MXPA05003322A - Procedimiento para la produccion de un mamifero resistente a una infeccion por un alfa herpes virus asi como un mamifero obtenido por la aplicacion de este procedimiento y descendiente de dicho mamifero. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a un metodo para la produccion de un mamifero que pertenece a una especie no humana que se vuelve resistente por transgenesis germinal a una infeccion mediada por un alfa herpes virus para el cual el polipeptido HveC o nectina -1 constituye un receptor funcional. Se introduce por insercion o recombinacion homologa en el genoma de las celulas que constituyen la linea germinal del mamifero, un transgen que permite la expresion de una proteina quimerica constituida por un lado por el dominio extracelular de la nectina-1 o HveC o de una de sus partes y por otra parte por el fragmento cristalizable de una inmunoglobulina, en un sistema de expresion apropiado.

Description

PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE UN MAMÍFERO RESISTENTE A UNA INFECCIÓN POR UN ALFA HERPES VIRUS ASÍ COMO UN MAMÍFERO OBTENIDO POR LA APLICACIÓN DE ESTE PROCEDIMIENTO Y DESCENDIENTE DE DICHO MAMÍFERO Se conocen diferentes virus de tipo herpes que se distinguen por su genoma asi como por sus características biológicas. Una subfamilia de estos virus corresponde a alfa herpes virus entre los cuales podemos mencionar los virus herpes simplex humanos de tipo 1 y de tipo 2 (HSV-1 y HSV-2), el virus de la enfermedad de Aujeszky o Pseudorabies virus (PRV) y el herpes virus bovino de tipo 1 (BHV-1) . Todos estos virus presentan la peculiaridad de ser neurótropos y de presentar un ciclo de replicación muy corto y un amplio espectro de huéspedes. La infección por este virus provoca lesiones en la epidermis, en general a nivel de las mucosas, seguido por una propagación del virus hasta el sistema nervioso en donde puede causar inflamaciones agudas asi como infecciones latentes . Entre los alfa herpes virus que provocan las lesiones más importantes, podemos mencionar el virus PRV que es un agente patógeno de la mayor importancia económica en la producción porcina tanto por el costo directo de las patologías inducidas como por el costo de los medios para contrarrestar su acción.

Este virus se encuentra presente ampliamente en la mayoría de las regiones de producción porcina importante (Europa, Norteamérica, Asia) . Hoy en día existen varias vacunas contra el virus PRV que representan un mercado importante a escala mundial. Una vacunación de este tipo sin embargo presenta inconvenientes tomando en cuenta especialmente el costo causado por la necesidad de vacunar a una gran proporción de animales en un rebaño y los problemas prácticos relacionados con esta necesidad que hacen que esta operación sea particularmente incómoda, y esto todavía más puesto que es generalmente necesario efectuar varias inyecciones. El costo y las limitaciones de esta operación pueden limitar su uso y por consiguiente su eficacia. Las estrategias de erradicación del virus se emplean también con resultados variables pero siembre frágiles. El virus BHV-1 responsable de la rinotraqueitis infecciosa bovina provoca también daños importantes en los rebaños. Este virus es muy contagioso tanto en el caso de terneras recién nacidas como en el caso de animales de mayor edad; puede causar una inflamación al nivel de la cavidad nasal, de la laringe, lesiones oculares y afecciones respiratorias, pero también puede localizarse a nivel del cerebro causando encefalitis o tomar formas genitales. Estas afecciones diferentes son frecuentemente mortales en el caso de la ternera recién nacida y causan pérdidas muy importantes para los criaderos de ganado; además, en un caso de vacas lecheras, se puede observar una baja espectacular de la producción de leche. Existen también varias vacunas contra el virus BHV-1, pero la vacunación los mismos inconvenientes que la vacunación contra el virus PRV en las granjas porcinas. Además, vacunas contra el virus del BHV-1 inyectadas por vía intramuscular se consideraron como responsables de abortos en vacas en gestación. La erradicación de virus ha sido propuesta también especialmente en ciertos países europeos, pero resulta ser particularmente difícil debido al carácter latente del virus que puede permanecer durante mucho tiempo inactivo en un organismo antes de manifestarse, especialmente bajo el efecto de un estrés. Por consiguiente, la concepción de un procedimiento que permita crear líneas de puercos transgénicos constitutivamente resistentes al virus PRV o también de líneas de bovinos transgénicos constitutivamente resistentes al virus BHV-1 tendría un interés económico considerable. El objeto de la presente invención es proponer un procedimiento de este tipo. Este procedimiento pudo concebirse gracias a investigaciones previas efectuadas en un modelo de ratón, que, como el cerdo o el bovino, es sensible a ciertos alfa herpes virus y especialmente a los virus HSV1 y PRV. Se sabe que los alfa herpes virus se unen a las células primero gracias a la interacción de una glicoproteina viral gC, penetrando en la constitución de la membrana del virión y del sulfato de heparano presente en la superficie de las células, mientras que la fusión posterior entre la envoltura del virión y la membrana celular requiere de la intervención de otras glicoproteinas (gB, gD, gH y gL) . Numerosos trabajos se han enfocado al estudio de receptores potenciales de alfa herpes virus presentes en la superficie de células de mamíferos huéspedes que tienen una capacidad de fijación de al partícula viral y que pueden eventualmente neutralizar de esta forma su poder de infección. Cuatro proteínas receptoras de alfa herpes virus han sido identificadas hasta la fecha, específicamente: - HVEM o HveA que es un mediador de la entrada de los virus HVS1 y HVS2 pero no del virus PRV (Montgomery, R. I., Warner, M. S., Lum B.J., y Spear, P.G. (1996). Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Cell 87, 427-436) . - Tres miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas (HveB o nectina-2; HveC o nectina-1 y HveD) (Cocchi, F . , Menotti, L., Miorandola, P., López, M., and Campadelli-Fiume, G . (1998) . The ectodomain of a novel member of the immunoglobulin subfamily related to the poliovirus receptor has the attribute of bona fide receptor for herpes simplex virus types 1 and 2 in human cells. J. VI rol. 72, 9992-10002; Geraghty, R.J., Krummenacher, C, Eisenberg, R.J., Cohén G. H., and Spear, P. G. (1998) Entry of alphaherpesviruses mediated by poliovirus receptor related protein 1 and poliovirus receptor. Scence 280, 1618-1620; Shukla, D., Liu, J., Blaiklock, P., Sh orak, N. ., Bai, X., Esko, J.D., Cohén, G. H., Eisenberg, R. J., Rosenberg, R. D., and Spear, P. G. (1999) . A novel role for 3-O-sulfate heparan sulfate in herpes simplex virus entry. Cell99, 13-22; Warner, M. S., Martínez, W., Geraghty, R. J., Montgomery, R.I., Witbeck, J. C, Xu, R., Eisenberg, R; J., cohén, G. H., and Spear, P. G. (1998) . A cell surface protein with herpesvirus entry activity (HveB) confers susceptibility to infection by herpes simplex virus type 2, mutants of herpes simplex virus type 1 ans pseudorabies virus. Virology 246, 179-189. Según las publicaciones Spear, P. G. (1993) . Entry of alpha herpesviruses ínto cells. Semin. Virol 4, 167-180; Campadelli--Fiume, G., Arsenakis, M., Farabegoli, F., and Roizman, B. (1988) . Entry of herpes simplex virus 1 in BJ cells that constitutively express viral glycoprotein D is by endocystosis and results in degradation of the virus. J. Virol. 62, 159-167, se ha sugerido que, además de la unión inicial con el sulfato de heparano, es la interacción de la glicoproteina gD de alfa herpes virus con un receptor presente en la superficie de la célula que permite la entrada del virus bajo una forma infecciosa y que en algunos tipos de células, los virus HSV-1, PRV y BHV-1 pueden utilizar un receptor común de la glicoproteina gD para penetrar en la célula . Se ha comprobado asi que la proteina HVEM puede permitir la entrada de virus HSV1 y HSV2 en células no permisivas pero no la entrada de virus PRV. Al contrario, se ha demostrado que la proteina HveC, y especialmente la proteina del cerdo se comportan como un receptor funcional no solamente del virus HSV.l pero también de alfa herpes virus de animales PRV y BHV-1 (Milne, R.S.B., Connolly, S.A., Krummenacher, C, Eisenberg, R. J., and Cohén, G.H. (2001) . Porcine HveC, a member of the highly conserved HveC/nectin 1 family, is a functional alphaherpesvirus receptor. Virology 281, 315-328; Cocchi, F . , Menotti, L., Mirándola, P., López, M., and Campadelli-Fiume, G. (1998) . The ectodomain of a novel member of the immunoglobulin subfamily related to the poliovirus receptor has the attribute of a bona fide receptor for herpes simplex virus types 1 and 2 in human cells. J. Virol. 72, 9992-10002; Geraghty, R. J., Krummenacher , C, Eisenberg, R. J., Cohén G. H . , and Spear, P. G. (1998) Enty of alphaherpesviruses mediated by poliovirus receptor related protein 1 and poliovirus receptor. Science 280, 1618-1620) . Las capacidades de unión con la glicoproteina viral gD son atribuidas más particularmente al dominio V para HveC y a dos primeros dominios ricos en cisteina (<< CRD >>) para HVEM (Structure Based Analysis of the Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Binding Site Present on Herpesvirus Entry Mediator HevA (HVEM) . Connolly SA, Landsburg DJ, Cari A, Wiley DC, Eisenberg RJ, Cohén GH; J Virol 2002, ov 1; 76(21) : 10894-10904) . Sin embargo se ha mostrado en la publicación Martínez WM, Spear PG, Amino acid substitutions in the V domain of neectin-1 (HveC) that impair entry activity for herpes simples virus types 1 and 2 but not for Pseudorabies virus of bovine herpesvirus 1, J Virol. 2002 Jul; 76(14) : 7255-62, que las capacidades de unión con la glicoproteina viral gD de la proteína (HveC) podían ser alteradas significativamente sin impedir las capacidades de esta proteína para desencadenar la fusión de las membranas celulares y virales y permitir así la entrada de los virus PRV y BHV-1 en la célula bajo una forma infecciosa . Se ha mostrado además en la publicación Campadelli-Fiume G, Cocchi F, Menotti L, López M. the novel receptors that medíate the entry of herpes simplex viruses and animal alphaherpesviruses into cells Rev Med Virol. 2000 Sep-Oct; 10(5) : 305-19, que la proteína HveC expresada por el ratón puede desempeñar una función de mediador de la entrada de alfa herpes virus PRV, BHV-1 y HSV independientemente de una interacción detectable con la glicoproteína gD. Se a concebido además globalmente en el estudio Geraghty RJ, Fridber A, Krummenacher C, Cohén GH, Eisenberg RJ, Spear PG, use of chemiric nectin-1 (HveC) -related receptors to demónstrate that ability to bind alphaherpesvirus gD is not necessarily sufficient for viral entry, Yirology. 2001 Jul 5; 285(2) : 336-75, que la interacción de la proteína HveC con la glicoproteína gD no era suficiente para permitir la entrada del virus en la célula y que las características de la proteína HveC responsable de esas propiedades de mediador de la entrada de virus HSV, PVR y BHV1 en las células blanco no podían relucirse a sus capacidades de unión con la glicoproteína gD. Se debe observar además que la proteína HveC posee además una secuencia polipeptídica notablemente bien conservada entre las especies de mamíferos. A titulo de ejemplo, el 97% de los aminoácidos son comunes entre la proteína HveC expresada en el cerdo y la proteína HveC expresada en los bovinos, lo que implica una fuerte identidad de estructura y de función en estas dos especies.

Según la publicación INOBE MA ABU et al « Functional analysis of HVEM, a member of TNFR Family, by using a transgenic mice expressing soluble from of HVEM >> (Biosciences information Service, Philadelphia, PA - US -2001.03.07), se a creado con un propósito experimental, lineas de ratones genéticamente modificados introduciendo en el genoma de estos ratones un transgen que codifica una proteina quimérica conformada por el dominio extracelular de la proteina HVEM y la porción cristalizada Fe de la inmunoglobulina IgG, y esto para estudiar la implicación de la proteina HVEM en la regulación del sistema inmunitario. Se ha confirmado asi que la expresión de una forma soluble de HVEM miembro de la familia de receptor de TNF-alfa, produce un efecto inmunosupresor . A partir de estos conocimientos previos, se ha propuesto de conformidad con la presente invención un procedimiento para la producción de un mamífero que pertenece a una especie no humana que se vuelve resistente por transgénesis germinal a una infección por un alfaherpes virus para el cual el polipéptido HveC o nectina 1 constituye un receptor funcional, que se caracteriza porque se introduce mediante la inserción o recombinación homologa en el genoma de células que conforman la línea germinal de mamífero o de uno de sus ancestros un transgen que permite la expresión de la proteína quimérica constituida por un lado por el dominio extracelular de la nectina-1 o HveC y bien de una de sus partes, y por otro lado del fragmento cristalizable de una inmunoglobulina, especialmente una inmunoglobulina de tipo gamma, en un sistema de expresión apropiado. La idea de base de la invención consiste por consiguiente en utilizar parcialmente las capacidades de mediador de la proteina HveC con relación a la penetración del virus enfocado, pero esto de manera inofensiva para la célula (aislando su dominio celular o una de sus partes) para inhibir finalmente la entrada de este virus en la célula y favorecer su eliminación, esto a través de un proceso que sigue por determinarse. El mecanismo de acción de la proteina quimérica expresada podría comprender específicamente, gracias a la capacidad de fijación de dicha proteína tanto en el caso de partícula viral como en el caso del receptor celular Fe, de un incremento de las capacidades de fagocitosis y de destrucción de viriones por los macrófagos y células dendríticas y una activación de los linfocitos citotóxicos NK. Podría también comprender la formación de receptores de membrana de alfa herpes virus, bajo la forma de multímeros funcionalmente alterados por la incorporación de una o varias unidades de la proteína quimérica, permitiendo la fijación de partículas virales en la superficie de la célula pero no su penetración en el citoplasma bajo una forma infecciosa.

Según la infección, la proteina HveC o nectina-1 y/o la inmunoglobulina pertenecen de preferencia a la especie homologa . Se podría también utilizar solamente una parte de la nectina-1 o HveC, o bien eventualmente formas mutadas de estas partes, seleccionadas por su capacidad de unión con el virus obj etivo . La primera etapa en el procedimiento de conformidad con la presente invención corresponde por consiguiente a la preparación del transgen que puede efectuarse utilizando métodos bien conocidos por parte de especialistas y ampliamente descritos en la literatura que consisten en clonar : Por un lado, o bien ADN complementario del ARN transcrito para el gen del receptor celular, a partir de una preparación de ARN extraída de una toma de tejido efectuada en un mamífero, ya sea la región cromosómica (ensamble de exones e intrones) que constituye ese tipo de receptor a partir de una preparación de ADN genómico extraída también por toma de tejido efectuada en un mamífero, ya sea una constitución quimérica constituida en parte por ADNc y por la parte restante por la cadena polipéptida de fragmento genómico correspondiente (<< minigen >>) . En todos los casos, se utilizará solamente la parte correspondiente al dominio extracelular de este receptor, o bien en otra versión del procedimiento, una subparte de este dominio o hasta eventualmente una secuencia polipeptidica esencialmente derivada de este dominio extracelular . Por otro lado, o bien el ADNc complementario del ARN transcrito para uno de los genes de la cadena pesada para la clase y la subclase de inmunoglobulina seleccionada (por ejemplo Gl), a partir de una preparación de ARN extraída de una toma de tejido efectuada en un mamífero, o bien la región cromosómica (ensamble de exones e intrones) que constituyen este gen de cadena pesada a partir de una preparación de ADN genómico extraída también de una toma de tejido efectuada en un mamífero, o bien una construcción quimérica constituida por parte de ADNc y por parte restante de la cadena polipeptidica del fragmento genómico correspondiente (<< minigen>>) . La construcción realizada conservará provechosamente las regiones que codifican los dominios Hinge, CH2 y CH3 únicamente de la cadena pesada de inmunoglobulina seleccionada, (fracción cristalizable) . Un ejemplo de una construcción de este tipo para la inmunoglobulina humana Gl se describe en la publicación CTLA-4 Is a Second Receptor for the B Cell Activation Antigen B7. By Peter S. Linsley, William Brady, Mark Urnes, Laura S. Grosmaire. Nitin K. Damale, and Jeffrey A. Ledbetters; J. Exp. ed © The Rockefeller University Press; volume 174, Septiembre de 1991, 561-569.

Las operaciones de clonación se realizarán a partir e conocimientos previos existentes con relación a los genes utilizados, Específicamente subsecuencia, su localización cromosómica, esto en caso posible en la especie homologa, sino basándose en las secuencias conocidas para este gen en otros mamíferos. Estas operaciones podrán realizarse a través de una reacción de polimerización en cadena de polimerasa (PCR) precedida por una etapa de transcripción reversa para el ADN complementario o por detección en bancos de ADN genómico de la especie contemplada de clones susceptibles de hibridarse con una sonda específica o de producir un amplicon PCR específico del gen buscado. Esta construcción se efectuará para unir las secuencias que codifican el dominio extracelular de la nectina-1 o HveC o de una de sus partes en 5' de secuencias que codifican el fragmento cristalizable de la cadena pesada de inmunoglobulina (determinada por un codón de terminación) respetando el cuadro de lectura original de los dos genes, y eventualmente la naturaleza y la eficacia de uniones intrones-extrones si están incluidos, para cerciorarse, al final, de la expresión de una proteína quimérica constituida por la parte aminc terminal del polipéptido que corresponde al dominio extracelular del receptor celular HveC o bien a una de sus subpartes y por la parte carboxi terminal de los dominios Hinge, CH2 y CH3 de la cadena pesada de inmunoglobulina . Esta construcción se efectuará en un vector de expresión que permite una expresión fuerte de la proteina quimérica en uno o varios compartimientos biológicos del huésped en donde permitirá la protección de células para que el huésped sea globalmente resistente a la infección inicial o a su desarrollo. El procedimiento consistirá especialmente en utilizar sistemas de expresión activos ya sea de manera constitutiva en el conjunto de las células ya sea más específicamente en tejidos blancos de la infección viral tales como los tejidos del sistema nervioso central o los tejidos epiteliales (especialmente los del sistema respiratorio) . El efecto de expresión podrá incluir una región promotora, una señal de terminación, elementos estimuladores de la transcripción, secuencias aislantes del contexto cromatiño, otras unidades de transcripción, todos los elementos susceptibles de asegurar la expresión deseada. El procedimiento consistirá de manera provechosa del empleo de sistemas de expresión constituidos a partir de secuencias reguladoras clonadas en la especie homologa o bien para la aplicación a animales de renta, en otros animales de crianza habitualmente consumidos por el ser humano. La segunda etapa del procedimiento de conformidad con la presente invención consiste en la introducción del transgen obtenido de esta manera en el genoma de células que constituyen la linea germinal del mamífero huésped contemplado por inserción o recombinación homologa, ahí también a través de un método bien conocido por parte de los especialistas de tal manera que este transgen se integre en el patrimonio genético de este mamífero. Se podrá utilizar especialmente para este propósito la microinyección pronuclear del segmento de ADN que codifica el transgen o la transferencia nuclear de células transformadas en cultivo por el transgen. La invención se refiere también a un mamífero que pertenece a una especie no humana que se vuelve resistente por transgénesis germinal a una infección por un alfa herpes virus para el cual el polipéptido HveC o nectina-1 constituye un receptor funcional para el propósito de expresión de una proteína quimérica constituida por un lado por el dominio extracelular de la nectina-1 o HveC o bien por una de sus partes de preferencia de la especie homologa, y por otro lado del fragmento cristalizable de una inmunoglobulina, especialmente de una inmunoglobulina de tipo gamma, preferentemente de la especie homologa. La invención se refiere también a la descendencia de un mamífero de este tipo que ha heredado por descendencia el transgen insertado en el genoma de la línea germinal de uno de sus padres. De conformidad con la presente invención, el alfa herpes virus puede ser provechosamente el virus PRV y el mamífero puede pertenecer a la especie porcina. Es esencial de conformidad con la presente invención que la operación de transgénesis sea una transgénesis germinal de tal manera que los descendientes de mamífero sean también ellos susceptibles de expresar la proteína quimérica. La invención se refiera también a un material genético como por ejemplo semillas o bien ovocitos o bien embriones esencialmente derivados de mamíferos transgénicos del tipo mencionado arriba. En anexos se presentan varios ejemplos de secuencias de proteínas quiméricas de conformidad con la presente invención . Se trata de secuencias de aminoácidos que contienen el péptido señal en el extremo amino terminal que será procesado durante la maduración. Una proteína quimérica de conformidad con este modelo se describe también en el documento JP-2001-328430 dentro del marco de otra solicitud. La factibilidad del procedimiento de conformidad con la presente invención ha sido confirmada por 1) Resultados experimentales obtenidos dentro del marco del análisis in vivo de la resistencia al virus herpes simplex humano de tipo l(HSV-l) de ratones transgénicos que expresan una proteína quimérica Hvem-Ig.

Según esas pruebas, se ha introducido por transgénesis germinal en el ADN de estos ratones un transgen que codifica una proteina quimérica constituida por el dominio extracelular del receptor murino HveM de este virus y de la porción cristalizable Fe de la inmunoglobulina IgG-1 humana. El dominio extracelular murino HveM ha sido clonado por RT PCR a partir de una preparación de ARN extraída de células de bazo estimuladas por concavalina A, obtenidas en ratones de cepa BALB/c. Los cebadores utilizados para la reacción RT PCR fueron 5'-TAACTCGAGCTCTTGGCCTGAAGTTTC-3' y 5' - TTAAGGATCCGAGGAGCAGGTGGTGTCT-3 ' . El ADNc ha sido insertado en los sitios de restricción Xhol y BamHl de un plásmido que lleva la secuencia del fragmento cristalizable de la inmunoglobulina Gl humana (de conformidad con lo descrito en la publicación Nakaga a IU., Murakami, M., Ijima, K., Chikuma, S., Saito, I., Kanegae, Y., Ishikura, H., Yoshiki, T., Okamoto, H., Kitabatake, A., and Uede, T. (1998) . Persistent and secondary adenovirus-mediated hepatic gene expression using adenovirus vector containing CTLA41gG. Human Gene Therapy 9, 1739-1745) . El fragmento Xhol/Xbal que contiene el AND que codifica la proteína quimérica HveMIg ha sido aislado de esta construcción e insertado a su vez, después de la colocación consecutiva de los extremos, en el sitio de restricción SwaI del vector cosmidico pAxCAwt (distribuido comercialmente por la sociedad TARARA, Kyoto, Japón) bajo el control del promotor CAG (promotor de la ß actina) conocido por permitir una expresión constitutiva elevada en cualquier tipo de célula (Niwa, H., Yamamura, K., and Miyazaki, J. (1991) . Efficient selection for high-expression trans fectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108, 193-200) . Se creó después por microinyección del fragmento Pmel/Sall de este vector, que contiene el factor de estimulación del gen viral CMV IE, el promotor de gen Beta actina de la gallina, la secuencia de la proteina HVEMIg y la señal de poliadenilación 3' de locus Beta globina de conejo, en los pronúcleos de embriones fecundados de ratones (genotipo Fl C57 BL/6 X SJL) tres lineas, A, B, C de ratones transgénicos , cada una proveniente de un fundador independiente que expresa esta proteina quimérica HVEM Ig. La presencia de la proteina HVEMIg ha sido detectada como una banda especifica revelada por un anticuerpo anti-HVEMIg (producido por hiperinmunisación en conejo) por inmunoelectroforesis en el suero de tres lineas de ratones transgénicos, con un titulo en promedio más bajo en el caso de los ratones de la linea B. La construcción efectuada está representada esquemáticamente en la Figura 1. La concentración en proteina quimérica HVEMIg del suero de ratones de las tres lineas transgénicas A B C es representada en las tablas 1, 2, 3 y 4 que se anexan. Los ratones transgénicos de 3 líneas se desarrollaron normalmente y no se observó ninguna diferencia entre los pesos de sus ratones y los de sus homólogos no transgénicos de la misma carnada. Para determinar si los ratones transgénicos que expresan la proteína quimérica HVEMIg presentaban una protección efectiva contra el virus HSV-1, se inoculó por vía intravenosa y una dosis de lC ufe que corresponde a 10 veces la dosis letal (10 DL 50) de virus, a ratones transgénicos y ratones no transgénicos de control de la misma carnada. La DL 50 ha sido determinada inicialmente en la línea de ratones menos susceptible de las dos que sirvieron a la producción de animales transgénicos híbridos. De conformidad con las Figuras 2, 3, y 4 se ha determinado el número de ratones transgénicos Tg respectivamente de las líneas A, B, y C y los ratones no transgénicos no Ta que siguieron vivos hasta 14 días después de la infección. Se pudo observar así que todas las líneas de ratones transgénicos eran resistentes al virus de HSV-1. Con mayor precisión, todos los ratones transgénicos de las líneas A y C sobrevivieron a la inoculación por el virus y permanecieron en buena salud durante varios meses después del ensayo (tablas 1 y 4) .

Solamente un ratón transgénico de la linea B falleció después de la inoculación por el virus mientras que los demás seis sobrevivieron (Tabla 3) , pero la linea B es la linea para la cual las tasas séricas medidas en HBEMIg eran las más débiles. En contraparte, seis de los siete ratones no transgénicos de las mismas carnadas que los ratones transgénicos de la linea A, 13 de los 14 ratones no transgénicos de las mismas carnadas que los ratones transgénicos de la linea B y seis de los siete ratones no transgénicos de las mismas carnadas que los ratones transgénicos de linea C desarrollaron síntomas tales como una parálisis o fallecieron dentro de los 14 días posteriores a la inoculación por el virus HSV-1. Se buscó la expresión de LAT del virus HSV-1 en los ganglios trigeminales de ratones sobrevivientes después de la inoculación por el método descrito en las publicaciones. .- Spivak, J. G., and Fraser, N. W. (1987) . Detection of herpes virus type 1 transcripts during latent infections in raice. J. Virol., 61, 3841-3847. - Stevens, J. G., and Cook, M. L. (1971) . Latent herpes simplex virus in spinal ganglia of mice. Science 173, 843-845. Se utilizó por consiguiente el método de RT-PCR para detectar la expresión de LAT. Se observó esta expresión en ratones no transgénicos que desarrollaron síntomas y en un solo ratón transgénico de la linea B que no presentó síntomas, pero no se ha observado en contraparte en los demás ratones transgénicos probados ni en ratones no transgénicos sobrevivientes que no desarrollaron síntomas . Dentro del marco de este estudio, se efectuó también un ensayo de control con el objeto de determinar si los ratones transgénicos que expresan una proteína quimérica HVEMIg estaban protegidos contra el virus PRV mientras que la proteína HVEM no es un receptor funcional para el virus PRV. Para este propósito, se inoculó por vía intravenosa y por una dosis correspondiente 10 veces a la dosis letal (10 LD 50) de virus PRV, ratones transgénicos de la línea A y ratones no transgénicos de la misma carnada (Tabla 2 y Figura 5) . Se pudo observar de esta manera que a excepción de un ratón transgénico que sobrevivió durante 10 días, todos los ratones murieron en los 5 días después de la inoculación por el virus PRV. Por consiguiente los ratones transgénicos que expresan la proteína quimérica HVEMIg no fueron protegidos contra el virus PRV. Dentro del marco de este estudio, se buscó también determinar si la resistencia de ratones transgénicos a la inoculación por virus HSV-1 que pudo constatarse in vivo sea acompañada en paralelo de una resistencia de la células de estos ratones una vez aisladas. Para este propósito, se inoculó cultivos de fibroblastos embrionarios de ratones transgénicos o de ratones no transgénicos por el virus HSV-1. Se contó entonces el número de placas de lisis causadas por el virus en el cultivo celular 5 días después de la inoculación, y se llegó a la conclusión que el número de estas placas era bastante más importante en el caso de los fibroblastos de ratones no transgénicos que en el caso de los fibroblastos de ratones transgénicos (un promedio 22 placas por disco de cultivo en el caso de ratones no transgénicos y una 1 placa por disco de cultivo en el caso de ratones transgénicos) . Se efectuó en forma paralela una prueba similar para el virus PRV inoculando cultivos de fibroblastos embrionarios provenientes de ratones transgénicos o de ratones no transgénicos por virus PRV, sin observar diferencias importantes entre el número de placas de lisis que se observó en los ratones transgénicos y en los ratones no transgénicos. Estos resultados comprueban que la proteina quimérica HVEMIg expresada por los fibroblastos de ratones transgénicos interviene en la inhibición de la adsorción del virus HSV-1 por estos fibroblastos embrionarios. En una prueba complementaria cuyos resultados se ilustran en la Tabla 5, se buscó si la proteína quimérica HVEMIg presente en el suero de ratones transgénicos podía inhibir la infección de cultivos celulares por los virus HSV-1 o PRV. Para este propósito, se recogió suero de ratones transgénicos de la línea C y se incubó con un inoculo de este suero el virus HSV-1 o el virus PRV antes de ponerlo en contacto con cultivos de células Vero. Se pudo establecer así que el suero de ratones transgénicos de la línea C puede proteger las células Vero contra contaminación por el virus HSV-1 pero no contra una contaminación por el virus PRV. Al contrario, una prueba de control efectuada con suero de ratones no transgénicos no permitió observar actividad antiviral . Además, se observó que el suero de ratones transgénicos de la línea C ya no presenta actividad antiviral después de su puesta en contacto con un suero policlonal anti-HVEMIg producido por hiperinmunisación en conejo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Este último resultado no confirma que las capacidades seroneutralizantes del suero de ratones transgénicos deben atribuirse a la expresión de la proteína quimérica. El conjunto de esos resultados demuestra que la actividad antiviral observada proviene de la proteína quimérica HVEMIg presente en el suero de ratones transgénicos, pero se relacionan también sin duda con la expresión de esta proteína quimérica en la superficie de células del huésped como por ejemplo los fibroblastos embrionarios evaluados en estas pruebas . Esos resultados confirman la eficacia antiviral de la expresión in vivo de una forma modificada del receptor de membrana de alfa herpes virus, esto a pesar de propiedades inmunosupresoras descritas en el caso de la proteina HveM. 2) Resultados experimentales obtenidos dentro del marco del análisis in vivo ce la resistencia al virus PRV de ratones transgénicos que expresan una proteina quimérica Hvec-Ig. Según estas pruebas, se introdujo mediante transgénesis germinal en ADN de estos ratones un transgen que codifica una proteina quimérica constituida por el dominio extracelular del receptor porcino HveC del virus PRV y de la porción cristalizada Fe de la inmunoglobulina de IgG-1 humana. El dominio extracelular porcino HveC ha sido clonado por RT PCR a partir de una preparación de ARN extraída de células de cerdo . Los cebadores utilizados para la reacción RT PCR eran 5'-TAACTCGAGCTCTTGGCCTGAAGTTTC-3 ' y 5'- TTAAGGATCCGAGGAGCAGGTGGTGTCT-3' , como se describe y siguiendo las condiciones propuestas en la publicación (Milne, R. S. B., Connolly, S. A., Krummenacher, C., Eisenberg, R. J., and Cohén, G. H. (2001) . Porcine HveC, a member of the highly conserved HveC/nectina 1 Family, is a functional alphaherpesvirus receptor. Virology 281, 315-32.) . El ADNc fue insertado en los sitios de restricción Xhol y BamHl de un plásmido que lleva la secuencia de fragmento cristalizable de la inmunoglobulina Gl humana (de conformidad con lo descrito en la publicación Nakagawa I., urakami, M., Ijima, K., Chikuma, S., Saito, I., Kanegae, Y., Ishikura, H., Yoshiki, T., Okamoto, H., Kitabatake, A., and Uede, T. (1998) . Persistent and secondary adenovirus-mediated hepatic gene expression using adenovirus vector containing CTLA41G. Human Gene Therapy 9, 1739-1745) . El fragmento Xbal/Xbal de ese plásmido que contiene el AND que codifica la fusión HveC-Ig fue aislado, colocado en extremos y ligado a adaptadores Salí con el propósito de insertarlo a su vez, después de digestión por Xhol y Salí, en el sitio de la restricción Xhol del vector pCXN2 bajo el control del promotor CAG (promotor de la ß actina) conocido por permitir una expresión constitutiva elevada en cualquier tipo célula (Niwa, H., Yamamura, K., and Miyazaki, J. (1991) . Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108, 193-200) . El plásmido recombinante obtenido de esta forma ha sido designago Pcxn2 /pHvecIg . Se creó por microinyección del fragmento Salí /Salí de este plásmido, que contiene el factor de estimulación de la transcripción del gen viral CMV IE, el promotor del gen Beta actina de la gallina, la secuencia de la proteina HVEMIg y la señal de políadení lación 3' de locus Beta globína de conejo, en los pronúcleos de embriones fecundados de ratones (cepa C57/BL6) seis lineas #6, #22, #32, #33, #37, #45 de ratones transgénicos cada una proveniente de un fundador independiente que expresa esta proteina quimérica Hvec-Ig. LA construcción efectuada es representada esquemáticamente en la Figura 6. Los ratones transgénicos de las seis lineas se desarrollaron normalmente y no se observó diferencias entre los pesos de estos ratones transgénicos y el peso de ratones no transgénicos provenientes de las mismas carnadas. Pruebas virales por inyecciones intraperitoneales Para determinar si los ratones transgénicos que expresan la proteina quimérica HveC-Ig presentarán protección efectiva contra el virus PRV, se inoculó en una primera serie de pruebas por vía intraperitoneal una dosis de 500 u.f.p. que corresponde a 20 veces a dosis letal (20 DL 50) de virus, ratones transgénicos y ratones no transgénicos de control de la misma carnada. De conformidad con la Tabla 6 se contó los ratones transgénicos Tg respectivamente de las líneas #6, #22, #32, #33, #37, #45 y los ratones no transgénicos no Tq que permanecieron vivos hasta 14 días después de la infección. Se pudo observar así que las 6 líneas de ratones transgénicos eran resistentes al virus PRV en esta prueba severa, con 100% de supervivencia en el caso de los animales transgénicos , a excepción de un solo animal para la linea #33. En contra parte solamente aproximadamente el 9% de los ratones no transgénicos sobrevivieron, con una variación según las pruebas efectuadas para cada linea. Estas pruebas fueron confirmadas para las lineas #22 y #32 en un laboratorio independiente utilizando una cepa diferente de virus PRV. Pruebas virales por infección intranasal Se inoculó en una segunda serie de pruebas por vía intranasal una dosis de 250 u.f.p. que corresponde a 10 veces la dosis letal (20 DL 50) de virus, ratones transgénicos y ratones no transgénicos de control de la misma carnada. Según la tabla 7, se contaron los ratones transgénicos Tg respectivamente de las lineas #6, #22, #32, #33, #37 y los ratones no transgénicos no Tg que permanecieron vivos hasta 14 días después de la infección. Se pudo observar asi que las 5 lineas de ratones transgénicos eran relativamente resistentes al virus PRV en esta prueba severa, con aproximadamente el 70% de supervivencia de los animales transgénicos. En contra parte, solamente aproximadamente el 10% de los ratones no transgénicos sobrevivieron, con variación según las pruebas efectuadas para cada linea. Esos resultados demuestran una acción protectora eficaz del transgen que permite la expresión de la proteína quimérica HveC-Ig en el contexto de una prueba severa en el ratón por vía intranasal. Globalmente, el conjunto de estos resultados muestra la eficacia in vivo de la protección proporcionada a un mamífero por el procedimiento de conformidad con la presente invención, con base en la inhibición de la entrada de un alfa herpes virus en la célula blanco. Esta eficacia solamente es posible puesto que el procedimiento propuesto permite probablemente varios niveles de acción cuyos mecanismos no están del todo elucidados: Más allá de las capacidades del ligando de las proteínas virales gD conocidas para los receptores HveM, HveC, la utilización de un dominio extracelular solo permite aislar sus capacidades de receptor de las funciones biológicas complejas de estas proteínas de transmembrana en su entrada y especialmente de su aptitud para inicial cascadas de señalización intracelulares . Esto permite contemplar a priori la sobreexpresión de este dominio proteico sin amplificar sin embargo la función fisiológica y permite sin duda la ausencia de efectos secundarios observados en el caso de animales transgénicos que expresan la proteína quimérica. Esto permite probablemente en el contexto de una infección in vivo : una competencia para la fijación de partículas virales que infectan proteínas quiméricas en solución o presentes en la superficie de las células con los receptores membranarios funcionales del virus; la neutralización de partículas virales por opsonisación e incremento de la fagocitosis o por los macrófagos y células dendríticas ; la activación de la inmunidad celular por estimulación de los linfocitos NK. La eficacia del procedimiento en el caso de infecciones experimentales por vía nasal así que (para HveMIg) la resistencia de los fibroblastos embrionarios provenientes de animales transgénicos se explican por una inhibición eficaz de la penetración del virus en las células blancos sensibles por la fracción membranaria de la proteína quimérica expresada, más allá de la capacidad seroneutralizante de la fracción soluble secretada en el suero. Esta inhibición de la entrada del virus en la célula podría deberse a receptores membranarios de virus modificados, según un modo dominante, autorizando la fijación del virus en la superficie de células blanco pero no su entrada en el citoplasma bajo una forma infecciosa. La eficacia del procedimiento sobre la entrada del virus y los primeros resultados que se requieren a la latencia viral después de la infección (en el caso de HveM y HSVI ) permiten además contemplar la ausencia de latencia en los animales criados protegidos de esta forma lo que no es necesariamente el caso de las estrategias de vacunación, y por consiguiente se obtiene un control más eficaz de los fenómenos de resurgencia de la infección. 3) Resultados experimentales obtenidos dentro del marco del análisis in vitro de la resistencia a los virus BHV-1 y PRV de lineas celulares transformadas por plásmidos que expresan proteínas quiméricas construidas a partir del dominio extracelular de la proteína HveC porcina y del fragmento cristalizable de la inmunuglobulina Ig humana. Según esta prueba se prepararon líneas de células Vero transformadas por plásmidos que expresan una forma soluble de la proteína HveC porcina que inhibe la entrada de los virus BHV-1 y PRV y después se analizó la resistencia de estas líneas celulares a la infección por estos virus con el objeto de determinar las propiedades antivirales de la forma soluble de la proteína HveC porcina in vitro. Para construir un plásmido que exprese una forma soluble de la proteína HveC porcina (PHveCIg) se utilizó un vector de expresión PCXN2 que permite la transcripción de un ARN mensajero que codifica el dominio extracelular de la proteína HveC porcina unida al fragmento cristalizado Fe de la inmunoglobulina IgGl humana. El dominio extracelular porcino HveC ha sido clonado por RTPCR a partir de una preparación de ARN extraída de células de cerdo.

Los cebadores utilizados para la reacción RT PCR eran 5'-TAACTCGAGCTCTTGGCCTGAAGTTTC-3' y 5' - TTAAGGATCCGAGGAGCAGGTGGTGTCT- 3' como se describe siguiendo las condiciones propuestas en la publicación (Milne, R. S. B., Connolly, S. A., Krummenacher, C, Eisenberg, R. J., and Cohén, G. H. (2001) . Porcine HveC, a member of the highly conserved HveC/nectin 1 family is a functional alphaherpesvirus receptor. Virology 281, 315-32.) . El ADNc fue insertado en los sitios de restricción Xhol y BamHl de un plásmido que lleva la secuencia de fragmento cristalizable de la inmunoglobulina Gl humana (de conformidad con lo descrito en la publicación Nakagawa I., Murakami, M., Ijima, K., Chikuma, S., Saito, I., Kanegae, Y., Ishikura, H., Yoshiki, T., Okamoto, H., Kitabatake, A., and Uede, T. (1998) . Persistent and secondary adenovirus-mediated hepatic gene expression using adenovirus vector containing CTLA41G. Human Gene Therapy 9, 1739-1745) . El fragmento Xbal/Xbal de ese plásmido que contiene el AND que codifica la fusión HveC-Ig fue aislado, colocado en extremos y ligado a adaptadores Salí con el objeto de su inserción a su vez en el sitio de la restricción Xhol del vector pCXN2 bajo el control del promotor CAG (promotor de la ß actina) conocido por permitir una expresión constitutiva elevada en cualquier tipo célula (Ni a, H . , Yamamura, K., and Miyazaki, J. (1991) . Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108, 193-200) . El plásmido recombinante obtenido de esta forma fue designago a Pcxn2/pHvecIg . Se preparó por transfección con el plásmido obtenido de esta manera líneas celulares transformadas de manera estable. Las líneas celulares transformadas de esta forma fueron cultivadas en condiciones que permiten la acumulación de la proteína quimérica en el medio, específicamente 24 horas de cultivos adicionales después de expansión a subconfluencia . Estos cultivos fueron después inoculados por los virus PRV o BHV-1 con una multiplicidad de 50 u.f.p. por caja de 35 mm de diámetro con un tiempo de incubación de 1 hora seguido por dos enjuagues con DMEM con cobertura con medio DMEM 0.5% de agar . Se contó entonces las placas de lisis provocadas por el virus en el cultivo celular cuatro días después de la inoculación. Se observó que en las líneas celulares que expresan la proteína quimérica PHveCIg, el número de placas de lisis fue notablemente reducido por comparación con las líneas celulares resistentes de control y las líneas Vero 4 días después de la inoculación. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 8. Las líneas celulares transformadas por el plásmido PCXN2/pHveC Ig son claramente resistentes a la afectación por el virus PRV y BHV-1. 4) Los resultados experimentales obtenidos dentro del marco del análisis ín vítro de la resistencia a los virus BHV-1 y PRV de línea celular es transformado por los plásmidos que expresan las proteínas quiméricas construidas a partir del dominio extracelular de la proteína HveC porcina y del fragmento cristalizable de la inmunoglobulína gl del cerdo. Según esta prueba se prepararon líneas de células Vero transformadas por plásmidos que expresan la forma soluble de la proteína HveC porcina que inhibe la entrada de los virus BHV-1 y PRV y después se analizó la resistencia de estas líneas celulares a la infección por estos virus para determinar las propiedades antivirales de la forma soluble de la proteína HveC porcina ín vítro. Para Construir un plásmido que expresa una forma soluble de la proteína HveC porcina (PHveCIg) se utilizó un vector de expresión pCXN2 que permite la transcripción de un ARN mensajero que codifica el volumen extracelular de la proteína HveC porcina y el fragmento cristalizado Fe de la inmunoglobulína IgG-1 porcina. El dominio extracelular porcina HveC ha sido clonado por RT PCR a partir de una preparación de ARN extraído de células de cerdo . Los cebadores utilizados para la reacción RT PCR fueron 5'-TAACTCGAGCTCTTGGCCTGAAGTTTC-3' y 5'- TTAAGGATCCGAGGAGCAGGTGGTGTCT-3 ' , de conformidad con lo descrito y siguiendo las condiciones propuestas en la publicación (Milne, R. S. B., Connolly, S. A., Krummenacher , C, Eisenberg, R. J., and Cohén, G. H. (2001) . Porcine HveC, a member of the highly conserved HveC/nectin 1 family, is a functional alphaherpesvirus receptor. Virology 281, 315-32.) . El ADNc obtenido de esta forma fue ligado en 5' de un fragmento de ADNc que codifica el fragmento cristalizado Fe de la inmunoglobulina Ig porcina respetando el cuadro de lectura original de los dos polipéptidos . El fragmento de ADNc de inmunoglobulina porcina fue clonado a partir de una preparación de ARN extraído de tejidos linfoidos del cerdo de una línea de tipo Large White (FH025) por RT PCR utilizando como cebadores 5'-TAACTCGAGCTCTTGGCCTGAAGTTTC- 3 ' Y 5'-TTAAGGATCCGAGGAGCAGGTGGTGTCT-3' siguiendo las condiciones propuestas en la publicación Simón Musyoka Mwangi, Thomas J. Stabel*, MArcus E. Kehrli Jr, development of a baculovirus expression system for soluble porcine tumor necrosis factor receptor type I and soluble porcine tumor necrosis factor receptor type I-IgG fusión protein, Veterinary Immunology and Immunopathology 86 (2002) 251-254. El ADNc que resulta de la fusión codifica una proteína quimérica cuya secuencia de aminoácido se adjunta en anexo ( secuencia 4 ) . El ADNc resultante de la fusión fue insertado en el sitio de restricción Xhol del plásmido pCXN2 bajo el control del promotor de gen beta antina de la gallina asociado con el factor de estimulación de la transcripción del gen viral CMV IE y la secuencia de poliadenilación de la beta globina de cone o . El plásmido resultante obtenido de esta forma fue designado PCXN2/pWC-pFc. Una versión restringida de este plásmido designada PCXN2/pV-pFc fue construida utilizando solamente el dominio V de la proteina HveC y el fragmento cristalizable Fe de la inmunoglobulina IgG de cerdo. La secuencia de aminoácido de la proteina quimérica obtenida de esta forma se adjunta en anexo (secuencia 3) . Se preparó por transacción con el plásmido obtenido de esta forma líneas celulares transformadas en forma estable. 1 Las líneas celulares transformadas de esta manera fueron cultivadas en condiciones que permiten la acumulación de la proteína quimérica en el medio, es decir 24 horas de cultivos adicionales después de la expansión a subconfluencia . Esos cultivos fueron después inoculados por los virus PRV o BHV-1 con una multiplicidad de 50 u.f.p. por caja de 35 mm de diámetro con un tiempo de incubación de una hora seguido por dos enjuagues con DMEM con cobertura con el medio DMEM 0.5% de agar. Se contó entonces las placas de lisis provocadas por el virus en el cultivo celular 3 días después de la inoculación y se efectuaron las observaciones agrupadas en la Tabla 9. Las lineas celulares transformadas por las dos versiones del transgen que expresa una proteina quimérica de conformidad con la presente invención son claramente resistentes a la afección por los virus BHV-1 y PRV. TABLA 1 Resistencia de ratones transgénicos de la linea A a una inoculación por el virus HSV-1 Número del HVEMIg Día de Ensayo Animal Sexo (ug/ml ) Síntomas la Muerte I Al * M 14.8 - A2 * M 10.0 - A3 * M 11.6 - A4 F 7.6 - A5 * F 8.3 - A6 * F 10.0 - A7 F 24.6 - A8 F 8.5 - A9 * F 7.9 - A10 * F 7.3 - Ll M 1.5 - L2 M 1.1 - L3 M 1.6 + L4 M 14 L5 M L6 F 0.6 II All M 10.1 A12 M 15.9 A13 M 10.5 Al 4 M 9.3 Al 5 F 7.3 Al 6 F 14.0 A17 F 15.4 Al 8 F 14.9 L7 M 0.4 L8 M 0.5 L9 F 0.5 TABLA 2 Sensibilidad de ratones transgénicos de la línea A a una inoculación por el virus PRV Número del HVEMIg Día de Animal Sexo (ug/ml ) Síntomas la Muerte 41 + 4 19 + 10 29 5 24 5 20 5 C57BL/6 M NT 4 C57BL/6 M NT 4 C57BL/6 M NT + 5 C57BL/6 M NT + 5 C57BL/6 M NT 5 TABLA 3 Resistencia de ratones transgénicos de la linea B a una inoculación por el virus HSV-1 Número del HVEMIg Día de Ensayo Animal Sexo (ug/ml) Síntomas la RT-PCR Muerte Bl M 8.5 - B2 M 7.8 - B3 M 7.7 - B4 F 8.1 + 11 Ll M 0.4 + 6 L2 M 0.7 + 6 L3 M 0.5 + 5 L4 M 0.7 + 7 L5 F 0.3 + 5 II B5 M 5.0 - + B6 M 6.2 - B7 F 4.4 - L6 M 0.6 L7 M 0.6 + 10 L8 M 0.5 + 7 L9 M 0.6 + + LIO F 0.4 + 7 Lll F 0.5 + 5 L12 F 0.5 + 5 L13 F 0.5 + 5 L14 F 0.4 + 6 TABLA 4 Resistencia de ratones transgénicos de la linea C a una inoculación por el virus HSV-1 Número del HVEMIg Dia de Ensayo Animal Sexo (ug/ml) Síntomas la RT-PCR Muerte Cl * M 20.4 C2 * M 14.2 - C3 * F 19.3 C4 * F 18.5 C5 * F 24.3 C6 * F 21.8 C7 * F 24.0 - C8 * F 20.6 Ll M 1.3 L2 M 0.9 + + L3 M 1.6 + 6 L4 F 1.3 + 5 L5 F 1.4 5 L6 F 1.5 6 L7 F 1.6 5 En las tablas 1-4, los animales designados por un * son animales transgénicos , mientras que los animales designados por L son animales no transgénicos de control de las mismas carnadas . TABLA 5 Neutralización del virus HVS-1 por la proteina quimérica HVEMIg en el suero de ratones transgénicos de la linea C. Inoculación del virus HSV1 en células VERO, después de inoculación con concentraciones variables de este suero Número de placas de lisis observadas Suero (HVEMIg ug/ml) HSV-1 PRV (20.4) 0 108.0 + 8.8 (20.4) 0 (0.20) 1.7 + 1.6 (0.02) 34.7 ± 16.2 (0.20) + anti HVEMIg 30.3 ± 6.9 Control 44.0 ± 0 107.3 ± 2.9 TABLA 6 Pruebas por vía intraperitoneal (20 LD 50) . Linea Número de Número de Número de animales Tg controles de las animales Tg probados (de mismas sobrevivientes carnadas) probados a los 14 días PHveCIg#6 5 10 5 PHveCIg#22 12 12 12 PHveCIg#32 10 7 10 PHveCIg#33 7 9 6 PHveCIg#37 10 4 10 PHveCIg#45 3 12 (Continuación TABLA 6) Linea Número de % de % de controles supervivencia supervivencia sobrevivientes de animales de controles a los 14 días transgénicos PHveCIg#6 2 100 20 PHveCIg#22 0 100 0 PHveCIg#32 1 100 14.2 PHveCIg#33 0 85.7 0 PHveCIg#37 1 100 25 PHveCIg#45 1 100 8.3 TABLA 7 Pruebas por vía intranasal (10 LD 50) . Linea Número de Número de Número de animales Tg controles de las animales Tg probados (de mismas sobrevivientes carnadas) probados a los 14 días PHveCIg#6 8 7 4 PHveCIg#22 23 21 18 PHveCIg#32 10 6 PHveCIg#33 17 11 PHveCIg#37 10 7 9 (Continuación TABLA 7) Linea Número de % de % de controles supervivencia supervivencia sobrevivientes de animales de controles a los 14 días transgénicos PHveCIg#6 0 50 0 PHveCIg#22 2 78.3 9.5 PHveCIg#32 1 60 12.5 PHveCIg#33 1 64.7 12.5 PHveCIg#37 1 90 14.2 TABLA 8 Resistencia de lineas celulares transformadas a alfa herpes virus PRV y BHV-1 Linea PHveCIg Número de placas de lisis observadas celular PRV BHV-1 A6 + 0 0 Cl + 0 0 C2 55.8 + 4.6 75.5 + 3.5 Vero 50.8 + 6.2 65.0 + 5.6 * En esta tabla, las lineas A6 y Cl son de lineas celulares transformadas por el plásmido PCXN2/pHveCIg y expresan la proteína quimérica PHveCIg mientras que la línea C2 corresponde a un control negativo de esta transformación que no expresa el transgen y la línea Vero en células iniciales sensibles a los virus y utilizadas para la producción de líneas transformadas por los diferentes transgenes. TABLA 9 Resistencia de líneas celulares transformadas a alfa herpes virus PRV y BHV-1 Línea celular* Número de placas de lisis observadas PRV BHV-1 3-16 0 1 VI 10 0 6 Vero 56 67 * En esta tabla, la línea 3-16 es una línea celular transformada por el plásmido p CXN2 / pVCC - pFc y la línea V110 es una linca celular transformada por el plásmido p CXN2 / pV - pFc mientras que la línea Vero corresponde a células iniciales sensibles a los virus y utilizadas para la producción de células transformadas por los diferentes transgenes.

LISTA DE SECUENCIAS <110> FPANCE HYBRIDES <120> Procedimiento para la producción de un mamífero resistente a una infección por un alfa herpes virus así como un mamífero obtenido por la aplicación de este procedimiento y descendiente de dicho mamífero <130> hvec <150> Fr02 12775 <151> 2002-10-15 <160> 4 <170> Patentln versión 3.1 <210> 1 <211> 440 <212> PRT <212> secuencia artificial <220> <223> Proteína artificial que fusiona el dominio extracelular de la proteína H ler. LO cristalizable de la mmunoglobulina Gl humana <400> 1 Met Glu Pro Leu Pro Gly Trp Gly Ser Ala Pro Trp Ser Gln Ala Pro 1 5 10 15 Thr Asp Asr, Thr Phe Arg Leu Val Pro Cys val Phe Leu Leu Asn Leu 20 25 30 Leu Gln Arg lie Ser Ala Gln Pro Ser Cys Arg Gln Glu Glu Phe Leu 35 40 45 val Gly Asp Glu rys Cvs Pro Met Cys Asn Pro Gly Tyr His al 50 55 60 Gln al Cys Ser Glu Hi s Thr Gly Thr val Cys Ala Pro cys pro ro 65 70 75 80 ¦ 1 Gln Thr Tyr Thr Ala His Ala Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Pro Cys 85 90 95 Gly val cys Asp pro Asp Met Gly Leu Leu Thr Trp Gln Glu Cys ser 100 105 110 Trp Lys Asp Thr Val cys Arg Cys lie Pro Gly Tyr Phe Cys Glu 115 120 ?25 Asn Gln Asp Gly ser His cys Ser Thr Cys Leu Gln His Thr Thr Cys 130 135 140 Pro Pro Gly Gln Arg val Glu Lys Arg Gly Thr His Asp Gln Asp Thr 145 150 155 160 Val cys Ala Asp cys Leu Thr Gly Thr Phe Ser Leu Gly Gly Thr Gln 165 170 175 Glu Glu cys Leu pro Trp Thr Asn Cys Ser Ala Phe Gln Gln Glu Val 180 185 190 Arg Arg Gly Thr Asn Ser Thr Asp Thr Thr Cys Ser Ser Asp Pro Glu 195 200 ,.. 205 Glu Pro Lys Ser cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro cys Pro Ala 210 215 220 Pro Glu Leu Leu Gly Gly pro Ser Val Phe Leu Phe Pro ro Lys Pro 225 230 235 240 Lys Asp Thr Leu Met lie ser Arg Thr Pro Glu Val Thr cys val Val 245 250 255 val Asp al Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 260 265 270 Asp Gly Val Glu val His Asn Ala Lys Thr Lys pro Arg Glu Glu Gln 275 280 285 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg val Val Ser val Leu Thr Val Leu H s Gln 290 295 300 Asp Trp Leu Asn Gly Lvs Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 305 310 315 320 Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 325 330 335 Arg Glu Pro Gln al Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 340 345 350 2 Lys Asn Gln val ser Leu Thr cys Leu val Lys Gly Phe Tyr Pro ser 355 360 365 Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 370 375 380 Lys Thr Thr Pro Pro val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 385 390 . 395 400 ser Lys Leu Thr val Asp Lys ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 405 410 415 ser Cys Ser val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 420 425 430 Ser Leu ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 2 <211> 581 <212> PRT <213> secuencia artificial <220> <223> Proteina arti ricial que fusiona el dominio extraceiular (dominios V-C-C) de la proteina Hvec del cerdo y el fragmento cristalizabie de la r nmunoglobul ina Gl humana < 400 > 2 Met Ala Arg Mat Gly Leu Ala Gly Ala Ala Gly Arg Trp Trp Gly Leu 1 5 10 15 Ala Leu Gly Leu Thr Ala Phe Phe Leu ro Gly Ala H s Thr Gln val 20 25 30 val Gln val Asn Asp ser Met Tyr Gly Phe lie Gly Thr Asp Val val 35 40 45 Leu His Cys Ser Phe Ala Asn Pro Leu Pro Gly Val Lys lie Thr Gln 50 55 60 Val Thr Trp Gln Lys Ala Thr Asn Gly Ser Lys Gln Asn Val Ala lie 65 70 75 80 Tyr Asn Pro Ala Met Gly Val Ser Val Leu Ala Pro Tyr Arg Glu Arg y 85 90 . 95 val Glu Phe Leu Arg Pro Ser Phe Thr Asp Gly Thr lie Arg Leu Ser 100 105 110 Arg Leu Glu Leu Glu Asp Glu Gly Val Tyr lie Cys Glu Phe Ala Thr 115 120 125 Phe Pro Ala Gly Asn Arg Glu Ser Gln Leu Asn Leu Thr Val Met Ala 130 135 140 Lys Pro Thr Asn Trp lié Glu Gly Thr G n Ala Val Leu Arg Ala Lys 145 150 155 160 Lys Gly Lys Asp Asp Lys Val Leu val Ala Thr cys Thr Ser Ala Asn 165 170 175 Gly Lys Pro Pro Ser Val Val Ser Trp Glu Thr His Leu Lys Gly Glu 180 185 190 Ala Glu Tyr Gln Glu lie Arg Asn Pro Asn Gly Thr Val Thr Val lie 195 200 205 ser Arg Tyr Arg Leu Val Pro Ser Arg Glu Asp His Arg Gln ser Leu 210 215 220 Ala Cys lie Val Asn Tyr His Met Asp Arg he Arg Glu Ser Leu Thr 225 230 235 240 Leu Asn val Gln Tyr Glu Pro Glu val Thr lie Glu Gly Phe Asp Gly 245 250 255 Asn Trp Tyr Leu Gln Arg Met Asp val Lys Leu Thr Cys Lys Ala Asp 260 265 270 Ala Asn Pro Pro Ala Thr Glu Tyr His Trp Thr Thr Leu Asn Gly Ser 275 280 285 Leu Pro Lys Gly Val Glu Ala Gln Asn Arg Thr Leu Phe Phe Arg Gly 290 295 300 Pro He Asn Tyr ser Met Ala Gly Thr Tyr lie Cys Glu Ala Thr Asn 305 310 315 320 Pro lie Gly Thr Arg Ser Gly Gln Val Glu Val Asn lie Thr Glu Phe 325 330 335 Pro Tyr Thr Pro Ser pro Pro Glu His Ala Asp Pro Glu Glu Pro Lys 340 345 350 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 355 360 365 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe ro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 370 375 380 Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu val Thr cys Val Val Val Asp Val 385 390 395 400 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 405 410 415 Glu val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 420 425 430 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr val Leu H s Gln Asp Trp Leu 435 440 445 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 450 455 460 Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 465 470 475 480 Gln val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn üln 485 490 495 Val Ser Leu Thr cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala 500 505 510 val Glu Trp Glu ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 515 520 525 Pro Pro Val' Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 530 535 540 Thr val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Glv Asn Val Phe Ser Cys Ser 545 550 555 560 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 565 570 575 Leu Ser Pro Gly Lys 580 <210> 3 <211> 376 <212> PRT <213> secuencia artificial <220> <223> Proteína artificial que fusiona el dominio V de la proteína Hvec del cerdo y el fragmento cristalizable de la inmunoglobulina Gl del cerdo <400> 3 Met Ala Arg Met Gly Leu Ala Gly Ala Ala Gly Arg Trp Trp Gly Leu 1 5 10 . 15 Ala Leu Gly Leu Thr Ala Phe Phe Leu Pro Gly Ala His Thr Gln al 20 25 30 Val Gln Val Asn Asp Ser Met Tyr Gly Phe lie Gly Thr Asp Val Val 35 40 45 Leu His Cys Ser Phe Ala Asn Pro Leu Pro Gly Val Lys lie Thr Gln 50 55 60 al Thr Trp Gln Lys Ala Thr Asn Gly Ser Lys Gln Asn val Ala lie 65 70 75 80 Tyr Asn Pro Ala Met Gly Val Ser Val Leu Ala Pro Tyr Arg Glu Arg 85 90 95 Val Glu Phe Leu Arg Pro Ser Phe Thr Asp Gly Thr lie Arg Leu Ser 100 105 110 Arg Leu Glu Leu Glu Asp Glu Gly Val Tyr l e Cys Glu Phe Ala Thr 115 120 125 Phe Pro Ala Gly Asn Arg Glu ser Gln Leu Asn Leu Thr val Met Gly 130 135 140 Ser Val Gly lie His Gln Pro Gln Thr Cys Pro lie Cys Pro Gly Cys 145 150 155 160 Glu val Ala Gly Pro ser val Phe lie Phe Pro pro Lys Pro Lys Asp 165 170 175 Thr Leu Met lie Ser Gln Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 180 185 190 val Ser Lys Glu H s Ala Glu Val Gln Phe ser Trp Tyr val Asp Gly 195 200 205 val Glu val His Thr Ala Glu Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn 210 215. 220 Ser Thr Tyr Arg val Val Ser val Leu Pro lie Gln His Gln Asp Trp 225 230 235 240 Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Val Asp Leu Pro 245 250 255 6 Ala Pro lie Thr Arg Thr lie Ser Lys Ala lie Gly Gln Ser Arg Glu 260 265 270 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu Glu Leu Ser Arg ser 275 280 285 Lys Val Thr Leu Thr Cys Leu Val lie Gly Phe Tyr Pro Pro Asp lie 290 295 300 His val Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Asn Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp val Asp Gly Thr Phe Phe Leu Tyr 325 330 335 Ser Lys Leu Ala val Asp Lys Ala Arg Trp Asp His Gly Asp Lys Phe 340 . 345 350 Glu cys Ala Val Met H s Glu Ala Leu H s Asn His Tyr Thr Gln Lys 355 360 365 Ser lie Ser Lys Thr Gln Gly Lys 370 375 <210> 4 <211> 5~8 <212> PRT <213> secuencia artificial <220> <223> Proteina artificial que fusiona el dominio extracelular (dominios V-C-C de la proteina Hvec del cerdo y el fragmento c istalizable de la inmunoglobulina Gl del cerdo . <400> 4 Met Ala Arg Met Gly Leu Ala Gly Ala Ala Gly Arg Trp Trp Gly Leu 1 5 10 15 Ala Leu Gly Leu Thr Ala Phe Phe Leu Pro Gly Ala His Thr Gln Val 20 . 25 30 Val Gln Val Asn Asp Ser viet Tyr Gly Phe lie Gly Thr Asp Val Val 35 40 45 Leu His Cys Ser he Ala Asn pro Leu Pro Gly Val Lys lie Thr Gln 50 55 60 val Thr Trp Gln Lys Ala Thr Asn Gly ser Lys Gln Asn val Ala lie 65 70 75 80 Tyr Asn Pro Ala Met Gly val Ser Val Leu Ala Pro Tyr Arg Glu Arg 85 90 95 Val Glu Phe Leu Arg Pro Ser Phe Thr Asp Gly Thr lie Arg Leu Ser 100 105 110 Arg Leu Glu Leu Glu Asp Glu Gly val Tyr lie Cys Glu Phe Ala Thr 115 120 125 Phe Pro Ala Gly Asn Arg Glu ser Gln Leu Asn Leu Thr Val Met Ala 130 135 140 Lys- Pro Thr Asn Trp l e Glu Gly Thr Gln Ala Val Leu Arg Ala Lys 145 150 155 160 Lys Gly Lys Asp Asp Lys Val Leu Val Ala Thr Cys Thr Ser Ala Asn 165 170 175 Gly Lys Pro Pro Ser Val Val Ser Trp Glu Thr His Leu Lys Gly Glu 180 1S5 190 Ala Glu Tyr Gln Glu lie Arg Asn Pro Asn Gly Thr Val Thr Val lie 195 200 205 Ser Arg Tyr Arg Leu val Pro Ser Arg Glu Asp His Arg Gln Ser Leu 210 215 220 Ala cys lie val Asn Tyr His Met Asp Arg Phe Arg Glu ser Leu Thr 225 230 235 240 Leu Asn Val Gln Tyr Glu Pro Glu Val Thr lie Glu Gly Phe Asp Gly 245 250 255 Asn Trp Tyr Leu Gln Arg Met Asp val Lys Leu Thr Cys Lys Ala Asp 260 265 270 Ala Asn Pro Pro Ala Thr Glu Tyr His Trp Thr Thr Leu Asn Gly Ser 275 280 285 Leu Pro Lys Gly val Glu Ala Gln Asn Arg Thr Leu Phe Phe Arg Gly 290 295 300 Pro lie Asn Tyr Ser Met Ala Gly Thr Tyr lie Cys Glu Ala Thr Asn 305 310 315 320 Pro lie Gly Thr Arg ser Gly Gln val Glu val Asn lie Thr Glu Phe 325 330 335 Pro Tyr Thr Pro Ser Pro Pro Glu His Gly Ser Val Gly lie His Gln 340 345 350 Pro Gln Thr Cys Pro lie Cys Pro Gly Cys Glu Val Ala Gly Pro Ser 355 360 365 Val Phe lie Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Gln 370 375 380 Thr Pro Glu Val Thr cys val Val val Asp Val Ser Lys Glu His Ala 385 390 395 400 Glu val Gln Phe ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Thr Ala 405 410 415 Glu Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg val Val 420 425 430 Ser Val Leu Pro lie Gln H s Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe 435 440 445 Lys Cys Lys Val Asn Asn Val Asp Leu Pro Ala Pro lie Thr Arg Thr 450 455 460 lie Ser Lys Ala lie Gly Gln Ser Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 465 470 475 480 Pro pro Pro Ala Glu Glu Leu Ser Arg ser Lys Val Thr Leu Thr Cys 485 490 495 Leu Val lie Gly Phe Tyr Pro Pro Asp lie His Val Glu Trp Lys Ser 500 505 510 Asn Gly Gln Pro Glu pro Glu Asn Thr Tyr Arg Thr Thr pro Pro Gln 515 520 525 Gln Asp Val Asp Gly Thr Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ala Val Asp 530 535 540 Lys Ala Arg Trp Asp His Gly Asp Lys Phe Glu Cys Ala Val Met His 545 550 555 560 Glu Ala Leu H s Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser lie ser Lys Thr Gln 565 570 575 Gly Lys

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Un procedimiento para producir un mamífero que pertenece una especie no humana que se vuelve resistente por transgénesis germinal a una infección por un alfa herpes virus, para el cual el polipéptido HveC o nectina-1 constituye un receptor funcional, que se caracteriza porque se introduce por inserción o recombinación homologa en el genoma de células que constituyen la línea germinal de mamífero, un transgen que permite la expresión de una proteína quimérica constituida per un lado por el dominio extracelular de la nectina-1 o HveC o de una de sus partes y por otro lado del fragmento cristalizable de una inmunoglobulina, en un sistema de expresión apropiado . Procedimiento de conformidad con la rei indicación 1, que se caracteriza porque la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de tipo gamma. Procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, que se caracteriza porque la nectina-1 o HveC y/o la inmunoglobulina pertenece (n) a la especia homologa. Un mamífero que pertenece a una especie no humana, que se caracteriza porque se ha vuelto resistente por transgénesis germinal a una infección por un alfa herpes virus para el cual el polipéptido HveC o nectina-1 constituye un receptor funcional para el efecto de la expresión de una proteina quimérica constituida por un lado por el dominio extracelular de la nectina-1 o HveC, de preferencia de la especie homologa, y por otro lado del fragmento cristalizable de una inmunoglobulina, especialmente, una inmunoglobulina de tipo gamma, de preferencia de la especie homologa. Un mamífero de conformidad con la reivindicación 4, que se caracteriza porque el receptor específico del alfa herpes virus es una subparte del dominio extracelular de la nectina-1 o HveC. Un mamífero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 y 5, que se caracteriza porque pertenece a la especie porcina y el alfa herpes virus es el virus PRV. Un mamífero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 y 5, que se caracteriza porque pertenece a la especie bobina y el alfa herpes virus es el virus BHV-1. Un mamífero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, que se caracteriza porque contiene en el genoma de sus células un transgen que codifica una proteína quimérica constituida por un lado por el dominio extracelular de la nectina-1 o HveC o de una de sus partes, y por otro lado por el fragmento cristalizable de una inmunoglobulina, en un sistema de expresión apropiado, este transgen ha sido insertado en el genoma de la linea germinal de uno de sus padres. Un material genético como, por ejemplo, semilla u ovocito o embrión esencialmente derivado del mamífero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a