MXPA01001913A

MXPA01001913A - Metodo para el analisis de acidos nucleicos para variaciones nucleotidas.

Info

Publication number: MXPA01001913A
Application number: MXPA01001913A
Authority: MX
Inventors: Paul A Dahlhauser
Original assignee: Genetic Assays Inc
Priority date: 1998-08-20
Filing date: 1999-08-18
Publication date: 2002-04-24
Also published as: EP1105540B1; JP2010063469A; CA2340306C; JP2002523063A; US6610486B1; EP1105540A1; CN100408692C; AU774357B2; WO2000011222A1; JP4663118B2; AU5780599A; CA2340306A1; CN1324410A; US6150105A

Abstract

La presente invencion proporciona un metodo de deteccion de la variacion nucleotida en un primer acido nucleotido, que comprende la generacion de un equipo de productos de extension de un primer acido nucleico en la presencia de bases nucleotidas modificadas, en donde los productos de extension incorporan nucleotidos modificados y por lo tanto limitan la actividad exonucleasa en la base nucleotida 3'-terminal y en donde los productos de extension tienen longitudes variable, hibridando los productos de extension de longitud variable a un acido nucleico de referencia, contactando los acidos nucleicos de hibridacion con una enzima que puede remover y reemplazar el nucleotido 3'-terminal de los productos de extension en la presencia de nucleotidos etiquetados seleccionados, en donde los productos de extension que terminan con un nucleotido 3' que no hibrida con la posicion correspondiente en el acido nucleico de referencia se reemplaza con uno o mas nucleotidos que hibridan con los nucleotidos correspondientes en el acido nucleico de referencia y en donde aquellos productos de extension que tienen un nucleotido de no-hibridacion en el termino 3' puede ahora distinguirse de aquellos productos de extension que tienen un nucleotido de hibridacion en el termino 3' y distinguiendo aquellos productos de extension que tienen un nucleofido de no-hibridacion en su termino 3' de aquellos productos de extension que tienen un nucleotido de hibridacion en su termino 3', de esta manera detectando la variacion nucleotida en el primer acido nucleico. Tambien se proporcionan alternativas de este metodo que tambien pueden detectar mutaciones en un acido nucleico en la penultima posicion 3'-terminal en los productos de extension enhebrados individualmente.

Description

MÉTODO PARA EL ANÁLISIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS PARA VARIACIONES NUCLEÓTIDAS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención Esta invención se relaciona al campo de la detección de las variaciones nucleótidas en un ácido nucleico. Más particularmente, la invención se refiere a métodos de detección de las variaciones nucleótidas en un ácido nucleico mediante la generación de copias de longitud variable de un ácido nucleico de una muestra, hibridando aquellos ácidos nucleicos generados para los ácidos nucleicos de referencia y detectar la presencia o ausencia de las variaciones nucleótidas en la posición 3'-terminal o la penúltima posición 3' en los ácidos nucleicos de longitud variable.

Arte Previo El número de enfermedades que están relacionadas a las mutaciones de genes continúa incrementando a medida que la secuencia del genoma humano se aclara. La secuencia del ácido nucleico es el último estándar para la detección de las variaciones de nucleótidos. La secuencia de ácido nucleico está bien adaptada para detectar mutaciones desconocidas o polimorfismos que pueden ocurrir en cualquier base en un segmento del ácido nucleico blanco. La química de la secuencia de ADN enzimática, el método más comúnmente usado, continua siendo esencialmente la misma desde su concepción (Sanger et al., Proc. Nati. Sci. E.U.A. 74, 5463 (1977)). La técnica se ha mejorado mediante la tecnología que ha permitido su automatización tal como la introducción de tintes fluorescentes, sistemas electroforéticos mejorados con detección automática. Sin embargo, si las variaciones genéticas ocurren en una baja frecuencia en la población muestra, la automatización llega a un costo que es muy alto para la mayoría de los laboratorios. Incluso en un modo manual, la secuencia puede ser un costo prohibitivo debido a su intensa mano de obra. Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de un proceso simple no costoso para la detección de los ácidos nucleicos desde las variaciones nucleótidas desconocidas antes de la secuencia.

La necesidad en la técnica es evidente por el número de métodos siendo desarrollados para la detección de mutaciones desconocidas. El polimorfismo de conformación de hebra individual (SSCP) detecta mutaciones en una muestra desconocida mediante la comparación de su velocidad de migración en un estado enhebrado individual en una muestra conocida en un gel de no desnaturalización, como se describe por Orita et al., Genomics, 5:874-879 (1989). Los cambios en la secuencia nucleótida afectan la estructura secundaria o la conformación de una molécula de ADN que puede alterar su velocidad de migración durante la electrofóresis. Esta técnica, sin embargo, se limita a blancos pequeños menores de 200 bp, tiene sensibilidad limitada y requiere condiciones rígidas de electrofóresis para ser reproducible. Las mejoras en el análisis SSCP tales como la huella molecular, unidireccional (Sarkar et al., Genomics, 13:441-443 (1992)) y bidireccíonal (Liu et al., Hum. Mol. Genet., 5:107-114 (1996)) y la huella molecular de endonucleasa de restricción (Liu y Sommer, Bioctechniques, 18:470-477 (1995)) puede detectar mutaciones en un espacio de 1 kb pero sacrifica la sensibilidad por naturalidad dado que el diseño complejo de las bandas de ADN generadas por estos procesos hace difícil detectar rápidamente las mutaciones.

Otro método que se usa para la detección de variaciones nucleótidas en un ácido nucleico se basa en la movilidad diferencial de las moléculas heterodúplex puesto que emigran a través de la matriz de gel. En esta forma más simple llamada análisis heterodúplex, un segmento ADN no caracterizado, usualmente una amplificación o producto PCR se mezcla con el segmento de tipo no cultivado correspondiente, calentado y re-naturalizado lentamente, como se describió por Nagamine et al., (Am. J. Hum. Genet., 45, 337-339 (1989)). Si el ácido nucleico no caracterizado tiene una secuencia diferente a la secuencia de tipo no cultivado, se forman moléculas heterodúplex. Las desigualdades de base en el heterodúplex alteran su velocidad de migración permitiendo ser resueltas parcialmente del homodúplex en un gel no-desnaturalizado.

Un planteamiento más sensible llamado electrofóresis de gel de gradiente desnaturalizado (DGGE) sujeta las moléculas heterodúplex para incrementar los niveles de desnaturalización en un formato de gel de gradiente, como primero se describió por Fisher y Lerman. (Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 80:1579-1583 (1983)). A medida que las moléculas heterodúplex emigran a través de la desnaturalización, ellas empiezan a ser fusionadas o desnaturalizadas. En este primer punto, la migración es lenta y no es más lineal. El punto de fusión es ligeramente diferente para las moléculas homodúplex, permitiendo la resolución parcial de las moléculas heterodúplex. El control preciso de la resistencia del campo, la temperatura y el tiempo son críticos para lograr los resultados reproducibles y dificultan la reproducción común.

Con la electrofóresis de gel de desnaturalización constante (CDGE), estas variables son menos puesto que la concentración de desnaturalizante es la misma en todo el gel (Hovig et al., Mut. Res., 262:63-71 (1991)). Una limitante significante de esta técnica es que un segmento de ácido nucleico puede tener más de un dominio de fusión para los cuáles deberán correrse geles separados en diferentes concentraciones desnaturalizantes.

La electrofóresis de gel de gradiente a temperatura temporal (TTGE) intenta resolver este problema mediante incrementar gradualmente la temperatura durante la electrofóresis, tal como se describió por Borresen et al. (Bioradiations, 99:12-113 (1997)). Esta es una técnica de híbridos entre CDGE y la electrofóresis de gel de gradiente de temperatura que usa solamente temperatura como un desnaturalizante (Rosenbaum y Riesner, Biophys. Chem., 26:235-246 (1987)). Como se esperaba, sin embargo, esta técnica es también difícil de realizar y también difícil de producir.

Una técnica introducida recientemente llamada análisis de secuencia de excisión de base (BESS) mejora en la huella molecular dideoxi con ddTTP mediante obviando la necesidad de una reacción de secuencia separada (Epicentre Technologies, Madison, Wl.). El blanco de interés se amplifica mediante PCR usando un iniciador etiquetado y una cantidad limitante de dUTP. Después de la amplificación, los productos se tratan con glicosilasa ADN de uracilo para penetrar en los sitios uracilos. La electrofóresis de gel de desnaturalización de los fragmentos posteriormente produce una escalera casi idéntica a una escalera de secuencia T dideoxi. La técnica es útil para el análisis de segmentos de ADN arriba de 1 kb para las mutaciones, pero se limita mediante la resolución de la electrofóresis de gel y no detecta C en las transversiones C o viceversa.

Otra técnica recientemente introducida usa una endonucleasa de estructura específica llamada cleavasa para digerir las estructuras intra-enhebradas y producir polimorfismos de longitud de fragmento (CFLP) y se describe por Brow et al., J. Clin. Microbiol., 34:3129-3137 (1996). Las estructuras se crean mediante desnaturalizar un segmento de ADN y posteriormente enfriarlo rápidamente a temperatura de digestión y agregar la enzima. El patrón de plegado para un segmento dado puede alterarse mediante las variaciones de secuencia que en la digestión con la enzima produce un patrón de banda único en un gel de desnaturalización. Esta técnica, sin embargo, está severamente limitada mediante la resolución de la electrofóresis de gel y el patrón del diseño de las bandas de ADN generadas mediante el proceso que hace difícil la detección de mutaciones.

La detección de mutaciones mediante penetración enzimática o química de las desigualdades en ADN heterodúplex se ha descrito por Noack et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A., 83:586-590 (1986), Cotton et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A., 85:4394-4401 (1988), Cotton et al., Pat. de E.U.A. No. 5,202,231 , (Winter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 82:7575-7579 (1989), Myers et al., Science, 230 :1245-1246 (1985)), (Lu y Hsu, Genomics, 14 :249-255 (1992)) y la Pat. De E.U.A. No. 5,698,400. Muchas de estas técnicas están limitadas mediante la inhabilidad de los reactivos de penetración para reconocer todos los tipos de desigualdades de pares de base y para otros esto puede superarse mediante el análisis de ambas hebras de un segmento de ADN. A la fecha, el uso generalizado de estas técnicas no se ha observado, en parte debido a que requieren reactivos altamente tóxicos y los procedimientos son difíciles de realizar.

La miniaturización del proceso de hibridación del ADN en una superficie sólida pequeña, conocida como una micro formación o chip de ADN, permite el análisis de segmentos de ADN sin la electrofóresis de gel. Ver Macevicz, Pat. de E.U.A. No. 5,002,867, Drmanac, Pat. de E.U.A. No. 5,202,231 , Lipshutz et al., Biotecniques, 9(3):442-447 (1995) y Chee et al., Science, 274:610-614 (1996). La solución de ia electrofóresis de gel, sin embargo, limita estrictamente el tamaño del segmento de ADN que puede analizarse por todas las tecnologías de detección de mutación antes mencionadas incluyendo la secuencia de ADN y el alto costo del equipo y los chips usados en este proceso limita su amplio extensión de uso.

La presente invención proporciona mejoras necesarias en éstos métodos del arte previo mediante proporcionar métodos que puedan detectar todas las posibles variaciones de base incluyendo las sustituciones de base múltiple y simple, inserciones y eliminaciones. Estas variaciones pueden ocurrir en uno o más sitios y afectar uno o más nucleótidos en cada sitio para un punto dado. En segundo lugar, como un proceso de análisis, éstos métodos proporcionan un resultado negativo o positivo claro. En tercer lugar, el proceso no se limita mediante la resolución de la electrofóresis de gel y por lo tanto permite el análisis de los segmentos de ADN mayores de 1 kb en tamaño. Por último, mediante vía la eliminación de la detección electroforética, es altamente responsable para la automatización y por lo tanto apropiado para el análisis de alto volumen.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN De conformidad con el (los) propósito (s) de esta invención, así incorporado y ampliamente descrito en este documento, esta invención, en un aspecto, se refiere a un método de detección de variaciones nucleótidas en un primer ácido nucleico, que comprende la generación de un juego de productos de extensión enhebrada individualmente de un primer ácido nucleico en la presencia de bases nucleótidas modificadas y por lo tanto limita la actividad exonucleasa a la base nucleótida 3'-terminal y en donde los productos de extensión tienen longitudes variables, hibridando los productos de extensión de longitud variable a un ácido nucleico de referencia, contactando los ácidos nucleicos de hibridación con una enzima que puede remover y remplazar al nucleótido 3'-terminal de los productos de extensión en la presencia de nucleótidos etiquetados seleccionados, en donde los productos de extensión que terminan con un nucleótido 3' que no híbrida con la posición correspondiente en el ácido nucleico de referencia se reemplazan con un nucleótido que híbrida con el nucleótido correspondiente en el ácido nucleico de referencia y en donde estos productos de extensión que tienen un nucleótido de no-hibridación en el término 3' puede ahora distinguirse de aquellos productos de extensión que tienen un nucleótido de hibridación en el término 3', distinguiéndose de aquellos productos de extensión que tienen un nucleótido de hibridación en su término 3', por lo tanto detectando la variación nucleótida en el primer ácido nucleico.

La invención también proporciona un método de detección en la presencia de un primer ácido nucleico de una variación nucleótida, comprendiendo la generación de un juego de productos de extensión enhebrada individualmente en la presencia de bases nucleótidas modificadas, en donde los productos de extensión incorporan nucleótidos modificados que limitan la actividad exonucleasa a la base nucleótida 3'-terminal y en donde los productos de extensión tienen longitudes variables, hibridando los productos de longitud variable a un ácido nucleico de referencia, contactando los ácidos nucleicos de hibridación con una enzima que puede remover y reemplazar el nucleótido 3'-terminal de los productos de extensión en la presencia de un nucleótido modificado seleccionado que es resistente al reemplazo adicional y cuando incorporado en un producto de extensión inhibe además la extensión del producto de extensión, en donde los productos de extensión que terminan en un nucleótido no modificado puede ser además extendido y por lo tanto distinguido de aquellos productos de extensión que no pueden ser extendidos adicionalmente, removiendo el nucleótido modificado seleccionado no incorporado, extendiendo aquellos productos de extensión que pueden ser además extendidos, distinguiendo aquellos productos de extensión que además se extienden de aquellos productos de extensión que no pueden extenderse adicionalmente, de esta manera detectando la variación nucleótida en el primer ácido nucleico.

La invención además proporciona un método de detección de variaciones nucleótidas en un primer ácido nucleico, comprendiendo la generación de un juego de productos de extensión enhebrada individualmente en la presencia de bases nucleótidas modificadas y bases nucleótidas de terminación en cadena de un primer ácido nucleico, en donde los productos de extensión incorporan nucleótidos modificados que limitan la actividad exonucleasa en la base nucleótida 3'-terminal y en donde los productos de extensión tienen longitudes variables, hibridando los productos de extensión de longitud variable a un ácido nucleico de referencia, contactando los ácidos nucleicos de hibridación con una enzima que puede remover y reemplazar el nucleótido 3'-terminal de los productos de extensión en la presencia de trifosfatos deoxinucleótidos, en donde el penúltimo nucleótido 3' es resistente a la remoción de los productos de extensión, en donde los productos de extensión que contienen un penúltimo nucleótido 3' que no híbrida con la posición correspondiente en el ácido nucleico de referencia no se reemplaza con un nucleótido que híbrida con el nucleótido correspondiente en el ácido nucleico de referencia y por lo tanto no puede ser extendido adicionalmente, extendiendo aquellos productos de extensión que pueden ser extendidos adicionalmente, distinguiendo aquellos productos de extensión que se extienden adicionalmente de aquellos productos de extensión que no pueden extenderse adicionalmente, de esta manera detectando la variación nucleótida en el primer ácido nucleico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra un diagrama esquemático para el método de detección de la extensión de reacción de intercambio del modelo de extensión de base individual, en donde: I = Iniciador PO-MU = Positivo-Mutante A = Polimerasa EX = Extensión seguida por purificación AC = Polimerasa correctora PA = Plantilla sin secuencia PB = Plantilla secuenciada PEN = Iniciadores extendidos con término 3' igualado normal PEM = Iniciadores extendidos con término 3' mutante desigual NE-NO = Negativo-Normal I = Generación de dideoxi-productos de extensión de una plantilla sin secuencia II = Intercambio con una plantilla secuenciada III = Corrección y extensión IV = Detección de la etiqueta La Figura 2 muestra un diagrama esquemático para el método de detección de la extensión, en donde: V = Corrección y extensión del término 3' igualado VI = Corrección del término 3' desigual Vil = Remoción del a-tio ddATP seguida por extensión. La Figura 3 muestra un diagrama esquemático para el método de detección de la reacción de extensión de intercambio del modelo de no-extensión usando términos exo-resistentes, en donde: DE = Digestión exonucleasa seguida por purificación A' = Iniciador de extensión en una plantilla sin secuencia B' = Extensión C = Electrofóresis con gel de desnaturalización P' = Producto de extensión de longitud completa MB = Hebra mutante La Figura 4 muestra un diagrama esquemático para el método de detección de reacción de la extensión de intercambio del modelo de no-extensión usando dideoxinucleótidos incorporados en los términos 3'.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente ¡nvención podrá entenderse más rápidamente mediante la referencia de la descripción detallada siguiente de las modalidades preferidas de la ¡nvención y los Ejemplos incluidos en este documento.

Se han descrito anteriormente los métodos y compuestos presentes, se entiende que esta invención no se limita a ácidos nucleicos específicos, nucleótidos de terminación en cadena, enzimas de edición, enzimas de amplificación y/o extensión, porciones detectables y otros reactivos usados en los métodos descritos en este documento, los cuales por supuesto pueden variar. También se entiende que la terminología usada en este documento es para propósitos de describir solamente las modalidades particulares y no es limitante.

Se anotará que, como se usa en la especificación y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto imponga claramente su uso de otra manera. De esta manera, por ejemplo, con referencia a "un ácido nucleico" incluye copias múltiples del ácido nucleico y también puede incluir más de una especie particular de moléculas.

En un aspecto, la invención se refiere a un método de detección de variaciones nucleótidas en un primer ácido nucleico, comprendiendo la generación de un juego de productos de extensión enhebrada individualmente en la presencia de bases nucleótidas modificadas en donde los productos de extensión incorporan nucleótidos modificados y por lo tanto limita la actividad exonucleasa de la base nucleótida 3'-terminal y en donde los productos de extensión tienen longitudes variables, hibridando los productos de extensión de longitud variable a una referencia de ácido nucleico, contactando los ácidos nucleicos de hibridación con una enzima que puede remover y reemplazar el nucleótido 3'-terminal de los productos de extensión en la presencia de nucleótidos etiquetados seleccionados, en donde los productos de extensión que terminan con un nucleótido 3' que no hibrida con la posición correspondiente en el ácido nucleico de referencia se reemplazan con un nucleótido que hibrida con el nucleótido correspondiente en el ácido nucleico de referencia y en donde aquellos productos de extensión que tienen un nucleótido de no-hibridación en el término 3' ahora pueden distinguirse de aquellos productos de extensión que tienen un nucleótido de hibridación en el término 3', distinguiendo aquellos productos de extensión que tienen un nucleótido de no hibridación en su término 3' de aquellos productos de extensión que tienen un nucleótido de hibridación en su término 3', de esta manera detectando la variación nucleótida en el primer ácido nucleico.

La variación nucleótida como se usa en este documento se refiere a cualquier sustitución nucleótida en una o más posiciones en un ácido nucleico (el primer ácido nucleico) y cualquier inserción u omisión en una o más posiciones en un ácido nucleico y cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, un ácido nucleico puede tener una sustitución de base individual en una región que esta siendo probada, o que el ácido nucleico puede tener múltiples sustituciones base en la región o cualquier combinación de sustituciones base, inserciones y eliminaciones. La variación nucleótida como se usa en este documento también se refiere a cualquier nucleótido que podría dar crecimiento a un fenotipo p genotipo alterado. Los métodos descritos en este documento pueden detectar la presencia de una sustitución base, una eliminación y una inserción y cualquier mutación que causa un nucleótido en un ácido nucleico para no hibridar con el nucleótido correspondiente en un separado ácido nucleico, al menos complementariamente parcial.

El primer ácido nucleico pude ser un ácido nucleico enhebrado doble o individualmente de una muestra, es decir, un paciente o muestra experimental y el ácido nucleico de referencia puede ser un ácido nucleico de referencia o estándar al cual el primer ácido nucleico se hibrida y/o compara. En los métodos descritos en este documento, uno o más hebras del primer ácido nucleico se usan para generar un juego de productos de extensión enhebrados individualmente que son al menos parcialmente resistentes a la actividad exonucleasa 3'?5' y que pueden contener opcionalmente un nucleótido de terminación en cadena o deoxinucleótido en su término 3' para generar un equipo de productos de extensión enhebrados individualmente de longitud variable.

La generación o aislamiento del primer ácido nucleico para usarse en la invención puede ser opcionalmente facilitada mediante amplificación de la región blanco mediante la clonación de la región de interés en un vector de replicación tal como un plásmido o un fago, para generar moléculas enhebradas doble o individualmente. Si el primer ácido nucleico se genera mediante la clonación del ácido nucleico, existen muchas técnicas conocidas para el aislamiento del ácido nucleico a partir del vector de clonación después de que el ácido nucleico en el vector de clonación se ha replicado, tal como el aislamiento fago, el aislamiento del plásmido vía lisis de bacteria después de la desnaturalización de las proteínas celulares y la centrifugación de los ácidos nucleicos o incluso la congregación de la densidad de los ácidos nucleicos fago o plásmido mediante centrifugación del gradiente de densidad.

Un experto en la técnica reconocerá que existen muchas otras técnicas de amplificación conocidas para la generación de copias de una o más hebras de un ácido nucleico tales como la reacción de cadena polimerasa (PCR). Otras técnicas de amplificación también pueden usarse para amplificar un ácido nucleico, sin embargo, el sistema de replicación de secuencia sostenida por si misma (3RS), el sistema de amplificación basada en la transcripción (TAS) y el sistema de replicación ARN se basan en la replicasa Qß. El producto de la amplificación, el primer ácido nucleico y/o el ácido nucleico de referencia puede por lo tanto ser un ADN ó un ARN enhebrado individualmente o de doble hebra. Si el producto de la amplificación es de doble hebra, las hebras individuales pueden aislarse mediante los métodos bien conocidos en la técnica, tales como el uso de iniciadores de amplificación enlazada biotina o la degradación selectiva de una hebra fosforilada usando exonucleasa lambda como lo describe Higuchi y Ochman, Nucleic Aclds Research, 17:5865 (1989). Métodos alternos para la producción de plantillas enhebradas individualmente también se conocen en la técnica como PCR asimétrica (Ausbel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York (1987))y captura de fase sólida (Holtman et al., Nucleic Acids Research, 17:4937-4946 (1989)). Si el producto del procedimiento de amplificación es un ARN, ADN puede generarse de ese ARN usando técnicas bien conocidas en la técnica tales como el uso de transcriptasa inversa.

* Si el primer ácido nucleico para uso en los métodos descritos en este documento se ha amplificada o si el primer ácido nucleico se obtuvo directamente, tal como de una muestra de un paciente o cualquier otra muestra experimental, ese ácido nucleico posteriormente se usa como una plantilla para generar un juego de productos de extensión enhebrados individualmente de longitud variable. Por ejemplo, un dideoxinucleótido de terminación en cadena puede usarse en la reacción de manera que el juego resultante de los productos de extensión enhebrados individualmente contiene productos de extensión enhebrados individualmente que terminan en cada posición en donde el dideoxinucleótido se incorpora. Preferiblemente, el juego de productos de extensión enhebrados individualmente de longitud variable en esta modalidad contendría al menos un producto de extensión enhebrado individualmente que incorpora un dideoxinucleótido en cada posición disponible para esas especies particulares de dideoxinucleótido, es decir, una "escalera de secuencia". La generación de escaleras de secuencia es bien conocida en la técnica y puede lograrse con equipos de secuencia comercialmente disponibles. En una modalidad preferida de la presente invención, la escalera de secuencia se genera mediante la secuencia de ciclo térmico para generar una pluralidad de escaleras de secuencia correspondientes al primer ácido nucleico para facilitar la detección posterior de aquellos productos de extensión enhebrados individualmente que tienen el nucleótido 3'-terminaI que hibrida a un nucleótido en la posición correspondiente en un ácido nucleico de referencia o un nucleótido 3'-terminaI que no hibrida a un nucleótido en la posición correspondiente de un ácido nucleico de referencia.

Alternativamente, el juego de productos de extensión enhebrados individualmente de longitud variable pueden generarse mediante diferentes procedimientos. Por ejemplo, los productos de extensión enhebrados individualmente pueden generarse mediante la extensión del la primera secuencia sin los nucleótidos de terminación de cadena presentes en la mezcla de reacción, pero donde los deoxinucleótidos pueden estar presentes en una cantidad suficiente para sintetizar un juego de productos de extensión enhebrados individualmente que corresponden a la longitud total del primer ácido nucleico, pero que posteriormente se usan para generar un juego de productos de extensión enhebrados individualmente de longitud variable a través de la degradación terminal parcial de los productos de extensión enhebrados individualmente, por ejemplo, usando exonucleasa I ó lll o Polimerasa ADN T4 en la ausencia de o una cantidad limitante de deoxinucleótidos. Un experto en la técnica apreciará que la técnica particular o técnicas usadas para generar el juego de productos de extensión enhebrados individualmente pueden variar.

Un experto en la técnica también reconocerá que la generación del juego de productos de extensión enhebrados individualmente requerirá un iniciador para que proceda la reacción de extensión. El iniciador puede ser interno, tal como la hibridación de una región 3' a la región 5' de la misma molécula o el iniciador puede ser externo, tal como el uso de un iniciador sintético que puede hibridar a un sitio preferido o sitios en el primer ácido nucleico.

El primer ácido nucleico, los productos de extensión enhebrados individualmente y el iniciador pueden modificarse tal como mediante siendo enlazados a otra molécula tal como biotina, digoxigenina, un hapteno, un anticuerpo, una enzima u otra porción que puede facilitar el aislamiento y/o detección de las moléculas. Como se describe en la sección de Ejemplos en este documento, un iniciador puede enlazarse a la biotina y el juego de productos de extensión enhebrados individualmente producidos como resultado de reacciones de extensión usando ese iniciador modificado pueden aislarse del primer ácido nucleico y los otros componentes de la reacción de extensión usando lechos magnéticos cubiertos con estraptavidina.

Opcionalmente, el primer ácido nucleico modificado, los productos de extensión enhebrados individualmente y/o el iniciador pueden purificarse o aislarse de una mezcla de reacción y/u otros ácidos nucleicos mediante su enlace a un soporte sólido. Por ejemplo, un ácido nucleico complementario a al menos una porción de un iniciador usado en la reacción de extensión puede enlazarse a un soporte sólido, tales como lechos usados en la cromatografía de columna y después de que el iniciador se ha extendido, esa mezcla de reacción puede calentarse para desnaturalizar los productos de extensión lejos del primer ácido nucleico y esa mezcla pasa a través de la columna bajo condiciones de manera que los productos de extensión hibriden a un ácido nucleico enlazado a los lechos y no al primer ácido nucleico y en donde los productos de extensión son por lo tanto purificados del primer ácido nucleico. Por ejemplo, el iniciador puede comprender la secuencia complementaria al primer ácido nucleico y también tener una región 5' comprendiendo una secuencia no complementaria al primer ácido nucleico, tal como una región poli(C). El ácido nucleico enlazado a los lechos posteriormente puede comprender un poli (G) que puede hibridar a la región poli(C) bajo condiciones de manera que el producto de extensión no hibride al primer ácido nucleico. Un experto en la técnica reconocerá que existen muchos otros ejemplos de procedimientos usados para separar una hebra de una reacción de extensión de su hebra complementaria o parcialmente complementaria y los métodos descritos en este documento no están limitados a ningún procedimiento de purificación, separación y aislamiento.

Alternativamente, un primer iniciador usado para generar productos de extensión enhebrados individualmente pueden fosforilarse en el extremo 5' para permitir la degradación subsecuente de la hebra fosforilada con exonucleasa lambda como lo describe Higuchi y Ochman (Nucleic Acids Research, 17:5865 (1989)). Métodos alternativos para la producción de plantillas enhebradas individuamente también se conocen en la técnica tales como la PCR asimétrica (Ausbel, et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York (1987)) y la captura de fase sólida (Hotman et al., Nucleic Acids Research, 17:4937-4946 (1989)).

Los productos de extensión enhebrados individualmente se generan típicamente en la presencia de la menos un tipo de nucleótido modificado que se usa en la generación de la reacción y de este modo incorporados en los productos de extensión enhebrados individualmente, de manera que los productos de extensión enhebrados individualmente son al menos parcialmente resistentes a la actividad exonucleasa 3'?5'. La función principal de los nucleótidos modificados después de a incorporación como un nucleótido es limitar la actividad exonucleasa 3'?5' subsecuente al dideoxinucleótido 3'. Estos nucleótidos modificados son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no están limitados a trifosfatos deoxinucleótidos tio-modificados y trifosfatos deoxinucleótido modificados con borano (Eckstein y Gish, Trends in Biochem, Sci., 14:97-100 (1989) y Porter Nucleic Acids Research, 25: 1611 -1617 (1997)).

Después de que el juego de productos de extensión enhebrados individualmente de longitud variable se han generado y aislado opcionalmente del primer ácido nucleico, los productos de extensión enhebrados individualmente posteriormente se hibridan a un ácido nucleico de referencia. Este ácido nucleico de referencia puede ser un ácido nucleico que típicamente se considera de "tipo no cultivado" para un gen en particular o porción de un gen incluyendo las regiones reguladoras y estructurales del gen. Por ejemplo, el ácido nucleico de referencia puede ser un ácido nucleico que se conoce por ser un punto para mutaciones en o un gen particular que cuando mutado, típicamente da lugar a un fenotipo alterado o enfermedad en un individuo. Alternativamente, las mutaciones pueden resultar en un fenotipo diferente que se considera benéfico, tal como una especie bacterial siendo ahora capaz de desintoxicar una toxina. Cualquier mutación se contempla para ser detectada mediante los métodos descritos en este documento y la identidad específica de la mutación no limita la aplicabilidad de éstos métodos.

Adicionalmente, el ácido nucleico de referencia puede aislarse, generarse, sintetizarse o amplificarse para uso en los métodos descritos en este documento mediante cualesquiera de los métodos descritos en la técnica puesto que el ácido nucleico de referencia también no es limitante de los métodos presentes.

Las condiciones precisas de las hibridaciones, por supuesto, variarán dependiendo de la secuencia específica del ácido nucleico de referencia y el primer ácido nucleico. Las condiciones específicas son rápidamente obtenibles mediante un experto en la técnica y las condiciones de hibridación típicas y las condiciones de optimización están disponibles a partir de una amplia variedad de referencias fuente. Por ejemplo, Innis et al ("PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" Academic Press, Inc. 1990) y Erlich, H.A. (PCR Technology, Principies and Applications for DNA Amplification) ambas describen condiciones estándares de hibridación para la amplificación del ácido nucleico y Sambrook et al. ("Molecular Cloning, a Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) establece métodos generales para hibridaciones de ácido nucleico típicas y procedimientos de optimización para éstos métodos. Opcionalmente, la condición de hibridación específica para la hibridación entre los productos de extensión enhebrados individualmente y los ácidos nucleicos de referencia es que la actividad de una enzima que puede remover y reemplazar el nucleótido 3'-terminal del producto de extensión enhebrado individualmente puede retenerse y típicamente ampliamente activo y específico.

Después de que los productos de extensión enhebrados individualmente se han hibridado a los ácidos nucleicos de referencia, una enzima que puede remover y reemplazar el nucleótido 3'-terminaI de los productos de extensión (es decir, una enzima "correctora") se agrega a éstos híbridos. En una modalidad de la presente invención, esta reacción puede llevarse a cabo en la presencia de un nucleótido con terminación en cadena y si el nucleótido 3'-terminal híbrida al ácido nucleico de referencia, ese nucleótido 3'-terminal se reemplazará con un nucleótido con terminación en cadena de la misma identidad (Fig. 1). Donde el nucleótido 3'-terminal del producto de extensión no híbrida al ácido nucleico de referencia, tal como en donde el nucleótido 3'-terminal de la extensión representa una mutación en el primer ácido nucleico en esa posición particular, la enzima correctora removerá esta base desigual en el producto de extensión y la reemplazará con una base que híbrida al ácido nucleico de referencia y que puede detectarse.

La enzima correctora específica usada en los métodos descritos en este documento no se limita a una polimerasa ADN, pero incluye cualquier enzima o combinación de enzimas que pueden remover un nucleótido 3'-terminal y puede reemplazar ese nucleótido 3'-terminal con otro nucleótido de la misma o diferente identidad. Por ejemplo, la enzima correctora puede ser, por ejemplo, una polimerasa termoestable tal como Polimerasa ADN Vent®, Polimerasa ADN Deep Vent®, Polimerasa I ADN E.coli, Polimerasa I ADN Fragmento Klenow, Polimerasa ADN T4, Polimerasa ADN T7, Polimerasa ADN Ultima® y Polimerasa ADN Pfu®. Alternativamente, la enzima que remueve el nucleótido 3'terminal puede ser exonucleasa tal como exonucleasa MI É. Co/ o exonucleasa I usada en combinación con una polimerasa tal como Polimerasa ADN T4, para lograr efectivamente el mismo resultado con una etapa adicional. Alternativamente, una enzima polimerasa no-correctora puede usarse en los métodos descritos en este documento. La inhabilidad de una polimerasa no-correctora para extender una irregularidad es bien conocida en la técnica y es la base de los sistemas de mutación refractaria de amplificación y PCR específica de alelo (ARMS). Ver Wu et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 86:2757-2760 (1989) y Newton et al., Nucleic Acids Res., 17:2503-2516 (1989).

El nucleótido que se incorpora en el producto de extensión que tiene un nucleótido 3'-terminal que no hibridó al ácido nucleico de referencia puede comprender un nucleótido que puede detectarse en la presencia de nucleótidos que tienen la misma identidad como el nucleótido 3'-terminal de los productos de extensión en donde el nucleótido 3'-terminal hibridado inicialmente al ácido nucleico de referencia. Por ejemplo, en donde la reacción de extensión se realiza en la presencia de un nucleótido con terminación en cadena correspondiente a dATP, la reacción de reemplazo/excisión donde el nucleótido 3'-terminal que no híbrida al ácido nucleico de referencia se reemplaza por un nucleótido que híbrida al ácido nucleico de referencia puede realizarse en la presencia de dGTP, dCTP y dTTP radio-marcado. En este ejemplo, en donde cualquiera de los nucleótidos dTTP, dCTP y dGTP radio-marcados se incorporan en el producto de extensión, ese producto puede detectarse mediante la presencia de radioactividad. Además, la reacción puede contener un control interno, tal como un nucleótido diferentemente etiquetado, tal como 35S-sATP o dATP fluorescente en este ejemplo, en donde esa etiqueta puede incorporarse en el producto de extensión enhebrado individualmente que tiene un nucleótido 3' que híbrida a la posición correspondiente en el ácido nucleico de referencia, de manera que se pueda monitorear la reacción para la actividad, especialmente en el caso de que pocas o ninguna mutación se detecten, puesto que estos productos de extensión que tiene un nucleótido de hibridación en su nucleótido 3'-terminal y aquellos que tienen un nucleótido de no-hibridación en el nucleótido 3'-terminal pueden detectarse y también distinguirse. Alternativamente, la etiqueta puede ser solamente incorporada en el producto de extensión que tiene un nucleótido de hibridación en su posición nucleótida 3'-terminal.

La etiqueta específica que se usa para detectar la presencia de una mutación puede, por supuesto variar. Por ejemplo, la etiqueta puede comprender una radio marca, una etiqueta fluorescente, una etiqueta luminiscente, un anticuerpo enlazado a un nucleótido que puede detectarse subsecuentemente, un hapteno enlazado a un nucleótido que puede detectarse subsecuentemente u cualquier otro nucleótido o nucleótido modificado que puede detectarse directamente o indirectamente. Por lo tanto el método o métodos específicos usados para distinguir entre los productos de extensión enhebrados individualmente que tienen un nucleótido 3'-terminal que hibridan al ácido nucleico de referencia y los productos de extensión enhebrados individualmente que tiene un nucleótido 3'-terminal que no hibridan al ácido nucleico de referencia variarán dependiendo de la etiqueta específica que se usa en los métodos descritos en este documento. Por ejemplo, si el nucleótido etiquetado es un nucleótido radio marcado, el método de detección puede comprender conteo por centelleo o exposición de los productos de reacción para cubrir con una capa, los cuales cuando se desarrollan pueden distinguirse entre los ácidos nucleicos etiquetados y los ácidos nucleicos no etiquetados.

También se proporciona mediante la presente invención un método de detección en la presencia de un primer ácido nucleico de una variación nucleótida, comprendiendo la generación de un juego de productos de extensión enhebrados individualmente del primer ácido nucleico en la presencia de bases nucleótidas modificadas, en donde los productos de extensión incorporan nucleótidos modificados que limitan la actividad exonucleasa de la base nucleótida 3'-terminal y en donde los productos de extensión tienen longitudes variables, hibridando a los productos de extensión de longitud variable a un ácido nucleico de referencias, contactando los ácidos nucleicos de hibridación con una enzima que puede remover y reemplazar el nucleótido 3'-terminal de los productos de extensión en la presencia de un nucleótido modificado seleccionado el cual es resistente al reemplazo adicional y cuando se incorpora en un producto de extensión inhibe además la extensión de los productos de extensión, en donde los productos de extensión que terminan con un nucleótido no modificado pueden ser además extendidos y por lo tanto distinguirse de aquellos productos de extensión que no pueden extenderse adicionalmente, removiendo el nucleótido modificado seleccionado no incorporado, extendiendo aquellos productos de extensión que pueden extenderse adicionalmente, distinguiendo aquellos productos de extensión que se extienden adicionalmente de aquellos productos de extensión que no pueden extenderse adicionalmente, de esta manera detectando la variación nucleótida en el primer ácido nucleico.

Este método particular se basa en la habilidad de una polimerasa correctora para reemplazar un nucleótido con terminación en cadena de terminal de igualación tal como un dideoxinucleótido con un nucleótido con terminación en cadena modificado que es resistente a la actividad exonucleasa 3'?5' en una reacción "suicida" o irreversible. Los productos de extensión enhebrados individualmente de longitud variable generados de un primer ácido nucleico se mezclan con una platilla conocida o un ácido nucleico de referencia para formar un híbrido estable. El híbrido se expone a una polimerasa correctora o en una reacción equivalente del mismo como se describió anteriormente, en la presencia de un nucleótido de terminación en cadena que es resistente a la actividad exonucleasa 3'?5' adicional, tal como un a-tio-dideoxinucleótido, que es la base equivalente de la base 3' terminal de los productos de extensión, bajo condiciones apropiadas para la excisión del nucleótido 3'-terminal del producto de extensión y su reemplazo con el nucleótido con terminación en cadena que es resistente a la actividad exonucleasa 3'-»5' adicional (FIG. 2). Si el nucleótido 3'-terminal del producto de extensión híbrida a la posición correspondiente en el primer ácido nucleico, entonces ese nucleótido 3'-terminal se corta y se reemplaza con un nucleótido de terminación en cadena correspondiente que es resistente a la actividad 3'->5' adicional. La enzima polimerasa correctora no puede corregir más al nucleótido 3'terminal y también no puede extender la base terminal de igualación porque es un nucleótido de terminación en cadena. Si, sin embargo, el nucleótido 3'-terminal del producto de extensión enhebrado individualmente no híbrida al ácido nucleico de referencia (es decir, existe una igualación en la base terminal), la polimerasa de corrección cortará el nucleótido 3'terminal del producto de extensión enhebrado individualmente pero que no insertará un nucleótido de terminación en cadena en esa posición, debido, por ejemplo, un nucleótido de terminación en cadena que puede hibridar a la posición correspondiente en el ácido nucleico de referencia no esta presente en la mezcla de reacción. El producto de extensión corregido posteriormente puede extenderse adicionalmente y ese producto extendido detectado. De esta manera, los productos de extensión cuyo nucleótido 3'terminal es complementario a la posición correspondiente en el ácido nucleico de referencia puede terminarse irreversiblemente mientras que los productos de extensión cuyo nucleótido 3'-terminal no es complementario a la posición correspondiente en el ácido nucleico de referencia puede corregirse y listo para servir como iniciador para una reacción de extensión subsecuente que puede detectarse.

Para una reacción de extensión subsecuente, sería deseable remover el nucleótido de terminación en cadena que es resistente a la actividad exonucleasa 3'-»5' de la reacción. Esto puede lograrse mediante la adición a esa mezcla de reacción de una actividad que presenta el nucleótido de terminación en cadena que es resistente a la actividad exonucleasa 3'?5' adicional efectivamente incapaz de ser agregada adicionalmente al producto de extensión enhebrado individualmente, tal como fosfatasa alcalina de camarón que hidroliza el trifosfato en el nucleótido de terminación en cadena después del cual la enzima puede inactivarse térmicamente. Alternativamente, la plantilla y los productos de extensión pueden purificarse del nucleótido de terminación en cadena que es resistente a al actividad exonucleasa 3'?5' adicional mediante otros métodos bien conocidos para aquellos expertos en la técnica, tal como peso molecular o tamaño de la separación, enlace de los productos de extensión a un soporte sólido como se describió anteriormente y degradación selectiva de nucleótidos libres.

El iniciador de la reacción de extensión en este método puede detectarse mediante la incorporación de una etiqueta, como se describió anteriormente o indirectamente detectado, por ejemplo mediante la liberación de pirofosfato inorgánico como un resultado de la incorporación nucleósida mediada con polimerasa durante la síntesis del ADN. (Nyren, Anal. Biochem., 167:235-238 (1987)). Esta modalidad tiene una ventaja de permitir el monitoreo continuo de la actividad polimerasa con la reacción. Esta reacción particular puede iniciarse mediante agregar las bases de trifosfato nucleósido, D-luciferina, ATP sulfurilasa, luciferasa y un oligonucleótido que tiene la misma secuencia de una región en o cerca del extremo 5' de la plantilla conocida y que es capaz de preparar una reacción de extensión. Este oligonucleótido puede usarse para incrementar la sensibilidad de la prueba mediante preparación inversa de cualquier producto de extensión de longitud completa que se genera, que es particularmente importante cuando una mutación/desigualdad ocurre cerca del extremo 5' del ácido nucleico de referencia conocido ya que los nucleótidos relativamente pocos se agregarán antes de que se alcance el extremo de la plantilla. Para la detección luminométrica típica, ver Nyren et al., (Anal. Biochem., 244:367-373 (1997)). El uso de una luciferasa termoestable permitirá que ocurra la reacción de extensión a temperaturas más altas e incrementará la sensibilidad y la especificidad de la reacción. (Kaliyama y Nakano, Biosci. Biotechnol. Biochem., 58:1170-1171 (1994)).

• Otro ejemplo de un método para la detección de extensiones de iniciador de bases múltiples usa la Prueba de Nucleasa 5' Fluorogénica disponible en Perkin Elmer, Foster City, CA y como se describe por Holland et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 88, 7276-7280 (1991). Este método involucra el etiquetado de una prueba, referida como la prueba TaqMan®, con un reportero y tinte templador. La prueba puede ser específica para una secuencia interna en el ácido nucleico particular estando amplificado. Como la polimerasa ADN Taq extiende el iniciador de amplificación, encuentra la prueba TaqMan® y la degrada con su actividad exonucleasa 5'a 3'. La disociación del reportero del templador resulta en un incremento en la fluorescencia. La aplicación de este método a la detección de extensión de base múltiples requiere solamente la síntesis de una prueba TaqMan® complementaria a la secuencia 5' terminal de la plantilla conocida. Como con la detección bioluminométrica, este método permite el monitoreo continuo de la actividad polimerasa con la reacción. Una ventaja adicional es la alta sensibilidad y especificidad dado que la reacción puede realizarse a elevadas temperaturas en una reacción de termo-oscilación.

En una variación de este método, la etapa de extensión de aquellos productos de extensión que pueden ser extendidos adicionalmente antes de la etapa de detección pueden eliminarse donde la remoción del nucleótido modificado no incorporado puede comprender por si mismo una etapa que puede detectarse. Por ejemplo, donde la base 3'-terminal es un nucleótido para templar y la remoción de ese nucleótido permite la detección del ácido nucleico, la extensión del producto de extensión para incorporar una porción detectable no es necesaria para la etapa de detección subsecuente. Otro método alterno para la detección comprende la incorporación de un trifosfato deoxinucleósido modificado (dNTP) en el producto de extensión. Los ejemplos incluyen los dNTPs etiquetados de hapteno, fluorescentes y radioactivos. Un dNTP etiquetado fluorescente, por ejemplo, permite la detección no radioactiva directa. La sensibilidad de este método, como la detección bioluminométrica, se logra mediante el uso de un oligonucleótido que puede hibridar a una región en o cerca del extremo 5' de la plantilla conocida y que es capaz de preparar una síntesis de reacción de extensión de un primer ácido nucleico. Este método, como la Prueba Nucleasa 5' Fluorogénica tiene la ventaja de alta sensibilidad y especificidad dado que la reacción de extensión puede realizarse a elevadas temperaturas, tal como en una reacción termo-oscilación. Este método puede agregar una etapa adicional para remover cualquier etiqueta no incorporada, como se describió anteriormente, seguido por la detección directa o indirecta de la etiqueta incorporada. En una modalidad, la purificación de fase sólida puede usarse para capturar y purificar los oligómeros extendidos de cualquier dNTPs etiquetado fluorescente no incorporado seguido de detección fluorométrica.

Todavía otro método para distinguir aquellos productos de extensión enhebrados individualmente que tienen un nucleótido 3'-terminal que hibridan con el nucleótido en la posición correspondiente en el ácido nucleico de referencia de aquellos que tienen un nucleótido 3'-terminal que no híbrida con el nucleótido en la posición correspondiente en el ácido nucleico de referencia que comprende la separación de los productos del método para la presencia de los productos de extensión de longitud completa después de que la actividad correctora ha reemplazado el nucleótido 3'-terminal y además extendió el producto de extensión mediante, por ejemplo, la electrofóresis de gel de desnaturalización para visualizar las hebras individuales, ambas de longitud completa y aquellos que no son de longitud completa. En ciertas aplicaciones de la invención puede ser deseable amplificar una mutación que comprende un porcentaje pequeño del analito, tal como en la detección temprana del cáncer en donde solamente un poco de células malignas pueden estar presentes en el número total de células que están siendo analizadas. La amplificación selectiva del gen mutante, en donde la mutación ocurre en un sitio conocido, tal como el K-ras gen, se efectúa rápidamente mediante el diseño de iniciadores específicos para amplificar la mutación como se describe por Stork et al., (Oncogene, 6:857-862 (1991)). Sin embargo, la amplificación selectiva de una mutación aleatoria en un gen entre un alto porcentaje de los genes tipo sin cultivar no es posible mediante PCR estándar. En éstas aplicaciones, puede preferirse la amplificación selectiva de la plantilla mutante. Por consiguiente, los productos de extensión de la plantilla mutante se purifican de esa plantilla conocida e hibridan el ácido nucleico amplificado purificado de la muestra cuya secuencia es desconocida. El ácido nucleico amplificado puede purificarse de los iniciadores residuales antes de mezclarlos con los productos de extensión para prevenir la reamplificación de la plantilla de tipo no cultivado. El híbrido puede, por ejemplo, ser expuesto a una polimerasa termoestable y el dNTPs bajo condiciones termo-oscilación apropiadas para la polimerización de los productos de extensión. Los productos de extensión que son refractarios a la extensión en la plantilla conocida debido a su desigualdad 3'-terminal, ahora pueden hibridar a la platilla mutante de la cual se forman y se extienden mediante la polimerasa. Preferiblemente, uno de los dNTPs se etiqueta con un hapteno tal como digoxigenina, para permitir la captura de fase sólida de los productos de extensión. La captura de fase sólida de los productos de extensión etiquetados con hapteno seguida por la amplificación PCR estándar, con los iniciadores usados para la amplificación de blanco inicial, preferiblemente amplifica la plantilla que contiene la mutación. El producto PCR posteriormente puede secuenciarse mediante los métodos estándares para la identidad especifica de la posición precisa de la mutación o la variación nucleótida.

La presente invención también proporciona un método de detección de variaciones nucleótidas en un primer ácido nucleico, que comprende un juego de productos de extensión enhebrados individualmente del primer ácido nucleico en la presencia de bases nucleótidas modificadas y opcionalmente en la presencia de bases nucleótidas de terminación en cadena, en donde los productos de extensión incorporan nucleótidos modificados que limitan la actividad exonucleasa a la base nucleótida 3'-terminal y en donde los productos de extensión tienen longitudes variables, hibridando los productos de extensión de longitud variable a un ácido nucleico de referencia, contactando los ácidos nucleicos de hibridación con una enzima que puede remover o reemplazar el nucleótido 3'-terminal de los productos de extensión en la presencia de trifosfatos deoxinucleótidos en donde el penúltimo 3'-nucleótido es resistente para la remoción de los productos de extensión, en donde los productos de extensión contienen un penúltimo 3'-nucleótido que no híbrida con la posición correspondiente en el ácido nucleico de referencia no se reemplaza con un nucleótido que híbrida con el nucleótido correspondiente en el ácido nucleico de referencia y por consiguiente no puede extenderse adicionalmente, extendiendo aquellos productos de extensión que pueden extenderse adicionalmente, distinguiendo aquellos productos de extensión que se extienden adicionalmente de aquellos productos de extensión que no pueden extenderse adicionalmente, por consiguiente detectando la variación nucleótida en el primer ácido nucleico.

Este método particular se basa en la inhabilidad de una polimerasa correctora para cortar y o extender un nucleótido 3' desigual que es resistente a la remoción mediante una actividad exonucleasa 3'?5' tal como un tio nucleótido modificado o un nucleótido borano modificado. En este método, el juego de productos de extensión enhebrados individualmente de longitud variable se generan como se describió anteriormente, aquellos productos de extensión se hibridan a un ácido nucleico de referencia y el híbrido se contacta con una enzima correctora en la presencia de todos los cuatro deoxinucleótidos bajo condiciones apropiadas para la corrección y la polimerización.

(Figuras 3 y 4). En aquellos productos de extensión enhebrados individualmente en donde los nucleótidos 3'-terminal igualan el ácido nucleico de referencia conocido, posteriormente la polimerasa corta el nucleótido de terminación en cadena u otro nucleótido 3'-terminal y reemplaza ese nucleótido y además extiende el producto de extensión. Sin embargo, si existe una desigualdad en el nucleótido modificado que es resistente a la actividad exonucleasa 3'->5' adyacente (es decir, el nucleótido 3'-terminal (Fig. 3) o el penúltimo nucleótido 3' (Figura 4)) a un nucleótido 3'-terminal desigual o igualado, la enzima correctora no cortará ese penúltimo nucleótido o terminal desigual y será incapaz de extender adicionalmente ese producto de extensión. El producto de esta reacción posteriormente puede analizarse, por ejemplo mediante electrofóresis de gel de desnaturalización, en donde la detección de los productos de extensión extendidos no adicionalmente indica variaciones nucleótidas entre el ácido nucleico de referencia y desconocido y la extensión adicional de los productos de extensión indica que las plantillas tienen base complementaria en sus extremos 3' y por consiguiente no hay variaciones nucleótidas presentes en el extremo 3' del primer ácido nucleico relativo al ácido nucleico de referencia.

Puesto que la identidad de la base terminal no es crítica a la modalidad que usa un nucleótido de terminación en cadena, esa base terminal puede removerse antes de hibridar el producto de extensión enhebrado individualmente con el ácido nucleico de referencia. Varias exonucleasas con actividad 3'?5' son apropiadas para esta modalidad y están rápidamente disponibles. Algunos ejemplos son exonucleasa I y exonucleasa lll. Adicionalmente, la remoción de la base terminal obvia la necesidad de una enzima correctora en la reacción subsecuente. Por lo tanto, las enzimas con carencia de actividad exonucleasa de 3' a 5', tales como el fragmento largo de la Polimerasa ADN Bst y la Polimerasa ADN Taq, pueden usarse para la detección de extensión.

También, dado que el nucleótido 3'-terminal necesita solamente ser un sustrato apropiado para las actividades de extensión de una polimerasa, los métodos de secuencia alternos pueden usarse para generar el equipo de productos de extensión enhebrados individualmente para usarse en este método de detección. Los ejemplos incluyen métodos de secuenciación que usan nucleótido modificado de tio-fosfato o boranofosfato como delimitantes en un iniciador de reacción de extensión seguido por la digestión enzimática con exonucleasa lll. (Ver Labeit et al., DNA, 5:173 (1986) y Porter, Nucleic Acids Research 25:1611-1617 (1997)). Las series de los productos de extensión enhebrados individualmente de longitud variable generados mediante estos procesos pueden terminarse con un nucleótido modificado tio- o borano y por lo tanto bien adaptado para este método.

El siguiente método se describe para proporcionar a aquellos expertos en la técnica con una descripción completa de los métodos reivindicados y es puramente ejemplarizador de la invención y no limita el alcance que los inventores consideran como su invención. Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números (es decir, cantidades, temperatura, etc.) pero se deben considerar algunos errores y desviaciones. A menos que se indique de otra manera, las partes son partes por peso, la temperatura es en °C y la presión es en o cerca de la atmosférica.

EJEMPLOS Preparación de Moléculas Plantillas Amplificación de K-ras. Una región de pares base 275 del exón 1 del gen K-ras se amplificó mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR) con el iniciador K-ras p-A (p-CAGAGAAACCTTTATCTG)(SEC ID NO:1) conteniendo un fosfato 5' y K-ras B (GTACTGGTGGAGTATTT)(SEC ID NO:2) como se describe por Stork et al., Oncogene, 6:857-862 (1991). Todos los iniciadores se sintetizaron por Oligos Etc., Inc., Wilsonville, OR. La reacción (20 µl) contenía HCI-Tris 10 nM, pH 8.3, KCl 50 mM, MgCI2 2.0 mM, 1 pm/µl de Iniciador Kras A&B, 200 µM de cada dNTP 1 ng/µl de ADN genómico K562 (Promega, Madison, Wl) y 0.025 unidades/µl de polimerasa Taq ADN (Perkin Elmer, Foster City, CA). Justo antes de usar la polimerasa Taq se mezcló con anticuerpo Taq Start (Clontech, Palo Alto, CA) de conformidad con las instrucciones del fabricante. La termo-oscilación se realizó en un Sistema GeneAmp 9600 PCR (Perkin Elmer) con el siguiente programa: Retener: 95° C por 5 min, Ciclo: 95° C por 15 segundos, 53° C por 30 segundos, 72° C por 15 segundos por 33 ciclos, Retener: 72° C pro 5 minutos.

Determinación de la Secuencia. El ADN amplificado se purificó por la secuencia de ciclo usando el Sistema de Purificación ADN Preps PCR Wizard (Promega). Se secuenció en ambas direcciones mediante el uso de K-ras o iniciador K-ras-B. La secuencia del ciclo y la detección se realizó con el Sistema de Secuenciación ADN de Secuencia de Plata (Promega) como se describe pro el fabricante. Las condiciones de oscilación fueron: 95° C por 5 min, Ciclo: 95° C por 30 segundos, 50° C por 30 segundos, 72° C por 60 segundos, Retener: 40° C siempre. La secuencia se confirmó para ser de tipo no cultivado o secuencia normal de exón 1 proto-oncogen c-Ki-ras2 celular mediante el análisis BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-10 (1990)) en contra de las bases de datos GenBank+EMBL+DDBJ+PDB en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.

Generación de la plantilla enhebrada individualmente. El producto PCR purificado se enhebró individualmente mediante la digestión con exonucleasa lambda (Higuchi y Ochman, Nucleic Acids Research, 17:5865 (1989)) usando el Equipo de Preparación de la Plantilla PCR de Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ.

Generación de oligómeros dideoxi-terminados Amplificación y secuenciación. La misma región del gen k-ras se amplificó del ADN genómico de la línea celular SW480 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) y purificada como se describió anteriormente. La plantilla purificada (40 ng) se mezcló con 10 pm de iniciador K-ras b-A en 10 µl de Estabilizador de Reacción Secuenasa 0.7X (Amersham), calentado a 100°C por 2 min y posteriormente enfriado inmediatamente en un baño de agua helada por 5 min. Cinco µl de la Mezcla de Enzimas [1 µl de 0.1 M DTT (Amersham) + 2 µl de 5x de Estabilizador Secuenasa (Amersham) + 2 µl de Secuenasa Versión 2.0 (Amersham) diluidos en 1 :8 en Estabilizador de Dilución de Enzimas (Amersham)] se agregó a una mezcla de ADN en hielo. Esta mezcla (3.5 µl) posteriormente se agregó a un tubo a 37° C conteniendo 2.5 µl de 200 µM de cada alfa-tio-dNTP (Amersham) 1 µM ddATP (Pharmacia). Similarmente, esto se repitió por cada uno de los tres ddNTPs restantes. Después de incubar las muestras a 37° C por 5 min, 30 µl de 1XTE pH 7.5 (HCI-Tris 10 mM pH 7.51 EDTA 1mM) se agregó a cada tubo para detener la reacción.

Purificación de los productos de extensión de la plantilla. Se usaron lechos magnéticos cubiertos con estreptavidina (Dynabeads M-280, Dynal Inc., Lake Sucess, NY) para la captura de fase sólida de los productos de extensión. Antes de usar los Dynabeads se lavaron en estabilizador 2X B&W (HCI-Tris 10 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM, NaCI 2M) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Para cada reacción de secuencia dideoxi completada, 40 µl de 1.25 µg/µl de los lechos magnéticos cubiertos con estreptavidina en estabilizador 2X B&W se agregaron a cada reacción. Después de la incubación por 15 minutos a temperatura ambiente con movimiento ciclónico intermitente, los lechos se capturaron y se lavaron con 40 µl de estabilizador 2X B&W. La fusión del ADN dúplex y la separación de las hebras se realizó de conformidad con las instrucciones de los fabricantes.

Generación de olí gomeros alfa-tio terminados de una plantilla de tipo cultivado y mutante. La misma región del gene k-ras se amplificó a partir del ADN genómico de ambas líneas celulares K562 y SW480 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) y se purificó como se describió anteriormente. La plantilla purificada (240 ng) se mezcló con 60 pm del iniciador K-ras b-A en 60 µl de Estabilizador de Reacción Secuenasa 0.07X, disperso en tres alícuotas de 20 µl, calentado a 100° C por 3 min y posteriormente enfriado inmediatamente en un baño de agua helada por 5 mín. Diez µl de la Mezcla de Enzimas (1µl de DTT 0.1 M + 2µl de Estabilizador Secuenasa 5x + 2µl de Estabilizador Secuenasa 5x + 2µl de Secuenasa Versión 2.0 diluida 1 :8 en Estabilizador de Dilución de Enzimas) se agregaron a la mezcla de ADN helado. Esta mezcla (28 µl) posteriormente se agregó a un tubo a 37° C conteniendo 20 µl de 26 µM de alfa-tio-dATP 54 µM dATP 80 µM de los tres dNTPs restantes. Después de la incubación de las muestras a 37° C pro 5 minutos, la reacción se inactivo mediante calentamiento a 75° C por 10 minutos. Dieciséis µl de una solución conteniendo 20 U/µl de Exonucleasa lll (Promega) en Estabilizador Exonucleasa lll 7X (Promega) se agregó a cada reacción de extensión ¡nactivada. Las reacciones se incubaron a 37° C por 30 minutos y posteriormente se calentaron inactivadas a 70° C por 10 minutos.

Detección de extensión de las variaciones nucleótidas Detección de No-extensión. Dos reacciones de hibridación se establecieron para los oligómeros alfa-tio terminados K562 y SW 480, uno conteniendo el ADN de plantilla ss k- ras y uno sin el ADN de plantilla. La plantilla conteniendo la reacción de hibridación contuvo lo siguiente: 36 µl de oligómeros alfa-tio terminados de K562 ó SW480, 100 ng de la plantilla ss k-ras de K562, 60 µl de estabilizador 2X B&W (HCI-Tris 10 mM, ph 7.5, EDTA 1.0 mM, NaCI 2M) y agua con grado biológico molecular (MBG) (Sigma, W-4502, St. Louis, MO) a un volumen final de 120 µl. Una reacción paralela se estableció sin la plantilla ADN. Las reacciones se calentaron a 99.9° C por 2 min y se enfriaron a 1 °C/min a 58° O La reacción se transfirió a un dispositivo de filtración centrífuga Microcon YM-30 y se giró 5 minutos a 7200 x g. El remanente se mezcla con 450 µl de agua MBG y se reconcentró dos veces. El remanente se ajustó a un volumen final de 12 µl con agua MBG. Seis µl del remanente se mezclaron con 4 µl de la mezcla maestra de extensión: HCI-Tris 25 mM, pH 8.3, KCl 125 mM, MgCI2 5.0 mM, 500 µM de cada dNTP y 0.125 unidades/µl de polimerasa ADN Taq (Perkin Elmer). Justo antes de usar la polimerasa Taq se mezcla con el anticuerpo Taq Start (Clontech, Palo Alto, CA) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Las reacciones se termo-oscilaron como sigue: Retener: 95° C por 5 min, Ciclo: 95° C por 15 seg posteriormente 94° C por 15 seg con una disminución de 2° C /ciclo por 14 ciclos, Ciclo: 95° C por 15 seg, 68° C por 15 seg con una disminución de 2° C /ciclo, 72° C por 15 seg por 19 ciclos. Al término, 4 µl de la solución de suspensión (formamida 95%), EDTA 20 mM, azul bromofenol al 0.05%, cianol xileno al 0.05% FF) se agregaron a cada reacción. Tres µl de la nata se cargaron en un gel poliacrilamida de desnaturalización al 6 % de 0.4 mm x 20 cm x 34 cm. El gel se precalentó a 40 W por 30 minutos antes de cargar las muestras y se corrió a 40 w por 50 minutos. El Equipo de Detección Phototope Star (New England Biolabs) se usó para la detección quimoluminiscente de los productos de extensión biotinilados como se describe por el fabricante.

Detección de la extensión de base individual. Seis µl de la mezcla maestra de la extensión de base simple conteniendo: Estabilizador de Reacción 1X ThermoPol (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) MgSO4 2.0 mM, 200 µM de un ddNTP no etiquetado que iguala el dideoxinucleótido terminal, 200 µM de los 3 ddNTPs restantes con 33P (Amersham), 1 ng/µl de ADN de plantilla enhebrada individualmente y 0.01 unidades/µl de polimerasa ADN Vent (New England Biolabs, Inc.) se usó para suspender los productos de extensión de fase sólida. La termo-oscilación fue como sigue: Retener: 95° C por 5 min, Ciclo: 95° C por 15 seg posteriormente 94° C por 15 seg con una disminución de 2° C/ciclo por 14 ciclos, Ciclo: 95° C por 15 seg, 68° C por 15 seg con una disminución de 2° C/ciclo, 72° C por 15 seg por 19 ciclos, Retener: 4° O A través de esta solicitud, se hace referencia a varias publicaciones. Las descripciones de estas publicaciones en su totalidad se incorporan en este documento como referencia en esta solicitud para describir más ampliamente el estado de la técnica al cual la invención pertenece.

A pesar de que el proceso presente se ha descrito con referencia a detalles específicos de ciertas modalidades de los mismos, no se pretende que estos detalles sean limitantes del alcance de la ¡nvención excepto cuando se incluyen en las reivindicaciones anexas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para detección de las variaciones nucleótidas en un primer ácido nucleico, que comprende: a) generar un juego de productos de extensión enhebrados individualmente del primer ácido nucleico en presencia de bases nucleótidas modificadas, en donde los productos de extensión incorporan nucleótidos modificados y por lo tanto limitan la actividad exonucleasa en la base nucleótida 3'- terminal y en donde los productos de extensión tienen longitudes variables; b) hibridar los productos de extensión de longitud variable a un ácido nucleico de referencia; c) contactar los ácidos nucleicos de hibridación con una enzima que puede remover y reemplazar el nucleótido 3'-terminal de los productos de extensión en la presencia de nucleótidos etiquetados seleccionados, en donde los productos de extensión que terminan con un nucleótido 3' que no hibridan con la posición correspondiente en el ácido nucleico de referencia se reemplazan con un nucleótido que híbrida con el nucleótido correspondiente en el ácido nucleico de referencia y en donde aquellos productos de extensión que tienen un nucleótido de no hibridación en el término 3' ahora pueden distinguirse de aquellos productos de extensión que tienen un nucleótido de hibridación en el término 3'. d) distinguir aquellos productos de extensión que tienen un nucleótido de no hibridación en su término 3' de aquellos productos de extensión que tienen un nucleótido de hibridación en su término 3', de este modo detectando la variación nucleótida en el primer ácido nucleico.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde los nucleótidos modificados comprenden deoxinucleótidos tio-modificados.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde los nucleótidos modificados comprenden deoxinucleótidos borano-modificados.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la enzima que remueve y reemplaza el nucleótido 3'-terminal en los productos de extensión comprende una polimerasa correctora.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde los productos de extensión se modifican.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, en donde ka modificación comprende enlazar la biotina al producto de extensión.

7. El método de conformidad con la reivindicación 5, en donde la modificación comprende enlazar un hapteno al producto de extensión.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1 , que además comprende aislar los productos de extensión de la etapa (a) mediante enlazarlos a un soporte sólido.

9. El método de conformidad con la reivindicación 6, en donde los productos de extensión se etiquetan con biotina y se aislan mediante enlazarlos a un soporte sólido cubierto con estreptavidina.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la etapa (C) además comprende realizar la etapa de contacto en la presencia de la base del nucleótido seleccionado en la forma de una segunda etiqueta del tio-fosfato dideoxinucleósido etiquetado, de este modo proporcionando un control positivo para el funcionamiento de la enzima.

11. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde los productos de extensión son de longitud variable mediante la incorporación de nucleótido con terminación en cadena en los productos de extensión.

12. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde los productos de extensión son de longitud variable mediante la digestión exonucleasa parcial de los productos de extensión.

13. Un método de detección en un primer ácido nucleico, la presencia de una variación nucleótida, que comprende: a) generar un juego de productos de extensión enhebrados individualmente del primer ácido nucleico en la presencia de bases nucleótidas modificadas, en donde los productos de extensión incorporan nucleótidos modificados que limitan la actividad exonucleasa en la base nucleótida 3'-terminal y en donde los productos de extensión tienen longitudes variables; b) hibridar los productos de extensión de longitud variable a un ácido nucleico de referencia; c) contactar los ácidos nucleicos de hibridación con una enzima que puede remover y reemplazar el nucleótido 3'-terminal de los productos de extensión en la presencia de un nucleótido modificado seleccionado que es resistente al reemplazo adicional y cuando incorporado en un producto de extensión inhibe además la extensión del producto de extensión, en donde los productos de extensión que terminan con un nucleótido no modificado pueden además extenderse y por lo tanto distinguirse de aquellos productos de extensión que no pueden extenderse adicionalmente; d) remover el nucleótido modificado seleccionado no incorporado; e) extender aquellos productos de extensión que pueden extenderse adicionalmente; f) distinguir aquellos productos de extensión que se extienden adicionalmente de aquellos productos de extensión que no pueden extenderse adicionalmente, de este modo detectando la variación nucleótida en el primer ácido nucleico.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde el nucleótido modificado seleccionado comprende un trifosfato dideoxinucleótido tio-modificado.

15. El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde el nucleótido modificado seleccionado comprende un trifosfato dideoxinucleótido borano-modificado.

16. El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde la etapa (d) además comprende agregar la enzima fosfatasa alcalina de camarón bajo condiciones apropiadas para la actividad de la enzima seguida por la inactividad de la enzima.

17. El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde la enzima que remueve y reemplaza el nucleótido 3'-terminal en los productos de extensión comprende una polimerasa correctora.

18. El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde los productos de extensión se modifican.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, en donde la modificación comprende enlazar la biotina al producto de extensión.

20. El método de conformidad con la reivindicación 18, en donde la modificación comprende enlazar un hapteno al producto de extensión.

21. El método de conformidad con la reivindicación 13, que además comprende el aislamiento de los productos de extensión de la etapa (a) mediante enlazarlos a un soporte sólido.

22. El método de conformidad con la reivindicación 19, en donde los productos de extensión se etiquetan con biotina y se aislan mediante enlazarlos a un soporte sólido cubiertos con estreptavidina.

23. El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde los productos de extensión son de longitud variable mediante la incorporación de nucleótidos de terminación en cadena en los productos de extensión.

24. El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde los productos de extensión son de longitud variable mediante la digestión exonucleasa parcial de los productos de extensión.

25. Un método de detección de las variaciones nucleótidas en un primer ácido nucleico, que comprende: a) generar un juego de productos de extensión enhebrados individualmente del primer ácido nucleico en la presencia de bases nucleótidas modificadas y bases nucleótidas de terminación en cadena, en donde los productos de extensión incorporan nucleótidos modificados que limitan la actividad exonucleasa de la base nucleótida 3'-terminal y en donde los productos de extensión tienen longitudes variables; b) hibridar los productos de extensión de longitud variable a un ácido nucleico de referencia; c) contactar los ácidos nucleicos de hibridación con una enzima que puede remover y reemplazar el nucleótido 3'-terminal de los productos de extensión en la presencia de trifosfato deoxinucleótidos, en donde el penúltimo nucleótido 3' es resistente a la remoción de los productos de extensión, en donde los productos de extensión contienen un penúltimo nucleótido 3' que no híbrida con la posición correspondiente en el ácido nucleico de referencia no se reemplaza con un nucleótido que híbrida con el nucleótido correspondiente en el ácido nucleico de referencia y por lo tanto no puede extenderse adicionalmente; d) extender aquellos productos que no pueden extenderse adicionalmente; e) distinguir aquellos productos de extensión que se extienden adicionalmente de aquellos productos que no pueden extenderse adicionalmente, por lo tanto detectando variables nucleótidas en el primer ácido nucleico.

26. El método de conformidad con la reivindicación 25, en donde los productos de extensión enhebrados individualmente se etiquetan con una etiqueta detectable y la etapa (e) de distinción comprende realizar la electrofóresis de gel de la reacción de la etapa (d), en donde la electrofóresis es de resolución suficiente para distinguir entre un producto de extensión etiquetado que no se extiende adicionalmente y un producto de extensión etiquetado que esta extendido adicionalmente.

27. El método de conformidad con la reivindicación 25, en donde los nucleótidos modificados comprenden deoxinucleótidos tío-modificados.

28. El método de conformidad con la reivindicación 25, en donde los nucleótidos modificados comprenden deoxinucleótidos borano-modificados.

29. El método de conformidad con la reivindicación 25, en donde la enzima que remueve y reemplaza el nucleótido 3'-terminal en los productos de extensión comprende una polimerasa correctora.

30. El método de conformidad con la reivindicación 25, en donde los productos de extensión se modifican.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, en donde la modificación comprende enlazar la biotina al producto de extensión.

32. El método de conformidad con la reivindicación 30, en donde la modificación comprende enlazar un hapteno al producto de extensión.

33. El método de conformidad con la reivindicación 25, que además comprende el aislamiento de los productos de extensión de la etapa (a) mediante enlazarlos a un soporte sólido.

34. El método de conformidad con la reivindicación 25, en donde los productos de extensión se etiquetan con biotina y se aislan mediante enlazarlos a un soporte sólido cubierto con estreptavidina.

35. Un método para detectar variaciones nucleótidas en un primer ácido nucleico, que comprende: a) generar un juego de productos de extensión enhebrados individualmente del primer ácido nucleico en la presencia de bases nucleótidas modificadas, en donde los productos de extensión incorporan nucleótidos modificados que inhiben la actividad exonucleasa en la base nucleótida 3'-terminal y en donde los productos de extensión tienen longitudes variables; b) hibridar los productos de longitud variable a un ácido nucleico de referencia; c) contactar los ácidos nucleicos de hibridación con una enzima que en la presencia de trifosfatos deoxinucleótidos, puede además extender aquellos productos de extensión que tienen un nucleótido 3'-terminal que híbrida con la posición correspondiente en el ácido nucleico de referencia y por lo cual los productos de extensión que contienen un nucleótido 3'-terminal que no híbrida con la posición correspondiente en el ácido nucleico de referencia no se extienden adicionalmente; d) extender aquellos productos de extensión que pueden extenderse adicionalmente; e) distinguir aquellos productos de extensión que además se extiende de aquellos productos de extensión que no se extienden adicionalmente, de esta manera detectando la variación nucleótida en el primer ácido nucleico.

36. El método de conformidad con la reivindicación 35, en donde los productos de extensión son de longitud variable mediante la digestión exonucleasa parcial de los productos de extensión.