MX2015002183A - Acidos grasos de cadena ramificada como intercambiadores de cationes liquidos. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para retirar un compuesto orgánico de una solución acuosa, que comprende las etapas de proporcionar la solución acuosa que contiene el compuesto orgánico y una solución orgánica hidrofóbica, en donde ésta última comprende un intercambiador de cationes hidrofóbico líquido, poner en contacto la solución acuosa y la solución orgánica hidrofóbica y separar la solución orgánica hidrofóbica de la solución acuosa, en donde el intercambiador de cationes hidrofóbico líquido es un ácido alcanoico saturado que tiene al menos un sustituyente alquilo, en donde el compuesto orgánico es un compuesto orgánico que tiene al menos una carga positiva y una carga total neutra o positiva.

Description

ÁCIDOS GRASOS DE CADENA RAMIFICADA COMO INTERCAMBIADORES DE CATIONES LÍQUIDOS La presente invención se refiere a un método para retirar un compuesto orgánico de una solución acuosa, que comprende las etapas de proporcionar la solución acuosa que contiene el compuesto orgánico y una solución orgánica hidrofóbica, en donde la última comprende un intercambiador de cationes hidrofóbico, poner en contacto la solución acuosa y la solución orgánica hidrofóbica y separar la solución orgánica hidrofóbica de la solución acuosa, en donde el intercambiador de cationes hidrofóbico líquido es un ácido alcanoico saturado que tiene al menos un sustituyente alquilo, en donde el compuesto orgánico es un compuesto orgánico que tiene al menos una carga positiva y una carga total neutra o positiva.

El problema fundamental en la producción bioteenológica de productos químicos finos que proceden de materias primas renovables, cuyos productos químicos finos de otra manera se sintetizarían procediendo de combustibles fósiles, es transferir el producto una vez obtenido, el cual típicamente se encuentra presente en una fase acuosa de gran volumen, a una fase orgánica,. Esta transferencia se lleva a cabo, en primer lugar, a fin de concentrar un producto intermediario terminado o final y opcionalmente permitir el procesamiento sintético en las siguientes etapas de reacción en una solución orgánica y en segundo lugar, a fin de mejorar el rendimiento de la reacción en la fase acuosa al retirar el producto deseado o permitir que tenga lugar la reacción completamente en un contexto téenicamente lógico. La concentración térmica directa de la solución acuosa de gran volumen del producto que frecuentemente se encuentra presente a bajas concentraciones, generalmente no es conveniente.

La distribución de un compuesto en un sistema de dos fases en equilibrio que comprende una fase hidrofílica acuosa y una fase hidrofóbica orgánica que no se mezclan, depende fundamentalmente de las propiedades fisicoquímicas del compuesto respectivo. Considerando que los compuestos que tienen una alta fracción de, o que consisten exclusivamente de hidrocarburos no sustituidos se acumulan predominantemente en la fase hidrofóbica, los compuestos que tienen una alta fracción de grupos polares, tal como las funcionalidades que contienen heteroátomos y muy particularmente los compuestos con cargas predominantemente o virtualmente de manera exclusiva se sitúan en la fase acuosa, lo que hace más difícil la transferencia a una fase orgánica.

La distribución de un compuesto en dicho sistema bifásico, después que se establece el equilibrio, se describe frecuentemente con el uso de coeficientes de distribución, por ejemplo de acuerdo con la ecuación de Nernst.

— Cfasel/Cfase2, El coeficiente de distribución espacial es KoW, también denominado valor P, que caracteriza el equilibrio de distribución de un compuesto entre una fase de octanol y una fase acuosa: ^ow = P = Coctanol/Cagua Los ejemplos de compuestos orgánicos que tienen una alta demanda en la industria y que se cargan positivamente en una solución acuosa a pH fisiológico son el ácido 12-aminolaurico (ALA) y derivados de éste, en particular el metil éster (ALAME). El ALA es un material de alimentación importante en la producción de polímeros. Usualmente, el ALA que se produce a partir de materias primas fósiles en un proceso de bajo rendimiento a través de lauroctama que se sintetiza por trimerización de butadieno, la posterior hidrogenación con la formación de ciclododecano, la posterior oxidación a ciclododecanona, la reacción con hidroxilamina y después el reordenamiento de Beckmann. Una trayectoria altamente prometedora para la producción bioteenológica de ALA o ALAME se describe en DE10200710060705.

La técnica anterior enseña la obtención de compuestos orgánicos con carga positiva al poner en contacto una mezcla de reacción acuosa que comprende una célula metabólicamente activa con una fase orgánica que comprende un solvente orgánico. Por ejemplo, DE10200710060705, describe obtener el producto ALAME de una mezcla orgánica de reacción al agitarla con acetato de etilo. Asano et al (2008) describe la extracción de ALA con tolueno a partir de una solución de reacción acuosa que comprende una enzima sintetizadora de ALA (Asano, Y., Fukuta, Y., Yoshida, Y. y Komeda, H. (2008): The Screening, Characterisation, and Use of w-Laurolactam Hydrolase: A New Enzymatic Synthesis of 12-Aminolauric Acid (El análisis, caracterización y uso de w-Laurolactama Hidrolasa: Una Nueva Síntesis enzimática de ácido 12-aminolaurico), Biosc. Biotechn. Biochem. , 72(8), 2141-2150).

Por lo tanto, el objetivo de la presente invención es desarrollar un método para retirar compuestos orgánicos cargados positivamente, particularmente ácidos co-aminocarboxílicos, que tienen al menos una carga positiva de una mezcla de reacción acuosa, en donde se desea una posición del equilibrio de distribución tan conveniente como sea posible entre la mezcla de reacción y una fase orgánica hidrofóbica utilizada como medio de extracción, i.e., el equilibrio de distribución se encuentre hasta donde sea posible en el lado de la fase orgánica hidrofóbica.

Un objetivo adicional de la invención es desarrollar un método para retirar compuestos orgánicos que tengan al menos una carga positiva, particularmente ácidos w-aminocarboxílíeos, de una solución acuosa que comprende una célula metabólicamente activa, utilizando una fase orgánica hidrofóbica como medio de extracción, en donde el equilibrio de distribución se encuentra en la medida de lo posible en el lado de la fase orgánica hidrofóbica.

Un objetivo adicional de la invención es desarrollar un método para retirar compuestos orgánicos que tengan al menos una carga positiva, particularmente ácidos w-aminocarboxílicos, de una solución acuosa, al utilizar una solución orgánica hidrofóbica como medio de extracción, que afecte o retarde tan poco como sea posible el crecimiento de microorganismos bioteenológicamente relevantes, en particular la Escherichia coli y/o disminuya tan poco como sea posible, el conteo de células que sean capaces de la división celular y/o de células viables y/o respiratorias y/o metabólicamente activas y sintéticamente activas en el curso de esto.

Un objetivo adicional de la invención es desarrollar un método para retirar de una solución acuosa, los compuestos orgánicos que tienen al menos una carga positiva, particularmente los ácidos w-aminocarboxílicos, al utilizar una solución orgánica hidrofóbica como medio de extracción, en el que mantener la cualidad y/o la recuperabilidad, particularmente con respecto al contenido constante del intercambiador de cationes hidrofóbico líquido o la pureza del intercambiador de cationes después de la recuperación, de la solución orgánica hidrofóbica, sea tan bueno como sea posible.

Finalmente, el objetivo de la invención es descubrir un método para retirar un compuesto orgánico que tenga al menos una carga positiva, particularmente ácidos w-a inocarboxílicos, de una solución acuosa que comprenda una célula metabólicamente activa, al utilizar una fase orgánica hidrofóbica como medio de extracción, en la que se optimice la totalidad de las propiedades fundamentales para la producción, la tasa total de conversión y la rápida operabilidad de un método sintético bioteenológico subyacente, en particular la toxicidad de la fase orgánica hacia una célula metabólicamente activa y la absorción del compuesto en el medio orgánico de extracción, con respecto al rendimiento total o a una secuencia más rápida o, en el caso de un proceso continuo, la utilidad de la célula metabólicamente activa durante tanto tiempo como sea posible, particularmente en el caso de que el compuesto orgánico que tiene al menos una carga positiva sea el producto o un intermediario del método sintético que se sintetiza con la participación de la actividad catalítica de la célula metabólicamente activa.

Estos y otros objetivos se logran por la materia de la presente solicitud y particularmente también por la materia de las reivindicaciones independientes acompañantes, con las modalidades que surjan de las reivindicaciones dependientes.

En un primer aspecto, el problema subyacente en la invención se resuelve por un método para retirar un compuesto orgánico de una solución acuosa, que comprende las etapas: a) proporcionar la solución acuosa que contiene el compuesto orgánico y una solución orgánica hidrofóbica, en donde la última comprende un intercambiador de cationes hidrofóbico, b) poner en contacto la solución acuosa y la solución orgánica hidrofóbica, y c) separar la solución orgánica hidrofóbica de la solución acuosa, en donde el intercambiador de cationes hidrofóbico líquido es un ácido alcanoico saturado que tiene al menos un sustituyente alquilo, en donde el compuesto orgánico es un compuesto orgánico que tiene al menos una carga positiva y una carga total neutra o positiva.

En una primera modalidad del primer aspecto, el problema se resuelve por un método en donde el compuesto orgánico es un compuesto de la fórmula NR2R3H+-A-COOR1(I)O NR2R3H+-A-NR4R5H+ (II), en donde R1 es hidrógeno, metilo, etilo, propilo, isopropilo o una carga negativa. en donde A es un grupo alquileno que tiene al menos tres, preferentemente al menos seis, particularmente de manera preferente ocho átomos de carbono, que es preferentemente no sustituido y de cadena recta, y en donde R2, R3, R4 y R5, en cada caso e independientemente de otros, se seleccionan del grupo que consiste de hidrógeno, metilo, etilo y propilo.

En la segunda modalidad del primer aspecto, que también es una modalidad de la primera modalidad, el problema se resuelve por un método en donde el pH en la solución acuosa en la etapa b) es de 6 a 8, preferentemente de 6.2 a 7.2.

En la tercera modalidad del primer aspecto, que también es una modalidad de la primera a la segunda modalidades, el problema se resuelve por un método en donde la proporción de la cantidad de la sustancia del intercambiador de cationes líquido al compuesto orgánico en la etapa b) es al menos de 1.

En una cuarta modalidad del primer aspecto, que también es una modalidad de la primera a la tercera modalidad, el problema se resuelve por un método en donde la proporción volumétrica de la solución orgánica a la solución acuosa es de 1:10 a 10:1.

En una quinta modalidad del primer aspecto, que también es una modalidad de la primera a la cuarta modalidades, el problema se resuelve por un método en donde el intercambiador de cationes líquido es un ácido graso de cadena ramificada de la fórmula (H3C)2CH-(CH2)n-C00H o una forma no protonada de la misma y n es al menos 4, preferentemente al menos 8 y más preferentemente es 14.

En una sexta modalidad del primer aspecto, que también es una modalidad de la primera a la quinta modalidades, el problema se resuelve por un método en donde el intercambiador de cationes líquido es un ácido alcanoico saturado que tiene al menos un sustituyente alquilo que comprende preferentemente en total al menos 12 átomos de carbono.

En una séptima modalidad del primer aspecto, que también es una modalidad de la primera a la sexta modalidades, el problema se resuelve por un método en donde la solución acuosa comprende adicionalmente una célula metabólicamente activa.

En una octava modalidad del primer aspecto, que también es una modalidad de la primera a la séptima modalidades, el problema se resuelve por un método en donde el compuesto orgánico es un compuesto tóxico para la célula, preferentemente una célula bacteriana.

En una novena modalidad del primer aspecto, que también es una modalidad de la primera a la octava modalidades, el problema se resuelve por un método en donde la solución orgánica contiene adicionalmente al menos un solvente orgánico, preferentemente un ácido graso y/o un éster de ácido graso.

En una décima modalidad del primer aspecto, que también es una modalidad de la primera a la novena modalidades, el problema se resuelve por un método en donde la solución orgánica hidrofóbica contiene el intercambiador de cationes hidrofóbico líquido en una fracción volumétrica de 20 a 80%, preferentemente de 25 a 75%.

En una onceava modalidad del segundo aspecto, que también es una modalidad de la primera a la décima modalidades del primer aspecto, el compuesto orgánico es una diamina seleccionada del grupo que consiste de 1,4-butanodiamina, 1,5-pentanodiamina, 1,6-hexanodiamina, 1,8-octanodiamina, 1,14-tetradecanodiamina, 1,18-octadecanodiamina, 2-metil-l,5-diaminopentano, 2,2-dimetil-1,5-diaminopentano, 4,4'-diaminodiciclohexilmetano, 3,3'-dimetil-4,4'-diaminodiciclohexilmetano, 3,3',5,5'-tetrametil-4,4'-diaminodiciclohexilmetano, m- o p-xililenodiamina, 2,2,4- o 2,4,4-trimetilhexametilendiamina, 1,4-diaminociclohexano, 4,4'-diaminodiciclohexilpropano, isoforonodiamina, meta-xililenodiamina y para-xililenodiamina.

En una doceava modalidad del segundo aspecto, que también es una modalidad de la primera a la onceava modalidades, la temperatura en la etapa b) es de entre 28 y 70°C, preferentemente entre 30 y 37°C.

En un segundo aspecto, el problema que subyace a la invención se resuelve por una mezcla de reacción que comprende una solución acuosa que contiene un compuesto orgánico y una solución orgánica hidrofóbica. en donde la solución orgánica hidrofóbica comprende un intercambiador de cationes hidrofóbico líquido, en donde el intercambiador de cationes hidrofóbico líquido es un ácido alcanoico saturado que tiene al menos un sustituyente alquilo, y en donde el compuesto orgánico es un compuesto orgánico que tiene al menos una carga positiva y una carga total neutra o positiva.

En una primera modalidad del segundo aspecto, el problema se resuelve por una mezcla de reacción en donde el compuesto orgánico es un compuesto de la fórmula NR2R3H+-A-COOR1 (I) o NR2R3H+-A-NR4R5H+ (II), en donde R1 es hidrógeno, metilo, etilo, propilo, isopropilo o una carga negativa, en donde A es un grupo alquileno que tiene al menos tres, preferentemente al menos seis, particularmente de manera preferente ocho átomos de carbono que preferentemente es no sustituido y de cadena recta, y en donde R2, R3, R4 y R5 en cada caso e independientemente uno de otro, se seleccionan del grupo que consiste de hidrógeno, metilo, etilo y propilo.

En una segunda modalidad del segundo aspecto, que también es una modalidad de la primera modalidad del primer aspecto, el problema se resuelve por una mezcla de reacción en donde el intercambiador de cationes hidrofóbico líquido es un ácido graso de cadena ramificada de la fórmula (H3C)2CH-(CH2)n-C00H o una forma no protonada de la misma y n es al menos 4, preferentemente al menos 8 y más preferentemente 14.

En una tercera modalidad del segundo aspecto, que también es una modalidad de la primera a la segunda modalidades del primer aspecto, el intercambiador de cationes líquido es un ácido alcanoico saturado que tiene al menos un sustituyente alquilo que comprende preferentemente en total al menos 12 átomos de carbono.

En una cuarta modalidad del segundo aspecto, que también es una modalidad de la primera a la tercera modalidades del primer aspecto, la solución acuosa comprende adicionalmente una célula metabólicamente activa.

En una quinta modalidad del segundo aspecto, que también es una modalidad de la primera a la cuarta modalidades del segundo aspecto, el compuesto orgánico es una diamina seleccionada del grupo que consiste de 1,4-butanodiamina, 1,5-pentanodiamina, 1,6-hexanodiamina, 1,8- octanodiamina, 1,14-tetradecanodiamina, 1,18-octadecanodiamina, 2-metil-l,5-diaminopentano, 2,2-dimetil-1,5-diaminopentano, 4 ,4'-diaminodiciclohexilmetano, 3,3'-dimetil-4,4'-diaminodiciclohexilmetano, 3,3',5,5'-tetrametil-4,4'-diaminodiciclohexilmetano, m- o p-xililenodiamina, 2,2,4- o 2,4,4-trimetilhexametilendiamina, 1,4-diaminociclohexano, 4,4'-diaminodiciclohexilpropano, isoforondiamina, meta-xililendiamina y para-xililendiamina.

Modalidades adicionales del segundo aspecto comprenden todas las modalidades del primer aspecto de la presente invención.

Los inventores de la presente invención han encontrado que la eficiencia del retiro de un compuesto orgánico que tiene una carga positiva de una solución acuosa en una solución orgánica hidrofóbica puede incrementarse sorprendentemente si esta solución orgánica comprende un intercambiador de cationes líquido que es un ácido alcanoico saturado que tiene al menos un sustituyente alquilo. Sin desear limitarse por cualquier teoría, los inventores de la presente invención suponen que la carga negativa o las cargas negativas del intercambiador de cationes líquido interactúan iónicamente con la carga positiva o la multiplicidad de cargas positivas de los compuestos orgánicos y que esta interacción conduce al enmascaramiento de al menos una carga positiva, que incrementa la solubilidad en la fase orgánica.

La presente invención proporciona el uso de un ácido alcanoico saturado que tiene al menos un sustituyente alquilo como un intercambiador de cationes hidrofóbico líquido para retirar un compuesto orgánico que tiene una carga positiva de una solución acuosa, preferentemente con la acumulación del compuesto orgánico en la solución orgánica hidrofóbica. En una modalidad preferida, la expresión "ácido alcanoico saturado que tiene al menos un sustituyente alquilo" se toma en el sentido de un ácido alcanoico de la fórmula CH3-(C¾)n-C00H o una forma no protonada de la misma, en la que al menos un átomo de hidrógeno de la cadena de alquilo se intercambia por un sustituyente alquilo de la fórmula (CH2)m-H, en donde n y m en cada caso e independientemente uno de otro pueden ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30. En una modalidad más preferida, el ácido alcanoico saturado que tiene al menos un sustituyente alquilo, es un compuesto del grupo que consiste de ácido isoesteárico, ácido isopalmítico, ácido isomirístico, ácido fitánico, ácido 2-hexildecanoico, ácido 2-butiloctanoico, ácido 15-metilhexadecanoico, ácido 13-metiltetradecanoico. En una modalidad particularmente preferida, el último átomo de carbono, excepto uno se sustituye en la cadena alquilo, particularmente de manera preferente con un grupo metilo. Las mezclas que son utilizables de acuerdo con la invención son explícitamente mezclas de varios ácidos alcanoicos saturados que tienen al menos un sustituyente alquilo, opcionalmente con más intercambiadores de cationes hidrofóbicos líquidos que son estructuralmente diferentes del último.

En una modalidad preferida, el intercambiador de cationes líquido es un ácido graso de cadena ramificada que comprende exclusivamente sustituyentes distintos a los sustituyentes cíclicos, i.e., la molécula es lineal, por lo tanto no comprende ninguna estructura de tipo anillo.

Como con todos los compuestos en esta solicitud, un ácido alcanoico saturado que tiene al menos un sustituyente alquilo, en una modalidad preferida, comprende igualmente formas no protonadas, parcialmente y completamente protonadas del compuesto.

La enseñanza de acuerdo con la invención es adecuada para el retiro de compuestos orgánicos estructuralmente diversos que tienen una carga positiva y una carga total positiva o neutra, de una solución acuosa . En una modalidad preferida, el compuesto orgánico es un compuesto de la fórmula NR2R3H+-A-COOR1 (I) o NR2R3H+-A-NR4R5H+ (II), en donde R1 es hidrógeno, metilo, etilo, propilo, isopropilo o una carga negativa, en donde A es un grupo alquileno que tiene al menos tres, preferentemente al menos seis, particularmente de manera preferente ocho átomos de carbono que es preferentemente no sustituido y de cadena recta. A puede ser un alcano ramificado o no ramificado, lineal o cíclico o un aromático heteroaromático que se sustituye con al menos los dos sustituyentes dados en la fórmula (II). En una modalidad particularmente preferida, el compuesto orgánico es un compuesto de la fórmula II y A es una cadena de alquileno de la fórmula -(CH2)n- en donde n es 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 O 40 y particularmente de manera preferente adicionalmente R2 = R3 = R4= R5= R6= R7 = H, y en donde R2, R3, R4 y R5, en cada caso e independientemente uno de otro, se seleccionan del grupo que consiste de hidrógeno, metilo, etilo y propilo. En una modalidad preferida es un ácido aminoláurico o un áster del mismo, preferentemente el áster de metilo.

En una modalidad preferida, la expresión "intercambiador de cationes líquido", como se utiliza en la presente, significa un compuesto soluble en un solvente orgánico hidrofóbico que es líquido a temperatura ambiente, cuyo compuesto, debido a la carga negativa ubicada al menos en parte en el grupo carboxilato del ácido alcanoico, puede desarrollar al menos transitoriamente una interacción iónica con al menos un catión.

La solución acuosa de la que se retira el compuesto orgánico es preferentemente una solución amortiguadora que contiene agua o un medio de cultivo acuoso que aún más preferentemente contiene agua como solvente predominante. Por ejemplo, la fracción de solvente del agua en la solución acuosa es más de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 9599 por ciento por volumen o de 100 por ciento por volumen. Los expertos en la téenica conocen varios medios de cultivo amortiguadores acuosos que son adecuados para mantener o cultivar células, en particular células de importancia biotecnológica. Estas incluyen igualmente, medios completos tales como el medio LB, medios mínimos tales como medios M9, medios mínimos que tienen componentes complejos tales como extracto de levadura o peptona, combinaciones de los antes mencionados y también medios selectivos, por ejemplo los que tienen una alta concentración de sal y, por lo tanto, únicamente permiten el crecimiento de organismos halofílicos o al menos halotolerantes. En una modalidad preferida, la expresión "medio de cultivo acuoso", como se utiliza en la presente, significa un medio de reacción a base de agua que, con respecto a todos los factores relevantes, en particular el pH, el contenido de sal y temperatura, es de tal naturaleza que mantiene o promueve la viabilidad de las células presentes en el mismo, preferentemente microorganismos y tanto el medio de cultivo acuoso como la fase orgánica hidrofóbica se encuentran presentes en la forma líquida. Los requerimientos de temperatura de varias células bioteenológicamente importantes pueden encontrarse en los libros de texto de microbiología y biología molecular, e.g. Fuchs/Schlegel (2007) Allgemeine Mikrobiologie [General Microbiology], 2008, Georg Thieme Verlag. En una modalidad preferida, el pH del medio de cultivo acuoso en el punto de tiempo de contacto es de entre 4 y 9, más preferentemente entre 4.5 y 8.5, más preferentemente entre 62 y 7.2. En una modalidad preferida, el pH del medio de cultivo acuoso en la etapa b) se mantiene en el rango de pH de 4 a 9, más preferentemente entre 4.5 y 8.5, más preferentemente entre 6.2 y 7.2 durante al menos 0.5 h, más preferentemente al menos 2 h, aún más preferentemente al menos 6 h, más preferentemente al menos 12 h. Los expertos en la técnica saben, con base en la técnica, cómo ajustar y controlar el pH de una solución acuosa, en particular también una solución acuosa que comprenda células metabólicamente activas y medios requeridos para el cultivo de las mismas, al agregar ácido o base, por ejemplo ácido sulfúrico o agua amoniacal. En una modalidad más preferida, la temperatura es de entre 0 y 45°C, más preferentemente entre 15 y 40°C, más preferentemente entre 20 y 37°C.

En una modalidad preferida de la presente invención, la expresión "poner en contacto", como se utiliza en la presente, significa que dos fases se exponen entre si directamente y en particular sin conexión intermedia de una barrera física tal como una membrana. Poner en contacto en el caso más simple se lleva a cabo al colocar las dos fases en el mismo recipiente y mezclarlas entre si de manera adecuada, por ejemplo por agitación. Muy explícitamente, para la implementación de la enseñanza de acuerdo con la invención, es posible pero de ninguna manera necesario, que esté presente un sistema bifásico. Más bien, mezclando bien, de manera tan continua como sea posible, el total de la solución acuosa y la solución orgánica hidrofóbica, por ejemplo mediante agitación, es útil el retiro de la solución orgánica de la solución acuosa.

En una modalidad preferida, la expresión "tiene una carga", como se utiliza en la presente significa que un compuesto así caracterizado tiene una carga correspondiente en un grupo funcional adecuado, por ejemplo una carga positiva en un grupo de amonio, en la solución acuosa a pH de 0 a 14, más preferentemente de 2 a 12, de 2 a 6, de 8 a 12, de 3 a 10, de 6 a 8, más preferentemente con un pH de 7. En una modalidad preferida, es una carga que se encuentra permanentemente presente. En una modalidad más preferida, la expresión "tiene una carga", como se utiliza en la presente, significa que el grupo o compuesto funcional correspondiente se encuentra predominantemente presente con la carga correspondiente a H 7, i . e. , a al menos 50, más preferentemente 90, aún más preferentemente 99%. Por ejemplo, la molécula de etanolamina tiene una carga a pH 0. En este caso, es el grupo amonio protonado. En una modalidad preferida, la expresión "carga total" de un compuesto, significa en contraste la suma de todas las cargas en el compuesto a un pH de 0 a 14, más preferentemente de 2 a 12, de 2 a 6, de 8 a 12, de 3 a 10, de 6 a 8, más preferentemente a pH de 7. Por ejemplo, el compuesto glicina en una solución acuosa a pH 6 tiene dos cargas, es decir una carga negativa en la función carboxi y una carga positiva en el grupo amino protonado, i.e., en total una carga total neutra.

En una modalidad preferida de la invención, la expresión "que contiene" se entiende en el sentido de "comprendiendo", i.e., no exhaustivo. En este contexto, una mezcla que contiene A puede, además de A, tener otros componentes. La expresión "una o más cargas" significa al menos una carga de la naturaleza correspondiente.

En una modalidad preferida, la expresión "hidrofóbico", como se utiliza en la presente, significa la capacidad de un líquido, en la presencia de una fase acuosa y en equilibrio, i.e., en particular en ausencia de medidas neutraizantes tal como la agitación, para formar una fase líquida separada, claramente delimitada de la fase acuosa. La fase líquida puede ser una fase líquida coherente o una emulsión. En una modalidad preferida adicional, la expresión "hidrofóbico", como se utiliza en la presente, significa la propiedad de un compuesto para ser sustancialmente insoluble en agua. Finalmente, la expresión, en una modalidad preferida adicional, como se utiliza en la presente, significa que un compuesto designado de esta manera tiene un valor P (J. Sangster, Octanol-Water Partition Coefficients: Fundament is and Physical Chemistry (Coeficientes de Partición de Octanol-Agua: Fundamentos y Química FisicaJ, Vol. 2 de Wilcy Series in Solution Chemistry, John Wiley & Sons, Chichester, 1997), el logaritmo de base 10 el cual es mayor que 0, más preferentemente mayor de 0.5, aún más preferentemente mayor de 1 y más preferentemente mayor de 2. Los solventes orgánicos preferidos comprenden, pero no están restringidos a solventes del grupo que consiste de alcanos, cicloalcanos, cicloalquenos, arilos, ácidos grasos, ásteres de ácidos grasos, alcoholes, heterocicloalcanos, heterocicloalquenos y heteroarilos sustituidos y no sustituidos que son líquidos a temperatura ambiente. La solución orgánica hidrofóbica también puede ser una mezcla que comprende más de un solvente orgánico hidrofóbico.

En otra modalidad de la presente invención, el intercambiador de iones líquido no es tóxico o es únicamente moderadamente tóxico con respecto a las células metabólicamente activas, particularmente los microorganismos bioteenológicamente relevantes. La expresión "tóxico", como se utiliza en la presente, en una modalidad preferida de la invención, significa la propiedad de un compuesto que en contacto con los microorganismos correspondiente, reduce la tasa de crecimiento de los mismos, para reducir la actividad metabólica de los mismos, para incrementar el consumo de energía de los mismos, para reducir la densidad óptica de los mismos o la cuenta de células capaces de desarrollarse, para reducir o inhibir la actividad metabólica biotecnológica o la productividad de la misma y/o para conducir directamente a la muerte y a la lisis de los mismos. En una modalidad preferida, al menos una de estas acciones se logra en el caso de un compuesto tóxico aún a una concentración baja, preferentemente a una concentración de 1000, más preferentemente de 100, aún más preferentemente de 50 o 25, más preferentemente de 5 mg/1. Los expertos en la técnica conocen varios métodos utilizables como materia de rutina, por medio de los cuales puede estudiarse la toxicidad. Estos incluyen por ejemplo, la medición de la respiración de los microorganismos correspondientes por medio de electrodos de 02 o análisis de gases de salida o colocación en placas comparativas de las muestras de microorganismos y el posterior conteo de las unidades formadoras de colonias (CFUS colony forming units). En una modalidad preferida, "actividad tóxica moderada" significa que los microorganismos situados en una fase de crecimiento en la presencia del compuesto, crecen más y/o son metabólicamente activos, pero en menor grado que el control que se incuba bajo condiciones idénticas en la ausencia del compuesto correspondiente y/o de una fase prolongada de latencia.

Las soluciones acuosas y orgánicas se ponen en contacto bajo condiciones adecuadas y en particular durante un período de tiempo que es suficiente para el suficiente paso del compuesto orgánico de la fase acuosa a la fase orgánica, de manera ideal incluso para establecer el equilibrio correspondiente. Este periodo de tiempo y condiciones pueden determinarse por expertos en la téenica en el contexto de la experimentación de rutina. En una modalidad preferida, la etapa b) dura al menos 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 18, 24, 36 o 48 horas, o más de tal periodo de tiempo. En EP11154707 se describe información adicional sobre posibles maneras de llevar a cabo la invención.

La temperatura en la etapa b) depende no únicamente de las propiedades del intercambiador de cationes líquido sino, en particular en el caso de que tenga lugar el contacto de las soluciones acuosa y orgánica cuando la reacción está en proceso en la fase acuosa, también en los requerimientos de temperatura de cualquier reacción que tenga lugar en la fase acuosa. En particular, en el caso de que una celula metabólicamente activa sea catalíticamente activa en la fase acuosa, la temperatura debe ser adecuada para mantener esta actividad. En una modalidad preferida, la temperatura en la etapa b) es de 0 a 100°C, más preferentemente de 20 a 80°C, de 28 a 70°C, de 30 a 37°C, de 35 a 40°C.

El pH durante la etapa b) debe también tomar en cuenta los requerimientos de cualquier reacción que esté en proceso al mismo tiempo, de la transferencia de masa del compuesto orgánico disuelto en la fase del intercambiador de iones líquido y de la estabilidad de los reactivos, productos, intermediarios o agentes. En una modalidad preferida, el pH es de 3 a 8, más preferentemente de 6 a 8, aún más preferentemente de 6.2 a 7.2. Puede ser necesario mantener el pH en la solución acuosa constante y/o controlarlo de otras maneras por métodos de ciclo abierto o ciclo cerrado y, de ese modo, alimentar los auxiliares de corrección (e.g., agua amoniacal/gas amoniacal, ácido sulfúrico, o lo similar).

A fin de transferir el compuesto orgánico de la fase acuosa de manera tan completa como sea posible a la fase orgánica, es necesaria una cantidad suficiente de intercambiador de cationes hidrofóbico líquido. En una modalidad preferida de la presente invención, la proporción de la cantidad de sustancia del intercambiador de cationes líquido y del compuesto orgánico en al menos una etapa, en el caso de un proceso continuo, fue en total durante toda la secuencia de la reacción, de al menos 1, i.e., por molécula del compuesto orgánico, se utiliza al menos una molécula del intercambiador de cationes hidrofóbico líquido. En una modalidad aún más preferida, la proporción es mayor a 2, 3, 5, 10, 15 o 20, preferentemente de 1.5 a 3.

Para un método eficiente es importante la proporción volumétrica de la solución orgánica a la solución acuosa, junto con la proporción de la cantidad de sustancia del intercambiador de cationes/compuesto orgánico. En una modalidad particular, es de 100:1, más preferentemente de 20:1 a 1:20, aún más preferentemente de 10:1 a 1:10, de 4:1 a 1:4, de 3:1 a 1:3 o más preferentemente de 1:2 a 2:1.

Además del intercambiador de cationes hidrofóbico líquido, la fase orgánica hidrofóbica puede contener además un solvente hidrofóbico. Esto puede utilizarse para incrementar la capacidad de absorción del intercambiador de cationes hidrofóbico líquido en la fase hidrofóbica y evitar el comportamiento no deseado, por ejemplo la floculación. En una modalidad preferida, el solvente es un reactivo de una reacción precedente en la solución acuosa, más preferentemente el sustrato de una reacción catalizada por enzimas que precede en la solución acuosa. En una modalidad preferida, es un áster de ácidos grasos. En una modalidad particularmente preferida, el solvente es un áster de ácidos grasos, preferentemente áster de metilo, de un ácido graso que actúa como intercambiador de cationes hidrofóbico líquido. También pueden utilizarse mezclas de más de un solvente y uno o más de un intercambiador de cationes hidrofóbico líquido como solución orgánica hidrofóbica.

En donde está presente la fracción del solvente de la fase orgánica hidrofóbica, en una modalidad preferida, es de 1 a 99 por ciento por volumen (vol.-%). En una modalidad preferida, la fracción del solvente es de 10 a 90, aún más preferentemente de 20 a 80, más preferentemente de 25 a 75% vol En una modalidad preferida, la célula metabólicamente activa es una célula recombinante que está equipada con enzimas para producir el compuesto de la fórmula (I) o (II) y sobreexpresa al menos una de éstas, preferentemente todas. Las enzimas adecuadas que pueden utilizarse para producir compuestos orgánicos de la fórmula (I) o (II), en particular alcanohidroxilasas, AlkL, transaminasas, aldehido deshidrogenasas y alanino deshidrogenases se describen en la téenica anterior, por ejemplo, en DE10200710060705, EP11004029 o en PCT/EP2011/053834. En una modalidad preferida, la expresión "célula metabólicamente activa", como se utiliza en la presente, significa una célula viva que tiene actividad metabólica, preferentemente una célula que expresa, o aún más preferentemente sobreexpresa, en forma activa, una enzima relevante para la producción bioteenológica del producto de interés. La célula puede ser procariota, incluyendo arquea, o eucariota y en el caso de una procariota, preferentemente del grupo de género que comprende Pseudomonas, Corynebacterium y Escherichia . En una modalidad aún más preferida, la célula es una célula bacteriana, aún más preferentemente una célula bacteriana gram-negativa, más preferentemente E. coli . En una modalidad más preferida, es una célula eucariótica, más preferentemente un célula fúngica, aún más preferentemente una célula de levadura, más preferentemente Saccharomyces o Candida, Pichia, en particular Candida tropicalis . En una modalidad preferida, la expresión "eucariota inferior", como se utiliza en la presente, significa una eucariota que es unicelular en todas las fases de su existencia, en contraste con eucariotas superiores que pasan la parte predominante de su vida en la forma de organismo multicelular que tiene tejidos que comprenden células diferenciadas. La expresión "célula", en una modalidad particular, en esta solicitud, se utiliza como sinónimo y de manera intercambiable con la expresión "microorganismo". Además, la célula puede ser una célula aislada o una mezcla de varias células.

El método puede utilizarse a fin de oxidar primero ácidos grasos o ésteres de los mismos y después aminarlos. Para este propósito, por ejemplo, es adecuado un sistema enzimático como se describe en la solicitud de patente internacional WO 2009/077461. La célula metabólicamente activa en este caso es una célula que tiene una alcanohidroxilasa recombinante y una transaminasa, preferentemente, además, al menos una enzima del grupo que consiste de alcohol deshidrogenasa, alanino deshidrogenasa y lactama hidrolasa.

En la modalidad más preferida, la alcanohidroxilasa es una alcanohidroxilasa del tipo AlkB. AlkB es una oxidoreductasa del sistema AlkBGT de Pseudomonas putida, que es conocida por la actividad hidroxilasa de la misma. Esto depende de dos polipéptidos adicionales, AlkG y AlkT, que preferentemente se co-expresan. AlkT se caracteriza como una rubredoxina reductasa dependiente de FAD que transfiere los electrones de NADH a AlkG. AlkG es una rubredoxina, una proteína redox que contiene hierro que funciona como donante directo de electrones para AlkB. En una modalidad preferida, la expresión "alcanohidroxilasa del tipo AlkB", como se utiliza en la presente, significa una alcanomonooxidasa situada en la membrana. En una modalidad más preferida, la misma expresión "alcanohidroxilasa del tipo AlkB" significa un polipéptido que tiene una homología de secuencia con creciente preferencia de al menos 75, 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98 o 99% a la secuencia de la AlkB de Pseudomonas putida Gpol (código de la base de datos: CAB54050.1). En una modalidad más preferida, la expresión significa una monooxigenasa independiente de citocromo. En una modalidad más preferida, la expresión "alcanohidroxilasa del tipo AlkB" 5 significa una monooxigenasa independiente del citocromo que utiliza al menos una rubredoxina o su homologa como donante de electrones. En una modalidad particularmente preferida, la expresión significa una alcanohidroxilasa independiente del citocromo situada en la membrana que tiene cada vez más preferentemente al menos 60, 70, 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98, o 99% de la secuencia de AlkB de Pseudomonas putida Gpol, que como donante de electrones requiere al menos AlkG (CAB54052.1), pero preferentemente la combinación de AlkG con la reductasa AlkT (CAB54063.1), en donde AlkG y/o AlkT también pueden ser homologas del polipéptido respectivo. La expresión "secuencia", como se utiliza en la presente, puede relacionarse con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido y/o la secuencia de ácidos nucleicos que la codifican. En una modalidad más preferida, una "alcanohidroxilasa del tipo AlkB", como se utiliza en la presente, es una oxidoreductasa independiente del citocromo, i.e., una oxidoreductasa que no comprende citocromo como cofactor. Todos los códigos de la base de datos citados en esta solicitud son códigos de la versión disponible en línea el 1 de agosto del 2012.

En una modalidad preferida, la expresión "alcohol deshidrogenasa", como se utiliza en la presente, significa una enzima que reduce un aldehido o cetona al correspondiente alcohol primario o secundario, respectivamente. Los ejemplos que comprenden las alcohol deshidrogenasas de Ralstonia eutropha (ACB78191.1), Lactobacillus brevis (YP:_795183.1), Lactobacillus kefiri (ACF95832.1), de hígado de equino, de Paracoccus pantotrophus (ACB78182.1) y Sphingobium yanoikuyae (EU427523.1) y también las variantes respectivas de éstos.

En una modalidad preferida, la expresión "transaminasa", como se utiliza en la presente, significa una enzima que cataliza la transferencia de grupos amino de una molécula donante, preferentemente un aminoácido, a una molécula aceptora, preferentemente un ácido OÍ -cetocarboxílico. Por ejemplo, puede utilizarse la transaminasa de Chromobacterium violaceum ATCC 12472 (código de la base de datos NP_901695).

En una modalidad preferida, la expresión "alanino deshidrogenasa", como se utiliza en la presente, significa una enzima que cataliza la conversión de L-alanina con el consumo de agua y NAD+ a piruvato, amoniaco y NADH. Por ejemplo, pueden utilizarse las alaninodeshidrogenasas del Bacillus subtilis (código de la base de datos: L20916), Rhizobium Leguminosarum (código de la base de datos: CP001622), Vibrio proteolytikus (código de la base de datos: AF070716), Mycobacterium tuberculosis (código de la base de datos: X63069), Enterobacter aerogenes (código de la base de datos: AB013821).

En la modalidad más preferida, la alcanohidroxilasa es una alcanohidroxilasa del tipo AlkB. La AlkB es una oxidoreductasa del sistema AlkBGT de Pseudomonas putida, que se conoce por su actividad hidroxilasa. Esta depende de dos polipéptidos adicionales, AlkG y AlkT, que preferentemente se co-expresan. La AlkT se caracteriza como una rubredoxina reductasa dependiente de FAD, que transfiere electrones de NADH a AlkG. AlkG es una rubredoxina, una proteína redox que contiene hierro que funciona como un donante directo de electrones a AlkB. En una modalidad preferida, la expresión "alcanohidroxilasa del tipo AlkB", como se utiliza en la presente, significa una alcanomonooxidasa situada en la membrana. En una modalidad más preferida, la misma expresión "alcanohidroxilasa del tipo AlkB" significa un polipéptido que tiene una homología de secuencia con mayor preferencia de al menos 75, 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98 o 99% a la secuencia de la AlkB de Pseudomonas putida Gpol (código de la base de datos: CAB54050.1). En una modalidad más preferida, la expresión significa una monooxigenasa independiente del citocromo. En una modalidad más preferida, la expresión "alcanohidroxilasa del tipo AlkB" 5 significa una monooxigenasa independiente del citocromo que utiliza al menos una rubredoxina o su homólogo como donante de electrones. En una modalidad particularmente preferida, la expresión significa una alcanohidroxilasa independiente del citocromo, situada en la membrana que tiene con mayor preferencia al menos 60, 70, 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98 o 99% de la secuencia de AlkB de Pseudomonas putida Gpol, que requiere, como donante de electrones, al menos AlkG (CAB54052.1), pero preferentemente la combinación de AlkG con la reductasa AlkT (CAB54063.1), en donde AlkG y/o AlkT también pueden ser una homólogo del polipéptido respectivo. La expresión "secuencia" como se utiliza en la presente, puede referirse a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido y/o a la secuencia de ácidos nucleicos que lo codifica. En una modalidad más preferida, una "alcanohidroxilasa del tipo AlkB", como se utiliza en la presente, es una oxidoreductasa independiente del citocromo, i.e., una oxidoreductasa que no comprende citocromo como cofactor.

En una modalidad más preferida, la alcanohidroxilasa es una monooxigenasa del citocromo P450 de la familia CYP153. En una modalidad preferida, la expresión "monooxigenasa del citocromo P450 de la familia CYP153" significa una oxidasa citosólica que es parte de un sistema de 3 componentes que comprende además una ferredoxina y una ferredoxina reductasa, con un sitio de enlace de alcano y la capacidad de hidroxilar aleanos. En una modalidad particularmente preferida, es una enzima que tiene al menos 80, preferentemente 90, más preferentemente 95 o 99%, de identidad de secuencia a la monooxigenasa del citocromo P450 de la familia CYP153 de Alcanivorax borkumensis SK2 (código de la base de datos YP_691921) o una enzima que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene al menos 80, preferentemente 90, más preferentemente 95 o 99%, de identidad de secuencia con la monooxigenasa del citocromo P450 de la familia CYP153 de Alcanivorax borkumensis SK2 (código de la base de datos YP_691921) y además tiene actividad alcanohidroxilasa. En una modalidad preferida, la expresión "actividad alcanohidroxilasa", como se utiliza en la presente, significa la capacidad de catalizar la hidroxilación de alcanos o radicales del alquilo lineales no sustituidos que comprenden al menos cinco, preferentemente doce átomos de carbono. En una modalidad más preferida, la expresión "monooxigenasa del citocromo P450 de la familia CYP153" significa una oxidasa no unida a la membrana que incluye un sitio de enlace para alcanos, radicales alquilo lineales no sustituidos que comprenden al menos cinco, preferentemente doce átomos de carbono o alcanos monohidroxilados y la cadena polipeptídica que comprende el motivo LL(I/L)(V/l)GGNDTTRN. En una modalidad preferida, una "monooxigenasa del citocro o P450 de la familia CYP153", como se utiliza en la presente es una monooxigenasa del citocromo P450 de la familia CYP153 de Alcanivorax borkumensis SK2 (código de la base de datos YP_691921) o una variante que tiene preferentemente, actividad alcanohidroxilasa.

Para el suministro óptimo de la monooxigenasa del citocromo P450 de la familia CYP153 con electrones del agente reductor, preferentemente NADH, es preferible que se utilice la monooxigenasa junto con la ferredoxinreductasa que interactúa funcionalmente con ella y la ferredoxina que interactúa funcionalmente con ella. Estos pueden ser polipéptidos aislados o, en el caso de utilizar una célula metabólicamente activa, polipéptidos co-expresados o polipéptidos fusionados en la terminal N- o C- con la monooxigenasa del citocromo P450 de la familia CYP153. Un experto en la téenica puede establecer fácilmente si la ferredoxinreductasa o la ferredoxina con una monooxigenasa del citocromo P450 dada de la familia CYP153 interactúan funcionalmente entre si, si el agente reductor se oxida en presencia de un sustrato alcano y de los tres polipéptidos. Alternativamente, es posible utilizar la prueba enzimática descrita por Scheps, D., Malea, H., Hoffmann, B., Nestl, B.M. y Hauer, B. (2011) Org. Biomol . Chem. , 9, 5727 que en el caso de los polipéptidos que interactúan funcionalmente, exhibe un incremento considerable en la tasa de reacción. En una modalidad particularmente preferida, la monooxigenasa del citocromo P450 de la familia CYP153, la ferredoxina y la ferredoxinreductasa se originan del mismo organismo. En una modalidad particularmente preferida, es la ferredoxinreductasa de Alcanivorax borkumensis SK2 (código de la base de datos YP_691923) o una variante de ésta, la ferredoxina de Alcanivorax borkumensis SK2 (código de la base de datos YP_691920) o una variante de ésta y la monooxigenasa del citocromo P450 de la familia CYP153 de Alcanivorax borkumensis SK2 (código de la base de datos YP_691921) o una variante de ésta.

La enseñanza de la presente invención puede no solo llevarse a cabo o aplicarse con el uso de o en las secuencias exactas de aminoácidos o de ácidos nucleicos de las macromoléculas biológicas que se describen en la presente, por ejemplo a través de la inactivación de un gen que codifica una enzima que cataliza una de las reacciones de la b-oxidación, sino también con el uso o en variantes de tales macromoléculas que pueden obtenerse por supresión, adición o sustitución de uno o más aminoácidos o ácidos nucleicos. En una modalidad preferida, la expresión "variante" de una secuencia de ácidos nucleicos o secuencia de aminoácidos de aquí en adelante utilizada como sinónimo y de manera intercambiable con el término "homólogo", como se utiliza en la presente, significa otra secuencia de ácidos nucleicos o secuencia de aminoácidos, que tiene una homología, que se utiliza en la presente como sinónimo con una identidad del 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98, 99% o más, con respecto a la secuencia correspondiente de ácidos nucleicos o de aminoácidos tipo silvestre original, en donde preferentemente los aminoácidos diferentes a los aminoácidos que forman el centro catalíticamente activo o esencial para la estructura o duplicación se suprimen o sustituyen o éstos últimos son solamente sustituidos de manera conservadora, por ejemplo, un glutamato en lugar de un aspartato o una leucina en lugar de una valina. La téenica anterior describe algoritmos, que pueden utilizarse para calcular el grado de homología de dos secuencias, e.g. , Arthur Les (2008), Introduction to Bioinformatics (Introducción a la Bioinformática), 3a. Edición. En una modalidad aún más preferida de la presente invención, la variante de una secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos, preferentemente además de la homología de la secuencia que se menciona arriba, tiene sustancialmente la misma actividad enzimática de la molécula tipo silvestre y/o la molécula original. Por ejemplo, una variante de una proteasa polipeptídica enzimáticamente activa tiene la misma o sustancialmente la misma actividad proteolítica que la enzima polipeptídica, i.e., la capacidad de catalizar la hidrólisis de un enlace peptídico. En una modalidad particular, la expresión "sustancialmente la misma actividad enzimática" significa una actividad, con respecto a los sustratos del polipéptido tipo silvestre, que claramente se encuentra por arriba de la actividad de fondo y/o difiere de los valores ¾ y/o kcat por menos de 3, más preferentemente 2, aún más preferentemente un orden de magnitud, que exhibe el polipéptido tipo silvestre con respecto a los mismos sustratos. En una modalidad más preferida, la expresión "variante" de una secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos incluye al menos una parte activa y/o fragmento de la secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos. En una modalidad más preferida, la expresión "parte activa", como se utiliza en la presente, significa una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácidos nucleicos que tiene menos de la longitud total de la secuencia de aminoácidos y/o codifica menos de la longitud total de la secuencia de aminoácidos, en donde la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada con una longitud más corta que la secuencia de aminoácidos tipo silvestre tiene sustancialmente la misma actividad enzimática que el polipéptido tipo silvestre o una variante del mismo, por ejemplo, como importador de ácidos grasos, como enoil-CoA-hidratasa o FadE, o como acetil-CoA-aciltransferasa o FadB. En una modalidad particular, la expresión "variante" de un ácido nucleico comprende un ácido nucleico, la hebra complementaria con la cual, preferentemente bajo condiciones rigurosas, se une al ácido nucleico tipo silvestre. La rigurosidad de la reacción de hibridación es fácilmente determinable por los expertos en la téenica y depende en general de la longitud de la sonda, las temperaturas de lavado y la concentración de sal. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más altas para la hibridación, mientras que las sondas más cortas funcionan a temperaturas más bajas. Si la hibridación tiene lugar depende en general de la capacidad del ADN desnaturalizado para formar hibridarse a las hebras complementarias que se encuentran presentes en su ambiente y abajo de la temperatura de fusión. La rigurosidad de las reacciones de hibridación y las condiciones correspondientes se describen en más detalle en Ausubel efc al. (1995). Las instrucciones para identificar las secuencias de ADN por medio de hibridación pueden encontrarse por las personas expertas en la técnica entre otros en el manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" (Guía para los Usuarios del Sistema DIG (para la Hibridación en Filtro) de Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993) y en Liebl et al (International Journal of Systematic Bacteriology 41:255-260(1991). La hibridación tiene lugar en una modalidad preferida bajo condiciones rigurosas, i.e., únicamente se forman híbridos en los que la sonda y la secuencia objetivo, i.e., los polinucleótidos tratados con la sonda, son al menos 70% identicos. Se sabe que la rigurosidad de la hibridación que incluye las etapas de lavado es influenciada y/o determinada por la variación de la composición del amortiguador, la temperatura y la concentración de sal. La reacción de hibridación se lleva a cabo en general, con una rigurosidad relativamente menor, en comparación con las etapas de lavado (Hybaid Hybridisation Guide (Guía Hybaid de Hibridación), Hybaid Limited, Teddington, RU, 1996). Por ejemplo, para la reacción de hibridación puede utilizarse un amortiguador que corresponda a un amortiguador de 5 x SSC, a una temperatura de aproximadamente 50°C - 68°C. En relación a esto, las sondas también pueden hibridarse con polinucléotidos que tengan menos del 70% de identidad con la secuencia de la sonda. Tales híbridos son menos estables y se retiran por medio del lavado bajo condiciones rigurosas. Esto puede lograrse por ejemplo al reducir la concentración de sal a 2 x SSC y opcionalmente de manera subsecuente 0.5 x SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania, 1995), en cuyo caso se establece una temperatura, con un incremento en el orden de preferencia de aproximadamente 50°C - 68°C, aproximadamente de 52°C - 68°C, aproximadamente de 54°C - 68°C, aproximadamente de 56°C - 68°C, aproximadamente de 58°C -68°C, aproximadamente de 60°C - 68°C, aproximadamente de 62°C - 68°C, aproximadamente de 64°C - 68°C, aproximadamente de 66°C - 68°C. Se prefieren los rangos de temperatura de aproximadamente 64°C - 88°C o de aproximadamente de 66°C -68°C. Opcionalmente es posible reducir la concentración de sal a una concentración correspondiente a 0.2 x SSC o de 0.1 x SSC. Por medio de un incremento gradual en la temperatura de hibridación en etapas de aproximadamente 1 - 2°C de 50°C a 68°C, los fragmentos de polinucleótido pueden aislarse, los cuales tienen por ejemplo, en el orden de mayor preferencia, al menos el 70% o al menos el 80% o al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad con la secuencia de la molécula de ácido nucleico utilizada. Instrucciones adicionales relacionadas con la hibridación se encuentran comercialmente disponibles en la forma de los llamados equipos (e.gr., DIG Easy Hyb de Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Catálogo No.1603558). En una modalidad preferida, la expresión "variante" de un ácido nucleico, como se utiliza en la presente, comprende cualquier secuencia de ácidos nucleicos que codifica la misma secuencia de aminoácidos que el ácido nucleico original o una variante de esta secuencia de aminoácidos en el contexto de la degeneración del código genético.

Después de la segunda etapa, la solución orgánica hidrofóbica se separa del medio de cultivo acuoso. Debido a la capacidad inherente de este sistema para desarrollar dos fases, esto es una operación fácil de llevar a cabo por una persona experta en la téenica, que pueda proceder simplemente al permitir que el recipiente permanezca firme y posteriormente decantar una fase. Alternativamente, puede utilizarse un embudo de separación. Si los puntos de ebullición difieren suficientemente, existe la posibilidad, al aplicar presión reducida, de retirar la fase de ebullición más baja, que en general es la fase orgánica. Pueden retirarse pequeñas cantidades de agua que permanecen en la fase orgánica al utilizar desecantes inorgánicos tales como hidruro de calcio, cloruro de calcio anhidro, gel de sílice, sulfato de sodio anhidro, hidróxido de sodio o lo similar.

Las instrucciones adicionales para llevar a cabo la invención pueden encontrarse en PCT/EP2011/071491, en donde es necesario remplazar los ácidos grasos descritos por los que se mencionan de acuerdo con la invención.

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Un método para retirar un compuesto orgánico de una solución acuosa, que comprende las etapas de: proporcionar la solución acuosa que contiene el compuesto orgánico y una solución orgánica hidrofóbica, en donde esta última comprende un intercambiador de cationes hidrofóbico líquido, poner en contacto la solución acuosa y la solución orgánica hidrofóbica, y separar la solución orgánica hidrofóbica de la solución acuosa, en donde el intercambiador de cationes hidrofóbico líquido es un ácido alcanoico saturado que tiene al menos un sustituyente alquilo, que comprende preferentemente al menos 12 átomos de carbono, en donde el compuesto orgánico es un compuesto orgánico que tiene al menos una carga positiva y una carga total neutra o positiva.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto orgánico es un compuesto de la fórmula NR2R3H+-A-COOR1 (I) o NR2R3H+-A-NR4R5H+ (II), en donde R1 es hidrógeno, metilo, etilo, propilo, isopropilo o una carga negativa, en donde A es un grupo alquileno que tiene al menos tres, preferentemente al menos seis, particularmente de manera preferente ocho átomos de carbono, que es preferentemente no sustituido y de cadena recta, y en donde R2, R3, R4 y R5, en cada caso e independientemente de los otros, se seleccionan del grupo que consiste de hidrógeno, metilo, etilo y propilo.

3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde el pH en la solución acuosa en la etapa b) es de 6 a 8, de 6.2 a 7.2.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la proporción de la cantidad de sustancia del intercambiador de cationes líquido al compuesto orgánico en la etapa B) es de al menos 1.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la proporción volumétrica de la solución orgánica a la solución acuosa es de 1:10 a 10:1.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el intercambiador de cationes líquido es un ácido graso de cadena ramificada de la fórmula (H3C)2CH-(CH2)n-C00H o una forma no protonada de la misma y n es al menos 4, preferentemente al menos 8 y más preferentemente es 14.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el intercambiador de cationes líquido es un ácido graso de cadena ramificada que comprende exclusivamente sustituyentes distintos a los sustituyentes cíclicos.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la solución acuosa comprende adicionalmente una célula metabólicamente activa.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el compuesto orgánico es un compuesto que es tóxico para la célula, preferentemente una célula bacteriana.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la solución orgánica contiene adicionalmente al menos un solvente orgánico, preferentemente un ácido graso y/o un éster de ácidos grasos.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la solución orgánica hidrofóbica contiene el intercambiador de cationes hidrofóbico líquido en una fracción volumétrica del 20 al 80%, preferentemente del 25 al 75%.

12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el compuesto orgánico es una diamina del grupo que consiste de 1,4-butanodiamina, 1,5-pentanodiamina, 1,6-hexanodiamina, 1,8-octanodiamina, 1,14-tetradecanodiamina, 1,18-octadecanodiamina, 2-metil-1,5-diaminopentano, 2,2-dimetil-l,5-diaminopentano, 4,4'-diaminodiciclohexilometano, 3,3'-dimetil-4,4'-diaminodiciclohexilometano, 3,3',5,5'-tetrametil-4,4'- diaminodiciclohexilometano, m- o p-xililenodiamina, 2,2,4- o 2,4,4- trimetilhexametilendiamina, 1,4-diaminociclohexano, 4,4'-diaminodiciclohexilpropano, isoforondiamina, meta-xililenodiamina y para-xililenodiamina.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la temperatura en la etapa b) es de entre 28 y 70°C, preferentemente de entre 30 y 37°C.

14. La mezcla de reacción comprende una solución acuosa que contiene un compuesto orgánico y una solución orgánica hidrofóbica, en donde la solución orgánica hidrofóbica comprende un intercambiador de cationes hidrofóbico líquido, en donde el intercambiador de cationes hidrofóbico líquido es un ácido alcanoico saturado que tiene al menos un sustituyente alquilo, que comprende preferentemente al menos 12 átomos de carbono, y en donde el compuesto orgánico es un compuesto orgánico que tiene al menos una carga positiva y una carga total neutra o positiva.

15. La mezcla de reacción de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el compuesto orgánico es un compuesto de la fórmula NR2R3H+-A- COOR1 ( I ) O NR2R3H+-A-NR4R5H+ (II) , en donde R1 es hidrógeno, metilo, etilo, propilo, isopropilo o una carga negativa, en donde A es un grupo alquileno que tiene al menos tres, preferentemente al menos seis, particularmente de manera preferente ocho átomos de carbono que es preferentemente no sustituido y de cadena recta, y en donde R2, R3, R4 y R5, en cada caso e independientemente uno de otro, se seleccionan del grupo que consiste de metilo, etilo, propilo y butilo.

16. La mezcla de reacción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 15, en donde el intercambiador de cationes hidrofóbico líquido es un ácido graso de cadena ramificada de la fórmula (H3C)2CH-(CH2)n-COOH o una forma no protonada de la misma y n es al menos 4, preferentemente al menos 8 y más preferentemente 14.

17. La mezcla de reacción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en donde el intercambiador de cationes líquido es un ácido graso de cadena ramificada que comprende exclusivamente sustituyentes distintos a los sustituyentes cíclicos.

18. La mezcla de reacción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en donde la solución acuosa comprende adicionalmente una célula metabólicamente activa.

19. La mezcla de reacción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en donde el compuesto orgánico es una diamina del grupo que consiste de 1,4- butanodiamina, 1,5-pentanodiamina, 1,6-hexanodiamina, 1,8- octanodiamina, 1,14-tetradecanodiamina, 1,18- octadecanodiamina, 2-metil-l,5-diaminopentano, 2,2-dimetil- 1,5-diaminopentano, 4,4'-diaminodiciclohexilometano, 3,3'- 5 dimetil-4,4'-diaminodiciclohexilometano, 3,3',5,5'- tetrametil-4,4'-diaminodiciclohexilometano, m- o p- xililenodiamina, 2,2,4- o 2,4,4- trimetilhexametilendiamina, 1,4-diaminociclohexano, 4,4'-diaminodiciclohexilopropano, isoforonodiamina, meta-xililenodiamina y para lo xililenodiamina.