AGENTES QUE REGULAN, INHIBEN O MODULAN LA ACTIVIDAD Y/O EXPRESIÓN DE FACTOR DE CRECIMIENTO DE TEJIDO DE CONEXIÓN (CTGF) COMO UN MEDIO ÚNICO PARA AMBOS . REDUCIR | LA PRESIÓN INTRAOCULAR Y TRATAR RETINOPATÍAS GLAUCOMATOSAS/NEUROPATÍAS ÓPTICAS
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN I 1. Campo de la Invención La presente invención se relaciona con el campo de condiciones oculares que involucran neurodegeneración y/o presión intraocular elevada. Más específicamente, la invención proporciona composiciones que reducen la presión intraocular y proporcionan neuroprotección ocular. 2. Descripción del Ramo Relacionado Existe un número de condiciones oculares que son ocasionadas por, o agravadas por, daño a la cabeza del nervio óptico, degeneración de tejidos oculares, y/o presión intraocular elevada. Por ejemplo, los "glaucomas" son un grupo de enfermedades debilitantes del ojo que son una causa que conduce a ceguera irreversible en los Estados Unidos y I otras naciones desarrolladas. El Glaucoma de Ángulo Abierto Primario ("POAG") es la forma más común de glaucoma. La enfermedad se caracteriza por la degeneración de la retí trabecular, conduciendo a obstrucción de la capacidad normal de humor acuoso de dejar el ojo sin cierre del espacio (v.gr., el "ángulo") entre el iris y la córnea (Vaughan, D. , y col., (1992)). Una característica de dicha obstrucción en I esta enfermedad es una presión intraocular aumentada ("IOP"), que resulta en pérdida visual progresiva y ceguera si no se trata apropiadamente y en forma a tiempo. La enfermedad se calcula que afecta entre 0.4% y 3.3% de todos los adultos de más de 4C años de edad (Leske, M.C., y col. (1986); Béngtsson, B. (1989); Strong, N. P. (1992)). Además, la prevalencia de la enfermedad se eleva con la edad sobre 6% de aquellos de 75 años de edad o mayores (Strong, N.P., (1992)) . El glaucoma afecta tres tejidos separados en el ojo. ' La 10P elevada asociada con POAG se debe a cambios morfológicos y bioquímicos en la red trabecular (TM) , un tejido ubicado en el ángulo entre la córnea e iris. La mayoría del humor acuoso nutritivo sale el segmento anterior del ojo a través de la TM. La pérdida progresiva de cédulas de TM y la acumulación de desperdicio extracelular en la TM de ojos glaucomatosos conduce a. resistencia aumentada al flujo saliente acuoso,' elevando de esta manera l'a IOP. La I0P elevada, así como otros factores tales como isquemia, ocasionan cambios degenerativos en la cabeza de nervio óptico
(ONH) que conduce a "acopamiento" progresivo en {la ONH y pérdida de células de ganglio retinal y axones. Los mecanismos moleculares detallados responsables , de daño glaucomatoso a la TM, ONH, y las células de ganglio retinal son desconocidos.
Hace veinte años, la combinación de hipertensión I ocular,, isquemia y distorsión mecánica de la cabeza de nervio óptico se debatieron pesadamente como los factores principales que ocasionan la progresión de pérdida de campo visual en glaucoma. Desde entonces, otros ' factores, incluyendo excitotoxicidad, óxido nítrico, ausencia de factores neurotróficos vitales, combinación glial/neuronal anormal ¦ y genómicas se han implicado en el proceso de enfermedad degenerativa. La consideración de genómicas merece alguna discusión en tanto que puede definir finalmente el mecanismo de muerte de célula, y proveer la discriminación de diversas formas de glaucoma. Dentro de los pasados 8 años, más de 15 genes diferentes de glaucoma se han trazado y 7 genes de glaucoma se han identificado. Esto' incluye seis genes trazados (GLCIA-GLCIF) y dos genes identificados (MYOC y OPTN) para glaucoma de ángulo abierto primaria, dos genes trazados (GLC3A-GLC3B) y un gene identificado para glaucoma congénita (CYP1B1), dos genes trazados para 1 dispersión pigmentaria/glaucoma pigmentaria, y un número de genes para formas de desarrollo o síndrome de glaucoma (F0XC1, PITX2, LMX1B, PAX6) . De esta manera, cada forma de glaucoma puede tener una patología única y consecuentemente un acercamiento terapéutico diferente a la administración de la enfermedad se puede requerir. Por ejemplo, una droga que efectúa la expresión de enzimas que degradan la matriz extrlacelular de la cabeza de nervio óptico probablemente no impediría muerte de RGC ocasionada por excitotoxicidad o déficit de factor neutrotrófico . En glaucoma, la muerte de RGC ocurre por un proceso llamado apoptosis (muerte de célula programada). Se ha especulado que diferentes tipos de insultos que pueden ocasionar la muerte pueden hacerlo convergiendo en unas pocas trayectorias comunes. La dirección corriente abajo en una trayectoria común es una estrategia que puede ensanchar la utilidad de una droga y aumentar la probabilidad de que puede tener utilidad en el manejo de diferentes formas de la enfermedad. Sin embargo, las drogas pueden' efectuar múltiples trayectorias metabólicas y más probablemente para producir efectos laterales indeseables. Con el advenimiento de equipos de diagnóstico basados en gene para identificar formas específicas de glaucoma, los agentes neuroprotectores selectivos se pueden probar con la meta de reducir el grado I de variación acerca de la respuesta medida. La terapia de glaucoma actual está dirigida a reducir la IOP, un factor de riesgo mayor para el desarrollo y progresión de glaucoma. Estas terapias reducen la IOP, pero no se dirigen de manera directa a los mecanismos patógenos, y la enfermedad continúa progresando. De esta manera, lo que se necesita es un método terapéutico para reducir la IOP y/o proporcionar neuroprotección a la cabeza de nervio óptico y/o las células de ganglio retinal a través de trayectorias patógenas. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN 1 i La presente invención supera estas - y otras desventajas del ramo anterior' proporcionando un método para reducir la presión intraocular y proporcionar neuroprotección a un paciente en necesidad de lo mismo, administrando una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que I incluye cuando menos un agente de no-nucleótido o no-proteina que inhibe la expresión y/o señalización de factor de crecimiento de tejido conector (CTGF) , y ,un portador farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, la 'invención proporciona un método para, reducir la presión intraocular administrando a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente que inhibe la expresión y/o señalización de CTGF. De preferencia, las composiciones para uso en el método de la invención reducirán 'la presión intraocular que es elevada debido a una expresión aumentada de CTGF o de un producto de señalización de CTGF. En modalidades preferidas, la composición de la invención se puede administrar mediante aplicación tópica, intracameralmente o a través de un implante. De manera típica, la concentración total del inhibidor de CTGF en la composición de la invención será de 0.01% a 2%. Generalmente, el método de tratamiento de la invención será más útil para un paciente que sufre de glaucoma, por ejemplo glaucoma de tensión normal, o hipertensión ocular. La invención proporciona además un método para impedirla pérdida de campo visual asociada con POAG administrando a un paciente en necesidad de' la misma, una composición que incluye un agente de no-nucleót ido o no-proteina que modula la expresión y/o señalización de CTGF de modo que la presión intraocular se controla y se proporciona protección a las células de ganglio retinal o a la cabeza de nervio óptico. . En otra modalidad, la presente ' invención proporciona una composición para reducir la presión intraocular y proporcionar neuroprotección en un paciente en necesidad de la misma. Generalmente, la composición de la invención incluye cuando menos un agente que inhibe la expresión y/o señalización de factor de crecimiento de tejido conector (CTGF) y un portador farmacéuticamente aceptable. La concentración total de CTGF en la composición de la invención será de preferencia de 0.01% a 2% . i BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención se puede entender mejor haciendo referencia a uno o mas de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de modalidades especificas presentadas en la presente. I Figura 1·. · La expresión de gene de CTGF es elevada en tejidos qlaucomatosos contra TM normales. Para verificar los resultados de la microdisposición y substracción de cADN, la expresión mRNA de CTGF se determinó mediante análisis de QPCR de cADN de tejido normal contra tejido de TM de glaucoma. Los números debajo de cada muestra se Irefieren al número de identificación de cADN asignado a cada muestra. Tejido donador humano y RNA total se obtuvieron como se describe ( ang y col. 2001). "Ave." Representa el medio de niveles normales y TM de glaucoma. Figura 2. Expresión de gene de CTGF es elevada, en lineas de célula qlaucomatosas contra TM normal. Para verificar los resultados de la microdisposición y substracción de cADN, la expresión mRNA de CTGF se determinó mediante análisis de QPCR de cADN de linea de célula TM normal contra glaucoma. Los números debajo de cada muestra se 'refieren al número de identificación de line'a de célula. Las lineas de célula de TM humano y RNA total se obtuvieron como se describe (Shepard y col. 2001). "pozo NTM" y "pozo GTM" se refieren a niveles de amplificación de cADN de NTM o GTM agrupados. Figura 3. Efecto de inhibición de G5K-3 en 1 expresión de gene de CTGF en células de TM qlaucomatosas . Para determinar los efectos de inhibición de GSK-3 en expresión de gene de CTGF, se midieron los ' efectos del I inhibidor de GSK-3 conocido SB-216763 (Coghlan, y col. 2000) en ambas expresión de mRNA de CTGF basal y estimulada con
TGF 2 en una linea de célula TM glaucomatosa (SGTM2697) utilizando análisis de QPCR. Figura . Efecto de inhibición de CD 2 en expresión de gene de CTGF en células de TM qlaucomatosas . Para determinar los efectos de inhibición de CDK en expresión de gene CTGF, se midieron los efectos del inhibidor de CDK2 i conocido G -8510 (Davis, y col. 2001) en ambas expresión de mRNA de CTGF basal y estimulado- con TGFP2 en una linea de célula TM glaucomatosa (SGTM2697) usando análisis QPCR. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE MODALIDADES PREFERIDAS El glaucoma es un grupo heterogéneo de ^neuropatías ópticas que comparten ciertas particularidades clínicas. La pérdida de visión en glaucoma se debe a la muerte selectiva de células de ganglio retinal en la retina néural que se diagnostica clínicamente por cambios característicos en el campo visual, defectos de capa de fibra de nervio, y un acombado progresivo del ONH. Uno de los factores de riesgo principales para el desarrollo de glaucoma es la presencia de hipertensión ocular (presión infraocular elevada, IOP) . IOP I también parece estar involucrada en la patogénesis de glaucoma de tensión normal en donde los pacientes tienen lo que frecuentemente se considera que es IOP normal,. .La IOP elevada asociada con glaucoma se debe a resistencia al flujo saliente de humor acuoso elevada en la malla trabecular (TM) , un pequeño tejido especializado colocado en el ángulo de iris-córnea de la cámara anterior ocular. Los cambios glaucomatosos a la TM incluyen la pérdida en células de TM y la deposición y acumulación de desperdicio extraceiular incluyendo material semejante a placa. Además, también hay cambios que ocurren en la cabeza de nervio óptico glaucomatoso. En ojos glaucomatosos, hay' cambios morfológicos y de movilidad en células gliales de ONH. En respuesta a IOP elevada y/o insultos isquémicos transientes, hay un cambio en la composición de la matriz extraceiular de
ONH y alteraciones en la célula glial y morfologías de axón I de célula de ganglio retinal. Los cambios glaucomatosos a la TM difieren de fibrosis, que está asociada con una respuesta de curación de herida y generalmente involucra inflamación1 y la proliferación subsecuente de miofibroblastos . Le daño de tejido se reconoce por el sistema inflamatorio, que', inicia un proceso de reparación de herida estimulando fibroblastos y angiogenesis . Los tejidos/células muertos o teñidos se reemplazan por tejido de herida que consiste inic'ialmente de fibrina, que subsecuentemente se reemplaza por cantidades excesivas de material de matriz extraceiular, particularmente colágeno. ' , CTGF es una citoquina secretada que sel sabe que aumenta la producción de matriz extracelular (ECM) , principalmente a través de deposición aumentadas dé colágeno I y de fibronectina. La sobreexpresión de CTGF se ha implicado como un factor causante principal en condiciones tales como escleroderma, enfermedades fibroproiiferativas, cicatrización, etc., en donde hay una sobreacumulación de componentes de ECM. Una sobreacumulación de materiales de matriz extracelular en la región de la malla trabecular '(TM) también es una marca de muchas formas de glaucoma; estos aumentos se cree que conducen a resistencia aumentada al flujo saliente acuoso, y por lo tanto presiones intraoculares elevadas. La presente invención han descubierto la presencia de productos de gene de CTGF en tejidos aislados y líneas de célula establecidos de la TM humana. De esta manera se cree que CTGF juega un papel en la producción de ECM por la TM. Los agentes que regulan descendentemente la expresión de gene CTGF, producción de proteína, o efectos corriente abajo de activación de CTGF, representan un medio novedoso para reducir la IOP. La expresión de CTGF se puede inducir por una amplia variedad de factores incluyendo: TGF-ß, VEGF, trombina, productos finales de glicación avanzada (AGE), esfuerzo mecánico, y ácido lisofosfatídico (LPA) , entre otros. Los inductores específicos de CTGF y las trayectorias de señalización pueden variar dependiendo del tipo de célula especifica que se está estimulando. Hay reportes de inducción de TGF-ß de CTGF que involucra Smads, PLC, PKC, y quinasas de
tirosina en algunos tipos de célula mientras que RhoA, PKA, y el citoesqueleto parecen estar involucrados en otrps tipos de célula. El esfuerzo mecánico de fibroblastos induce expresión de CTGF a través de involucramiento de quinasas de proteína y fosfatasas de tirosina. 1 El mecanismo de acción de CTGF no se entiende bien. CTGF parece ligarse a receptores de PDGF, integrinas, y proteínas relacionadas con receptor de LDL (LRP), cada uno- de los cuales puede actuar como un receptor de superficie de célula de señalización para CTGF. En algunos tipos de I célula, la señalización de CTGF a través de receptores de PDGF parece involucrar MAPK y P13K. La señalización de CTGF en condrocitos involucra señalización de , ERK para proliferación de célula y señalización de p38MAPK para diferenciación celular. Los receptores superficiales de célula específicos y trayectorias de señalización utilizados por CTGF parecen ser dependientes del tipo de célula específico que se está estudiando. La Patente de E.U.A. No. 5,585,270 describe polinucleótidos que codifican CTGF. CTGF se dice que tiene actividad mitógena, o la capacidad de estimular a las células I de meta para proliferarse . También se dice que tienen actividad quimiotáctica, es decir, el movimiento químicamente inducido de las células como resultado de interacción con moléculas particulares. Se cree que la proteína juega un papel en el desarrollo, crecimiento y reparación normal de tejido humano. La patente también describe un método para acelerar la curación de heridas en un sujeto aplicando a la herida una cantidad efectiva de una composición ' que contiene i CTGF purificado. El polipéptido se dice que es útil en casos en donde hay curación no dañada de heridas de la piel o existe la necesidad de aumentar los mecanismos de curación normales, v.gr., quemaduras. La patente no contiene, discusión de glaucoma o desórdenes del ojo. ! La Patente de E.U.A. No. 6,069,006, cuya especificación es una continuación en parte de la Patente de E.U.A. No. 5,585,270, arriba discutida, describe secuencias de ácido nucléico regulador de CTGF. Esta patente describe además métodos para tratar enfermedades fibróticas y para I identificar agentes para tratamiento de enfermedades fibróticas. No se describen agentes específicos, distintos a secuencias de ácido nucléico de CTGF o polipéptidos . No se I describe la neuroproteccion de tejidos oculares. La Patente de E.U.A. No. 6,358,741 describe un número de secuencias de ácido nucléico derivadas de CTGF que se dice que son útiles para inhibir la expresión de CTGF en una célula. Esta patente no discute glaucoma, neuroprotección de tejidos oculares ni ácido no nucleico o secuencias de no polipéptido para inhibir expresión de CTGF. El CTGF parece aumentar en concentraciones elevadas en el citoplasma de astrocitos reactivos de estelato del sistema nervioso central. Se ha implicado como un agente causante en mecanismos asociados con astrocitosis reactiva tal como gliosis (crecimiento excesivo de glial) y| formación de herida de glial, es decir, en procesos conocidos que impiden la reparación y crecimiento neural (Schwab y col. 2000; Schwab y col. 2001). Se cree que dichos procesos también participan en la pérdida de" neuronas retínales y/o la incapacidad de reparar axones de nervio óptico asbciados con glaucoma. Los presentes inventores han descubierto que la regulación descendente de -CTGF proporciona un medio de protección de ambos, la retina y el nervio óptico cabeza de nervio. De esta manera, en un aspecto, la f presente invención proporciona un método para reducir IOP y proporcionar neuroprotección a células de ganglio retinal administrando una composición que incluye un inhibidor de CTGF de no nucleótido o no peptidilo. Se contempla además que la composición podría incluir un compuesto que inhibe un agente que regula hacia arriba el CTGF. Por ej'emplo, se ha mostrado que el peróxido de hidrógeno (H;02) es un inductor de expresión de gene de CTGF. TGF-ß, dexametosan y serotonina i
también se ha encontrado que inducen expresión de CTGF (Park y col . 2001 ) . El agente terapéutico para el trabamiento de glaucoma de preferencia será una molécula pequeña semejante a droga, que afecta uno o más aspectos de la trayectoria de CTGF. Los agentes terapéuticos preferidos son aquel-Ios que son: (1) inhibidores de CTGF; (2) inhibidores de agentes que actúan corriente abajo de acción de CTGF (es decir, inhibidores de señalización de CTGF), y/o (3). inhibidores de agentes que regulan ascendentemente gene de CTGF o expresión de' proteina . 1 Los. inventores han probado diversas clases diferentes de compuesto en un ensayo QPCR de CTGF para inhibición de expresión de gene CTGF inducida por 1GF 2 y basal en células de TM g laucomatosas . o normales humanas cultivadas. Los inhibidores de molécula pequeña son dirigidos a la inhibición de GSK-3, CDK, NAALADase, Proteina Quinasa C, MEK, p38MAPK, ROCK, VEGF, transferasa de geranilgeranilo y AGE. Los agonistas de moléculal pequeña de PPAR, 5-HT, y P2X7 también se probaron para actividad. Los compuestos' que se dirigen a quinasa 1 o 2 regulada por señal 1 extracelular (ERK1 o ERK2) también pueden jugar un papel en expresión de gene CTGF basal o inducido por TGFP2. Existe reactividad cruzada significativa de muchos . de los inhibidores de GSK-3 y CDK y es posible que compuestos que inhiben otras metales tales como ERK's, Quinasa C de proteina, o familias de STAT pueden probar ser valiosos en la inhibición de CTGF basal o estimulado por TGF 2 en células de TM. Dos clases de compuestos generales se han encontrado que inhiben ambas expresión de CTGF basal e inducida por TGF 2 en células de TM humanas: inhibidores de GSK-3 y CDK. Quinasa de sintasa de glicogen (GSK-3) es una quinasa de proteina de serina/treonina que está presente como dos formas _ celulares, GSK-3a _ y GS -3 derivadas de dos genes. GSK-3a y 63?-3ß son 95% idénticos y su inhibición diferencial por antagonistas de molécula pequeña no se pueden distinguir fácilmente. GSK-3 es la enzima de limitación de régimen en síntesis de glicogen pero tiene muchas metas celulares de fosforilación incluyendo sintasa de glicógeno, ß-catenina, e IF2B, y tau (revisado en (Cohén and Frame 2001) y (Woodgett 2001)) . El interés directo de GSK-3 en expresión y señalización de CTGF no tiene ejemplo en la literatura. Las quinasas dependientes de ciclina (CDKs) tienen múltiples funciones celulares incluyendo la regulación de ciclo de división de célula, apoptosis, transcripción, función neuronal, y diferenciación. Varios inhibidores competidores de ATP conocidos de CDK se han identificado (Knockaert, Greengard y col. 2002) . La inhibición de CDK se está siguiendo para ' uso en el tratamiento de cáncer, enfermedad de Alzheimer, ALS, ataque, ' enfermedad cardiovascular y otras. CTGF se ha mostrado que es un
mediador de corriente abajo de TGF en proliferación de I fibroblasto por regulación ascendente de ciclina A-cdk2 (Kothapalli y Grotendorst 2000) . Dentro de la clase GSK-3 de compuestos, un compuesto, SB-216763 (Coghlan, Culbert y col. 2000), se encontró que inhibe ambos niveles de CTGF basal e inducido por TG ß2 en células de TM humanas normales y giaucomatosas (Fig.3), SB-216763 es un derivado de maleimida con un IC50 de
34 nM contra GSK-3a y GSK-3P en presencia de 0.0}. mM de ATP y
un Kj de 9 nM (Coghlan, Culbert y col. 2000) !. Otros compuestos en la clase GSK-3 de inhibidores probados y encontrados que inhiben expresión de gene CTGF basal y, en algunos casos inducido por TGF 2 en células de tM incluyeron
paullones tales como alsterpaullona, 9-cianopaullona y I quenpaullona (Zaharevitz, Gussio y col. 1999; Leost, Schultz y col. 2000; Bain, McLauchlan y col. 2003). Dentro de la clase CDK de compuestos, , un inhibidor de CDK2 relativamente selectivo, GW-8510 (Davis, ! Benson y col. 2001), se encontró que inhibe ambos niveles de CTGF
basal e inducido por TGF32 en células de TM humanas normales
y glaucomatosas (Figura 4). GW-8510 también inhibe CDK1 y CDK4 pero con valores IC50 inferiores (110 y 130 nM) (Davis,
Benson y col. 2001). Otros inhibidores de clase CDK probados I y mostrados que tienen actividad inhibitoria incluyeron purvalanol A y roscovitina (Hardcastle, Golding y col. 2002). Otras clases de compuestos probados en . el ensayo QPCR de CTGF y encontrados que inhiben expresión de gene de CTGF basal y, en algunos casos, inducido por TGF 2 incluidos agonistas de PPAR tales como troglitazona, ciglitazona (Willson, Brown y col. 2000) y 15(S)HETE. Los agentes de esta invención, se pueden incorporar en diversos tipos de formulaciones oftálmicas para entrega al ojo (v.gr. , tópicamente, intracameralmente, o a través de un implante) . Los agentes de preferencia se incorporan en formulaciones oftálmicas tópicas para entrega al ójo. Los agentes se pueden combinar con conservadores oftalmológicamente aceptables, agentes tensioact ivos , mejoradores de viscosidad, mejoradores de penetración, tampones, cloruro de sodio y agua para formar una suspensión I o solución oftálmica estéril, acuosa. Las formulaciones de solución oftálmica se pueden preparar disolviendo un agente en un tampón acuoso isotónico, fisiológicamente aceptable. Además, la solución oftálmica puede incluir Un agente tensioactivo oftalmológicamente aceptable para ayudar a disolver el agente. Adicionalmente, la solución 'oftálmica puede contener un agente para aumentar la viscosidad, tal como, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropi lmet i 1 celulosa , metilcelulosa, polivinilpirrolidona, o lo semejante, para mejorar la retención de la formulación en el saco conjuntival. Los agentes de gelificación también se pueden , utilizar, incluyendo, pero no limitado, a gelán y goma de xantano. A fin de preparar formulaciones de ungüento oftálmico estéril, el 'ingrediente activo se combina con un conservador en un vehículo apropiado, tal como aceite mineral, lanolina líquida., o vaselina blanca. Las formulaciones de gel oftálmico estériles" se pueden preparar suspendiendo el - agente en una base hidrofílica preparada de la combinación de, por ejemplo, carbopol-974 , o lo semejante, de conformidad con las I formulaciones publicadas para preparaciones oftálmicas análogas; conservadores y agentes de tonicidad se pueden incorpora . Los agentes de preferencia se formulan como suspensiones o soluciones oftálmicas tópicas, con un pH de aproximadamente 4 a 8. El establecimiento de un régimen de dosificación específico para individuo se deja a la discreción de los médicos. Los agentes normalmente estarán I contenidos en estas formulaciones en una cantidad de 0.01% a 5% en peso, pero de preferencia en una cantidad de 0.05% a 2% y más preferentemente en una cantidad de 0.1 a 1.0% en peso. La forma de dosificación puede ser una solución, microemulsión de suspensión. De esta mañera, para presentación tópica 1 a 2 gotas de estas formulaciones se entregaría a la superficie del ojo 1 a 4 veces al día de conformidad con la discreción de un médico experimentado. Los agentes también se pueden , utilizar en combinación con otros agentes para tratar glaucoma, tales como, pero no limitados a ß-bloqueadúres , análogos de prostaglandina , inhibidores de anhidrasa carbónica, agonistas a2, mióticos, y neuroprotectores. I El agente se puede entregar directamente al ojo (por ejemplo, gotas oculares tópicas o ungüentos; dispositivos de liberación lenta en lo bajo de saco o implantados adyacentes a la esclera o dentro del ojo; inyecciones perioculares, conjuntivales , subtenones, intracamerales o intraví treas ) o parenteralmente (por ejemplo: oralmente; inyecciones intravenosas, subcutáneas o intramusculares; entrega dérmica; etc.), utilizando técnicas bien conocidas por aquellos expertos en el ramo. Los siguientes son ejemplos de posibles formulaciones modalizadas por esta invención. 1 (a) Formulación ocular tópica % en peso Inhibidor de CTGF 0.005 - 5.0
Ti81oxapol 0.01-0.05 HPMC 0.5 Cloruro de benalconio 0. 1 Cloruro de sodio Ó.8 Edetato disódico 0.01 NaOH/HCl S.q. PH 7.4
Agua purificada s.q. 100 mL
Se contempla además que los compuestos de la invención se podrían formular en dispositivos de ? inserción intraocular . Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar modalidades preferidas de la invención.; Se debe apreciar por aquellos de experiencia en el ramo que las técnicas descritas en los ejemplos que' siguen representan" técnicas descubiertas por el inventor para funcionar bien en la practica de la invención, y de esta manera se puede considerar que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, aquellos de experiencia en el ramo, en la luz de la presente exposición, deben apreciar que se pueden hacer muchos cambios en las modalidades específicas que se describen y todavía I obtener un resultado semejante o similar sin abandonar el espíritu y alcance de la invención Ejemplo 1 i Expresión de CTGF en TM Glaucomatosa contra TM No
Glaucomatosa Tamiz de Microensayo La transcripción de mRNA para CTGF se identificó como siendo elevada en células de TM glaucomatosas contra I células de TM normales mediante un tamiz GeneFi lterÍR). (Research Genetics). Quinientos ng de RNA total (TRIzol, Reagent; Invitrogen) se aislaron de lineas de células de TM normales o glaucoma tosas en pozos (6 cada una) como se describe (Shepard y col., IOVS 2001, 42:3173) y transcritas inversamente de manera separada en · presencia de 300 unidades de Superscript II RNase H - transcriptasa invertida (Invitrogen), 100 uCi
[ -i;,P]dCTP (10 mCi/ml, 3, 000 Ci/mmol; amersham) , 0.33mM dATP, dGTP, dCTP (Promega), 3.3mM DTT , IX First Strand Buffer (Invitrogen), y 2 ug oligo-dT a 37°C durante 90.min. El cADÑ radioet iquetado se purificó subsecuentemente con Chroma-Spin 100 Columns (Clontech) de conformidad con las instrucciones del fabricante). Un solo Genefilter(R) (GF211;1 Research Genetics) marcado con =4,000 genes conocidos se útilizo para hibridi zación con sonda radioetiquetada de conformidad con I las instrucciones del fabricante. La membrana primero se trató previamente hirviendo en 0.5% de SDS durante 5 rain. La prehibiridización de la membrana .se realizó durante 30 min a
42°C en botellas de rodillo que contiene 5 mi de: MicroHyb (Research Genetics) con 5 ug poly-dA (Research Genetics) y 5 ug de ADN Cotí hervida (Invitrogen) como reactivos de bloqueo. La sonda radioetiquetada completa se hirvió y añadió a la mezcla de prehibridización durante 16 h a 42°C. Después de la hibridización, las membranas se lavaron I
dos veces en 2X SSC/1% SDS durante 20 min y luego una vez en 0.5X SSC/1% SDS durante 15 min. La membrana se colocó en papel húmedo Whatmann 3MM y se envolvió en SaranWrap. Se adquirieron imágenes en un Sotrm Phosphorimager (Molecular Dynamics) utilizando resolución máxima. Una ve'z que la imagen se adquirió la mancha se separó inmediatamente hirviendo 0.5% de SDS y se sometió a otra hibridi zación con la sonda opuesta, v.gr., TM normal seguido por TM glaucomatoso. Las imágenes de sondas duplicadas se analizaron utilizando Pathways (Research Genetics) y software MSExcel (Microsoft). " "De ios 4300 genes en iel -GF211 GeneFilter(R! , CTGF (GenBank acceso #AA598794) fue uno de 7 genes que mostraron una relación de GTM:NTM de >2 veces. Tamiz de Substracción de cADN Se identificó CTGF independientemente en un tamiz de Substracción de cADN PCR-Select"" (Clontech ) utilizado para tamizar transcripciones de mRNA que se expresaron diferencialmente en células de TM glaucomatosas contra normales. Setecientos ug de RNA total (TRIzol Reagent; Invitrogen) se aislaron de lineas de célula TM normales o glaucomatosas en pozos (7 cada uno) como se describe (Shepartd y col. 2001). El probador (glaucomatosa ) e impulsor (normal) poli A+ RNA se aisló por dos ( vueltas de selección de poly A+ en cuentas de látex de oligo-dT I
utilizando in juego ucleotrap mRNA Midi (Clontech) . Todos los pasos de Substracción de cADN PCR-Select'^ subsecuentes se realizaron de conformidad con la metodología de equipo Clontech (catálogo #K1804-1). I El tamizado diferencial de las librerías de substracción de cADN resultante se realizó esencialmente de conformidad con las instrucciones en el Equipo PCR-SelectMR de Tamizado Diferencial (catálogo Clontech # K1808-1). Un número seleccionado de . clones de cADN . diferencialmente expresados también se confirmaron mediante análisis Northern virtual. Una "lista 'd todos las clones 'candidato diferencialmente expresados identificados con sonda de I librería de cADN de célula TM restada se generó mediante Clontech. La transcripción para CTGF (acceso a GenBank
#XM_037055.1 ) estuvo en esta lista y se enriqueció en la i librería de cADN glaucomatoso. Ejemplo 2 Aislamiento de RNA y Preparación de cADN Primera Cepa RNA total se aisló de células TM utilizando reactivo TrizolÍR! de conformidad con las instrucciones del fabricante (Life Technologies). El cADN de . primera cepa se generó de saliente de RNA total utilizando hexámeros al azar y reactivos TaqMan[R1 Reverse Transcription de conformidad con las instrucciones del fabricante (PE Biosystems, Foster City, CA) . La reacción de 100 ul se diluyó subsecuentemente 20 I
veces para alcanzar una concentración de cADN efectiva de 0.5 ng/ul . PCR Cuantitativo ! La expresión diferencial de CTGF' se verificó mediante RT-PCR de tiempo real cuantitativo (QPCR) ^utilizando un Sistema de Detección de Secuencia ABI Prism<RI 7700 (Applied Biosystems), esencialmente como se describe (Shepard y col., IOVS 2001, 42:3173). Imprimadores para amplificación de CTGF se diseñaron usando software Primer Express (Applied Biosystems) y se recocieron a exones adyacentes de Genbank acceso" # 'NM_00190Í.Í ( CÁGCTC GACATTCTGATTCGA , ntS 1667-1689 y TGCCACAAGCTGTCCAGTCT , nts 1723-1742) y generar un amplicon 76-bp. La amplificación de CTGF se normalizó a expresión de RNA 18S ribosomal utilizando imprimadores diseñados al gene rRNA 18S (GenBank accesottX03205 GTCCCTGCCCTTTCTACACAC, nts 1680-1700 y CGATCCGAGGGCCTCACTA, nts 1730-1749) que genera un amplicon de 69-pb. La química de tinte de enlace de ADN de doble hebra SYBR(r) Green í (Applied Biosystems) se usó para amplificar CTGF o 18S cADN. La especificidad del' CTGF y pares de imprimador 18S se determinó del producto de PCR por una combinación de secuencia de ADN, análisis de gel de agarosa y análisis de curva de disociación usando el Prisma ABI 770 SDS software Dissociation Curve (Applied Biosystems). CTGF o reacciones de 18S rRNA consistieron de IX SYBFj Green PCR Paster Mix !
(Applied Biosystems), concentraciones de imprimador de 50 nM y 2.5 ng de cADN en un volumen final de 50 ' ul. Las I condiciones de ciclado térmico consistieron en 50°C, 2 min, 95°C 10 min seguido por 40 ciclos a 95°C, 15 seg, 60°C, 1 min. La cuantificación de concentraciones de RNA relativas se hizo utilizando el método de curva convencional relativo como se describe en PE Biosystems User Bulletin #2
( http : //docs . appliedbiosystems . com/pebiodocs / 04303859. pdf ) . El análisis de dato se realizó con software SDS versión 1.9.1
(Applied Biosystems) y MS Excel 97 (Microsoft ) v El ADN de plásmido que contiene " secuencia "dé" meta para" CTGF o 8S se usó para generar la curva convencional. Los datos QPCR se presentan como +SD medio. Todas las composiciones y/o métodos descritos y reivindicados en la presente se pueden hacer y ejecutar sin I experimentación indebida en la luz de la presente exposición. Mientras que las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en términos de modalidades preferidas, será evidente a aquellos de experiencia en el ramo que ! se pueden aplicar variaciones a las composiciones y/o métodos y en los pasos o en la secuencia de pasos del método descrito en la presente sin abandonar el concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, será evidente que ciertos agentes que están tanto química como estriicturalmente relacionados se pueden substituir por los agentes descritos en la presente para lograr resultados similares., Todas estas substituciones y modificaciones aparentes a aquellos expertos en el ramo se considera que están dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención como se define por las reivindicaciones anexas. Referencias " Las siguientes referencias, hasta el grado en que proporcionan detalles de procedimiento de ejemplo u otros suplementarios a aquellos expuestos en la presente, se incorporan específicamente en la presente por referencia. Patentes 'dé" Estados Unidos : . . .. 6,069,006 · ¡ 6, 358, 741 Libros Otras Publicaciones I Bain, J., H . McLauchla , y col., "The speci ficities of protein kinase inhibitors: an update" BIOCHE J 371 (Pt 1 ) : 199-204 (2003) . Coghlan, M.P. Y col., "Selective small molecule inhibitors ofglycogen synthasekinase-3 modulate glycogenmetabolism and gene transcription" CHEM. BIOL. 7(10) : 793-803 (2000) . Cohén, P. Y frame, S., "Therenaissance qf GSK3" NAT EV MOL CELL BIOL. 2(10) : 769-776 (2001) . Davis, S. T. Y col., "Prevention of Chemotherapy-Induced alopecia in rats by CD inhibitors'' SCIENCE 291 (5501 ) .-134-137 (2001 ) . Hardcastle, I.R. Ycol., "Designing inhibitors of cyclin-dependent kinases" ANNU REV PHARMACOL. TOXICOL. 42:325-348 (2002) . Knockaert , M. , y col., "Pharmacological1 inhibitors of cyclin-dependent kinases" TRENDS PHARMACOL SCI 23(9) :417-425 82002) . othopall i , D . Y Grotendorst, G.R., "CTGF| modulates cell cycle progression in cAMP-arrested NRK fibroblasts" J CELL PHYSIOL 182 (1) : 119-126 (2000; . - - -¦ . . . LeosL, M., y col., "Paullones are potent inhibitors ofglycogen synthasekinase-3betaandcyclin-dependent kinase 5/p25" EUR J BIOCHEM 267 ( 19 ) : 5983-5994 (2000). , Park, S.K., Kim, J.,Seomun, Y., Choi, J., Kim,
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