativa. Ver, por ejemplo, Pad mapriya y Agrawal, 1 993, Bioorg. & Med. Chem. Lett. , 3, 761 . Aunque la introducción de átomos de azufre a la estructura disminuye la velocidad de degradación de la enzima, también incrementa la toxicidad al mismo tiempo. Otra desventaja de agregar átomos de azufre es que cambia la estructura de aquiral a quiral y da como resultado 2" diaestereómeros. Esto puede originar efectos secundarios adicionales. Todavía más desventajas de los presentes oligonucleótidos de anti-detección son que pueden contener una carga negativa en el grupo de fosfato que inhibe su habilidad para pasar a través de la membrana celular principalmente lipofílica. Mientras más tiempo permanece el compuesto fuera de la célula, más se degrada, dando como resultado que llegue al objetivo compuesto menos activo. Una desventaja adicional de los presentes compuestos de antidetección es que los oligonucleótidos tienden a formar estructuras de solución de orden elevado y secundario. Una vez que se forman estas estructuras, se vuelven objetivo de diversas enzimas, proteínas, ARN y ADN para enlace. Esto da como resultado efectos secundarios no específicos y cantidades reducidas de compuesto activo que se une a mARN. Otros intentos por mejorar la terapia de oligonucleótidos han incluido la adición de un elemento de enlace y glicol de polietileno. Ver, por ejemplo, Kawaguchi, et al., Estabilidad, Actividad de Enlace Específica y Concentración de Plasma en Ratones de un Oligodeoxinucleótido Modificado en la Terminal 5' con PoIi(glicol de etileno), Biol. Pharm. Bull. , 18(3) 474-476 (1995), y Patente de E.U. No. 4,904,582. En ambos de estos ejemplos, las modificaciones involucran el uso de elementos de enlace que son de naturaleza permanente en un esfuerzo por estabilizar el oligonucleótido contra la degradación e incrementar la permeabilidad celular. Sin embargo, ambos esfuerzos fallan en la proporción de eficacia alguna. Debido a lo inadecuado de los presentes métodos, existe una necesidad de mejorar la estabil idad y resistencia a degradación de nucleasa , así como también a disminuir la toxicidad e incrementar la afinidad de unión a mA N de los compuestos oligonucleótidos. La terapia actual de oilgonucleótidos es costosa. Esto se debe principalmente al problema de degradación . Por lo tanto, existe una necesidad real de proteger a los compuestos oligonucleótidos de antidetección contra la degradación , evitar la formación de estructuras de orden elevado y al mismo tiempo suministrar cantidades suficientes de los compuestos oligonucleótidos de anti-detección , activos, hacia el objetivo. Esta invención proporciona tales mejoras.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto de la invención, se proporcionan profármacos oligonucleótidos de la fórmula (I): en donde: Ri y R2 son independientemente H o un resid uo de polímero ; elementos de enlace liberable independ ientemente seleccionados; L2 y L3 son g rupos separadores independientemente seleccionados ; un resid uo nucleótido o un residuo oligonucleótido; m, n , o y p son independientemente cero o un entero positivo, siempre y cuando ya sea (o + n) o (p + m) > 2. Otro aspecto de la invención incluye compuestos bifuncionales que se forman cuando y/o R2 son residuos de polímero que incluyen tanto grupos de enlace de terminal alfa como de omega, según se describe en la presente, a fin de que dos oligonucleótidos se enlacen a los sistemas de suministro polimérico, proporcionados. Los ejemplos de esta modalidad incluyen oligonucleótidos unidos a los sistemas de polímero a través de sus respectivos grupos de terminal 3'-, 5'-, por ejemplo, conjugados oligonucleótidos 3'-bis o conjugados oligonucleótidos 5'-bis, o un conjugado formado por enlace de un primer oligonucleótido a través de la terminal 3'- a la terminal 5'- de un segundo oligonucleótido. Los ejemplos de tales conjugados de polímero se ilustran abajo como fórmulas (i), (ii), (iii) y (iv): bis-5', 3'-ioi¡gonucleót¡do, y (iv) bis-3', 5'-Oligonucleótido, en donde todas las variables son como se describe arriba. Para propósitos de la presente invención, el término "residuo" deberá entenderse que representa esa porción de un compuesto biológicamente activo, es decir, un oligonucleótido, más específicamente un oligonucleótido de anti-detección, que permanece después de que ha experimentado una reacción de substitución en la cual se ha anexado el vehículo de pro-fármaco. Para propósitos de la presente invención, el término "residuo polimérico" o "residuo PEG" deberá entenderse que representa esa porción del polímero o PEG que permanece después de que ha experimentado una reacción con un compuesto oligonucleótido mejorado. Para propósitos de la presente invención, el término "alquilo" deberá entenderse que incluye recto, ramificado, sustituido, por ejemplo, halo-, alcoxi-, nitro-, alquilos Ci_i2, cicloalquilos C3-8 o cicloalquilos sustituidos, etc. Para propósitos de la presente invención, el término "sustituido" deberá entenderse que incluye la adición o reemplazo de uno o más átomos contenidos dentro de un grupo o compuesto funcional con uno o más átomos diferentes. Para propósitos de la presente invención, los alquilos sustituidos incluyen carboxialquilos, aminoalquilos, dialquilaminos, hidroxialquilos y mercaptoalquilos; alquenilos sustituidos incluyen carboxialquenilos, aminoalquenilos, dialquenilaminos, hidroxialquenilos y mercaptoalquenilos; alquinilos sustituidos incluyen carboxialquinilos, aminoalquinilos, dialquinilaminos, hidroxialquinilos y mercaptoalquinilos; cicloalquilos sustituidos incluyen elementos tales como 4-clorociclohexilo; arilos incluyen elementos tales como naftilo; arilos sustituidos incluyen elementos tales como 3-bromo-fenilo; aralquilos incluyen elementos tales como toluilo; heteroalquilos incluyen elementos tales como etiltiofeno; heteroalquilos sustituidos incluyen elementos tales como 3-metoxi-tiofeno; alcoxi incluye elementos tales como metoxi; y fenoxi incluye elementos tales como 3-nitrofenoxi. Halo- deberá entenderse que incluye fluoro, cloro, yodo y bromo. El término "cantidades suficientes" o "cantidades eficaces" para propósitos de la presente invención debe representar una cantidad que logra un efecto terapéutico, en la medida en que tal efecto se entiende por aquellos de experiencia ordinaria en la materia. Algunas de las principales ventajas de la presente invención incluyen profármacos oligonucleótidos, poliméricos, novedosos, que demuestran una estabilidad y resistencia incrementadas a la degradación de nucleasa, solubilidad incrementada, permeabilidad celular incrementada y toxicidad disminuida. Otra ventaja de los compuestos de la invención es que una variedad de plataformas de profármaco polimérico se anexan de manera liberable a los compuestos oligonucleótidos modificados. Esta ventaja permite que el técnico diseñe un conjugado de fármaco que puede manipularse para diversos elementos entre el residuo polimérico y el oligonucleótido anexo que puede afectar la velocidad de hidrólisis del profármaco. De este modo, el técnico tiene la habilidad de incluir sustitutos que permiten la modulación de la velocidad de hidrólisis del profármaco. Los métodos para elaboración y uso de los compuestos, tal como en métodos de tratamiento de cánceres o malignidades, y los conjugados descritos en la presente también se proporcionan. También se contempla q ue los profármacos oligonucleotidos poiiméricos, inventivos, se administren junto con (de manera simultánea y/o secuencial) cualquier otro agente anti-cáncer adecuado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DI BUJOS La FIG. 1 ilustra esquemáticamente los métodos para la preparación de los oligonucleotidos PEGiiados de los compuestos 3 y 5. La FIG. 2 ilustra esquemáticamente los métodos para la preparación de oligonucleotidos PEGiiados de los compuestos 7 y 9. La FIG. 3 ilustra esq uemáticamente métodos para la preparación de oligonucleotidos PEGiiados de los compuestos 1 1 , 12 (SEQ ID NO: 1 ) y 14 (SEQ ID NO: 1 ). La FIG. 4 ilustra esquemáticamente un método para la preparación del oligonucleótido PEGilado del compuesto 16 (SEQ ID NO: 1 ).

La FIG. 5 ¡lustra esquemáticamente métodos para la preparación de oligonucleótidos PEGiíados de los compuestos 17 (SEQ I D NO: 2), 18 (SEQ ID NO: 3) y 19 (SEQ ID NO: 4), de AS1 (SEQ ID NO: 3) y AS3 (SEQ ID NO: 4). La FIG. 6 ilustra esquemáticamente métodos para la preparación de oligonucleótidos PEGiíados de compuestos 21 (SEQ ID NO: 1 ) y 22 (SEQ ID NO: 2). La FIG . 7 ilustra esq uemáticamente métodos para la preparación de oligonucleótidos PEGiíados de los compuestos 24 (SEQ ID NO: 1 ) y 26 (SEQ ID NO: 1 ). La FIG. 8 ilustra esquemáticamente métodos para la preparación de los oligonucleótidos PEGiíados de los compuestos 28 (SEQ I D NO: 1 ), 29 (SEQ ID NO: 2), 30 (SEQ I D NO : 3) y 31 (SEQ ID NO: 4), de AS1 (SEQ I D NO: 2), AS2 (SEQ I D NO: 3) y AS3 (SEQ ID NO: 4). La FIG. 9 ilustra esquemáticamente métodos para la preparación de los oligonucleótidos PEGiíados de los compuestos 33 (SEQ ID NO: 1 ) y 35 (SEQ ID NO: 1 ). La FIG. 1 0 ilustra los efectos inhibidores del compuesto 14 y el compuesto 28 sobre el desarrollo celular PC3. Se sembraron 0.4 x 1 04 células en placas de 96 cavidades, tratadas ya sea con complejos del compuesto 14 o compuesto 28 (400 n M) y Lipofectina (15 µg/ml) durante 24 horas en Opti-MEM y después en medios completos sin complejos. La viabilidad celular se determinó diariamente, y las absorciones se midieron como 570 nm. Los datos se presentan como la desviación estándar promedio +; n=4. Las curvas son las siguientes: El control se marca por ? y una curva punteada; El compuesto 28 a 400 nM se marca por ? y una curva sólida; El compuesto 14 a 400 nM se marca por ? y una curva suave; El compuesto 28 a 200 nM se marca por ¦ y una curva suave; El compuesto 14 a 200 nM se marca por ¦ y una curva punteada. La FIG. 1 A proporciona un resumen de la producción de ROS (a partir del análisis citométrico de flujo) mediante oligonucleótidos del compuesto 14 y el compuesto 28, mediante detección de la oxidación de diacetato de 2', 7'-di idrodiclorofluoresceína permeable a células hacia 2', 7'-diclorofluoresceína fluorescente (DCF). Las células PC3 se trataron con complejos de oligonucleótidos (400 nM)/Lipofectina ( 5µg/ml) durante 24 horas y se ensayaron después de 3 d ías, como se describe. Los incrementos de veces en el canal de fluorescencia media se normalizaron contra células no tratadas. Los experimentos se realizaron por triplicado y los datos se presentan como desviación estándar media + (n=3). La FIG. 1 1 B proporciona un resumen de la producción de ROS (a partir del análisis citométrico de flujo) mediante oligonucleótidos del compuesto 14 y el compuesto 28, mediante detección de la oxidación de hidroetidio (HE) a etidio (E), el cual se intercala posteriormente en ADN con fluorescencia detectable mediante citometría de flujo. Las células PC3 se trataron con complejos de oligonucleótidos (400 nM/Lipofectina (15 µg/ml) durante 24 horas, y se ensayaron después de 3 días, como se describe. Los incrementos de veces en el canal de fluorescencia media se normalizaron contra células no tratadas. Los experimentos se realizaron por triplicado y los datos se presentan como desviación estándar media + (n=3). La FIG. 12 es un resultado de Western Blot que confirma la inhibición de expresión proteínica de bcl-2 mediante el compuesto 14 en presencia de Lipofectina. Las células PC3 se trataron con oligonucleótido de compuesto 14 (200, 400 y 800 nM) en presencia (+Lipo) y ausencia (-Lipo) de Lipofectina durante 24 horas en Opti-MEM y después durante 67 horas más en medio completo. Las muestras de proteína (30-40 µg de proteína/hilera) se analizaron mediante manchado Western, como se describe en el Material y Métodos, con tubulina utilizada como una especie de proteína de control. "C" marca el control.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona profármacos oligonucleótidos enlazados a polímero, útiles, que tienen muchos usos prácticos, incluyendo usos como reactivos de diagnóstico y analíticos, como herramientas de investigación, tanto in Vitro como in vivo, y como agentes terapéuticos. Con objeto de apreciar más completamente el alcance de la presente invención , se definen los siguientes términos. El técnico apreciará que los términos, "ácido nucleico" o "nucleótido" se aplican a ácido deoxirribonuclélco ("ADN"), ácido ribonucleico, ("ARN") ya sea de uno solo o de doble filamento, a menos que se especifique de otro modo, y cualquier modificación química de ios mismos. Un "oligonucleótido" es generalmente un polinucleótido relativamente corto, por ejemplo, q ue varía en tamaño desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 200 nucleótidos, o más preferentemente desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos, de acuerdo con la invención, son generalmente ácidos nucleicos sintéticos y son de un solo filamento, a menos que se especifique de otro modo. Los términos "polinucleótido" y "ácido polinucléico" también pueden utilizarse como sinónimos en la presente. Las modificaciones a los oligonucleótidos de la invención opcionalmente Incluyen, por ejemplo, la adición o sustitución de nucleótidos seleccionados con grupos o elementos funcionales que permiten el enlace covalente de un oligonucleótido a un polímero deseable, y/o la adición o sustitución de elementos funcionales que incorporan carga adicional, capacidad de polarización, unión a hidrógeno, interacción electroestática y funcionalidad hacia un oligonucleótido. Tales modificaciones incluyen , pero sin limitarse, modificaciones de azúcar a posición 2'-, modificaciones a pirimidina de posición 5'-, modificaciones a purina de posición 8'-, modificaciones en aminas exocíclicas, sustitución de 4-tiouridina, sustitución de 5-bromo o 5-yodouracilo, modificaciones estructurales, mutilaciones, combinaciones de pares base, tales como la isocitidina de ¡sobases e isoguanidina y combinaciones análogas. Las modificaciones oligonucleótidas también pueden incluir modificaciones 3' y 5', tales como tapado. Según se utiliza en la presente, el término "anti-detección" se refiere a secuencias nucleótidas que son complementarias a una secuencia específica de ADN o ARN que codifica un producto genético o que codifica una secuencia de control. El término "filamento de anti-detección" se utiliza con relación a un filamento de ácido nucleico que es complementario al filamento de "detección". En la operación normal del metabolismo celular, el filamento de detección de una molécula de ADN es el filamento que codifica polipéptidos y/u otros productos genéticos. El filamento de detección sirve como un patrón de síntesis de una transcripción de ARN mensajero ("mARN") (un filamento de anti-detección), el cual, a su vez, dirige la síntesis de cualquier producto genético codificado. Las moléculas de ácido nucleico de anti-detección pueden producirse mediante cualquier método conocido en la materia, incluyendo síntesis mediante ligación del(de los) gen(es) de interés en una orientación inversa a un promotor viral que permite la síntesis de un filamento complementario. Una vez introducido en una célula, este filamento transcrito se combina con secuencias naturales producidas mediante la célula para formar dúplex. Estros dúplex bloquean entonces ya sea la transcripción o traducción ulterior. De esta manera, pueden generarse fenotipos mutantes. Las designaciones "negativo" o (-) también son conocidas en la materia para referirse al filamento de anti-detección, y "positivo" o (+) también se sabe en la materia que se refieren al filamento de detección. Por ejemplo, si se intenta sub-regular la expresión de una transcripción de mARN en una célula o células, el oligonucleótido de anti-detección se introduce en una célula. Una vez introducido en una célula, el oligonucleótido de anti-detección hibridiza a la secuencia de mARN correspondiente a través de unión Watson-Crick, formando un heterodúplex. Una vez que se forma el dúplex, se inhibe la traducción de la proteína codificada por la secuencia de mARN unido. De este modo, los oligonucleótidos de anti-detección también se emplean en la materia como sondas, por ejemplo, sondas de hibridización, generalmente enlazadas a un identificador o etiqueta, así como también se utilizan para proporcionar la sub-regulación precisa de la expresión de productos celulares específicos o elementos reguladores genéticos para ambos propósitos, investigacional y terapéutico. Para propósitos de la presente invención, el uso del singular o del plural no significa que se limita el número de artículos u objetos referidos. De este modo, el uso del singular para referirse a una célula, polímero o fármaco no implica que solo se trata a una célula, se prepara o emplea solo una molécula y/o se emplea solo un fármaco, y el uso del plural no excluye la aplicación a un solo artículo referido, a menos que se declare expresamente. Para propósitos de la presente invención, el término "residuo" deberá entenderse que representa esa porción de un compuesto biológicamente activo, tal como un oligonucleótido, que permanece después de que ha experimentado una reacción en la cual la porción de vehículo de profármaco se ha anexado mediante modificación de, por ejemplo, un hidróxilo disponible o grupo amino, para formar, por ejemplo, un éster o grupo amido, respectivamente.

A. DESCRIPCIÓN DE LOS OLIGQNUCLEÓTIDOS Una de las características de la invención es la habilidad para proporcionar conjugado de polímero, nucleótidos u oligonucleótidos, mejorados. Los sistemas de transporte de polímero descritos en la presente no se limitan a una sola especie de oligonucleótidos, sino más bien, se diseñan para funcionar con una amplia variedad de tales elementos, entendiéndose que los sistemas de transporte de polímero pueden anexarse a una o más de las terminales 3'- o 5'-, normalmente grupos P04 o S04 de un nucleótido. Las secuencias nucleótidas se ilustran en la presente mediante el uso de nomenclatura convencional, en donde las secuencias se leen de izquierda a derecha, yendo del término 5'- al término 3'- (5'- -> 3'-). X1-3 representa el mismo o diferente residuo nucleótido u oligonucleótido, el cual, para propósitos de la presente invención, incluye residuos oligodeoxinucleótidos. Más preferentemente, X -3 son residuos oligonucleótidos de anti-detección, independientemente seleccionados. Una lista no limitante de nucleótidos potenciales que pueden utilizarse, ya sea solos o como parte de un oligonucleótido (10-1 ,000 nucleótidos), incluyen en donde M es O o S; B<i y B2 se seleccionan independientemente a partir del grupo q ue consiste en A (adenina), G (guanina), C (citosina), T (timina), U (uracilo) y bases modificadas, incluyendo aquellos abajo mostrados y aquellos conocidos por aquellos de experiencia ordinaria; R-? ?? y 101 se seleccionan independientemente a partir del grupo q ue consiste en H , OR' donde R' es H, un alquilo C1 -6, alquilo sustituido, nitro, halo, ariio, etc. Algunos de los oligonucleótidos y oligodeoxinucleótidos útiles en los métodos de la invención incluyen, pero sin limitarse, lo siguiente: Los oligonucleótidos y oligodeoxinucleótidos con estructura de fosfodiéster natural o estructura de fosforotioato o cualquier otro análogo estructural modificado; LNA (Ácido Nucleico Bloqueado); PNA (ácido nucleico con estructura péptida); triciclo-ADN; ODN simulado(oligonucleótido de doble filamento); ARN (secuencia de ARN catalítica); ribozimas; fundiciones especulares (oligonucleótidos L-conformacionales); oligómeros CpG y lo similar, tal como aquellos expuestos en: Tides 2002, Oligonucleotide and peptide Technology Conferences, Mayo 6-8, 2002, Las Vegas, NV y Oligonucleotide & Peptide Technologies, 18 y 19 de Noviembre del 2003, Hamburgo, Alemania, el contenido de los cuales se incorpora en la presente para referencia. Los oligonucleótidos de acuerdo con la invención también pueden incluir opcionalmente cualquier análogo y derivado de nucleótido, conocido en la materia, adecuado, incluyendo aquellos listados por la Tabla 1 , a continuación.

TABLA 1 Análogos y Derivados Nucleótidos Representativos 4-acetilcitidina 5-metoxiaminometil-2-tiouridina 5-(carboxihidroximetil)uridina beta.D-mannosilqueuosina 2'-0-metilcitidina 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina 5-carboximetilaminometil-2- 5-metoxicarboniImetiluridina tiouridina 5-carboximetilaminometiluridina 5-metoxiuridina Dihidrouridina 2-metiltio-N6- isopenteniladenosina 2'-0-metiIpseudour¡dina N-((9-beta-D-ribofuranosil-2- metiltiopurina-6- il)carbamoil)treonina D-galactos¡lqueuosina N-((9-beta-D-ribofuranosilpurina- 6-iI)N-metilcarbamoil)treonina 2'-0-metiIguanosina uridina-5-ácido oxiacético- metiléster Inopina uridina-5-ácido oxiacético N6-isopenteniladenosina wibutoxina 1 -metiladenosina Pseudouridina 1 -metilpseudouridina Queuosina 1 -metiIguanosina 2-tiocitidina 1 -metilinosina 5-metii-2-tiouridina 2,2-dimetilguanosina 2-tiouridina 2-metiladenosina 4-tiouridina 2-metilguanosina 5-metiluridina 3-metilcitidina N-((9-beta-D-ribofuranosilpurina- 6-il)-carbamoil)treonina 5-metilicitidina 2'-0-metil-5-metiluridina N6-met¡ladenosina 2'-0-met¡luridina 7-metilguanosina Wibutosina 5-metilaminometiluridina 3-(3-amino-3-carboxi- propil)uridina Preferentemente, el oligonucleótido de anti-detección es uno que sub-regula una proteína implicada en la resistencia de las células tumorosas a terapéuticos anti-cáncer. Por ejemplo, la proteína BCL-2 inhibe la liberación de Citocroma-C y el Factor de Inicio de Apoptosis de mitocondrias y evita así que ocurra la apoptosis. Las células de cáncer que tienen niveles elevados de BCL-2 son así muy resistentes tanto a la quimioterapia como la terapia de radiación. La Patente de E.U. No. 6,414,134, incorporada para referencia en la presente, describe oligonucleótidos de anti-detección que sub-regulan la proteína Bcl-2 que se asocia con resistencia a terapia anti-cáncer en un número de células de tumor, por ejemplo, incluyendo células de cáncer de próstata, células de mieloma y otras células de tumor. De acuerdo con la Patente de E.U. arriba anotada, el gen bcl-2 se cree que contribuye a la patogénesis de cáncer básicamente al prolongar la sobrevivencia de las células tumorosas que mediante aceleración de la división celular. La Patente de E.U. No. 6,414, 134 generalmente describe oligonucleótidos de anti-detección de 17 a 35 bases de longitud, que son complementarias a mARN de bcl-2, y que incluyen una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de TACCGCGTGC GACCCTC (SEQ ID NO: 5). Estos preferentemente incluyen al menos un enlace de fosforotioato. Otras proteínas celulares conocidas en la materia que se contemplan por diversas compañías como objetivos de sub-regulación mediante oligonucleótidos de anti-detección, para terapia de cáncer, se resumen por la siguiente tabla.

Tabla 2 Agente de Anti-detección Proteína Objetivo Affinitak (ISIS 3521 ) PKC-alfa ISIS 1 12989 (OGX 01 1 ) Clusterina de Proteína Segregadora ISIS 23722 Survivina AP 12009 TGF-Beta2 GEM 231 Quinasa de Proteína A GEM 240 MD 2 IGF-1 R/AS ODN Factor de Crecimiento Similar a Insulina MG98 metiltransferasa de ADN LErafAON C-raf-1 oligonucleótido de anti-detección Ki-67 Ki-67 GTI-2040 reductasa de ribonucleótido ISIS 2503 H-ras AP1 1014 TGF-Beta1 Los oligonucleótidos de anti-detección adecuados para utilizarse en la sub-regulación de la expresión de proteínas relacionadas con la sobrevivencia de células cancerosas, tal como la expresión de bcl-2, incluyen oligonucleótidos que son de aproximadamente dos hasta doscientos codones nucleótidos. Los oligonucleótidos se seleccionan preferentemente a partir de aquellos oligonucleótidos complementarios a sitios estratégicos a lo largo del pre-mARN de bcl-2, tal como el sitio de inicio de traducción, sitios donadores y de división, o sitios para el transporte o degradación. El bloqueo de la traducción en tales sitios estratégicos evita la formación de un producto genético bcl-2 funcional. Sin embargo, debe apreciarse que cualquier combinación o sub-combinación de oligómeros de anticódigo, incluyendo oligonucleótidos complementarios o substancialmente complementarios al pre-mARN de bcl-2 o mARN que inhiben la proliferación celular, es adecuada para utilizarse en la invención. Por ejemplo, los oligodeoxinucleótidos complementarios a porciones de secuencias de tensiones contiguas o no contiguas del ARN de bcl-2 pueden inhibir la proliferación celular y por lo tanto serían adecuados para utilizarse en métodos de la invención. Los oligonucleótidos adecuados para la sub-regulación de la expresión de bcl-2 también incluyen oligonucleótidos complementarios o substancialmente complementarios a porciones de secuencia que flanquean los sitios estratégicos u otros a lo largo del mARN de bcl-2. Las porciones de secuencia de flanqueo preferentemente varían desde aproximadamente dos hasta aproximadamente un ciento de bases, corriente arriba o corriente debajo de los sitios previamente anotados a lo largo del mARN de bcl-2. Estos sitios preferentemente varían desde aproximadamente cinco hasta aproximadamente veinte codones de longitud. También es preferible que los oligonucleótidos sean complementarios a una porción de secuencia del pre-mARN o mARN que no se encuentra comúnmente en pre-mARN o mARN de otros genes, con objeto de reducir la homología de los oligonucleótidos para filamentos de codificación de mARN o pre-mARN de otros genes. Un número de oligonucleótidos de anti-detección, o complementarios, preferidos para la sub-regulación de bcl-2 se listan como sigue por la Tabla 3.

Se apreciará que los oligonucleótidos de anti-detección que pueden emplearse comprenden más o menos nucleótidos sustitutos y/o que se extienden más allá de la cadena de mARN de bcl-2 en cualquier dirección 3' o 5' con relación a aquellos listados por la Tabla 3, supra. Preferentemente, el oligonucleótido de anti-detección empleado en el profármaco de la invención tiene la misma o substancialmente la misma secuencia nucleótida similar que Genasense (a/k/a sodio de oblimerseno, producido por Genta Inc. , Berkeley Heights, NJ). Genasense es un oligonucleótido de anti- detección de fosforotioato de 1 8-mer, TCTCCCAGCGTGCGCCAT (SEQ ID NO: 1 ), q ue es complementario a los primeros seis codones de la secuencia de inicio del mARN de bcl-2 humano (mARN de bcl-2 humano es conocido en la materia y se describe, por ejemplo, como SEQ I D NO: 19 en la Patente de E. U. No. 6,414, 134, incorporada en la presente para referencia). La Administración de Alimentos y Fármacos de E.U . (FDA) ha dado estatus de Genasense Orphan Drug en Agosto del 2000, y ha aceptado una Nueva Aplicación de Fármaco (NDA) para Genasense en el tratamiento de cáncer. La NDA propone la administración de Genasense en combinación con dacarbazina para el tratamiento de pacientes con melanoma avanzado que no han recibido previamente quimioterapia. Además, la FDA otorgó estatus de Revisión de Prioridad a la aplicación , lo cual se dirige a una acción de agencia en o antes del 8 de Junio del 2004. Ver, también, Chi et al. , 2001 , Clinical Cáncer Research, Vol. 7, 3920-3927, incorporada para referencia en la presente, que confirma la actividad de Genasense en combinación con terapia de cáncer de próstata en ensayos clínicos tempranos. Los profármacos de la presente invención tienen la misma utilidad q ue los reconocidos por 1 8-mer nativo (no modificado). Genasense ha demostrado sub-regular la producción de proteína Bcl-2 y mejorar una sensibilidad de las células tumorosas a terapia y, finalmente, origina la muerte celular. Un número de estudios han reportado resultados prometedores en el tratamiento de carios cánceres con Genasense en combinación con agentes anticáncer. Un ensayo de fase l/ll de Genasense en combinación con dacarbazina en pacientes con melanoma ha demostrado una prometedora actividad y un ensayo multicentral de Fase I I I se encuentra en camino. Además, Genasense, utilizado en combinación con mitoxantrona en pacientes con cáncer de próstata refractario de hormona, ha demostrado resultados prometedores. Kin et al. , 2001 , id. La conjugación de oligon ucleótidos de anti-detección , tal como Genasense, con pol ímeros ejemplifica una modalidad preferida de la invención . En una modalidad alternativa, los oligonucleótidos de anti-detección adecuados, adicionales , incluyen : T-C-T-C-C-C-A-G-C-G-T-G-C-G-C-C-A-T; (compuesto 13 - SEQ ID NO: 1 ) T-C-T-C-C-C-A-G-C-A-T-G-T-G-C-C-A-T; (compuesto 36 - SEQ I D NO: 2) A-T-C-C-T-A-A-G-C-G-T-G-C-G-C-C-T-T; (compuesto 37 - S EQ I D NO: 3) y T-C-T-C-C-C-A-G-X-G-T-G-X-G-C-C-A-T; (compuesto 38 - SEQ I D NO: 4) así como también aq uellos encontrados en los ejemplos . B. FÓ RM ULA (\ ) En una modalidad preferida de la invención , se proporcionan profármacos oligonucleótidos de la fórmula (I ): en donde: Ri y R2 son independientemente H o un residuo de polímero; -i y L4 son elementos de enlace liberable independ ientemente seleccionados; L2 y L3 son grupos separadores independientemente seleccionados; Xi es un residuo nucleótido o un residuo oligonucleótido; m, n, o y p son independientemente cero o un entero positivo, siempre y cuando ya sea (o + n) o (p + m) > 2. El sistema de transporte de polímero de la presente invención se basa en parte en al menos uno de R-¡ y R2, siendo preferentemente un residuo polimérico, que tiene opcionalmente un grupo de tapado designado en la presente como A. Los grupos de tapado adecuados incluyen, por ejemplo, OH, NH2, SH, C02H, alquilos C -6, así como también grupos que contienen oligonucleótidos, tales como en donde X2 y X3 son ya sea el mismo que u otro nucleótido residuo oligonucleótido. Los grupos de tapado preferidos (II) y (III) permiten que se formen las composiciones de las fórmulas (i), (ii), (iii) y (iv) abajo mostrados: H-X3 ("^)-"^1) R2 (L1") — — X2'H bis-5', 3'-ioligonucleótido, y H-X2 (-½)— 1-} Rl 4 y^~(L^"X3"H bis-3', 5'-ioligonucleótido, en donde todas las variables son como se describió previamente. En otra modalidad preferida de la invención, L4 es elemento de enlace liberable seleccionado de entre las fórmulas: en donde: ?-?.25 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en O, S o NR9; Re-7. R9-13, R16-25 y R27-41 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilos C1-1S, alquilos ramificados C3-i2, cicloalquilos C3.8, alquilos sustituidos C -6, cicloalquilos sustituidos C3-8, arilos, arilos sustituidos, aralquilos, heteroalquilos C1-6, heteroalquilos sustituidos C -6, alcoxi C-,.6, fenoxi y heteroalcoxi C1-6; Ar es un elemento que forma un hidrocarburo aromático multi-sustituido o un grupo heterocíclico multi-sustituido; L5_12 son separadores independientemente bifuncionales; Z se selecciona de entre elementos activamente transportados hacia una célula objetivo, elementos hidrofóbicos, elementos de enlace bifuncional y combinaciones de los mismos; c, h, k, I, r, s, v, w, v\ w', c' y h' son enteros positivos independientemente seleccionados; a, e, g, j, t, z, a', z\ e' y g' son independientemente ya sea cero o un entero positivo; y b, d, f, i, u, q , b', d' y f son independientemente cero o uno. En otra modalidad preferida, es un elemento de enlace liberable seleccionado de entre las fórmulas: en donde: Y1 -25 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en O , S o NRg; Re-7, R9-13 , R16-25 y R27-4 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilos C1 -16, alquilos ramificados C3-12, cicloalquilos C3-8, alquilos sustituidos C1-6, cicloalquilos sustituidos C3-8, arilos, arilos sustituidos, aralquilos, heteroalquilos C1 -6, heteroalquilos sustituidos C1 -6, alcoxi Ci-6, fenoxi y heteroalcoxi Ci-6; y L5--12' son separadores independientemente bifuncionales.

En alg unas modalidades preferidas de la i nvención , L5-1 2 lores i ndepend ientemente bifuncionales, seleccionados de entre: -(CH2)3-, -C(0)NH(CH2)3-, -NH(CH2)3-, -(CR55R56)sO(CR57R58)tC(0)- -NR59(CH2)(OCH2CH2)NH- -(OCH2CH2)sNH- -NR59(CR57R58)tC(0)NH(CR55R56)sC(0)- -0(CH2)sOC(0)- -NR59(CH2)t(OCH2CH2)sNHC(0)- -NR59(OCH2CH2)sOC(0)- -0(CR55R56)sNHC(0)- -0(CR55R56)sOC(0)- (OCH2CH2)sNHC(0)- y L5'.i 2' son separadores i ndepend ientemente bifu ncionales, seleccionados de entre: -(CH2)3-, -(CH2)3NH-C(0), -(CH2)3NH-, -C(0)(CR67' 68-)S'0(CR55-R56')f -NH(CH2CH20)s-(CH2)fNR59-., -NH(CH2CH20)s -, -C(0)(CR55' R56-)s'NHC(0)(CR57. R58-)fNR59'-, -C(0)9(CH2)S R59._, -C(0)(CR55.R56')s'NR59'-, -C(0)NH(CH2CH20)sl(CH2)t'NR59'-, -C(0)0-(CH2CH20)S'HR5e'., -C(O)NH(CR55.R56 sO-, -C(0)0(CR55.R -C(0)NH(CH2CH20)s -, en donde: R55-R59 y R55- 59' se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquiios C1-6, alquiios ramificados C3-12, cicloalquilos C3-8, alquiios sustituidos C -6, cicloalquilos sustituidos C3.8, arilos, arilos sustituidos, aralquilos, heteroalquilos C -6, heteroalquilos sustituidos C1-e, alcoxi C1-6, fenoxi y heteroalcoxi C1 -6, y Reo y R60' se seleccionan a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilos C -6, alquilos ramificados C3-12, cicloalquilos C3- 8, alquilos sustituidos C1.6, cicloalquilos sustituidos C3-8, arilos, arilos sustituidos, aralquilos, heteroalquilos C1 -6, heteroalquilos sustituidos C -6, alcoxi C1 -6, fenoxi, heteroalcoxi C1 -6, N02, haloalquilo y halógeno; y s' y t' son cada uno un entero positivo. En otra modalidad preferida de la invención, L2 y L3 son grupos independientemente separadores que tienen aproximadamente 1 hasta aproximadamente 60 átomos de carbono y desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 heteroátomos. Preferentemente, L2 y L3 son grupos independientemente separadores que tienen desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 10 átomos de carbono y desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 6 heteroátomos. Más preferentemente, L3 se selecciona de entre: -Q(CR5oR5 )qO(CR52R53)r' -Q(CH2CH20)q'(CR52R53)r -, -QCR50R5i)q'NHC(O)(CR52R53)r.-, -QCCRsoRsi), (CR52 53)t- y -Q(CH2)q-S-S-(CH2)r-; y más preferentemente, L2 se selecciona de entre: -(CRsa' sa r'OÍCRso'Rsi q'Q -(CR52.R53-)r'(OCH2CH2)Q,-I -(CR52-R53 r'C(O)N H(CR50-R5r)q'Q'-. y -(CH2)-S-S-(CH2)q.Q'-en donde, Q y Q' se seleccionan independientemente a partir de O, S o NH; R50-53 y 50 -53' se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilos Ci-6, alquilos ramificados C3-i2, cicloalquilos C3-8, alquilos sustituidos C -6, cicloalquilos sustituidos C3-8, arilos, arilos sustituidos, aralquilos, heteroalquilos C1-6, heteroalquilos sustituidos C1-6, alcoxi C1-6, fenoxi y heteroalcoxi C1 -6; R54 y R54' se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilos C1-e, alquiles ramificados C3-12, cicloalquilos C3-8, alquilos sustituidos C -6, cicloalquilos sustituidos C3-8 , arilos, arilos sustituidos, aralquilos, heteroalquilos C1-6, heteroalquilos sustituidos C1 -6, alcoxi C1-6, fenoxi, heteroalcoxi C -6, N02, haloalquilo y halógeno; y q' y r' son cada uno un entero positivo. Con respecto a otras variables que comprenden las fórmulas de la presente invención, se prefieren los siguientes: Y1 -25 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en O, S o NR9; Rs-7, R->-13> Rl 6-25 , R27-41 y ^6'-7'. ^9'-13? R-| 6'-25', R27'-41 ' Se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilos C1-16, cicloalquilos C3-a, arilos, aralquilos y heteroalquilos C -6; c, h, k, I, r, s, v, w, v', w', c' y h' son uno; a, e, g, j, t, z, a', z', e' y g' son independientemente ya sea cero o uno; y b, d, f, i, u, q, b', d' y f son independientemente cero o uno. En todavía otra modalidad preferida de la invención, se proporcionan compuestos de la fórmula (la): (v) en donde: l_2 es un grupo separador; Xi es un nucleótido o un residuo oligonucleótido; u' es un entero positivo; y T es un polímero ramificado que se selecciona preferentemente de entre aquellos compuestos descritos en los números de publicación de PCT, comúnmente asignados, WO 02/065988 y WO 02/066066, incorporándose la exposición de cada una en la presente para referencia. Dentro de estas fórmulas generales, se prefieren las siguientes: -39- en donde R6i es un residuo de polímero tal como se define para R-i con el entendimiento de que el polímero puede ser bifuncional cuando Reí se muestra con sustituciones en ambos términos; y todas las otras variables son como se describe arriba. Para propósitos ilustrativos, un compuesto no limitante de la fórmula (la) es: en donde todas las variables son como se describe arriba. Otro aspecto de la fórmula (la) incluye compuestos bifuncionales que se forman cuando el residuo polimérico (R6i ) incluye un grupo de enlace tanto de terminal alfa como de omega a fin de que se suministren al menos cuatro oligonucleótidos. Los ejemplos de tales conjugados de polímero se ¡lustran abajo como las fórmulas (vi) y (vii): en donde todas (as variables son como se describe arriba. En otra modalidad preferida de la invención, L2 y L3 son grupos independientemente separadores que tienen aproximadamente 1 hasta aproximadamente 60 átomos de carbono y desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 heteroátomos. Preferentemente, L2 y L3 son grupos independientemente separadores que tienen desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 10 átomos de carbono y desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 6 heteroátomos. Más preferentemente, L3 se selecciona de entre: -Q(CR5oR5i)qO(CR52R53)r' -Q(CH2CH20)q.(CR52R53)r--, -QCR5oR5l)q'NHC(0)(CR52R53)r-. y -Q(CH2)q-S-S-(CH2)r.., y más preferentemente, L2 se selecciona de entre: -(CR52.R53<)r'0(CR5o'R5r)q'Cr -(CR52'R53)r'( CH2CH2)Q,-J -(CR52R53-)r-C(O)NH(CR50-R5r)q'Q'-. y -(CH2)-S-S-(CH2)q.Q'-en donde, Q y Q' se seleccionan independientemente a partir de O, S o NH; R50-53 y 5o'-53- se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilos C1-6. alquilos ramificados C3- 2, cicloalquilos C3-8, alquilos sustituidos C1-6, cicloalquilos sustituidos C3-8, arilos, arilos sustituidos, aralquilos, heteroalquilos C -6l heteroalquilos sustituidos C -6, alcoxi Ci-6, fenoxi y heteroalcoxi Ci -6', 54 y R5 ' se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilos C1 -6, alquilos ramificados C3.12 , cicloalquilos C3-8. alquilos sustituidos C -6 ) cicloalquilos sustituidos C3-8, arilos, arilos sustituidos, aralquilos, heteroalquilos Ci-S , heteroalquilos sustituidos C -6, alcoxi C -6 , fenoxi, heteroalcoxi Ci-6 , N02l. haloalquilo y halógeno; y q' y r' son cada uno un entero positivo. Con respecto a otras variables que comprenden las fórmulas de la presente invención, se prefieren los siguientes: Y1 -25 e ??-25· se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en O, S o N R9 ; Re-7. R9-13. R-I 6-25. R27-41 y 6'-7' , R9'-13' i Rl 6'-25'. R27'-41 ' Se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilos C1 - 6, cicloalquilos C3-8, arilos, aralquilos y heteroalquilos C -6; c, h, k, I, r, s, v, w, v', w', c' y h' son uno; a, e, g, j, t, z, a', z', e' y g' son independientemente ya sea cero o uno; y b, d, f, i, u, q, b', d' y f son independientemente cero o uno. C. DESCRIPCIÓN DEL ELEMENTO Ar En ciertos aspectos de la invención, puede observarse que el elemento Ar es un elemento que, cuando se incluye en la Fórmula (I) forma un hidrocarburo aromático multí-sustituido o un grupo heterocíclico multi-sustituido. Una característica clave es que el elemento Ar es de naturaleza aromática. En general, para ser aromático, los electrones pi deben compartirse con una "nube" tanto arriba como debajo del plano de una molécula cíclica. Además, el número de electrones pi debe satisfacer la regla Hückel (4n+2). Aquellos de experiencia ordinaria ser darán cuenta de que un millardo de elementos cumplirá los requisitos aromáticos del elemento para la fórmula (I) y, de este modo, son adecuados para utilizarse en la presente. Algunos grupos aromáticos particularmente preferidos incluyen: en donde Re2-67 se seleccionan independientemente a partir del mismo grupo que define R6. Otros elementos hidrocarburos aromáticos preferidos incluyen, sin limitación en donde E y E' son independientemente GR6a o NR6 g ," y J es O, S o NR70, donde Res ro se seleccionan a partir del mismo grupo en el que se define R6 o un ciano, nitro, carbóxilo, acilo, acilo sustituido o carboxialquilo. También se contemplan isómeros de los anillos integrados por cinco y seis miembros así como también sistemas benzo- y dibenzo y sus congéneres relacionados. También se apreciará por el técnico experto que los anillos aromáticos pueden sustituirse opcionalmente con hetero-átomos tales como O, S, NR9, etc., siempre y cuando se obedezca la regla de Hückel. Además, las estructuras aromáticas o heterocíclicas pueden sustituirse opcionalmente con halógeno(s) y/o cadenas laterales ya que aquellos términos son comúnmente entendidos en la materia. D. ÓXIDOS DE POLIALQUILENO Refiriéndose a la Fórmula (I), puede observarse que R-i y R2 son elementos de polímero tales como óxido de polialquileno. Los ejemplos adecuados de tales polímeros incluyen glicoles de polietileno que son substancialmente no antigénicos. También son útiles los glicoles de polipropileno, tales como aquellos descritos en las Patentes de E.U. comúnmente asignadas Nos. 5,643,575, 5,919,455 y 6, 1 13,906. Otros PEG's útiles en los métodos de la invención se describen en el catálogo de Shearwater Poiymers, Inc. "Polyetylene Glycol and Derivatives 2001 ". La exposición de cada uno se incorpora en la presente para referencia. R-i y R2 son preferentemente derivados de PEG, por ejemplo, -0-(CH2CH20)x-. Dentro de este aspecto, Ri-2 se seleccionan independientemente de entre: J-0-(CH2CH20)n- J-0-(CH2CH20)n-CH2C(0)-0- J-0-(CH2CH20)n-CH2CH2NR48- J-0-(CH2CH20)n-CH2CH2SH -0-C(0)CH2-O-(CH2CH20)n-CH2C(O)-0- -NR48CH2CH2-0-(CH2CH20)n-CH2CH2NR48- -SHCH2CH2-0-(CH2CH20)n-CH2CH2SH-, en donde n' es el grado de polimerización seleccionado a fin de que el peso molecular promedio en peso sea de al menos aproximadamente 2,000 Da hasta aproximadamente 136,000 Da; R48 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilos C1-6, alquilos ramificados C3-12, cicloalquilos C3.8, alquilos sustituidos C1-6, cicloalquilos sustituidos C3-8, arilos, arilos sustituidos, aralquilos, heteroalquilos C1-6, heteroalquilos sustituidos C -6, alcoxi C1-6, fenoxi y heteroalcoxi C1-6; y J es un grupo de tapado, tal como metilo o un grupo de enlace complementario que permite que se proporcione un polímero bifuncional. Aunque los PAO's y PEG's pueden variar substancialmente en peso molecular promedio en peso, preferentemente, Ri y R2 independientemente tienen un peso molecular promedio en peso de desde aproximadamente 2,000 Da hasta aproximadamente 136,000 Da en la mayoría de los aspectos de la invención. Más preferentemente, R-i y R2 independientemente tienen un peso molecular promedio en peso de desde aproximadamente 3,000 Da hasta aproximadamente 100,000 Da, prefiriéndose más un peso molecular promedio en peso de desde aproximadamente 5,000 Da hasta aproximadamente 40,000 Da. Las substancias poliméricas incluidas en la presente son preferentemente solubles en agua a temperatura ambiente. Una lista no limitante de tales polímeros incluye homopolímeros de óxido de polialquileno tales como glicol de polietileno (PEG) o glicoles de polipropileno, polioles polioxietilenados, copolímeros de los mismos y copolímeros de bloque de los mismos, siempre y cuando se mantenga la solubilidad en agua de los copolímeros de bloque. E. SÍNTESIS DE CONJUGADOS DE POLÍMERO OUGONUCLEÓTIDOS Generalmente los conjugados se preparan mediante a) reacción de un compuesto de la fórmula: R2-L-4-gi"u o de abandono con un compuesto de la fórmula: bajo condiciones suficientes para formar un profármaco de la fórmula en donde: R2 es un residuo de polímero; L4 es un elemento de enlace liberable; L3 es un grupo separador; X es un nucleótido o un residuo oligonucleótido. Dentro de este aspecto de la invención, se prefiere emplear polímeros activos que ya contienen los enlazadores liberables anexos a los mismos. Una lista no-limitante de combinaciones adecuadas incluyen los sistemas de transporte a base de PEG liberables, descritos en las Patentes de E.U. comúnmente asignadas Nos. 6,624, 142, 6,303,569, 5,965, 1 1 9, 6,566,506, 5,965, 1 19, 6,303,569, 6,624, 142 7 6, 180,095. Los contenidos de cada una se incorporan en la presente para referencia. Los ejemplos específicos incluyen, pero sin limitarse, 8 {PEG mw 12,000) entendiéndose, por supuesto, que el peso molecular de la porción de polímero puede variar de acuerdo con las necesidades del técnico. El enlazador liberable de polímero arriba mostrado reacciona entonces con un oligómero modificado bajo condiciones suficientes para permitir que se forme el conjugado. Cualquiera de los nucleótidos u oligonucleótidos arriba descrito puede ser funcional en uno del fosfato o fosforotioato de terminal 5'- o 3'- mediante el uso de técnicas de rutina, tales como los métodos de fosforamidita a fin de anexar un grupo alquil-amino u otro al fosfato terminal. Por ejemplo, se anexa un amino alquilo (Fmoc) bloqueado, se oxida el compuesto resultante, se desprotege y purifica. La síntesis de conjugados o profármacos de polímero oligonucleótidos específicos se establece en los Ejemplos. De manera alternativa, los profármacos pueden prepararse mediante: 1 ) reacción de un polímero PEG activado con un grupo de enlace liberable, bifuncional, protegido, bajo condiciones adecuadas de acoplamiento para formar un primer compuesto intermedio, 2) desprotección y activación del compuesto intermedio de la etapa 1 ) con un grupo de activación adecuado, tal como un éster de NHS, y 3) reacción del compuesto intermedio activado de la etapa 2) con un oligonucleótido modificado en un sistema regulado con PBS a fin de obtener el profármaco de polímero oligonucleótido deseado. Una lista no limitante de polímeros activados incluye el PEG activado con carbonato de bls-succinimidilo (SC-PEG), PEG activado con bis-tiazolidina-2-tiona (T-PEG), PEG activado con carbonato de N-hldroxiftalamidilo (BSC-PEG) (ver la USSN 09/823,296 comúnmente asignada, la exposición de la cual se incorpora en la presente para referencia) PEG activado con succinato de succinimidilo (SS-PEG) y PEG's mono-activados, tales como aquellos encontrados en, por ejemplo, el Catálogo Shearwater 2001 antes mencionado. La conjugación del polímero de PEG activado con el grupo de enlace liberable bifuncional, protegido, puede llevarse a cabo en presencia de un agente de acoplamiento. Una lista no limitante de agentes de acoplamiento adecuados incluyen 1 ,3-diisopropilcarbodiimida (DIPC), cualquier carbodiimida de dialquilo adecuada, haluros de 2-halo-1 -alq uil-piridinio (reactivos Mukaiyama), carbodiimida de 1 -(3-dimetiIaminopropil)-3-etilo (EDC), anhídrido cíclico de ácido fosfónico de propano (PPACA) y diclorofosfatos de fenilo, etc. , los cuales se encuentran disponibles, por ejemplo, en fuentes comerciales, tales como Sigma-Aldrich Chemical, o se sintetizan mediante el uso de técnicas conocidas. Preferentemente, los sustitutos reaccionan en un solvente inerte, tal como tetrahidrofurano (THF), acetonitrilo (CH3CN), cloruro de metileno (DCM), cloroformo (CHCI3), formamida de dimetilo (DMF) o mezclas de los mismos y a una temperatura de desde 0°C hasta aproximadamente 22°C (temperatura ambiente). La conjugación del oligonucleótido modificado con el enlazador iiberable de PEG puede llevarse a cabo en un sistema regulado con PBS en el rango de pH de aproximadamente 7.4-8.5. Por supuesto, el experto apreciará que la síntesis de los profármacos descritos en la presente también incluirá el uso de condiciones de laboratorio comúnmente encontradas, es decir, solventes, temperatura, agentes de acoplamiento, etc., tales como aquellos descritos en los ejemplos. Sin tomar en cuenta la síntesis seleccionada, algunos de los compuestos preferidos que resultan de las técnicas sintéticas descritas en la presente incluyen: ?? -54- en donde: representan un oligonucleótido y punto de modificación de fosfato terminal y mPEG es CH3-0-(CH2-CH2-0)x-; en donde x es un entero positivo seleccionado a partir de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 2300. Los compuestos más preferidos de la invención incluyen: G. MÉTODOS DE TRATAMIENTO Otro aspecto de la presente invención proporciona métodos para el tratamiento de diversas condiciones médicas en mamíferos. Los métodos incluyen la administración al mamífero que necesita de tal tratamiento, de una cantidad eficaz de un profármaco oligonucleótido, el cual se ha preparado como se describe en la presente. Las composiciones son útiles para, entre otras cosas, tratamiento de enfermedades neoplásticas, reducción de expansión de tumores, prevención de metástasis de neoplasmas y prevención de recurrencias de crecimientos tumorosos/neoplásticos, enfermedades del hígado, enfermedades virales, tales como VIH, en mamíferos. Los profármacos de la presente invención pueden utilizarse para cualquier indicación en la que se utilicen oligonucleótidos nativos u oligonucleótidos de anti-detección, es decir, terapia de cáncer, etc. Simplemente a manera de ejemplo, los profármacos inventivos se contempla sean empleados en el tratamiento de múltiples mielomas, leucemia linfocítica crónica, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de próstata y otros tumores o cánceres demasiado numerosos para mencionarse. La cantidad de profármaco administrado dependerá de la molécula principal incluida en el mismo y la condición a tratarse. En general, la cantidad de profármaco utilizado en los métodos de tratamiento es la cantidad que logra eficazmente el resultado terapéutico deseado en mamíferos. Naturalmente, las dosis de los diversos compuestos profármacos variarán algo dependiendo del compuesto principal, la velocidad de hidrólisis in vivó, el peso molecular del polímero, etc. El rango arriba establecido es ilustrativo y aquellos expertos en la materia determinarán la dosis óptima del profármaco seleccionado en base a la experiencia clínica y a la indicación de tratamiento. Las dosis reales serán aparentes al técnico sin experimentación indebida.

Los profármacos de la presente invención pueden incluirse en una o más composiciones farmacéuticas adecuadas para administración a mamíferos. Las composiciones farmacéuticas pueden encontrarse en la forma de una solución, suspensión, tableta, cápsula, o lo similar, preparadas de acuerdo con métodos muy conocidos en la materia. También se contempla que la administración de tales composiciones puede ser mediante las rutas oral y/o parenteral, dependiendo de las necesidades del técnico. Una solución y/o suspensión de la composición puede utilizarse, por ejemplo, como un vehículo para inyección o infiltración de la composición mediante cualquier método conocido, por ejemplo, mediante inyección intravenosa, intramuscular, subdérmica y lo similar. Tal administración también puede ser mediante infusión en un espacio o cavidad corporal, así como también mediante inhalación y/o rutas intranasales. En aspectos preferidos de la invención, sin embargo, los profármacos se administran parenteralmente a mamíferos que necesitan de los mismos. También se contempla que los profármacos de la invención se administren en combinación (por ejemplo, de manera simultánea y/o secuencial) con otros agentes anti-cáncer conocidos en la materia. Los agentes anti-cáncer adecuados incluyen, simplemente a manera de ejemplo: (Paclitaxel; Bristol Myers Squibb); Camptosar® (Irinotecan; Pfizer); Gleevec® (Imatiinib Mesylate; Novartis); Rituxan® (Rituximab; Genentech/IDEC); Fludara® (F!udarabine; Berlex Labs); Cytoxan® (ciclofosfamida; Bristol Myers Squibb); Taxotere® (Docetaxel; Aventis Pharmaceuticals); ylotarg® (Gemtuzumab ozogamicin; Wyeth-Ayerst); Arabinosida de citosina y/o dexametasona, por nombrar solo unos cuantos de tales agentes. EJ E MPLOS Los siguientes ejemplos sirven para proporcionar una apreciación adicional de la invención pero no significa que limiten de manera alguna el alcance eficaz de la invención. Los números subrayados y en negritas citados en los Ejemplos corresponden a aquellos mostrados en las Figuras. En cada una de las figuras, el elemento de azúcar y la estructura de fosfato se representan como: Base simplemente como La designación mPEG deberá entenderse que representa Procedimientos Generales. Todas las reacciones de conjugación entre enlazadores PEG y oligonucleótidos se llevaron a cabo en sistemas reguladores de PBS a temperatura ambiente. La extracción con solventes orgánicos retiró en general los oligonucleótidos sin reaccionar, además, la cromatografía de intercambio aniónico separó conjugados PEG-oligo de los enlazadores en exceso_PEG no reaccionados a fin de dar productos puros. Métodos de HPLC. Las mezclas de reacción y la pureza de los compuestos intermedios y los productos finales se monitorearon mediante un instrumento HPLC Beckman Coulter System Gold® que emplea una columna de fase inversa ZORBAX® 300 SB C-8 (150 x 4.6 mm) o una columna de fase inversa Phenomenex Júpiter® 300A C1 8 (150 x 4.6 mm) con un detector UV de múltiple longitud de onda, mediante el uso de una gradiente de 30-90% de acetonitrilo en 0.5% de ácido trifluoroacético (TFA) y 25-35% de acetonitrilo en 50 m de regulador TEAA con 4 mM de TBACI a una velocidad de flujo de 1 mL/min. La cromatografía de intercambio aniónico se ejecutó en una Estación de Trabajo de Cromatografía por Perfusión Bio-Cad 700E de Applied Biosystems mediante el uso ya sea de resina de intercambio aniónico fuerte Poros 50HQ de Applied Biosystems o de resina de intercambio aniónico débil de flujo rápido DEAE Sepharose de Amersham Biosciences empaquetada en una columna de vidrio AP-Empty de Waters. La desalación se logró mediante el uso de HiPrep 26/10 o columnas de desalación PD-10 de Amersham Biosciences. Ejemplo 1 Compuesto 3. Una solución de compuesto 1 (440 mg, 0.036 mmol) y 2 (5 mg, 3.6 µ????) en regulador de PBS (10 mL, pH 7.4) se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 12 horas. La solución de reacción se extrajo con cloruro de metileno (DC , 3 x 10 mL) y las capas orgánicas combinadas se secaron (MgS04), se filtraron, y el solvente se evaporó bajo presión reducida. El residuo se disolvió en agua doblemente destilada (1 .5 mL por 100 mg) y se cargó en una columna de intercambio aniónico fuerte HQ/Poros (10 mm x 60 mm, volumen de lecho ~6 mL). Los enlazadores PEG sin reaccionar se levigaron con agua (3 - 4 volúmenes de columna) y el producto se levigó entonces con 0.2 M de solución de NH4HCO3 (~2 volúmenes de columna). Las fracciones que contienen producto puro se depositaron y üofilizaron para producir el compuesto puro 3 ( 1 9 mg, 1 .44 mmol, 40%). Ejemplos 2-6 Los compuestos 5, 7, 9, 11 , y 12 se elaboraron y purificaron en la manera similar a 3, variando las producciones desde 30% hasta 50% . Ejemplo 7 Compuesto 14. A una solución de compuesto 13 ( 1 0 mg, 1 .7 µ????) en regulador de PBS (5 mL, pH 7.4) se agregó 10 (175 mg, 85 µ????) en cinco porciones equivalentes cada hora y se agitó a temperatura ambiente durante 12 horas. La solución de reacción se extrajo con DCM (3 x 10 mL) y solución salina (10 mL), y las capas orgánicas combinadas se secaron (MgS04), se filtraron, y el solvente se evaporó bajo presión reducida. El residuo se disolvió en agua doblemente destilada (1 .5 mL) y se cargó en una columna de intercambio aniónlco débil, de flujo rápido, DEAE (10 mm x 60 mm, volumen de lecho ~6 mL), la cual se pre-equilibró con 20 mM de regulador tris-HCI, pH 7.4. Los enlazadores PEG sin reaccionar se levigaron con ag ua (3 a 4 volúmenes de columna) y el producto se levigó entonces con una gradiente de 0 hasta 100% de 1 M de NaCI durante 10 mm a una velocidad de flujo de 3 mL/min. Las fracciones que contienen producto puro se depositaron y desalaron en una columna de desalación PD-10 con 0.2 de solución de NH4HCO3 (~2 volúmenes de columna) y la solución resultante se liofilizó para producir el compuesto puro 14 (25 mg, 0.95 µG???, 57%). Ejemplo 8 El compuesto 16 se elaboró y purificó de la misma manera 14, con una producción de 60%. Ejemplo 9 Compuesto 17. A una solución de ASI (5 mg, 0.85 µ?t???) en regulador de fosfato (2 ml_, pH 7.8) se agregó 10 (175 mg, 0.085 mmol) el cual se dividió en cinco porciones equivalentes en 2 hrs y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante otras 2 hrs. La solución de reacción se extrajo con DC (3 x 6 mL) y solución salina (5 mL), y las capas orgánicas combinadas se secaron (MgS04), se filtraron, y el solvente se evaporó bajo presión reducida. El residuo se disolvió en agua doblemente destilada (5mL) y se cargó en una columna de intercambio aniónico débil, de flujo rápido, DEAE (10 mm x 60 mm, volumen de lecho ~6 mL) la cual se pre-equilibró con 20 m de regulador tris-HCI, pH 7.4. Los enlazadores PEG sin reaccionar se levigaron con agua (3 a 4 volúmenes de columna) y el producto se levigó entonces con una gradiente de 0 a 100% de 1 M de NaCI en 20 mM de regulador tris-HCI, pH 7.4, durante 10 minutos, seguidos por 100% de 1 M de NaCI a una velocidad de flujo de 3 mL/min durante 10 minutos. Las fracciones que contienen producto puro se depositaron y desalaron en una columna de desalación PD-10 y la solución resultante se liofilizó para producir compuesto puro 17 ( 5 mg, 0.57 µp???, 67%). Ejemplos 10-11 Los Compuestos 18 y 19 se elaboraron y purificaron de la misma manera que 17 con producciones de 67% para los productos finales mediante uso de AS2 y AS3 en lugar de ASI . Ejemplos 12-15 El Compuesto 21 se elaboró y purificó de la misma manera que 14 mediante reemplazo de 12 con 20, con una producción de 90%. El Compuesto 22 se elaboró y purificó de la misma manera que 14 mediante reemplazo de 12 con 20, con una producción de 65%. El Compuesto 24 se elaboró y purificó de la misma manera que 14 mediante reemplazo de 12 con 23 y, para la desalación, se utilizó agua (~2 volúmenes de columna) para envigar el producto en lugar de 0.2 M de NH4HC03 de solución. El final fue de 30%. El Compuesto 26 se elaboró y purificó de la misma manera que 24 mediante reemplazo de 23 con 25. La producción fue de 30%. Ejemplo 16 Compuesto 27. A una solución de 13 (10 mg, 1.7 µp???) en regulador de fosfato (5 mL, pH 8.5) se agregó 27 (180 mg, 0.084 mmol) el cual se dividió en diez porciones equivalentes, y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 días. La solución de reacción se extrajo con DCM (3 x 0 mL) y solución salina (10 mL), y las capas orgánicas combinadas se secaron (MgS04), se filtraron y el solvente se evaporó bajo presión reducida. El residuo se disolvió en agua doblemente destilada (1 .5 mL) y se cargó en una columna de intercambio aniónico débil, de flujo rápido, DEAE (0 mm x 60 mm, volumen de lecho ~6 L) la cual se pre-equilibró con 20 mM de regulador tris-HCI, pH 7.4. Los enlazadores de PEG sin reaccionar se levigaron con agua (3 a 4 volúmenes de columna y el producto se levigó entonces con una gradiente de 0 a 100% de 1 M de NaCI en 20 mM de regulador Tris-HCI, pH 7.4, durante 10 min, seguidos por 100% de 1 M de NaCI a una velocidad de flujo de 3 mL/min durante 10 minutos. Las fracciones que contienen producto puro se depositaron y desalaron en una columna de desalación de PD-10 y la solución resultante se liofilizó para producir 14 (105 mg, 0.0102 mmol, 60%). La pureza del producto se determinó por HPLC. Ejemplos 17-21 Los Compuestos 29, 30, y 31 se elaboraron y purificaron de la misma manera que 28, excepto que 13 se reemplazo por AS1 , AS2 y AS3, respectivamente. Se obtuvo una producción de 65% para cada uno de los productos finales. El Compuesto 33 se elaboró y purificó de la misma manera que 14, reemplazando 12 con 32, dando como resultado una producción de 76%. El Compuesto 35 se elaboró y purificó de la misma manera que 14 excepto que PEG activado 34 se utilizó en lugar de 10. La producción final fue de 30%. DATOS BIOLÓGICOS Algunas propiedades in Vítro de conjugados PEG-Oligo se resumen a continuación : Tabla 4. Propiedades In Vitro de conjugados PEG-Oligo PEI= Fosfodiesterasa I, 5'-exonucleasa, cinética realizada a pH 8.8 Regulador TEAA a 37°C; PEI I = Fosfodiesterasa I I, 3'-exonucleasa, cinéticas realizadas a pH 6.5 Regulador TEAA a 37°C; Nucleasa P1 = endonucleasa, cinéticas realizadas a pH 5.3 Regulador TEAA a 37°C; para todas las enzimas 1 unidad libera 1 µ?t??? de oligonucleótido. Farmacocinéticas de Conjugado PEG-Oligo en Ratones ICR Procedimientos Generales 1 ) Alojamiento de animales: Los ratones se alojaron de 6 por jaula, en cajas de cría. Las jaulas se dimensionaron de acuerdo con la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Instituto de Recursos Animales de Laboratorio", Consejo de Investigación Nacional. 2) Dieta: Los ratones tuvieron acceso a agua corriente y se alimentaron con alimento de laboratorio comercialmente disponible ad libitum. 3) Preparación del Compuesto: El compuesto 13 se disolvió en 4.0 mL de solución salina y el compuesto 14 se disolvió en 4.1 mL de solución salina. 4) Sitio de Administración: Los compuestos 13 y 14 se administraron como una sola dosis a través de (Día 1 ) a través de la vena de la cola. Diseño Experimental Se asignaron sesenta (60) ratones, se dosificaron y sangraron de acuerdo con el siguiente diseño, mostrado por la Tabla 5, a continuación . Tabla 5 *Oligo equivalente Tres (3) ratones no tratados se sangraron a través de punción cardiaca en tubos que contienen EDTA para la recolección de plasma de control no tratado. Los ratones se inyectaron de manera intravenosa con 100 µ?_ por ratón con compuestos nativos 13 y 14. Después de la sedación con 0.09% de Avertin, los ratones se sangraron de manera terminal -1000 µ?_ mediante punción cardiaca. La sangre se recolectó en frascos que contienen EDTA. El plasma se recolectó después de centrifugación de la sangre y se congelaron inmediatamente a -80°C en hielo seco. Examinaciones Clínicas: Los ratones se examinaron visualmente una vez al día después de la infusión del artículo de prueba, respecto a mortandad y signos de reacción al tratamiento. Se registró cualquier muerte y señal clínica. Los pesos corporales se midieron solo antes del día de la inyección. Los estudios farmacocinéticas para los compuestos 28 y 33 se realizaron de manera similar. Resultados Experimentales Los resultados farmacocinéticos se resumen en la siguiente Tabla 6, a continuación.

Tabla 6. Propiedades ln Vivo de Conjugados PEG-Oligo Ejemplos 22-25 Confirmación de Actividad In Vitro de Conjugados PEG de Antidetección La proteína Bcl-2 ha demostrado tener una importante actividad anti-apoptótica en células de cáncer de próstata. La sub-regulación de proteína bcl-2 en células de cáncer de próstata se confirma por la muerte celular y la inducción de muerte celular por conjugados PEG de anti-detección de bcl-2 se empleó para confirmar el suministro exitoso intra-celuiar de los oligonucleótidos de antidetección. Materiales y Métodos Para Los Ejemplos 22-25 Los compuestos de prueba se listan por la Tabla 6, a continuación.

Tabla 7 Compuesto Descripción 14 5'G aromático liberable 28 5'-permanente 33 5'G -> aromático liberable A 24 24k-mPEG-BCN3-5' alifático liberable 35 20k-mPEG-RNL9 5' liberable (compuesto intermedio ti ? en ratas) Estos se prepararon como se describe arriba Cultivo celular Se obtuvieron células PC3 libres de micoplasma de la American Type Culture Collection (Rockville, MD) , se desarrollaron en medio del RosweII Park Memorial Institute ("RPMI") (Invitrogen, Grand Island, NY) más 10% de suero bovino fetal ("FBS"), que contiene 10% (v/v) de FBS inactivado por calor (56°C) complementado con 1 % de amino ácidos no esenciales, 1 % de piruvato, 25 mM de regulador HEPES (N-2-Hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido etanosulfónico), 1 00 U/ml de sodio de penicilina G y 100 µ?/?t?? de sulfato de estreptomicina. Los cultivos de depósito se mantuvieron a 37°C en una incubadora de C02 al 5% humidificada. Reactivos FBS y Lipofectina (formulación de liposoma del lípido catiónico N-[1 -(2,3-dioleiloxi)propil]-n,n,n-cloruro de trimetilamoniaco) se adquirieron en Invitrogen (Grand Island, NY). El anticuerpo monoclonal anti-bcl-2 fue de Dako (Carpintería, CA). El anticuerpo monoclonal de anti- -tubulina y 3-(4,5-dimetiltiazol-2-¡l)-2,5-bromuro de difeniltetrazolio ("MTT") se adquirieron en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Los oligonucleótidos de fosforotioato se sintetizaron y purificaron a través de procedimientos estándares. Transfección de Oligonucleótidos Las células se sembraron el día antes del experimento en placas de 6 cavidades a una densidad de 25 x 104 células por cavidad, para ser 60-70% confluentes el día del experimento. Todas las transfecciones se llevaron a cabo en medio Opti-MEM en ausencia de FBS y antibióticos según instrucciones del fabricante. Las cantidades adecuadas de reactivos se diluyeron en 100 µ? de medio Opti-MEM para dar una concentración final de Lipofectina y oligonucleótido. Las soluciones se mezclaron suavemente y se pre-incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir que se formen complejos. Entonces, se agregaron 800 µ? de Opti-MEM, se mezcló la solución y se sobrecolocaron las células que se habían pre-enjuagado con Opti-Mem. El tiempo de incubación para los complejos de oligonucleótido/Lipofectina en Opti-Mem fue de 24 hrs, seguidos por incubación en medio completo que contiene 10% de FBS. El tiempo de incubación total antes de la lisis celular y aislamiento de proteínas fue normalmente de 72 h a 37°C. Análisis Western Blot Las células tratadas con complejos oligonucleótidos-lípido se enjuagaron en PBS y se extrajeron después en regulador de lisis [50 mM de Tris-HCI pH7.4, 1 % de NP-40, 0.25% deoxicolato de sodio, 150 mM de NaCI, 1 mM EGTA, 50 µ??/?t?? Pefabloc SC, 15 µ???? aprotinina, leupeptina, quimoestatina, pepstatina A, 1 mM de Na3V04, 1 mM NaF] a 4°C durante 1 h. Los residuos celulares se retiraron mediante centrifugación a 14 000 g durante 20 min a 4°C. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante uso del sistema de ensayo de proteína Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Las alícuotas de extractos celulares, que contienen 25-40 µg de proteína, se resolvieron por SDS-PAGE y después se transfirieron a papel de filtro Hybond ECL (Amersham, Arlington Heights, IL) y los filtros se incubaron a temperatura ambiente durante 1 -2 hrs en 5% de BSA en PBS que contiene 0.5% Tween-20. Los filtros se sondearon entonces con diluciones al 1 :500 del anticuerpo de anti bcl-2 en 5% de BSA en PBS que contiene 0.5% Tween-20, los filtros se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en 5% de leche en PBS que contiene 0.5% de Tween con una dilución al 1 :3,000 de un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (Amersham). Después de enjuagar (3 x 10 min), la iluminación electroquímica ("ECL") se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Determinación de Velocidad de Proliferación Celular El efecto sobre la viabilidad celular de conjugados PEG se determinó por ensayo MTT. En resumen, se sembraron 15-20 x 104 células en placas de 6 cavidades y se permitieron anexar durante la noche. Las células se trataron entonces con las concentraciones adecuadas de oligonucleótido acomplejado con Lipofectina durante 24 hrs a 37°C, seguido por incubación en medio completo (100 µ?) que contiene 10% de FBS. La viabilidad celular se determinó diariamente. Se agregaron diez µ? de 5 mg/ml de TT en PBS a cada cavidad, seguido por incubación durante 4 h a 37°C. Después, se agregaron 100 µ? de 10% de SDS en 0.04 M de HCI a cada cavidad , seguido por incubación durante la noche a 37°C para disolver los cristales de formazan. La absorción se determinó a 570 mn con un espectrofotómetro Benchmark plus Microplate (Bio Rad, Hercules, CA). Los experimentos se llevaron a cabo en 6 reproducciones y los datos se presentan como el promedio +/- S.D. Cuantlficación de niveles ROS intracelulares Se utilizaron diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluoresceína (H2DCF-DA) y dihidroetidio (HE) para especies de oxígeno reactivo ("ROS") determinadas y niveles de superóxido. Ambas tinturas no son fluorescentes y pueden difuminarse libremente hacia las células. Cuando HE se oxida a etidio (E), se intercala en ADN celular y resplandece. La oxidación de H2DCF-DA produce 2'-7'-diclorofluoresceína (DCF), la cual resplandece, y ambos pueden detectarse mediante citometría de flujo. Las células se cosecharon mediante tripsinización, se enjuagaron con PBS y se tiñeron con 50 µ? de H2DCF-DA o 50 µ? de HE en DMEM libre de rojo fenol durante 2 h a 37°C. Los números de canal de fluorescencia medio de DCF y E se analizaron mediante citometría de flujo en los canales FL-1 y FL-2, respectivamente. Se adquirió un mínimo de 10,000 células para cada muestra y los datos se analizaron mediante el uso de software CELLQuest (Becton Dickinson). Los histogramas se graficaron a una escala logarítmica. Ejemplo 22 Inhibición de Expresión de Proteína Bcl-2 Tres oligonucleótidos PEG (compuestos 14, 28 y 33) dirigidos a la expresión de bcl-2 se transfectaron en células PC3 y su capacidad para inhibir la expresión de proteína bcl-2 se evaluó mediante manchado Western. Efectos de Lipofectina Inicialmente, el grado de inhibición de la expresión de proteína bcl-2 en células PC3 inducido por el compuesto 14 se determinó en presencia y ausencia de Lipofectina. Las células PC3 se trataron con compuesto 14 (a 200, 400 y 800 nM) en presencia o ausencia de Lipofectina durante 24 horas en Opti-MEM, y después por 67 horas más en medio completo. Las muestras de proteína (30-40 µg de proteína/hilera) se analizaron mediante manchado Western como se describe en Material y Métodos, utilizándose tubulina como una especie de proteína de control. El % de inhibición vs. células no tratadas de control se determinó mediante densitometría de exploración láser. Los resultados del Western Blot se muestran por la FIG. 12. La expresión de a-tubulina y PKC-a permaneció sin cambios, confirmando que la Lipofectina es útil para obtener la penetración del compuesto 14 en células PC-3, y confirmando que solo la expresión de proteína bcl-2 se sub-reguló por el compuesto 14. La investigación adicional demostró que los compuestos 14 y 28 fueron los más activos a 400 nM. Las células PC3 se trataron con complejos del compuesto 14, compuesto 28 y compuesto 23 a 400, 800 y 1 000 n M y Lipofectina durante 24 hrs en Opti-ME y después durante 67 horas más en medio completo. Las muestras de proteína (30-40 µ9 de proteína/hilera) se analizaron mediante manchado Western como se describe en Material y Métodos, utilizándose tubulina como especie de proteína de control. El % de inhibición vs. células no tratadas de control se determinó mediante densitometría de exploración láser. El compuesto 14 produjo 86% de la sub-regulación y el compuesto 28 produjo 78% de la sub-regulación. Ejemplo 23 Análisis dependiente de dosis de expresión de proteína bcl-2 mediante oligonucleótidos PEG Para confirmar aún más el efecto inhibidor de los compuestos 14 y 28 en la expresión de proteína bcl-2, las células PC3 se trataron con concentraciones crecientes (25, 50, 100, 200 y 400 nM) de compuesto 14, compuesto 28 y compuesto 13 como un control positivo, acomplejado con Lipofectina, durante 24 hrs en Opti-MEM, y después durante 67 hrs más en medio completo. Las muestras de proteína (30-40 µg de proteína/hilera) se analizaron por manchado Western, como se describe en la sección de Material y Métodos, supra.

Se observó una inhibición dependiente de la concentración de la expresión de proteína bcl-2 mediante Western Blot para los compuestos 14 y 28, con relación a los controles. Se observó aproximadamente una inhibición de 1 -2% a 50 nM, incrementándose a 99% y 75% a una concentración de 400 nM . Para el compuesto 24, esencialmente no se observó inhibición a 50 nM, pero la inhibición incrementó a 77% a una concentración de 400 nM. La transfección con el compuesto 13 se utilizó como un control positivo. La expresión de a-tubulina no se inhibió por ningún oligonucleótido. El experimento anterior se repitió con el compuesto 24 como un control. Las células de PC3 se trataron con concentraciones incrementadas de compuestos 35 y 24 (25, 50, 100, 200 y 400 nM) que fueron acomplejados con Lipofectina durante 24 hrs en Opti-MEM y después durante 67 hrs más en medio completo. Las muestras de proteína (30-40 µg de proteína/hilera) se analizaron mediante manchado Western, como se describe en la sección de Material y Métodos, supra, utilizándose tubulina como una especie de proteína de control. El % de inhibición vs. células no tratadas de control se determinó mediante densitometría de exploración láser. Ejemplo 24 Efecto de Oligonucleótidos PEG en Desarrollo Celular de PC3 Los efectos de los compuestos 14 y 28 sobre el desarrollo de células de cáncer de próstata PC3, ín Vitro, también se examinaron. Las células PC3 se trataron con complejos oligonucleótidos/Lipofectina. Como se muestra en la FIG. 10, la transfección del compuesto oligonucleótido de anti-detección 14 a 400 y 200 nM inhibió fuertemente el desarrollo celular, afectando solo ligeramente el compuesto 28 la velocidad de proliferación. Ejemplo 25 Efecto de oligonucleótidos PEG sobre la producción de especies de oxígeno reactivas en células PC3 La producción de especies de oxígeno reactivas o ROS en células PC3 se evaluó de manera citométrica por flujo mediante dos métodos. El primero se basa en la oxidación de hidroetidio (HE) a etidio (E), el cual se intercala posteriormente en ADN con fluorescencia detectable por citometría de flujo. El segundo método empleó la oxidación de diacetato 2',7'-dihidrodiclorofluoresceína permeable a células hacia 2',7'-diclorofluoresceína fluorescente (DCF). En células PC3, el tratamiento con complejos de compuesto 14/Lipofectina (400 nM/15 µg/ml) durante 24 horas en Opti-MEM generó ROS tres días después, según se evaluó por citometría de flujo tanto por E (1.9 veces de incremento contra control, células no tratadas) y DCF (2 veces de incremento contra control, células no tratadas) de fluorescencia. Según se confirma por los datos resumidos por la Fig. 11 , el compuesto 28 no produjo ningún incremento en la producción de ROS contra células no tratadas de control. Además, la producción de ROS se relaciona de manera muy cercana con la velocidad de la proliferación celular; las células dejan de desarrollar después de tratamiento con 400 nM de compuesto 14 y este oligonucleótido también origina un incremento en la producción de ROS (DCF y HE).

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1 . Un profármaco oligonucleótido de la fórmula (I): 0) en donde: Ri y R2 son independientemente H o un residuo de polímero; L-i y L4 son elementos de enlace liberable independientemente seleccionados; l_2 y L-3 son grupos separadores independientemente seleccionados; X-i es un residuo nucleotido o un residuo oligonucleótido; m, n, o y p son independientemente cero o un entero positivo, siempre y cuando ya sea (o + n) o (p + m) > 2. 2. El profármaco según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho nucleotido se selecciona a partir del grupo que consiste en: en donde: es O o S; y B2 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en A (adenina), G (guanina), C (citosina), T (timina), U (uracilo) y bases modificadas; R-i oo y R101 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en H, OR' donde R' es H, un alquilo C1 -6, alquilo sustituido, nitro, halo y arilo. 3. El profármaco según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho oligonucleótido contiene desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 1000 nucleótidos. 4. El profármaco según la reivindicación 1 , caracterizado porque M es S. 5. El profármaco según la reivindicación 1 , caracterizado porque el oligonucleótido es un oligonucleótido de fosforotioato. 6. El profármaco según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho residuo oligonucleótido es un residuo oligonucleótido de anti-detección o residuo oiigodeoxinucleotido. 7. El profármaco según la reivindicación 6, caracterizado porque dicho residuo oligonucleótido de anti-detección o residuo oligodeoxinucleótido se selecciona a partir del grupo que consiste en oligonucleótidos y oligodeoxinucleótidos con estructuras de fosforodiéster o estructuras de fosforotioato, LNA, PNA, triciclo-ADN, ODN simulado, ARNi, ribozimas, fundiciones especulares, y oligómeros CpG. 8. El profármaco según la reivindicación 6, caracterizado porque dicho oligonucleótido de anti-detección tiene una secuencia seleccionada a partir del grupo q ue consiste en SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, en donde X de SEQ ID NO : 4 es cualquier nucleótido compatible. 9. El profármaco según la reivindicación 1 caracterizado porque al menos uno de R-¡ y R2 es un residuo polimérico que tiene un grupo de tapado A, seleccionado a partir dei grupo que consiste en OH , N H2, S H , C02H , alquilos Ci-6, (TU) en donde X2 y X3 son residuos nucleótidos u oligonucleótidos independientemente seleccionados. 1 0. Un profármaco según la reivindicación 9, seleccionado a partir del grupo que consiste en: H-X2 f"L)~ Rl 1") — (L¡) ?2"? ° (i) bis-3'- oligonucleótido, H-X2 (~^-(-L) R1 {?^{1^~?t? bis-3', 5'-Oligonucleótido, 1 1. El profármaco según la reivindicación 1 , caracterizado porque l_4 se selecciona a partir del grupo que consiste en: en donde: Y -25 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en O , S o N R9; R6-7 , R9-131 Ri e-25 y R27-41 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilos C1 -16, alquilos ramificados C3-12, cicloalquilos C3-8, alquilos sustituidos C1 -6, cicloalquilos sustituidos C3-8, arilos, arilos sustituidos, aralquiios, heteroalquilos C1-6, heteroalquilos sustituidos C -6, alcoxi C1 -6, fenoxi y heteroalcoxi C1-6; Ar es un elemento que forma un hidrocarburo aromático multi-sustituido o un grupo heterocíclico multi-sustituido; L5-12 son separadores independientemente bifuncionales; Z se selecciona de entre elementos activamente transportados hacia una célula objetivo, elementos hidrofóbicos, elementos de enlace bifuncional y combinaciones de los mismos; c, h, k, I, r, s, v, w, v', w', c' y h' son enteros positivos independientemente seleccionados; a, e, g, j, t, z, a', z', e' y g' son independientemente ya sea cero o un entero positivo; y b, d, f, i, u, q, b', d' y f son independientemente cero o uno. 12. El profármaco según la reivindicación 1, caracterizado porque Li se selecciona a partir del grupo que consiste en: en donde: ??'.25' se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en O, S o NR9; R6'-7', R9'-13', Ri6--25' y R27'- r se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilos C-i.-ie, alquilos ramificados C3-12, cicloalquilos C3-8, alquilos sustituidos C1-6, cicloalquilos sustituidos C3-s, arilos, arilos sustituidos, araiquilos, heteroaiquiios C1-6, heteroaiquiios sustituidos C1-6, alcoxi C1-6, fenoxi y heteroalcoxi C1-6; y 1-5 -12· son separadores Independientemente bifuncionales. 13. El profármaco según la reivindicación 1 , caracterizado porque 1 -2 son cada uno óxidos de polialquiíeno. 14. El profármaco según la reivindicación 1 , caracterizado porque R1-2 son cada uno glicoles de polietileno. 15. El profármaco según la reivindicación 1 , caracterizado porque R1 -2 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en: J-0-(CH2CH20)n.- J-0-(CH2CH20)n-CH2C(0)-0- J-0-(CH2CH20)n-CH2CH2N R48- J-0-(CH2CH20)n-CH2CH2SH -0-C(0)CH2-0-(CH2CH20)n-CH2C(0)-0- -NR48CH2CH2-0-(CH2CH20)n.-CH2CH2N R48- -SHCH2CH2-0-(CH2CH20)n -CH2CH2SH-, en donde n' es el grado de polimerización; R4a se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilos Ci-6, alquilos ramificados C3-12, cicloalquilos C3-8, alquilos sustituidos C1-6 l cicloalquilos sustituidos C3-8, arilos, arilos sustituidos, aralquilos, heteroalquilos C1-6, heteroalq uilos sustituidos C1-6, alcoxi C1 -6, fenoxi y heteroalcoxi Ci-6; y J es un grupo de tapado. 16. El profármaco según la reivindicación 1 , caracterizado porque R1 -2 son independientemente -0-(CH2CH20)x- en donde X es un entero positivo seleccionado a fin de que el peso molecular promedio en peso sea de al menos aproximadamente 2,000 Da hasta aproximadamente 136,000 Da. 17. El profármaco según la reivindicación 1 , caracterizado porq ue R1-2 independientemente tienen un peso molecular promedio en peso de desde aproximadamente 3,000 Da hasta aproximadamente 100,000 Da. 18. El profármaco según la reivindicación 1 , caracterizado porque R1-2 independientemente tienen un peso molecular promedio en peso de desde aproximadamente 5,000 Da hasta aproximadamente 40,000 Da. 19. El profármaco según la reivindicación 8, caracterizado porque dicho oligonucleótido de anti-detección es oblimerseno (SEQ ID NO: 1 ). 20. Un profármaco oligonucleótido de la fórmula: l_2 es un grupo separador; ?? es un nucieótido o un residuo oligonucleótido; u' es un entero positivo; y T es un miembro del grupo que consiste en : ?? 21 . Un compuesto según la reivindicación 1 , caracterizado porque se selecciona a partir del grupo que consiste en: todos los cuales comprenden un oligonucleótido de la SEQ ID NO: 1 . 22. Un método para la elaboración de un profármaco, caracterizado porque comprende: reaccionar un compuesto de la fórmula: R2-L4-grupo de abandono con un compuesto de la fórmula: en donde: R2 es un residuo de polímero; L4 es un elemento de enlace liberable; L3 es un grupo separador; es un nucleótido o un residuo oligonucleótido. 23. Un método para el tratamiento de un mamífero, caracterizado porque comprende la administración a un mamífero, que necesita de tal tratamiento, de una cantidad eficaz de un compuesto de la reivindicación 1. 24. El método según la reivindicación 23, caracterizado porque el mamífero se está tratando por cáncer. 25. El método según la reivindicación 23, caracterizado porque X-i es un oligonucleótido de anti-detección. 26. El método según la reivindicación 23, caracterizado porque el mamífero también se trata con un segundo agente anticáncer que se administra de manera simultánea o secuencial con el profármaco oligonucleótido.