JP2002523063A

JP2002523063A - ヌクレオチドの変異について核酸をスクリーニングする方法

Info

Publication number: JP2002523063A
Application number: JP2000566473A
Authority: JP
Inventors: ポールエイ．ダールハウザー，
Original assignee: ジェネティックアセイズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1998-08-20
Filing date: 1999-08-18
Publication date: 2002-07-30
Anticipated expiration: 2019-08-18
Also published as: EP1105540B1; JP2010063469A; MXPA01001913A; CA2340306C; US6610486B1; EP1105540A1; CN100408692C; AU774357B2; WO2000011222A1; JP4663118B2; AU5780599A; CA2340306A1; CN1324410A; US6150105A

Abstract

(57)【要約】第一の核酸内のヌクレオチド変異を検出する以下の工程を包含する方法：第一の核酸から、改変ヌクレオチドを取り込むことにより３’末端ヌクレオチド塩基に対するエキソヌクレアーゼ活性を制限しかつ種々の長さを有する１セットの一本鎖伸長産物を生成する工程；この伸長産物を参照核酸にハイブリダイズさせる工程；ハイブリダイズする核酸を、選択した標識ヌクレオチドの存在下で伸長産物の３’末端ヌクレオチドを除去および置換し得る酵素と接触させ、参照核酸内の対応する位置とハイブリダイズしない３’ヌクレオチドで停止する伸長産物が、参照核酸内の対応するヌクレオチドとハイブリダイズする１以上のヌクレオチドで置き換えられる工程；および３’末端でハイブリダイズしないヌクレオチドを有していた伸長産物を、３’末端でハイブリダイズするヌクレオチドを有していた伸長産物から識別して、第一の核酸内のヌクレオチド変異を検出する工程。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、核酸におけるヌクレオチド変異を検出する分野に関する。より詳細
には、本発明は、核酸におけるヌクレオチド変異を検出する方法に関する。この
方法は、サンプルから核酸の種々の長さのコピーを生成する工程、参照核酸に対
して、生成された核酸をハイブリダイズする工程、およびその種々の長さの核酸
における３’末端位置または最後から２番目の３’位置においてヌクレオチド変
異の存在または非存在を検出する工程による。（背景技術）遺伝子変異に関連する疾患の数は、ヒトゲノムの配列が明らかにされるにつれ
て、継続して増加している。核酸配列決定は、ヌクレオチド変異を検出するため
の究極的な標準である。核酸配列決定は、標的核酸セグメント内の任意の塩基に
生じ得る未知の変異または多型性を検出するために充分に適している。最も一般
的に使用される方法である酵素的なＤＮＡ配列決定の化学は、その着想以来本質
的に同じままである（Ｓａｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，５４６３（１９７７））。当該分野は、蛍光色素、ロボ
ット工学および自動検出を伴う改良された電気泳動システムの導入のようなその
自動化を可能にした技術によって改良されてきた。しかし、遺伝的変異がサンプ
ル集団において低頻度で生じる場合、自動化は、大抵の研究室にとってコストが
高すぎる結果となる。手動様式においてさえ、配列決定は、コスト的に見合わな
い可能性がある。なぜなら、手動様式は労働集約的であるからである。従って、
配列決定の前に、未知のヌクレオチド変異について核酸をスクリーニングするた
めの単純で安価なプロセスについて、当該分野において必要性が存在する。

【０００２】当該分野におけるこの必要性は、未知の変異についてスクリーニングするため
に開発されている方法の数によって証拠付けられる。一本鎖コンフォメーション
多型性（ＳＳＣＰ）は、Ｏｒｉｔａら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、５：８７４−８７９
（１９８９）によって開示されるように、非変性ゲル中で既知のサンプルに対し
て一本鎖状態での移動速度を比較することによって未知のサンプル中の変異を検
出する。ヌクレオチド配列における変化は、ＤＮＡ分子の二次構造またはコンフ
ォメーションに影響する。これは、電気泳動中のＤＮＡ分子の移動速度を変更し
得る。しかし、この技術は、２００ｂｐ未満の小さな標的に限定されており、感
度が限定されており、そして再現性のある、厳格な電気泳動条件を要求する。Ｓ
ＳＣＰ分析における改良（例えば、ジデオキシフィンガープリンティング（一方
向性（Ｓａｒｋａｒら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１３：４４１−４４３（１９９２）
）および二方向性（Ｌｉｕら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、５：１０７−１
１４（１９９６））の両方、ならびに制限エンドヌクレアーゼフィンガープリン
ティング（ＬｉｕおよびＳｏｍｍｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１８：４
７０−４７７（１９９５）））は、１ｋｂの範囲にわたる変異を検出し得るが、
単純さのために感度を犠牲にする。なぜなら、これらのプロセスによって生成す
るＤＮＡバンドの複雑なパターンによって、変異を容易に検出することが困難と
なるからである。

【０００３】核酸におけるヌクレオチド変異についてスクリーニングするために使用される
別の方法は、ヘテロ二重鎖分子が、ゲルマトリクス中を移動する際のそのヘテロ
二重鎖分子の示差的な移動度に基づく。ヘテロ二重鎖分析と呼ばれるその最も単
純な形態において、Ｎａｇａｍｉｎｅら（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、４
５、３３７−３３９（１９８９））によって最初に記載されるように、特徴付け
られていないＤＮＡセグメント（通常は、増幅またはＰＣＲの産物）を、対応す
る野生型セグメントと混合し、加熱し、そして緩和に再生させる。この特徴付け
られていない核酸が、野生型配列とは異なる配列を有する場合、ヘテロ二重鎖分
子が形成される。ヘテロ二重鎖における塩基ミスマッチは、そのヘテロ二重鎖の
移動速度を変更し、非変性ゲルにおいてホモ二重鎖とは部分的に分離されること
が可能になる。

【０００４】変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）と呼ばれるより感度の高いアプローチは、
ＦｉｓｈｅｒおよびＬｅｒｍａｎ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０：１５７９−１５８３（１９８３））によって最初に記載さ
れるように、勾配ゲル形式において、変性体の増加レベルに対してヘテロ二重鎖
分子を供させる。このヘテロ二重鎖分子が、その変性体を通って移動する場合、
そのヘテロ二重鎖分子は、融解し始めるか、または変性し始める。この時点で、
移動は遅くなり、そしてもはや線形ではなくなる。融点は、ホモ二重鎖分子につ
いてのわずかに異なっており、ヘテロ二重鎖分子の部分的な分離が可能になる。
（電）場の強さ、温度および時間の正確な制御が、再現性のある結果を達成する
ために重要であり、そして一貫して再現することは困難である。

【０００５】定常変性ゲル電気泳動（ＣＤＧＥ）では、これらの変数はあまり重要ではない
。なぜなら、変性体の濃度が、ゲル全体において同じであるからである（Ｈｏｖ
ｉｇら、Ｍｕｔ．Ｒｅｓ．、２６２：６３−７１（１９９１））。この技術の顕
著な制限は、核酸セグメントが１を超える融解ドメインを有し得ることである。
そのため、異なる変性濃度での分離ゲルが実行されねばならない。

【０００６】一過的温度勾配ゲル電気泳動（ＴＴＧＥ）は、Ｂｏｒｒｅｓｅｎら（Ｂｉｏｒ
ａｄｉａｔｉｏｎｓ、９９：１２−１１３（１９９７））によって記載されるよ
うに、この問題を、電気泳動中の温度を徐々に上昇させることによって解決しよ
うと試みる。これは、ＣＤＧＥと、変性体として温度のみを使用する温度勾配ゲ
ル電気泳動（ＲｏｓｅｎｂａｕｍａｎｄＲｉｅｓｎｅｒ、Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｃｈｅｍ．、２６：２３５−２４６（１９８７））とのハイブリッド技術である
。しかし、予期されるように、この技術もまた、実行することが困難で、そして
また、再現することも困難である。

【０００７】塩基切除配列スキャニング（ＢＥＳＳ）と呼ばれる近年導入された技術は、ｄ
ｄＴＴＰを用いたジデオキシフィンガープリンティングに、分離配列決定反応に
ついての必要性を省略することによって改良を加える（ＥｐｉｃｅｎｔｒｅＴ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ．）。目的の標的を、標識され
たプライマーおよび制限量のｄＵＴＰを用いてＰＣＲによって増幅する。増幅後
、この産物を、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを用いて処理して、ウラシル部位
を切断する。次いで、このフラグメントの変性ゲル電気泳動によって、ジデオキ
シＴ配列決定ラダーとほぼ同一のラダーが生成される。この技術は、変異につい
て１ｋｂまでのＤＮＡセグメントをスクリーニングするために有用であるが、ゲ
ル電気泳動の解像度によって制限を受け、そしてＧからＣへのトランスバージョ
ンまたはその逆を検出しない。

【０００８】近年導入された別の技術は、クリーバーゼ（ｃｌｅａｖａｓｅ）と呼ばれる構
造特異的なエンドヌクレアーゼを使用して、鎖内の構造を消化し、そしてフラグ
メント長の多型性（ＣＦＬＰ）を生成し、そしてこれは、Ｂｒｏｗら、Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３４：３１２９−３１３７（１９９６）によって
記載される。この構造は、ＤＮＡのセグメントを変性し、次いで、消化温度へと
迅速にそれを冷却し、そしてその酵素を添加することによって作製される。所定
のセグメントについての折り畳みパターンは、その酵素での消化の際に変性ゲル
上の独特のバンドパターンを生成する配列変異によって変動し得る。しかし、こ
の技術は、ゲル電気泳動の解像度およびこのプロセスによって生成されたＤＮＡ
バンドの複雑なパターンによって厳しく制限を受け、これによって、変異を検出
することは困難となる。

【０００９】ヘテロ二重鎖ＤＮＡ中の塩基対ミスマッチの化学酵素的切断による変異の検出
は、Ｎｏａｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８
３：５８６−５９０（１９８６）、ＣｏｔｔｏｎらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：４３９４−４４０１（１９８８）、Ｃｏｔ
ｔｏｎら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２０２，２３１、（Ｗｉｎｔｅｒら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８２：７５７５−７５７
９（１９８９）、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０：１２４５−１２４６
（１９８５））、（ＬｕおよびＨｓｕ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１４：２４９−２５
５（１９９２），）ならびに米国特許第５，６９８，４００号によって記載され
ている。これらの技術の多くは、切断試薬が塩基対ミスマッチの全ての型を認識
することができないことによって制限を受け、そして他のものについて、これは
、ＤＮＡセグメントの両鎖を分析することによって克服され得る。今日までに、
これらの技術が広汎に使用されていることは観察されておらず、これは、部分的
に、これらの技術が非常に毒性のある試薬を必要とし、そしてそのプロセスを実
施することが困難であるからである。

【００１０】ＤＮＡチップまたはマイクロアレイとして知られるＤＮＡハイブリダイゼーシ
ョンプロセスの小さな固体表面へのミニチュア化は、ゲル電気泳動なしのＤＮＡ
セグメントの分析を可能にする。Ｍａｃｅｖｉｃｚ、米国特許第５，００２，８
６７号、Ｄｒｍａｎａｃ．、米国特許第５，２０２，２３１号、Ｌｉｐｓｈｕｔ
ｚら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、９（３）：４４２−４４７（１９９５）お
よびＣｈｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：６１０−６１４（１９９６）を参照
のこと。しかし、ゲル電気泳動の解像度は、ＤＮＡ配列決定を含む上記の変異検
出技術のすべてについて分析され得るＤＮＡセグメントの大きさを厳密に制限し
、そしてこのプロセスにおいて使用される装置およびチップの高価格は、その広
汎な使用の普及を制限する。

【００１１】本発明は、これらの従来技術の方法に対する必要とされている改良を、単一お
よび複数の塩基置換、挿入および欠失を含むすべての可能な塩基変異を検出し得
る方法を提供することによって提供する。これらの変異は、１つ以上の部位にお
いて生じ得、そして所定の位置について各部位で１つ以上のヌクレオチドに影響
を与え得る。第二に、スクリーニングプロセスとして、これらの方法は、明らか
な陽性および陰性の結果を提供する。第三に、このプロセスは、ゲル電気泳動の
解像力によっては制限されず、それゆえ、大きさが１ｋｂを超えるＤＮＡセグメ
ントの分析を可能にする。最後に、電気泳動検出を省くことによって、自動化に
非常に受け入れられやすく、それゆえ、高容量スクリーニングに適切である。

【００１２】（発明の要旨）本発明の目的に従って、本明細書において具体化され、そして広汎に記載され
るように、本発明は、一つの局面において、第一の核酸内でヌクレオチド変異を
検出する方法に関する。この方法は、以下の工程を包含する：第一の核酸から、
１セットの一本鎖伸長産物を、改変ヌクレオチド塩基の存在下で生成する工程で
あって、この伸長産物が改変ヌクレオチドを取り込み、それによって、３’末端
ヌクレオチド塩基に対してエキソヌクレアーゼ活性を制限し、かつ、この伸長産
物が種々の長さを有する、工程、この種々の長さの伸長産物を、参照核酸に対し
てハイブリダイズさせる工程、このハイブリダイズする核酸を、選択された標識
ヌクレオチドの存在下で、この伸長産物の３’末端ヌクレオチドを除去し得、そ
して置換し得る酵素と接触させる工程であって、この参照核酸における対応する
位置とハイブリダイズしない３’ヌクレオチドで停止する伸長産物が、この参照
核酸上の対応するヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチドで置き換えら
れ、そして、この３’末端においてハイブリダイズしないヌクレオチドを有して
いた伸長産物が今度は、この３’末端においてハイブリダイズするヌクレオチド
を有していた伸長産物から識別され得る、工程；その３’末端においてハイブリ
ダイズしないヌクレオチドを有していた伸長産物を、その３’末端においてハイ
ブリダイズするヌクレオチドを有していた伸長産物から識別し、それによって、
この第一の核酸におけるヌクレオチド変異を検出する工程。

【００１３】本発明はまた、核酸変異の存在を第一の核酸内で検出する方法を提供する。こ
の方法は、以下の工程を包含する：１セットの一本鎖伸長産物を、改変ヌクレオ
チド塩基の存在下で生成する工程であって、この伸長産物が、３’末端ヌクレオ
チド塩基に対してエキソヌクレアーゼ活性を制限する改変ヌクレオチドを取り込
み、かつ、この伸長産物が種々の長さを有する、工程、この種々の長さの伸長産
物を、参照核酸に対してハイブリダイズさせる工程、このハイブリダイズする核
酸を、さらなる置換に対して耐性であり、そして伸長産物に取り込まれたときに
この伸長産物のさらなる伸長を阻害する選択された改変ヌクレオチドの存在下で
、この伸長産物の３’末端ヌクレオチドを除去し得、そして置換し得る酵素と接
触させる工程であって、改変されていないヌクレオチドで停止する伸長産物が、
さらに伸長され得、それによって、さらに伸長され得ない伸長産物から識別され
得る、工程；この取り込まれていない選択された、改変ヌクレオチドを除去する
工程；さらに伸長され得る伸長産物を伸長する工程；さらに伸長された伸長産物
を、さらに伸長され得ない伸長産物から識別し、それによって、この第一の核酸
におけるヌクレオチド変異を検出する工程。

【００１４】本発明はさらに、第一の核酸内でヌクレオチド変異を検出する方法を提供する
。この方法は、以下の工程を包含する：この第一の核酸から、１セットの一本鎖
伸長産物を、改変ヌクレオチド塩基および連鎖終結ヌクレオチド塩基の存在下で
生成する工程であって、この伸長産物が、３’末端ヌクレオチド塩基に対してエ
キソヌクレアーゼ活性を制限する改変ヌクレオチドを取り込み、かつ、この伸長
産物が種々の長さを有する、工程、この種々の長さの伸長産物を、参照核酸に対
してハイブリダイズさせる工程、このハイブリダイズする核酸を、デオキシヌク
レオチド三リン酸の存在下で、この伸長産物の３’末端ヌクレオチドを除去し得
、そして置換し得る酵素と接触させる工程であって、最後から２番目の３’ヌク
レオチドが、この伸長産物からの除去に耐性であり、この参照核酸上の対応する
位置でハイブリダイズしない最後から２番目の３’ヌクレオチドが、この参照核
酸上の対応するヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチドでは置換されず
、それによって、さらに伸長され得ない、工程、さらに伸長され得る伸長産物を
伸長する工程、さらに伸長された伸長産物を、さらに伸長され得ない伸長産物か
ら識別し、それによって、この第一の核酸におけるヌクレオチド変異を検出する
工程。

【００１５】（発明の詳細な説明）本発明は、以下の本発明の好適な実施態様およびそこに含められる実施例の詳
細な説明を参照して、より容易に理解され得る。

【００１６】本発明の化合物および方法が開示され、かつ記載される前に、本発明が特定の
核酸、連鎖終結ヌクレオチド、エディティング酵素（ｅｄｉｔｉｎｇｅｎｚｙ
ｍｅ）、伸長酵素および／または増幅酵素、検出可能な部分、ならびに本明細書
中に記載される方法で使用される他の試薬に制限されず、もちろんそれ自体変化
し得ることは理解されるべきである。本明細書中で使用される用語法は、特定の
実施態様を記載する目的にすぎず、そして制限することは意図されないことがや
はり理解されるべきである。

【００１７】本明細書中および添付の請求の範囲で使用される場合、文脈が明らかにそれ以
外のものを指示しない限り、単数形態「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複
数対象を含むことが注意されなければならない。従って、例えば、「核酸」に対
する言及は、核酸の複数コピーを含み、そしてやはり１つを超える特定の種の分
子を含み得る。

【００１８】１つの局面で、本発明は、第一の核酸内のヌクレオチドバリエーションを検出
する方法に関し、この方法は、改変されたヌクレオチド塩基の存在下で第一の核
酸由来の一本鎖伸長産物のセットを生成する工程（ここで、この伸長産物は改変
されたヌクレオチドを取り込み、そしてこれによって、３’末端ヌクレオチド塩
基に対するエキソヌクレアーゼ活性を制限し、そしてここでこの伸長産物が種々
の長さを有する）、この種々の長さの伸長産物を参照核酸とハイブリダイズさせ
る工程、このハイブリダイズした核酸と、選択された標識ヌクレオチドの存在下
で伸長産物の３’末端ヌクレオチドを取り除き得、かつ置換し得る酵素とを接触
させる工程（ここで、この参照核酸上での対応位置とハイブリダイズしない３’
ヌクレオチドで終結する伸長産物は、この参照核酸上での対応ヌクレオチドとハ
イブリダイズするヌクレオチドと置き換わり、そしてここで、３’末端でハイブ
リダイズしないヌクレオチドを有したそれらの伸長産物は、３’末端でハイブリ
ダイズするヌクレオチドを有したそれらの伸長産物とは区別され得る）、それら
の３’末端でハイブリダイズしないヌクレオチドを有した伸長産物と、それらの
３’末端にハイブリダイズするヌクレオチドを有したそれらの伸長産物とを区別
し、これにより、第一の核酸におけるヌクレオチドバリエーションを検出する工
程を包含する。

【００１９】本明細書中で使用される場合、核酸バリエーションとは、核酸（第一の核酸）
中の１つ以上の位置における任意のヌクレオチド置換および核酸上での１つ以上
の位置での任意の挿入または欠失、ならびにそれらの任意の組み合わせをいう。
例えば、核酸は、アッセイされている領域に単一塩基置換を有し得るか、または
その核酸は、その領域に複数の塩基置換、もしくは塩基の置換、挿入、および欠
失の任意の組み合わせを有し得る。本明細書中で使用される場合、ヌクレオチド
バリエーションとは、改変された表現型または遺伝子型を生じ得る任意のヌクレ
オチド改変もまたいう。本明細書中に記載される方法は、塩基の置換、欠失、お
よび挿入、ならびに別個の少なくとも部分的に相補的な核酸上の対応するヌクレ
オチドとハイブリダイズしない、核酸上のヌクレオチドを生じる任意の他の変異
の存在を検出し得る。

【００２０】第一の核酸は、サンプル（すなわち、患者または実験サンプル）由来の一本鎖
核酸または二本鎖核酸であり得、そして参照核酸は、第一の核酸がハイブリダイ
ズされ、そして／もしくは比較される標準核酸または参照核酸であり得る。本明
細書中に記載される方法において、第一の核酸の１つ以上の鎖を使用して、３’
→５’エキソヌクレアーゼ活性に少なくとも部分的に抵抗性である一本鎖伸長産
物のセットを生成し、そして必要に応じて、それらの３’末端に連鎖終結ヌクレ
オチドもしくはデオキシヌクレオチドを含ませて、可変長の一本鎖伸長産物のセ
ットを生成し得る。

【００２１】本発明における使用のための第一の核酸の生成または単離は、必要に応じて、
プラスミドまたはファージのような複製ベクターに目的の領域をクローニングし
て、二本鎖分子もしくは一本鎖分子のいずれかを生成することによる標的領域の
増幅によって促進され得る。第一の核酸が核酸のクローニングにより生成される
場合、クローニングベクター内の核酸が複製された後にクローニングベクターか
ら核酸を単離するための多くの公知の技術（例えば、ファージ単離、細菌の溶解
によるプラスミドの単離、次いで、細胞タンパク質の変性および核酸の遠心分離
、またはさらに密度勾配遠心分離によるプラスミドもしくはファージ核酸の密度
バンド形成）が存在する。

【００２２】当業者は、核酸の１以上の鎖のコピーを産生するための他の多くの公知の増幅
技法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））が存在することを認識する。
しかし、他の増幅技法、自立性配列複製（３ＳＲ）系、転写ベースの増幅系（Ｔ
ＡＳ）、およびＱβレプリカーゼに基づくＲＮＡ複製系もまた、核酸を増幅する
ために使用され得る。従って、増幅の産物、第一の核酸、および／または参照核
酸は、１本鎖または２本鎖のいずれかの、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。増幅
の産物が２本鎖である場合、１本鎖が、当該分野で周知の方法によって単離され
得、この方法は、ビオチン結合増殖プライマーの使用、またはλエキソヌクレア
ーゼを使用するリン酸化した鎖の選択的分解である（例えば、Ｈｉｇｕｃｈｉお
よびＯｃｈｍａｎ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１７：５
８６５（１９８９）によって記載される）。１本鎖テンプレートの産生の代替の
方法（例えば、非対称ＰＣＲ（Ａｕｓｂｅｌら、「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏ
ｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」、ＪｏｈｎＷｉｌｅ
ｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８７））および固相捕捉（Ｈｏｌｔｍａ
ｎら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１７：４９３７−４９
６９（１９８９）））がまた、当該分野で公知である。増幅手順の産物がＲＮＡ
である場合、ＤＮＡを、逆トランスクリプターゼの使用のような当該分野で周知
の技法を使用して、そのＲＮＡから産生し得る。

【００２３】本明細書中で記載される方法における使用のための第一の核酸が増殖されたか
どうか、または第一の核酸が直接（例えば、親サンプルからまたは任意の他の実
験的サンプルから）得られるかどうかにかかわらず、その核酸を、次いで、可変
長の１本鎖伸長産物のセットを産生するためのテンプレートとして使用する。例
えば、連鎖終結ジデオキシヌクレオチドが、この反応において使用され得、その
結果、得られる１本鎖伸長産物のセットは、このジデオキシヌクレオチドが組み
込まれた各位置で終結する１本鎖伸長産物を含む。好ましくは、この実施態様に
おける可変長の１本鎖伸長産物のセットは、特定の種類のジデオキシヌクレオチ
ドについて利用可能な各位置へジデオキシヌクレオチドを組み込んだ少なくとも
１個の１本鎖伸長産物（すなわち「塩基配列決定ラダー」）を含む。ジデオキシ
塩基配列決定ラダーは、当該分野で周知であり、そして市販の配列決定キットを
用いて達成され得る。本発明の好ましい実施態様において、塩基配列決定ラダー
は、サーマルサイクル塩基配列決定によって産生され、このサーマルサイクル塩
基配列決定は、第一の核酸に対応する複数の塩基配列決定ラダーを産生し、参照
核酸上の対応する位置でヌクレオチドへハイブリダイズする３’末端ヌクレオチ
ドか、または参照核酸上の対応する位置でヌクレオチドへハイブリダイズしない
３’末端ヌクレオチドを有する、１本鎖伸長産物の後の検出を容易にする。

【００２４】あるいは、可変長の１本鎖伸長産物のセットを、種々の手順によって産生し得
る。例えば、１本鎖伸長産物を、反応混合物中に連鎖終結ヌクレオチドの存在を
伴わず、プライマー配列の伸長によって産生し得るが、ここで、デオキシヌクレ
オチドは、限られた量で存在する。あるいは、デオキシヌクレオチドは、１本鎖
伸長産物のセット（これは、第一の核酸の全長に対応する）を合成するに十分な
量で存在し得るが、これを、次いで、例えば、デオキシヌクレオチドの非存在下
または制限量下で、例えば、エキソヌクレアーゼＩまたはＩＩＩあるいはＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼ使用して、この１本鎖伸長産物の部分的末端分解によって、可
変長の１本鎖伸長産物のセットを産生するために使用する。当業者は、１本鎖伸
長産物のセットを産生するために使用される特定の技法（単数または複数）が変
化し得ることを理解する。

【００２５】当業者はまた、１本鎖伸長産物のセットの産生は、伸長反応が進行するために
プライマーを要求することを認識する。プライマーは内因性であり得る（例えば
、同一分子の３’−領域〜５’領域のハイブリダイゼーション）か、またはプラ
イマーは外因性であり得る（例えば、第一の核酸上の好ましい部位（単数または
複数）へハイブリダイズし得る合成プライマーの使用）。

【００２６】第一の核酸、１本鎖伸長産物、およびプライマーを、例えば、別の分子（例え
ば、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、抗体、酵素）、あるいはこれらの分
子の単離および／または検出を容易にし得る別の部分）へ結合させることによっ
て、改変し得る。本明細書中の実施例の節において議論するように、プライマー
はビオチンに結合され得、そしてその改変されたプライマーを使用した伸長反応
の結果として産生された１本鎖伸長産物のセットを、第一の核酸および伸長反応
の他の成分から、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを使用して、分離
し得る。

【００２７】必要に応じて、改変された第一の核酸、１本鎖伸長産物、および／またはプラ
イマーを、これらを固体支持体へ結合させることによって反応混合物および／ま
たは他の核酸から精製または単離し得る。例えば、伸長反応において使用される
プライマーの少なくとも一部分に相補的な核酸は、固体支持体（例えば、カラム
クロマトグラフィーにおいて使用されるビーズ）へ連結され得、そしてこのプラ
イマーが伸長した後、その反応混合物は、第一の核酸から伸長産物を変性して離
させるために加熱され得る。そしてこの混合物を、伸長産物がビーズに結合され
た核酸にハイブリダイズするが第一の核酸へはハイブリダイズしない条件下で、
カラムを通過させ、それによって、伸長産物を第一の核酸から精製する。例えば
、プライマーは、第一の核酸に相補的な配列を含み得、そしてまたは第一の核酸
に相補的でない配列を含む５’領域（例えば、ポリ（Ｃ）領域）を有し得る。ビ
ーズへ結合した核酸は、次いで、伸長産物が第一の核酸へハイブリダイズしない
条件下で、ポリ（Ｃ）領域へハイブリダイズし得るポリ（Ｇ）領域を含み得る。
当業者は、伸長反応の一方の鎖をその相補鎖から、あるいは部分的相補鎖から分
離させるために使用される他の多くの手順の例が存在し、そして本明細書中で記
載される方法は、いかなる特定の単離、分離、または精製手順にも限定されない
ことを認識する。

【００２８】あるいは、１本鎖伸長産物のセットを産生するために使用されるプライマーは
、５’末端でリン酸化され得、λエキソヌクレアーゼ（ＨｉｇｕｃｈｉおよびＯ
ｃｈｍａｎ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１７：５８６５
（１９８９）に記載）を用いてのリン酸化した鎖の引き続いての分解を可能にす
る。１本鎖テンプレートの産生のための代替の方法（例えば、非対称ＰＣＲ（Ａ
ｕｓｂｅｌら、「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌ
ａｒＢｉｏｌｏｇｙ」、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ
（１９８７））および固相捕捉（Ｈｏｌｔｍａｎら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
ｓＲｅｓａｒｃｈ，１７：４９３７−４９６９（１９８９）））がまた、当該
分野において公知である。

【００２９】一本鎖伸長産物は、代表的には、生成反応において使用され、そしてそれによ
って一本鎖伸長産物中に取り込まれる、少なくとも１つのタイプの改変ヌクレオ
チドの存在下で生成され、従って、この一本鎖伸長産物は、少なくとも部分的に
は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性に抵抗性である。改変ヌクレオチドのヌ
クレオチドとしての取り込み後の主要な機能は、３’ジデオキシヌクレオチドに
対する続く３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を制限することである。これらの
改変ヌクレオチドは、当該分野で周知であり、このような改変ヌクレオチドとし
ては、チオ改変、デオキシヌクレオチド三リン酸、ホウ酸（ｂｏｒａｎｏ）改変
デオキシヌクレオチド三リン酸（ＥｃｋｓｔｅｉｎおよびＧｉｓｈ、Ｔｒｅｎｄ
ｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１４：９７−１００（１９８９）、およ
びＰｏｒｔｅｒＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、２５：１６
１１−１６１７（１９９７））が挙げられる。

【００３０】可変長の一本鎖伸長産物のセットが生成され、そして必要に応じて第一の核酸
から単離された後、次いで、一本鎖伸長産物は、参照核酸にハイブリダイズされ
る。この参照核酸は、代表的には、特定の遺伝子または、この遺伝子の構造およ
び調節領域を含む遺伝子の一部について「野生型」であるとみなされる核酸であ
り得る。例えば、参照核酸は、変異された場合、個体において変化された表現型
または疾患を生じる特定の遺伝子中または近傍で変異について遺伝子座であるこ
とが知られる核酸であり得る。あるいは、変異は、有益であるとみなされる異な
る表現型を生じ得る（例えば、今や毒素を解毒し得る細菌種）。任意の変異は、
本明細書中に記載の方法によって検出されるものとして意図され、そして変異の
具体的な正体は、これらの方法の適用性を限定しない。さらに、参照核酸の供給
源もまた、本発明の方法を限定するものではないので、参照核酸は、当該分野に
記載の任意の方法によって本明細書中に記載の方法において使用するために、単
離され、生成され、合成され、または増幅され得る。

【００３１】ハイブリダイゼーションの正確な条件は、もちろん、参照核酸の特定の配列お
よび第一の核酸に依存して変動する。特定の条件は、当業者によって容易に入手
可能であり、そして代表的なハイブリダイゼーション条件および至適化条件は、
広範な種々の供給源参照から利用可能である。例えば、Ｉｎｎｉｓら（「ＰＣＲ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡ
ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．１９９０）
およびＥｒｌｉｃｈ、Ｈ．Ａ．（ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｉ
ｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＤＮＡＡｍｐｌｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ）は共に、核酸増幅についての標準的なハイブリダイゼーション
条件を開示し、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ、ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９））は、これらの
方法についての代表的な核酸ハイブリダイゼーションおよび至適化手順について
の一般的な方法を記載する。必要に応じて、一本鎖伸長産物と参照核酸との間の
特定のハイブリダイゼーション条件は、一本鎖伸長産物の３’末端ヌクレオチド
を除去および置換し得る酵素の活性が保持され、そして代表的には非常に高い活
性であり、そして特異的であるような条件である。

【００３２】一本鎖伸長産物が参照核酸にハイブリダイズした後、伸長産物の３’末端ヌク
レオチドを除去および置換し得る酵素（すなわち、「プルーフリーディング」酵
素）がこれらのハイブリッドに添加される。本発明の１つの実施態様では、この
反応は、連鎖終結ヌクレオチドの存在下で生じ得、そして３’末端ヌクレオチド
が参照核酸にハイブリダイズする場合、その３’末端ヌクレオチドは、同じ正体
の連鎖終結ヌクレオチドと置換される（図１）。伸長産物の３’末端のヌクレオ
チドは、参照核酸にハイブリダイズしない場合、例えば、伸長の３’末端ヌクレ
オチドがその特定の位置で第一の核酸における変異を示す場合、プルーフリーデ
ィング酵素は、伸長産物におけるこのミスマッチ塩基を除去し、そしてそれを、
参照核酸にハイブリダイズし、そして検出され得る塩基と置換する。

【００３３】本明細書中に記載の方法において使用される特定のプルーフリーディング酵素
は、ＤＮＡポリメラーゼに限定されないが、３’末端ヌクレオチドを除去し得る
か、またはこの３’末端ヌクレオチドを同じまたは異なる正体の別のヌクレオチ
ドと置換し得る任意の酵素、または酵素の組み合わせを包含する。例えば、プル
ーフリーディング酵素は、例えば、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡＰｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｅ
．ｃｏｌｉＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ、クレノウフラグメントＤＮＡ
ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ、Ｔ４ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔ７Ｄ
ＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｕｌｔｉｍａ（登録商標）ＤＮＡＰｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ、およびＰｆｕ（登録商標）ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅのような熱
安定性ポリメラーゼであり得る。あるいは、３’末端ヌクレオチドを除去する酵
素は、さらなる工程を用いて同じ結果を有効に達成するために、Ｔ４ＤＮＡ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅのようなポリメラーゼと組み合わせて使用されるＥ．ｃｏ
ｌｉエキソヌクレアーゼＩＩＩまたはエキソヌクレアーゼＩのようなエキソヌク
レアーゼであり得る。あるいは、非プルーフリーディングポリメラーゼ酵素は、
本明細書中に記載の方法において使用され得る。非プルーフリーディングポリメ
ラーゼはミスマッチを伸長することができないことが、当該分野で周知であり、
そして対立遺伝子特異的ＰＣＲおよび増幅不応変異系（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎｒｅｆｒａｃｔｏｒｙｍｕｔａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓ；ＡＲＭＳ）
の根拠である。Ｗｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．
、８６：２７５７−２７６０（１９８９）およびＮｅｗｔｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉ
ｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１７：２５０３−２５１６（１９８９）を参照のこ
と。

【００３４】参照核酸にハイブリダイズしなかった３’末端ヌクレオチドを有する伸長産物
中に取り込まれるヌクレオチドは、３’末端ヌクレオチドがまず参照核酸にハイ
ブリダイズする伸長産物の３’末端ヌクレオチドと同じ正体を有するヌクレオチ
ドの存在下で検出され得るヌクレオチドを含み得る。例えば、伸長反応が、ｄＡ
ＴＰに対応する連鎖終結ヌクレオチドの存在下で実施される場合、参照核酸にハ
イブリダイズしない３’末端ヌクレオチドが参照核酸にハイブリダイズするヌク
レオチドによって置換される、切り出し／置換反応が、放射性標識ｄＧＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、およびｄＴＴＰの存在下で実施され得る。本実施例において、放射性標
識ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰヌクレオチドのいずれかが伸長産物中に
取り込まれる場合、その産物は、放射能の存在によって検出され得る。さらに、
この反応は、内部コントロール（例えば、標識の異なるヌクレオチド（例えば、
本実施例における³⁵Ｓ−ｄＡＴＰまたは蛍光ｄＡＴＰ）を含み得る。それにより
この標識は、参照核酸上の対応する位置にハイブリダイズした３’ヌクレオチド
を有する一本鎖伸長産物中に取り込まれ得る。従って、特に、ほとんどまたは全
く変異が検出されない場合に、活性についての反応をモニタリングし得る。なぜ
なら、３’末端ヌクレオチドでハイブリダイズするヌクレオチドを有する伸長産
物および３’末端ヌクレオチドでハイブリダイズしないヌクレオチドを有する伸
長産物の両方が、検出され得、そしてまた識別され得るからである。あるいは、
標識は、その３’末端ヌクレオチド位置でハイブリダイズするヌクレオチドを有
する伸長産物にのみ取り込まれ得る。

【００３５】変異の存在を検出するために使用される特異的な標識は、もちろん、変化し得
る。例えば、この標識は、放射線標識、蛍光標識、発光標識、引き続き検出され
得るヌクレオチドに結合した抗体、引き続き検出され得るヌクレオチドに結合し
たハプテン、あるいは直接的または間接的のいずれかで検出され得る、他の任意
のヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドを含み得る。従って、３’末端ヌクレオ
チドが参照核酸とハイブリダイズされた一本鎖伸長産物と、３’末端ヌクレオチ
ドが参照核酸とハイブリダイズされなかった一本鎖伸長産物とを区別するために
使用される特異的な方法（単数または複数）は、本明細書中に記載の方法で使用
される特異的な標識に依存して、変化する。例えば、標識ヌクレオチドが放射線
標識ヌクレオチドである場合には、その検出方法は、シンチレーション計数、ま
たは反応生成物のフィルムへの露光（これは、現像すると、標識核酸と非標識核
酸とを区別し得る）を包含し得る。

【００３６】本発明により、第一核酸においてヌクレオチド改変体の存在を検出する方法も
また提供され、この方法は、１セットの一本鎖伸長産物を、改変ヌクレオチド塩
基の存在下でこの第一核酸から生成する工程（ここで、この伸長産物は、３’末
端ヌクレオチド塩基に対するエキソヌクレアーゼ活性を制限する改変ヌクレオチ
ドを取り込み、そしてここで、この伸長産物は、様々な長さを有する）、この様
々な長さの伸長産物を、参照核酸とハイブリダイズさせる工程、このハイブリダ
イズする核酸を、選択した改変ヌクレオチド（これは、さらなる置換に対して抵
抗性があり、そして伸長産物に取り込まれると、その伸長産物のさらなる伸長を
阻害する）の存在下でその伸長産物の３’末端ヌクレオチドを除去および置換し
得る酵素と接触させる工程（ここで、非改変ヌクレオチドで終結する伸長産物が
さらに伸長され得、これによって、さらに伸長され得ない伸長産物から区別され
得る）、取り込まれなかった選択された改変ヌクレオチドを除去する工程、さら
に伸長され得る伸長産物を伸長させる工程、さらに伸長された伸長産物を、さら
に伸長され得ない伸長産物から区別し、これによって第一核酸中のヌクレオチド
改変体を検出する工程を包含する。

【００３７】この特定の方法は、プルーフリーディングポリメラーゼが、マッチング末端連
鎖終結ヌクレオチド（例えば、ジデオキシヌクレオチド）を、不可逆反応または
「自殺（ｓｕｉｃｉｄｅ）」反応において、３’から５’のエキソヌクレアーゼ
活性に対して抵抗性の改変連鎖終結ヌクレオチドと置換する能力に基づく。第一
核酸から生成する様々な長さの一本鎖伸長産物は、既知のテンプレートまたは参
照核酸と混合されて、安定なハイブリッドを形成する。このハイブリッドは、さ
らなる３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性の連鎖終結ヌクレ
オチド（例えば、α−チオ−ジデオキシヌクレオチドであって、これは、この伸
長産物の３’末端塩基の塩基当価体（ｂａｓｅ−ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）である
）の存在下で、この伸長産物の３’末端ヌクレオチドの切出しおよびさらなる３
’から５’のエキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性の連鎖終結ヌクレオチドと
のその置換に適切な条件下で、上述のように、プルーフリーディングポリメラー
ゼに曝露されるか、またはそれと等価な反応に供される（図２）。この伸長産物
の３’末端ヌクレオチドが、第一核酸の対応する位置とハイブリダイズする場合
には、この３’末端ヌクレオチドは切り出され、そしてさらなる３’から５’の
エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性の、対応する連鎖終結ヌクレオチドと置
換される。このプルーフリーディングポリメラーゼ酵素は、もはや、３’末端ヌ
クレオチドをプルーフリードし得ず、そしてまた、マッチング末端塩基を伸長し
得ない。なぜなら、この酵素が連鎖終結ヌクレオチドであるためである。しかし
、一本鎖伸長産物の３’末端ヌクレオチドが、参照核酸とハイブリダイズしない
（すなわち、末端塩基においてミスマッチが存在する）場合には、このプルーフ
リーディングポリメラーゼは、この一本鎖伸長産物の３’末端ヌクレオチドを切
り出すが、その位置に連鎖終結ヌクレオチドを挿入しない。なぜなら、例えば、
参照核酸上の対応する位置とハイブリダイズし得る連鎖終結ヌクレオチドが、そ
の反応混合物中に存在しないためである。次いで、このプルーフリード伸長産物
は、さらに伸長され得、そしてこの伸長した産物が、検出され得る。従って、３
’末端ヌクレオチドが参照核酸の対応する位置に対して相補的である伸長産物は
、不可逆的に終結され得るが、３’末端ヌクレオチドが参照核酸の対応する位置
に対して相補的ではない伸長産物は、プルーフリードされ得、そして引き続く伸
長反応（これが検出され得る）のためのプライマーとして作用する準備ができて
いる。

【００３８】引き続く伸長反応のためには、さらなる３’から５’のエキソヌクレアーゼ活
性に対して抵抗性である連鎖終結ヌクレオチドを、その反応から除去することが
望ましくあり得る。このことは、この反応混合物に、この反応混合物に、さらな
る３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性の連鎖終結ヌクレオチ
ドを、一本鎖伸長産物（例えば、この連鎖終結ヌクレオチド上の三リン酸を加水
分解するシュリンプ（ｓｈｒｉｍｐ）アルカリホスファターゼ）にさらに付加さ
れることに対して効果的に不能にする活性を追加すること（この後、この酵素は
熱的に不活化され得る）により、達成され得る。あるいは、このテンプレートお
よび伸長産物は、さらなる３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗
性の連鎖終結ヌクレオチドから、当業者に周知の他の方法（例えば、分子量分離
もしくは分子サイズ分離、伸長産物を上記のような固体支持体に結合させること
、および遊離ヌクレオチドの選択的分解）によって、精製され得る。

【００３９】この方法におけるプライマー伸長反応は、上記のように、標識の取り込みによ
って検出され得るか、または、例えばＤＮＡ合成中にポリメラーゼにより媒介さ
れるヌクレオシド取り込みの結果である無機ピロリン酸の放出によって間接的に
検出され得る。（Ｎｙｒｅｎ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６７：２３５〜
２３８（１９８７））。この実施態様は、この反応におけるポリメラーゼ活性の
連続的なモニタリングを可能にするという利点を有する。この特定の反応は、ヌ
クレオシド三リン酸塩基、Ｄ−ルシフェリン、Ｌ−ルシフェリン、ＡＴＰスルフ
リラーゼ、ルシフェラーゼ、ならびに既知のテンプレートの５’末端における領
域またはその近くの領域と同じ配列を有し、伸長反応をプライミングし得るオリ
ゴヌクレオチドを添加することによって、開始され得る。このオリゴヌクレオチ
ドを使用して、生成する任意の全長伸長産物を逆プライミングすることによって
、このアッセイの感度を増加させ得る。このことは、ミスマッチ／変異が既知の
参照核酸の５’末端の近くで生じる場合に、特に重要である。なぜなら、比較的
少ないヌクレオチドが、このテンプレートの末端に達する前に付加されるためで
ある。代表的な閾値計検出については、Ｎｙｒｅｎら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．、２４４：３６７〜３７３（１９９７））を参照のこと。熱的に安定なルシ
フェラーゼの使用は、この伸長反応がより高温で起こることを可能とし、そして
この反応の感度および特異性を増加させる。（ＫａｌｉｙａｍａおよびＮａｋａ
ｎｏ、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５８：１１７
０〜１１７１（１９９４））。

【００４０】多塩基プライマー伸長を検出するための方法の他の例は、ＰｅｒｋｉｎＥｌ
ｍｅｒ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡから入手可能である蛍光発生５’ヌクレ
アーゼアッセイを利用し、Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８，７２７６−７２８０（１９９１）により記載され
る通りである。この方法は、レポーターおよびクエンチング剤染料とともに、Ｔ
ａｑＭａｎプローブ（登録商標）と呼ばれるプローブを標識化する工程を包含
する。このプローブは、増幅される特定の核酸における内部配列に対して特異的
であり得る。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、増幅プライマーを伸長するにつれ
て、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブと遭遇し、その５’→３’エキソヌク
レアーゼ活性と共に分解する。このクエンチング剤からのレポーターの解離は、
蛍光における増加という結果となる。本方法の多塩基伸長検出への適用は、公知
の鋳型の５’末端配列に相補的なＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの合成の
みを要求する。生物発光検出に関して、本方法は、反応中のポリメラーゼ活性の
連続的なモニタリングを可能とする。この反応が熱循環反応における高温で実行
され得るため、追加の利点は、高い感度および特異性である。

【００４１】本方法の１つの変形において、取り込まれていない改変されたヌクレオチドの
除去がそれ自体、検出され得る工程を包含し得る場合、この検出工程の前にさら
に伸長され得るそれらの伸長産物を伸長する工程は、除かれる。例えば、３’末
端塩基がクエンチングヌクレオチドであり、そしてそのヌクレオチドの除去が核
酸の検出を可能とする場合、検出可能部分を取り込むための伸長産物の伸長は、
その後の検出工程のためには必要ではない。

【００４２】検出のための他の代替の方法は、改変したデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄ
ＮＴＰ）を、この伸長産物へ取り込む工程を包含する。実施例は、放射性、蛍光
性、およびハプテン標識したｄＮＴＰを含む。例えば、蛍光標識したｄＮＴＰは
、直接の非放射性検出を可能にする。この方法の感度は、生物発光検出と同様に
、公知の鋳型の５’末端における領域または５’末端の近くの領域へハイブリダ
イズし得、かつこれは伸長反応合成を第一の核酸から初回刺激することを可能と
するオリゴヌクレオチドを利用することにより高められる。この方法は、蛍光発
生５’ヌクレアーゼアッセイと同様、この伸長反応が熱循環反応などにおける高
温で実行され得るために高い感度および特異性という利点を有する。この方法は
、上記のように任意の取り込まれていない標識を除去する追加の工程を追加し得
、それに次いで取り込まれた標識の直接または間接の検出が続く。１つの実施形
態において、固相精製が使用され得て、伸長されたオリゴマーを、任意の取り込
まれていない蛍光標識したｄＮＴＰから、捕獲するかまたは精製し、その後蛍光
定量的検出が続く。

【００４３】参照核酸上の対応する位置においてヌクレオチドとハイブリダイズした３’末
端ヌクレオチドを有したそれらの一本鎖伸長産物を、参照核酸上の対応する位置
においてヌクレオチドとハイブリダイズしなかった３’末端ヌクレオチドを有し
た産物から、区別するなお他の方法は、プルーフリーディング活性が３’末端ヌ
クレオチドを置換し、さらにその伸長産物をさらに伸長した後、全長伸長産物の
存在について本方法の産物を例えば、一本鎖（全長および全長ではないものの両
方）を視覚化するための変性ゲル電気泳動により、分離する工程を、包含し得る
。

【００４４】本発明の特定の適用において、分析される細胞の全数中、ほんの少しの割合の
悪性細胞が存在し得る、初期のガン検出におけるような、全分析物の少ない割合
を損なう変異を増幅することが所望され得る。変異が既知の部位（例えばＫ−ｒ
ａｓ遺伝子）で生じる場合の変異遺伝子の選択的増幅は、Ｓｔｏｒｋら（Ｏｎｃ
ｏｇｅｎｅ，６：８５７−８６２（１９９１））により記載されるように、変異
を増幅するための特定のプライマーの設計により容易に達成される。しかし、野
生型遺伝子の高い割合での遺伝子におけるランダムな変異の選択的増幅は、標準
的なＰＣＲによっては可能ではない。これらの適用において、この変異鋳型の選
択的増幅が好まれ得る。従って、変異鋳型からの伸長産物は、その既知の鋳型か
ら精製され、その配列が不明であるサンプルから精製した増幅核酸へハイブリダ
イズされる。この増幅された核酸は、この伸長産物との混合の前に残りのプライ
マーから精製され得て、野生型鋳型の再増幅を防ぐ。ハイブリッドは、例えば伸
長産物の重合に適切な熱循環条件のもとで、熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴ
Ｐに暴露され得る。３’末端ミスマッチによる既知の鋳型上で伸長に不応性であ
った伸長産物は、今度は変異鋳型へハイブリダイズし得る。それらはそこから形
成されたものであり、そしてポリメラーゼにより伸長される。好ましくは、ｄＮ
ＴＰの１つが例えばジゴキシゲニンなどのハプテンを使用して標識化され、伸長
産物の固相捕獲を可能にする。ハプテン標識された伸長産物の固相捕獲は、続い
て初期の標的増幅のために使用されるプライマーを用いる標準ＰＣＲ増幅を行う
ことは、変異を含むこの鋳型を優先的に増幅する。このＰＣＲ産物は、次いで標
準的方法により配列決定され得て、変異またはヌクレオチド変化の正確な位置を
具体的に同定する。

【００４５】本発明はまた、第一の核酸内のヌクレオチド変化を検出する方法を提供し、こ
の方法は、改変されたヌクレオチド塩基の存在下で、そして必要に応じて鎖末端
ヌクレオチド塩基の存在下で、第一の核酸から一セットの一本鎖伸長産物を生成
する工程であって、ここで伸長産物は、エキソヌクレアーゼ活性を３’末端ヌク
レオチド塩基へ制限する改変されたヌクレオチドを取り込み、そしてここで伸長
産物は可変長を有する、工程、可変長伸長産物を参照核酸へハイブリダイズする
工程、ハイブリダイズしている核酸を、デオキシヌクレオチド三リン酸の存在下
で、伸長産物の３’末端ヌクレオチドを除去および、置換し得る酵素と接触させ
る工程であって、ここで最後から２番目の３’ヌクレオチドは、伸長産物からの
除去へ抵抗性であり、それにより参照核酸上の対応する位置とハイブリダイズし
ない最後から２番目の３’ヌクレオチドを含む伸長産物は、参照核酸上の対応す
るヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチドと置換されず、それによりさ
らには伸長され得ない、工程、さらに伸長され得るそれらの伸長産物を伸長する
工程、さらに伸長されたそれらの伸長産物を、さらには伸長され得ないそれらの
伸長産物から区別する工程、それにより第一の核酸中のヌクレオチド変化を検出
する工程を包含する。

【００４６】この特定の方法は、チオ改変ヌクレオチドまたはボラン改変ヌクレオチドのよ
うな、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性による除去に抵抗性のある不一致３’
ヌクレオチドを削除および／または伸長するプルーフリーディングポリメラーゼ
の不能に基づいている。この方法において、種々の長さの一本鎖伸長産物のセッ
トが、上記のように産生され、それら伸長産物が、参照核酸にハイブリダイズさ
れ、そしてこのハイブリッドが、プルーフリーディングおよび重合に適した条件
下で４つすべてのデオキシヌクレオチドの存在中でプルーフリーディング酵素に
接触される。（図３および図４）３’末端ヌクレオチドが既知の参照核酸に一致
する一本鎖伸長産物において、ポリメラーゼが、連鎖終結ヌクレオチドまたは他
の３’末端ヌクレオチドを削除し、そしてそのヌクレオチドを置換し、そしてさ
らにその伸長産物を伸長させる。しかし、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性に
抵抗性があり、一致または不一致の３’末端ヌクレオチドに隣接する（すなわち
３’末端ヌクレオチド（図３）またはその末端から２番目の３’ヌクレオチド（
図４））改変ヌクレオチドに不一致が存在する場合、このプルーフリーディング
酵素は、不一致の末端ヌクレオチドまたは末端から２番目の不一致のヌクレオチ
ドを削除せず、その伸長産物をさらに伸長させ得ない。次いで、この反応産物を
、例えば、変性ゲル電気泳動により分析し得、それによって、さらに伸長されな
かった伸長産物の検出が、未知核酸と参照核酸との間のヌクレオチド変異を示し
、そして伸長産物のさらなる伸長が、その鋳型が３’末端に塩基相補性を有し、
従って、参照核酸と比較して第一の核酸の３’末端に核酸変異は存在しないこと
を示す。

【００４７】末端塩基の同一性が、連鎖終結ヌクレオチドを利用するこの実施態様に重要で
はないので、その末端塩基は、一本鎖伸長産物が参照核酸とハイブリダイズする
前に、除去され得る。３’→５’活性を有するいくつかのエキソヌクレアーゼは
、この実施態様に適しており、容易に入手可能である。いくつかの例が、エキソ
ヌクレアーゼＩおよびエキソヌクレーゼＩＩＩである。さらに、その末端塩基の
除去が、後の反応におけるプルーフリーディング酵素についての必要性を取り除
く。従って、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼおよびＴａｑＤＮＡポリメラーゼの
大フラグメントのような３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠如する酵素が、
伸長検出に使用されうる。

【００４８】また、この３’末端ヌクレオチドは、ポリメラーゼの伸長活性に適切な基質で
あることだけを必要とするので、代替的な配列決定方法を使用し、この検出方法
において使用するための一本鎖伸長産物のセットを産生し得る。例は、プライマ
ー伸長反応に続いてエキソヌクレアーゼＩＩＩでの酵素的消化において、チオリ
ン酸化またはボランリン酸化改変ヌクレオチドを区切り記号として使用する配列
決定方法を含む。（Ｌａｂｅｉｔら、ＤＮＡ、５：１７３（１９８６）および、
Ｐｏｒｔｅｒ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ２５：１６１
１〜１６１７（１９９７）を参照のこと）。これらの過程で産生された種々の長
さの一連の一本鎖伸長産物が、チオ改変ヌクレオチドまたはボラン改変ヌクレオ
チドで終結され得、従って、この方法に対してよく適合する。

【００４９】下記の実施例は、完全な開示および特許請求される方法の説明を当業者に提供
するために発表され、本発明の全くの例示であることが意図され、そして本発明
者らがその発明としてみなすものの範囲を限定することが意図されない。数（例
えば、量、温度など）に関する正確さを保証するための努力がなされたが、いく
らかの誤差および偏差が考慮されるべきである。他に示されない限り、割合は重
量での割合であり、温度は℃で示され、そして圧力は、大気圧またはその近くで
ある。

【００５０】（実施例）（鋳型分子の調製）（Ｋ−ｒａｓの増幅）Ｋ−ｒａｓ遺伝子エキソン１の２７５ｂｐ領域を、プラ
イマーＫ−ｒａｓｐ−Ａ（ｐ−ＣＡＧＡＧＡＡＡＣＣＴＴＴＡＴＣＴＧ）（配
列番号１）（５’リン酸を含む）およびＫ−ｒａｓｐ−Ｂ（ＧＴＡＣＴＧＧＴ
ＧＧＡＧＴＡＴＴＴ）（配列番号２）（Ｓｔｏｒｋら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、６：
８５７〜８６２（１９９１）により開示されているように）を用いて、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。すべてのプライマーが、Ｏｌｉｇｏｓ
Ｅｔｃ．，Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ、ＯＲにより合成された。この
反応液（２０μｌ）は、ｐＨ８．３の１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ
ＫＣｌ、２．０ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｐｍ／μｌＫｒａｓＡ＆Ｂプライマー、
２０μＭの各ｄＮＴＰ、１ｎｇ／μｌのＫ５６２ゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ
、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）および０．０２５ｕｎｉｔｓ／μｌのＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）を含
んだ。製造業者の指示に従い、Ｔａｑポリメラーゼを使用する直前に、Ｔａｑ
Ｓｔａｒｔ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）と混合した。
熱サイクルをＧｅｎｅＡｍｐ９６００ＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ）において、以下のプログラム（ホールド：９５℃５分間、サイク
ル：９５℃１５秒間、５３℃３０秒間、７２℃１５秒間を３３サイクル、ホール
ド：７２℃５分間）で実施した。

【００５１】（配列決定）増幅されたＤＮＡを、ＷｉｚａｒｄＰＣＲＰｒｅｐｓＤＮ
ＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、サ
イクル配列決定のために精製した。Ｋ−ｒａｓＡプライマーまたはＫ−ｒａｓ
Ｂプライマーのいずれかを使用して、両方向で配列決定をした。サイクル配列
決定および検出を、製造者によって記載されるように、ＳｉｌｖｅｒＳｅｑｕ
ｅｎｃｅＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で
実施した。サイクル条件は：９５℃５分間、サイクル：９５℃３０秒間、５０℃
３０秒間、７２℃６０秒間を６０サイクル、ホールド：４℃永久であった。この
配列が、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳ
ＴにおけるＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢデータベースに対する
ＢＬＡＳＴ分析（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０
３〜１０（１９９０））により、細胞性ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ２プロトオンコジーン
エキソン１の野生型すなわち正常の配列であることを確認した。

【００５２】（一本鎖鋳型の産生）精製されたＰＣＲ産物を、ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏ
ｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪからのＰＣＲＴｅｍｐｌａ
ｔｅＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎＫｉｔを使用し、λエキソヌクレアーゼ（Ｈｉ
ｇｕｃｈｉおよびＯｃｈｍａｎ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃ
ｈ、１７：５８６５（１９８９））で消化することにより、一本鎖化した。

【００５３】（ジデオキシ−末端オリゴマーの産生）（増幅および配列決定）ｋ−ｒａｓ遺伝子の同じ領域を、細胞株ＳＷ４８０
（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏ
ｃｋｖｉｌｌ、ＭＤ）のゲノムＤＮＡから増幅し、そして上で概略を述べたよう
に精製した。この精製したテンプレート（４０ｎｇ）を、１０ｐｍのＫ−ｒａｓ
ｂ−Ａプライマー（１０μｌの０．７×ＳｅｑｕｅｎａｓｅＲｅａｃｔｉｏ
ｎＢｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中）と混合し、２分間で１００℃まで加
熱し、次いで即座に５分間氷浴中で冷却した。５μｌのＥｎｚｙｍｅＭｉｘ［
１μｌの０．１ＭＤＴＴ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）＋２μｌの５×Ｓｅｑｕｅｎａ
ｓｅＢｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）＋２μｌのＳｅｑｕｅｎａｓｅＶｅ
ｒｓｉｏｎ２．０（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、ＥｎｚｙｍｅＤｉｌｕｔｉｏｎ
Ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中に１：８で希釈したもの］を、氷冷ＤＮ
Ａ混合物に添加した。次いで、この混合物（３．５μｌ）を、３７℃で２００μ
Ｍのα−チオ−ｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）および１μＭのｄｄＡＴＰ（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）の各々２．５μｌを含むチューブに添加した。このことを、同
様に残る３つのｄｄＮＴＰの各々に対して繰り返した。３７℃で５分間、このサ
ンプルをインキュベートした後、３０μｌの１×ＴＥｐＨ７．５（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＣｌｐＨ７．５１ｍＭＥＤＴＡ）をこの反応を停止するために
各チューブに添加した。

【００５４】（テンプレートからの伸長産物（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔ）の精
製）ストレプトアジビンでコートした磁気ビーズ（ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−
２８０、ＤｙｎａｌＩｎｃ．，ＬａｋｅＳｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）を、伸長産
物の固相捕捉のために使用した。使用の前に、製造者の指示に従ってＤｙｎａｂ
ｅａｄｓを２×Ｂ＆Ｗ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１ｍ
ＭＥＤＴＡ，２ＭＮａＣｌ）で洗浄した。各完了したジデオキシ配列決定反
応に対して、４０μｌの１．２５μｇ／μｌのストレプトアジビンでコートした
磁気ビーズ（２×Ｂ＆Ｗ緩衝液中）を各反応に添加した。継続的にボルテックス
しながら１５分間室温でインキュベートした後、このビーズを捕捉し、そして４
０μｌの２×Ｂ＆Ｗ緩衝液で洗浄した。ＤＮＡ二重鎖の融解およびストランドの
分離を、製造者の指示に従って実施した。

【００５５】（変異体および野生型テンプレートからのα−チオ末端オリゴマーの産生）同じ領域のｋ−ｒａｓ遺伝子を、Ｋ５６２およびＳＷ４８０（Ａｍｅｒｉｃａ
ｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌ、Ｍ
Ｄ）細胞株の両方のゲノムＤＮＡから増幅し、そして上で概略を述べたように精
製した。精製したテンプレート（２４０ｎｇ）を、６０ｐｍのＫ−ｒａｓｂ−
Ａプライマー（６０μｌの０．０７×ＳｅｑｕｅｎａｓｅＲｅａｃｔｉｏｎ
Ｂｕｆｆｅｒ中）と混合し、３つの２０μｌアリコートに分散し、３分間で１０
０℃まで加熱し、次いで即座に５分間氷浴中で冷却した。１０μｌのＥｎｚｙｍ
ｅＭｉｘ［１μｌの０．１ＭＤＴＴ＋２μｌの５×ＳｅｑｕｅｎａｓｅＢ
ｕｆｆｅｒ＋２μｌのＳｅｑｕｅｎａｓｅＶｅｒｓｉｏｎ２．０を、Ｅｎｚ
ｙｍｅＤｉｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ中に１：８で希釈したもの］を、氷冷
ＤＮＡ混合物に添加した。次いで、この混合物（２８μｌ）を、３７℃で２０μ
ｌの２６μＭα−チオ−ｄＡＴＰ、５４μＭのｄＡＴＰおよび８０μＭの残りの
３つのｄＮＴＰを含むチューブに添加した。３７℃で５分間、このサンプルをイ
ンキュベートした後、この反応を、７５℃で１０分間、加熱することによって不
活化した。１６μｌの２０Ｕ／μｌＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩＩＩ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ）（７×ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩＩＩＢｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ）中）を含有する溶液を、各不活化した伸長反応に添加した。この反応を、
３７℃で３０分間不活化し、次いで７０℃で１０分間不活化した。

【００５６】（ヌクレオチド変異の伸長検出）（非−伸長検出）２つのハイブリダイゼーション反応は、ＳＷ４８０および
Ｋ５６２α−チオ末端オリゴマー（Ｋ５６２由来のｓｓｋ−ｒａｓテンプレー
トＤＮＡを含むオリゴマーおよびテンプレートＤＮＡを含まないオリゴマー）に
対して設定された。ハイブリダイゼーション反応を含むテンプレートは、以下を
含んでいた：Ｋ５６２またはＳＷ４８０のいずれか由来の３６μｌのα−チオ末
端オリゴマー、１００ｎｇのＫ５６２由来のｓｓｋ−ｒａｓテンプレート、６
０μｌの２×Ｂ＆Ｗ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１．０
ｍＭＥＤＴＡ，２ＭＮａＣｌ）および最終の体積が１２０μｌになるような
分子生物学グレード（ＭＢＧ）水（Ｓｉｇｍａ，Ｗ−４５０２，Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ，ＭＯ）。平行反応は、テンプレートＤＮＡなしで設定された。この反応を、
２分間で９９．９℃に加熱させ、そして１℃／分で５８℃まで冷却した。この反
応物を、ＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−３０遠心分離フィルター装置に移し、そして
７２００×ｇで５分間遠心分離した。保持物を４５０μｌのＭＢＧ水と混合し、
そして２回再濃縮した。この保持物を、最終容量１２μｌに、ＭＢＧ水で調節し
た。この６μｌの保持物を、４μｌ伸長マスターミックス：２５ｍＭのＴｒｉｓ
−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，１２５ｍＭＫＣｌ，５０ｍＭＭｇＣｌ₂，５００μ
Ｍの各ｄＮＴＰおよび０．１２５ユニット／μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）と混合した。Ｔａｑポリメラーゼを使用する直前
に、製造業者の指示に従ってＴａｑＳｔａｒ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌ
ｏＡｌｔｏ，ＣＡ）と混合した。この反応を、以下のように熱サイクルにかけ
た：ホールド：９５℃で５分間、サイクル：９５℃で１５秒、次いで９４℃で１
５秒（２℃減少／サイクル）（１４サイクル）、サイクル：９５℃で１５秒、６
８℃で１５秒（２℃減少／サイクル）、７２℃で１５秒（１９サイクル）。完了
後、４μｌの停止溶液（９５％ホルムアミド，２０ｍＭＥＤＴＡ，０．０５％
ブロモフェノールブルー，０．０５％キシレンシアノ−ルＦＦ）を各反応に添加
した。３μｌの上清を、０．４ｍｍ×２０ｃｍ×３４ｃｍの分析用の６％の変性
ポリアシルアミドゲルに充填した。このゲルを、サンプルを充填しする前に３０
分間４０Ｗで予め泳動し、そして４０ｗで５０分間泳動した。このＰｈｏｔｏｔ
ｏｐｅ−ＳｔａｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢ
ｉｏｌａｂｓ）を、製造者によって示されるビオチン化伸長産物の化学ルミネセ
ンス検出用に使用した。

【００５７】（単一塩基伸長検出）６μｌの単一塩基伸長マスターミックスは、以下を含
む：１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌＲｅａｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（ＮｅｗＥｎ
ｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ．ＭＡ）、２．０ｍＭ
のＭｇＳＯ₄、２００μＭの未標識のｄｄＮＴＰ（末端のジデオキシヌクレオチ
ドに一致する）、２００μＭの³³Ｐで標識した３つの残るｄｄＮＴＰ（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ）、１ｎｇ／μｌの一本鎖テンプレートＤＮＡおよび０．０１ユニット
／μｌのＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａ
ｂｓ，Ｉｎｃ．）を、固相伸長産物を懸濁するために使用した。熱サイクルを以
下のようにかけた：ホールド：９５℃で５分間、サイクル：９５℃で１５秒、次
いで９４℃で１５秒（２℃減少／サイクル）（１４サイクル）、サイクル：９５
℃で１５秒、６８℃で１５秒（２℃減少／サイクル）、７２℃で１５秒（１９サ
イクル）、ホールド：４℃。

【００５８】本願の全体で、種々の刊行物が引用される。これらの刊行物の開示の全体は、
本発明が属する技術水準をより十分に記載するために、明細書中において本願に
参考として援用される。

【００５９】本発明のプロセスは、その特定の実施態様の詳細な説明に参照として記載され
が、このような説明は、添付の特許請求の範囲に含まれる範囲を除き、本発明の
範囲を限定するものとして扱われることを意図するものではない。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、単一塩基伸長テンプレート交換反応伸長検出法を模式的に示す。

【図２】図２は、伸長検出法を模式的に示す。

【図３】図３は、エキソ制限末端を用いる、非伸長テンプレート交換伸長反応検出法を
模式的に示す。

【図４】図４は、３’末端に組み込まれたジデオキシヌクレオチドを用いる、非伸長テ
ンプレート交換伸長反応検出法を模式的に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA01 CA09 CA11 HA12 4B063 QA01 QA17 QQ42 QQ52 QR08 QR42 QR48 QR56 QR62 QR82 QS25 QS34 QS36 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】第一の核酸内におけるヌクレオチド変異を検出する方法であ
って、以下の工程：ａ）該第一の核酸から、１セットの一本鎖伸長産物を、改変ヌクレオチド塩基
の存在下で生成する工程であって、該伸長産物が改変ヌクレオチドを取り込み、
それによって、３’末端ヌクレオチド塩基に対してエキソヌクレアーゼ活性を制
限し、かつ、該伸長産物が種々の長さを有する、工程；ｂ）該種々の長さの伸長産物を、参照核酸に対してハイブリダイズさせる工程
；ｃ）該ハイブリダイズする核酸を、選択された標識ヌクレオチドの存在下で、
該伸長産物の３’末端ヌクレオチドを除去し得、そして置換し得る酵素と接触さ
せる工程であって、該参照核酸における対応する位置とハイブリダイズしない３
’ヌクレオチドで停止する伸長産物が、該参照核酸上の対応するヌクレオチドと
ハイブリダイズするヌクレオチドで置き換えられ、そして、該３’末端において
ハイブリダイズしないヌクレオチドを有していた伸長産物が今度は、該３’末端
においてハイブリダイズするヌクレオチドを有していた伸長産物から識別され得
る、工程；およびｄ）その３’末端においてハイブリダイズしないヌクレオチドを有していた伸
長産物を、その３’末端においてハイブリダイズするヌクレオチドを有していた
伸長産物から識別し、それによって、該第一の核酸におけるヌクレオチド変異を
検出する工程、を包含する、方法。
【請求項２】前記改変ヌクレオチドがチオ改変されたデオキシヌクレオチ
ドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記改変ヌクレオチドがボラン改変されたデオキシヌクレオ
チドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記伸長産物において３’末端ヌクレオチドを除去し、そし
て置換する前記酵素がプルーフリーディングポリメラーゼを含む、請求項１に記
載の方法。
【請求項５】前記伸長産物が改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】前記改変が前記伸長産物にビオチンを連結させることを含む
、請求項５に記載の方法。
【請求項７】前記改変が前記伸長産物に対してハプテンを連結させること
を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】さらに、前記工程ａ）の伸長産物を、固体支持体に結合させ
ることによって、該伸長産物を単離する工程を包含する、請求項１に記載の方法
。
【請求項９】前記伸長産物が、ビオチンで標識されており、そして該伸長
産物をストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体へと結合させること
によって単離される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】前記工程ｃ）が、さらに、第二の標識で標識されたジデオ
キシヌクレオチド三リン酸の形態において、前記選択されたヌクレオチド塩基の
存在下で、前記接触工程を実施し、それによって、前記酵素の機能について陽性
コントロールを提供することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】前記伸長産物が、連鎖終結ヌクレオチドの該伸長産物への
取り込みによって種々の長さになる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】前記伸長産物が、該伸長産物の部分的なエキソヌクレアー
ゼ消化によって種々の長さになる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】第一の核酸内においてヌクレオチド変異の存在を検出する
方法であって、以下の工程：ａ）該第一の核酸から、１セットの一本鎖伸長産物を、改変ヌクレオチド塩基
の存在下で生成する工程であって、該伸長産物が、３’末端ヌクレオチド塩基に
対してエキソヌクレアーゼ活性を制限する改変ヌクレオチドを取り込み、かつ、
該伸長産物が種々の長さを有する、工程；ｂ）該種々の長さの伸長産物を、参照核酸に対してハイブリダイズさせる工程
；ｃ）該ハイブリダイズする核酸を、さらなる置換に対して耐性であり、そして
伸長産物に取り込まれたときに該伸長産物のさらなる伸長を阻害する選択された
改変ヌクレオチドの存在下で、該伸長産物の３’末端ヌクレオチドを除去し得、
そして置換し得る酵素と接触させる工程であって、改変されていないヌクレオチ
ドで停止する伸長産物が、さらに伸長され得、それによって、さらに伸長され得
ない伸長産物から識別され得る、工程；ｄ）該取り込まれていない選択された、改変ヌクレオチドを除去する工程；ｅ）さらに伸長され得る伸長産物を伸長する工程；およびｆ）さらに伸長された伸長産物を、さらに伸長され得ない伸長産物から識別し
、それによって、該第一の核酸におけるヌクレオチド変異を検出する工程、を包含する、方法。
【請求項１４】前記選択された改変ヌクレオチドが、チオ改変されたジデ
オキシヌクレオチド三リン酸を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】前記選択された改変ヌクレオチドが、ボラン改変されたジ
デオキシヌクレオチド三リン酸を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】前記工程（ｄ）が、さらに、酵素エビアルカリホスファタ
ーゼの活性のために適切な条件下で、該酵素エビアルカリホスファターゼを添加
し、続いて、該酵素を不活化することを包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】前記伸長産物において３’末端ヌクレオチドを除去し、そ
して置換する前記酵素がプルーフリーディングポリメラーゼを含む、請求項１３
に記載の方法。
【請求項１８】前記伸長産物が改変されている、請求項１３に記載の方法
。
【請求項１９】前記改変が前記伸長産物にビオチンを連結させることを含
む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】前記改変が前記伸長産物に対してハプテンを連結させるこ
とを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】さらに、前記工程ａ）の伸長産物を、固体支持体に結合さ
せることによって、該伸長産物を単離する工程を包含する、請求項１３に記載の
方法。
【請求項２２】前記伸長産物が、ビオチンで標識されており、そして該伸
長産物をストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体へと結合させるこ
とによって単離される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】前記伸長産物が、連鎖終結ヌクレオチドの該伸長産物への
取り込みによって種々の長さになる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】前記伸長産物が、該伸長産物の部分的なエキソヌクレアー
ゼ消化によって種々の長さになる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】第一の核酸内のヌクレオチド変異を検出する方法であって
、以下の工程：ａ）該第一の核酸から、１セットの一本鎖伸長産物を、改変ヌクレオチド塩基
および連鎖終結ヌクレオチド塩基の存在下で生成する工程であって、該伸長産物
が、３’末端ヌクレオチド塩基に対してエキソヌクレアーゼ活性を制限する改変
ヌクレオチドを取り込み、かつ、該伸長産物が種々の長さを有する、工程；ｂ）該種々の長さの伸長産物を、参照核酸に対してハイブリダイズさせる工程
；ｃ）該ハイブリダイズする核酸を、デオキシヌクレオチド三リン酸の存在下で
、該伸長産物の３’末端ヌクレオチドを除去し得、そして置換し得る酵素と接触
させる工程であって、最後から２番目の３’ヌクレオチドが、該伸長産物からの
除去に耐性であり、該参照核酸上の対応する位置でハイブリダイズしない最後か
ら２番目の３’ヌクレオチドが、該参照核酸上の対応するヌクレオチドとハイブ
リダイズするヌクレオチドでは置換されず、それによって、さらに伸長され得な
い、工程；ｄ）さらに伸長され得る伸長産物を伸長する工程；およびｅ）さらに伸長された伸長産物を、さらに伸長され得ない伸長産物から識別し
、それによって、該第一の核酸におけるヌクレオチド変異を検出する工程、を包含する、方法。
【請求項２６】前記一本鎖伸長産物が、検出可能な標識で標識されており
、前記識別する工程ｅ）が、前記工程ｄ）からの反応物のゲル電気泳動を行うこ
とを包含し、ここで、該電気泳動が、さらに伸長されていない標識された伸長産
物と、さらに伸長された標識された伸長産物との間を識別するに充分な解像度で
ある、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】前記改変ヌクレオチドが、チオ改変されたデオキシヌクレ
オチドを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】前記改変ヌクレオチドが、ボラン改変されたデオキシヌク
レオチドを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】前記伸長産物において３’末端ヌクレオチドを除去し、そ
して置換する前記酵素がプルーフリーディングポリメラーゼを含む、請求項２５
に記載の方法。
【請求項３０】前記伸長産物が改変されている、請求項２５に記載の方法
。
【請求項３１】前記改変が前記伸長産物にビオチンを連結させることを含
む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】前記改変が前記伸長産物に対してハプテンを連結させるこ
とを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】さらに、前記工程ａ）の伸長産物を、固体支持体に結合さ
せることによって、該伸長産物を単離する工程を包含する、請求項２５に記載の
方法。
【請求項３４】前記伸長産物が、ビオチンで標識されており、そして該伸
長産物をストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体へと結合させるこ
とによって単離される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】第一の核酸内のヌクレオチド変異を検出する方法であって
、以下の工程：ａ）該第一の核酸から、１セットの一本鎖伸長産物を、改変ヌクレオチド塩基
の存在下で生成する工程であって、該伸長産物が、３’末端ヌクレオチド塩基に
おいてエキソヌクレアーゼ活性を阻害する改変ヌクレオチドを取り込み、かつ、
該伸長産物が種々の長さを有する、工程；ｂ）該種々の長さの伸長産物を、参照核酸に対してハイブリダイズさせる工程
；ｃ）該ハイブリダイズする核酸を、デオキシヌクレオチド三リン酸の存在下で
、該参照核酸上の対応する位置でハイブリダイズする３’末端ヌクレオチドを有
する伸長産物をさらに伸長し得、それによって、該参照核酸上の対応する位置で
ハイブリダイズしない３’末端ヌクレオチドを含む伸長産物がさらに伸長されな
い、工程；ｄ）さらに伸長され得る伸長産物を伸長する工程；およびｅ）さらに伸長された伸長産物を、さらに伸長され得ない伸長産物から識別し
、それによって、該第一の核酸におけるヌクレオチド変異を検出する工程、を包含する、方法。
【請求項３６】前記伸長産物が、該伸長産物の部分的なエキソヌクレアー
ゼ消化によって種々の長さになる、請求項３５に記載の方法。