MXPA03010833A - Efector del metabolismo del glutation junto con acido a lipoico para su uso en el marco de la terapia de reemplazo de la funcon renal. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a un medicamento que contiene un efector del metabolismo del glutation junto con acido a-lipoico, sus sales y/o sus prodrogas como preparado combinado para el tratamiento simultaneo, separado, o escalonado en el tiempo de una perturbacion del estatus de tiol-disulfuro en el ambito de una terapia de apoyo de la funcion renal como tambien de cuadros de enfermedad en la cual se presenta una perturbacion del estatus tiol-disulfuro en celulas inmunologicas. La correccion de un metabolismo de tiol perturbado cobra una importancia fundamental como terapia basica en el tratamiento de una gran cantidad de enfermedades de diversa genesis, especialmente aquellas bajo las condiciones necesarias de una terapia de reemplazo de la funcion renal.

Description

EFECXOR DEL METABOLISMO DEL GLUTATION JUNTO CON ÁCIDO a LIPOICO PARA SU USO EN EL MARCO DE LA TERAPIA DE REEMPLAZO DE LA PUNCIÓN RENAL.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con la utilización de la combinación ácido a-lipóico y sustancias con efecto en el metabolismo de glutation para el tratamiento de deficiencias del estatus de tiol celular y las enfermedades producidas en consecuencia, en el marco de la terapia de reemplazo de la función renal .

La regulación fina del estatus tiol-disulfuro es una de las condiciones básicas de la función metabólica biológica. El elemento central de regulación dentro de este sistema es el tripeptido glutatión que alcanza en forma reducida a nivel intracelular concentraciones relativamente altas (hasta 10 mM) Junto al glutatión las proteínas portadoras de grupos tiol en forma intracelular y especialmente en forma unida a la membrana celular son componentes importantes para el estatus tiol-disulfuro de cada célula. ANTECEDENTES El metabolismo del rompimiento de grupos disulfuro y formación de grupos tiol, regulado por diferentes tipos de enzimas, es imprescindible que esté intacto, por sus múltiples funciones biológicas, entre otras, en los procesos de crecimiento y diferenciación celular, incluida la muerte celular programada, como también la protección celular y mecanismos de detoxificación, para la función celular normal. Fallas en este sistema y cambios en la concentración de los tioles llevan a graves fallas de funcionamiento, que solo en algunos casos permanecen limitadas localmente, afectando en la regla la totalidad del organismo.

En una gran cantidad de investigaciones se pudo demostrar la participación de un estatus tiol-disulfuro perturbado en enfermedades agudas y crónicas .

Así por ejemplo en enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson fue demostrado en determinadas células nerviosas, claras modificaciones del metabolismo de tiol (Brain Res Rev.l997;25 :335-358) . Existen claros indicios que como consecuencia de estas fallas de metabolismo sucumben un mayor numero de células nerviosas en áreas del cerebro afectadas, los ganglios básales, causando los síntomas de la enfermedad. (Ann Neuro 1994;36:348-355) .

Niveles de glutatión reducidos, respectivamente un contenido de glutatión intracelular reducido, fue encontrado además en el marco de enfermedades vasculares y sus consecuencias - la arteriosclerosis , infarto al miocardio, - en las células endoteliales recubriendo la pared interna de los vasos (Med sci res 1998;26:105-106) Enfermedades pulmonares, que están asociadas a una modificación del tejido pulmonar, regularmente están unidas a un déficit de glutatión en el tejido. En una fibrosis pulmonar de este tipo la gravedad de la enfermedad transcurre paralelamente con la pérdida de tiol (Clin Chim Acta 1977;265:113-119). La enfermedad grave pulmonar inflamatoria, investigada en el síndrome de deficiencia respiratoria en adultos, es acompañada por una desregulación del metabolismo del tiol en las células inflamadas (granulocitos) participantes (Chest 1996,109:163-166 ).

Células de defensa inmunocompetentes del sistema bronquial ( acrófagos alveolares) de fumadores o de pacientes con enfermedades de las vías respiratorias obstructivas crónicas muestran según investigaciones propias un grave déficit de tiol celular. El grado de perturbación del estatus de tiol celular correlacionó directamente con la limitación de función pulmonar (Free Radie Biol Med 2000,29:1160-1165) Mas allá de esto en los últimos años se han encontrado mayores indicios de un metabolismo de tiol dañado en enfermedades de riñon crónicas ( en Fail 1998,20:117-124 ), anemias (Br J Haematol 1995;91:811-819), recién nacidos inmaduros (Pediatr Pulmonol 1995;20: 160-166 ), pérdida de audición por efecto de ruido (Brian Res 1998, 784:82-90 ) enfermedades intestinales inflamatorias (Gut 1998;42:485-492) como en Diabetes mellitus (Metabolism: Clinical and Experimental 1998; 47 (8) : 993-997) . Amplias investigaciones (Proc Nati Acad Sci USA 1997 ; 94 : 1967-1972) ara la interpretación del metabolismo de glutatión en infecciones de virus indicaron una defensa celular dañada de células deficientes de tiol como también una función limitante del glutatión en la multiplicación del virus.

El sistema inmunológico celular del hombre, consistente de glóbulos blancos granulocitos , linfocitos y monocitos, representa un sistema que reacciona muy sensiblemente a una perturbación del metabolismo de tiol.

Modificaciones mínimas, especialmente pérdidas de glutatión celular pueden desencadenar un programa en cascada para la auto destrucción de la célula , la muerte celular programada (apoptosis) (FASEB J 1998 ; 12 : 479-486) . El metabolismo tiol-disulfuro actúa aquí como un ajustador central en un sistema imunológico intacto , sin el cual el organismo no sería capaz de vivir. Investigaciones propias mostraron, que especialmente bajo las condiciones de una función renal altamente limitada y por esto la necesidad de una terapia de apoyo de función renal en forma de hemodiálisis o diálisis peritoneal, el metabolismo celular tiol-disulfuro está interferido gravemente . Esta falla tiene como consecuencia, entre otros, una gran pérdida de funciones celulares normales, como la capacidad de fagositosis de macrofagos peritoneales o la capacidad de activación de linfocitos . Regularmente se encuentra en estos pacientes junto al déficit inmunólogico local existente, el que se caracteriza por las frecuentes infecciones de la cavidad abdominal, también una defensa inmunológica notoriamente disminuida con una tendencia general de infección mayor. Se ha descrito especialmente las fallas de función y una menor capacidad de activación de los linfocitos y macrofagos como desbalances de las citoquinas inmunoreguladoras . Immunbiol 1999;200:62-76).

La corrección de un metabolismo de tiol perturbado cobra por lo tanto una importancia fundamental como terapia base en el tratamiento de múltiples enfermedades de diversa génesis, especialmente bajo las condiciones de una terapia de reemplazo de la función renal .

El ácido a-lipoico se ha usado hasta ahora con relativo éxito en el tratamiento de malestares condicionados neurotóxicamente en el marco de la polineuropatía diabética como sustancia neuroprotectora (Diabetologica 1995; 38:1425-1433, Diabetes Res Clin Pract 1995;29:19-26, Diab Care 1999;22:1296-1301, Drug Metab Rev 1997; 29:1025-1054, DE 43 43 592 C2) . (De la patente DE 44 47 599 C2 y EP 0 530 446 Bl se conoce la aplicación del ácido a-lipoico en otras alteraciones neuronales, incluyendo tinnitus y pérdida de audición ) El mecanismo de acción citoprotectora se basa aquí, en la influencia de la modificación de proteína azúcar-dependiente (glicolización de proteína) , junto con una disminución de la génesis de cuerpos cetónicos neurotóxicos y por último a la acción antioxidante del ácido a-lipoico y sus metabolitos (Free Radie Biol Med 1995;19:227-250) .

Esta función de protección celular fue investigada especialmente bajo el aspecto de evitar la transformación oxidativa de ácidos grasos no saturados. Un bloqueo de la lipoperoxidación es la base para la aplicación de ácido cc-lipoico para una aplicación como medicamento protector del hígado en diversas intoxicaciones y enfermedades del hígado (Biochemistry 1998;37:1357-1364), junto con la aplicación como neuroprotector .

Además se pudo demostrar que el ácido a-lipoico frena la multiplicación del Virus HIV en diversas etapas de desarrollo pudiendo actuar contra la progresión de la enfermedad del SIDA. Los resultados de estas pruebas de laboratorio sin embargo solo se pudieron traspasar limitadamente a estudios clínicos (FEBS-Lett 1996; 394:9-13) Algo parecido sucede con la comprobación de una función antiinflamatoria de la substancia para las células islotes del páncreas productoras de insulina. (Agents Actions 1993;38:60-65) .

En la patente EP 0 812 590 A2 como en la EP 0 427 247 Bl se presenta la aplicación de ácido a-lipoico como citoprotector y medicamento contra los dolores y enfermedades inflamatorias .

Las propiedades antioxidantes del ácido a-lipoico se basan en la capacidad de formar quelatos con iones metálicos como la eliminación directa de radicales especialmente por su función de fuerte medio reductor. Para realizar esta reacción intracelularmente, debe existir el ácido a-lipoico en forma reducida como ácido dihidrolipoico . El paso de ácido a-lipoico (disulfídico) mediante reducción a la forma de ditiol del ácido dihidrolipoico requiere a su vez de equivalentes reductores, siendo catalizado este proceso por la enzima glutation-reductasa (gen Pharmacol 1997;29:315-311). Esto constituye evidentemente la razón para la acción insatisfactoria, hasta el momento, de esta substancia respecto a la restitución de tioles.

La patente DE 44 20 102 Al describe una combinación de medicamentos de ácido a-lipoico y substancias activas en el sistema circulatorio, especialmente un nitrato orgánico, un antagonista de calcio, un inhibidor-ACE u oxifedrina. La combinación de medicamentos es aplicable a enfermedades circulatorias y del corazón, como a enfermedades condicionadas por la diabetes .

Ambroxol, esto es, trans-4- (2-Amino-3 , 5-dibromobenzil-amino) -ciclohexano, clorhidrato, es aplicado como medicamento mucolítico en enfermedades pulmonares y bronquiales en diversas formas farmacéuticas. (WO 96 33704, GB 2239242, WO 01 05378) . Aparte de esto, es conocida la aplicación en hiperuricemia de la patente DE 35 30 761. La acción de Ambroxol como mucolítico se basa tanto en una estimulación de la producción de surfactantes de las células bronquiales como especialmente también en la capacidad de eliminar radicales libres (Respir ed 1998;92:609-23). La actividad antioxidante de la substancia basada en esto fue demostrada principalmente en células pulmonares (Pharmacol 1999;59:135-141) pero también en el marco de mecanismos inflamatorios (Inflamm Res 1999;48:86-93). Además es conocido que en vi tro, por la adición de Ambroxol en altas dosis, son influenciadas directamente enzimas reguladoras del metabolismo de glutatión como también son frenados procesos peroxidativos (Aren Vet Pol 1992;32:57-66) Bloqueadores de la enzima convertidora de angiotensina (Angiotensin-Converting Enzyme Inhibitors, inhibidor-ACE) son aplicados con mucho éxito en una amplia gama de enfermedades cardiovasculares . La razón de la actividad reductora de presión sanguínea aprovechada aquí, se basa en el bloqueo de la transformación de angiotensina I en angiotensina II. Además de esto, los inhibidores-ACE han sido descritos como sustancias con efecto en el metabolismo de glutatión. Junto con las investigaciones de estos efectos en las enfermedades del corazón, circulatorias y de vasos sanguíneos (J Cardiovasc Pharmacol 2000;36:503-509) fueron investigados los principios generales de regulación (Clin Nephrol 1997 47 :243-247) Hay que diferenciar aquí la acción de inhibidores-ACE portadores de grupos SH como por ejemplo Captopril (1-[(2S)-3-Mercapto-2-metilpropionil] -L-prolina) , de inhibidores libres de SH como por ejemplo Enalapril (1- {N- [ (S) -1-Etoxicarbonil-3-fenilpropil] -L-alanil} -L-prolina) . Los primeros reaccionan directamente como antioxidantes capturadores de radicales mientras los inhibidores-ACE libres de SH son incapaces de hacerlo primariamente . Ambos grupos tienen en común la influencia del ciclo redox del glutatión con la regulación de la glutatión-reductasa y glutatión-peroxidasa como también la superóxido-dismutasa (Am J Physiol Regulatory Integrative Comp. Physiol .2000 ; 278 : 572-577) . SUMARIO DE LA INVENCIÓN La misión de la presente invención es proporcionar medicamentos novedosos conteniendo substancias reactivas del tiol para la estabilización mejorada de un desequilibrio en el estatus del tiol-disulfuro, especialmente en insuficiencia renal, en el marco de una terapia de apoyo de función renal y para la restitución de la pérdida de funciones desencadenada por esto.

Esta misión es resuelta por el medicamento de esta invención con las características de la reivindicación 1. En la reivindicación 13 se describe el empleo de las sustancias activas para la preparación de un medicamento. Las reivindicaciones dependientes siguientes muestran en cada caso desarrollos adicionales convenientes .

Según la invención, son aplicadas sustancias con efecto en el metabolismo del glutatión (efectores) en combinación con ácido a-lipoico, sus sales y/o sus prodrogas.

Sorprendentemente se pudo mostrar que por la aplicación de la combinación de ácido cc-lipoico y un efector del metabolismo de glutatión se produjo una normalización del estatus de tiol disminuido de células inmunológicas . La acción estabilizadora de la combinación sobrepasó la aplicación individual de ácido -lipoico o de los respectivos efectores, no sólo regularmente, sino que se pudieron demostrar efectos superaditivos . La restitución del estatus de tiol comprendió tanto los tioles intracelulares como también a grupos SH unidos a membranas y es con esto la expresión de una regulación biológica compleja. Este fenómeno se basa que por un lado los efectores del metabolismo de glutatión eliminan radicales libres que se forman intermediariamente y por otra parte aumentan la disponibilidad de equivalentes reductores para la transformación del ácido cc-lipoico de su forma disulfídica a la forma reducida, mejorando la acción inductora de síntesis del ácido a-lipoico en el estatus tiol-disulfuro .

Mas allá se vio que el efecto de incrementar el tiol de la combinación de efectores del metabolismo de glutatión y ácido oc-lipoico sólo se presentó en células inmunológicas deficientes primariamente de tiol. Células inmunológicas sanas, que no presentaron alteración del estado tiol-disulfuro, no reaccionaron con un aumento mayor de la concentración de SH.

La restitución del estado de tiol de las células inmunológicas fue acompañado por la normalización de parámetros funcionales . Esto se refirió especialmente efectos inmunomoduladores en el marco de la capacidad de activar linfocitos T.

Además se pudo mostrar que la aplicación de combinaciones de la invención estabiliza el estatus de tiol-disulfuro de otras células inmunológicas como los macrófagos peritoneales de pacientes obligados a dializarse. Los macrófagos peritoneales mostraron antes del tratamiento con ácido cc-lipoico /Ambroxol respectivamente ácido a-lipoico /inhibidores-ACE junto con un estatus de tiol deficiente, una pérdida casi completa de su función de fagocitosis/ como un gran trastorno de la diferenciación y síntesis de citoquina, que se describe como causa de la alta frecuencia de infección en estos pacientes. Esta pérdida de funciones pudo ser eliminada por la administración de la combinación conocida de la invención.

Es especialmente apropiado este medicamento en la terapia de reemplazo de función renal como en otros cuadros clínicos en los cuales existe un trastorno del estado tiol-disulfuro en células inmunes. El tratamiento puede ser efectuado simultáneamente, en formulaciones separadas o también escalonado en el tiempo.

Los preparados combinados a ser aplicados según la invención pueden ser administrados en las formas farmacológicas usuales o como infusión tanto en forma profiláctica como terapéutica. La dosis efectiva se determinará caso a caso. Preferentemente en la aplicación de medicina humana la dosis es entre 30 y 1200 mg/d, y con mayor preferencia entre 200 y 600 mg/d. En una variante se utiliza como sustancia efectora del metabolismo del glutatión al Ambroxol de la formula general I, I su sal y/o su prodroga . La dosis de Atnbroxol para la aplicación en medicina humana es preferentemente entre 7,5 y 90 mg/d, con especial preferencia entre 60 y 75 mg/d.

En una siguiente variante se utiliza como efector del metabolismo del glutatión un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina (inhibidor-ACE) . Aquí la dosis preferencial para la aplicación médica humana es entre 0,2 y 20 mg/d.

Como inhibidores ACE pueden ser empleados por ejemplo los siguientes compuestos: A) 1- [ (2S) -3-Mercapto-2-metilpropionil] -L-prolina (Captopril) de la Formula II II B) 1-{N- [ (S) -l-Etoxicarbonil-3-fenilpropil] -L- alanil} prolina (Enalapril) de la Formula III III C) ácido (2S,3aS, 6aS) -l-{ (S) -N- [ (S) -l-Etoxicarbonil-3- fenilpropil] -alanil}-octahidrociclopenta [b] - pirrol-2-carboxilico (Ramipril) de la formula IV IV Los medicamentos pueden ser administrados tanto oral como parenteralmente .

Adicionalmente el medicamento puede contener los aditivos usuales, entre ellos cuentan por ejemplo solubilizantes acuosos, estabilizantes, medios de suspensión, dispersión y humectación .

El medicamento puede ser fabricado con la formulación a gusto. Por ejemplo en soluciones, granulados, polvos, emulsiones, tabletas y/o comprimidos de lámina.

Según la invención es utilizado un efector del metabolismo de glutatión junto con el ácido oc-lipoico, su sal y/o sus prodrogas para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno del estado de tiol-disulfuro de células inmunológicas en el marco de la terapia de reemplazo de la función renal .

De la misma forma puede aplicarse un efector del metabolismo de glutatión junto con el ácido a-lipoico, su sal y/o sus prodrogas para la preparación de un medicamento para el aumento inmunomodulatorio de defensas y/o el tratamiento antiinf1amatorio Los componentes del preparado de combinación pueden estar presentes en una formulación única o también en formulaciones separadas . La aplicación de la combinación de ácido a-lipoico y efectores del metabolismo de glutatión son descritas mediante los siguientes ejemplos y figuras mas detalladamente .

Ej emplo 1 Influencia sobre el estatus de tiol celular de células inmunológicas periféricas en el hombre Células inmunológicas primarias de dadores sanos (n=9) fueron aisladas mediante centrifugación de gradientes de densidad desde sangre periférica. La fracción principal de la población total resultante de células mononucleares es representada por linfocitos con una proporción dependiente del dador de cerca un 90%. Un 10% de las células mononucleares fueron representadas por monocitos .

Las células mononucleares obtenidas fueron recibidas en un medio de cultivo celular especial e incubados en una estufa de cultivo gasificada a 37°C, una humedad relativa de aire de 98% y contenido aire-CC>2 relativo de un 5%. El metabolismo de las células inmunológicas primarias en reposo fue activado mediante estimulación mitógena (0,5 //g/ml fitohemoglutinina) Para comprobar la influencia de la aplicación de la combinación de esta invención en el estatus de tiol de células inmunológicas deficientes de tiol, éstas fueron empobrecidas artificialmente de tiol. Esto se efectuó por cultivo en medios deficientes de tiol (RP I 1603) según procedimientos probados . Cultivos de referencia con la aplicación de medios completos (RPMI 1640) sirvieron para definir el mejor valor normal bajo las condiciones de cultivo .

La determinación del contenido de tiol intracelular a nivel individual se realizó bajo la utilización de 5-Diacetato de Clorometilfluoresceina (CMFDA) en la citofluorimetría de fluj o.

El CMFDA, primariamente no fluorogénico, es recibido pasivamente por la célula. Por el residuo clorometilo se produce una unión a los grupos tiol citoplasmáticos . Después del rompimiento de los restos de acetato por esterasas celulares inespecíficas este complejo ahora impermeable a la membrana celular se torna fluorogeno con una longitud de onda de exitación ?e? = 490 nm y con una longitud de onda de emisión ?e?p = 520 nm. La intensidad media de fluorescencia de la muestra (10.000) células) es directamente proporcional con la concentración intracelular de los grupos tiol.

La expresión de grupos tiol unidos a membranas también fue determinada por citofluorimetría de flujo. Aquí fue aplicado Clorometiltetrametilrodamina (CMTMR) como conjugado de tiol, las células bajo condiciones de un potencial de membrana bloqueado como también una capacidad de difusión frenada. La intensidad de fluorescencia de las moléculas fluorocrómicas unidas a la membrana celular es a su vez proporcional a la cantidad de grupos tiol en la superficie de la célula.

En la fig. 1 esta representado el efecto de la combinación de ácido cc-lipoico y Ambroxol (Fig. la) como ácido a-lipoico y Enalapril (Fig. Ib) sobre la expresión de tiol intracelular de linfocitos . La siguiente tabla muestra los los resultados de la combinación de ácido a-lipoico y Captopril. Los datos son representados como relación de la intensidad fluorescente celular con respecto a partículas de calibración analizadas en paralelo para cada caso (Beads) La concentración de sustancias activas de las respectivas combinaciones es idéntica con la concentración de los componentes individuales .

Expresión de tiol intracelular [mflBeads/ atiol Tiempo Control Ac . oc- Captopril Ac . cc-de Lipoico [10 µ ] Lipoico + cultivo [50 µ?] Captopril [d] 0 2, 88 + 2,88 + 2, 88 ± 2, 88 + 0,20 0,20 0,20 0,20 1 2,31 + 2,81 + 2, 80 ± 2, 89 + 0,20 0,23 0,21 0,31 2 1,98 ± 2,76 ± 2, 76 ± 2, 92 ± 0, 16 0,50 0,22 0, 32 3 1, 63 + 2 , 63 + 2,49 ± 2, 88 + 0,15 0,60 0,26 0,41 4 1,30 + 2,41 + 2, 21 ± 2, 91 + 0,16 0,40 0,36 0,39 6 1, 10 + 2,23 + 1,83 + 2,93 ± 0,13 0,50 0, 33 0,35 8 0,95 + 2,02 + 1,02 ± 2, 93 ± 0,10 0,30 0,39 0,41 10 0, 81 + 1,89 + 0,91 + 2,90 ± 0, 10 0,30 0, 46 0,45 12 0, 69 + 1,86 + 0,76 + 2, 88 ± 0,10 0,68 0,49 0,49 14 0, 65 + 1,83 ± 0,75 + 2, 86 ± 0, 08 0,60 0,56 0,47 Las células inmunológicas periféricas fueron cultivadas por un período de 4 días bajo condiciones normales (control 1640) y respectivamente condiciones deficientes de tiol (1603) para inducir la reducción de tiol de un 10 a 20%. Como se muestra en la el resultado de la adición de Ambroxol en combinación con ácido a-lipoico después de 48 horas de tratamiento es un ajuste completo del déficit del tiol intracelular. Con la utilización de la combinación de ácido a-lipoico y el inhibidor ACE libre de SH, Enalapril como el inhibidor ACE portador de SH, Captopril, estos efectos se vieron reforzados cuantitativamente y demostrables ya desde las 24 horas. Ni por la aplicación individual del ácido a-lipoico ni del efector fue posible un ajuste completo del déficit de tiol.

En la figura 2 se encuentran los resultados obtenidos con este enfoque experimental para la influencia de la combinación de la invención en la expresión de tioles unidos a membranas celulares, (Fig.2a) para la combinación de ácido a-lipoico y Ambroxol como también la combinación de ácido a-lipoico y Enalapril (Fig. 2b) . La siguiente tabla refleja los resultados para la combinación de ácido a-lipoico y Captopril : Expresión de tiol unido a membrana [mfÍBeads/Ratiol Tiempo control ácido a- Captopril ácido a-de lipoico [10 µ?] lipoico + cultivo [50 µ?] Captopril [dj 0 2,37 ± 2, 37 + 2,37 + 2,37 ± 0,45 0,45 0,45 0,39 1 2, 79 + 2, 65 + 2, 63 + 2,38 ± 0,50 0, 39 0,39 0,38 2 2,35 ± 2,43 + 2,54 ± 2,42 ± 0,45 0, 52 0,41 0,41 3 1,98 + 2, 31 + 2,52 + 2,49 ± 0,43 0,36 0,38 0,46 4 1, 63 + 2,26 + 2,50 + 2,39 ± 0,43 0,20 0,41 0,52 6 1,10 + 2,19 ± 2,46 + 2,40 ± 0,46 0, 13 0,50 0,50 8 0, 98 + 1, 93 ± 2, 01 + 2,40 ± 0,31 0,20 0,39 0,53 10 0,96 ± 1,63 + 1, 68 ± 2,36 ± 0,32 0, 16 0,29 0,52 12 0,95 ± 1,32 + 1, 02 + 2,38 + 0,33 0,21 0,51 0,49 14 0,98 + 1,34 + 0,99 + 2,36 ± 0,33 0,20 0,46 0,55 Bajo el tratamiento con la combinación de ácido a-lipoico y Ambroxol, nuevamente comenzando después de 48 horas se observó una significativa mejoría de la expresión de tiol unido a membranas. Llama la atención aquí que la administración de las substancias individualmente no mostró en ningún momento una influencia significativa. La administración de la combinación de ácido a-lipoico y los respectivos inhibidores ACE resultó tanto para Enalaprxl como para Captopril en un efecto superaditivo .

Ejemplo 2 Influencia en el estado de activación celular de linfocitos T periféricos del hombre .

En el preparado de cultivo descrito en el ejemplo 1 se estimularon linfocitos-T humanos con 1,0 g/ml de fitohemoglutinina. Dentro de un tiempo de cultivo de 72 horas fueron evidenciados marcadores específicos de la activación celular citoflorimétricamente · por detección mediante anticuerpos monoclonales . Se investigó la influencia de la aplicación de la combinación de esta invención sobre los marcadores de activación CD69 (antxgeno de activación temprano) , CD25 (antxgeno de activación medio) ,y CD71 (antxgeno de activación tardío) de linfocitos T. En la figura 3 está representado el efecto de la combinación de ácido oc-lipoico y Ambroxol (Pig. 3a) como de ácido cc-lipoico y Enalapril (Fig. 3b) sobre el índice de activación de linfocitos T. Comparados con los linfocitos T normales (Indice de activación =1,0) se registra en células deficientes de tiol una disminución clara de la capacidad de activación, demostrando una deficiencia de funcionamiento celular. Después de la administración de ácido cc-lipoico ocurre el efecto de una ligero mejoramiento de la activación celular, que en ningún caso compensa la desviación significativa del grupo de control normal. El Ambroxol no muestra influencia sobre uno de los tres marcadores de activación, el inhibidor ACE Enalapril solo es equivalente al efecto del ácido -lipoico en el antígeno CD25. En cambio en la aplicación combinada de ácido a-lipoico y Ambroxol, como también de ácido cc-lipoico y Enalapril, fue demostrable un aumento del índice de activación de células T hacia el rango normal. Este efecto fue observado en marcadores de activación tempranos, medios y tardíos. Se puede concluir con esto, que la normalización del estatus celular de tiol por la aplicación combinada de ácido cc-lipoico y los respectivos efectores del metabolismo de glutatión es acompañada por una restitución de la funcionalidad celular.

Ejemplo 3 Influencia sobre el estatus de tiol celular de macrofagos periteonales en el ámbito de una terapia de apoyo de función renal Los macrofagos peritoneales fueron aislados del efluente de la diálisis peritoneal de pacientes con una insuficiencia renal aguda, fueron incorporados en un medio de cultivo de células e incubados en una estufa de cultivo gasificada a 37 °C , una humedad relativa de 98% y un contenido relativo aire-C02 de un 7,5%. Para comprobar el efecto de la aplicación de la combinación de esta invención sobre el estatus del tiol de los macrofagos peritoneales , fueron tratadas diferentes fracciones con ácido cc-lipoico , los efectores del metabolismo de glutatión Ambroxol o el inhibidor Enalapril, y respectivamente con las combinaciones de ácido a-lipoico/Ambroxol o cido oc-lipoico/Enalapril , mientras una fracción se mantuvo como control sin tratamiento.

La determinación del estatus celular se efectuó mediante el método de medición descrito en 1. La expresión de tioles en membrana fue determinada por la intensidad de fluorescencia media (mfi) de la muestra (3000 células/medición) después de acoplamiento a un derivado de clorometil-fluorocromo.

En la Fig. 4 está representado el efecto de la combinación de ácido cc-lipoico y Ambroxol (Fig. 4a) como de ácido a-lipoico y Enalapril ( Fig. 4b) en la cinética durante 14 días (n=12) Bajo la adición de las monosustancias nuevamente sólo se observó un aumento de la expresión de tiol celular con la aplicación de ácido a-lipoico, mientras que Ambroxol y el inhibidor ACE no mostraron efecto. En oposición a esto, para la combinación de ácido a-lipoico y Ambroxol, comenzando desde las 72 horas, fue demostrable un claro incremento de la expresión celular de tiol, que después de 4 días de tratamiento alcanzó un efecto superaditivo , alcanzando un máximo después de 8 días , el que excedió el triple los datos iniciales y respectivamente los datos de control (Fig. 4a) . La combinación de ácido a-lipoico y un inhibidor ACE (Fig. 4b) resultó en una cinética similar de tiempo más corto aún. El máximo del efecto superaditivo fue alcanzado ya después de 48 a 72 horas de tratamiento. En la Fig. 5 está representado el efecto de la combinación de ácido a-lipoico y Enalapril (Fig. 5b) sobre la expresión de tiol unida a membranas de macrófagos peritoneales en la distribución experimental descrita anteriormente. La expresión de tioles en membranas fue determinada en base de la intensidad fluorescente media (mfi) de la muestra (3000 células/medida) después de acoplar a un derivado de clorometil-fluorocromo . En comparación con los resultados de la expresión de tiol intracelular, aquí se registra un claro efecto de la adición individual de ácido a-lipoico, el que sin embargo cesa después de 4 días de tratamiento. Contrariamente la aplicación combinada de ácido a-lipoico y Ambroxol (Fig. 5a) respectivamente ácido a-lipoico y un inhibidor ACE (Fig. 5b) produce un incremento primario más notorio y un aumento superaditivo estable y duradero en el período de observación de la expresión de tiol unido a membranas.

Ejemplo 4 Influencia sobre la capacidad de fagocitosis de macrófagos peritoneales Para permitir una caracterización de los macrófagos peritoneales en cuanto a sus funciones originarias se eligió a la capacidad de fagocitosis como unidad de medida.

Los macrófagos peritoneales fueron aislados en forma análoga a lo descrito en el ejemplo 3 y cultivados ex-vivo.

La determinación de la capacidad de fagocitosis se efectuó mediante un test citofluorimétrico a nivel de una célula .Para ésto los macrofagos fueron co-cultivados con bacterias opsonadas y marcadas fluorocromáticamente . La cantidad de bacterias recibidas se determinó cuantitati amemte en un período de tiempo determinado mediante la intensidad fluorescente en los macrofagos y se tomó como una medida de la capacidad de fagocitosis de éstos.

La influencia de la aplicación de la combinación de la invención sobre la capacidad de fagocitosis de los macrofagos peritoneales después de un tratamiento de 6 días se muestra siguiente tabla: Razón de fagocitosis [mfi / 10.000 células] Control 371 ± 39 -Lipoico [50 µ?] 687 ± 59 Ambroxol [10 µ?] 501 ± 52 a-Lipoico + Ambroxol 1.398 ± 286 (p<0.05) Enalapril [5 µ?] 567 + 59 a-Lipoico + Enalapril 1.698 ± 241 (p<0.05) Captopril [10 µ ] 653 + 43 a-Lipoico + Captopril 1.589 + 176 (p<0.05) Después de la incubación con ácido a-Lipoico , Ambroxol y respectivamente Enalapril la razón de fagocitosis frente al control sin tratamiento fué incrementada por un factor de 1,85 (a-Lipoico) 1,35 (Ambroxol); y respectivamente 1,53 (Enalapril) . En comparación se pudo alcanzar un incremento de la razón de fagocitosis de 3,7 para la combinación de ácido -Lipoico y Ambroxol y para la utilización de la combinación de un inhibidor ACE un factor de 4,6 (Enalapril) y respectivamente 4,3 (Captopril) . Además de esto se pudo demostrar una correlación directa entre la razón de fagocitosis y el contenido intracelular de tiol de los macrofagos peritoneales para la combinación de ácido ct-Lipoico y Ambroxol (r=0,79; p<0,01 ), ácido a-Lipoico y Captopril (r=0,86, p<0,01) como de ácido -Lipoico y Enalapril (r=0,82 ; p<0,01) Ejemplo 5 Influencia sobre el grado de diferenciación y activación como de la síntesis de citocruina de macrófagos peritoneales.

Los macrófagos peritoneales fueron aislados de pacientes bajo terapia de apoyo de función renal descrita según el procedimiento del ejemplo 3 y cultivados en presencia de las combinaciones nombradas para la invención de ácido a-Lipoico y efectores del metabolismo de glutatión. Después de 6 dias de incubación fue determinado el grado de diferenciación de los macrófagos peritoneales mediante la expresión de antígenos de superficie celular CD15 y CDllc , como también el grado de la activación celular por la coexpresión de los antígenos de activación CO69 sobre células CD15-positivas como CD71 sobre células CDllc- positivas, en forma citofluorimétrica .

Los resultados están resumidos en la siguiente tabla CD15 CDllc CD15/69 CDllc/71 Control 1,0 1,0 1,0 1,0 a-Lipoico 1, 18 + 1,21 ± 1,09 + 1,08 ± [50 µ?] 0, 16 0, 11 0, 08 0,09 Ambroxol 0, 98 + 1, 01 ± 0, 98 + 0,96 + [10 µ?] 0,13 0, 09 0,11 0,1 a-Lipoico + 1,29 + 1, 65 + 1,49 + 1, 83 + Ambroxol 0,21 0,21 0,13 0, 14 Enalapril 1,21 + 1,23 ± 1,19 ± 1, 10 + [5 µ?] 0,22 0,22 0,12 0, 14 a-Lipoico + 2,12 + 1,99 ± 1,69 ± 1,58 + Enalapril 0,16 0,15 0,2 0, 12 (p<0. ,05) (P<0. 05) Captopril 1, 19 + 1,26 + 1, 69 + 1,52 + [10 µ?] 0,14 0,24 0,21 0,16 a-Lipoico + 2,25 + 2,63 + 1, 74 ± 1,61 + Captopril 0,2 0,23 0,19 0,18 (p<0. .05) (p<0. 05) Se pudo mostrar que la expresión de los marcadores de madurez CD15 y CDllc se incrementó notoriamente bajo la utilización de la combinación de ácido a-Lipoico y Ambroxol y muy significativamete bajo la utilización de la combinación de acido oc-Lipoico e inhibidores ACE . Además fue demostrable un claro aumento de los antígenos de activación CD69 y respectivamete, CD71 en las respectivas poblaciones celulares. La aplicación de las monosubstancias no tuvo influencia o muy marginal, sobre el grado de diferenciación y activación de los macrófagos peritoneales .

Paralelamente a esto en este diseño experimental se han recuperado los excedentes de cultivo celular y determinado las citoquinas, interleucina-6 (IL-6) como el antagonista receptor interleucina-1 (IL-lra) contenidas, que fueron sintetizadas y secretadas por los macrófagos peritoneales. El análisis se efectuó bajo la aplicación de técnicas de inmunoensayo enzimático con sistemas de medición estandarizados y está representado en la siguiente tabla que muestra los efectos del ácido -Lipoico y efectores del metabolismo celular del glutatión sobre la síntesis de citoquina de macrófagos peritoneales después de un tiempo de tratamiento de 6 dias (n=10) IL-lra [ng/10s Células] Control 53.1 ± 8. .9 115.2 + 23 .4 a-Lipoico [50 µ?] 46.9 ± 6. ,7 119.8 ± 19 .5 Ambroxol [10 µ?] 51.8 ± 8. .1 118.6 ± 21. .3 -Lipoico + 31.5 ± 9· ,2 126.8 + 15. .3 Ambroxol (?<0..05) (?<0.05) Enalapril [5 µ?] 41.7 ± 7. ,3 121.1 ± 16. .9 a-Lipoico + 22.3 ± 8. ,1 139.8 ± 22. .1 Enalapril (?<0..05) (?<0.05) Captopril [10 µ?] 42.9 ± 7. .7 129.4 ± 25. .1 a-Lipoico + 28.1 ± 6. ,1 143.5 ± 18. .7 Captopril (?<0..05) (?<0.05) En presencia de la combinación de ácido a-Lipoico y Ambroxol como en la combinación de ácido a-Lipoico y los diferentes inhibidores ACE se pudo demostrar una significativa reducción de la síntesis de IL-6 . Este efecto sobrepasó clarmente la suma de la disminución otorgada por las monosubstancias . La síntesis de IL-lra fue inducida significativamente bajo estas condiciones. También aquí fue registrado un efecto superaditivo de las combinaciones de ácido a-Lipoico y Ambroxol y respectivamente inhibidores ACE.

Ej emplo 6 Influencia en la estabilidad de la restitución de tiol en macrófaqos peritoneales en el modelo de diálisis.

Los macrófagos restituidos de tiol mediante la aplicación de la combinación de la invención, descritas en el ejemplo 3, fueron extraídos del sistema de ensayo después de 6 días y cultivados por 14 días en un modelo de diálisis.

Para esto se adaptaron los macrófagos peritoneales sobre matrices móviles recubiertas de colágeno IV y puestos en contacto 3 veces al día durante 60 minutos cada vez con una solución normal de diálisis . Este modelo sirvió aquí para la inducción de un estrés combinado hiperglicémico y osmótico. En la Fig. 6 está representado el efecto de la combinación de ácido a-Lipoico y Ambroxol (Fig. 6a) como de ácido a-Lipoico y Enalapril (Fig. 6b) sobre la expresión de tiol intracelular de los macrófagos peritoneales en una cinética de tiempo. La expresión de tioles en membranas fué determinada en base de la intensidad media de fluorescencia (mfi) de la muestra (3000 células/medición) después de acoplar a un derivado de fluorocromo .

Mientras que los controles no tratados restituidos de tiol primariamente mostraron una disminución casi lineal de la concentración de tiol intracelular dentro de los 4 primeros días , resulto que la adición combinada de ácido a-Lipoico y Ambroxol como de acido a-Lipoico y Enalapril mantuvo un estatus de tiol intracelular constante en el nivel de la restitución primaria. También aquí se evidencia un monoefecto por el ácido a-Lipoico, sin embargo es de corta duración y después de 4 dias muestra en el modelo de diálisis solo un efecto de un 50% de las combinaciones.

Un cuadro similar ofrece la observación de los transcursos de la expresión de tiol unidos a membranas mostrados en la Fíg. 7 .

Nuevamente se mantuvieron constantes las cantidades obtenidas en la restitución primaria de tiol por la utilización de la combinación de ácido a-Lipoico y Ambroxol (Fig. 7a) y respectivamente inhibidores ACE (Fig. 7b) , mientras que con la adición de las substancias solas se observaron efectos intermedios ( ácido a-Lipoico ) o marginales (Ambroxol, Enalapril ) En total estos experimentos dejan en claro, que la aplicación de ácido a-Lipoico y los efectores del metabolismo del glutation, Ambroxol y respectivamente los inhibidores ACE estabilizan un estado de tiol primario dañado masivamente en diversos sistemas celulares . Por esta normalización se obtiene mas allá la recuperación de funciones celulares centrales inmunoregulatorias , las que sin este tratamiento no se habrían registrado.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES 1. Medicamento caracterizado porque contiene un efector del metabolismo de glutatión junto con ácido cc-lipoico, sus sales y/o sus prodrogas, como un preparado combinado para el tratamiento simultáneo, separado o escalonado en el tiempo de una perturbación del estatus de tiol- disulfuro en el ámbito de la terapia de apoyo de la función renal, síndromes en los cuales la perturbación del estatus de tíol-disulfuro aparece en células inmunes, en donde es utilizado como efector el Ambroxol, con la formula general I, I sus sales , y/o sus prodrogas . Medicamento según la reivindicación 1, caracterizado porque, la dosis de ácido a-lipóico, sus sales y o sus prodrogas para la aplicación en medicina humana es en el paciente entre 30 y 1200 mg/d, y preferentemente entre 200 y 600 mg/d. Medicamento según una de las Reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porgue, la dosis de Ambroxol, sus sales y /o sus prodrogas, para la aplicación en medicina humana es en el paciente entre 7,5 y 90 mg/d, y preferentemente entre 60 y 75 mg/d. Medicamento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la administración se realiza en forma parenteral . Medicamento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque, se han seleccionado aditivos del grupo de los solubilizantes acuosos, estabilizantes, y medios de suspensión, dispersión y humectación. Medicamento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque, está en forma de una solución, un granulado, un polvo, una emulsión, una tableta y/o tableta. El uso de al menos un efector del metabolismo del glutatión junto con ácido cc-lipoico, sus sales y/o sus prodrogas para la preparación de un medicamento para el tratamiento simultáneo, separado o escalonado en el tiempo de una perturbación del estatus de tiol- disulfuro en el ámbito de la terapia de apoyo de la función renal, en la forma de un proceso de diálisis hemo o peritoneal . . Uso de al menos un efector del metabolismo del glutatión junto con ácido a-lipoico, sus sales y/o sus prodrogas para la preparación de un medicamento para el tratamiento simultáneo, separado o escalonado en el tiempo de una perturbación del estatus de tiol- disulfuro en síndromes en los cuales la perturbación del estatus de tiol-disulfuro aparece en células inmunes, de manera particular para el tratamiento inmunomodulador y/o de incremento de las defensas, simultáneo, separado o escalonado en el tiempo. . Uso según la reivindicación 7 y 8, caracterizado porgue se utiliza como efector una enzima inhibidora de la enzima convertidora de angiotensina (Inhibidor ACE) . 0. Uso según la reivindicación 9, caracterizado porgue la dosis del inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina (inhibidor ACE) para la aplicación humana es en el paciente entre 0,2 y 20 mg/d. Uso según la reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque es utilizado el in ibidor-ACE l-[(2S)-3- mercapto-2-metilpropionil] -L-prolina (captopril) de la formula II. II Uso según la reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque, como el inhibidor ACE es utilizado 1-{N-[(S)-1- etoxicarbonil-3-phenilpropil] -L-alanil}-L-prolina (Enalapril) de la formula III III 13. Uso según la reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque, el inhibidor ACE utilizado es el (2S,3aS, 6aS) - l-{ (S) -N- [ (S) -l-etoxicarbonil-3 -fenilpropil] -alanil}- octahidrociclopenta [b] -pirrol-ácido 2-carboxílico (ramipril) de la fórmula IV IV El uso según al menos cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, caracterizado porque, el efector del metabolismo del glutation y el ácido a- lipoico, sus sales y/o sus prodrogas están presentes en una misma formulación. El uso según al menos cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, caracterizado porque el efector del metabolismo del glutation y el ácido a-lipoico, sus sales y/o sus prodrogas están presentes en formulaciones separadas .