UNA FORMULACIÓN ORAL PARA SUMINISTRO DE FÁRMACO GASTROINTESTINAL
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a una formulación oral para suministro de fármaco gastrointestinal. Más específicamente, la presente invención se relaciona a una formulación oral para el suministro de fármaco gastrointestinal para mejorar la biadisponibilidad de los fármacos que tienen una biodisponibilidad baja debido a una absorción baja en el tracto digestivo. ' La biodisponibilidad baja de los fármacos después de la administración oral es considerada a ser- provocada por los factores siguientes. (1) En la administración oral de las formulaciones tales como tabletas y cápsulas, el gradiente de concentración del fármaco entre el lumen digestivo y la sangre aumenta inmediatamente después de liberar el fármaco de la formulación oral, pero rápidamente disminuye mientras la formulación se mueve en la parte inferior del tracto digestivo, que da una desventaja a las condiciones de absorción de fármacos. (2) los fármacos tales como la furosemida se absorben a partir del sitio de absorción limitado de la parte superior del intestino delgado (así llamado efecto ventana) , y las formulaciones comunes de tales fármacos no pueden mostrar biodisponibilidad satisfactoria después de presionar a través del sitio de absorción. (3) Los
fármacos de la proteína o péptido se someten a degradación hidrolítica drástica mediante enzimas digestivas secretadas al tracto digestivo, por lo que la biodisponibilidad es reducida en únicamente un poco porcentaje. (4) Los inhibidores de proteasa VIH tales como ritonavir, sequinavir, indinavir y nelfinavir son, después de absorber del tracto digestivo, activamente excretadas por proteínas excretorias tales como P-gp expresadas en la membrana de célula epitelial del tracto intestinal. Para mejorar la biodisponibilidad bajo de los fármacos provocados por el efecto de ventana, Aklyama et al., desarrolló formulaciones de granulo adhesivas de mucosa (Pharmaceutical Research, vol. 12, pp . 397-405, 1995). Como técnicas convencionales para mejorar la biodisponibilidad de proteína y el peptido después de la administración oral, con el objeto principal de prevenir la degradación hidrolítica en el estómago y el intestino delgado, se ha desarrollado unas tabletas de insulina cubiertas por azopolímeros disolvatables en el colon por el Dr . Saffran et al., una preparación de emulsión de Cortex Co . , una técnica para la fabricación de la formulación oral por Takada, una técnica de suministro de colon y una preparación de liposoma por Takada (Takada, Pharm. Tech. Japón, 1988, p . 1299-1307; Takada, Pharm. Tech. Japón, 1991, pp. 512-52; Takada, Pharm. Tech. Japón, 1995, pp . 1335-1344;
Ko et al., Nippon Rinsho [Japón Clinicals], 1998, pp . 595-600) y similares. En mucosa las formulaciones del granulo adhesivas, las moléculas de fármaco no pueden protegerse- a partir del ataque de las enzimas digestivas que existen en el tracto digestivo. También en las formulaciones de péptido o proteínas oral anteriores, es difícil prevenir perfectamente a la proteína o péptido del ataque o de enzimas digestivas en el lumen intestinal. El objeto de la presente invención es proporcionar una formulación oral para el suministro de fármaco (a veces referida como formulaciones del sistema de suministro de fármaco (DDS)) qué permite la mejora de la biodisponibilidad para preparar una preparación de parche utilizando un polímero de formación de gel y un polímero insoluble en agua que se adhiere a la membrana de mucosa del tracto digestivo después de la administración oral y previene la permeación de las enzimas digestivas que existen en el tracto digestivo, protegiendo las moléculas de fármaco en la preparación de parche a partir del ataque de las enzimas digestivas en el lumen del intestino delgado, y que retienen eJ gradiente de concentración sobre un período largo de tiempo por la adhesión a la membrana mucosa. Se condujo a varios estudios para lograr el objeto antes mencionado, y tienen exitosamente desarrollada una
formulación oral para el suministro de fármaco gastrointestinal que comprende tres capas que cada uno tiene una función específica. La presente invención se logró en base a estos descubrimientos. De acuerdo con la presente invención, existe proporcionada una formulación oral para suministro de fármaco gastrointestinal que comprende una capa que controla el sitio de adhesión para unir la formulación al sitio seleccionado en el tracto digestivo, una capa portadora de fármaco conteniendo un fármaco y un adhesivo, y una capa protectora para proteger el fármaco en la capa portadora de fármaco, en donde la capa portadora de fármaco existe entre la capa de protección y la capa que controla el sitio de adhesión, y la capa que controla el sitio de adhesión puede unirse a la capa de protección. De acuerdo con una modalidad de la presente invención, existe proporcionada la formulación oral para el suministro de fármaco gastrointestinal en donde cada una de las capas gue controla el sitio, la capa portadora de fármaco y la capa de protección están en la forma de película y estas tres capas son laminadas . En esta modalidad, cada uno de los espesores de la capa gue controla el sitio de adhesión, la caspa portadora de fármaco y la capa de protección preferiblemente es de 20 a 100 µm. De acuerdo con otra modalidad adiciona de la
presente invención, existe proporcionada la formulación oral para el suministro de fármaco gastrointestinal en donde la capa de protección está en la forma hemisférica, y la capa portadora de fármaco existe en el espacio interior de la capa de protección en la forma hemisférica, y_la capa portadora de fármaco existe en el espacio interior de la caspa de protección en la forma hemisférica, y en donde la capa que controla el sitio de adhesión cubre la parte abierta de la capa de protección en la forma hemisférica. En esta modalidad, la profundidad interna del hemisferio es de manera preferible de 50 a 500 µm en diámetro interno de la parte abierta del hemisferio es preferiblemente de 20 a 800 µm, y el espesor de la capa de protección y la capa de control de adhesión del sitio es preferiblemente de 20 a 100 µm. Preferiblemente, la capa portadora de fármaco es un substrato de hoja porosa absorbido con un fármaco, o una hoja o una película de gel o cera que contiene un fármaco. Preferiblemente, la capa gue porta el fármaco además contiene uno o más ingredientes seleccionados a partir de un grupo gue consiste de los promotores de absorción, los inhibidores de proteasa y los inhibidores transportadores. Preferiblemente, la capa de protección es una película o cápsula hecha de un polímero o cera insolubles en agua . Preferiblemente, la capa de control de sitio de
adhesión es una película hecha de un polímero entérico. Preferiblemente, el fármaco es una proteína o péptido fisiológicamente activo. Preferiblemente, el fármaco es G-CSF, interferon o indinavir De acuerdo con otro aspecto de la presente invención existe proporcionada una formulación de cápsula oral que está preparada llenando la formulación antes mencionada en una cápsula. La formulación de la cápsula oral es preferiblemente una cápsula entérica. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figure 1 muestra las curvas de tiempo de concentración de fluoresceina (FL) después de administración intravenosa, lmg, y oral, 30 mg de FL en sistemas de suministro gastrointestinal (Gl ) -mucoadhesiva a perros sabueso. En la figura, D: sistema HP-55 , O sistema
EudragitR LlOO, y 0: sistema EudragitR S100. Cada valor representa la media±S.E. de tres o cuatro objetos. La Figure 2 muestra los dinámicos de glóbulos blancos totales (WBC) después de la administración intravenosa y oral de CSF, 125µg en sistemas de suministro Gl-mucoadhesivos a perros sabueso. En la figura, D: el sistema HP-55R, O: sistemas EudragitR LlOO, y 0: sistemas EudragitR SIOO. Cada valor representa la media±S.E. de tres objetos .
La Figure 3 muestra efectos de HCO-60R y ácido cítrico sobre los dinámicos WBC después de la administración oral de G-CSF, 125 µg, en el sistema de suministro EudragitR LlOO Gl-mucoadhesivo a perros sabuesos. En la Figura, ?: HCO-60/ácido cítrico (100/100), íl: HCO-60/ácido cítrico (100/150), O: HCO-60/ácido cítrico (100/200), y 0: BC0-60/ácido cítrico (50/200) . Cada valor representa la media±S.E. de tres objetos. La Figure 4 muestra las curvas de tiempo de concentración G-CSF de suero después de la administración oral, 125µg de G-CSF en el sistema de suministro EudragitR LlOO Gl-mucoadhesivo a perros sabueso. Cada valor representa la media±S,E. de tres objetos. La Figure 5 muestra la distribución de sistemas de suministro Gl-mucoadhesivos (a) HP-55R, (b) EudragitR LlOO, (c) EudragitR S100 en el tracto intestinal de ratas después de la administración intraduodenal. El intestino delgado se dividió en cinco secciones*" y la longitud de cada sección fue 12-15 cm. La formulación oral para el suministro de fármaco gastrointestinal de acuerdo con la presente invención está caracterizada porque la formulación comprende una capa que controla el sitio de adhesión para unir la formulación a un sitio seleccionado en el tracto digestivo, una capa portadora de fármaco conteniendo un fármaco y un adhesivo y una capa de
protección para proteger el fármaco en la capa portadora de fármaco, y la capa portadora de fármaco existe entre la capa de protección y la capa que controla el sitio de adhesión, y la capa que control al sitio de adhesión puede unirse a la capa de protección. Cuando la formulación de la presente invención es oralmente administrada, la capa que controla el sitio de adhesión disuelve a un sitio único en el tracto digestivo. El sitio de la membrana mucosa del tracto digestivo al cual la capa portadora de fármaco se une, es controlado por tal disolución de la capa d control de sitio de adhesión en un sitio único en el tracto digestivo. Después de que la administración oral de la formulación, la capa de protección previene el jugo digestivo de la permeación en la capa portadora de fármaco y la capa portadora de fármaco a partir de la liberación del fármaco, y también previene el jugo digestivos y las enzimas digestivas a partir de la permeación en la capa protectora de fármaco después de que la formulación se une a la membrana mucosa del tracto digestivo. La biodisponibilidad del fármaco oralmente administrado es mejorada por la protección de las moléculas de fármaco a partir del ataque de enzimas digestivas y la retención del gradiente de concentración sobre un largo periodo de tiempo. La capa gue controla el sitio de adhesión comprende una substancia que previene el fármaco a partir de la
liberación de estallido en la fase anterior y disuelve en un sitio (adhesión) de parche específico seleccionado en el tracto digestivo. Típicamente, la capa que controla el sitio de adhesión se hace de un polímero entérico dependiente de pH tal como ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa (HP-55R) , copolimero metacrílico (EudragitR L) , copolímero-LD metacrílico (Eudragit LD) y copolímero-S metacrílico
(EudragitR S) . El espesor de la capa que controla el sitio de adhesión generalmente es de 20 a 100 µm, preferiblemente de 30 a 70 µm, y más preferiblemente de 40 a 50 µm. La capa portadora de fármaco es una capa intermedia la cual existe entre la capa de protección y la capa que controla el sitio de adhesión. La capa portadora de fármaco contiene un fármaco y un adhesivo. El adhesivo se utiliza para unir la capa portadora de fármaco a la membrana mucosa del tracto digestivo cuando la capa que controla el sitio de adhesión disuelve en un sitio seleccionado en el tracto digestivo . El tipo de fármaco contenido en la capa portadora de fármaco no está particularmente limitado, y es preferiblemente aquella que tiene una biodisponibilidad cuando se administra oralmente. Aquéllos absorbidos en el tracto gastrointestinal, específicamente en el intestino son preferidos. Los ejemplos incluyen proteínas fisiológicamente activa o péptido (por ejemplo, el factor gue estimula la
colonia de granulocito (G-CSF) , interferon gue incluye interferon-a, ß y ?, eritroproteína, interleucinas, hormonas de crecimiento, calcitonina e insulina) , así como ADN o ARN gue incluye oligo- o poli-nucleótido (el ADN puede estar en la forma de plásmido) , aromático, antígeno o anticuerpo (por ejemplo, toxina botulino) y células (por ejemplo, ísleta Langerhans pancreática). Más específicamente, los ejemplos incluyen G-CSF, indinavir e interferon. El adhesivo para unir la capa que porta el fármaco a la membrana mucosa del tracto digestivo puede ser preparada mezclando un plasticida en polímeros o gomas tales como polímero de carboxivinilo, copolímero de acrilato de /octil acrilato, copolímero de 2-etilhexil acrilato/vinilpirrolidona, resina de copolímero acrilato silkbroina, resina de copolímero metil acrilato/2-etilhexil acrilato, goma arábiga, poli (vinilalcohol) , polivinilpirrolidona, metilcelulosa, poliisopreno, poliacrilato, y poliacrilato de sodio, seguidos por amasado de la mezcla con agua. Por ejemplo, un adhesivo puede ser preparado amasando 0.8 g de Hivis akoR 103, 250 µl de PEG 400 y 2 ml de agua purificada. Cuando un soporte es utilizado como la capa portadora de fármaco, ejemplos del soporte incluyen el substrato poroso, substratos porosos rehumedecidos con un fármaco tal como fibra de poliéster, tela delgada, papel
tisú, y papel sintético de película hecha de un polímero de celulosa sintético o un polímero entérico. Cuando una capa de gel es utilizada como la capa portadora de fármaco, la capa de gel puede ser preparada mezclando una solución acuosa de un fármaco, polvos de un fármaco o una dispersión de sólido de un fármaco, o un fármaco micro- o nano-encapsulado con una solución concentrada de un polímero de formación de gel tal como polímero de carboxivinilo. En lugar de la capa de gel, allí puede utilizarse una capa de cera hidrofilica preparada agregando un fármaco y un adhesivo tal como Hiviswako 103R a una cera hidrofílica tal como polietilenglicol 400 (PEG 400) . Cuando el nano- o micro-encapsulación se aplica al fármaco, un uso de hidroxipropil metilcelulosa de ftalato (HP-55P) como una pared nano- o microcapsula da liberación rápida del fármaco después de unir a la pared gastrointestinal. Además, por la formulación del promotor de absorción tal como los derivados de aceite de castor polioxietilado, ácido cáprico y el ácido ursodesoxicólico, etc., en la capa que porta el fármaco, la biodisponibilidad del fármaco pueden ser además mejorada. Alternativamente, formulando inhibidores proteasa tales como aprotinina en la capa portadora de fármaco, degradación hidrolítica de un péptido o fármaco de proteína puede ser efectivamente inhibida y la biodisponibilidad del fármaco puede también ser
mejorada. Alternativamente, formulando los inhibidores de transportador como P-gp gue participa en la excreción del fármaco absorbido (por ejemplo, verapamil y ciclosporina) a la capa portadora de fármaco, la biodisponibilidad del fármaco pueden ser mejorada. Como se explicó en lo siguiente, la capa portadora de fármaco utilizada en la presente invención puede estar en la forma de una película o puede existir en el espacio interno de la forma "hemisférica hecha de- la capa de protección. Cuando la capa portadora de fármaco está en la forma de una película, el espesor de la película generalmente es de 20 a 100 µm, preferiblemente de 30 a 70 µm, y más preferiblemente de 40 a 50 µm. Las funciones de capa de protección (capa de respaldo) para proteger el fármaco en la capa portadora de fármaco y está en la forma de una película o una pared, por ejemplo una forma hemisférica, que está hecha de un polímero insoluble en agua, una cera o una mezcla de la misma para inhibir la permeación del fármaco eir la capa portadora de fármaco y las enzimas digestivas, la capa de protección puede ser preparada, por ejemplo, utilizando un polímero farmacéutico insoluble en agua tal como etilcelulosa, copolímero de aminoalquilmetacrilato (Eudragit RS) , acetato de celulosa, quitina y quitosan, o una cera tal como ácido esteárico, alcohol estearílico, cera de abejas blanca,
mantequilla de cacao, grasa severa, goma de laca purificada, estearato de polioxilo 40, cetanol y polioxietil lauril éter. El espesor de la capa de protección generalmente es de 20 a 100 µm, preferiblemente de 30 a 70 µm, y más preferiblemente de 40 a 50 µm. Cuando la capa de protección está en la forma hemisférica, el tamaño del hemisferio no está particularmente limitado. Por ejemplo, la profundidad interna del hemisferio es de 50 a 500 µm, y el diámetro -interno (calibre) del hemisferio es de 20 a 800 µm, preferiblemente de 50 a 500 µm, y más preferiblemente de 100 a 300 µm. De acuerdo con la presente invención, la capa portadora de fármaco existe entre la capa de protección y la capa que controla el sitio de adhesión. Ejemplos de aguéllos en donde la capa portadora de fármaco existe entre la capa de protección y la capa gue controla el sitio de adhesión incluye (1) donde- la capa gue controla el sitio de adhesión, la capa portadora de fármaco y la capa de protección están en la forma de película respectivamente, y aquellas tapas se laminan en orden (de aquí en adelante referido como la formulación de acuerdo con la primera modalidad) y (2) donde la capa de protección está en la forma hemisférica, la capa portadora de fármaco existe en el espacio interno de la forma hemisférica, y la capa que controla el sitio de adhesión cubre la parte abierta del hemisferio (de aquí en adelante referida como la formulación de acuerdo con la segunda
modalidad) . Los métodos para preparar las formulaciones antes mencionadas en las primera y segunda modalidades que son ejemplos típicos de la presente invención, se describirán en detalle en lo siguiente. Para preparar la formulación de acuerdo con la primera modalidad, una película para la capa de protección está formada utilizando un polímero insoluble en agua o una cera mencionada en lo anterior. Más específicamente, un polímero o cera insoluble en agua se disuelve en un solvente orgánico tal como etanol, la solución resultante se vacía en una llama de Teflón, y el solvente se evapora. Por ejemplo, 550 mg de etilcelulosa y 150 µl de citrato de trietilo se disuelven en 5 ml de una mezcla de cloruro de metileno y metanol (4:1), y la solución resultante se vacía en una placa de Teflón. Enseguida, como se explicó anteriormente, la capa portadora de fármaco está formada en la capa de protección. Un adhesivo puede ser aplicado en la capa de protección y entonces el soporte gue contiene un fármaco- se une para formar la capa protectora de fármaco, o alternativamente, un fármaco y un adhesivo (tal como polímeros que forman gel, pueden ser mezclados y entonces aplicados en la capa de protección. Como la capa gue controla el sitio de adhesión, una película que tiene de 20 a 100 µm de espesor que es hecha de un polímero entérico como -se explicó anteriormente puede ser
utilizada. Por ejemplo, 225 mg de HP-55R (Shin-etsu Chemical Ind. Co. Ltd.) y 25 µl de citrato de trietilo se disuelven en 5 ml de una mezcla de cloruro de metileno y metanol (4:1) , y la solución resultante se vacía en una placa de Teflón para formar una película. Como otro ejemplo, una película puede utilizarse la cual se prepara disolviendo 225 mg de EudragitR S100 o EudragitR LlOO y 150 µl de citrato de trietilo en 5 ml de una mezcla de cloruro de metileno y metanol (4:1) y se vacía la solución resultante en una. placa de Teflón. La formulación de acuerdo con la primera modalidad de la presente invención puede ser preparada uniendo tal película en la capa portadora de fármaco con un adhesivo y similares y cortando la película en tres capas en un tamaño apropiado. Además, para prevenir una fuga de fármaco y similares de los bordes de la capa portadora de fármaco entre la capa de protección y la capa que controla el sitio de adhesión, es preferible que la formulación se selle rociando una substancia insoluble en agua tal como polvos finos de ácido esteárico . El tamaño de la formulación del parche de película no está limitado hasta el momento a aquella de la formulación que puede ser llenada en una cápsula de gelatina o en una cápsula entérica hecha de un polímero entérico. Por ejemplo, el tamaño puede ser un cuadro de 3 x 3 mm y un círculo de 5 mm en diámetro. Para prevenir la adhesión o hedor de las
películas entre sí cuando se llenan en una cápsula en filas, el tratamiento de lubricación es preferiblemente aplicado rociando polvos de silicato de magnesio. Para preparar la formulación en la segunda modalidad, la capa de protección en la forma hemisférica, utilizada en la presente invención puede ser preparada cortando minicápsulas o microcápsulas hechas de un polímero insoluble en agua o una cera a la mitad. Las minicápsulas o microcápsulas se preparan utilizando polímero insoluble en agua tal como etilcelulosa o Eudragit RS1Q0 en un método convencional, y entonces las cápsulas resultantes se cortan en el centro en dos piezas, y el lado interno es raspado para preparar alojamiento de minicápsulas a la mitad o microcápsulas a la mitad en la forma de (cazoleta) hemisférica, la cual sirve como la capa de protección. Para preparar la capa portadora de fármaco, un fármaco y una polímero de formación de gel se mezclan y llenan en las minicápsulas a la mitad o microcápsulas a la mitad. La capa que controla el sitio de adhesión puede ser formada uniendo una película hecha de un polímero entérico en la parte superior de las minicápsulas a la mitad o microcápsulas a la mitad utilizando una goma de polímero de formación de gel así como las tapas de las cápsulas a la mitad. Alternativamente, las minicápsulas o mícrocápsulas gue contienen un fármaco y un polímero adhesivo pueden ser preparados utilizando un
polímero insoluble en agua tal como etilcelulosa o EudragitR RS100 en un método convencional, y las cápsulas resultantes se cortan en el centro en dos piezas. Entonces, la capa que controla el sitio de adhesión puede estar formada uniendo una película hecha de un polímero entérico sobre la parte superior de las minicápsulas a la mitad o microcápsulas a la mitad utilizando una goma de polímero de formación de gel así como la tapa de las cápsulas a la mitad. Alternativamente, para preparar la formulación en la segunda modalidad en una amplia cantidad, una película se forma utilizando un polímero insoluble en agua o una cera en una forma similar a agüella en la preparación a la capa de protección utilizada en las formulaciones en la primera modalidad. La película resultante se pone sobre un objeto espinoso que tiene muchas protecciones de micrón regularmente dispuesto tal como una rana utilizada en la disposición de la flor, ün molde de metal preparado por técnicas en micro-máquina puede también ser utilizados como un objeto en el cual la pelí-cula se coloca. La película está permitida para permanecer bajo calentamiento a una alta temperatura durante pocas horas, y entonces enfriar para preparar una película con muchas cavidades en la forma de un micro-contenedor que tiene una profundidad desde 50 a 500 µm y el calibre desde 20 a 800 µm. Para llenar un fármaco en un micro-contenedor como
las cavidades formadas en la película, dos formas del método de fase sólida y el método de fase líquida puede ser utilizada. En el método de fase sólida, un fármaco y un adhesivo se mezclan y entonces la mezcla resultante se llena en las cavidades similares a un micro-contenedor en una cantidad fijada bajo la condición sólida. En el método de fase líquida, un adhesivo se inyecta dentro de las cavidades por medio de un método de fase sólido, y una solución de fármaco se inyecta en las cavidades mediante un micro-inyector. Entonces, la capa que controla el sitio de adhesión (una película hecha de un polímero entérico) se proporciona de manera que cubre la parte superior de las cavidades similares al micro-contenedor. La capa que controla el sitio de adhesión y la película que tiene cavidades similares al micro-contenedor pueden adherirse entre sí previamente aplicando un adhesivo sobre la capa que controla el sitio de adhesión, y aplicar a la película que tiene cavidades similares al micro-contenedor llenado con el fármaco. La capa que controla el sitio de adhesión pueden ser adherida a la película que tiene las cavidades similares al microcontenedor llenadas con el fármaco, calentando los métodos de presión, cuando el fármaco es resistente al calor. La película resultante, la cual tiene muchas cavidades llevas con el fármaco y cuyas cavidades se cubren
con la capa gue controla el sitio de adhesión, se corta en piezas pequeñas cada una teniendo una cavidad para preparar las formulaciones en la segunda modalidad de la presente invención. Los cortes pueden ser llevados a cabo mecánicamente o utilizando un láser bajo el microscopio. La presente invención se explicará más específicamente refiriéndose a los siguientes ejemplos. Sin embargo, el alcance de la presente invención no se limita a los siguientes ejemplos. Ejemplos Ej emp1o A Materiales Una solución de G-CSF (500 µg mL-1) se obtiene a partir de Kirin Bre ery Co., Ltd (Tokio, Japón) . Se obtiene ftalato de hidroxipropilmetilceloulosa (HP-55) de Shin-etsu Chemical . Industry Co . , Ltd. (Tokyo, Japón) . Se obtuvieron Eudragit S100 y LlOO (Rohm Pharm, Darmstadt, Germany) a través de Higuchi Inc. (Tokio, Japón) . El polímero de carboxivinilo {Hiviswako 103) , etilcelulosa (EC, lOcp) y citrato de trietilo se obtuvieron a partir de Wako Puré
Chemicals Industries, Ltd. (Osaka, Japón) , Los polioxietilados, ßOµmol, el derivado de aceite de castor
(HCO-60) se obtuvieron a partir de Nikko Chemical Co . , Ltd
(Tokyo, Japón) . Polietilenglycol (PEG) 400, negro de Sudán, sacarosa y ácido cítrico se obtuvieron a partir de Nacalai
Tesgue Inc. (Kyoto, Japón) . Se obtuvieron la fluoresceina
(FL), mletanol y diclorometano de Kanto Chemical Co . , Ltd.
(Tokio, Japón) . Se obtuvo el silica-to de magnesio a partir de
Kyowa Chemical Industry Co., Ltd. (Takamatsu, Japón) . Las cápsulas de gelatina (#0) se obtuvieron de Yoshida Co., Ltd.
(Himeji, Japón). Los perros sabueso machos (10.0-12.5 kg) utilizados en este estudio y la comida sólida estándard del alimento comercial (Labo D stock) se obtuvieron de Nippon
Nousan Co., Ltd. (Yokohama, Japón) . Se obtuvieron ratas a partir de SLC (Hamamatsu, Japón) . Todos los otros materiales utilizados son del grado reactivo y se utilizaron como se recibieron. Preparación del sistema de suministro ucoadhesivo Gl La capa de refuerzo (capa de protección) se preparó mediante una técnica de evaporación "de vaciado/solvente a partir de la solución EC gue contiene el plasticida. La solución polimérica plasticida (11%, P/V) se preparó disolviendo 550 mg de EC en 5 ml de la mezcla del cloruro de metileno y metanol (4:1) y se agrega 150 mg de citrato de trietilo al plasticida EC. Para preparar las películas de prueba para la retención/tránsito en el tracto Gl de ratas, se agregaron 3.5 mg de negro de sudan a la mezcla. La solución EC plasticida se fundió sobre una placa de Teflón, 10 x 10 cm, y el solvente se evaporó a 6°C durante 12h. Después de remover de la placa, el mismo tamaño de capa
portadora de fármaco, la membrana de celulosa, se unió mediante un enlace térmico a 80°C. Por lo tanto, la capa de respaldo que tiene la capa portadora de fármaco se corta a 1.0 x 10.0 cm. El espesor de la película EC por sí misma fue de 48.3 ± 2.7 µm, y el espesor total fue 115.3 + 0.9 µm. La capa de superficie sensible al pH (capa que controla el sitio de adhesión) también se preparó por la misma forma del polímero entérico, HP-55, Eudragit LlOO y S100, respectivamente. Principalmente, 550 mg de HP-55 y 50 µl de citrato de trietilo se disolvieron con una mezcla de 10 ml de cloruro de metileno y metansl (4:1) . Similarmente, se disolvieron 550 mg Eudragit LlOO o Eudragit S100 con una mezcla de 10 ml de cloruro de metileno y metanol (1:1) con la adición de 100 µl de citrato de trietilo. Cada solución se fundió en una placa de Teflón, 10 X 10 cm, y la película sensible al pH se preparó a 6°C durante 12 horas. Después de eliminar a partir de la placa, la película sensible al pH se cortó a 1.0 x 10.0 cm. El espesor de las películas entéricas fueron 39.0 ± 2.5 Mm por HP-55, 36.3 ± 2.2 µm para Eudragit LlOO y 37.7 ± 2.2 µm para "Eudragit S100. La goma adhesiva se preparó mezclando 0.8 g de Hiviswako 103, 250 µl de PEG 400 y 2 ml de agua. Después de tejer bien, la goma se esparce uniformemente sobre la superficie de da capa de superficie sensible al pH . El fármaco cargado se realiza como sigue; en primer
lugar, la capa portadora de fármaco se humedece con 400 µl del ácido cítrico que contiene la solución (100, 150 ó 200 mg) y HCO-60 (50 o 100 mg) y se seca bien a 50°C durante 2 horas. Por lo tanto, una solución de fármaco se carga sobre la capa portadora de fármaco. Para el estudio FL, 200 µl de solución FL, 150 mg/ml se cargaron. Para el estudio G-CSF, la solución de 180 µl o 250 µl de _ solución G-CSF cuya concentración fue 500 µg/ml se cargó. Después de que la hoja se secó bien durante 12 horas en un refrigerador, la capa de superficie sensible al pH se unió a la capa portadora de fármaco con la ayuda de la goma Hiviswako. La película en tres capas se cortó en piezas pegueñas, 3 .0 x 3.0 mm, y las películas pequeñas se trataron con ácido esteárico micro-pulverizado y silicato de magnesio para cubrir los bordes de las películas y prevenir la adherencia de las películas entre sí. Finalmente, las películas se llenan, en una cápsula #0 Hp-55 con la adición de la sucrosa pulverizada como un excipiente. Se preparó la cápsula HP-55 como sigue. Se disolvió HP-55 con la mezcla de cloruro de metileno y metanol (4:1) . La solución de 4.0 P/V % obtenida se llenó en un cuerpo y tapa de cápsula de gelatina #0, respectivamente. Después de la evaporación, la tapa HP-55 y el cuerpo se obtuvieron disolviendo la capa de gelatina. Estudios de Farmacocinética en perros sabueso Tres perros sabueso adultos macho se sometieron a
ayuno durante la noche por 12 horas en cada experimento, aungue el acceso libre al agua se permitió. Sin embargo, durante el curso del experimento, el agua no se dio hasta 4 horas después de que la preparación de prueba se administró. Cada perro recibió una administración oral de una cápsula de prueba en todos los estudios . 4 horas después de la administración, una comida sólida de alimento comercial, 450 g, y agua se dieron, la comida adicional se dio durante el estudio Todos los experimentos se llevaron a cabo al mismo tiempo del día para excluir las influencias a un ritmo cada día. La administración se "hizo a las 10:30 AM con 20 ml de agua. A los 30 minutos antes de la administración del fármaco de la administración de fármaco, la muestra de sangre de control (0-5 ml) se removió a partir de la vena yugular. Cada perro recibió una cápsula que contuvo 30 mg de FL, o 125 µg de G-CSF. Después de la administración oral de la preparación de prueba, 0.5 ml de las muestras de sangre se colectaron a partir de la vena yugular a 0, 1, 2, 3, 4, 5 y 6 h para el estudio FL y a O, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, y 8 h para el estudio G-CSF. Las muestras de sangres para el ensayo ELISA de G-CSF se colectaron en EDTA. La fracción del plasma para el ensayo FL o la fracción de suero para el ensayo G-CSF se obtuvo centrifugando las muestras de sangre a 12,000 rpm durante 5 minutos. Estas muestras de plasma y suero se congelaron inmediatamente en un congelador a -80°C hasta ser analizado.
Una semana después, la solución iv de FL o G-CSF se inyecto a los mismos perros. Las concentraciones de la solución de prueba fue 1.0 mg/ml para FL y 500 µg/ml para G-CSF. La iv fue de 10 mg para FL y 125 µg/kg para G-CSF, respectivamente. Después de la administración, las muestras de sangre se colectaron a 0, 5, 10, 20, 30, 40 minutos, 1 y 2 h. Las muestras de plasma también se almacenaron a -80°C hasta análisis . Estudio farmacodinámico de G-CSF en perros sabueso El sistema de suministro mucoadhesivo de prueba Gl gue contiene 125 ó 90 µg de G-CSF se administró oralmente a los mismos perros sabueso dos semanas después y 0 5 ml de las muestras ' de sangre se colectaron de la vena yugular a 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 y 12 h. Justo después del último muestreo sanguíneo, todas las muestras de sangre se utilizaron para el análisis del conteo de glóbulos blancos (WBC) . Además, la muestra de sangre también se colectó .en la siguiente mañana a 24 después de la administración y se midió el conteo WBC. Determinación de la retención y transmisión de películas en el tracto de rata Gl . Las ratas Wistar macho gue pesaron de 300 a 350 g se dejaron ayunar durante 12h antes de los experimentos. El agua se alojó en el libito. Bajo la ligera anestesia de éter, la incisión abdominal se realizó y diez piezas de las
l'.
películas de prueba de las cuales midieron 1.0 X 2.0 mm se administraron en el duodeno a través de un corte en la cercanía del estómago al píloro. Para detectar las películas pequeñas en el tracto Gl, la capa posterior de la película se tiñó con tinte negro, negro de sudan. Después de la sutura abdominal, cada rata se dejó en una jaula. En 1, 2, 3, 4, 5 y 6 h después de la administración, las ratas se sacrificaron. El estómago y la longitud completa del intestino delgado se aisló y el estómago y el intestino delgado se esparcieron en una hoja. El intestino pequeño completo de esfínter pilórico en la unión ileo-cecal . se dividió "en 5 porciones y las películas restantes en el tracto Gl se detectaron visualmente y se registraron. Después, las fotografías se tomaron con una cámara digital DC-3Z (RICOH Co., Ltd., Tokio, Japón) y la imagen se capturó y digitalizó utilizando software (Logitec, Tokio, Japón) y se analizó con software PhotoDeluxe (Adobes) . Las fotografías se imprimieron utilizando una impresora de color digital (SONY, Tokio, Japón) . Método de ensayo Concentración FL de plasma La concentración de FL en el plasma se determinó de acuerdo a un método espectrofotofluorométrico. Se agregó a 200 µl de la muestra de plasma del perro, 0.5 ml de metanol. Después de mezclar bien, la mezcla resultante se centrifugó a 12,000 rpm durante 5 minutos. En el sobrenadante, 1 ml de 0.1
X
de solución N-NaOH y 2 ml de agua destilada y la intensidad de fluorescencia se midió utilizando un espectrofotofluorometro Shimadzu RF-500 con una longitud de onda en estimulación de 468 nm y una emisión de 512 nm. Ensayo (ELISA) inmunosorbeñté de enzima unido para G-CSF Se midieron las concentraciones de suero G-CSF en un ensayo inmunosorbente unido a la enzima se agregó a cada pozo de la placa de 96 pozos de fondo plano, 100 µl de la muestra de suero o la solución estándar G-CSF preparada agregando la cantidad conocida de G-CSF al suero de perro en blanco se agregó a cada pozo. Las placas de 96 pozos se incubaron durante 3 h a temperatura ambiente. Después de la incubación, las placas de 96 pozos se lavaron con amortiguadores. 200 µl del anticuerpo policlonal contra el G-CSF conjugado en fosfatasa alcalina se agregó a cada pozo y se incubó durante 2 horas. Después de lavar, 50 µl de NADPH se agregó y se incubo durante 1 h. 50 µl de la solución amortiguada que contiene etanol y violeta INT se agregó y se incubó durante 0.5h. Después de agregarse el ácido sulfúnico 2N, la densidad óptica de cada pozo se determinó utilizando un lector de micro-placa a 490 nm. Para nuestros ensayos, se utilizó el método de regresión menos cuadrado que ha sido pesado acoplado con la transformación de diagrama lógico de tercer orden. Conteo de glóbulos blancos (WBC) totales
*1
Los efectos farmacológicos de G-CSF se evaluaron midiendo los conteos WBC circulantes. Los 20 µl de EDTA de muestras de sangre tratadas se utilizaron para la medición de WBC después de diluir y hemolizar utilizando el agente de estromatolización . Las células sanguíneas estromatolizadas se contaron utilizando un contador microcelular automático (Sysmex F-500) . Se realizaron tres mediciones con una muestra sanguínea. El conteo WBC se expresó como un valore relativo, determinado dividiendo el contador WBC en cada punto de tiempo después de que se administró el fármaco mediante el valor respectivo, particularmente, el conteo WBC de pre-dosis . Análisis de datos Los parámetros farmacocinéticos siguientes se determinaron a partir de los datos del tiempo de concentración de fármaco de plasma. Cmax fue la concentración de fármaco máxima y el Tmax fue el tiempo tomado para alcanzar Cmax y estos valores se obtubieron como los valores medidos. El área bajo el plasma o la curva de la concentración de tiempo (AUC) del suero de perro y el área bajo la curva de primer momento (AUMC) después de las administraciones intravenosa y oral se calcularon utilizando la regla trapezoidal lineal en la última concentración del fármaco medido. El tiempo de residencia medido (MRT) después de la administración oral se calculó por AUMC/AUC. La
-*J
extensión de la biocapacidad (BA) se calculo a partir de Dosßi.v,, AUCLV./ y UCorai mediante la siguiente ecuación, BA=AUCora?«Dose1.v./AUC1.v.#Doseora?. La capacidad farmacológica (PA) de la dosis oral de G-CSF se calcularon a partir de la siguiente ecuación: F = AUCo-48, oral x Dose^ VJ / (AUC0_8, i.v.xDoseora? ) Donde AUCo- 8, oral es el área individual a partir del tiempo cero a 48h bajo la curva del efecto de tiempo farmacológico de cada perro el cual recibió el sistema de suministro micoadhesivo G-CSF Gl o solución iv. Doselv y AUC0- 48, ?v son la dosis promedio y el área a partir del tiempo cero a 48h bajo la curva de tiempo de efecto farmacológico de todos los perros datos en solución intravenosa G-CFS para la administración iv de la solución G-CSF, los efectos farmacológicos se midieron a partir del momento cero a 48 horas cuando los sujetos regresaron al nivel de pre-dosis. Estadísticas . Todo los valores se expresaron como su media±S.E. Las diferencias estadísticas se asumieron para ser reproducibles cuando p<0.05 (prueba t unilateral) . Resultados El estudio farmacocinético del sistema de suministro mucoadhesivo Gl formulado con FL. En el estudio de los farmacocinéticos del FL después de la administración oral en el sistema de suministro
mucoadhesivo Gl, el sistema de suministro mucoadhesivo Gl que contiene 30 mg de Fl se preparó y se administro a tres perros sabuesos . En este estudio sobre sistema de suministro mucoadhesivo Gl, tres tipos de capas de superficie sensitiva de pH se utilizaron. Estas fueron HP-55, Eudragit LlOO y S100. Después de la administración oral de estos tres tipos de sistemas de suministro mucoadhesivo Gl, la concentración FL de plasma contra los perfiles de tiempo se obtuvieron como se muestra en la Figura 1. En cada caso de los sistemas de suministro mucoadhesivos HP-55 y Eudragit LlOO Gl, la concentración FL de plásmido inicia a incrementar en lh y 1.5h después de la administración oral en perros y alcanzo niveles pico, Cmax, a 2 y 3h, respectivamente." Sin embargo, en el caso del sistema de suministro^ mucoadhesivo S100 Gl Eudragit existió un tiempo de retraso de absorción, aproximadamente 2h. Después, la concentración Fl de plasma inicio a incrementar y alcanzó a Cmax a 5h. El análisis farmacocinético no compartimental se realizó por estos datos y los resultados se mostraron en la Tabla 1. No existen diferencias significantes en los valores AUC entre HP-55 y el sistema de suministro mucoadhesivo Eudragit LlOO Gl . Sin embargo, el AUC del sistema de suministro mucoadhesivo Gl Eudragit S100 fue significativamente más pequeño gue los otros, debido a gue fue un tiempo de retraso " de absorción
JS
mayor debido al suministro en la parte inferior del intestino delgado y la absorción de FL no termino durante 8h después de la administración oral. Como este estudio fue un muestreo sanguíneo explorativo se realizo durante 8h. Para determinar la biocapacidad de FL a partir de tres sistemas de suministro mucoadhesivos Gl, FL fue administrado intravenosamente a los mismos perros y los resultados también se mostraron en la Tabla 1. Comparando el valor AUC obtenido después de la inyección intravenosa de la misma cantidad de FL, la biocapacidad de FL a partir de tres preparaciones se calculó para ser 79.1±7.59%, 85.1+7.85%. y 56.1±8.16%, respectivamente . Tabla 1 Parámetros Farmacocinéticos de FL después de la administración oral en los sistemas de suministro GI-mucoadhesivos en perros sabuesos. Cma? (µg rpl) Trricax (h) AUC (µq - h/m!) MRT ( ) BA (%)
HP-55 0 -10 ±0-03 2.33 ±0.82 1 24?r0.12 3.45±0.18 79! ± ?.S9
Eudragit l. 0 41 ±0.04 3.33 :0.41 1.3 ±0 1 2 3.3a-t0.26 85.1 ±7.85
Eudragil S 0 40 0.02 5.00?:0.00 0.0B-+-.0.13 4.32±0.17 56 1 :1: 8.1 6
Cada valor representa la medio ± S.E. de tres sujetos
Estudio farmacodinámico del sistema de suministro mucoadhesivo Gl formulado con G-CSF
ZZ
Basado en el estudio con FL, el sistema de suministro mucoadhesivo Gl se aplicó a una proteína. G-CSF se utilizó como una proteína modelo, debido a que se realizaron muchos estudios en la evaluación farmacodinámica de G-CSF formulada en unos sistemas de suministro orales que incluyen el sistema de suministro de colón. La cantidad de 125µg de G-CSF se formularon en tres tipos de sistema de suministro mucoadhesivo Gl y se administraron oralmente a perros. La Figura 2 mostró el curso de tiempo de la actividad farmacológica de G-CSF. Después de la administración, en WBC incrementado a 1.4 veces como se comparó en el nivel de predosis en el caso del sistema de suministro mucoadhesivo Gl HP-55. Sin embargo, el WBC más incrementada, aproximadamente 1.7 veces, en el sistema de suministro mucoadhesivo Gl Eudragit LlOO que el sistema de suministro mucoadhesivo Gl HP-55. En el caso del sistema de suministro mucoadhesivo Gl Eudragit SlOO, la WBC no incremento como se ve en el sistema de suministro mucoadhesivo Gl LlOO. Para determinar la capacidad farmacológica (PA) de G-CSF a partir de tres sistemas de suministro mucoadhesivos, la misma cantidad de G-CSF se inyectó a los mismos perros y la actividad farmacológica de G-CSF se verificó. La Figura insertada mostró el resultado. Comparando las áreas bajo el incremento doblado del total de WSF, el PA de los tres sistemas de suministro mucoadhesivos Gl son 5.5% por el sistema de
z
suministro mucaadhesivo HP-55 Gl, 23% para el sistema de suministro mucoadhesivo Gl Eudragit LlOO y 6.0% para el sistema de suministro mucoadhesivo Gl Eudragit SlOO, respectivamente . En la prueba la dependencia de dosis del efecto farmacológico de G-CSF, 90µg de G-CSF se formuló en el sistema de suministro mucoadhesivo Gl Eudragit LlOO y se administró oralmente a los mismos perros. El resultado también se mostró en la Figura. El incremento del WBC total fue menor que el previsto a partir del estudio de dosis de 125 µg, y el incremento máximo fue de 1.2 veces como se comparó en el nivel de predosis. En el sistema de suministro mucoadhesivo Gl, los aditivo tales como tensioactivo, HCO-60 y el ácido orgánico, ácido cítrico se formularon. Por lo tanto, en el estudio los efectos de los aditivos en la actividad farmacológica de G-CSF, la cantidad formulada de ácido cítrico se disminuyó de 299 mg a 150 y 100 mg, donde la cantidad de tensioactivo HCO-60, fue constante, 100 mg . Como se muestra en la Figura 3 cuando la cantidad formulada de ácido cítrico se disminuye de 200 mg a 150 mg, el Pa de G-CSF disminuye. Sin embargo, el PA no cambia significativamente disminuyendo la cantidad formulada de ácido cítrico de 150 mg a 100 mg . Por otro lado, el efecto alcanzado de HCO-60 en el PA de G-CSF claramente disminuyendo la cantidad formulada de -ÜCO-60 de 100 mg a 50
mg . Estudio farmacocinético de G-CSF después de la administración oral a los perros . Como el sistema de suministro mucoadhesivo Gl Eudragit LlOO que contiene 125µg de G-CSF mostró el PA menos elevado de G-CSF, las mismas preparaciones se administraron a los perros y a los niveles G-CSF de plasma se midieron mediante un método ELISA. Como se muestra en la Figura 4, los niveles de plasma G-CSG empezaron a incrementar después de la administración oral y alcanzaron su nivel pico, lOOpg/ml, a lh. Además, el nivel G-CSF de plasma declino rápidamente. Estos resultados fuertemente sugirieron que se absorberá G-CSF a partir del tracto Gl y entraron en la circulación sistema como una forma intacta. Determinación de la retención y paso de las películas en el tracto Gl de las ratas Para determinar las características adhesivas de los tres sistemas de suministro mucoadhesivo Gl, tres clases de películas microadhesivas más pequeñas y coloreadas 1.0 x 2.0 mm se prepararon, y las películas de prueba se administraron en el duodeno de las ratas. La retención/paso de las películas bioadhesivas se verificaron por una incisión abdominal como se muestra en la Figura 5. Para las películas bioadhesivas HP-55 más de las películas administradas se detectaron en la sección #1 intestinal pequeño, es decir,
duodeno, en 1 y 2h después de la administración. Además, las películas fueron adhesivas al duodeno por aproximadamente 3h. Sin embargo, a 4h después de la administración, 8 de 10 películas movidas a la sección #2 intestinal pequeño de las ratas, y después movidas a la parte inferior del intestino delgado. En el caso de las películas bioadhesivas Eudragit LlOO, las películas desaparecieron a partir de la sección #1 intestinal pequeña dentro de 2h después de la administración y se retuvieron en la sección #2 por aproximadamente 2h. Después, las películas transferidas a la sección #3 y #4 intestinal pequeña gradualmente. De otra manera, las películas bioadhesivas Eudragit SlOO transferidas de la sección #1 a #4 gradualmente. Esto tomo aproximadamente 3h. entonces, las películas se unieron a la sección #5 y se retuvieron ahí por aproximadamente 3h. Ejemplo B Ejemplo 1 Una película de EC (16 cm x 1.6 cm) de la capa de protección (capa de respaldo) se aplicó con goma Hiviswako 103. Un papel tisú en el mismo tamaño se remojó con una solución de fármaco gue se preparó disolviendo 100 µl de solución G-CSF de 1.25 mg/ml, 100 mg de HCO-60 (un derivativo de aceite del ricino polioxietilado) y 200 mg de ácido cítrico en 200 ml de agua el papel tisú se secó y se insertó en la película EC alrededor para dar la película que porta el
fármaco (la película intermedia) . Una película HP-55 del mismo tamaño se aplicó con goma Hiviswako 103, y se remojó en la capa intermedia para obtener la capa gue controla el sitio de adhesión (capa de superficie) . Las tres películas en capas resultantes se cortaron en pegueñas piezas, 3.0 x 3.0 mm, cubiertas con polvo de silicato de magnesio en la superficie de corte, y se llenaron en una cápsula HP-55. La lactosa se lleno en el espacio para dar una formulación DDS de parche oral . Ejemplo 2 Un formulación DDS de parche oral se preparó en una forma similar a aquella en el Ejemplo 1 excepto que 100 mg de ácido ursodesoxicólico y 2,000 unidades de aprotinina (un inhibidor de enzimas hidrolítico) se agregó a la solución de fármaco en la preparación de la capa portadora del fármaco (capa del intermedia) . Ejemplo 3 Una capa portadora de fármaco en gelatina 81a capa intermedia) se preparó primero. Indinavir (100 mg) se mezcló con 0.8 ml de agua y 100 ml de polietilenglicol 400, y se agregó con 300 mg de Hiviswako 103. La mezcla resultante se amasó concienzudamente para dar una goma. Una película EC (el película de respaldo) del mismo tamaño como ag ella como en el Ejemplo 1 se aplicó con la goma que contiene indinavir. Una película HP-55 se amasó como una película de capa de
superficie. Después de eso, el tratamiento de silicato de magnesio se realizó en una forma similar como aquella en el Ejemplo 1, y la película resultante y una cantidad apropiada de lactosa se llenaron en dos cápsulas entéricas HP-55 de tamaño No. 0 para dar una formulación de DDS de parcha oral de indinavir. Ejemplo 4 Una formulación DDS de parche oral de indinavir se preparó en una forma similar a aquella en el Ejemplo 3 excepto que 200 mg de ciclosporina la cual es un inhibidor del transportador P-gp se agregó a la solución de fármaco en la preparación de la capa portadora de fármaco (la capa intermedia) . Ejemplo 5 Se disolvió etilcelulosa (Ec) (550 mg) y 50 µl de citrato de trietilo en 5 ml de una mezcla de cloruro de metileno y metanol (4:1) . La solución resultante se vertió en una placa de Teflón de lOm por lOcm, y el solvente se evaporó para formar una película EC. La película EC se puso en un molde de metal que tiene proyecciones de 200 µm de diámetro máximo y 80 µm de peso, y se presionaron a 175°C durante 10 minutos. La película entonces se enfrió a temperatura ambiente para formar una película EC que tiene la forma de microcontenedor. G-CSF (100 µl) como el fármaco, 50 mg de HCO-60 (un derivado de aceite de ricino polioxietilado) y 200
mg de ácido cítrico se disolvieron en 1 ml de agua para preparar una solución de fármaco. La solución de fármaco se liofilizó, y el fármaco pulverizado se puso en la película EC que tiene la forma de micro-contenedor y fue uniformemente llenada en los micro-contenedores con una espátula inoxidable. El resto del polvo en la placa EC se barrió hacia fuera con una brocha inoxidable. Para preparar una película de capa de superficie de HP-55 la cual está en un polímero entérico, 300 mg de HP-55 y 50 µl de citrato de trietilo se disolvieron en 10 ml de una mezcla de. cloruro de metileno y metanol (4:1) . La solución resultante se vertió en una placa de Teflón 15 x 15 cm, y el solvente se evaporó para formar una película HP-55. Como una goma para la adhesión, 0.8 g de Hiviswako 103, 2 ml de agua destilada y 250 µl de polietilenglicol 400 se agitó en un mortero con un matraz. La goma para la adhesión se esparció en la película HP-55 y se fijó a la película EC que tiene micro-contenedores llenados con el fármaco. Bajo el microscopio, la película en capas resultantes se cortó alrededor de los micro-contenedores en cuadros de aproximadamente 500 x 500 micrones o círculos de aproximadamente 500 micrones en diámetro para dar formulaciones de microcápsula uniforme que tiene tres estructura en capas. El cortado se realizó por láser utilizando láser UV que realiza la máquina LYH-100AA (Ushio Electronics Co.) bajo onda elevada modulada 4 veces de láser
•*!
YAG, la longitud de onda de 266nm, la amplitud de haz de aproximadamente 30 µm y salida de 105mV x 0.77 segundos en una forma gue agüella del carácter "O" de descripción es trazado . Ejemplo 6 De acuerdo con un método convencional (Ohyama Takao, et al., Ishoku [Transplantation], vol. 34, No. 4, pp . 174-185, 1999) , la isleta Langerhans se obtuvo a partir del páncreas de rata. Un microinyector se llenó con la isleta Langerhans pancreática suspendida en una solución carboximetilcelulosa de 0.1%. Bajo el microscopio, la isleta Langerhans pancreática se inyecta en micro-contenedores en una película EC preparada en una forma similar como aquella en el Ejemplo 5 con el microinyector. Una película HP-55 se preparó en una forma similar aquella en el Ejemplo 5. La goma Hiviswako 103 se espacio en la película HP-55 y se espació a la película EC de la cual los micro-contenedores se llenan con la células disponibles. Bajo el microscopio, la película en capas resultante se corta alrededor de microcontenedores en cuadros de aproximadamente 500 x 5-00 micrones o círculos de aproximadamente 500 micrones en diámetro para dar formulaciones de mícrocápsula no uniformes que tienen tres estructura en capas . Ejemplo 1 de Prueba: Evaluación de un Método de biodisponibilidad in vivo
Los perros sabuesos se sometieron a la administración oral de la formulación DDS de parche oral preparada en el Ejemplo 1 a 4 antes mencionados. Después de la administración, la sangre circulante se colectó con tiempo y el conteo de glóbulos blancos en la sangre que circula se detectó como un indicador de la eficacia del fármaco en los casos utilizando las formulaciones G-CSF. La dosis de las formulaciones de G-CSF y las formulaciones indinavir fueron 125 µg/perro y 100 mg/perro, respectivamente. Los perros sabuesos fueron adultos machos que pesan de 10 a 11 kg y tratados bajo condiciones de ayuno. El resultado en la prueba terapéutica y farmacológica de las formulaciones de G-CSF se mostró en la Tabla 2 siguiente. Tabla 2 El conteo de glóbulos blanco después de la administración. Administración de 6hr 12hr 24hr 48hr fármaco anterior Solución G-CSF 100 105 103 97 106 Formulación G-CSF 100 111 132 130 108 del Ejemplo 1 Formulación G-CSF 100 120 141 139 109 del Ejemplo 1 La solución G-CSF es una formulación de una inyección G-CSF comercial" llenada en una cápsula entérica
hecha de HP-55. El conteo de glóbulos blanco en la sangre circulante de los perros sabuesos antes de la administración se definieron como una vaselina al 100% (y el cambio del conteo de glóbulos blancos se representó como valores relativos . El resultado en la administración de las formulaciones indinavir se muestra en la Tabla 3 siguiente. Tabla 3 Concentración Indinavir en el plasma circulante después de la administración oral (µg/ml) Ohr 2hr 4hr 6hr 8hr 12hr
Tableta 0 0 0 0 0 0 Formulación del Ejemplo 3 0 0 . 33 0 . 21 0 . 17 0 . 16 0 . 08 Formulación del Ejemplo 4 0 0 . 58 0 . 35 0 . 27 0 . 19 0 . 11
Ej emplo C Un sistema de suministro mucoadhesivo Gl que contiene interferon-a se preparó en una forma similar como en el Ejemplo A excepto que una solución de mterferon-a de 10,000,000 IU/ml se utilizó en lugar de la solución de G-CSF y 5,000,000 IU de interferon-a (0.5ml de solución) se administró por perro sabueso. Las concentraciones de interferon-a de suero se evaluaron en una forma similar como en el Ejemplo A. Los datos obtenidos se mostraron en la Tabla 4 siguiente.
Tabla 4 Concentración de Interferon de Suero (pg/ml) después de la administración Ihr 2hr 3hr 4hr 5hr
310±58 343±61 107+37 52+11 50±17
Ejemplo D Se disolvieron etilcelulosa (EC) (550 mg) y 150 µl de citrato del trietilo en 5 ml de una mezcla de cloruro de metileno y metanol (4:1) . La solución resultante se vació en una placa de Teflón de 9.0cm x 9.0cm para formar una película EC. La película EC se colocó sobre una estructura acrílica de J. Ocm x S.Ocm. Se disolvieron 100 mg de ácido poliacrílico, lg de HCO-60 y 2g de ácido cítrico en agua para preparar una solución de 10 ml de volumen total. -Se agregaron 1.5 ml de la solución así obtenida y 0.52 ml de una solución gue contiene 750 µg de antígeno p24 y 150 µg de toxina cólera en PBS. La muestra se almacenó durante la noche en un refrigerador para formar una película. Una película preparada por EudragitR L se adhirió a la misma, y entonces la película en capas resultante se cortó 15 piezas de tamaño similar, y cada pieza además se corto en l.Omm x l.Omm. La cara cortada se recubrió con polvos de silicato de magnesio y polvos finos de ácido esteárico. Aplicabilidad Industrial La técnica recombinante de gen tiene a gran escala
de varias proteínas y el péptido que tiene una actividad fisiológica útil, pero su ruta de administración se limitó a inyecciones. Concerniente al QOL (calidad de vida) de los pacientes, las formas de dosis son preparaciones preferiblemente orales. Sin embargo, la proteína y el péptido recibirá degradación hidrolítica en el lumen del tracto digestivo mediante el ácido gástrico, pepsina y enzimas proteolíticas del páncreas en el estómago e intestino. De acuerdo a la presente invención, un polímero insoluble en agua o una cera como la capa de protección previene el ataque de las enzimas proteolíticas en el lumen del trato digestivo. Además, el adhesivo (tal como polímero de poliacrilato) contenido en la capa portadora de fármaco tiene actividad inhibitoria contra las enzimas hidrolíticas, puede mostrar resistencia a la degradación hidrolítica provocada por las enzimas hidrolíticas que existen en la membrana mucosal del tracto digestivo. Además la formulación de varias enzimas hidrolíticas inhibitorias permiten la retención del efecto del fármaco más fuerte y más largo. Además, la biocapacidad del fármaco que es excretada contra el tracto digestivo después de la absorción puede ser mejorada. La ciclosporina y saquinavir, inhibidores de proteasa de los agentes anti-SIDA, son considerados para inhibir la biocapacidad baja debido a la re-excresión en el tracto digestivo mediante el P-gp expresado en las células
epiteliales del tracto digestivo. Cuando un inhibidor P-gp en la preparación común es formulada, la inhibición de eficiencia puede ser lograda en el sitio de absorción de fármaco ya que, la preparación se mueve hacia abajo del tracto digestivo. Formulando el inhibidor P-gp en la formulación DDS tipo parche oralmente disponible de la presente invención se vuelve posible al retener un inhibidor transportador excretivo en un sitio de adhesión sobre un largo periodo de tiempo, y mejora la biocapacidad del fármaco. Además, los antfi-agentes oralmente administrados pueden ser completamente absorbidos, y no pueden lograr satisfactoriamente la inmunización. De acuerdo a la presente invención, las vacunas orales pueden también ser desarrolladas lo cual logra una absorción eficiente de antígenos y mejora una eficiencia de inmunización.