MÉTODOS Y MEDIOS PARA LA EXPRESIÓN DE POLIPEPTIDOS DE MAMÍFEROS EN PLANTAS MONOCOTILEDONEAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con la expresión de transgenes en plantas, especialmente monocotiledóneas, en particular genes no vegetales o de mamíferos que codifican polipéptidos tales como anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. Las construcciones de expresión, las plantas transformadas y las células y varios métodos se proporcionan de acuerdo con varios aspectos de la invención. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las plantas ofrecen varias ventajas potenciales para la producción de polipéptidos de utilidad industrial o médica, tales como proteínas para mamíferos, incluyendo moléculas de anticuerpos, ya sea anticuerpos completos o fragmentos tales como moléculas de anticuerpos Fv de cadena simple (scFv) , y proteínas de fusión. La síntesis de anticuerpos funcionales en plantas transgénicas se demostró por primera vez por Hiatt y colaboradores, (Nature (1989) 342: 76-78) y posteriormente se han expresado con éxito fragmentos de cadena simple en hojas de tabaco y plantas Arabidopsis (Owen y colaboradores, (1992) Bio/Technology 10:790-794; Artsaenko y colaboradores, (1995) The Plant J 8: 745-750; Fecker y colaboradores, (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986). Fiedler y colaboradores, (Bio/Technology (1995) 13: 1090-1093) han mostrado la factibilidad de almacenamiento de los scFv en semillas de tabaco . Casi exclusivamente, este trabajo ha sido en plantas dicotiledóneas. Sin embargo, las plantas de cultivos monocotiledóneos tales como trigo y arroz tienen ventajas sobre las dicotiledóneas tales como el tabaco porque no contienen productos químicos nocivos tales como alcaloides. Esto aumenta las posibilidades para la producción segura de polipéptidos para uso farmacéutico. Además, las plantas de cereales son de importancia particular en contextos de alimentos, permitiendo la provisión de "alimentos funcionales" que pueden tener beneficios para la salud potenciales. Una aplicación ejemplar es el de los anticuerpos anti-caries dental, por ejemplo, como se expresa por Ma y colaboradores, (Eur J Immunol 24: 131-138 (1994) ; Plant Physiology 109, 341-346 (1995) ; Science (1995) 268, 716-719) en tabaco transgénico (no un alimento funcional como tal) . Hasta donde los presentes inventores lo saben el único ejemplo experimental de expresión de un anticuerpo o de otra proteína de mamífero en una monocotiledónea se describe en WO98/10062 (Monsanto), publicada el 12 de marzo de 1998. Este documento reporta la expresión de cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos de plásmidos separados en plantas de maíz transgénicas, bajo el control del promotor de glutelina-1 de arroz.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Los presentes inventores han considerado varias construcciones de expresión para genes de mamíferos tales como anticuerpos que se van a producir en plantas trangénicas, especialmente monocotiledóneas, preferiblemente cebada, arroz, maíz, trigo, avena, sorgo, más preferiblemente trigo, arroz. Como se nota, nadie anteriormente ha reportado la expresión exitosa de estos genes en estas plantas. La evidencia experimental descrita más adelante muestra varias ventajas y beneficios del uso de diferentes aspectos de las construcciones de expresión. En un aspecto de la presente invención se ha encontrado que niveles de expresión de anticuerpos en monocotiledóneas puede aumentar empleando una señal de retención de retículo endoplásmico (RE) . Esta señal es una etiqueta de péptido que usualmente incluye la secuencia de aminoácidos Lys Asp Glu Leu (KDEL) (SEQ ID NO. 2) o His Asp Glu Leu (HDEL) (SEQ ID NO. 4) . Artsaenko y colaboradores, empleó KDEL en la expresión de un anticuerpo Fv de cadena simple contra el ácido abscísico en el tabaco dicotiledóneo (The Plant J. (1995) 8: 745-750), pero esto no se ha mostrado previamente que sea funcional en monocotiledóneas. En otro aspecto de la presente invención, varias secuencias de péptídos delanteras se ha encontrado que aumentan la expresión de anticuerpos en plantas, especialmente monocotiledóneas. Ninguna de estas previamente ha mostrado ser efectiva en plantas. Más adelante se proporcionan detalles, pero no se ha encontrado expresión medible de molécula de anticuerpo en callo de raíz usando una construcción sin una secuencia de péptidos líder. En todavía otro aspecto de la presente invención varias regiones no traducidas 5' (5'UTR) se han empleado en la expresión de moléculas de anticuerpos en plantas en particular la chalconasintasa y omega 5 ' UTR (véase más adelante los detalles) . De nuevo, ninguna de éstas ha demostrado previamente ser efectiva como se demuestra en la presente en plantas, especialmente monocotiledóneas. Varios aspectos de la invención proporcionan construcciones y vectores de ácido nucleico que incluyen uno o más de estos elementos, células huésped transformadas, que pueden ser microbianas o vegetales, callo transgénico y cultivos en suspensión, plantas y varios métodos para la provisión o el uso de estas construcciones, vectores, células huésped, cultivos y vegetales en producción de polipéptidos eucarióticos no vegetales, tales como moléculas para anticuerpos . Breve descripción de la figura La Figura 1 muestra un esquema de los componentes en las construcciones de expresión de acuerdo con la presente invención. Además del promotor y del gen de interés, se pueden incluir uno o más de los otros elementos (5 'UTR, péptido líder, en señal (por ejemplo, KDEL), 3' UTR, pA - señal de poliadenilación) y la presente invención proporciona cualquier combinación de estos elementos. DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención se proporciona una célula vegetal o semilla, preferiblemente monocotiledónea, que contiene un polipéptido producido por la expresión dentro de la célula o semilla a partir de un cásete de expresión que incluye una secuencia de codificación para el polipéptido fusionado con una señal de retención de retículo endoplásmico. La señal de retención puede ser un péptido con la secuencia de aminoácidos KDEL (SEQ ID NO. 2) o HDEL (SEQ ID NO. 4) . KDEL puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos AAA GAT GAG CTC (SEQ ID NO. 1) y HDEL puede estar codificada por CAT GAT GAG CTC (SEQ ID NO. 3) . Otras secuencias que codifican los aminoácidos pero difieren de estas secuencias de nucleótidos en virtud de la degeneración del código genético se pueden emplear. La secuencia de codificación KDEL o HDEL se pueden enlazar operablemente a una secuencia de codificación para el polipéptido para proporcionar una secuencia de codificación para una fusión del polipéptido y la señal de retención RE. Generalmente la señal de retención se coloca en el término C del polipéptido. La señal de retención RE puede estar precedida por una secuencia enlazadora, tal como (Gly) 4Ser (SEQ ID NO. 5) y/o Arg Gly Ser Glu (RGSE) (SEQ ID NO. 6) (Wandelt y colaboradores, (1992) Plant J. 2 (2) : 181-192) . De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención se proporciona una célula vegetal o semilla, preferiblemente monocotiledónea, que contiene un polipéptido producido mediante la expresión dentro de la célula o semilla a partir de un cásete de expresión que incluye una secuencia de codificación para el polipéptido y una secuencia líder no traducida 5' (5' UTR). La 5' UTR puede ser la del gen chalconasintasa de la petunia (Reimold y colaboradores, (1983) EMBO J 2: 1801-1805) o una forma modificada que incluye una o más adiciones, supresiones, sustituciones o inserciones de uno o más nucleótidos, preferiblemente modificados para incluir las T en la siguiente secuencia: GAATTCACAACACAAATCAGATTTATAGAGAGATTTATAAAAAAAAAAAAACATATG (SEQ ID NO. 7). La 5 ' UTR puede ser la del gen omega de TMV (Gallie y colaboradores, (1992) NAR 20: 4631-4638) o una forma modificada que incluye una o más adiciones, supresiones, sustituciones o inserciones de uno o más nucleótidos, preferiblemente incluyendo modificaciones como se describe por Schmitz y colaboradores, (1996) NAR 24: 257-263; incorporados en la presente mediante referencia. La secuencia líder no traducida omega de la cepa Ul de TMV es (a nivel ARN) :
GUAUUUUUACAACAAUUACCAACAACAACAAACAACAAACAACAUUACAAUUACUAUUUAC AAUUACAATG (SEQ ID NO. 8) . (Obviamente las "U" son "T" a nivel ADN. El codón de iniciación se indica al final de la secuencia aquí) . Una modificación preferida de acuerdo con las modalidades de la presente invención es alterar las AUU subrayadas como AGG. Adicionalmente, una o más de las A subrayadas se puede suprimir. Una secuencia modificada preferida es: GUAUUUUUACAACAAUUACCAACAACAACAACAACAACAACAUUACAAUUACUAUUUACAA GGACCAUGG (SEQ ID NO. 9) . Además de la modificación preferida AUU - ? AGG, esto también incluye una secuencia casi de Kozak ACCAUGG, en donde el AUG es el codón de iniciación. De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención se proporciona una célula vegetal o semilla, preferiblemente monocotiledónea, que contiene un polipéptido producido por la expresión dentro de la célula o semilla a partir de un cásete de expresión que incluye una secuencia de codificación del polipéptido y un péptido líder. El péptido líder se puede usar para dirigir el producto a un compartimiento celular particular. El péptido líder puede ser de origen mamífero, y puede ser murino, tal como un péptido líder de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina. La secuencia de nucleótidos usada en la construcción para codificar el péptido líder puede ser codón optimizado para la expresión en la planta de interés, preferiblemente monocotiledónea, por ejemplo, arroz o trigo. Un péptido líder preferido útil de acuerdo con este aspecto de la presente invención es el del virión TMV mAb24 específico de Voss y colaboradores, (Mol Breed (1995) 1: 39-50) (incorporado en la presente mediante referencia) . Se pueden emplear formas modificadas. Como con otros elementos para el uso en casetes de expresión de acuerdo con varios aspectos de la presente invención, la secuencia de codificación puede ser de codón optimizada para el uso de codón monocotiledóneo de acuerdo con Angenon y colaboradores, (FEBS (1990) 271: 144-146)
(incorporada en la presente mediante referencia) . El péptido líder puede ser una señal que se dirige a vacuola, tal como el péptido líder del gen estrictosidina sintasa, por ejemplo, el de la estrictosidina sintasa de Catharanthus roseus (McKnight y colaboradores, Nucleic Acids Research (1990), 18, 4939; incorporada en la presente mediante referencia) o de la estrictosidina sintasa de Rauwolfia serpentina (Kutchan y colaboradores, (1988) FEBS Lett 237 40-44; incorporada en la presente mediante referencia) . Para una revisión de las secuencias dirigidas a vacuola ver Neuhaus (1996) Plant Physiol Biochem 34(2) 217-221. El péptido líder puede ser una señal dirigida a cloroplasto tal como la secuencia de péptido líder del chícharo rubisco (Guerineau y colaboradores, (1988) NAR 16 11 380) (incorporado en la presente mediante referencia) . Para una revisión de péptidos dirigidos a cloroplasto ver van Heijne
..yMM-aM y colaboradores, (Eur J Biochem (1989) 180: 535-545) o Kavanagh y colaboradores, (MGG (1988) 215: 38-45) o Karlin-Neumann y colaboradores, (EMBO J (1986) 5: 9-13) (todos incorporados en la presente mediante referencia) . El péptido líder puede ser una secuencia 5' de una proteína de almacenamiento de semilla, dicotiledónea o monocotiledónea, que causa el transporte en cuerpos de proteína, tales como el delantero B4 de leguminosa Vicia fabia (Baeumlein y colaboradores, Mol Gen Genet (1991) 225: 121-128) (incorporada en la presente mediante referencia) . Un aspecto de esta invención es una célula de planta de cereal o semilla que contiene una proteína de mamífero producida mediante la expresión dentro de la célula o semilla a partir de un cásete de expresión que comprende una secuencia de codificación para la proteína. En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula de planta de maíz o semilla que contiene una proteína de mamífero producida por la expresión dentro de la célula o semilla a partir de un cásete de expresión que incluye una secuencia de codificación para la proteína. En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula o semilla de planta de arroz que contiene una proteína de mamífero producida por la expresión dentro de la célula o semilla a partir de un cásete de expresión que incluye una secuencia de codificación para la proteína. Todavía otro aspecto de la presente invención proporciona una célula o semilla de planta de trigo que contiene una proteína de mamífero producida por la expresión dentro de la célula o semilla a partir de un cásete de expresión que incluye una secuencia de codificación para la proteína. En otros aspectos de la presente invención se proporcionan métodos para la producción de células vegetales de acuerdo con los aspectos descritos anteriormente, incluyendo los métodos de introducir en un ácido nucleico de célula de planta incluyendo la construcción de expresión específica. Técnicas convenientes para esto, incluyen la construcción del vector, la transformación de célula de planta, y la regeneración de plantas se discuten más adelante. De este modo, por ejemplo, uno de estos aspectos de la invención proporciona un método que incluye introducir en una célula vegetal, especialmente monocotiledónea, ácido nucleico que incluye un cásete de expresión que incluye una secuencia de codificación para un polipéptido de interés fusionado a una señal de retención de retículo endoplásmico (RE) . La introducción de ácido nucleico en células se puede denominar como una "transformación" y las células resultantes se pueden denominar "transgénicas". Esto es sin limitación a cualquier método o medio usado para introducir el ácido nucleico en las células. Una célula transformada se puede criar o cultivar, y
*-•* -* * i otros aspectos de la presente invención proporcionan un cultivo de suspensión o cultivo de callo que incluye estas células. Como se nota más adelante, otros aspectos proporcionan plantas y partes de las mismas, y métodos de producción de plantas mediante la transformación de células y regeneración. Deberá notarse que las células de plantas expresan transitoriamente el polipéptido deseado después de la transformación con el cásete de expresión adecuado se proporcionan mediante la presente invención, pero un aspecto adicional proporciona un método para hacer una célula de planta, preferiblemente monocotiledónea, que incluye un cásete de expresión como se describe, el método incluye: (i) introducir un vector de ácido nucleico conveniente para la transformación de una célula de planta y que incluye el cásete de expresión en la célula de planta, y,
(ii) causar o permitir la recombinación entre el vector y el genoma de célula de planta para introducir el cásete de expresión en el genoma. En todavía otro aspecto la presente invención proporciona un método para hacer una planta, el método incluye: (i) hacer células de plantas como se describen; y (ii) regenerar una planta a partir de dichas células de planta o descendientes de las mismas. Este método además puede incluir clonación o propagación de la planta o un descendiente de la misma que contiene el cásete de expresión relevante dentro de su genoma. En varias modalidades de la presente invención la célula o semilla está activamente producida por el polipéptido o proteína. El polipéptido expresado preferiblemente es una proteína no vegetal, eucariótica, especialmente de origen mamífero, y se puede seleccionar de moléculas anticuerpos, albúmina de suero humano (Dugaiczyk y colaboradores, (1982) PNAS USA 79: 71-75 (incorporada en la presente mediante referencia) , eritropoyetina, otras moléculas terapéuticas o sustitutos de sangre, proteínas con valor nutritivo aumentado, y puede ser una forma modificada de cualquiera de estos, por ejemplo, que incluye una o más inserciones, supresiones, sustituciones y/o adiciones de uno o más aminoácidos. (La secuencia de codificación preferiblemente se modifica para intercambiar codones que son raros en monocotiledóneas de acuerdo con los principios para uso de codón) . En modalidades preferidas de la presente invención, una proteína de mamífero es una molécula de anticuerpo, que incluye un polipéptido o complejo de polipéptidos que incluyen un dominio de enlace de inmunoglobulina, ya sea natural o sintético. Las moléculas quiméricas que incluyen un dominio de enlace de inmunoglobulina se fusionan a otro polipéptido y por lo tanto se incluyen. Fragmentos de enlace ejemplares son (8) el fragmento Fab que consiste en dominios VL, VH CL y CH1 ;
- y¿ i U „, - "-<•> (ii) el fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1 ; (iii) el fragmento Fv que contiene los dominios VL y VH de un anticuerpo simple; (iv) el fragmento dAb (Ward, E.S., y colaboradores, Nature 341, 544-546 (1989) incorporado en la presente mediante referencia) que consiste en un dominio VH; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab; (vii) moléculas Fv de cadena simple (scFv) , en donde un dominio VH y un dominio VL están enlazados mediante un enlazador péptido que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de enlace de antígeno (Bird y colaboradores, Science, 242, 423-426, 1988; Huston y colaboradores, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988) ; (viii) dímeros Fv de cadena simple y biespecíficos (PCT/US92/09965) y (ix) "diacuerpos" , fragmentos multivalentes o ultiespecíficos construidos mediante fusión de genes (WO94/13804; P. Holliger y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, (1993) (todos incorporados en la presente mediante referencia) . Los diacuerpos monoespecíficos pero bivalentes se pueden producir mediante la expresión a partir de una sola secuencia de codificación, en donde los polipéptidos se asocian para formar dímeros que incluyen dos sitios de enlace de antígenos. Los diacuerpos biespecíficos se forman mediante la asociación de dos péptidos diferentes, expresados a partir de secuencias de codificación respectivas. Cuando el producto deseado es un complejo de polipéptidos de dos cadenas o de cadenas múltiples (por ejemplo, la molécula Fab o el biacuerpo biespecífico) , los casetes de expresión se pueden introducir en células vegetales de acuerdo con la presente invención en el mismo vector o en 5 vectores separados. En un aspecto particular de la invención una célula vegetal, preferiblemente monocotiledónea, se transforma por separado por cuatro vectores, incluyendo cada uno ácido nucleico que codifica una de cuatro cadenas de un anticuerpo secretor, a saber la cadena pesada, la cadena
10 ligera, el componente secretor y la cadena J. El producto puede ser una proteína de fusión que incluye proteínas diferentes o dominios de proteínas diferentes. Por ejemplo, ciertas modalidades de la presente invención se relacionan con la provisión de proteínas de fusión
15 en las cuales una molécula de anticuerpo (tal como una molécula scFv o una o ambas cadenas de una molécula de anticuerpo multimérico tal como un fragmento Fab o un anticuerpo entero) se fusiona con un dominio de proteína que no es anticuerpo, tal como la interleucina 2, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa (un
20 ejemplo de un modificador de respuesta biológica) , proteína fluorescente verde (un ejemplo de una etiqueta colorimétrica) . La molécula que no es anticuerpo se puede fusionar al componente de anticuerpo en el término N- o C últimos. Los expertos en la técnica son muy capaces de
25 construir vectores y diseñar protocolos para la expresión de
títj genes recombinantes en plantas. Los vectores convenientes se pueden elegir o construir, que contienen secuencias reguladoras adecuadas, incluyendo secuencias promotoras, fragmentos terminadores, secuencias de poliadenilación, secuencias 5 mejoradoras, genes marcadores y otras secuencias como sea adecuado. Para mayores detalles ver, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook y colaboradores, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas conocidas y protocolos para la manipulación de
10 ácido nucleico, por ejemplo, la preparación de construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciamiento, introducción de ADN en células y expresión de genes, y análisis de proteínas, se describen en detalle en Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel y colaboradores,
15 eds., John Wiley & Sons, 1992. Las descripciones de Sambrook y colaboradores, y Ausubel y colaboradores, se incorporan en la presente mediante referencia. Los procedimientos específicos y los vectores previamente usados con amplio éxito en plantas se describen por Bevan (Nucí. Acids Restricción 12, 8711-8721
20 (1984)) y Guerineau y Mullineaux (1993) (Plant transformation and expression vectors. In: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed) Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp 121-148) . Los marcadores genéticos seleccionables que se pueden usar consisten en genes quiméricos que confieren fenotipos
25 seleccionables tales como resistencia a antibióticos tales como
canamicina, higromicina, fosfonitricina, clorosulfurón, metotrexato, gentamicina, espectinomicina, imidazolinonas y glifosato. La estructura central del vector puede ser pUC (Yanisch-Perron y colaboradores, (1985) Gene 33 : 103-119) o pSS (Voss y colaboradores, (1995) Mol Breed 1: 39-50). El c sete de expresión empleado de acuerdo con aspectos de la presente invención pueden incluir la secuencia de codificación bajo el control de un promotor de gen inducible externamente para colocar la expresión bajo el control del usuario. Un promotor inducible conveniente es el promotor de gen GST-II-27 que ha demostrado ser inducido por ciertos compuestos químicos que se pueden aplicar a plantas en crecimiento. El promotor es funcional tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas. El promotor GST-II-27 también es conveniente para el uso en una variedad de tejidos, incluyendo raíces, hojas, tallos y tejidos reproductivos. Otros promotores convenientes incluyen cualquier promotor constitutivo y cualquier promotor específico de semilla. Los ejemplos incluyen el promotor ubicuitina de maíz y el intrón (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número US-A-5510474) , promotor CaMV 35S (Gardner y colaboradores, (1981) NAR 9: 2871-2888), y el promotor de glutenina de bajo peso molecular de trigo (Colot y colaboradores, (1987) EMBO J 6: 3559-3564).
Una señal de poliadenilación tal como el terminador
NOS se puede usar (Depicker y colaboradores, (1982) J. Mol Appl
Genet 1: 499-512) . Un 3 ' UTR tal como la secuencia modificada de TMV como se describe por Voss y colaboradores, (Mol . Breed. (1995) 1:39-50) se puede usar. Cuando se introduce una construcción de gen elegido en una célula, se deben tomar en cuenta ciertas consideraciones, muy conocidas para los expertos en la técnica. El ácido nucleico que se va a insertar deberá ensamblarse dentro de una construcción que contiene elementos reguladores efectivos que llevarán la transcripción. Debe estar disponible un método para transportar la construcción a la célula. En cuanto la construcción está dentro de la membrana celular, la integración en el material cromosomal endógeno ocurrirá o no ocurrirá. Finalmente, en lo que se refiere a las plantas el tipo de célula objetivo puede ser tal que las células se puedan regenerar en plantas completas, aunque como se nota los cultivos en suspensión o los cultivos de callos están dentro de la presente invención. Una célula vegetal o semilla de acuerdo con la presente invención puede estar compuesta en una planta o en partes (por ejemplo, hoja, raíz, tallo) o en un propágulo de la misma . Las plantas que incluyen una célula vegetal de acuerdo con la invención también se proporcionan, junto con
,.t y^-?j- cualquier parte o propágulo de la misma, semilla, progenie natural o híbrida y descendientes. Una planta de acuerdo con la presente invención puede ser una que no se obtenga de verdad en una o más propiedades. Las variedades de plantas se pueden excluir, particularmente las variedades de plantas registrables de acuerdo con los derechos de los obtentores de plantas. Se nota que una planta no necesita ser considerada una "variedad de planta" simplemente debido a que contiene establemente dentro de su genoma transgén, introducido en una célula de la planta o un ancestro del mismo. Además de una planta, la presente invención proporciona un clon de esta planta, semilla, progenie y descendientes naturales o híbridos, y cualquier parte o de cualquiera de estos, tales como cortes, semillas. La invención proporciona cualquier propágulo de planta, esto es cualquier parte que se pueda usar en la reproducción o propagación, sexual o asexual, incluyendo cortes, semillas y así sucesivamente. También se abarcan por la invención una planta que es retoño, clon o descendiente propagado sexualmente o asexualmente de esta planta, o cualquier parte o propágulo de dicha planta, retoño, clon o descendiente. Las plantas transformadas con un cásete de expresión que contienen la secuencia de codificación deseada se pueden producir mediante varias técnicas que ya son conocidas para la manipulación genética de plantas. El ADN se pueden transformar
-S S ?^? ^e en células de plantas usando cualquier tecnología conveniente, tal como un vector de plásmido Ti desarmado llevado por Agrobacterium explotando su capacidad natural de transferencia de genes (EP-A-270355, EP-A-0116718 , NAR 12(22) 8711-87215 1984) , bombardeo de micropartículas o de partículas (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5100792, Patentes europeas EP-A-444882, EP-A-434616) microinyección (Publicaciones internacionales WO 92/09696, WO 94/00583, Patentes europeas EP 331083, EP 175966, Green y colaboradores, (1987) Plant Tissue and Cell Cul ture, Academic Press) , electroincorporación (Patente europea EP 290395, Publicación internacional WO 8706614 Gelvin Debeyser - véase anexo) otras formas de captura de ADN directo (DE 4005152, Publicación internacional WO 9012096, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 4684611) , asimilación de ADN mediado por liposoma (por ejemplo, Freeman y colaboradores, Plant Cell Physiol . 29: 1353 (1984)), o el método de vórtice (por ejemplo, Kindle, PNAS U. S.A. 87: 1228 (1990d) (todos incorporados en la presente mediante referencia) . Los métodos físicos para la transformación de células vegetales se revisan en Oard, 1991, Biotech, Adv. 9 : 1-11. La transformación de agrobacterium se usa ampliamente para aquellos expertos en la técnica para transformar especies dicotiledóneas. Recientemente, ha habido un avance sustancial hacia la rutina de producir plantas transgénicas fértiles,
_?<Éari__t_i estables en casi todas las plantas monocotiledóneas económicamente relevantes (Toriyama, y colaboradores, (1988) Bio/Technology 6, 1072-1074; Zhang, y colaboradores, (1988) Plant Cell Rep . 7, 379-384; Zhang, y colaboradores, (1988) Theor Appl Genet 76, 835-840; Shimamoto, y colaboradores, (1989) Nature 338, 274-276; Datta, y colaboradores, (1990) Bio/Technology 8, 736-740; Christou, y colaboradores, (1991) Bio/Technology 9, 957-962; Peng, y colaboradores, (1991) International Rice Research Institute, Manila, Philippines 563-574; Cao, y colaboradores, (1992) Plant Cell Rep . 11, 585-591; Li, y colaboradores, (1993) Plant Cell Rep . 12, 250-255; Rathore, y colaboradores, (1993) Plant Molecular Biology 21, 871-884; Fromm, y colaboradores, (1990) Bio/Technology 8 , 833-839; Gordon-Kamm, y colaboradores, (1990) Plant Cell 2 , 603-618; D'Halluin, y colaboradores, (1992) Plant Cell 4, 1495-1505; Walters, y colaboradores, (1992) Plant Molecular Biology 18, 189-200; Koziel, y colaboradores, (1993) Biotechnology 11, 194-200; Vasil, I. K. (1994) Plant Molecular Biology 25, 925-937; Weeks, y colaboradores, (1993) Plant Physiology 102, 1077-1084; So ers, y colaboradores, (1992) Bio/Technology 10, 1589-1594; Publicación internacional W092/14828) . En particular, la transformación mediada por Agrobacterium está surgiendo también como un método de transformación alternativo muy eficiente en monocotiledóneas (Hiei y colaboradores, (1994) The Plant Journal 6, 271-282) .
La generación de plantas transgénicas fértiles se ha logrado en cereales arroz, maíz, trigo, avena, y cebada (revisado en Shimamoto, K. (1994) Current Opinión in Biotechnology 5, 158-162; Vasil, y colaboradores, (1992) Bio/Technology 10, 667-674; Vain y colaboradores, 1995, Biotechnology Advances 13 (4) : 653-671; Vasil, 1996, Na ture Biotechnology 14 página 702) (todas incorporadas en la presente mediante referencia) . El bombardeo de microproyectiles, electroincorporación y la absorción directa de ADN se prefieren cuando la agrobacterium es ineficiente o inefectiva. Alternativamente, una combinación de diferentes técnicas se puede emplear para aumentar la eficiencia del proceso de transformación, por ejemplo, bombardeo con micropartículas recubiertas de agrobacterium (Patente europea EP-A-486234) o bombardeo de microproyectiles para inducir lesiones seguidas de cocultivo con agrobacterium (Patente europea EP-A-486233) . Después de la transformación, una planta se puede regenerar, por ejemplo, a partir de células simples, tejido calloso, discos de hojas, embriones inmaduros o maduros, como es normal en la técnica. Casi cualquier planta se puede regenerar enteramente a partir de células, tejidos y órganos de la planta. Técnicas disponibles se revisan en Vasil y colaboradores, Cell Cul ture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol I, II y III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984, y Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989 (ambas incorporadas en la presente mediante referencia) . La elección particular de una tecnología de transformación se determinará por su eficiencia para transformar ciertas especies vegetales así como la experiencia y preferencia de la persona que practica la invención con una metodología de elección particular. Será aparente para la persona experta que la elección particular de un sistema de transformación para introducir ácido nucleico en células vegetales no es esencial a o una limitación de la invención, ni la elección de técnica para la regeneración de la planta. Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para hacer una célula vegetal, preferiblemente monocotiledónea, como se discute que involucra la introducción de un vector conveniente que incluye el cásete de expresión relevante en una célula vegetal y que causa o permite la recombinación entre el vector y el genoma de la célula vegetal para introducir la secuencia de nucleótidos en el genoma. La invención se extiende a células vegetales que contienen ácido nucleico de acuerdo con la invención como un resultado de la introducción del ácido nucleico en una célula ancestro. El término "heterólogo" se puede usar para indicar que el gen/secuencia de nucleótidos en cuestión han sido introducidos en las células de la planta o un ancestro del mismo, usando ingeniería genética, es decir, mediante intervención humana. Una célula de planta transgénica, es decir, transgénica para el ácido nucleico en cuestión, se puede proporcionar. El transgén puede estar en un vector 5 extragenómico, tal como el vector viral de mosaico de alverjón, o incorporado, preferiblemente establemente, en el genoma. Después de la transformación de una célula vegetal, una planta se puede regenerar a partir de la célula o de los descendientes de la misma. 10 Otros aspectos de la presente invención proporcionan el uso de un cásete de expresión con características descritas en la presente (por ejemplo, secuencia de codificación de anticuerpo o secuencias fusionadas en una señal de retención RE de mamífero, un delantero de péptido, y/o 5 ' UTR como se
15 describió) en la producción de células vegetales transgénicas y en la producción de una planta transgénica. Esta célula o planta preferiblemente es monocotiledónea. Las plantas transgénicas de acuerdo con la presente invención se pueden cultivar bajo condiciones en las cuales el
20 producto deseado se produce en células y/o semillas de la planta. Las células que producen el producto pueden estar en una parte comestible de la planta, tales como hojas o fruto. Después del cultivo de plantas, ellas, o partes de las mismas tales como las hojas, semilla o fruto, se puede
25 cosechar y procesar para el aislamiento y/o purificación del
^|g ^jSg É__________g|k producto. Están disponibles técnicas convenientes para aquellos con experiencia en la técnica. El producto se puede usar conforme se desee, por ejemplo, en formulación de una composición que incluye cuando menos un componente adicional. Las semillas se pueden almacenar, por ejemplo, durante cuando menos seis meses. Aspectos y modalidades de la presente invención se ilustrarán ahora a manera de ejemplificación experimental. Otros aspectos y modalidades de la presente invención serán aparentes para los expertos en la técnica. EJEMPLO 1 El anticuerpo anti-CEA T84.66 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número A-5081235) se ha usado en ensayos clínicos y tiene un potencial probado para terapia y diagnóstico. Los presentes inventores han expresado con éxito el dominio de enlace del antígeno T84.66 en forma de un fragmento scFv (scFv84.66) tanto en arroz como en trigo. Se emplearon varias secuencias de péptido líder y líder no traducido. Ver más adelante para detalles. Los fragmentos de cadena simple fueron ya sea dirigidos al apoplasto por medio de una secuencia de péptido líder de mamífero (murino) adecuado (por ejemplo, la construcción CH84.66HP) (Tabla 1 construcción #1)) o se retuvo en el retículo endoplásmico por medio de una señal de retención de RE (por ejemplo, la construcción CH84.66KP (Tabla 1, construcción #5) ) . La expresión funcional del scFv capaz de enlazar este antígeno fue detectado por prueba inmunosorbente de enzima enlazada en callo y hojas de arroz y en hojas y semillas de trigo, tanto endospermo como embrión. 5/10 plantas de trigo transformadas con CH84.66HP expresaron el producto en un rango de 30-100 ng por gramo de material de hojas, con un promedio de 54 ng/gramo y un máximo de 100 ng/gramo. 19/30 plantas de trigo transformadas con CH84.66KP expresaron el producto en un rango de 50-700 ng/g, con un promedio de 243 ng/g y un máximo de 700 ng/g. 14/35 callos de arroz transformados con CH84.66HP expresaron el producto en un rango de 30-300 ng/g. Cuatro plantas regeneradas expresaron el producto en un rango de 25-200 ng/g. 7/14 callos de arroz transformados con CH84.66KP expresaron el producto en un rango de 70-3590 ng/g. Tres plantas regeneradas expresaron el producto a 1500, 890 y 29000 ng/g de material de hoja, respectivamente. La transformación del arroz con la construcción nr 7, que contenía el promotor 35S mejorado (2x35S) , dio como resultado que siete de once líneas expresaron scFvT84.66 a niveles entre 500 y 27000 ng/g de tejido de hoja. Además, análisis de manchado Western de extractos de hoja de líneas de arroz seleccionadas transformadas con esta construcción revelaron que el scFvT84.66 expresado estaba intacto y tenía el peso molecular predicho. La tabla 1 delinea los compuestos de varios casetes de expresión (ver más adelante) . El promotor de ubicuitina y el terminador Nos se usaron en las construcciones 1 a 6, el promotor y el terminador 35S mejorado se usaron en la construcción 7. Los resultados muestran que el uso de la señal de retención RE aumenta la acumulación de la proteína en plantas de trigo y arroz, que los 5 'UTR son funcionales en el trigo y el arroz, y que el péptido líder de mamífero es funcional en trigo y arroz. Después de seis meses de almacenamiento, los niveles de scFv 8466 de enlace con antígeno, funcional no fueron significativamente menores que en el momento de la cosecha. EJEMPLO 2 El anticuerpo anti -TMV rAb 24 (EMBL de cadena pesada y ligera con números de acceso X67210 y X67211, respectivamente) está muy bien estudiado. Ver por ejemplo,
Voss y colaboradores, (1995) Mol Breed 1 -. 39-50 (incorporado en la presente mediante referencia) . Este anticuerpo se expresó por los inventores en un formato Fv de cadena simple (scFv24) en callo y plantas de
. ? . _» .
arroz. Particularmente se detectaron cantidades grandes de fragmento de anticuerpo funcional mediante prueba inmunosorbente de enzima enlazada (Fischer y colaboradores, (1998) Characterization and application of plant -derived recombinant antibodies . En Cunningham C, Porter A (eds) , "Methods in Biotechnology, Vol. 3: Recombinant Proteins from Plants: Production and Isolation of Clinically Useful Compounds" Methods in Biotechnology, Vol. 3, 129-142, Humana Press, 1997 (incorporada en la presente mediante referencia)) en callo de raíz que contiene una construcción que incluye una señal de retención RE terminal C. Una construcción que carece de cualquier secuencia de péptido líder se introdujo en el arroz. No fue detectable ninguna expresión mediante prueba inmunosorbente de enzima enlazada en tejido de callo o en hojas de estos transformantes. Una construcción que incluye el péptido líder murino y que codifica scFv24 se usó para transformar arroz y el scFv funcional fue detectado por prueba inmunosorbente de enzima enlazada en tejidos de callo y hojas. 3/4 de callos de arroz expresaron el producto. Otra construcción que incluye la secuencia de codificación scFv24 y una señal de retención RE se expresó en arroz transgénico. Niveles altos de scFv funcionales se detectaron en callo. 12/25 callos expresaron el producto en el rango de 300-42066 ng/g. Una planta regenerada expresó el producto 8635 ng/g. Los resultados mostraron que el péptido líder de cadena ligera mamífero es funcional en arroz y mejora los niveles de proteína en comparación con la expresión citosólica, y que la señal de retención RE es funcional en arroz y aumenta los niveles de proteína. EJEMPLO 3 El anticuerpo T84.66 quimérico de tamaño completo (ratón/humano) se expresó con éxito en callo de arroz y plantas de arroz. Los genes para la cadena pesada y ligera del anticuerpo se localizaron en dos plásmidos separados y se introdujeron en las células de la planta vía un cobo bardeo . El promotor 35S mejorado se usó en todas las construcciones. La cadena pesada y ligera se dirigieron ambas al apoplasto mediante una secuencia de péptido líder de mamífero (murina) adecuada (Tabla 1, construcciones 8 y 9) o, alternativamente, la cadena pesada se retuvo en el retículo endoplásmico por medio de una señal de retención de RE (Tabla 1, construcción 10) . La expresión funcional de T84.66 capaz de enlazar su antígeno fue detectada mediante prueba inmunosorbente de enzima enlazada en callo de arroz, hojas y semillas (Tabla 3) . Para una reacción positiva de prueba inmunosorbente de enzima enlazada, tanto la cadena ligera como la cadena pesada tenían que expresarse. Si las cadenas ligera y pesada se producen a diferentes niveles, el ensayo prueba inmunosorbente de enzima enlazada solamente indica la expresión indicativa de un nivel de expresión más bajo. Los resultados muestran que los genes para la cadena pesada y ligera de un anticuerpo de tamaño completo se puede transformar establemente en una célula vegetal sobre dos plásmidos separados. Las moléculas de anticuerpo funcionales son capaces de ensamblarse en la célula vegetal si cualquiera de las dos cadenas se dirige al apoplasto, o si una cadena se retiene en el RE. EJEMPLO 4 El anticuerpo anti -TMV rAb 24 de tamaño completo se expresó en el apoplasto de células de callo de arroz. Los genes que codifican la cadena pesada y ligera fueron conducidos por secuencias promotoras 35S mejoradas y se presentaron en el mismo vector de transformación. Siete de 10 líneas de callo de arroz expresaron anticuerpos de tamaño completo (enlace de antígeno) funcionales a niveles entre 100 y 50000 ng/g. El resultado muestra que un anticuerpo anti -TMV funcional fue producido en el callo de arroz después de introducir un plásmido que contenía los genes que codifican la cadena pesada y ligera. EJEMPLO 5 El anticuerpo anti -TMV rAb 24 se expresó en callo de arroz y hojas y en un formato Fab (construcción 11), F(ab)2
(construcción 12) y formato Fv de cadena simple biespecífica
(construcción 13) . Se emplearon varios UTR y secuencias delanteras (construcciones 11-13; Tabla 4). El promotor aumentado 35S y el terminador 35S se usaron en todo el ensayo. Diez de 18 líneas de callo de arroz transformadas con construcción 11 expresaron el fragmento Fab24, dirigido al apoplasto, en el rango de 30-5200 ng/g. Una planta transgénica regenerada expresó el fragmento Fab en 2500 ng/g de material de hoja. Además, el análisis de manchado Western de extracto de hoja confirmó que el Fab 24 expresado estaba intacto y tenía el peso molecular predicho (banda doble a 28 kDa) . Tres de 5 líneas de callo de arroz que contenían la construcción 12 expresaron anticuerpo F(ab)2 (enlace de antígeno) funcional dirigidos a apoplasto. Los niveles de F(ab)2 medidos estaban en el rango de 100-29000 ng/g. Seis de 8 líneas de callo de arroz que contenía la construcción nr 13 produjeron el fragmento de cadena simple biespecífico de rAb24 en un rango de 240 a 31000 ng/g. Dos plantas transgénicas regeneradas expresaron el fragmento biscFv24 en hojas a niveles de 2100 o 1200 ng/g, respectivamente. En este caso, una secuencia de retención de RE se unió al término C del fragmento de anticuerpo. Las líneas de callos de arroz que contenían la construcción 14, que codifican el scFv24 fusionado a la coproteína de TMV (virus de mosaico de tabaco) , expresaron el producto a niveles detectables. Esto fue determinado por ensayos prueba inmunosorbente de enzima enlazada basados en la capacidad de enlace de antígeno del scFv24. 5 Estos resultados muestran que varios fragmentos de enlace de antígenos, tales como el fragmento Fab, fragmento F(ab)2, las proteínas de fusión scFv biespecíficas y scFv se pueden expresar en callo y/o tejido de hojas de líneas de arroz transgénico. 10 EJEMPLO 6 El tejido de callo de arroz se transformó con construcciones que contienen el gen para scFv24 fusionado en varias señales de péptidos para objetivos subcelulares. Estas señales de objetivos incluyen la señal de objetivo de
15 cloroplasto N-terminal del gen estructural para la sintasa de almidón enlazada con granulo de papa (van der Leij y colaboradores, Mol Gen (1991), 228: 240-248; incorporada en la presente mediante referencia) y la señal de objetivo vacuolar N-terminal de estrictosidina sintasa de Catharanthus roseus
20 (McKnight y colaboradores, Nucleic Acids Research (1990) , 18, 4939; incorporada en la presente mediante referencia) . La expresión del producto se logró a niveles entre 50 y 500 ng/g. Estos resultados muestran que un fragmento de enlace
25 de antígeno, tal como el scFv, se puede expresar con éxito en
.?lljmS^M^?tu?^.i^aaia ^ la fusión con péptidos de señal para dirigirse a diferentes compartimientos subcelulares. EJEMPLO 7 El anticuerpo 13 de Guy es un anticuerpo secretor (SigA) con especificidad a la proteína de adhesión de la superficie celular del antígeno de estreptococo (SA) I/II del patógeno oral Streptococcus mutans (Smith y Lehner (1989) Oral Microbiol Immunol . 4: 153) . Una forma secretora de este anticuerpo construido y usado en tabaco (Ma y colaboradores, (1995) Science 268: 716; incorporado en la presente mediante referencia) . La molécula consiste en dímeros IgA asociados con la cadena J y el componente secretor. Un anticuerpo secretor quimérico de ratón/humano derivado del 13 de Guy se expresó en líneas de arroz transgénico. Los cuatro compuestos, a saber la cadena pesada, la cadena ligera, la cadena J y el componente secretor, se codificaron por cuatro secuencias de codificación, cada una conducida por el promotor ubicuitina de maíz. Los cuatro casetes estuvieron presentes en cuatro plásmidos separados y se introdujeron en las células vegetales mediante co-bombardeo. Todas las secuencias de codificación contuvieron sus péptidos líderes naturales para la secreción al apoplasto. Se detectó SigA completamente ensamblado en varias líneas de callo, hasta un nivel de 800 ng/g. El SigA completamente ensamblado también se detectó en material de hoja o en una planta regenerada. El resultado muestra que los anticuerpos complejos, tales como SigA, se pueden expresar en callo y hojas de arroz después de la introducción de los genes que codifican los compuestos en plásmidos separados. MATERIALES Y MÉTODOS Plásmidos y Bacterias Construcción de plásmido scFv 84 . 66 Un fragmento de ADN que codifica la proteína de cadena simple (scFv) derivada del anticuerpo anti-CEA T84.66 se amplificó mediante reacción de cadena de polimerasa usando la construcción pUC18-T84.66/212 (Wu y colaboradores, 1996 Immunotechnology 2: 21-36; incorporada en la presente mediante referencia) ) como una plantilla, y cebadores específicos que introducen sitios de restricción Ncol y Salí en los extremos 5 ' y 3' respectivamente, para subclonación. La integridad del gen scFvT84.66 se confirmó mediante secuenciamiento de AD? (ALF, Pharmacia) . El fragmento amplificado T84.66 Ncol/ Salí se subclonó en un vector pGEM3zf que contenía la región no traducida 5' de chalconasintasa (CHS 5' UTR) y el péptido líder de cadena pesada (muLPH*) del anticuerpo monoclonal mAb24 específico de virión TMV (Voss y colaboradores, (1995) Mol Breed 1 -. 39-50). La secuencia de muLPH* se optimizó en codón para la expresión vegetal de acuerdo con Angenon y colaboradores, (FEB (1990) 271:144-146) . También se incluyeron ya sea un motivo KDEL o un His6 etiqueta 3' al fragmento de cadena simple T84.66 como una señal de modificación de traducción de terminal C. El cásete entero, que contenía ya sea CHS 5' UTR- 5 muLPH*-T84.66-KDEL o CHS 5' UTR-muLPH* -T84.66-His6 se recuperó con digestión con EcoRI y HipdlII y se subclonó en un plásmido pUC19 que contenía el promotor de maíz ubicuitina 1, intrónl (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número A- 5510474; (1990)) y la secuencia de terminación NOS para dar
10 las construcciones de expresión final. Se usó el plásmido pAHC20 para la cotransformación. Este plásmido contiene solamente el gen bar fusionado con el promotor ubicuitina 1 y el intrón 1 (Christensen y Quail (1996) Transgen Res 5:213-218; incorporada en la presente mediante referencia) . 15 Construcciones del plásmido scFv24 para la expresión vegetal Los ADN de cadena pesada y ligera de rAb24 (EMBL números de acceso X67210 y X67211, respectivamente) se usaron para la generación de scFv-ADNc. Los fragmentos VL y VH se amplificaron mediante reacción de cadena de polimerasa usando
20 cebadores específicos de dominio. Para cada dominio un cebador contenía una secuencia de traslape para formar el enlazador de conexión VL y VH (marcado en cursivas) por la extensión de traslape (SOE) de reacción de cadena de polimerasa (Horton y colaboradores, "Engineering hybrid genes without the use of
25 restriction enzymes; Gene splicing by overlap extensión" Gene
"-^'^«^^^•-^^"^ - 1 i rttü*' 77:61-68 (1989); incorporada en la presente mediante referencia) , y se usó junto con un cebador que contenía ya sea un sitio de restricción EcóRI (VL) o un sitio de restricción
Salí (VH) (marcados en negritas) . El dominio VL se amplificó usando el cebador delantero
Pl-frontal : 5' -GCCGAATTCCATGGACGTCGAGCTGACCCAGTCT-3' (SEQ ID NO. 10), y el cebador en reversa P2-reversa: 5' -CTTTCCGGAACCACTAGTAGAGCCTTTTATCTCCAGCTTGGT-3' (SEQ ID NO. 11) . El dominio VH se amplificó usando los cebadores P3-frontal : 5 ' -GGTTCCGGAAAGAGCTCTGAAGGTAAAGGTCAGGTCCAGCTGCAGCAG-3 ' (SEQ ID
NO. 12) y P4-trasero: 5' -GCCTCTAGACGTCGACTGCAGAGACAGTGACCAG-3' (SEQ ID NO. 13). Los fragmentos individuales VL y VH se purificaron y ensamblaron en un fragmento scFv mediante SOE-PCR (Horton y colaboradores, (1989)) y se subclonaron en los sitios de restricción EcoRI y Salí del derivado pUC18, que contenía una secuencia c-myc e His6. Un sitio de restricción Ndel se introdujo mediante reacción de cadena de polimerasa usando el cebador P5L24?L: 5 ' -GCACACCCGAATTCGGGCCCGGGCATATGCAAATTGTTCTCACCCAGTCT-3 ' (SEQ
ID ?O. 14), para permitir la clonación de la región 5 ' -no traducida de chalconasintasa (CHS 5 ' -UTR) como un fragmento EcoRI -Ndel . La ligación subsecuente de los fragmentos EcoRI-Xbal en el vector de expresión vegetal pSS (ver más adelante) , que contiene un promotor 35S aumentado y la secuencia de 5 terminación CaMV, dio como resultado la construcción final pscFv24CW, que se usó para la expresión scFv en el citosol. Una segunda construcción (pscFv24CM) se generó intercambiando el fragmento 5' EcoRI-PstI de pscFv24CW con su región correspondiente a partir de la cadena ligera de tamaño completo
10 de AD?c que contiene el CHS 5 ' -UTR y la secuencia de péptido líder de murino original del AD?c de cadena ligera del rAb24 para permitir la secreción de scFv en el apoplasto. Material vegetal Plantas de Tri ticum aestivu L., cv Bobwhite, se
15 cultivaron en invernadero y en salas de crecimiento al 15/12°C día/noche de temperatura y 10 horas de fotoperíodo durante los primeros 40 días, seguidos por mantenimiento a 21/18°C día/noche de temperatura y 16 horas de fotoperíodo. Las plantas para bioensayo de insecto se transfirieron a un
20 invernadero calentado; durante el día se suplemento con luz artificial para dar un período de 16 horas, y la temperatura se mantuvo en el rango de 8-25°C. Tejido y transformación objetivo Embriones inmaduros se removerion y cultivaron como
25 se describe (Vasil y colaboradores, (1992) Bio/Technology
10:667-674). Después de 6 a 7 días, se realizó bombardeo de proteínas usando condiciones estándar. De treinta a setenta microgramos de proteínas de oro recubierto (por tiro) se administraron al tejido objetivo que se incubó en medio que contenía osmóticum alto (0.2 M manitol y 0.2 M sorbitol) durante 5-6 horas antes de y 10-16 horas después del bombardeo. Los plásmidos que contenían el gen no seleccionado y el plásmido que contenía el gen bar se mezclaron para cotransformación a una proporción molar de 3:2 y se precipitaron en proteínas de oro (Christou y colaboradores, 1991 Bio/Technology 9: 957-962; incorporada en la presente mediante referencia) . El callo bombardeado se seleccionó en medio que contenía fosfinotricina, como se describe en cualquier parte (Altpeter y colaboradores, 1996, Plant Cell Rep 16: 12-17; incorporada en la presente mediante referencia) . Ensayos PAT La actividad PAT se probó usando tejido de hojas como se describió anteriormente transfiriendo las plantas a tierra (Vasil y colaboradores, (1992) Bio/Technology 10: 667-674). Producción de anticuerpo monoclonal y antígeno CEA El vector de expresión de levadura pPIC9K que contenía el dominio CEA/NA3 y el mAb84.66 se usó. La proteína CEA/NA3 se expresó en Pichia pastoris cepa GS115 (InVitrogen) y se purificó a partir de un caldo de fermentación usando cromatografía por afinidad Ni-NTA. La línea celular de hibridoma T84.66 (Wagener y colaboradores, 1983 Journal of Immunology 130: 2308-2315; incorporada en la presente mediante referencia) se cultivó en RPMl 1640 (Biocrom) que contenía 10 por ciento de suero de becerro fetal (Biocrom) , 25 mM NaHC03, 1 mM L-glutamina, 50 µM 2-mercaptoetanoi , 24 mM bicarbonato de sodio, 50 IU penicilina y 50 µg estreptomicina por mililitro (Gibco) y se mantuvo a 37°C en un incubador humedecido con 7 por ciento C02. Las inmunoglobulinas de los sobrenadantes del cultivo se sometieron a cromatografía por afinidad sobre proteína-A HC
(BioProcessing) . La pureza de la preparación del mAb se analizó mediante SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida
(EGPA) (Laemmli 1970) . La presencia de anticuerpos específicos para CEA se valoró mediante prueba inmunosorbente de enzima enlazada. Extracción de proteína y prueba inmunosorbente de enzima enlazada lia extracción de proteína soluble total a partir de hojas y semillas se realizó como se describe por Fischer y colaboradores, (1998) ( Characterization and application of plant-derived recombinant antibodies . In Cunningham C, Porter A (eds), "Methods in Biotechnology, Vol. 3: Recombinant Proteins from Plants: Production and Isolation of Clinically Useful Compounds", Methods in Biotechnology, Vol. 3, 129-142,
-t-tm-.^.
Humana Press Inc., 1997). El anticuerpo de cadena simple T84.66 funcional se midió en una prueba inmunosorbente de enzima enlazada (PISEE) mediante competencia con el anticuerpo monoclonal T84.66 murino de tamaño completo. Placas de microtitulación se recubrieron con 50 ng CEA/NA3 en regulador de bicarbonato y se bloquearon con 150 µl de albúmina de suero bovino (1.0 por ciento en regulador salino (0.85 por ciento NaCl, pH 7.2)) . Se hicieron diluciones en serie de los extractos vegetales a partir de hojas de control no infiltradas, y 100 µl de cada muestra diluida, que también contenía 2.5 ng de anticuerpo T84.66 de murina de tamaño completo se transfirieron al CEA/NA3 recubierto y bloqueado de placa de prueba inmunosorbente de enzima enlazada. IgG anti-ratón de cabra específico para Fc conjugado con fosfatasa alcalina (100 µl de una dilución de 1:5000; Jackson Immunoresearch) se añadió a cada pozo, y las placas se desarrollaron durante hasta 1 hora a 37°C con 100 µl de sustrato AP (1 mg ml"1 p-nitrofenilfosfato, Sigma, en regulador de sustrato (0.1M Dietolamina, 1 mM MgCl2 pH 9.8) antes de leer la absorción a 405 nm usando el espectrofotómetro Spectra Max 340 (Molecular Devices) . Manchado Southern y Northern El ADN se preparó a partir de tejido de hojas de acuerdo con Dellaporta y colaboradores, (1984) ?faize DNA miniprep . In Malmberg R, Messing J, Sussex I (eds) , "Molecular
^¡y¡ biology of plants. A laboratory course manual", páginas 36-37. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; incorporada en la presente mediante referencia. Alícuotas de 15 µg de ADN se digirieron con endonucleasas de restricción adecuadas sujetas a electroforesis en gels de agarosa al 0.9 por ciento. Se transfirieron las membranas de nylon y se llevó a cabo hibridización de acuerdo con procedimientos estándares (Sambrook y colaboradores, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual . Cold Spring Harbor, NY) . El ARN total se aisló de las hojas de plantas de trigo, se sometió a electroforesis en gel de agarosa (15 microgramos por franja) y se manchó en membrana de nitrocelulosa. Se prepararon sondas de hibridización etiquetadas 32P que comprendían la región de codificación del transgén usando el juego de etiquetación de cebador aleatorio (GIBCO-BRL) . Resultados Producción y caracterización de plantas de trigo transgénicas La producción de plantas de trigo transgénicas mediante bombardeo de embriones inmaduros se ha descrito previamente (Altpeter y colaboradores, 1997) . La codificación del gen para acFv84.66 y el gen bar como marcador seleccionable, se cotransformaron en trigo en dos plásmidos separados. De 9 a 10 semanas después del bombardeo, las plantas pequeñas regeneradas se probaron para determinar la expresión de fosfinotricina acetiltransferasa (PAT) . Se identificaron 40 líneas transgénicas independientes. Treinta líneas habían sido cobombardeadas con plásmido pCH84.66KP que codifica el anticuerpo scFv con una señal KDEL añadida para la retención en el RE. Las diez líneas restantes habían sido cobombardeadas con pCH84.66HP que contenía la etiqueta His en vez de la secuencia KDEL. Se llevó a cabo análisis de manchado Southern sobre una muestra representativa de quince transformantes primarios y se confirmó la presencia del gen bar en todas las líneas probadas. La hibridización con una sonda para la secuencia de codificación scFv reveló la integración del gen en 11 líneas con una frecuencia de cotransformación de aproximadamente 80 por ciento. Los patrones de integración de transgén claramente fueron únicos para cada línea y la complejidad de la integración varió dentro del rango esperado para plantas generadas vía transferencia de genes directa. Expresión de scFv en hojas Extractos de proteínas solubles a partir de hojas transgénicas se probaron para determinar la presencia de scFv y actividad mediante prueba inmunosorbente de enzima enlazada. Dieciocho de cada 27 plantas transformadas con la construcción pCH84.66KP mostraron niveles de producción de hasta 700 ng de scFv84.66 activo funcional por gramo de tejido de hoja (rango: 50-700 ng) . El nivel de expresión máxima se detectó en plantas
^^ que contenían la construcción pCH84.66HP fue de 100 ng por gramo de tejido de hoja (rango 30-100 ng) . Expresión de scFv en semillas Semillas maduras o de las plantas de expresión mejor se cultivaron y extractos de proteínas solubles se usaron para prueba inmunosorbente de enzima enlazada. Hasta 1.5 µg scFv por gramo de semilla se determinaron. Estos niveles de expresión excedieron los niveles medidos en hojas. Construcción de cT84 . 66 de ADN de cadena pesada y ligera La extensión de traslape (SOE) de reacción de cadena de polimerasa se usó para obtener ADNc de cadena ligera y pesada de T84.66 quimérico de ratón/humano tamaño completo mediante fusión en marco de los dominios variables VL y VH del anticuerpo monoclonal mAb T84.66 de ratón a los dominios constantes IgGl y Kappa humanos del ADN de anticuerpo quimérico de ratón/humano B72.3 (Primus y colaboradores, (1990) Cáncer Inmunol Immunother 31 , 349-57; incorporada en la presente mediante referencia) . Los dominios constantes humanos se amplificaron para los plásmidos chiB72.3L y chiB72.3H usando los siguientes cebadores: 5 ' -CTG GAA ATA AAA ACT GTG GCT GCA CCA TCT-3' (chiB72.3L-I) (SEQ ID NO. 15), 5 ' -GCC AAG CTT TTT GCA AAG ATT CAC-3 ' (chiB72.3L-II) (SEQ ID NO. 16), 5 ' -ACC GTC TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC CCA-3 ' (chíB72.3H-I) (SEQ ID NO. 17), y 5' -GCC AAG CTT GGA TCC TTG GAG GGG CCC AGG-3 ' (chíB72.3H) (SEQ ID NO. 18).
a_____l___________.^. -<-----mÉ_i_Íf___ __ - - • • - -*** Los dominios variables de ratón se amplificaron a partir de plásmidos T84.66L2 (cadena ligera) y T84.66H2 (cadena pesada) usando los cebadores: 5 ' -GGC GAA TTC ATG GAG ACA GAC ACA CTC-3' (T84.66L-I) (SEQ ID NO. 19), 5 ' -AGC CAC AGT TTT TAT TTC CAG CTT GGT CCC-3 ' (T84.66L) (SEQ ID NO. 20), 5 ' -GGC GAA TTC ATG AAA TGC AGC TGG GTT-3 ' (T84.66H) (SEQ ID NO. 21), 5'-GGT GGA GGC TGA GGA GAC GGT GAC TGA GGT-3 ' (T84.66H) (SEQ ID NO. 22) . Los ADNc de cadena ligera y pesada T84.66 quiméricos obtenidos mediante SOE PCR se clonaron como fragmentos EcoRl/HindIII en pUC18, para dar las construcciones pUCld-" ligero" y pUCld- "pesada" , respectivamente. Todas las secuencias de ADNc se confirmaron mediante secuenciamiento de nucleótidos. Construcción de plásmidos de expresión vegetal
CT84. 66 de tamaño completo. Se usó pGEM-3zf para clonar al 5 'UTR de la región delantera omega del virus de mosaico de tabaco (TMV) (Schmitz y colaboradores, (1996) Nucleic Acids Res 24 , 257-63), seguido por uno de los dos péptidos delanteros optimizados de codón vegetales derivados ya sea de la cadena pesada (LPH) o de la cadena ligera (LPL) del anticuerpo monoclonal mAb24 murino (
(Voss y colaboradores, (1995) Molecular Breeding 1 , 39-50), y para clonar la secuencia de señal de retención RE KDEL, y el 3 'UTR del TMV. La cadena ligera quimérico se digirió con Ncol/Sall y se insertó corriente abajo de la región 5' omega del TMV y del LPL; la cadena pesada quimérica se insertó de la misma manera (construcción 9) , o corriente abajo de la región omega 5' del TMV y del LPH, y corriente arriba de la secuencia KDEL (construcción 10) . Los casetes de expresión se clonaron entre el promotor 35S mejorado y la región de terminación de virus de mosaico de coliflor utilizando los sitios de restricción EcoRI y Xbal del vector de expresión de planta pSS
(Voss y colaboradores, (1995) Molecular Breeding 1 , 39-50) . Construcción de los vectores de expresión de planta
Fv 24 de cadena simple biespecíf ica Para combinar scFv24 y el enlazador CBHI con scFv29 en un anticuerpo de cadena simple biespecífico, se eligió un arreglo de cásete con sitios de restricción en los extremos 5' y 3 ' de las dos secuencias scFv y enlazadora. Primero, el scFv29 se subclonó en los sitios de restricción EcoRI y Salí de un derivado PUCld , que contenía una secuencia His6 (pUC18-scFv29-his) . El plásmido pML2 que contenía el ADNc del CBHI-enlazador se usó junto con el cebador delantero CBH-CLA 5 ' -GCG GAA TTC GTA ATC GAT CCC GGG GGT AAC
CGC GGT ACC-3' (SEQ ID NO. 23) y el cebador trasero CBH- MOD
5' -GCG GAC GTC GCT ATG AGA CTG GGT GGG CCC-3 ' (SEQ ID NO. 24) para introducir un sitio o sitios de restricción EcoRI y Clal
(extremo 5') o un AatlI (extremo 3') mediante reacción de cadena de polimerasa. El fragmento de reacción de cadena de
-** - —•**>•* -**"» polimerasa restringido EcoRI y AatlI se subclonó en pUCld- scFv29-his (CBHI-scFv29-his) . Los sitios de restricción EcoRI y Ncol se integraron en el extremo 5' de scFv24 (Zimmermann y colaboradores, (1998) Molecular Breeding 4 , 369-379; 5 incorporada en la presente mediante referencia) mediante reacción de cadena de polimerasa usando el cebador SCA25 5 ' -G CGG AAT TCG GCC ACC ATG GCC CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT-3 ' (SEQ ID NO. 25) y el sitio Clal 3' usando el cebador SCA26 5' -GCG ATC GAT TGC AGA GAC AGT GAC CAG AGT-3' (SEQ ID NO. 26) . La
10 clonación del fragmento EcoRI-Clal corriente arriba del enlazador CBHI en el vector pUCld-scFv29-his dio la construcción biscFv2429 pUCld-biscFv2429. Para dirigir el biscFv2429 a diferentes compartimientos de células de plantas, el fragmento 5' EcoRI- 15 Stul de pUC18-biscFv2429, que contiene el extremo 5' del scFv24, se intercambió con su región correspondiente a partir de pscFv24CM (Zimmermann y colaboradores, (1998) Molecular Breeding 4 , 369-379) que contenía la región 5' no traducida de la chalcona sintasa (CHS 5 ' -UT) (Voss y colaboradores, (1995)
20 Molecular Breeding 1 , 39-50) y la secuencia delantera de ratón original del ADNc de cadena ligera. La secuencia His6 terminal C del biscFv2429 se reemplazó con la señal de retención de RE KDEL, la cual se introdujo mediante reacción de cadena de polimerasa usando el cebador KDEL: 5 ' -ACG CTC TAG AGC TCA TCT
25 TTC TCA GAT CCA CGA GAA CCT CCA CCT CCG TCG ACT GCA GAG ACA GTG
——'-^Ülltfliiiiíil ACC AGA GTC CC-3' (SEQ ID NO. 27) para generar pUCld-biscFv2429-KDEL. La ligación subsecuente del fragmento EcoRI-Xbal en el vector de expresión vegetal pSS (Voss y colaboradores, (1995) Molecular Breeding 1 , 39-50), que contenía un promotor 35S mejorado y la secuencia de terminación CaMV, dio como resultado la construcción de expresión final biscFv2429-KDEL (Tabla 4, construcción 13), la cual se usó para la expresión biscFv2429 en el retículo endoplásmico. Construcción del vector de transformación vegetal que codifica una fusión de proteína de recubrimiento scFv24 La proteína de recubrimiento compañera de fusión de gen (CP) a partir de TMV se amplificó mediante reacción de cadena de polimerasa. El ADNc se amplificó a partir de un clon de ADNc a partir de TMV. Los cebadores delanteros introdujeron un sitio de restricción Ncol (extremo 5') y los cebadores traseros una secuencia enlazadora (Gly4Ser)2 terminal C y un sitio de restricción AatlI (extremo 3 ' ) . Los siguientes cebadores delantero y trasero se usaron para la amplificación con reacción de cadena de polimerasa: CP-delantero 5 ' -ACT GCG CCA TGG CTT ACA GTA TCA CT-3 ' (SEQ ID NO. 28) , CP-trasero 5' -CCG TCA GAC GTC AGA ACC TCC ACC TCC ACT TCC GCC GCC TCC AGT TGC AGG ACC AGA GGT CCA AAC CAA ACC-3 ' (SEQ ID NO. 29) .
^^^^^^^^^j Los fragmentos de reacción de cadena de polimerasa restringidos 5 ' -Ncol y 3 ' -AatlI se subclonaron en un pUC18 derivado que contenía el scFv24 específico de TMV (Zimmermann y colaboradores, (1998) Molecular Breeding 4 , 369-379) flanqueado por la región no traducida 5' (secuencia omega) y la región no traducida 3' (secuencia Pw) del TMV (Schmitzet y colaboradores, (1996) Nucleic Acids Res 24, 257-63) ; Gallie y colaboradores, (1994) Gene 142: 159-165). Una secuencia KDEL terminal C se añadió al acFv24 mediante reacción de cadena de polimerasa usando el cebador KDEL-trasero 5 ' -CCC TCA CTC GAG TTT AGA GCT CAT CTT TCT CAG ATC CAC GAG CGG CCG CAG AAC CTC CAC CTC CGT CGA CTG CAG AGA CAG TGA CCA G-3' (SEQ ID NO. 30). La ligación posterior de los fragmentos EcoRI-AscI en el vector de expresión vegetal pSS, que contenía un promotor 35S doble mejorado (Voss y colaboradores, 1995) , dio como resultado la construcción de expresión final CP-scFv24K. Construcción del pscFv24 -VTS: La señal dirigida vacuolar N-terminal optimizada de codón vegetal (para arroz, trigo y tabaco) de estrictosidina sintasa de Catharanthus roseus (McKnight y colaboradores, 1990) se añadió al scFv24 mediante reacción de cadena de polimerasa usando los cebadores delanteros VTS5 ' : 5 ' -GCC GAA TTC ATA TGG CAA ACT TCT CTG AAT CTA AGT CCA TGA TGG CAG TTT TCT TCA TGT TTT TCC TTC TTC TCC TTT C-3' (SEQ ID NO. 31) y VTS3 ' : 5 ' -ATG TTT TTC CTT CTT CTC CTT TCA TCT AGC TCT TCA AGC TCT TCA TCT TCC ATG GGA CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCC C-3' (SEQ ID NO. 32), que introducen un sitio de restricción 5 ' EcoRI y Ndel y un Ncol en el extremo 3' de la secuencia de dirigida vacuolar. Se usó scFv24CW (Zimmermann y colaboradores, 1998) como plantilla y un oligo específico pUC como cebador trasero. El fragmento de reacción de cadena de polimerasa restringido Ndel y HindIII se subclonó en scFv24CW. El fragmento scFv24, cmyc e his6 que contenía NcoI/HindIII se reemplazó por un fragmento secuenciado ya idéntico. La ligación posterior del fragmento EcoRl/SalI en el vector de expresión vegetal pSS que contenía una secuencia terminal C c-myc e his6 dio como resultado la construcción de expresión final pscFv24-VTS. Construcción de pscFv24 -CTS: La señal dirigida al cloroplasto N-terminal de codón optimizado vegetal (para arroz, trigo y tabaco) del gen estructural para la sintasa de almidón enlazado al granulo de papa (van der Leij y colaboradores, Mol Gen Gen 1991, 228: 240-248) se añadió al scFv24 mediante reacción de cadena de polimerasa usando cuatro cebadores hacia adelante: PrimCTSl : 5 ' -GCC GAA TTC ATA TGG CAT CTA TCA CTG CTT CTC ACC ACT TTG TGT CTA GGT CTC AAA CTT CTC TTG ACA CC-3' (SEQ ID NO. 33), Prim CTS2 : 5 ' -GGT CTC AAA CTT CTC TTG ACA CCA AAT CTA CCT TGT CTC AGA TCG GAC TCA GGA ACC ATA CTC TTA CTC AC-3 ' (SEQ ID NO. 34) , PrimCTS3 : 5 ' -TCA GGA ACC ATA CTC TTA CTC ACA ATG GTT TGA GGG CTG TTA ACA AGC TCG ATG GTC TCC AAT CTA GAA C-3' (SEQ ID NO. 35) , PrimCTS4 : 5 ' -CTC GAT GGT CTC CAA TCT AGG ACT AAT ACT AAG GTC ACC CCT AAG ATG GCA TCT AGG ACT GAG ACC AAG AGG C-3' (SEQ ID NO. 36) , y PrimCTS5 : 5 ' -GCA TCT AGG ACT GAG ACC AAG AGG CCA GGA TGC TCT GCT ACC ATT GTT TGC GCC ATG GGA CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT C-3' (SEQ ID NO. 37), que introduce sitios de restricción 5' EcoRI y 5' Ndel y un sitio de restricción Ncol en el extremo 3' de la secuencia dirigida al cloroplasto. ScFv24CW (Zimmermann y colaboradores, 1998) se usó como plantilla y un oligo específico para pUC como cebador trasero. El producto de reacción de cadena de polimerasa amplificado se digirió con Ndel y con HindIII y se subclonó en scFv24CW. El scFv24, c-myc y el his6 que contenían el fragmento Ncol/HindIII se reemplazó por un fragmento secuenciado ya pero idéntico. La construcción se digirió con EcoRl y Salí y el fragmento EcoRI/SalI que contenía la secuencia scFv se ligó posteriormente en el vector de expresión vegetal pSS que contenía una secuencia terminal C c-myc e his6 que dio como resultado la construcción de expresión final pscFv24-CTS. Construcción de plásmidos que codifican los componentes SigA Una cadena kapa híbrida de humano/ratón se ensambló como sigue. Un fragmento Xhol/HindIII que contenía la región variable ligera de Guy y un fragmento HindIII/EcoRI que contenía la región constante kapa humana se ligaron entre sí con la secuencia delantera de cadena pesada de ratón nativo (muLPH) en un plásmido pUC19 que contenía el promotor de maíz ubicuitina 1, intrón 1 y la secuencia de terminación NOS para dar la construcción de expresión final . Un fragmento Kpnl/EcoRI que contenía la cadena humana
J se ligó en un plásmido pUC19 que contenía el promotor de ubicuitina de maíz 1, intrón 1 y la secuencia de terminación NOS. Construcción de Fáb24 y F (ab) 2 24 Se usó una reacción de cadena de polimerasa de extensión traslapada para obtener los fragmentos Fab. Oligonucleótidos de fusión 5 ' -C TGT CCT CCA TGA GCT CAG CAC CCA CAA AAC -3' (31 mer) (SEQ ID NO. 38) y 5'- GTG CTG AGC TCA TGG AGG ACA GGG GTT GAT -3' (30 mer) (SEQ ID NO. 39) se usaron para la extensión de traslape del dominio de articulación IgG2B de ratón y el 3 ' -UT del IgG2b de ratón con el fin de obtener fragmentos Fab. El producto de extensión de traslape final contenía un puente S-S (1. Cys de la articulación) para la cadena ligera kapa de ratón. El segundo residuo cisteína se convirtió en un codón de detención TGA. Este oligonucleótido representa la cadena (+) y se puede usar como cebador trasero en una reacción de cadena de polimerasa para amplificar el 3 ' -UT de ratón de IgG2b. El traslape al dominio de articulación de ratón es de 22 pares de bases. Para obtener fragmentos F(ab)2, los oligonucleótidos de fusión 5 ' -A TGC AAG GAG TGA GCT CAG CAC CCA CAA AGC-3' (31 mer) (SEQ ID NO. 40) y 5 ' -TG CTG AGC TCA CTC CTT GCA TGG AGG ACA G-3' (30 mer) (SEQ ID NO. 41) se usaron para la extensión de traslape del dominio de articulación IgG2b de ratón y de el 3 ' -UT de IgG2b de ratón con el fin de obtener los fragmentos F(ab')2. El producto de extensión de traslape final contenía dos fuentes S-S (l.cys de la articulación de la cadena ligera de kapa de ratón y el segundo de la cadena pesada IgG2b) . El tercer residuo cys se convirtió en un codón de detención TGA. Este oligonucleótido representa la cadena (+) y se puede usar como un cebador trasero en una reacción de cadena de polimerasa para amplificar el IgG2b de ratón con el fin de obtener F(ab')2 de ratón. El traslape con el dominio de articulación de ratón es de 21 pares de bases. Los fragmentos de ADNc-Fab y F(ab')2 de ADNc modificados se fusionaron a la chalcona sintasa (CHS) 5 'UTR y se subclonaron en el vector de expresión vegetal pSS, que contenía el promotor 35S mejorado y la señal de terminación CaMV. Cadena J Un fragmento Kpn I/EcoR I que contenía la cadena J humana se ligó con pMON530. La clonación se confirmó mediante la digestión y restricción mediante análisis de reacción de cadena de polimerasa. Componente secretor
. ~^^«-í-* El componente 'secretor humano natural de longitud completa fue ensamblado a partir de tres fragmentos secuenciados, HuSC2 , HuSC3a y la porción 5' del HuSC (hasta el primer sitio Acc I) . Primero, el plásmido que contenía HuSC se cortó con Kpn y se religó, para remover los sitios Acc I y EcoR I en el polienlazador de vector. Esto se confirmó mediante digestión de restricción. Plásmidos que contenían HuSC2 y HuSC3 se digirieron con Xma I y EcoR I, se ligaron, y seleccionaron en cloranfenicol (solamente uno de los dos plásmidos originales fue resistente al cloranfenicol) . La fusión de HuSC2 y HuSC3a se confirmó por la digestión de restricción. Un fragmento Acc 1/EcoR I de la clona HuSC2/3a se usó para reemplazar el fragmento correspondiente en el clon HuSC. El clon ensamblado de este modo se hizo de subfragmentos completamente secuenciados, contenidos en los sitios Kpn I y Neo I en el extremo 5 ' , un sitio EcoR I en el extremo 3 ' , y un sitio interno Kpn I . El ensamble correcto se confirmó mediante digestiones de restricción. El fragmento Kpn I/EcoR I rensamblado se ligó con pMON530. Se seleccionaron clones mediante digestiones de restricción. El ensamble correcto se confirmó por digestiones de restricción adicionales. Cadena pesada Gama/Alfa Una cadena pesada híbrida humana/ratón se ensambló como sigue. Los plásmidos que contenían los dominios IgGl CH1-CH2 (pHUG) y la región variable pesada 13 de Guy (pGuyHV-2) se cortaron ambas con Apa I . Un fragmento que contenía los dominios IgGl CH1-CH2 se ligó con el corte Apa I pGuyHV-2. Los clones se seleccionaron mediante digestión de restricción. El híbrido resultante se llamó pGUY/HUG. Los clones pHuA2 y pHuA3 , que contenían los fragmentos HuA2 y HuA3 respectivamente, se cortaron con BspE I y Sac II. El fragmento inserto liberado del pHuA3 se ligó al pHuA2 linearizado, fusionando los dominios de codificación CH2-CH3 juntos. El ensamble se confirmó mediante digestión de restricción. El híbrido resultante se llamó pHuA2/3. El plásmido pHuA2/3 se cortó con Hind III y Sma I. El plásmido PGUY/HUG se cortó con Hind III y Hinc II. El fragmento Hua2/3 se ligó con el pGUY/HUG linearizado. El ensamble correcto se confirmó por digestiones por restricción. Los clones resultantes que contenían la cadena pesada (glicosilada) híbrida completa. El cásete entero se cortó como un fragmento Kpn I/Eco Rl y se clonó en PMON530. DISCUSIÓN Los resultados muestran que las 5 'UTR, la chalcona sintasa de petunia y las secuencias omega virales, son funcionales en trigo y arroz, también la 5 ' UTR de TMV. Las secuencias de péptido líder de mamífero, tanto de cadena pesada como ligera, se muestran por los resultados que son funcionales en callo de cereal, hojas y semillas. El uso de la señal de retención RE produjo un nivel más alto de anticuerpo que en el apoplasma. Dentro de las construcciones que llevan KDEL, CL84.66KP (construcción 4) y OL84.66KP (construcción 6) condujeron a niveles de producción mejores que las construcciones análogas que contenían el péptido líder de cadena pesada de murino proporcionando indicación de uso ventajoso del péptido líder que influencia el nivel de producción del producto de la expresión en arroz. Con el scFv24, expresado en callo y plantas de arroz, el pscFv24, careciendo de cualquier péptido líder 5' o secuencia de señal 3 ' , no proporcionaron a scFv24 a un nivel detectable usando prueba inmunosorbente de enzima enlazada. Una construcción que contenía el gen para scFv que incluye el péptido líder murino (de la cadena ligera) dio niveles detectables de scFv24 en líneas de callo transgénico, aunque por debajo de 200 ng/g. La construcción adicionalmente que contenía una secuencia 3' KDEL produjo los niveles más altos de scFv, hasta 42066 ng/g, rango 300-42066 ng/g.
¿&¿^t TABLA 1 Construcciones que contienen formas de T84.66
Nr Promotor Construcción ADNc ter
1 ubicuitina 5 ' -UTR (CHS) -muLPH*-scFv84.66-His6- NOS 3 ' UTR (PW-TMV) abreviatura: CH84.66HP 2 ubicuitina 5 ' -UTR (CHS) -muLPH*-scFv84.66-His6- NOS 3 ' UTR (PW-TMV) abreviatura: CH84.66HP 3 ubicuitina 5 ' -UTR (Ome) -muLPH*-scFv84.66-KDEL- NOS 3 ' UTR (PW-TMV) abreviatura: CH84.66KP 4 ubicuitina 5 ' -UTR (CHS) -muLPL*-scFv84.66-KDEL- NOS 3 ' UTR (PW-TMV) abreviatura: CH84.66KP 5 ubicuitina 5 ' -UTR (CHS) -muLPH*-scFv84.66-KDEL- NOS 3 ' UTR (PW-TMV) abreviatura: CH84.66KP 6 ubicuitina 5 ' -UTR (Ome) -muLPL*-scFv84.66-KDEL- NOS 3 ' UTR (PW-TMV) abreviatura: OL84.66KP 7 2x35S 5' -UTR (CHS) -muLPH*-scFv84.66-KDEL- 35S 3 'UTR (PW-TMV) 8 2x35S 5 ' -UTR (Ome) -muLPL* -muVL-huCL- 35S 3 'UTR (PW-TMV) 9 2x35S 5 ' -UTR (Ome) - muLPL* - muVH - huCH - 35S 3 'UTR (PW-TMV) 10 2x35S 5 ' -UTR(Ome) -muLPH*-muVH-huCH-KDEL- 35S 3 'UTR (PW-TMV) UTR región no traducida CHS 5 'UTR de chalcona sintasa Ome secuencia omega de TMV (mejorador de traducción 5') muLP péptido líder murino LPH* péptido líder de cadena pesada de a-TMV mAB24, codón optimizado para tabaco, chícharo + trigo LPL* péptido líder de cadena ligera de a-TMV mAB24, codón optimizado para tabaco, chícharo + trigo scFv fragmento Fv de cadena simple 84.66 anticuerpo OÍ-CEA T84.66 (enlaza con el dominio A3 con alta afinidad) His6 histidina 6 para cromatografía por afinidad basada en Ni-NTA KDEL motivo KDEL terminal C para permitir la retención de RE (conduce a acumulación de proteína aumentada) stop codón de detención PW región pseudoknot de TMV-tipo natural 3 ' UTR (aumentador potencial de transcripción y traducción) TMV virus de mosaico de tabaco ubicuitina promotor de ubicuitina 1 e intrón de maíz 2x35S promotor 35S mejorado del virus de mosaico de coliflor NOS terminador del gen sintasa nopalina de agrobacterium 35S terminador del virus de mosaico de coliflor muVL región variable de cadena ligera de murino muVH región variable de cadena pesada de murino huCL región constante de cadena ligera humana huCH regiones constantes de cadena pesada humana TABLA 2 Resultados de experimentos usando los casetes mostrados en la Tabla 1 para expresar el scFv84.66 en callo y hojas de arroz. El promotor ubicuitina y los pA NOS se usaron en todo.
niiiifttinmrnf-»--^ Cásete de expresión callo hoj semilla media ng/g media ng/g media ng/g construcción 1 129 59 110 construcción 2 n.d. 61 n.d. 5 construcción 3 762 1250 n.d. construcción 4 1663 3030 2800 construcción 5 758 10460 10050 construcción 6 1229 1460 n.d. construcción 7 n.d. 8930 n.d. 10 TABLA 3 Expresión funcional de T84.66 capaz de enlazar su antígeno detectado por prueba inmunosorbente de enzima enlazada en callo, hojas y semillas de arroz Cásete de expresión callo ho a semilla 15 ng/g ng/g ng/g construcción 8+9 100-250 250 200-300 construcción 8+10 100-300 280 200-390 TABLA 4 Construcciones que contienen formas de rAb24 20 N Nrr P Prroommoottoorr Construcción ADNc ter 11 2x35S 5' -UTR (CHS) -muLPL-VL24-CL-3 'UTR 35S 2x35S 5' -UTR (CHS) -muLPL-VH24-CHl-3 ' UTR 35S (los dos casetes están en tándem) 12 2x35S 5' -UTR (CHS) -muLPL-VH24-CL-3 'UTR 35S 25 2 2xx3355SS 5' -UTR(CHS) -muLPH-VL24-CHl (2cys) - 35S 3 'UTR (los dos casetes están en tándem) 13 2x35S 5 'UTR (Ome) -muLPL-CP-scFv24 -KDEL- 35S 3 'UTR (PW-TMV) CP proteína de recubrimiento de TMV
66 LISTADO DE SECUENCIAS
;i) INFORMACIÓN GENERAL (i) SOLICITANTE: Paul CHRISTOU; Eva STROGER; Carmen MARTIN-VAQUERO; Stefan SCHILLBERG; Julián K-C MA (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: MÉTODOS Y MEDIOS PARA LA EXPRESIÓN DE POLIPEPTIDOS DE MAMÍFEROS EN PLANTAS MONOCOTILIDONEAS (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 41 (iv) DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Fulbright & Jaworski L.L.P. (B) CALLE: 666 Fifth Avenue (C) CIUDAD: Ciudad de Nueva York (D) ESTADO: Nueva York (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO: 10103 (v) FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO MEDIO: Disco blando 3.25", 1.44 mb (B) COMPUTADORA: IBM PS/2 (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS (D) SOFTWARE: WordPerfect (vi) DATOS DE SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: Para ser asignado (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: Junto con la presente
iatík-aÉe¡ßßBSÍ 67 (C) CLASIFICACIÓN: 435 (vii) DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES: (A) NUMERO DE SOLICITUD: 60/089,322 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 15 de junio de 1998 (viii) INFORMACIÓN DE ABOGADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Mary Anne Schofield (B) NUMERO DE REGISTRO: 36,669 (C) NUMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: KL/JIC 202.1 PCT -JEL (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN: (A) TELEFONO: (212) 318-3000 (B) TELEFAX : (212) 752-5958
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 12 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 1 : AAAGATGAGC TC 12
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 2 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 4 68 (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 2 : Lys Asp Glu Leu
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 3 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 12 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 3 : CATGATGAGC TC 12
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 4 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 4 (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 4 : His Asp Glu Leu
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 5 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 5
gg^^^g^g^^HHg^wUny^^y 69 (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 5 : Gly Gly Gly Gly Ser 5
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 6 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 4 (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 6 : Arg Gly Ser Glu
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 7 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 57 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 7 : GAATTCACAA CACAAATCAG ATTTATAGAG AGATTTATAA AAAAAAAAAA ACATATG 57
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 8 : 70 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 71 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 8 : GUAUUUUUAC AACAAUUACC AACAACAACA AACAACAAAC AACAUUACAA UUACUAUUUA 60
CAAUUACAAT G 71
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 9 :
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 70 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 9 : GUAUUUUUAC AACAAUUACC AACAACAACA ACAACAACAA CAUUACAAUU ACUAUUUACA 60
AGGACCAUGG 70
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 34 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal 71 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10: GCCGAATTCC ATGGACGTCG AGCTGACCCA GTCT 34
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 42 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11: CTTTCCGGAA CCACTAGTAG AGCCTTTTAT CTCCAGCTTG GT 42
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 48 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12: GGTTCCGGAA AGAGCTCTGA AGGTAAAGGT GAGGTCCAGC TGCAGCAG 48
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 34 (B) TIPO: ácido nucleico 72 (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13: GCCTCTAGAC GTCGACTGCA GAGACAGTGA CCAG 34
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 50 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14: GCACACCCGA ATTCGGGCCC GGGCATATGC AAATTGTTCT CACCCAGTCT 50
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15: CTGGAAATAA AAACTGTGGC TGCACCATCT 30
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 73 (A) LONGITUD: 24 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16: GCCAAGCTTT TTGCAAAGAT TCAC 24
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17: ACCGTCTCCT CAGCCTCCAC CAAGGGCCCA 30
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18: GCCAAGCTTG GATCCTTGGA GGGGCCCAGG 30 74 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19: GGCGAATTCA TGGAGACAGA CACACTC 27
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20: AGCCACAGTT TTTATTTCCA GCTTGGTCCC 30
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21: 75 GGCGAATTCA TGAAATGCAG CTGGGTT 27
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:22: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22: GGTGGAGGCT GAGGAGACGG TGACTGAGGT 30
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:23: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 39 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23: GCGGAATTCG TAATCGATCC CGGGGGTAAC CGCGGTACC 39
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple 76 (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24: GCGGACGTCG CTATGAGACT GGGTGGGCCC 30
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:25: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 43 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25: GCGGAATTCG GCCACCATGG CCCAAATTGT TCTCACCCAG TCT 43
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26: GCGATCGATT GCAGAGACAG TGACCAGAGT 30
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 77 77 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27: ACGCTCTAGA GCTCATCTTT CTCAGATCCA CGAGAACCTC CACCTCCGTC GACTGCAGAG 60
ACAGTGACCA GAGTCCC 77
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 28: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 26 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28: ACTGCGCCAT GGCTTACAGT ATCACT 26
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 29: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 72 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29: CCGTCAGACG TCAGAACCTC CACCTCCACT TCCGCCGCCT CCAGTTGCAG GACCAGAGGT 60
CCAAACCAAA CC 72
^^^_^^^_^i 78 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 30: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 88 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30: CCCTCACTCG AGTTTAGAGC TCATCTTTCT CAGATCCACG AGCGGCCGCA GAACCTCCAC 60 CTCCGTCGAC TGCAGAGACA GTGACCAG 88
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 31: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 79 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31: GCCGAATTCA TATGGCAAAC TTCTCTGAAT CTAAGTCCAT GATGGCAGTT TTCTTCATGT 60 TTTTCCTTCT TCTCCTTTC 79
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 32: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 79 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple
itirn ii- nitl 79 (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:32: ATGTTTTTCC TTCTTCTCCT TTCATCTAGC TCTTCAAGCT CTTCATCTTC CATGGGACAA. 60
ATTGTTCTCA CCCAGTCCC 79
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:33: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 71 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33: OGCCGAATTCA TATGGCATCT ATCACTGCTT CTCACCACTT TGTGTCTAGG TCTCAAACTT 60
CTCTTGACAC C 71
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:34: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 71 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34: GGTCTCAAAC TTCTCTTGAC ACCAAATCTA CCTTGTCTCA GATCGGACTC AGGAACCATA 60
CTCTTACTCA C 71 80 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 35: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 70 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35: TCAGGAACCA TACTCTTACT CACAATGGTT TGAGGGCTGT TAACAAGCTC GATGGTCTCC 60
AATCTAGAAC 70
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 36: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 73 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36: CTCGATGGTC TCCAATCTAG GACTAATACT AAGGTCACCC CTAAGATGGC ATCTAGGACT 60
GAGACCAAGA GGC 73
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 37: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 82 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple 81 (D) TOPOLOGÍA : l ineal (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO : 37 : GCATCTAGGA CTGAGACCAA GAGGCCAGGA TGCTCTGCTA CCATTGTTTG CGCCATGGGA 60
CAAATTGTTC TCACCCAGTC TC 82
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 38: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 31 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38: CTGTCCTCCA TGAGCTCAGC ACCCACAAAA C 31
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 39: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39: GTGCTGAGCT CATGGAGGAC AGGGGTTGAT 30
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 40: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 82 (A) LONGITUD: 31 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40: ATGCAAGGAG TGAGCTCAGC ACCCACAAAG C 31
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 41: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41: TGCTGAGCTC ACTCCTTGCA TGGAGGACAG 30