MX2014011620A

MX2014011620A - Moleculas de acido nucleico artificiales.

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Publication number: MX2014011620A
Application number: MX2014011620A
Authority: MX
Inventors: Andreas Thess; Karl-Josef Kallen
Original assignee: Curevac Gmbh
Priority date: 2012-03-27
Filing date: 2013-03-27
Publication date: 2014-10-17
Also published as: CA2866955A1; WO2013143698A1; MX357803B; JP6298039B2; AU2013242403A1; KR102186497B1; SG10201607962RA; SG11201405542UA; EP2831239B1; AU2013242403B2; RU2651498C2; ES2660459T3; JP2015513897A; US20150184195A1; EP2831239A1; KR20140137455A; BR112014023800A2; US9890391B2; RU2014142994A; CN104220599A

Abstract

La invención se refiere a una molécula de ácido nucleico artificial que comprende por lo menos un marco de lectura abierto y por lo menos un elemento 3´UTR que comprende una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3´UTR de un gen de albúmina o de una variante de la 3´UTR de un gen de albúmina. La invención se refiere adicionalmente al uso de tal molécula de ácido nucleico artificial en la terapia génica y/o vacunación genética. Adicionalmente, la invención se refiere al uso de un elemento 3´UTR que comprende una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3´UTR de un gen de albúmina o de una variante de la 3´UTR de un gen de albúmina para la estabilización y/o prolongación de la expresión de proteínas de una secuencia de ácido nucleico que comprende tal elemento 3´UTR.

Description

MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO ARTIFICIALES CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a moléculas de ácido nucleico artificiales que comprenden un marco de lectura abierto y opcionalmente una secuencia poli (A) y/o una señal de poliadenilación . La invención se refiere adicionalmente a un vector que comprende un elemento 3'UTR a una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico artificial o el vector, y a un kit que comprende la molécula de ácido nucleico artificial, el vector y/o la composición farmacéutica, que comprende una molécula de ácido nucleico artificial, de manera preferente para uso en el campo de la terapia génica y/o vacunación genética.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La terapia génica y la vacunación genética pertenecen a los métodos más prometedores y de rápido desarrollo de la medicina moderna. Pueden proporcionar opciones sumamente especificas e individuales para la terapia de una gran variedad de enfermedades. Particularmente, las enfermedades genéticas heredadas pero también las enfermedades autoinmunitarias , enfermedades cancerosas o relacionadas con tumor, asi como enfermedades inflamatorias pueden ser el objetivo de tales procedimientos de tratamiento. También, se prevé evitar el inicio (temprano de tales enfermedades por estos procedimientos.

La razón fundamental principal conceptual detrás de la terapia génica es la modulación apropiada de la expresión génica deteriorada asociada con condiciones patológicas de enfermedades especificas. La expresión génica patológicamente alterada puede dar por resultado falta o sobreproducción de productos génicos esenciales, por ejemplo, factores de señalización tales como hormonas, factores de mantenimiento, enzimas metabólicas, proteínas estructurales o similares. La expresión génica alterada puede no solo no ser debido a la regulación defectuosa o transcripción y/o traducción, sino también debido a las mutaciones dentro de ORF que codifica una proteína particular. Las mutaciones patológicas pueden ser provocadas por ejemplo aberración cromosómica, o por más mutaciones específicas, tales como mutaciones puntuales o de desplazamiento de marco, todas ellas dando por resultado una funcionalidad limitada y, potencialmente, pérdida total de función del producto génico. Sin embargo, la regulación defectuosa de la transcripción o traducción también puede presentarse, si las mutaciones afectan los genes que codifican las proteínas que se implican en la maquinaria de transcripción o traduccional de la célula. Tales mutaciones pueden conducir a la regulación por incremento o decremento patológica de los genes que son - tales como - funcionales. Los genes que codifican los productos génicos que ejercen tale funciones reguladoras, pueden ser, por ejemplo, factores de transcripción, receptores de señal, proteínas mensajeras y similares. Sin embargo, la pérdida de función de tales genes que codifican las proteínas reguladoras puede, bajo ciertas circunstancias, ser revertidas por la introducción artificial de otros factores que actúan adicionalmente cadena abajo del producto génico deteriorado. Tales defectos génicos también se pueden compensar con la terapia génica a través de la sustitución del gen afectado solo.

La vacunación genética permite provocar una respuesta inmunitaria deseada a antígenos seleccionados, tales como componentes característicos de superficies bacterianas, partículas virales, antígenos tumorales o similares. En general, la vacunación es uno de los logros fundamentales de la medicina moderna. Sin embargo, las vacunas efectivas son actualmente disponibles solo para una pequeña variedad de enfermedades. Por consiguiente, las infecciones que no se pueden prevenir por la vacunación aún afectan millones de personas cada año.

Comúnmente, las vacunas se pueden subdividir en vacunas de "primera", "segunda" y "tercera" generación. Las vacunas de "Primera generación" son, típicamente, vacunas de organismo entero. Se basan en ya sea patógenos vivos y atenuados o exterminados, por ejemplo, virus, bacterias y similares. La desventaja principal de las vacunas vivas y atenuadas es el riesgo de reversión a las variantes que ponen en peligro la vida. De esta manera, aunque están atenuados, tales patógenos aún pueden llevar intrínsecamente riesgos no predecibles. Los patógenos exterminados pueden no ser tan eficaces como se desee para la generación de una respuesta inmunitaria específica. A fin de minimizar estos riesgos, se desarrollaron vacunas de "segunda generación". Estas son, típicamente, vacunas de subunidad, que consisten de antígenos definidos o componentes de proteína recombinantes que se derivan de patógenos.

Las vacunas genéticas, es decir, vacunas para la vacunación genética, son usualmente entendidas como vacunas de "tercera generación". Se componente típicamente de moléculas de ácido nucleico genéticamente diseñadas que permiten la expresión de fragmentos de péptido o proteína (antígeno) característicos de un patógeno o un antígeno tumoral in vivo. Las vacunas genéticas se expresan en la administración a un paciente y captación por las células competentes. La expresión de los ácidos nucleicos administrados da por resultado la producción de proteínas codificadas. En caso de que estas proteínas sean reconocidas como extrañas por el sistema inmunitario del paciente, se desencadena una respuesta inmunitaria.

Como se puede observar a partir de lo anterior, ambos métodos, terapia génica y vacunación genética, se basan esencialmente en la administración de moléculas de ácido nucleico a un paciente y la transcripción y/o traducción subsecuente de la información genética codificada. Alternativamente, la vacunación genética o terapia génica también pueden comprender métodos que incluyen aislamiento de células corporales específicas de un paciente a ser tratado, transfección in vitro subsecuente de tales células, y readministración de las células tratadas al paciente.

El ADN así como ARN se pueden utilizar como moléculas de ácido nucleico para administración en el contexto de la terapia génica o vacunación genética. El ADN se sabe que es relativamente estable y fácil de manejar. Sin embargo, el uso de ADN lleva el riesgo de inserción indeseada de fragmentos de ADN administrados en el genoma del paciente dando por resultado potencialmente pérdida de función de los genes deteriorados. Como un riesgo adicional, ha surgido la generación indeseada de anticuerpos anti-ADN. Otra desventaja es el nivel de expresión limitado del péptido o proteína codificada es lograble en la administración de ADN y su transcripción/traducción. Entre otras razones, el nivel de expresión del ADN administrado será dependiente de la presencia de factores de transcripción específicos que regulan la transcripción de ADN. En ausencia de tales factores, la transcripción de ADN no producirá cantidades satisfactorias de ARN . Como resultado, se limita el nivel de péptido o proteína traducida obtenida.

Al utilizar el ARN en lugar de ADN para la terapia génica o vacunación genética, el riesgo de integración y generación genómica indeseada de anticuerpos anti-ADN se minimiza o se evita. Sin embargo, el ADN se considera que es una especie molecular más bien inestable que se puede degradar fácilmente por ARNs ubicuos.

In vivo, la degradación de ARN contribuye a la regulación del tiempo de vida media de la ARN. Ese efecto se consideró y se probó para afinar la regulación de la expresión génica eucariótica (Friedel y colaboradores, Conserved principies of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life, Nucleic Acid Research, 2009, 1-12). Por consiguiente, cada ARNm de origen natural tiene s vida media individual dependiendo del gen del cual se deriva el ARNm. Contribuye a la regulación del nivel de expresión de este gen. Los ARNs inestables son importantes para llevar a cabo la expresión génica transitoria en distintos puntos en el tiempo. Sin embargo, los ARNs de larga vida se pueden asociar con la acumulación de distintas proteínas o expresión continua de genes. In vivo, la vida media de los ARNms también es dependiente en factores ambientales, tales como tratamiento hormonal, como se ha observado, por ejemplo, para el factor I de crecimiento similar a insulina, actina, y ARNm de albúmina (Johnson y colaboradores, Newly synthesized RNA: Simultaneous measurement in intact cells of transcription rates and RNA stability of insulin-like growth factor I, actin, and albumin in growth hormone-stimulated hepatocytes, Proc. Nati. Acad. Sci., Vol . 88, páginas 5287-5291, 1991).

Para la terapia génica y la vacunación genética, se desea un ARN usualmente estable. Es decir, por una parte, debido al hecho que el producto codificado por la secuencia de ARN se acumulará in vivo. Por otra parte, el ARN tiene que mantener su integridad estructural y funcional cuando se prepara para una forma de dosificación adecuada, en el curso de su almacenamiento, y cuando se administra. De esta manera, se dedicó una atención considerable para proporcionar moléculas de ARN estables para la terapia génica o vacunación genética a fin prevenirlas de ser sujetas a la degradación o descomposición temprana.

Se ha reportado que el contenido de G/C de las moléculas de ácido nucleico puede influir en su estabilidad. De esta manera, los ácidos nucleicos que comprenden una cantidad incrementada de residuos de guanina (G) y/o citosina (C) pueden ser funcionalmente más estables que los ácidos nucleicos que contienen una gran cantidad de adenina (A) y timina (T) o nucleótidos de uracilo (U) . En este contexto, la WO02/098443 proporciona una composición farmacéutica que contiene un ARNm que se estabiliza por modificaciones de secuencia en la región traducida. Tal modificación de secuencia, toma ventaja de la degeneración del código genético. Por consiguiente, los codones que contienen una combinación menos favorable de nucleótidos (menos favorable en términos de estabilidad de ARN) se puede sustituir por codones alternativos sin alterar la secuencia de aminoácidos codificada. Este método de estabilización de ARN se limita por las provisiones de la secuencia de nucleótidos especifica de cada molécula de ARN individual que no se le permite dejar el espacio de la secuencia de aminoácidos deseada. También, ese procedimiento se restringe a las regiones de codificación del ARN.

Como una opción alternativa para la estabilización del ARN, se ha descubierto que las moléculas de ARN eucarióticas de origen natural contienen elementos de estabilización característicos. Por ejemplo, pueden comprender las así llamadas regiones no traducidas (UTR) en su extremo 5' (5'UTR) y/o en su extremo 3' (3'UTR) así como otras características estructurales, tal como una estructura de etapa 5' o una cola 3' -poli (A) . Ambas, 5'UTR y 3'UTR se transcriben típicamente del ADN genómico y son, de esta manera, un elemento de ARN prematuro. Los aspectos estructurales característicos del ARNm maduro, tal como la tapa 5' y la cola 3' -poli (A) (también llamada cola poli (A) o secuencia poli (A) ) se agregan usualmente al ARNm transcrito (prematuro) durante el procesamiento del ARNm.

Una cola 3 '-poli (A) es típicamente un estiramiento de secuencia monótono de nucleótidos de adenina agregados al extremo 3' del ARNm transcripto. Puede comprender hasta aproximadamente 400 nucleótidos de adenina. Se descubrió que la longitud de tal cola 3 '-poli (A) es un elemento potencialmente crítico para la estabilidad del ARNm individual .

También, se muestra que la 3'UTR de ARNm de a-globina puede ser un factor importante para la estabilidad bien conocida de un ARNm de -globina (Rodgers y colaboradores, Regulated a-globina mRNA decay is a cytoplasmic event proceeding through 3'-to-5' exosome-dependent decapping, RNA, 8, páginas 1526-1537, 2002). La 3'UTR de una ARNm de ot-globina se implica obviamente en la formación de un complejo de ribonucleoproteína específico, el a-complejo, cuya presencia se correlaciona con estabilidad del ARNm in vitro ( ang y colaboradores, An mRNA stability complex functions with poli (A) -binding protein to stabilize mRNA in vitro, Molecular and Cellular biology, Vol 19, No. 7, Julio de 1999, páginas 4552-4560) .

Independientemente de los factores que afectan la estabilidad del ARNm, la traducción eficaz de las moléculas de ácido nucleico administradas por las células objetivo o tejido es crucial para cualquier procedimiento utilizando moléculas de ácido nucleico para la terapia génica o vacunación genética. Junto con la regulación de la estabilidad, también la traducción de la mayoría de ARNms se regula por las características estructurales similares a UTRs, tapa 5' y cola 3' -poli (A). En este contexto, se ha reportado que la longitud de la cola poli (A) puede desempeñar una función importante para la eficiencia traduccional también. La estabilización de elementos 3', sin embargo, también puede tener un efecto de atenuación en la traducción.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Es el objetivo de la invención proporcionar moléculas de ácido nucleico que pueden ser adecuadas para aplicación en la terapia génica y/o vacunación genética. Particularmente, es el objetivo de la invención proporcionar moléculas de ácido nucleico artificiales, tales como una especie de ARNm que se estabiliza contra la degradación o deterioro predeterminado sin mostrar una pérdida funcional significativa en la eficiencia traduccional incrementada. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar moléculas de ácido nucleico que codifican tal especie de ARN superior que puede ser apta para el uso en la terapia génica y/o vacunación genética. Es un objetivo adicional de la presente invención proporcionar una composición farmacéutica para el uso en la terapia génica y/o vacunación genética. En resumen, es el objetivo de la presente invención proporcionar especies de ácido nucleico mejoradas que superen las desventajas planteadas en lo anterior de la técnica previa por un procedimiento rentable y sencillo.

El objetivo subyacente de la presente invención se resuelve por el contenido reivindicado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las siguientes Figuras se proponen para ilustrar la invención adicionalmente .

La Figura 1 muestra el efecto de la 3'UTR a-globina humana, de la 3'UTR de albúmina humana y de la 3'UTR ß-glucuronidasa humana en la expresión de luciferasa del ARNm artificial. En la presente, el ARNm que comprende la 3'UTR de albúmina humana es un ARNm de acuerdo con la presente invención. Comprende un marco de lectura abierto que codifica la Luciferasa de Photinus pyralis, seguido en la dirección 5' a 3' por un elemento 3'UTR acuerdo con SEQ ID No. 2 y por una secuencia poli (A) que tiene una longitud de 64 adeninas. Se puede observar una expresión de proteina notablemente prolongada del ARNm artificial que contiene la 3'UTR de albúmina humana que corresponde a SEQ ID No. 2.

El efecto de la 3'-UTR de a-globina humana, de la 3'-UTR de albúmina humana, o de la 3'-UTR de ß-glucuronidasa humana en la expresión de luciferasa del ARNm se examinó, comparado con la expresión de Luciferasa del ARNm que carece de una 3'-UTR. Por lo tanto, se electroporaron diferentes ARNms en células HeLa. Los niveles de Luciferasa se midieron a 6, 24, y 48 horas después de la transfección. El nivel de luciferasa del ARNm carece de una 3'-UTR descendió de 6 horas a 48 horas, 10% de la señal de 6 horas restantes a 48 horas. La 3'-UTR de a-globina estabiliza la expresión de luciferasa del ARNm moderadamente. Sorprendentemente, sin embargo la 3'-UTR de albúmina humana inventiva se extiende notablemente de manera adicional. La expresión de Luciferasa del ARNm. En contraste, la 3'-UTR del ARNm de ß-glucuronidasa estable no prolonga la expresión de Luciferasa al grado observado para la 3'-UTR de albúmina, confirmando que la 3'-UTR de albúmina es particularmente eficiente en prolongar la expresión de proteínas de ARNm. Los datos se grafican como RLU ± SD media (unidades de luz relativas ± desviación estándar) para las transíecciones en triplicado. La RLU se resume en el Ejemplo 5.1.

La Figura 2 muestra el efecto de la 3'-UTR de albúmina humana en la expresión de luciferasa del ARNm comparado con la expresión de luciferasa del ARNm que contiene la 3'-UTR de -globina humana o la 3'-UTR de cada uno de varios ARNms estables diferentes. Por lo tanto, los ARNms diferentes se electroporaron en células HeLa. Los niveles de luciferasa se midieron a 6, 24, y 48 horas después de la transfección . El nivel de luciferasa de la ARNm que carece de una 3'-UTR desciende de 6 horas a 48 horas, 14% de la seña de 6 horas restante en 48 horas. La 3'-UTR de a-globina estabiliza la expresión de luciferasa del mRNA moderadamente. Sorprendentemente sin embargo, la 3'-UTR de albúmina humana inventiva prolonga notablemente además la expresión de luciferasa del ARNm. Comparadas con la 3'-UTR de albúmina, las 3' -UTRs de diferentes ARNms estables afectan la expresión de luciferasa del ARNm en una manera mucho menos favorable: Las 3' -UTRs atp5o y atp51 estabilizan la expresión de luciferasa mucho menor que la 3'-UTR de albúmina. Además, las 3' -UTRs atp5o y atp51 reducen los niveles de luciferasa comparados sustancialmente con la 3'-UTR de albúmina. La 3'-UTR del ARNm de ndufal estable estabiliza la expresión de luciferasa notablemente. Sin embargo, la 3'-UTR ndufal también reduce los niveles de luciferasa sustancialmente. La 3'-UTR de albúmina es única en la prolongación de la expresión de proteina mientras que mantiene la expresión de proteina total. Los datos se grafican como RLU ± SD media (unidades de luz relativa ± desviación estándar) para transíecciones en triplicado. La RLU se resume en el Ejemplo 5.2.

La Figura 3 muestra el efecto de las mutaciones puntuales para remover ya sea un sitio de restricción HindIII y/o Xbal y/o una señal de terminación T7 de la 3'-UTR de albúmina humana en la expresión de luciferasa del ARNm que contiene la 3'-UTR albúmina humana. Por lo tanto, los diferentes ARNms se electroporaron en células HeLa. Los niveles de luciferasa se midieron a 6, 24, 48, y 72 horas después de la transíección . La señal PpLuc se corrigió para la eficiencia de transfección por la señal de la RrLuc co-transíectada . La 3'-UTR de -globina estabiliza la expresión de luciferasa del ARNm solo muy moderadamente. En contraste, todas las variantes de la 3'-UTR de albúmina prolongaron notablemente la expresión de luciferasa del ARNm. Los datos se grafican como RLU ± SD media (unidades de luz relativas ± desviación estándar) para las transfecciones en triplicado. La RLU se resume en el Ejemplo 5.4.

La Figura 4 muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) -A64 que carece de una 3'-UTR. La Figura 5 muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) - albúmina - A64. La 3'-UTR de la albúmina humana se insertó entre el ORF y poli (A) . La secuencia se tomó de Dugaiczyk y colaboradores 1982; Proc Nati Acad Sci U S A. Jan; 79 ( 1) : 71-5.

La Figura 6 muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) -albúmina 2 - A64. La 3'-UTR de la albúmina humana, con la señal de terminación T7 removida por una mutación puntual individual, se insertó entre el ORF y poli (A) .

La Figura 7 muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) -albúmina 3 - A64. La 3'-UTR de la albúmina humana, con la señal de terminación T7 removida por una mutación puntual individual, se insertó entre el ORF y poli (A) .

La Figura 8 muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) -albúmina 4 - A64. La 3'-UTR de la albúmina humana, con la señal de terminación T7 removida por una mutación puntual individual, se insertó entre el ORF y poli (A).

La Figura 9 muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) -albúmina 5 - A64. La 3'-UTR de la albúmina humana, con la señal de terminación T7 removida por dos mutaciones puntuales consecutivas, se insertó entre el ORF y poli (A) .

La Figura 10 muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) -albúmina 6 - A64. La 3' -UTR de la albúmina humana, con los sitios de restricción HindIII y Xbal removidos por dos mutaciones puntuales individuales, se insertó entre el ORF y poli (A) .

La Figura 11 muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) -albúmina 7 - A64. La 3 ' -UTR de la albúmina humana, con la señal de terminación T7 asi como los sitios de restricción HindIII y Xbal removidos por tres mutaciones puntuales individuales, se insertó entre el ORF y poli (A) .

La Figura 12 muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) -ag - A64. La porción de ligación a a-complejo, central de la 3' -UTR de la a-globina humana se insertó entre el ORF y poli (A) .

La Figura 13 muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) -gusb - A64. La 3' -UTR de la ß-glucuronidasa humana se insertó entre el ORF y poli (A) .

La Figura 14 muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) -atp5o - A64. La 3' -UTR de la subunidad o de ATP sintasa humana se insertó entre ORF y poli (A) .

La Figura 15 muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) -ndufal - A64. La 3' -UTR de la subunidad 1 subcompleja a de NADH deshidrogenasa [ubiquinona] 1 humana se insertó entre el ORF y poli (A) .

La Figura 16 muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) -atp51 - A64. La 3'-UTR de la subunidad g de ATP sintasa humana se insertó entre el ORF y poli (A) .

La Figura 17 ilustra e emplarmente el efecto de estabilización de producción de proteínas y/o la prolongación de producción de proteínas del elemento 3'UTR de acuerdo con la presente invención. Las curvas representan la cantidad de proteína producida de las moléculas de ácido nucleico, por ejemplo en células de mamífero, medidas a través del tiempo. La línea continua representa la producción de proteínas de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, por ejemplo una ARNm artificial, la línea punteada representa la producción de proteínas de una molécula de ácido nucleico de referencia, por ejemplo que carece de una 3'UTR o que comprende una 3'UTR de referencia tal como una 3'UTR de origen natural con el ORF que codifica la proteína reportero. La línea gruesa horizontal continua representa un valor de umbral. Esto puede ser, por ejemplo, la cantidad de proteína medida 1, 2, 3, 4, 5, o 6 horas post-inicio de la expresión, tal como post-transfección de la molécula de ácido nucleico. Se puede observar que la cantidad de proteína producida de una molécula de ácido nucleico de referencia reduce el valor de umbral en aproximadamente 32 horas post-inicio de la expresión, tal como post- transfección, mientras que la cantidad de proteina producida de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención reduce el valor de umbral a aproximadamente 68 horas post-inicio de la expresión, tal como post-transfección . La cantidad total de proteina producida iguala el área bajo la curva (AUC) . De manera preferente, la cantidad total de proteina producida de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención es por lo menos la cantidad total de la proteina producida de una molécula de ácido nucleico de referencia que carece de una 3'UTR.

La Figura 18 muestra el efecto de diferentes 3'-UTRs de albúmina de primates en la expresión de luciferasa de un ARNm artificial, comparada con la expresión de luciferasa de un ARNm que carece de una 3'-UTR. En la presente, el ARNm que comprende la 3'UTR de albúmina humana (albúmina) y el ARNm que comprende la 3'UTR de albúmina de Olive baboon (albúmina 8) son ARNms de acuerdo con la presente invención. Comprenden un marco de lectura abierto que codifica la Luciferasa de Photinus pyralis, seguido en la dirección 5' a 3' por un elemento 3'UTR de acuerdo con SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 33 y por una secuencia poli (A) que tiene una longitud de 64 adeninas. Una expresión de proteina notablemente prolongada de los ARNms artificiales que contienen las 3'UTRs de albúmina que corresponden a SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 33 es observable .

El efecto de la 3'-UTR de albúmina humana y la 3'UTR de albúmina de Olive baboon en la expresión de luciferasa en el ARNm se examinó, comparado con la expresión de Luciferasa del ARNm que carece de una 3'-UTR. Para examinar la expresión de luciferasa, los diferentes ARNms se electroporaron en fibroblastos dérmicos humanos (HDF) . Los niveles de luciferasa se midieron a 6, 24, 48, y 72 horas después de la transíección . El nivel de luciferasa de ARNm que carece de una 3' -UTR desciende de 6 horas a 72 horas, 5% de la señal de 6 horas que restan en 72 horas. Otra vez, la 3' -UTR de albúmina humana inventiva prolonga notablemente la expresión de luciferasa de ARNm. La 3' -UTR de albúmina de Olive baboon (albúmina 8) prolonga la expresión de luciferasa del ARNm al mismo grado como la secuencia de 3'UTR de albúmina humana. Las 3'-UTRs de albúmina de los primates son de esta manera particularmente adecuadas para prolongar la expresión de proteina del ARNm. Los datos se grafican como RLU ± SD media (unidades de luz relativa ± desviación estándar) para transíecciones en triplicado. La RLU se resume en el Ejemplo 5.4, tabla 7.

La Figura 19 muestra el efecto de diferentes 3'-UTRs de albúmina de primates en la expresión de luciferasa del ARNm, comparado con la expresión de luciferasa del ARNm que carece de una 3' -UTR, utilizando un método de transfección diferente. Por lo tanto, diferentes ARNms se lipofectaron en fibroblastos dérmicos humanos (HDF) . Los niveles de Luciferasa se midieron a 6, 24, 48, y 72 horas después de la transfección. El nivel de luciferasa de ARNm que carece de una 3' -UTR desciende de 6 horas a 48 horas a 82% de la señal de 6 horas. Nuevamente, la 3' -UTR de albúmina humana prolonga notablemente la expresión de luciferasa del ARNm, la señal de 48 horas que es más alta que la señal de 6 horas. La 3' -UTR de albúmina de Olive baboon (albúmina 8) prolonga la expresión de luciferasa de ARNm a un grado similar como la secuencia de 3' UTR de albúmina humana. Las 3'-UTRs de albúmina de primate de esta manera son particularmente adecuadas para prolongar la expresión de proteínas del ARNm. Los datos se grafican como RLU ± SD media (unidades de luz relativa ± desviación estándar) para transfecciones en triplicado. La RLU se resume en el Ejemplo 5.4, tabla 9.

La Figura 20 muestra el efecto de diferentes 3'-UTRs de albúmina de primates en la expresión de luciferasa del ARNm en células de ratón, comparada con la expresión de luciferasa de ARNm que carece de una 3' -UTR. Por lo tanto, diferentes ARNms se lipofectaron en células L-929, una línea de células de fibroblasto de murino. Los niveles de luciferasa se midieron a 6, 24, 48, y 72 horas después de la transfeccion. El nivel de luciferasa de ARNm que carece de una 3'-UTR desciende de 6 horas a 48 horas, 23% de la señal de 6 horas que permanece a 48 horas. Aún en las células de murino la 3'-UTR de albúmina humana prolongó notablemente la expresión de luciferasa de ARNm. La 3' -UTR de albúmina de Olive baboon (albúmina 8) prolonga la expresión de luciferasa del ARNm similarmente . Las 3'-UTRs de albúmina de primates de esta manera son particularmente adecuadas para prolongar la expresión de proteina del ARNm en los tipos de células de mamífero. Los datos se grafican como RLU ± SD media (unidades de luz relativas ± desviación estándar) para transfecciones en triplicado. La RLU se resume en los Ejemplo 5.5, tabla 11.

La Figura 21 muestra el efecto de diferentes 3'-UTRs de albúmina de mamífero en la expresión de luciferasa del ARNm, comparado con la expresión de luciferasa del ARNm que carece de una 3' -UTR. Por lo tanto, diferentes ARNms se transfectaron en células HeLa. Los niveles de luciferasa se midieron a 6, 24, 48, y 72 horas después de la transfeccion. El nivel de luciferasa del ARNm que carece de una 3' -UTR desciende de 6 horas a 48 horas, 49% de la señal de 6 horas que permanece a 48 horas. Nuevamente, la 3' -UTR de albúmina humana y la 3' -UTR de albúmina de Olive baboon (albúmina 8) prolongó notablemente la expresión de luciferasa del ARNm, la señal de 48 horas que es más alta que la señal de 6 horas. De manera importante, también la 3'-UTR de albúmina de ratón (albúmina 9) prolonga la expresión de luciferasa de ARNm similarmente . Las 3'-UTRs de albúmina de mamífero son de esta manera particularmente adecuadas para prolongar la expresión de proteína de ARNm. Los datos se grafican como RLU ± SD media (unidades de luz relativa ± desviación estándar) para las transíecciones en triplicado. La RLU se resume en los Ejemplo 5.6, tabla 13.

La Figura 22 muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) -albúmina 8 - A64. La 3'-UTR de albúmina de Olive baboon se insertó entre el ORF y poli (A) . La secuencia se tomó de la Secuencia de Referencia NCBI XM_003898783.1.

La Figura 23 muestra la secuencia de ARNm de PpLuc(GC) -albúmina 9 - A64. La 3'-UTR de albúmina de ratón se insertó entre el ORF y poli (A) . La secuencia se tomó de la Secuencia de Referencia NCBI NM_009654.3.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En aras de claridad y legibilidad se proporcionan las siguientes definiciones. Cualquier característica técnica mencionada para estas definiciones se puede leer en cada una y cada modalidad de la invención. Las definiciones y explicaciones adicionales se pueden proporcionar específicamente en el contexto de estas modalidades.

Respuesta inmunitaria adaptativa: La respuesta inmunitaria adaptativa se entiende típicamente que es una respuesta específica de antlgeno del sistema inmunitario. La especificidad de antlgeno permite la generación de respuestas que se adaptan a patógenos específicos o células infectadas con patógenos. La capacidad de totalizar estas respuestas adaptadas se mantiene usualmente en el cuerpo por las "células de memoria". Un patógeno debe infectar el cuerpo más de una vez, estas células de memoria específicas se utilizan para eliminarlo rápidamente. En este contexto, la primera etapa de una respuesta inmunitaria adaptativa es la activación de células T específicas de antígeno sin tratamiento o células inmunitarias diferentes capaces de inducir una respuesta inmunitaria específica de antígeno por las células que presentan antígeno. Esta se presenta en los tejidos linfáticos y órganos a través de los cuales las células T sin tratamiento están constantemente pasando. Estos tres tipos de células que pueden servir como células que presentan antígeno son células dendríticas, macrófagos, y células B. Cada una de estas células tiene una función distinta en inducir repuestas inmunitarias. Las células dendríticas pueden captar antígenos por fagocitos y macropinocitosis y se pueden estimular por el contacto con por ejemplo un antigeno extraño para migrar al tejido linfático local, donde se diferencia en células dendriticas maduras. Los macrófagos ingieren antigenos particulados tales como bacterias y se inducen por agentes infecciosos u otros estímulos apropiados para expresar moléculas de MHC. La capacidad única de las células B para ligarse e internalizarse en antígenos de proteína solubles a través de estos receptores también puede ser importante para inducir células T. Las moléculas de MHC son, típicamente, responsables por la presentación de un antígeno a las células T. En la misma, la presentación del antígeno en las moléculas MHC conduce la activación de las células T que induce su proliferación y diferenciación en células T efectoras armadas. La función más importante de las células T efectoras es el exterminio de células infectadas por células T citotóxicas CD8+ y la activación de macrófagos por las células T Thl que juntas constituyen la inmunidad mediada por célula, y la activación de células B por célula tanto Th2 como Thl para producir diferentes clases de anticuerpos, conduciendo de esta manera la respuesta inmunitaria humoral. Las células T reconocen un antígeno por sus receptores de células T que no reconocen y ligan el antígeno directamente, sino un cambio reconocen fragmentos de péptido cortos por ejemplo de antígenos de proteína derivados de patógenos, por ejemplo los así llamados epítopos, que se ligan a las moléculas de MHC en las superficies de las otras células.

Sistema inmunitario adaptativo: El sistema inmunitario adaptativo se dedica esencialmente para eliminar o prevenir el crecimiento patogénico. Regula típicamente la respuesta inmunitaria adaptativa al proporcionar al sistema inmunitario vertebrado con la capacidad de reconocer y recordar patógenos específicos (para generar inmunidad) , y para montar ataques más potentes cada vez que el patógeno se encuentra. El sistema es sumamente adaptable debido a la hipermutación somática (un proceso de mutaciones somáticas aceleradas), y recombinación V(D)J (una recombinación genética irreversible de segmentos del gen de receptor de antígeno) . Este mecanismo permite un número pequeño de genes para generar un vasto número de receptores antígeno diferentes, que luego se expresan de manera única en cada linfocito individual. Debido a que el arreglo de genes conduce a un cambio irreversible en el ADN de cada célula, toda la progenie (descendencia) de tal célula entonces heredará los genes que codifican la misma especificidad de receptor, incluyendo las células B de memoria y las células T de memoria que son las claves para la inmunidad específica de larga vida.

Adyuvante/componente de adyuvante: Un adyuvante o un componente de adyuvante en el sentido más amplio es típicamente un agente farmacológico y/o inmunológico que puede modificar, por ejemplo mejorar, el efecto de otros agentes, tal como un fármaco o vacuna. Se va a interpretar en un sentido amplio y se refiere a un espectro amplio de sustancias. Típicamente, estas sustancias son capaces de incrementar la inmunogenicidad de los antígenos. Por ejemplo, los adyuvantes se pueden reconocer por los sistemas inmunitarios innatos y, por ejemplo, pueden inducir una respuesta inmunitaria innata. Los "adyuvantes" típicamente no inducen una respuesta inmunitaria adaptativa. De hecho, los "adyuvantes" no califican como antígenos. Su modo de acción es distinto de los efectos desencadenados por los antígenos que dan por resultado una respuesta inmunitaria adaptativa.

Antígeno : En el contexto de la presente invención "antígeno" se refiere típicamente a una sustancia que se puede reconocer por el sistema inmunitario, de manera preferente por el sistema inmunitario adaptativo, y es capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria específica de antígeno, por ejemplo por la formación de anticuerpos y/o células T específicas de antígeno como parte de una respuesta inmunitaria adaptativa. Típicamente, un antígeno puede ser o puede comprender un péptido o proteína que se puede presentar por las células MHC a T.

Molécula de ácido nucleico artificial: Una molécula de ácido nucleico artificial puede entender típicamente que es una molécula de ácido nucleico, por ejemplo un ADN o un ARN, que no se presenta naturalmente. En otras palabras, una molécula de ácido nucleico artificial se puede entender como una molécula de ácido nucleico no natural. Tal molécula de ácido nucleico puede ser no natural debido a su secuencia individual (que no se presenta naturalmente) y/o debido a otras modificaciones, por ejemplo modificaciones estructurales de nucleótidos que no se presentan naturalmente. Una molécula de ácido nucleico artificial puede ser una molécula de ADN, una molécula de ARN o una molécula híbrida que comprende porciones de ADN y ARN. Típicamente, las moléculas de ácido nucleico artificiales se pueden diseñar y/o generar por métodos de ingeniería genética que corresponden a una secuencia artificial deseada de nucleótidos (secuencia heteróloga) . En este contexto una secuencia artificial es usualmente una secuencia que no puede presentarse naturalmente, es decir, difiere de la secuencia de tipo natural por al menos un nucleótido. El término "tipo natural" se puede entender por una secuencia de origen que se presenta en naturaleza. Además, el término "molécula de ácido nucleico artificial" no se restringe al significado de "una sola molécula" pero, típicamente, se entiende que comprende un ensamblaje de moléculas idénticas. Por consiguiente, puede relacionarse con una pluralidad de moléculas idénticas contenidas en una alícuota.

ARN bicistrónico, ARN multicistrónico : Un ARN bicistrónico o multicistrónico es típicamente un ARN, de manera preferente un ARNm que puede tener típicamente dos (bicistrónico) o más (multicistrónico) marcos de lectura abiertos (ORF) . Un marco de lectura abierto en este contexto es una secuencia de codones que es traducible en un péptido o proteína .

Portador/portador polimérico: Un portador en el contexto de la invención puede ser típicamente un compuesto que facilita el transporte y/o formación en complejo de otro compuesto (carga) . Un portador polimérico es típicamente un portador que se forma de un polímero. Un portador se puede asociar a su carga por interacción covalente o no covalente. Un portador puede transportar ácidos nucleicos, por ejemplo ARN o ADN, a las células objetivo. El portador puede - para algunas modalidades - ser un componente catiónico.

Componente catiónico: El término "componente catiónico" se refiere típicamente a una molécula cargada, que se carga positivamente (catión) en un valor de pH típicamente de 1 a 9, de manera preferente en un valor de pH de o por abajo de 9 (por ejemplo de 5 a 9) , de o abajo de 8 (por ejemplo de 5 a 8 ) , de o abajo de 7 (por ejemplo de 5 a 7 ) , de manera más preferente en un pH fisiológico, por ejemplo de 7.3 a 7.4. Por consiguiente, un componente catiónico puede ser cualquier compuesto o polímero positivamente cargado, de manera preferente un péptido o proteína catiónica que se carga positivamente bajo condiciones fisiológicas, particularmente bajo condiciones fisiológicas in vivo. Un "péptido o proteína catiónica" puede contener por lo menos un aminoácido positivamente cargado, o más de un aminoácido positivamente cargado, por ejemplo seleccionado de Arg, His, Lys o Orn. Por consiguiente, los componentes "policatiónicos" también están dentro del alcance mostrando más de una carga positiva bajo las condiciones dadas.

Tapa 5' : Una tapa 5' es una entidad, típicamente una entidad de nucleótido modificada que "tapas" generalmente el extremo 5' de un ARNm maduro. Una tapa 5' se puede formar típicamente por un nucleótido modificado, particularmente por un derivado de un nucleótido de guanina. De manera preferente, la tapa 5' se liga a la 5' -terminal o a través de una ligación de 5 ' -5 ' -trifosfato . Una tapa 5' se puede metilar, por ejemplo m7GpppN, en donde N es el nucleótido 5' terminal de ácido nucleico que lleva la tapa 5' , típicamente el extremo 5' de un ARN. Ejemplos adicionales de estructuras de tapa 5' incluyen glicerilo, residuo abásico de desoxi invertido (porción), nucleótido 4', 5'- metileno, nucleótido 1- (beta-D-eritrofuranosilo) , nucleótido 4'-tio, nucleótido carbocíclico, nucleótido 1, 5-anhidrohexitol, L-nucleótidos, alfa-nucleótido, nucleótido base modificado, nucleótido treo-pentofuranosilo, nucleótido 3 ' , ' -seco-aciclico, nucleótido 3, 4-dihidroxibutil-aciclico, nucleótido 3,5 dihidroxipentil-aciclico, porción de nucleótido 3' -3' -invertida, porción abásica 3' -3' -invertida, porción de nucleótido 3'-2'-invertida, porsión abásica, 3' -2' -invertida, 1, 4-butanodiol-fosfato, 3' -fosforamidato, hexilfosfato, aminohexil-fosfato, 3' -fosfato, 3' fosforotioato, fofhoroditioato, o porción de metilfosfonato de puente o no de puente.

Inmunidad celular/respuesta inmunitaria celular: La inmunidad celular se relaciona típicamente a la activación de macrófagos, células exterminadoras naturales (NK) , linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno, y la liberación de varias citoquinas en respuesta a un antígeno. En términos más generales, la inmunidad celular no se basa en anticuerpos, sino en la activación de células del sistema inmunitario. Típicamente, una respuesta inmunitaria celular se puede caracterizar por ejemplo al activar linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno que son capaces de inducir la apoptosis en las células, por ejemplo células inmunitarias específicas similares a células dendríticas u otras células, que muestran epítopos de antígenos extraños sobre su superficie. Tales células pueden estar infectadas por virus o afectadas con bacterias intracelulares , o células cancerosas que muestran antigenos tumorales. Las características adicionales pueden ser la activación de macrofagos y células exterminadoras naturales, que les permite destruir patógenos y la estimulación de células para secretar una variedad de citoquinas que influyen en la función de otras células implicadas en las respuestas inmunitarias adaptativas y de respuestas inmunitarias innatas.

AD : El ADN es la abreviación usual para el ácido desoxi-ribonucleico . Es una molécula de ácido nucleico, es decir un polímero que consiste de nucleótidos. Estos nucleótidos son usualmente desoxi-adenosina-monofosfato, desoxi-timidina-monofosfato, desoxi-guanosina-monofosfato y monómeros de desoxi-citidina-monofosfato que son - solos -compuestos de una porción de azúcar (desoxirribosa) , una porción base y una porción de fosfato, y se polimerizan por una estructura de cadena principal característica. La estructura de cadena principal es, típicamente, formada por ligaciones de fosfodiéster entre la porción de azúcar de nucleótido, es decir desoxirribosa, de una primera porción de fosfato de un segundo monómero adyacente. El orden específico de los monómeros, es decir el orden de las bases ligadas a la cadena principal de azúcar/fosfato, es llamada la secuencia de ADN. El ADN puede ser de hebra individual o doble hebra. En la forma de doble hebra, los nucleótidos de la primera hebra se hibridan típicamente con un nucleótido de la segunda hebra, por ejemplo por un pareamiento base A/T y pareamiento base G/C.

Epítopo : Los epítopos (también llamados "determinante de antígeno") se pueden distinguir en epítopos de células T y epítopos de células B. Los epítopos de células T o partes de las proteínas en el contexto de la presente invención pueden comprender fragmentos que tienen de manera preferente una longitud de aproximadamente 6 a aproximadamente 20 o aún más aminoácidos, por ejemplo fragmentos como es procesado y presentado por las moléculas clase I MHC, que tienen de manera preferente una longitud de aproximadamente 8 a aproximadamente 10 aminoácidos, por ejemplo 8, 9, o 10, (o aún 11, o 12 aminoácidos), o fragmentos como es procesado y presentado por las moléculas clase II MHC, que tienen de manera preferente una longitud de aproximadamente 13 o más aminoácidos, por ejemplo 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o aún más aminoácidos, en donde estos fragmentos se pueden seleccionar de cualquier parte de la secuencia de aminoácidos. Estos fragmentos se reconocen típicamente por las células T en forma de un complejo que consiste del fragmento de péptido y una molécula MHC, es decir los fragmentos no se reconocen típicamente en su forma nativa. Los epítopos de células B son típicamente fragmentos situados en la superficie exterior de la proteína (nativa) o antígenos de péptido como se define en la presente, que tienen de manera preferente de 5 a 15 aminoácidos, de manera más preferente que tienen de 5 a 12 aminoácidos, de manera aún más preferente que tienen de 6 a 9 aminoácidos, que se pueden reconocer por los anticuerpos, es decir en su forma nativa.

Tales epítopos de proteínas o péptidos se pueden seleccionar adicionalmente de cualquiera de las variantes mencionadas en la presente de tales proteínas o péptidos. En este contexto los determinantes antigénicos pueden ser epítopos conformacionales o discontinuos que se componen de segmentos de las proteínas o péptidos como se define en la presente que son discontinuos en la secuencia de aminoácidos de las proteínas o péptidos como se define en la presente pero se ponen en contacto en la estructura tridimensional o epítopos continuos o lineales que se componen de una cadena de polipéptido individual.

Fragmento de una secuencia: Un fragmento de una secuencia puede ser típicamente una porción más corta de una secuencia de longitud completa de por ejemplo una molécula de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos. Por consiguiente, un fragmento, típicamente, consiste de una secuencia que es idéntica al estiramiento correspondiente dentro de la secuencia de longitud completa. Un fragmento preferido de una secuencia en el contexto de la presente invención, consiste de un estiramiento continuo de entidades, tales como nucleótidos o aminoácidos que corresponden a un estiramiento continuo de entidades en la molécula de la cual el fragmento se deriva, que representa por lo menos 20%, de manera preferente por lo menos 30%, de manera más preferente por lo menos 40%, de manera más preferente por lo menos 50%, de manera aún más preferente por lo menos 60%, de manera aún más preferente por lo menos 70%, y de manera mucho más preferente por lo menos 80% de la molécula total (es decir de longitud completa) de la cual el fragmento se deriva.

Modificado con G/C: Un ácido nucleico modificado con G/C puede ser típicamente un ácido nucleico, de manera preferente una molécula de ácido nucleico artificial como se define en la presente, basado en una secuencia de tipo natural modificada que comprende un número preferiblemente incrementado de nucleótidos de guanosina y/o citocina como es comparada con la secuencia de tipo natural. Tal número incrementado se puede generar por sustitución de codones que contienen nucleótidos de adenosina y timidina por codones que contienen nucleótidos de guanosina o citocina. Si el contenido G/C enriquecido se presenta en una región de codificación de ADN o ARN, hace uso de la degeneración del código genético. Por consiguiente, las sustituciones de codones no alteran de manera preferente los residuos de aminoácido codificados, sino incrementan exclusivamente el contenido de G/C de la molécula de ácido nucleico.

Terapia génica: La terapia génica se puede entender típicamente que propone un tratamiento del cuerpo de un paciente o elementos aislados del cuerpo de un paciente, por ejemplo, te idos/células aisladas, o ácidos nucleicos que codifican un péptido o proteina. Puede comprender típicamente por lo menos una de las etapas de a) administración de un ácido nucleico, de manera preferente una molécula de ácido nucleico artificial como se define en la presente, directamente al paciente - por cualquier vía de administración - o in vitro a las células/tejidos aislados de un paciente, que da por resultado la transfección de las células del paciente ya se in vivo/ex vivo o in vitro; b) transcripción y/o traducción de la molécula de ácido nucleico introducida; y opcionalmente c) re-administración de las células transfectadas , aisladas al paciente, si el ácido nucleico no se ha administrado directamente al paciente.

Vacunación genética: La vacunación genética se puede entender típicamente que es la vacunación por la administración de una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno o un inmunógeno o fragmentos del mismo. La molécula de ácido nucleico se puede administrar al cuerpo de un sujeto o a células aisladas de un sujeto. En la transfección de ciertas células del cuerpo o en otra sección de las células aisladas, el antígeno o inmunógeno se puede expresar por aquellas células y presentar subsecuentemente al sistema inmunitario, induciendo una respuesta inmunitaria adaptativa, específica de antígeno. Por consiguiente, la vacunación genética comprende típicamente por lo menos una de las etapas de a) administración de un ácido nucleico, de manera preferente una molécula de ácido nucleico artificial como se define en la presente, un sujeto, de manera preferente un paciente, o a células aisladas de un sujeto, de manera preferente un paciente, que da por resultado usualmente la transfección de las células del sujeto ya sea in vivo o in vitro; b) transcripción y/o traducción de la molécula de ácido nucleico introducida; y opcionalmente c) re-administración de las células transfectadas , aisladas al sujeto, de manera preferente el paciente, si el ácido nucleico no se ha administrado directamente al paciente.

Secuencia heteróloga: Dos secuencias se entiende típicamente que son "heterólogas" si no son derivables del mismo gen. Es decir, aunque la secuencias heterólogas pueden ser derivables del mismo organismo, no se presentan naturalmente (en la naturaleza) en la misma molécula de ácido nucleico, tal como en el mismo ARNm.

Inmunidad humoral/respuesta inmunitaria humoral: Inmunidad humoral se refiere típicamente a la producción de anticuerpos y opcionalmente a procesos accesorios que acompañan la producción de anticuerpos. Una respuesta inmunitaria humoral se puede caracterizar típicamente, por ejemplo, por activación de Th2 y producción de citoquinas, formación de centro germinal y cambio de isotipo, maduración por afinidad y generación de células de memoria. La inmunidad humoral también puede referirse típicamente a las funciones efectoras de anticuerpos, que incluyen neutralización de patógenos y toxinas, activación del complemento clásica, y promoción de opsonina de fagocitosis y eliminación de patógenos.

Inmunógeno : En el contexto de la presente invención, un inmunógeno se puede entender típicamente que es un compuesto que es capaz de estimular una respuesta inmunitaria. De manera preferente, un inmunógeno es un péptido, polipéptido o proteína. En una modalidad particularmente preferida, un inmunógeno en el sentido de la presente invención es el producto de traducción de una molécula de ácido nucleico proporcionada, de manera preferente una molécula de ácido nucleico artificial como se define en la presente. Típicamente, un inmunógeno induce por lo menos una respuesta inmunitaria adaptativa.

Composición inmunoestimuladora: En el contexto de la invención, una composición inmunoestimuladora se puede entender típicamente que es una composición que contiene por lo menos un componente que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria o de la cual un componente que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria es derivable. Tal respuesta inmunitaria puede ser de manera preferente una respuesta inmunitaria innata o una combinación de una respuesta inmunitaria adaptativa e innata. De manera preferente, una composición inmunoestimuladora en el contexto de la invención contiene por lo menos una molécula de ácido nucleico artificial, de manera más preferente un ARN, por ejemplo una molécula de ARNm. El componente inmunoestimulador , tal como el ARNm se puede formar en complejo con un portado Adecuado. De esta manera, la composición inmunoestimuladora puede comprender un complejo de ARNm/portador . Adicionalmente , la composición inmunoestimuladora puede comprender un adyuvante y/o un vehículo adecuado para el componente inmunoestimulador, tal como el ARNm.

Respuesta inmunitaria: Una respuesta inmunitaria puede ser típicamente una reacción específica del sistema inmunitario adaptativo a un antígeno particular (de esta manera llamado respuesta inmunitaria especifica o adaptativa) o una reacción no específica del sistema inmunitario innato (de esta manera llamada respuesta inmunitaria no específica o innata), o una combinación de los mismos.

Sistema inmunitario: El sistema inmunitario puede proteger organismo de infección. Si un patógeno tiene éxito en pasar una barrera física de un organismo y entra a este organismo, el sistema inmunitario innato proporciona una respuesta inmediata, pero no específica. Si los patógenos evaden esta respuesta inmunitaria, los vertebrados poseen una segunda capa de protección, el sistema inmunitario adaptativo. En este punto, el sistema inmunitario adapta su respuesta durante una infección para mejorar su reconocimiento del patógeno. Esta respuesta mejorada luego se retiene después de que el patógeno ha sido eliminado, en la forma de una memoria inmunológica , y permite que el sistema inmunitario adaptativo monte ataques más rápidos y más potentes cada vez que este patógeno se encuentra. De acuerdo con esto, el sistema inmunitario comprende el sistema inmunitario innato y adaptativo. Cada una de estas dos partes contiene típicamente los así llamados componentes humorales y celulares .

ARN inmunoestimulador : Un ARN inmunoestimulador (ARNis) en el contexto de la invención puede ser típicamente un ARN que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria innata. Usualmente no tiene un marco de lectura abierto y de esta manera no proporciona un péptido-antigeno o inmunógeno pero induce una respuesta inmunitaria por ejemplo al ligarse a una clase especifica de receptor similar a Toll (TLR) u otros receptores adecuados. Sin embargo, por supuesto, también los ARNms que tienen un marco de lectura abierto y codifican un péptido/proteina pueden inducir una respuesta inmunitaria innata, y de esta manera, pueden ser ARNs inmunoestimuladores .

Sistema inmunitario innato: El sistema inmunitario innato, también conocido como sistema inmunitario no específico (o no específico) , comprende típicamente las células y mecanismos que defienden al hospedero de la infección por otros organismos en una manera no específica. Esto significa que las células del sistema innato pueden reconocer y responder a los patógenos en una forma genérica, pero diferente al sistema inmunitario adaptativo, no confieren inmunidad de largo plazo o protectora al hospedero. El sistema inmunitario innato se puede, por ejemplo, activar por ligandos de los receptores similares a Toll (TLRs) u otras sustancias auxiliares tales como lipopolisacáridos , TNF-alfa, ligando CD40, o citoquinas, monocinas, linfocinas, interleucinas o quimocinas, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL- 6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, GM-CSF, G-CSF, -CSF, LT-beta, TNF-alfa, factores de crecimiento, y hGH, un ligando de un receptor similar a Toll humano TLRl, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7 , TLR8, TLR9, TLR10, un ligando de receptor similar a Toll de murino TLRl, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7 , TLR8 , TLR9, TLR10, TLRl 1 , TLR12 o TLRl 3 , un ligando de receptor similar a NOD, un ligando de un receptor similar a RIG-I, un ácido nucleico inmunoestimulador, un ARN inmunoestimulador (ARNis), un CpG-DNA, un agente antibacteriano, o un agente antiviral. La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede comprender una o más de tales sustancias. Típicamente, una respuesta del sistema inmunitario innato incluye reclutar células inmunitarias a los sitios de infección, a través de la producción de factores químicos, incluyendo mediadores químicos especializados, llamados citoquinas; activación de la cascadas de complemento; identificación y remoción de sustancias extrañas presentes en los órganos, tejidos, la sangre y nodos linfáticos, por glóbulos blancos especializados; activación del sistema inmunitario adaptativo; y/o actúa como una barrera física y química a agentes infecciosos.

Sitio de clonación: Un sitio de clonación se entiende típicamente que es un segmento de una molécula de ácido nucleico, que es adecuado para la inserción de una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que comprende un marco de lectura abierto. La inserción se puede llevar a cabo por cualquier método biológico molecular conocido por la persona experta en la técnica, por ejemplo por restricción y ligación. Un sitio de clonación comprende típicamente uno o más sitios de reconocimiento de enzimas de restricción (sitios de restricción) . Estos de uno o más sitios de restricción se pueden reconocer por las enzimas de restricción que escinden el ADN en estos sitios. Un sitio de clonación que comprende más de un sitio de restricción también se puede llamar un sitio de clonación múltiple (MCS) o un poliligador.

Molécula de ácido nucleico: Una molécula de ácido nucleico es una molécula que comprende, que consiste de manera preferente de componentes de ácido nucleico. El término molécula de ácido nucleico se refiere de manera preferente a moléculas de ADN o ARN. Se utiliza de manera preferente sinónimo con el término "polinucleótido" . De manera preferente, una molécula de ácido nucleico es un polímero que comprende o que consiste de monómeros de nucleótidos que se ligan covalentemente entre si por ligaciones de fosfodiéster de una cadena principal de azúcar/fosfato. El término "molécula de ácido nucleico" también abarca moléculas de ácido nucleico modificadas, tales como moléculas de ADN o ARN modificadas con base, modificadas con azúcar o modificadas con cadena principal etc.

Marco de lectura abierto: Un marco de lectura abierto (ORF) en el contexto de la invención puede ser típicamente una secuencia de varios tripletos de nucleótidos que se pueden traducir en un péptido o proteína. Un marco de lectura abierto contiene de manera preferente un codón de inicio, es decir una combinación de tres nucleótidos subsecuentes que codifican usualmente el aminoácido metionina (ATG o AUG) , en su extremo 5' y una región subsecuente que muestra usualmente una longitud que es un múltiple de 3 nucleótidos. Un ORF se termina de manera preferente por un codón de detección (por ejemplo, TAA, TAG, TGA) . Típicamente, este es el único codón de detección del marco de lectura abierto. De esta manera, un marco de lectura abierto en el contexto de la presente invención es de manera preferente secuencia de nucleótidos, que consiste de una variedad de nucleótidos que se pueden dividir por tres, que inicia por un codón de inicio (por ejemplo ATG o AUG) y que termina de manera preferente con un codón de detección (por ejemplo, TAA, TGA, o TAG) . El marco de lectura abierto se puede aislar o se puede incorporar en una secuencia de ácido nucleico más larga, por ejemplo en un vector o un ARNm. Un marco de lectura abierto también puede ser llamado "región de codificación de proteínas".

Péptido : Un péptido o polipéptido es típicamente un polímero de monómeros de aminoácido, ligados por ligaciones de péptido. Contiene típicamente menor que 50 unidades de monómeros. No obstante, el término péptido no es una negación para moléculas que tiene más de 50 unidades de monómero. Los péptidos largos también son llamados polipéptidos , que tienen típicamente entre 50 y 600 unidades monoméricas.

Cantidad farmacéuticamente efectiva: Una cantidad farmacéuticamente efectiva en el contexto de la invención se entiende típicamente que es una cantidad suficiente para inducir un efecto farmacéutico, tal como una respuesta inmunitaria, alterar un nivel patológico de un péptido o proteína expresada, o sustituir un producto carente de gen, por ejemplo, en el caso de una situación patológica.

Proteína : Una proteína comprende típicamente uno o más péptidos o polipéptidos. Una proteína se pliega típicamente en forma tridimensional, que puede ser requerida para que la proteína ejerza su función biológica.

Secuencia poli (A) : Una secuencia poli (A) , también llamada cola poli (A) o cola 3 '-poli (A), se entiende típicamente que es una secuencia de nucleótidos de adenina, por ejemplo, de hasta aproximadamente 400 nucleótidos de adenina, por ejemplo de aproximadamente 20 a aproximadamente 400, de manera preferente de aproximadamente 50 a aproximadamente 400, de manera más preferente de aproximadamente 50 a aproximadamente 300, de manera aún más preferente de aproximadamente 50 a aproximadamente 250, de manera mucho más preferente de aproximadamente 60 a aproximadamente 250 nucleótidos de adenina. Una secuencia poli (A) se sitúa típicamente en el extremo 3' de una ARNm. En el contexto de la presente invención, una secuencia poli (A) se puede situar dentro de una ARNm o cualquier otra molécula de ácido nucleico, tal como, por ejemplo, en un vector, por ejemplo, en un vector que sirve como plantilla para la generación de un ARNm de manera preferente un ARNm, por ejemplo, la transcripción del vector.

Poliadenilación : la poliadenilación se entiende típicamente que es la adición de una secuencia poli (A) a una molécula de ácido nucleico, tal como una molécula de ARN, por ejemplo a una ARNm prematuro. La poliadenilación se puede inducir por una así llamada señal de poliadenilación. Esta señal se sitúa de manera preferente dentro de un estiramiento de nucleótidos en el extremo 3' de una molécula de ácido nucleico, tal como una molécula de ARN, que se poliadenila.

Una señal de poliadenilación comprende típicamente un hexámero que consiste de nucleótidos de adenina y uracilo/timina , de manera preferente la secuencia de hexámero AAUAAA. Otras secuencias, de manera preferente secuencias de hexámeros, también son concebibles. La poliadenilación se presenta típicamente durante el procesamiento de un pre-ARNm (también llamado ARNm prematuro) . Típicamente, la maduración del ARN (de pre-ARNm a ARNm maduro) comprende la etapa de poliadenilación .

Sitio de restricción: Un sitio de restricción, también llamado "sito de reconocimiento de enzima de restricción", es una secuencia de nucleótidos reconocida por una enzima de restricción. Un sitio de restricción es típicamente una secuencia de nucleótidos corta, de manera preferente palindrómica , por ejemplo una secuencia que comprende de 4 a 8 nucleótidos. Un sitio de restricción es de manera preferente reconocido específicamente por una enzima de restricción. La enzima de restricción escinde típicamente una secuencia de nucleótidos que comprende un sitio de restricción en este sitio. En una secuencia de nucleótidos de doble hebra, tal como una secuencia de ADN de doble hebra, la enzima de restricción corta típicamente ambas hebras de la secuencia de nucleótidos.

ARN, ARNm: ARN es la abreviación usual para ácido ribonucleico. Es una molécula de ácido nucleico, es decir un polímero que consiste de nucleótidos. Estos nucleótidos son usualmente monómeros de adenosina-monofosfato, uridina-monofosfato, guanosina-monofosfato y citidina-monofosfato que se conectan entre sí a lo largo de así llamada cadena principal. La cadena principal se forma por ligaciones de fosfodiéster entre la azúcar, es decir ribosa, de una primera porción de fosfato de un segundo monómero adyacente. La asociación específica de los monómeros es llamada la secuencia de ARN. Usualmente el ARN puede ser obtenible por transcripción de una secuencia de ADN, por ejemplo, dentro de una célula. En las células eucarióticas , la transcripción se lleva a cabo típicamente dentro del núcleo o la mitocondria. In vivo, la transcripción del ADN da por resultado usualmente el así llamado ARN prematuro que tiene que ser procesado en el así llamado ARN mensajero, usualmente abreviado como ARNm. El procesamiento del ARN prematuro, por ejemplo en organismos eucarióticos , comprenden una variedad de diferentes modificaciones post-transcripcionales tales como empalme, tapa 5', poliadenilación, exportación del núcleo o la mitocondria y similares. La suma de estos procesos también es llamada maduración de ARN. El ARN mensajero maduro proporciona usualmente la secuencia de nucleótidos que se pueden traducir en una secuencia de aminoácidos de un péptido o proteína particular. Típicamente, una ARNm maduro comprende una tapa 5', una 5'UTR, un marco de lectura abierto, una 3'UTR y una secuencia poli (A) . Además del ARN mensajero, existen varios tipos no de codificación de ARN que se pueden implicar en la regulación de la trascripción y/o traducción.

Secuencia de una molécula de ácido nucleico: La secuencia de una molécula de ácido nucleico se entiende típicamente que es el orden particular e individual, es decir la sucesión de sus nucleótidos. La secuencia de una proteína o péptidos se entiende típicamente que es el orden, es decir, la sucesión de sus aminoácidos.

Identidad de secuencia: Dos o más secuencias son idénticas y muestran la misma longitud y orden de los nucleótidos o aminoácidos. El porcentaje de identidad describe típicamente el grado al cual dos secuencias son idénticas, es decir describe típicamente el porcentaje de nucleótidos que corresponde en su posición de secuencia con nucleótidos idénticos de una secuencia de referencia. Para determinación del grado de identidad, las secuencias que se comparan son consideradas que muestran la misma longitud, es decir, la longitud de la secuencia más larga de las secuencias que se comparan. Esto significa que una primera secuencia que consiste de 8 nucleótidos es 80% idéntica a una segunda secuencia que consiste de 10 nucleótidos que comprenden la primera secuencia. En otras palabras, el contexto de la presente invención, la identidad de secuencias se refiere de manera preferente al porcentaje de nucleótidos de una secuencia que tiene la misma posición en dos o más secuencias que tienen la misma longitud. Los espacios son considerados usualmente como posiciones no idénticas, independientemente de su posición actual en una alineación.

Molécula de ácido nucleico estabilizada: Una molécula de ácido nucleico estabilizada es una molécula de ácido nucleico, de manera preferente una molécula de ADN o ARN que se modifica tal, que es más estable a la desintegración o degradación, por ejemplo, por factores ambientales o digestión enzimática, tal como por una degradación de exo o endonucleasa, que la molécula de ácido nucleico y la modificación. De manera preferente, una molécula de ácido nucleico estabilizada en el contexto de la presente invención se estabiliza en una célula, tal como una célula procariótica o eucariótica, de manera preferente en una célula de mamífero, tal como célula humana. El efecto de estabilización también se puede ejercer fuera de las células, por ejemplo en una solución amortiguadora et . , por ejemplo, en un proceso de fabricación para una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico estabilizada.

Transíecció : El término "transíección" se refiere a la introducción de moléculas de ácido nucleico, tales como moléculas de ADN o ARN (por ejemplo ARNm) , en células, de manera preferente en células eucarióticas . En el contexto de la presente invención, el término "transfección" abarca cualquier método conocido por la persona experta para introducir moléculas de ácido nucleico en las células, de manera preferente en células eucarióticas, tal como en células de mamífero. Tales métodos abarcan, por ejemplo, electroporación, lipofección, por ejemplo basadas en lípidos catiónicos y/o liposomas, precipitación de fosfato de calcio, transfección basada en nanopartículas , transfección basada en virus, o transfección basad en polímeros catiónicos, tales como DEAE-dextrano o polietilenimina etc. De manera preferente, la introducción no es viral.

Vacuna : Una vacuna se entiende típicamente que es un material profiláctico terapéutico que proporciona por lo menos un antígeno, de manera preferente un inmunógeno. El antígeno o inmunógeno se puede derivar de cualquier material que sea adecuado para vacunación. Por ejemplo, el antígeno o inmunógeno se puede derivar de un patógeno, tal como de bacterias o partículas de virus etc., o de un tejido tumoral o canceroso. El antígeno o inmunógeno estimula el sistema inmunitario adaptativo del cuerpo para proporcionar una respuesta inmunitaria adaptativa.

Vector : El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico, de manera preferente a una molécula de ácido nucleico artificial. Un vector en el contexto de la presente invención es adecuado para incorporar o alojar una secuencia de ácido nucleico deseada, tal como una secuencia de ácido nucleico que comprende un marco de lectura abierto. Tales vectores pueden ser vectores de almacenamiento, vectores de expresión, vectores de clonación, vectores de transferencia etc. Un vector de almacenamiento es un vector que permite el almacenamiento conveniente de una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, de una molécula de ARNm. De esta manera, el vector puede comprender de una secuencia que corresponde, por ejemplo, a una secuencia de ARNm deseada o una parte de la misma, tal como una secuencia que corresponde al marco de lectura abierto y la 3'UTR de un ARNm. Un vector de expresión se puede utilizar para la producción de productos de expresión tal como ARN, por ejemplo ARNm, o péptidos, polipéptidos o proteínas. Por ejemplo, un vector de expresión puede comprender secuencias necesarias para la transcripción de un estiramiento de secuencia del vector, tal como una secuencia promotora, por ejemplo una secuencia promotora de ARN. Un vector de clonación es típicamente un vector que contiene un sitio de clonación, que se puede utilizar para incorporar secuencias de ácidos nucleicos en el vector. Un vector de clonación puede ser, por ejemplo, un vector plásmido o un vector bacteriófago. Un vector de transferencia puede ser un vector que es adecuado para transferir moléculas de ácido nucleico en las células u organismos, por ejemplo, vectores virales. Un vector en el contexto de la presente invención puede ser, por ejemplo, un vector de ARN o un vector de ADN. De manera preferente, un vector es una molécula de ADN. De manera preferente, un vector en el sentido de la presente solicitud comprende un sitio de clonación, un marcador de selección, tal como un factor de resistencia a antibióticos, y una secuencia adecuada para la multiplicación del vector, tal como un origen de replicacion. De manera preferente, un vector en el contexto de la presente solicitud es un vector plásmido.

Vehículo : un vehículo se entiende típicamente que es un material que es adecuado para almacenar, transportar, y/o administrar un compuesto, tal como un compuesto farmacéuticamente activo. Por ejemplo, puede ser un líquido fisiológicamente aceptable que es adecuado para almacenar, transportar, y/o administrar un compuesto farmacéuticamente activo .

Región 3' no traducida (3'UTR): Una 3'UTR es típicamente la parte de una ARNm que se sitúa entre la región de codificación de proteína (es decir, el marco de lectura abierto) y la secuencia poli (A) del ARNm. Una 3'UTR del ARNm no se traduce en una secuencia de aminoácidos. La secuencia 3'UTR se codifica generalmente por el gen que se transcribe en el ARNm respectivo durante el proceso de expresión génica. La secuencia genómica primero se transcribe en el ARNm pre-maduro, que comprende intrones opcionales. El ARNm prematuro luego se procesa adicionalmente en ARNm maduro en un proceso de maduración. Este proceso de maduración comprende las etapas de tapa 5, empalme del ARNm prematuro para escindir intrones opcionales y modificaciones del extremo 3' , tal como poliadenilación del extremo 3' del ARNm pre-maduro y escisiones de endo- o exonucleasa opcionales etc. En el contexto de la presente invención, una 3'UTR corresponde a la secuencia de una ARNm maduro que se sitúa 3' al codón de detención de la región de codificación de proteína, de manera preferente inmediatamente 3' al codón de detención de la región de codificación de proteína, y que se extiende al lado 5' de la secuencia poli (A) , de manera preferente al nucleótido inmediatamente 5' a la secuencia poli (A) . El término "corresponde a" significa que la secuencia 3'UTR puede ser una secuencia de ARN, tal como en la secuencia de ARNm utilizada para definir al secuencia 3'UTR, o una secuencia de ADN que corresponde a tal secuencia de ARN. En el contexto de la presente invención, el término "una 3'UTR de un gen", tal como "3'UTR de un gen de albúmina", es la secuencia que corresponde a la 3'UTR de la ARNm maduro derivado de este gen, es decir, el ARNm obtenido por transcripción del gen y maduración de la ARNm pre-maduro. El término "3'UTR de un gen" abarca la secuencia de ADN y la secuencia del ARN de la 3'UTR.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico artificial que comprende a. por lo menos un marco de lectura abierto (ORF) ; y b. por lo menos un elemento de región 3' -no traducida (elemento 3'UTR) que comprende o consiste de una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen de albúmina o de una variante de la 3'UTR de un gen de albúmina.

El término "elemento 3'UTR" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comprende o consiste de una secuencia de ácido nucleico que se deriva de una 3'UTR o de una variante de una 3'UTR. Un "elemento 3'-UTR" se refiere de manera preferente a una secuencia de ácido nucleico que representa una 3'UTR de una secuencia de ácido nucleico artificial, tal como un ARNm artificial, o que codifica una 3'UTR de una molécula de ácido nucleico artificial. Por consiguiente, en el sentido de la presente invención, de manera preferente, un elemento 3'UTR puede ser la 3'UTR de un ARNm, de manera preferente de un ARNm artificial, o puede ser la plantilla de transcripción para una 3'UTR de un ARNm. De esta manera, un elemento 3'UTR de manera preferente es una secuencia de ácido nucleico que corresponde a la 3'UTR de un ARNm, de manera preferente a la 3'UTR de un ARNm artificial, tal como un ARNm obtenido por la transcripción de un constructo vector genéticamente diseñado. De manera preferente, un elemento 3'UTR en el sentido de la presente invención funciona como un 3'UTR o codifica una secuencia de nucleótidos que cumple con la función de una 3'UTR.

De manera preferente, el por lo menos un marco de lectura abierto y el por lo menos un elemento 3'UTR son heterólogos. El término "heterólogo" en este contexto significa que el marco de lectura abierto y el elemento 3'UTR no son de origen natural (en la naturaleza) en esta combinación. De manera preferente, el elemento 3'UTR se deriva de un gen diferente que el marco de lectura abierto. Por ejemplo, el ORF se puede derivar de un gen diferente que el elemento 3'UTR, por ejemplo que codifica una proteina diferente o la misma proteina pero no una especie diferente etc. De manera preferente, el marco de lectura abierto no codifica la albúmina humana, de manera preferente el marco de lectura abierto no codifica la albúmina. Se prefiere que el marco de lectura abierto no codifiqué una proteina reportera, por ejemplo seleccionada de grupo que consiste de proteínas globina (particularmente beta-globina ) , proteína luciferasa, proteínas GFP o variantes de las mismas, por ejemplo, variantes que muestran por lo menos 70% identidad de secuencia una proteína globina, una proteína luciferasa, o una proteína GFP. Particularmente, se prefiere, en una modalidad específica, que el marco de lectura abierto no codifiqué la beta-globina, o, más específicamente, para la beta-globina de conejo, o variantes de la misma, en particular en el caso el elemento 3'UTR que se deriva de la 'UTR de albúmina de rata o variantes de la misma. Adicionalmente , en una modalidad específica, la molécula de ácido nucleico artificial de la invención no codifica una secuencia señal (y por lo tanto no contienen un segmento que codifica tal secuencia señal), que es sinónimamente también designada una señal de localización o señal de orientación. Tal secuencia señal se proporciona típicamente en la 5'-terminal de la secuencia de aminoácidos codificada. Particularmente, el ácido nucleico artificial de la invención no codifica una proteína que (artificial o naturalmente) contiene una "secuencia de aminoácidos señal), en particular no una secuencia señal que dirige la proteína codificada a los polisomas ligados a la membrana del retículo endoplásmico y/o transubica la proteína de interés codificada por el ácido nucleico inventivo a través de la membrana del retículo endoplásmico . En particular, la proteína codifica de la molécula de ácido nucleico inventiva no contiene una secuencia señal de albúmina, más específicamente no la secuencia señal de albúmina de rata. Típicamente, la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico artificial inventiva no contiene una proteína láctea o secuencia señal de hormona de crecimiento, en particular si la región de codificación codifica la globina, más específicamente la beta-globina , aún más específicamente la beta-globina de conejo. En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico artificial de la invención no contiene una secuencia 5'-UTR de globina, en particular no una secuencia 5'-UTR de beta-globina o, más particularmente, no una secuencia 5'-UTR de globina de conejo, en particular si la región de codificación codifica una secuencia de globina, más específicamente beta-globina o variantes de la misma. Sí la molécula de ácido nucleico artificial contiene una secuencia 5'-UTR, que la secuencia 5'-UTR se puede seleccionar tal que no es la secuencia 5'-UTR de un gen de albúmina, en particular no del gen de albúmina de rata. En caso de que la molécula de ácido nucleico artificial de la invención contenga más de una 3'-UTR, la otra 3'-UTR(s) es/son de manera preferente no seleccionadas del grupo que consiste de una 3'-UTR de globina y una '-UTR de c-myc . En otra modalidad, la 'UTR el ácido nucleico inventivo no corresponde a la '-UTR de albúmina de rata, en particular si la región de codificación codifica una globina, más específicamente una beta-globina .

Adicionalmente, se prefiere particularmente que el marco de lectura abierto no codificara el factor IX humano o variantes del mismo, por ejemplo las variantes que muestran por lo menos 70% de identidad de secuencia al factor IX humano. La molécula de ácido nucleico no contiene un promotor de albúmina, en particular un promotor de albúmina con una mutación puntual, más específicamente con una mutación puntual G52A, en particular si la región de codificación de la molécula de ácido nucleico inventiva codifica el factor IX humano o variantes del mismo como se describe en lo anterior.

En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico artificial de la invención no corresponde a un elemento transposon, por ejemplo un plásmido transposon, o no contiene un transposon (en particular no un transposon Tn5 o no contiene elementos mosaicos TN5) , en particular si la región de codificación codifica el gen de resistencia, en particular un gen de resistencia a la neomicina. La molécula de ácido nucleico de la invención no puede interactuar funcionalmente con una transposasa, no es particular con una transposasa Tn5, bajo tales circunstancias. Hablando funcionalmente , la molécula de ácido nucleico inventiva no formará típicamente un complejo entre el ácido nucleico (como el ácido nucleico artificial inventivo que no contiene un transposon) y una transposasa especifica para cualquier transposon. La región de codificación (ORF) de la molécula de ácido nucleico de la invención no codifica un ARNsi, en particular si la molécula de ácido nucleico de la invención interactúa funcionalmente con una transposasa.

En este contexto se prefiere particularmente una modalidad especifica que el marco de lectura vierto no contenga un intrón, particularmente en caso de que el marco de lectura abierto codifiqué el factor IX humano o variantes del mismo.

Adicionalmente , se prefiere en este contexto que en una modalidad especifica el marco de lectura abierto no codifiqué el factor IX humano o variantes del mismo, en particular en el caso de que el elemento 3'ÜTR se derive de la 3'UTR de albúmina humana o variantes de la misma.

La molécula de ácido nucleico artificial inventiva es -como una modalidad especifica de la invención, no un cásete de expresión. Por consiguiente, la molécula de ácido nucleico inventiva no contiene un promotor 3' o un extremo 3' promotor. En términos de esa modalidad, la molécula de ácido nucleico inventiva tampoco es un "cásete de secreción", ya que no contiene una secuencia señal y, de manera preferente, no contiene un promotor 3'. En particular, la molécula de ácido nucleico inventiva se compone de una sola molécula de ácido nucleico que comprende el ORF y la región 3'UTR y opcionalmente una región 5'UTR. Por consiguiente, la molécula de ácido nucleico inventiva no corresponde a un cásete de secreción que se compone de más de uno de los elementos genéticos separados, en particular no corresponde a un primer elemento genético que representa la región cadena arriba de la región de codificación (ORF) y un segundo elemento genético separado que representa la región cadena abajo del ORF, que se proporciona independientemente, por ejemplo como partes de un kit .

De manera preferente, el por lo menos un elemento 3'UTR se liga funcionalmente al ORF. Esto significa de manera preferente que el elemento 3'UTR se asocia con el ORF tal que puede ejercer una función, tal como una función de estabilización en la expresión del ORF o una función de estabilización en la molécula de ácido nucleico artificial. De manera preferente, el ORF y el elemento 3'UTR se asocian en la dirección 5'- 3f . De esta manera, de manera preferente, la molécula de ácido nucleico artificial comprende la estructura 5 -ORF-ligador (opcional) -elemento J'UTR-3', en donde el ligador estar presente o ausente. Por ejemplo, el ligador puede ser uno o más nucleótidos, tal como un estiramiento de 1-50 o 1-20 nucleótidos, por ejemplo, que comprende o que consiste de uno o más sitios de reconocimiento de enzimas de restricción (sitios de restricción) .

De manera preferente, el por lo menos un elemento 3'UTR comprende o consiste de una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen de albúmina de vertebrado o de una variante del mismo, de manera preferente de la 3'UTR de un gen de albúmina de mamífero tal como por ejemplo la 3'UTR del gen de albúmina de ratón, el gen de albúmina de Olive baboon o el gen de albúmina humano o de una variante del mismo. De manera más preferible el por lo menos un elemento 3'UTR comprende o cosiste de una secuencia de ácido nucleico derivada de la 3'UTR de un gen de albúmina de primate, particularmente de un gen de albúmina humano de un gen de albúmina de Olive baboon o de una variante del mismo, aún de manera más preferible de la 3'UTR del gen de albúmina humano de acuerdo con el número de Acceso de GenBank NM_000477.5 o de una variante del mismo. En una modalidad preferida, el elemento 3'UTR no se deriva de la 3'UTR de un gen de albúmina de Xenopus. De manera preferente, el elemento 3'UTR no comprende un elemento B limitador de poli (A) (PLEB) de una 3'UTR de un gen de albúmina de Xenopus. De manera preferente, el elemento 3'UTR no consiste de un PLEB de una 3'UTR de un gen de albúmina de Xenopus.

El término "una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un [...] gen de albúmina" se refiere de manera preferente a una secuencia de nucleótido que se basa en la secuencia 3'UTR de un gen de albúmina o en un fragmento o parte del mismo. Este término incluye secuencias que corresponden a la secuencia 3'UTR completa, es decir la secuencia 3'UTR de longitud completa de un gen de albúmina, y secuencias que corresponden a un fragmento de la secuencia 3'UTR de un gen de albúmina. De manera preferente, un fragmento de una 3'UTR de un gen de albúmina consiste de un estiramiento continuo de nucleótidos que corresponde a un estiramiento continuo de nucleótidos en la 3'UTR de longitud completa de un gen de albúmina, que representa por lo menos 20%, de manera preferente por lo menos 30%, de manera más preferible por lo menos 40%, de manera más preferible por lo menos 50%, de manera aún más preferente por lo menos 60%, de manera aún más preferente por lo menos 70%, de manera aún más preferente por lo menos 80%, y de manera mucho más preferente por lo menos 90% de la 3'UTR de longitud completa de un gen de albúmina. Tal fragmento, en el sentido de la presente invención, es de manera preferente un fragmento funcional como se describe en la presente. El término "3'UTR de un gen de albúmina" se refiere de manera preferente a la 3'UTR de un gen de albúmina de origen natural.

Los términos "variante de la 3'UTR de un gen de albúmina" y "variante de la misma" en el contexto de una 3'UTR de un gen de albúmina se refiere a una variante de la 3'UTR de un gen de albúmina de origen natural, de manera preferente a una variante de la 3'UTR de un gen de albúmina de vertebrado, de manera más preferible a una variante de la 3'UTR de un gen de albúmina de mamífero tal como la 3'UTR de un gen de albúmina de ratón, de manera aún más preferente una variante de la 3'UTR de un gen de albúmina de primate, particularmente de un gen de albúmina humana o de un gen de albúmina de Olive baboon como se describe en lo anterior. Tal variante puede ser una 3'UTR modificada de un gen de albúmina. Por ejemplo, una 3'UTR variante puede mostrar una o más supresiones, inserciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos comparadas con la 3'UTR de origen natural de la cual la variante se deriva. De manera preferente, una variante de una 3'UTR de un gen de albúmina es por lo menos 40%, preferiblemente por lo menos 50%, de manera más preferible por lo menos 60%, de manera más preferible por lo menos 70%, de manera aún más preferible por lo menos 80%, de manera aún más preferible por lo menos 90%, de manera mucho más preferible por lo menos 95% idéntica a la 3'UTR de origen natural de la cual la variante se deriva. De manera preferente, la variante es una variante funcional como se describe en la presente.

El término "una secuencia de ácido nucleico que se deriva de una variante de la 3'UTR de un gen de albúmina" se refiere de manera preferente a una secuencia de ácido nucleico que se basa en una variante de la secuencia 3'UTR de un gen de albúmina o un fragmento o parte del mismo como se describe en lo anterior. El término incluye las secuencias que corresponden a la secuencia completa de la variante de la 3'UTR de un gen de albúmina, es decir la secuencia 3'UTR variante de longitud completa de un gen de albúmina, y secuencias que corresponden a un fragmento de la secuencia 3'UTR variante de un gen de albúmina. De manera preferente, un fragmento de una variante de la 3'UTR de un gen de albúmina consiste de un estiramiento continuo de nucleótidos que corresponde a un estiramiento continuo de nucleótidos en la variante de longitud completa de la 3'UTR de un gen de albúmina, que representa por lo menos 20%, de manera preferente por lo menos 30%, de manera más preferible por lo menos 40%, de manera más preferible por lo menos 50%, aún de manera más preferible por lo menos 60%, aún de manera más preferible por lo menos 70%, aún de manera más preferible por lo menos 80%, y de manera mucho más preferible por lo menos 90% la variante de longitud completa de la 3'UTR de un gen de albúmina. Tal fragmento de una variante, en el sentido de la presente invención, es de manera preferente un fragmento funcional de una variante como se describe en la presente.

Los términos "variante funcional", "fragmento funcional" y "fragmento funcional de una variante" (también llamado "fragmento variante funcional") en el contexto de la presente invención, propone que el fragmento de la 3'UTR, la variante de la 3'UTR, el fragmento de una variante de la 3'UTR de un gen de albúmina cumpla con por lo menos una, de manera preferente más que una función de la 3'UTR de origen natural de un gen de albúmina, de la cual la variante, el fragmento, o el fragmento de la variante se deriva. Tal función puede ser, por ejemplo, estabilizar el ARNm y/o estabilizar y/o prolongar la producción de proteínas de un ARNm y/o incrementar la expresión de proteínas o producción de proteínas total de un ARNm, de manera preferente en una célula de mamífero, tal como una célula humana. Se prefiere particularmente que la variante, el fragmento, y el fragmento variante en el contexto de la presente invención cumpla con la función de estabilizar un ARNm, de manera preferente una célula de mamífero, tal como una célula humana comparado con un ARNm que comprende una 3'UTR de referencia o que carece de una 3'UTR, y/o la función de estabilizar y/o prolongar la producción de proteínas de un ARNm, de manera preferente de una célula de mamífero, tal como una célula humana, comparado con un ARNm que comprende una 3'UTR de referencia que carece de una 3'UTR, y/o la función de incrementar la producción de proteínas de un ARNm, de manera preferente de una célula de mamífero, tal como una célula humana, comparado con un ARNm que comprende una 3'UTR de referencia que carece de una 3'UTR. Una 3'UTR de referencia puede ser, por ejemplo, una 3'UTR de origen natural en combinación con el ORF. Adicionalmente, una variante funcional, un fragmento funcional, o un fragmento variante funcional de una 3'UTR de un gen de albúmina de manera preferente no tiene un efecto sustancialmente decreciente en la eficiencia de la traducción del ARNm que comprende tal variante, fragmento, o fragmento variante de una 3'UTR comparada con la 3'UTR de tipo natural de la cual la variante, el fragmento, o el fragmento variante se deriva. Una función particularmente preferida de un "fragmento funcional", una "variante funcional" o un "fragmento funcional de una variante" de la 3'UTR de un gen de albúmina en el contexto de la presente invención es la estabilización y/o prolongación de la producción de proteínas por la expresión de un ARNm que lleva el fragmento funcional, variante funcional o fragmento funcional de una variante como se describe en lo anterior.

De manera preferente, la eficiencia de la uno o más funciones ejercidas por la variante funcional, el fragmento funcional, o el fragmento variante funcional, tal como ARNm y/o eficiencia de estabilización de producción de proteínas y/o la eficiencia de incremento de producción de proteínas, es por lo menos 40%, de manera más preferible por lo menos 50%, de manera más preferible por lo menos 60%, aún de manera más preferible por lo menos 70%, aún de manera más preferible por lo menos 80%, de manera mucho más preferible por lo menos 90% del ARNm y/o la eficiencia de estabilización de producción de proteínas y/o la eficiencia de incremento de producción de proteínas mostrada por la 3'UTR de origen natural de un gen de albúmina de la cual la variante, el fragmento o el fragmento variante se deriva.

En el contexto de la presente invención, un fragmento de la 3'UTR de un gen de albúmina o de una variante de la 3'UTR de un gen de albúmina muestra de manera preferente una longitud de por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos, de manera preferente de por lo menos aproximadamente 75 nucleótidos, de manera más preferente de por lo menos aproximadamente 100 nucleótidos, aún de manera más preferente de por lo menos aproximadamente 125 nucleótidos, de manera mucho más preferente de por lo menos aproximadamente 150 nucleótidos. De manera preferente, tal fragmento de la 3'UTR de un gen de albúmina o una variante de la 3'UTR de un gen de albúmina es un fragmento funcional como se describe en lo anterior .

De manera preferente, el por lo menos un elemento 3'UTR de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención comprende o consiste de un "fragmento funcional", una "variante funcional", o un "fragmento funcional de una variante" de la 3'UTR de un gen de albúmina.

De manera preferente, el por lo menos un elemento 3'UTR de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención incrementa la estabilidad de la molécula de ácido nucleico artificial, por ejemplo incrementa la estabilidad de un ARNm de acuerdo con la presente invención, comparado con un ARNm respectivo (ARNm de referencia) que carece de una 3'UTR o que comprende una 3'UTR de referencia, tal como una 3'UTR de origen natural en combinación con el ORF. De manera preferente, el por lo menos un elemento 3'UTR de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención incrementa la estabilidad de la producción de proteínas de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de un ARNm de acuerdo con la presente invención, comparado con un ARNm que carece de una 3'UTR o que comprende una 3'UTR de referencia, tal como una 3'UTR de origen natural en combinación con el ORF. De manera preferente, el por lo menos un elemento 3'UTR de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención prolonga la producción de proteínas de la molécula de ácido nucleico artificial de a de acuerdo con la presente, de un ARNm de acuerdo con la presente invención, comparado con un ARNm respectivo que carece de una 3'UTR o que comprende de una 3'UTR de referencia, tal como una 3'UTR de origen natural en combinación con el ORF. De manera preferente, el por lo menos un elemento 3'UTR de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención incrementa la expresión de proteínas y/o la producción de proteínas de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de un ARNm de acuerdo con la presente invención, comparado con un ARNm respectivo que carece de una 3'UTR o que comprende una 3'UTR de referencia, tal como una 3'UTR de origen natural en combinación con el ORF. De manera preferente, el por lo menos un elemento 3'UTR de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención no influye negativamente en la eficiencia traduccional de un ARNm comparado con la eficiencia traduccional de un ARNm respectivo que carece de una 3'UTR o que comprende una 3'UTR de referencia, tal como una 3'UTR de origen natural en combinación con el ORF. El término "ARNm respectivo" en este contexto significa que - aparte de las 3'UTRs diferentes - el ARNm de referencia es comparable, de manera preferente idéntico, al ARNm que comprende el elemento 3'UTR inventivo.

El término "estabilizar y/o prolongar la producción de proteínas" de una molécula de ácido nucleico artificial tal como un ARNm artificial significa de manera preferente que la producción de proteínas de la molécula de ácido nucleico artificial tal como el ARNm artificial se estabiliza y/o se prolonga comparado con la producción de proteínas de una molécula de ácido nucleico de referencia tal como un ARNm de referencia, por ejemplo que comprende una 3'UTR de referencia o que carece de una 3'UTR, de manera preferente en un sistema de expresión de mamífero, tal como en las células HeLa o HDF. De esta manera, la proteína producida de la molécula de ácido nucleico artificial tal como el ARNm artificial es observable durante un período de tiempo más prolongado que lo que se puede observar para una proteína producida de una molécula de ácido nucleico de referencia. En otras palabras, la cantidad de proteína producida de la molécula de ácido nucleico artificial tal como el ARNm artificial medido a través del tiempo rebaja el valor de umbral en punto de tiempo posterior que la cantidad de la proteína producida de una molécula de ácido nucleico de referencia tal como un ARNm de referencia medido a través del tiempo. Tal valor de umbral puede ser, por ejemplo, la cantidad de proteínas medidas en la fase inicial de expresión, tal como 1, 2, 3, 4, 5, o 6 horas pos inicio de la expresión, tal como post-transfección de la molécula de ácido nucleico (Figura 17).

Por ejemplo, la producción de proteínas de la molécula de ácido nucleico artificial tal como el ARNm artificial - en una cantidad que es por lo menos la cantidad observada en la fase inicial de expresión, tal como 1, 2, 3, 4, 5, o 6 horas post-inicio de expresión, tal como post-transfección de la molécula de ácido nucleico - se prolonga por al menos aproximadamente 5 horas, de manera preferente por al menos aproximadamente 10 horas, de manera más preferente por al menos aproximadamente 24 horas comparada con la producción de proteínas de una molécula de ácido nucleico de referencia, tal como un ARNm de referencia, en un sistema de expresión de mamífero, tal como en células de mamífero, por ejemplo en células HeLa o HDF. De esta manera, la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención permite de manera preferente la producción de proteínas. prolongada en una cantidad que es por lo menos la cantidad observada en la fase inicial de la expresión, tal como 1, 2, 3, 4, 5, o 6 horas post-inicio de expresión, tal con post-transfección, por al menos aproximadamente 5 horas, de manera preferente por al menos aproximadamente 10 horas, de manera más preferente por al menos aproximadamente 24 horas comparada con una molécula de ácido nucleico de referencia que carece de una 'UTR o que comprende una 3'UTR de referencia .

En modalidades preferidas, la producción de proteínas de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención se prolonga por lo menos 1.5 veces, de manera preferente por lo menos 2 veces, de manera más preferente por lo menos 2.5 veces comparada con la producción de proteínas de una molécula de ácido nucleico de referencia que carece de una 3'UTR o que comprende una 3'UTR de referencia .

Este efecto de prolongar la producción de proteínas se puede determinar al (i) medir las cantidades de proteínas, por ejemplo obtenidas por la expresión de un ORF que codifica una proteína reportero tal como luciferasa, de manera preferente un sistema de expresión de mamífero tal como en células HeLa o HDF, a través del tiempo, (ii) determinar en el punto del tiempo en el cual la cantidad de proteínas rebaja la cantidad de proteínas observadas, por ejemplo, a 1, 2, 3, 4, 5, o 6 horas post-inicio de expresión, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, o 6 horas post-transfección de la molécula de ácido nucleico artificial, y (iii) comparar el punto de tiempo en el cual la cantidad de proteínas rebaja la cantidad de proteínas observada en 1, 2, 3, 4, 5, o 6 horas postinicio de expresión al punto de tiempo determinado para una molécula de ácido nucleico que carece de una 3'UTR o que comprende de una 3 'UTR de referencia (Figura 17).

De manera preferente, se logra esté efecto de estabilización y/o prolongación en la producción de proteínas, mientras que la cantidad total de proteínas producidas de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, por ejemplo dentro de un lapso de tiempo de 48 o 72 horas, es por lo menos la cantidad de proteínas producidas de una molécula de ácido nucleico de referencia que carece de una 'UTR o que comprende de una 3'UTR de referencia, tal como una 3'UTR de origen natural con el ORF de la molécula de ácido nucleico artificial.

De esta manera, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico artificial que permite la producción de proteínas prolongada y/o estabilizada en un sistema de expresión de mamífero, tal como en células de mamífero, por ejemplo en células HeLa o HDF, como se específica en lo anterior, en donde la cantidad total de proteína producida de la molécula de ácido nucleico artificial, por ejemplo dentro de un lapso de tiempo de 48 o 72 horas, es por lo menos la cantidad total de la proteína producida, por ejemplo dentro del lapso de tiempo, de una molécula de ácido nucleico de referencia que carece de una 3'UTR o que comprende de una 3'UTR de referencia, tal como una 3'UTR de origen natural con el ORF de la molécula de ácido nucleico artificial.

De esta manera, "expresión de proteína estabilizada" significa de manera preferente que existe una producción de proteínas más uniforme de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención durante un período de tiempo predeterminado, tal como durante 24 horas, de manera más preferente durante 48 horas, aún de manera más preferente durante 72 horas, cuando se compara con una molécula de ácido nucleico de referencia, por ejemplo, un ARNm que comprende una 3'UTR de referencia o que carece de una 3'UTR. Por consiguiente, el nivel de producción de proteínas, por ejemplo en un sistema de mamífero, de la molécula de ácido nucleico artificial que comprende un elemento 3'UTR de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de un ARNm de acuerdo con la presente invención, no baja de manera preferente el grado observado para una molécula de ácido nucleico de referencia, tal como un ARNm de referencia como se describe en lo anterior. Por ejemplo, la cantidad de proteína (codificada por el ORF) observada 6 horas después del inicio de expresión, por ejemplo 6 horas post-transfección de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención en una célula, tal como una célula de mamífero, puede ser comparable con la cantidad de proteína observada 48 horas después del inicio de la expresión, por ejemplo 48 horas post-transfección . De esta manera, la relación de la cantidad de proteína codificada por el ORF, tal como una proteína reportera, por ejemplo, luciferasa, observada 48 horas post-inicio de la expresión, por ejemplo 48 horas post-transfección, la cantidad de proteína observada 6 horas después del inicio de la expresión, por ejemplo 6 horas post-transfección, es de manera preferente por lo menos aproximadamente 0.4, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 0.5, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 0.6, aún de manera más preferente por lo menos aproximadamente 0.7. De manera preferente, la relación de entre aproximadamente 0.4 y aproximadamente 4, de manera preferente entre aproximadamente 0.65 y aproximadamente 3, de manera más preferente entre aproximadamente 0.7 y 2 para una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Para una molécula de ácido nucleico de referencia respectiva, por ejemplo un ARNm que comprende una 'UTR de referencia que carece de una 3'UTR, la relación puede ser, por ejemplo entre aproximadamente 0.05 y aproximadamente 0.3.

De esta manera, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico artificial que compren de un ORF y un elemento 3'UTR como se describe en lo anterior, donde la relación de la cantidad de proteina (reportera), por ejemplo la cantidad de luciferasa, observada 48 horas después del inicio de la expresión a la cantidad de proteina (reportera) observada 6 horas después del inicio de la expresión, de manera preferente en el sistema de expresión de mamífero, tal como en células de mamífero, por ejemplo en células HeLa, es de manera preferente por arriba de aproximadamente 0.4, de manera más preferente por arriba de aproximadamente 0.5, de manera más preferente por arriba de aproximadamente 0.6, aún de manera más preferente por arriba de aproximadamente 0.7, por ejemplo entre aproximadamente 0.4 y aproximadamente 4, de manera preferente entre aproximadamente 0.65 y aproximadamente 3, de manera más preferente entre aproximadamente 0.7 y 2, en donde de manera preferente la cantidad total de proteína producida de la molécula de ácido nucleico artificial, por ejemplo, dentro de un lapso de tiempo de 48 horas, es por lo menos la cantidad total de la proteína producida, por ejemplo dentro del lapso de tiempo, de una molécula de ácido nucleico de referencia que carece de una 3'UTR o que comprende una 'UTR de referencia, tal como una 3'UTR de origen natural con el ORF de la molécula de ácido nucleico artificial. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico artificial que comprende un ORF y un elemento 3'UTR como se describe en lo anterior, donde la relación de la cantidad de proteina (reportera), por ejemplo la cantidad de luciferasa, observada 72 horas después del inicio de la expresión a la cantidad de proteina (reportera) observada 6 horas después del inicio de la expresión, de manera preferente en un sistema de expresión de mamífero tal como en células de mamífero, por ejemplo en células HeLa, es de manera preferente por arriba de aproximadamente 0.4, de manera más preferente por arriba de aproximadamente 0.5, de manera más preferente por arriba de aproximadamente 0.6, aún de manera más preferente por arriba de aproximadamente 0.7, por ejemplo entre aproximadamente 0.4 y 1.5, de manera preferente entre aproximadamente 0.65 y aproximadamente 1.15, de manera más preferente entre aproximadamente 0.7 y 1.0, en donde de manera preferente la cantidad total de proteína producida de la molécula de ácido nucleico artificial, por ejemplo dentro de un lapso de tiempo de 72 horas, es por lo menos la cantidad total de la proteína producida, por ejemplo dentro del lapso de tiempo, de una molécula de ácido nucleico de referencia que carece de una 'UTR o que comprende una 3'UTR de referencia, tal como una 3'UTR de origen natural con el ORF de la molécula de ácido nucleico artificial.

"Expresión de proteina incrementada" en el contexto de la presente invención significa de manera preferente una expresión de proteínas incrementada en un punto de tiempo después del inicio de la expresión comparado con una molécula de referencia. De esta manera, el nivel de proteínas observado en un cierto punto de tiempo después del inicio de la expresión, por ejemplo después de la transfeccion, de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, por ejemplo después de la transfeccion de un ARNm de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, 48 o 72 horas post-transfección, es de manera preferente más alto que el nivel de proteína observada en el mismo punto de tiempo después del inicio de la expresión, por ejemplo después de la transfeccion, de una molécula de ácido nucleico de referencia, tal como un ARNm de referencia que comprende un 3'UTR que carece de una 3'UTR.

"Producción de proteína total incrementada" de una molécula de ácido nucleico artificial se refiere a una producción de proteínas incrementada a través de un lapso de tiempo, en el cual la proteína se produce de una molécula de ácido nucleico artificial, de manera preferente un sistema de expresión de mamífero, tal como en células de mamífero, por ejemplo en células HeLa o HDF. De esta manera, "producción de proteínas total" se refiere de manera preferente al área bajo la curva (AUC) que representa la producción de proteínas a través del tiempo.

El incremento a la estabilidad de la molécula de ácido nucleico artificial, el incremento en la estabilidad de la producción de proteínas, y la prolongación de la producción de proteínas y/o el incremento en la expresión de proteínas y/o la producción de proteínas se determina de manera preferente en comparación con la molécula de ácido nucleico de referencia respectiva que carece de una 3'UTR, por ejemplo una ARNm que carece de una 3'UTR, o una molécula de ácido nucleico de referencia que comprende una 3'UTR de referencia, tal como una 3'UTR de origen natural con el ORF como se describe en lo anterior.

El efecto y eficiencia de estabilización de la producción de ARNm y/o proteínas y/o el efecto y eficiencia de incremento de producción de proteínas de las variantes, fragmentos y/o fragmentos variantes de la 3'UTR de albúmina así como el efecto y eficiencia de estabilización de la producción de ARNm y/o el efecto y eficiencia de incremento de producción de proteínas del por lo menos un elemento 3'UTR de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención se puede determinar por cualquier método adecuado para este propósito conocido por la persona experta. Por ejemplo, se pueden generar moléculas de ARNm artificiales que comprenden una secuencia de codificación para una proteina reportera, tal como luciferasa, y no 3'UTR, una 3'UTR derivada de un gen de origen natural, una 3'UTR derivada de un gen de referencia (es decir, una 3'UTR de referencia, tal como una 3'UTR de origen natural con el ORF) , como una 3'UTR una variante una 3'UTR de un gen de albúmina, como 3'UTR un fragmento de gen de albúmina de origen natural, o como 3'UTR un fragmento de una variante de una 3'UTR de un gen de albúmina. Tales ARNms se pueden generar, por ejemplo, por transcripción in vitro de los vectores respectivos tales como vectores plásmidos, por ejemplo que comprenden un promotor T7 y una secuencia que codifica las secuencias de ARNm respectivas. Las moléculas de ARNm generadas se pueden transfectar en células mediante cualquier método de transfección adecuado para transfectar ARNm, por ejemplo se pueden electroporar en células de mamífero, tales como células HELA, y las muestras se pueden analizar en ciertos puntos de tiempo después de la transfección, por ejemplo, 6 horas, 24 horas, 48 horas, y 72 horas post-transfección . Las muestras se pueden analizar para cantidades de ARNm y/o cantidades de proteínas por los métodos bien conocidos por la persona experta. Por ejemplo, las cantidades de ARNm reportero presentes en las células en los puntos de tiempo de muestra se pueden determinar por los métodos de PCR cuantitativa. Las cantidades de la proteína reportera codificada por lo ARNms respectivos se puede determinar, por ejemplo por ensayos ELISA o ensayos de reporteros tales como ensayos de luciferasa dependiendo de la proteína reportera utilizada. El efecto de estabilizar la expresión de proteínas y/o prolongar la expresión de proteínas se puede, por ejemplo, analizar al determinar la relación de nivel de proteínas observado 48 horas post-transfección y el nivel de proteínas observado 6 horas post-transfección . Mientras es más cercano el valor a uno, es más estable la expresión de proteínas que está dentro de este período de tiempo. Tales mediciones por supuesto también se pueden llevar a cabo a 72 horas o más y la relación del nivel de proteína observado 72 horas post-transfección y el nivel de proteínas observados 6 horas post-transfección se pueden determinar para determinar la estabilidad de la expresión de proteínas.

De manera preferente, el por lo menos un elemento 3'UTR de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención comprende o consiste de una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de por lo menos aproximadamente 40%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 50%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 60%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 70%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 80%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 95%, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 99%, de manera mucho más preferente de 100% a la secuencia de ácido nucleico de una 3'UTR de un gen de albúmina, tal como a la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 34 o SEQ ID No. 35 como se muestra a continuación, en donde las variantes de las secuencias (por ejemplo por lo menos 40% idéntica) son variantes de manera preferente funcionales como se describe en lo anterior: CATCACATTT AAAAGCATCT CAGCCTACCA TGAGAATAAG AGAAAGAAAA TGAAGATCAA AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT TTAATCATTT TGCCTCTTTT CTCTGTGCTT CAATTAATAA AAAATGGAAA GAATCT (SEQ ID No. 1) CAUCACAUUU AAAAGCAUCU CAGCCUACCA UGAGAAUAAG AGAAAGAAAA UGAAGAUCAA AAGCUUAUUC AUCUGUUUUU CUUUUUCGUU GGUGUAAAGC CAACACCCUG UCUAAAAAAC AUAAAUUUCU UUAAUCAUUU UGCCUCUUUU CUCUGUGCUU CAAUUAAUAA AAAAUGGAAA GAAUCU (SEQ ID No. 2) .

AAACATCACA ATTAAGAACA TCTCAGCCTA CCATGAGAAC AAGAGAAATA AAATGAAGAT CAAAAGCTTA TTCATCTGTT TTTCTTTTTC ATTGGTATAA AGCCAACACC CTGTCTAAAA AACTATAAAT TTCTTTAATC ATTTTGCCTC TTTTCTCTGT GCTTCAATTA ATAAAAAATG GAAAGAATCT AGATCTAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA (SEQ ID No . 32) AAACAUCACA AUUAAGAACA UCUCAGCCUA CCAUGAGAAC AAGAGAAAUA AAAUGAAGAU CAAAAGCUUA UUCAUCUGUU UUUCUUUUUC AUUGGUAUAA AGCCAACACC CUGUCUAAAA AACUAUAAAU UUCUUUAAUC AUUUUGCCUC UUUUCUCUGU GCUUCAAUUA AUAAAAAAUG GAAAGAAUCU AGAUCUAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA (SEQ ID No. 33) ACACATCACA ACCACAACCT TCTCAGGCTA CCCTGAGAAA AAAAGACATG AAGACTCAGG ACTCATCTTT TCTGTTGGTG TAAAATCAAC ACCCTAAGGA ACACAAATTT CTTTAAACAT TTGACTTCTT GTCTCTGTGC TGCAATTAAT AAAAAATGGA AAGAATCTAC AGATCTAAAA AAAA (SEQ ID No. 34) ACACAUCACA ACCACAACCU UCUCAGGCUA CCCUGAGAAA AAAAGACAUG AAGACUCAGG ACUCAUCUUU UCUGUUGGUG UAAAAUCAAC ACCCUAAGGA ACACAAAUUU CUUUAAACAU UUGACUUCUU GUCUCUGUGC UGCAAUUAAU AAAAAAUGGA AAGAAUCUAC AGAUCUAAAA AAAA (SEQ ID No. 35) por lo menos un elemento 3'UTR de la molécula ácido nucleico acuerdo con la presente invención puede comprender o consistir de un fragmento de una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad por lo menos aproximadamente 40%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 50%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 60%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 70%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 80%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 95%, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 99%, de manera mucho más preferente de 100% a la secuencia de ácido nucleico de la 3'UTR de un gen de albúmina, tal como a la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 34 o SEQ ID No. 35, en donde el fragmento es de manera preferente un fragmento funcional o un fragmento variante funcional como se describe en lo anterior. Tal fragmento muestra de manera preferente una longitud de por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos, de manera preferente por lo menos aproximadamente 75 nucleótidos, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 100 nucleótidos, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 125 nucleótidos, de manera mucho más preferente por lo menos aproximadamente 150 nucleótidos.

Por ejemplo, tal fragmento puede mostrar una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID Nos. 18-30, tal como AAAAGCATCT CAGCCTACCA TGAGAATAAG AGAAAGAAAA TGAAGATCAA AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT TTAATCATTT TGCCTCTTTT CTCTGTGCTT CAATT (SEQ ID No. 18) CATCACATTT AAAAGCATCT CAGCCTACCA TGAGAATAAG AGAAAGAAAA TGAAGATCAA AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG (SEQ ID No. 19) AAAAGCATCT CAGCCTACCA TGAGAATAAG AGAAAGAAAA TGAAGATCAA AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC (SEQ ID No. 20) CAGCCTACCA TGAGAATAAG AGAAAGAAAA TGAAGATCAA AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT (SEQ ID No. 21) TGAGAATAAG AGAAAGAAAA TGAAGATCAA AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT TTAATCATTT (SEQ ID No. 22) AGAAAGAAAA TGAAGATCAA AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT TTAATCATTT TGCCTCTTTT (SEQ ID No. 23) TGAAGATCAA AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT TTAATCATTT TGCCTCTTTT CTCTGTGCTT (SEQ ID No. 24) AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT TTAATCATTT TGCCTCTTTT CTCTGTGCTT CAATTAATAA (SEQ ID No. 25) ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT TTAATCATTT TGCCTCTTTT CTCTGTGCTT CAATTAATAA AAAATGGAAA (SEQ ID No. 26) CAGCCTACCA TGAGAATAAG AGAAAGAAAA TGAAGATCAA AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT TTAATCATTT TGCCTCTTTT CTCTGTGCTT CAATTAATAA A (SEQ ID No. 27) TGAAGATCAA AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT TTAATCATTT TGCCTCTTTT CTCTGTGCTT CAATTAATAA A (SEQ ID No. 28) CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT TTAATCATTT TGCCTCTTTT CTCTGTGCTT CAATTAATAA A (SEQ ID No. 29) AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC (SEQ ID No. 30) o la secuencia de ARN correspondiente, o una secuencia de ácido nucleico que es por lo menos 40%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 50%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 60%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 70%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 80%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 95%, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 99% idéntica a las secuencias de ácido nucleico o la secuencia de ARN correspondiente. De esta manera, el por lo menos un elemento 3'UTR de la molécula de ácido nucleico acuerdo con la presente invención puede comprender o consistir de un fragmento de ácido nucleico como se determina en lo anterior. Obviamente, los nucleótidos de timidina comprendidos en los fragmentos de acuerdo con SEQ ID No. 18-30 se pueden reemplazar de nucleótidos de uridina.

De manera preferente, las variantes, fragmentos o fragmentos variantes son variantes funcionales, fragmentos funcionales o fragmentos variantes funcionales como se describe en lo anterior, que muestran por lo menos una función de la secuencia de ácido nucleico acuerdo con SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 34 o SEQ ID No. 35, tal como la estabilización de la molécula de ácido nucleico acuerdo con la invención, estabilizar y/o prolongar la expresión de proteínas de la molécula de ácido nucleico acuerdo con la invención, e/o incrementar la producción de proteínas, de manera preferente con una eficiencia de por lo menos 40%, de manera más preferente de por lo menos 50%, de manera más preferente de por lo menos 60%, de manera aún más preferente de por lo menos 70%, de manera aún más preferente de por lo menos 80%, de manera mucho más preferente de por lo menos 90% de la estabilización de la eficiencia y/o producción de proteínas que incrementa la eficiencia mostrada por la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID No. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 34 o SEQ ID No. 35.

De manera preferente, el por lo menos un elemento 3'UTR de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención muestra una longitud de por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos, de manera preferente por lo menos aproximadamente 75 nucleótidos, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 100 nucleótidos, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 125 nucleótidos, de manera mucho más preferente por lo menos aproximadamente 150 nucleótidos. Por ejemplo, el elemento 3'UTR puede mostrar una longitud de aproximadamente 50 a aproximadamente 300 nucleótidos, de manera preferente de aproximadamente 100 a aproximadamente 250 nucleótidos, de manera más preferente de aproximadamente 150 a aproximadamente 200 nucleótidos.

Adicionalmente , la molécula de ácido nucleico artificial acuerdo con la presente invención puede comprender más de un elemento 3'UTR como se describe en lo anterior. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico artificial acuerdo con la presente invención puede comprender uno, dos, tres, cuatro o más elementos 3'UTR, en donde los elementos 3'UTR individuales pueden ser los mismos o pueden ser diferentes. por ejemplo, la molécula de ácido nucleico artificial acuerdo con la presente invención puede comprender dos elementos 3'UTR esencialmente idénticos como se describe en lo anterior, por ejemplo dos elementos 3'UTR que comprenden o consisten de una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen de albúmina o de una variante de la 3'UTR de un gen de albúmina, tal como una secuencia de ácido nucleico acuerdo con SEQ ID No. 1, 2, 32, 33, 34 o 35, variantes funcionales de los mismos, fragmentos funcionales de los mismos, o fragmentos variantes funcionales de los mismos como se describe en lo anterior.

Sorprendentemente, los inventores descubrieron que una molécula de ácido nucleico artificial que comprende una 3'UTR como se describe en lo anterior puede representar o puede proporcionar una molécula de ARNm que permite la producción de proteínas prolongada y/o estabilizada. De esa manera, una 3'UTR como se describe en la presente puede mejorar la estabilidad de la expresión de proteínas de una molécula de ARNm y/o mejorar la eficiencia traduccional.

La molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención puede ser ARN, tal como ARNm, ADN, tal como un vector de ADN, o puede ser una molécula de ARN o ADN modificada. Se puede proporcionar como una molécula de doble hebra que tiene una hebra de sentido y una hebra anti-sentido, por ejemplo como una molécula de ADN que tiene una hebra de sentido y una hebra anti-sentido .

El ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención puede comprender además opcionalmente una 5'UTR y/o una tapa 5'. La tapa 5' opcional y/o la 5'UTR se sitúan de manera preferente 5' al ORF dentro de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención.

De manera preferente, la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención comprende además una secuencia poli (A) y/o una señal de poliadenilacion. De manera preferente, la secuencia poli (A) opcional se sitúa 3' al por lo menos un elemento 3'UTR, de manera preferente se conecta al extremo 3' del elemento 3'UTR. La conexión puede ser directa o indirecta, por ejemplo, a través de un estiramiento de 2, 4, 6, 8, 10, 20 etc. nucleótidos, tal como a través de un ligador de 1-50, de manera preferente de 1-20 nucleótidos, por ejemplo que comprende o consiste de uno o más sitios de restricción.

En una modalidad, la señal de poliadenilacion opcional se sitúa dentro del elemento 3'UTR. De manera preferente, la señal de poliadenilacion comprende la secuencia consenso NN ( U/T ) ANA, con N = A o U, de manera preferente AA ( U/T ) AAA o A(U/T) (U/T) AAA. Tal secuencia consenso se puede reconocer por la mayoría de sistemas de células animales y bacterianas, por ejemplo por los factores de poliadenilacion, tal como factor de especificidad de escisión/poliadenilación (CPSF) que cooperan con CstF, PAP, PAB2, CFI y/o CFII. De manera preferente, la señal de poliadenilacion, de manera preferente la secuencia consenso NNUANA, se sitúa menor que aproximadamente 50 nucleótidos, de manera más preferente menor que aproximadamente 30 bases, de manera mucho más preferente menor que aproximadamente 25 bases, por ejemplo 21 bases, cadena arriba del extremo 3' del elemento 3'UTR.

La transcripción de una molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una molécula de ADN artificial, que comprende una señal de poliadenilación con el elemento 3'UTR dará por resultado un ARN prematuro que contiene la señal de poliadenilación en su elemento 3'UTR. Por ejemplo, la transcripción de una molécula de ADN que comprende un elemento 3'UTR de acuerdo con SEQ ID No. 1 CATCACATTT AAAAGCATCT CAGCCTACCA TGAGAATAAG AGAAAGAAAA TGAAGATCAA AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT TTAATCATTT TGCCTCTTTT CTCTGTGCTT CAATTAATAA AAAATGGAAA GAATCT (SEQ ID No. 1) dará por resultado un ARN que tiene un elemento 3'UTR de acuerdo con la secuencia CAUCACAUUU AAAAGCAUCU CAGCCUACCA UGAGAAUAAG AGAAAGAAAA UGAAGAUCAA AAGCUUAUUC AUCUGUUUUU CUUUUUCGUU GGUGUAAAGC CAACACCCUG UCUAAAAAAC AUAAAUUUCU UUAAUCAUUU UGCCUCUUUU CUCUGUGCUU CAAUUAAUAA AAAAUGGAAA GAAUCU (SEQ ID No. 2) .

Utilizando un sistema de transcripción apropiado entonces conducirá a la unión de una secuencia poli (A) al ARN prematuro. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico artificial inventiva puede ser una molécula de ADN que comprende un elemento 3'UTR como se describe en lo anterior y una señal de poliadenilación, que puede dar por resultado la poliadenilación de un RNA en la transcripción de esta molécula de ADN. Por consiguiente, una ARN resultante puede comprender una combinación del elemento 3'UTR inventivo seguido por una secuencia poli (A) .

Los sistemas de transcripción potenciales so los sistemas de transcripción in vitro o sistemas de transcripción celulares etc. Por consiguiente, la transcripción de una molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la invención, por ejemplo transcripción de una molécula de ácido nucleico artificial que comprende un marco de lectura abierto, un elemento 3'UTR y una señal de poliadenilación, puede dar por resultado una molécula de ARNm que comprende un marco de lectura abierto, un elemento 3'UTR y una secuencia poli (A) .

Por consiguiente, la invención también proporciona una molécula de ácido nucleico artificial que es una molécula de ARNm que comprende un marco de lectura abierto, como un elemento 3'UTR como se describe en lo anterior y una secuencia poli (A) .

En una modalidad, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico artificial que es una molécula de ADN artificial que comprende un marco de lectura abierto y una secuencia de acuerdo con SEQ ID No. 1 o una secuencia que tiene una identidad de por lo menos aproximadamente 40% o más a SEQ ID No. 1 o un fragmento de la misma como se describe en lo anterior. Adicionalmente , la invención proporciona una molécula de ácido nucleico artificial que es una molécula de ADN artificial que comprende un marco de lectura abierto y una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO. 2 o una secuencia que tiene una identidad de por lo menos aproximadamente 40% o más a SEQ ID No. 2 o un fragmento de la mima como se describe en lo anterior.

En una modalidad adicional, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico artificial que es una molécula de ADN artificial que comprende un marco de lectura abierto y una secuencia de acuerdo con SEQ ID No. 32 o una secuencia que tiene una identidad de por lo menos aproximadamente 40% o más a SEQ ID No. 32 o un fragmento de la misma como se describe en lo anterior. Adicionalmente, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico artificial que es una molécula de ARN artificial que comprende un marco de lectura abierto y una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO. 33 o una secuencia que tiene una identidad de por lo menos aproximadamente 40% o más a SEQ ID No. 33 o un fragmento de la misma como se describe en lo anterior.

Adicionalmente, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico artificial que es una molécula de ADN artificial que comprende un marco de lectura abierto y una secuencia de acuerdo con SEQ ID No. 34 o una secuencia que tiene una identidad de por lo menos aproximadamente 40% o más a SEQ ID No. 34 o un fragmento de la misma como se describe en lo anterior. Adicionalmente, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que es una molécula de ARN artificial que comprende un marco de lectura abierto y una secuencia de acuerdo con SEQ ID NO. 35 o una secuencia que tiene una identidad de por lo menos aproximadamente 40 % o más a SEQ ID No. 35 o un fragmento de la misma como se describe en lo anterior.

Por consiguiente, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que puede ser una plantilla para una molécula de ARN, de manera preferente para una molécula de ARNm, que es estabiliza y optimiza con respecto a la eficiencia de traducción. En otras palabras, la molécula de ácido nucleico artificial puede ser un ADN o ARN que se puede utilizar para la producción de un ARNm. El ARNm obtenible, puede, a su vez se ha traducido para la producción de un péptido o proteina deseada codificada por el marco de lectura abierto. Si la molécula de ácido nucleico artificial es un ADN, puede, por ejemplo, ser utilizado como una forma de almacenamiento de doble hebra para la producción in vitro o in vivo continuada y respectiva del ARNm.

En una modalidad, la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención comprende además una secuencia poli (A) . La longitud de la secuencia poli (A) puede variar. Por ejemplo, la secuencia poli (A) puede tener una longitud de aproximadamente 20 nucleótidos de adenina hasta aproximadamente 300 nucleótidos de adenina, de manera preferente de aproximadamente 40 a aproximadamente 200 nucleótidos de adenina, de manera más preferente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 nucleótidos de adenina, tal como aproximadamente 60, 70, 80, 90 o 100 nucleótidos de adenina.

Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención puede comprender una secuencia de ácido nucleico que corresponde a las secuencias de ADN.

CATCACATTT AAAAGCATCT CAGCCTACCA TGAGAATAAG AGAAAGAAAA TGAAGATCAA AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT TTAATCATTT TGCCTCTTTT CTCTGTGCTT CAATTAATAA AAAATGGAAA GAATCTAGAT CTAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA (SEQ ID No. 3) , AAACATCACA ATTAAGAACA TCTCAGCCTA CCATGAGAAC AAGAGAAATA AAATGAAGAT CAAAAGCTTA TTCATCTGTT TTTCTTTTTC ATTGGTATAA AGCCAACACC CTGTCTAAAA AACTATAAAT TTCTTTAATC ATTTTGCCTC TTTTCTCTGT GCTTCAATTA ATAAAAAATG GAAAGAATCT AGATCTAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA (SEQ ID No. 36) o ACACATCACA ACCACAACCT TCTCAGGCTA CCCTGAGAAA AAAAGACATG AAGACTCAGG ACTCATCTTT TCTGTTGGTG TAAAATCAAC ACCCTAAGGA ACACAAATTT CTTTAAACAT TTGACTTCTT GTCTCTGTGC TGCAATTAAT AAAAAATGGA AAGAATCTAC AGATCTAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA (SEQ ID No. 38) La transcripción de tales secuencias puede dar por resultado moléculas de ácido nucleico artificiales que comprenden las secuencias CAUCACAUUU AAAAGCAUCU CAGCCUACCA UGAGAAUAAG AGAAAGAAAA UGAAGAUCAA AAGCUUAUUC AUCUGUUUUU CUUUUUCGUU GGUGUAAAGC CAACACCCUG UCUAAAAAAC AUAAAUUUCU UUAAUCAUUU UGCCUCUUUU CUCUGUGCUU CAAUUAAUAA AAAAUGGAAA GAAUCUAGAU CUAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA (SEQ ID No. ) , AAACAUCACA AUUAAGAACA UCUCAGCCUA CCAUGAGAAC AAGAGAAAUA AAAUGAAGAU CAAAAGCUUA UUCAUCUGUU UUUCUUUUUC AUUGGUAUAA AGCCAACACC CUGUCUAAAA AACUAUAAAU UUCUTTAATC ATTTTGCCTC TTTTCTCTGT GCTTCAATTA ATAAAAAATG GAAAGAATCT AGATCTAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA (SEQ ID No. 37 ) O ACACAUCACA ACCACAACCU UCUCAGGCUA CCCUGAGAAA AAAAGACAUG AAGACUCAGG ACUCAUCUUU UCUGUUGGUG UAAAAUCAAC ACCCUAAGGA ACACAAAUUU CUUUAAACAU UUGACUUCUU GUCUCUGUGC UGCAAUUAAU AAAAAAUGGA AAGAAUCUAC AGAUCUAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA (SEQ ID No. 39) Tales moléculas de ARn artificial, es decir las moléculas de ácido nucleicos artificiales que comprenden una secuencia de acuerdo con SEQ ID No. 4, 37 o 39 también pueden ser obtenibles in vitro por métodos comunes de síntesis química sin ser transcriptos necesariamente de un progenitor de ADN.

En una modalidad particularmente preferida, la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención es una molécula de ARN, de manera preferente una molécula de ARNm que comprende en la dirección 5' a 3' o uh marco de lectura abierto, como un elemento 3'UTR como se describe en lo anterior y una secuencia poli (A) .

En una modalidad preferida, el marco de lectura abierto no codifica la albúmina, particularmente no la albúmina humana, albúmina de ratón o la albúmina de Olive baboon, con la condición de que el elemento 3'UTR sea idéntico a la 3'UTR de la albúmina humana, albúmina de ratón o albúmina de Olive baboon, respectivamente. En algunas modalidades adicionales, puede ser preferido si el marco de lectura abierto o codifique la albúmina humana de acuerdo con el número de Aceso de GenBank NM_000477.5 con la condición de que el elemento 3'UTR sea idéntico a la 3'UTR de la albúmina humana. En algunas modalidades adicionales, puede ser preferido si el marco de lectura abierto no codifica la albúmina o variantes de la misma que el elemento 3'UTR es una secuencia que es idéntica a SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 34 o SEQ ID No. 35. Adicionalmente, en algunas modalidades se prefiere que el marco de lectura abierto no codifique el factor IX humano o una proteina reportera, por ejemplo, seleccionada del grupo que consiste de proteínas globina, (particularmente beta-globína ) , proteínas luciferasa, proteínas GFP, o variantes de las mismas, por ejemplo, variantes que muestran por lo menos 70% de identidad de secuencia a una proteína globina, una proteína luciferasa, o una proteína GFP. Adicionalmente, en modalidades específicas se prefiere que el marco de lectura abierto no contenga un intrón, particularmente en el caso en que el marco de lectura abierto codifique el factor IX humano .

En una modalidad, la invención proporciona una molécula de ADN artificial que comprende un marco de lectura abierto, de manera preferente un marco de lectura abierto que codifica un péptido o proteina diferente a la albúmina; un elemento 3'UTR que comprende o consiste de una secuencia que tiene por lo menos aproximadamente 60%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 70%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 80%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 95%; de manera aún más preferente por lo menos 99%; de manera aún más preferente 100% de identidad de secuencia a SEQ ID No. 1, 32 o 34; y una señal de poliadenilación y/o una secuencia poli (A) . Adicionalmente, la invención proporciona una molécula de ADN artificial que comprende un marco de lectura abierto, de manera preferente un marco de lectura abierto que codifica cualquier péptido o proteina diferente a la albúmina; un elemento 3'UTR que comprende o consiste de una secuencia que tiene por lo menos aproximadamente 60%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 70%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 80%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 95%; de manera aún más preferente por lo menos 99%; de manera aún más preferente 100% de identidad de secuencia a SEQ ID No. 3, 36 o 38.

Adicionalmente, la invención proporciona una molécula de ARN artificial, de manera preferente una molécula de ARNm artificial o una molécula de ARN viral artificial, que comprende un marco de lectura abierto, de manera preferente un marco de lectura abierto que codifica un péptido o proteina diferente a la albúmina; un elemento 3'UTR que comprende o consiste de una secuencia que tiene por lo menos aproximadamente 60%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 70%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 80%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 95%; de manera aún más preferente por lo menos 99%; de manera aún más preferente 100% de identidad de secuencia a SEQ ID No. 2, 33 o 35; y una señal de poliadenilación y/o una secuencia poli (A) . Adicionalmente, la invención proporciona una molécula de ARN artificial, de manera preferente una molécula de ARNm artificial o una molécula de ARN viral artificial, que comprende un marco de lectura abierto, de manera preferente un marco de lectura abierto que codifica un péptido o proteina diferente a a la albúmina; un elemento 3'UTR que comprende o consiste de una secuencia que tiene por lo menos aproximadamente 60%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 70%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 80%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 95%; de manera aún más preferente por lo menos 99%; de manera aún más preferente 100% de identidad de secuencia a SEQ ID No. 4, 37 o 39.

La invención proporciona una molécula de ácido nucleico artificial, de manera preferente un ARNm artificial, que se puede caracterizar por la estabilidad mejorada y la expresión prolongada del péptido o proteina codificada. Sin que se limite por ninguna teoria, la estabilidad mejorada de la expresión de proteínas y de esta manera la expresión de proteínas prolongada puede resultar de la reducción en la degradación de la molécula de ácido nucleico artificial, tal como una molécula de ARNm artificial acuerdo con la presente invención. Por consiguiente, el elemento 3'UTR inventivo puede prevenir al ácido nucleico artificial de la degradación y deterioro.

En algunas modalidades, se prefiere que el elemento 3'UTR consista de un tallo-asa de histona, de manera preferente no comprende un tallo-asa de histona. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención no comprende un tallo-asa de histona. Sin embargo, en algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico artificial puede comprender un tallo-asa de histona además de la secuencia de ácido nucleico derivada de la 3'UTR de un gen de albúmina. Tal molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, puede comprender en la dirección 5' a 3' un ORF, un elemento 3'UTR inventivo, de manera preferente que comprende una señal de poliadenilación, un tallo-asa de histona opcional y una secuencia poli (A) opcional. También puede comprender en la dirección 5' a 3' un ORF, un elemento 3'UTR inventivo, por ejemplo que comprende una señal de poliadenilación, una secuencia poli (A) y un tallo-asa de histona opcional.

En el contexto de la presente invención, tal tallo-asa de histona se deriva típicamente de un gen de histona y comprende un apareamiento base intramolecular de secuencias complementarias total o parcialmente inversas vecinas, formando de esta manera un tallo-asa. Un tallo-asa puede presentarse en el ADN de hebra individual o, más comúnmente, en el ARN . La estructura también es conocida como un tallo-asa de horquilla y consiste usualmente de un tallo y una asa (terminal) dentro de una secuencia consecutiva, en donde el tallo se forma por dos secuencias complementarias total o parcialmente inversas vecinas separadas por una secuencia corta como una especie de espaciador, que construye el asa de la estructura de tallo-asa. Las dos secuencias complementarias total o parcialmente inversas vecinas se pueden definir como por ejemplo elementos de tallo-asa tallo 1 y tallo 2. El tallo-asa se forma cuando las dos secuencias complementarias total o parcialmente inversas vecinas, por ejemplo elementos de tallo-asa tallo 1 y tallo 2, forman pares bases entre si, conduciendo a una secuencia de ácido nucleico de doble hebra que comprende una asa no pareada en su extremo terminal formado por una secuencia corta situada entre los elementos de tallo-asa tallo 1 y tallo 2 en la secuencia consecutiva. El asa no pareada representa típicamente de esta manera una región del ácido nucleico que no es capaz del apareamiento base con cualquiera de estos elementos de tallo-asa. La estructura en forma de paleta resultante es un bloque de construcción clave de muchas estructuras secundarias de ADN . La formación de una estructura de tallo-asa de esta manera es dependiente en la estabilidad de las regiones de tallo y asa resultantes, en donde el primer requisito es típicamente la presencia de una secuencia que se puede replegar sobre sí mismo para formar una doble hebra pareada. La estabilidad de los elementos de tallo-asa pareados se determina por la longitud, el número de no coincidencias o protuberancias que contienen (un número pequeño de no coincidencias es típicamente tolerable, especialmente en una doble hebra larga) , y la composición base de la región pareada. En el contexto de la presente invención, la longitud de asa óptima es 3-10 bases, de manera más preferente 3 a 8, 3 a 7, 3 a 6 o de manera aún más preferente de 4 a 5 bases, y de manera mucho más preferente 4 bases .

Un ejemplo para una secuencia de tallo-asa de histona es la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO: 31 (CAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCA) o la secuencia de ARB correspondiente.

De esta manera, en algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención comprende (a.) por lo menos un elemento 5'UTR como se describe en la presente, (b.) por lo menos un marco de lectura abierto, y por lo menos un tallo-asa de histona que puede, por ejemplo, comprender o consistir de una secuencia que tiene una identidad de secuencia de por lo menos aproximadamente 75%, de manera preferente de por lo menos aproximadamente 80%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 85%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 95% a la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO. 31 o la secuencia de ARN correspondiente, en donde de manera preferente las posiciones 6, 13 y 20 de la secuencia que tiene una identidad de secuencia de por lo menos aproximadamente 75%, de manera preferente de por lo menos aproximadamente 80%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 85%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 95% a la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO. 31 o se conserva la secuencia de ARN correspondiente, es decir son idénticas a los nucleótidos en las posiciones 6, 13 y 20 de SEQ ID NO. 31.

En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico artificial comprende elementos adicionales tales como una tapa 5', una secuencia poli(C) y/o una porción IRES. Una tapa 5' se puede agregar post-transcripcionalmente al extremo 5' de un ARN. Además, la molécula de ácido nucleico artificial inventiva, particularmente si el ácido nucleico está en la forma de un ARN o codifica un ARNm, se puede modificar por una secuencia de por lo menos 10 citidinas, de manera preferente por lo menos 20 citidinas, de manera más preferente por lo menos 30 citidinas (asi llamada "secuencia poli(C)"). Particularmente, la molécula de ácido nucleico inventiva puede contener, especialmente si el ácido nucleico está en la forma de un ARN (m) o codifica un ARNm, una secuencia poli(C) de típicamente aproximadamente 10 a 200 nucleótidos de citidina, de manera preferente aproximadamente 10 a 100 nucleótidos de citidina, de manera más preferente aproximadamente 10 a 70 nucleótidos de citidina o de manera aún más preferente aproximadamente 20 a 50 o aún de 20 a 30 nucleótidos de citidina. De esta manera, de manera preferente la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención comprende, de manera preferente en la dirección 5' a 3' , un ORF, por lo menos un elemento 3'UTR como se describe en lo anterior, una secuencia poli (A) o una señal de poliadenilación, y una secuencia poli (C) .

Una secuencia lateral de entrada de ribosoma interna (IRES) o porción IRES puede separar varios marcos de lectura abiertos, por ejemplo si la molécula de ácido nucleico artificial codifica dos o más péptidos o proteínas, una secuencia IRES puede ser particularmente útil si el ARNm es ARN a bi o multicistrónico .

Adicionalmente, la molécula de ácido nucleico artificial puede comprender elementos 5' adicionales, de manera preferente una 5'UTR, un promotor, o una 5'UTR y una secuencia que contiene un promotor. El promotor puede conducir y o regular la transcripción de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, por ejemplo de una molécula de ADN de acuerdo con la presente invención. Adicionalmente, la 5'UTR puede interactuar con el elemento 3'UTR inventivo y de esta manera puede soportar el efecto de estabilización del elemento 3'UTR inventivo. Tales elementos pueden soportar adicionalmente la estabilidad y eficiencia traduccional . Por consiguiente, en algunas modalidades, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico artificiales, de manera preferente moléculas ARNm, que comprenden en la dirección 5' a 3' por lo menos una de las siguientes estructuras. tapa 5' - 5'UTR - ORF - elemento 3'UTR- tallo-asa de histona - secuencia poli (A) tapa 5' - 5'UTR - ORF - elemento 3'UTR- secuencia poli (A) - tallo-asa de histona tapa 5' - 5'UTR - ORF - IRES - ORF - elemento 3'-UTR -tallo-asa de histona - secuencia poli (A) tapa 5' - 5'UTR - ORF - IRES - ORF - elemento 3'-UTR -tallo-asa de histona - secuencia poli (A) - secuencia poli(C) tapa 5' - 5'UTR - ORF - IRES - ORF - elemento 3'UTR-secuencia poli (A) - tallo-asa de histona tapa 5' - 5'UTR - ORF - IRES - ORF - elemento 3'UTR-secuencia poli (A) - secuencia poli(C)- tallo-asa de histona tapa 5' - 5'UTR - ORF - elemento 3'UTR- secuencia poli (A) - secuencia poli (C) tapa 5' - 5'UTR - ORF - elemento 3'UTR - secuencia poli (A) - secuencia poli(C)- tallo-asa de histona De manera preferente, la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, de manera preferente el marco de lectura abierto, es por lo menos parcialmente modificado con G/C. De esta manera, la molécula de ácido nucleico y artificial inventiva se puede estabilizar termodinámicamente al modificar el contenido de G (guanosina) /C (citidina) de la molécula. El contenido G/C del marco de lectura abierto de una molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención se puede incrementar comparado con el contenido G/C del marco de lectura abierto de una secuencia de tipo natural correspondiente, de manera preferente al utilizar la degeneración del código genético. De esta manera, la secuencia de aminoácidos codificada de la molécula de ácido nucleico es de manera preferente no modificada por la modificación G/C comparada con la secuencia de aminoácidos codificada de la secuencia de tipo natural particular. Los codones de una secuencia de codificación o una molécula de ácido nucleico entera, por ejemplo un ARNm, por lo tanto se puede variar comparado con la secuencia de codificación de tipo natural, tal que incluyen una cantidad incrementada de nucleótidos G/C mientras que la secuencia de aminoácidos traducidas se mantiene. Con respecto al hecho de que varios codones codifican uno y el mismo aminoácido (asi llamado degeneración del código genético) , los codones más favorables para la estabilidad se pueden determinar (asi llamado el uso del codón alternativo) .

Dependiendo del aminoácido que se codifica por la región de codificación de la molécula de ácido nucleico inventiva como se define en la presente, existen varias posibilidades para la modificación de la secuencia de ácido nucleico, por ejemplo el marco de lectura abierto, comparado con su región de codificación de tipo natural. En el caso de los aminoácidos que se codifican por los codones que contienen exclusivamente nucleótidos G o C, no es necesaria modificación del codón. De esta manera, los codones para Pro (CCC o CCG) , Arg (CGC o CGG) , Ala (GCC o GCG) y Gly (GGC o GGG) no requieren modificación, puesto que ninguna A o U/T están presentes.

En contraste, los codones que contienen nucleótidos A y/o U/T se pueden modificar por la sustitución de otros codones que codifican los mismos aminoácidos pero no contienen A y/o U/T. Por ejemplo los codones para Pro se pueden modificar de CC(U/T) o CCA a CCC o CCG; los codones para Arg se pueden modificar de CG(U/T) o CGA o AGA o AGG a CGC o CGG; los codones para Ala se pueden modificar de GC(U/T) o GCA a GCC o GCG; los codones parar Gly se pueden modificar de GG(U/T) o GGA a GGC o GGG.

En otros casos, aunque los nucleótidos A o (U/T) no se pueden eliminar de los codones, sin embargo, es posible disminuir el contenido de A y (U/T) al utilizar codones que contienen un contenido más bajo de nucleótidos A y/o (U/T) . Ejemplos de estos son: Los codones parar Phe se pueden modificar de (U/T) (U/T) (U/T) a (U/T) (U/T)C; los codones parar Leu se pueden modificar de (U/T) (U/T)A, (U/T) (U/T)G, C(U/T) (U/T) o C(U/T)A a C(U/T)C o C(U/T)G; los codones parar Ser se pueden modificar de (U/T) C (U/T) o (U/T)CA o AG(U/T) a (U/T)CC, (U/T)CG o AGC; el codón para Tyr se pueden modificar de (U/T)A(U/T) a (U/T)AC; el codón para Cys se pueden modificar de (U/T) G (U/T) a (U/T)GC; el codón para His se pueden modificar de CA(U/T) a CAC; el codón para Gln se pueden modificar de CAA a CAG; los codones parar lie se pueden modificar de A(U/T) (U/T) o A(U/T)A a A(U/T)C; los codones parar Thr se pueden modificar de AC(U/T) o ACA a ACC o ACG; el codón para Asn se pueden modificar de AA(U/T) a AAC; el codón para Lys se pueden modificar de AAA a AAG; los codones parar Val se pueden modificar de G(U/T) (U/T) o G(U/T)A a G(U/T)C o G(U/T)G; el codón Asp se pueden modificar de GA(U/T) a GAC; el codón para Glu se pueden modificar de GAA a GAG; el codón de detección (U/T)AA se puede modificar a (U/T)AG o (U/T)GA.

En el caso de los codones parar et (A(U/T)G) y Trp ((U/T)GG), por otra parte, no existe posibilidad de modificación de secuencia sin alterar la secuencia de aminoácidos codificada.

Las sustituciones listadas en lo anterior se pueden utilizar ya sea individualmente o en todas las combinaciones posibles para incrementar el contenido G/C del marco de lectura abierto de la secuencia de ácido nucleico inventiva como se define en la presente, comparada con su marco de lectura abierto de tipo natural particular (es decir la secuencia original). De esta manera, por ejemplo, todos los codones para Thr que se presentan en la secuencia de tipo natural se pueden modificar a ACC (o ACG) .

De manera preferente, el contenido de G/C del marco de lectura abierto de la molécula de ácido nucleico artificial inventiva como se define en la presente se incrementa por al menos 7%, de manera más preferente por lo menos 15%, particularmente de manera preferente por lo menos 20%, comparado con el contenido G/C de la región de codificación de tipo natural. De acuerdo con una modalidad especifica por lo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, de manera más preferente por lo menos 70%, de manera aún más preferente por lo menos 80% y de manera mucho más preferente por lo menos 90%, 95% o aún 100% de los codones sustituibles en el marco de lectura abierto de la molécula de ácido nucleico artificial inventiva o un fragmento, variante o derivado del mismo se sustituyen, incrementado de esta manera el contenido de G/C del marco de lectura abierto.

En este contexto, es particularmente preferible incrementar el contenido de G/C del marco de lectura abierto de la secuencia de ácido nucleico inventiva como se define en la presente, al máximo (es decir 100% de los codones sustituibles), comparado con el marco de lectura abierto de tipo natural, sin alterar la secuencia de aminoácidos codificados .

Adicionalmente , el marco de lectura abierto es de manera preferente por lo menos parcialmente utilizado con codón. La optimización con codón se basa en el descubrimiento de que la eficiencia de traducción se puede determinar por una frecuencia diferente en la ocurrencia de los ARNs de transferencia (ARNts) en las células. De esta manera, si los asi llamados "codones raros" están presentes en la región de codificación de la molécula de ácido nucleico artificial inventiva como se define en la presente, a un grado incrementado, la traducción a la secuencia de ácido nucleico modificada correspondiente es menos eficiente que en el caso donde los codones que codifican los ARNts relativamente "frecuente" están presentes.

De esta manera, el marco de lectura abierto de la secuencia de ácido nucleico inventiva se modifica de manera preferente comparada con la región de codificación de tipo natural correspondiente tal que por lo menos un codón de la secuencia de tipo natural que codifica un ARNt que es relativamente raro en las células se intercambia por un codón que codifica un ARNt que es comparablemente frecuente en la célula y lleva el mismo aminoácido como el ARNt relativamente raro. Mediante esta modificación, el marco de lectura abierto de la molécula de ácido nucleico artificial inventivo como se define en la presente, se modifica tal que los codones por los cuales los ARNts que se presentan frecuentemente están disponibles pueden reemplazar los codones que corresponden a los ARNts raros. En otras palabras, de acuerdo con la invención, mediante tal modificación todos los codones del marco de lectura abierto de tipo natural que codifica un ARNts se puede intercambiar por un codón que codifica un ARNt que es más frecuente en la célula y que lleva el mismo aminoácido como el ARNt raro. Los ARBts que se presentan relativamente de manera frecuente en la célula y que, en contraste, se presentan relativamente de manea rara son conocidos por una persona experta en el campo; comparar, por ejemplo Akashi, Curr. Opin. Genet . Dev. 2001, 11(6): 660-666. Por consiguiente, de manera preferente, el marco de lectura abierto se optimiza con codón, de manera preferente con respecto al sistema en el cual la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se va a expresar, de manera preferente con respecto al sistema en el cual la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se va a traducir. De manera preferente, el uso de codón del marco de lectura abierto se optimiza con codón de acuerdo con el uso de codón de mamífero, de manera más preferente de acuerdo con el uso de codón humano. De manera preferente, el marco de lectura abierto se optimiza con codón y se modifica el contenido de G/C.

Para mejorar adicionalmente la resistencia a la degradación, por ejemplo resistencia a una degradación in vivo por una exo- o endonucleasa, y/o para mejorar adicionalmente la producción de proteínas de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, la molécula de ácido nucleico artificial puede comprender además modificaciones, tales como modificaciones de cadena principal, modificaciones de azúcar y/o modificaciones base, por ejemplo, modificaciones de lipidos o similares. De manera preferente, la transcripción y/o la traducción de la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención no se deteriora significativamente por las modificaciones.

Los análogos/modificaciones de nucleótidos que se pueden utilizar en el contexto de la presente invención se pueden seleccionar, por ejemplo, de 2-amino-6-cloropurineribosido-5 ' -trifosfato, 2-aminoadenosina-51 -trifosfato, 2-tiocitidina-5 ' -trifosfato, 2-tiouridina-5 ' -trifosfato, 4-tiouridina-51 -trifosfato, 5-aminoalilcitidina-5 ' -trifosfato, 5-aminoaliluridina-5 ' -trifosfato, 5-bromocitidina-5 ' -trifosfato, 5-bromouridina-5 ' -trifosfato, 5-yodocitidina-51 -trifosfato, 5-yodouridina-5 ' -trifosfato, 5-metilcitidina-5 ' -trifosfato, 5-metiluridina-5 ' -trifosfato, 6-azacitidina-5 ' -trifosfato, 6-azauridina-5 ' -trifosfato, 6-cloropurineribosido-51 -trifosfato, 7-deazaadenosina-5 ' -trifosfato, 7-deazaguanosina-5 ' -trifosfato, 8-azaadenosina-5 ' -trifosfato, 8-azidoadenosina-5 ' -trifosfato, bencimidazol-ribosido-5 ' -trifosfato , Nl-metiladenosina-5 ' -trifosfato, Nl-metilguanosina-5 ' -trifosfato, N6-metiladenosina-5 ' - trifosfato, 06-metilguanosina-5 ' -trifosfato, pseudouridina-5 ' -trifosfato, o puromicina-5 ' -trifosfato, xantosina-5 ' -trifosfato. La preferencia particular se da a los nucleotidos para modificaciones base seleccionadas del grupo de nucleotidos modificados base que consisten de 5-metilcitidina-5 '-trifosfato, 7-deazaguanosina-5 ' -trifosfato, 5-bromocitidina-5 ' -trifosfato, y pseudouridina-5 ' -trifosfato .

Además, las moléculas de ácido nucleico artificiales modificadas por líquidos pueden comprender típicamente por lo menos un ligador que se liga covalentemente con la molécula de ácido nucleico artificial, y por lo menos un lípido que se liga covalentemente con este ligador. Alternativamente, una molécula de ácido nucleico artificial modificada con lípidos puede comprender por lo menos una molécula de ácido nucleico artificial como se define en la presente y por lo menos uno, de manera preferente lípido bifuncional que se liga covalentemente, se manera preferente sin un ligador, con aquella de la molécula de ácido nucleico artificial. De acuerdo con una tercera alternativa, una molécula de ácido nucleico artificial modificada por lípido puede comprender una molécula de ácido nucleico artificial como se define en la presente, por lo menos un ligador que se liga covalentemente con la molécula de ácido nucleico artificial, por lo menos un lipido que se liga covalentemente con este ligador, y adicionalmente por lo menos uno, lipido de manera preferente bifuncional que se liga covalentemente , de manera preferente sin un ligador, con la molécula de ácido nucleico artificial .

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un vector que comprende a. un marco de lectura abierto (ORF) y/o un sitio de clonación, por ejemplo para la inserción de un marco de lectura abierto o una secuencia que comprende un marco de lectura abierto; y b. por lo menos un elemento de región 3' -no traducida (elemento 3'UTR) que comprende una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen de albúmina o de una variante de la 3'UTR de un gen de albúmina.

El por lo menos un elemento 3'UTR y el ORF se describen en lo anterior en la presente para la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención. El sitio de clonación puede ser cualquier secuencia que sea adecuada para introducir un marco de lectura abierto o una secuencia que comprende un marco de lectura abierto, tal como uno o más sitios de restricción. De esta manera, el vector que comprende un sitio de clonación es de manera preferente adecuado para insertar un marco de lectura abierto en el vector de manera preferente para insertar un marco de lectura abierto 5' al elemento 3'UTR. De manera preferente, el sitio de clonación o el ORF se sitúa 5' al elemento 3'UTR, de manera preferente en proximidad cercana al extremo 5' del elemento 3'UTR. Por ejemplo, el sitio de clonación o el ORF se pueden conectar directamente al extremo 5' del elemento 3'UTR o se pueden conectar a través de un estiramiento de nucleótidos, tal como por un estiramiento de 2, 4, 6, 8, 10, 20 etc., nucleótidos como se describe en lo anterior para la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención.

De manera preferente el vector de acuerdo con la presente invención es adecuado para producir la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, de manera preferente para producir un ARNm artificial de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, al insertar opcionalmente el marco de lectura abierto o una secuencia que comprende un marco de lectura abierto en el vector y transcribir el vector. De esta manera, de manera preferente, el vector comprende elementos necesarios para la transcripción, tal como un promotor, por ejemplo un promotor de ARN polimerasa. De manera preferente, el vector es adecuado para la transcripción utilizando sistemas de transcripción eucarióticos , procarioticos virales o en fago, tales como células eucarióticas , células procarióticas , o sistemas de transcripción in vitro eucarióticos, procarióticos , virales o en fago. De esta manera, por ejemplo, el he vector puede comprender una secuencia promotora, que es reconocida por una polimerasa, tal como por una ARN polimerasa, por ejemplo por una ARN polimerasa eucariótica, procariótica, viral, o en fago. En una modalidad preferida, el vector comprende un promotor de ARN polimerasa en fago tal como un SP6 o T7, de manera preferente un promotor T7. De manera preferente, el vector es adecuado para la transcripción in vitro utilizando un sistema de transcripción in vitro basado en fago, tal como una ARN polimerasa T7 basada en el sistema de transcripción in vitro.

El vector puede comprender además una secuencia poli (A) y/o una señal de poliadenilación como se describe en lo anterior para la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención.

El vector puede ser un vector de ARN o un vector de ADN. De manera preferente, el vector es un vector de ADN. El vector puede ser cualquier vector conocidos por la persona experta, tal como un vector viral o un vector plásmido. De manera preferente, el vector es un vector plásmido, de manera preferente un vector plásmido de ADN.

En una modalidad preferida, el vector de acuerdo con la presente invención comprende la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención.

De manera preferente, un vector de acuerdo con la presente invención comprende una secuencia de acuerdo con SEQ ID NOs. 1, SEQ ID NOs . 3, SEQ ID NOs . 32, SEQ ID NOs . 34 o SEQ ID NOs. 38, o una secuencia que tiene una identidad de por lo menos aproximadamente 40%, de manera preferente de por lo menos aproximadamente 50%, de manera preferente de por lo menos aproximadamente 60%, de manera preferente de por lo menos aproximadamente 70%, de manera más preferente de por lo menos aproximadamente 80%, de manera más preferente de por lo menos aproximadamente 90%, aún de manera más preferente de por lo menos aproximadamente 95%; aún de manera más preferente de por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia a una secuencia de acuerdo con cualquiera de SEQ ID NOs. 1, SEQ ID NOs. 3, SEQ ID NOs. 32, SEQ ID NOs. 34 o SEQ ID NOs. 38, o un fragmento de las mismas.

De manera preferente, un vector RNA de acuerdo con la presente invención comprende una SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 35, SEQ ID No. 37 o SEQ ID No. 39 o una secuencia que tiene una identidad de por lo menos aproximadamente 40%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 50%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 60%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 70%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 80%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 95%; de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia a la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 35, SEQ ID No. 37 o SEQ ID No. 39 o un fragmento de la misma, de manera preferente un fragmento funcional de las mismas.

De manera preferente, el vector una molécula circular. De manera preferente, el vector es una molécula de doble hebra, tal como una molécula de ADN de doble hebra. Tal molécula de ADN de manera preferente de doble hebra, circular se puede utilizar convenientemente como una forma de almacenamiento para la molécula de ácido nucleico artificial inventiva. Adicionalmente , se puede utilizar para transfección de células, por ejemplo, células cultivadas. También se puede utilizar para la transcripción in vitro para obtener una molécula de ARN artificial de acuerdo con la invención .

De manera preferente, el vector, de manera preferente el vector circular, es lineali zable , por ejemplo, por la digestión de enzimas de restricción. En una modalidad preferida, el vector comprende un sitio de escisión, tal como un sitio de restricción, de manera preferente un sitio de escisión único, situado inmediatamente 3' al ORF, o - si está presente - inmediatamente 3' al elemento 3'UTR , o - si está presente - inmediatamente 3' a la secuencia poli (A) o señal de poliadenilación, o - si está presente - situado 3' a la secuencia poli(C), o - si está presente - situado 3' al tallo-asa de histona". De esta manera, de manera preferente, el producto obtenido al linealizar el vector termina en el extremo 3' con el extremo 3' del elemento 3'UTR o - si está presente - con el extremo 3' de la secuencia poli (A) o señal de poliadenilación, o si está presente - con el extremo 3' de la secuencia poli(C) . En la modalidad, en donde el vector de acuerdo con la presente invención comprende la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, un sitio de restricción, de manera preferente un sitio de restricción único, se sitúa de manera preferente inmediatamente 3' al extremo 3' de la_~molécula de ácido nucleico artificial.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una célula que comprende la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención o el vector de acuerdo con la presente invención. La célula puede ser cualquier célula, tal como una célula bacteriana, célula de insecto, célula de planta, célula de vertebrado, por ejemplo una célula de mamífero. Tal célula puede ser, por ejemplo, utilizada para replicación del vector de la presente invención, por ejemplo, en una célula bacteriana. Adicionalmente, la célula se puede utilizar para transcribir la molécula de ácido nucleico artificial o el vector de acuerdo con la presente invención y/o traducir el marco de lectura abierto o de la molécula de ácido nucleico artificial o el vector de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, la célula se puede utilizar para la producción de proteínas recombinantes .

Las células de acuerdo con la presente invención son, por ejemplo, obtenibles por métodos de transferencia de ácido nucleico estándares, tales como métodos de transfección estándares. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico artificial o el vector de acuerdo con la presente invención se pueden transferir en la célula por electroporacion, lipofección, por ejemplo basados en lípidos catiónicos y/o liposomas, precipitación de potación de calcio, transfección basada en nanopartículas, transfección basada en virus, o basados en polímeros catiónicos, tales como DEAE-dextrano o polietilenimina etc.

De manera preferente, la célula es una célula de mamífero, tal como una célula de sujeto humano, un animal doméstico, un animal de laboratorio, tal como una célula de ratón o rata. De manera preferente la célula es una célula humana. La célula puede ser una célula de una línea de células establecida, tal como una célula CHO, BHK, 293T, COS-7, HELA, HEK etc., o la célula puede ser una célula primaria, por ejemplo una célula HDF, de manera preferente una célula aislada de un organismo. En una modalidad preferida, la célula es una célula aislada de un sujeto mamífero, de manera preferente de un sujeto humano. Por ejemplo, la célula puede ser una célula ínmunitaria, tal como una célula dendrítica, una célula cancerosa o tumoral, o cualquier otra célula somática etc., de manera preferente de un sujeto mamífero, de manera preferente de un sujeto humano.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, o la célula de acuerdo con la presente invención. La composición farmacéutica de acuerdo con la invención se puede utilizar, por ejemplo, como una vacuna, por ejemplo, para vacunación genética. De esta manera, el ORF puede, por ejemplo, codificar un antígeno al ser administrado a un paciente para vacunación. De esta manera, en una modalidad preferida, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención es una vacuna. Adicionalmente , la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se puede utilizar, por ejemplo, para terapia génica.

De manera preferente, la composición farmacéutica comprende además uno o más excipientes, vehículos, rellenadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. En el contexto de la presente invención, un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye típicamente una base líquida o no líquida para la composición farmacéutica inventiva. En una modalidad, la composición farmacéutica se proporciona en forma líquida. En este contexto, de manera preferente, el vehículo se basa en agua, tal como agua sin pirógeno, solución salina isotónica o soluciones amortiguadas (acuosas), por ejemplo soluciones amortiguadas con fosfato, citrato, etc. La solución amortiguadora puede ser hipertónica, isotónica o hipotónica con referencia al medio de referencia específico, es decir la solución amortiguadora puede tener un contenido de sal más alto, idéntico o más bajo con referencia al medio de referencia específico, en donde de manera preferente tales concentraciones de las sales mencionados en lo anterior se pueden utilizar, que no conduzcan al daño de las células de mamífero debido a la osmosis u otros efectos de concentración. Los medios de referencia son por ejemplo líquidos que se presentan en los métodos "in vivo" tales como líquidos sanguíneos, linfoides, citosólicos, u otros líquidos corporales, por ejemplo líquidos, que se pueden utilizar como medios de referencia en los métodos "in vitro" , tales como soluciones amortiguadoras comunes o líquidos. Tales soluciones amortiguadoras o líquidos comunes son conocidos por una persona experta. La solución de Lactato de Ringer se prefiere particularmente como una base líquida.

Uno o más rellenadores o diluyentes sólidos o líquidos compatibles o compuestos encapsulantes adecuados para la administración a un paciente se pueden utilizar así como para la composición farmacéutica inventiva. El término "compatible" como se utiliza en la presente significa de manera preferente que estos componentes de la composición farmacéutica inventiva son capaces de ser mezclados con el ácido nucleico inventivo, vector, o células como se define en la presente de tal manera que no se presenta una interacción que reduciría la efectividad farmacéutica de la composición farmacéutica inventiva bajo condiciones de uso típicas.

La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede comprender adicionalmente además uno o más componentes farmacéuticamente activos adicionales. Un componente farmacéuticamente activo en este contexto es un compuesto que muestra un efecto terapéutico para sanar, mejorar o prevenir una indicación o enfermedad particular. Tales compuestos incluyen, sin implicar ninguna limitación, péptidos o proteínas, ácidos nucleicos, compuestos orgánicos o inorgánicos de peso molecular bajo (terapéuticamente activos) (peso molecular menor que 5000, de manera preferente menor que 1000), azucares, antígenos o anticuerpos, agentes terapéuticos ya conocidos en la técnica previa, células antigénicas, fragmentos celulares antigénicos, fracciones celulares, componentes de pared celular (por ejemplo polisacáridos ) , patógenos modificados, atenuados o desactivados (por ejemplo químicamente o por irradiación) (virus, bacterias etc.).

Adicionalmente , la composición farmacéutica inventiva puede comprender un portador para la molécula de ácido nucleico artificial o el vector. Tal portador puede ser adecuado para mediar la disolución en los líquidos aceptables fisiológicos, transporte y captación celular de la molécula de ácido nucleico artificial activa farmacéutica o el vector. Por consiguiente, tal portador puede ser un componente que puede ser adecuado para el almacenamiento y administración de una molécula de ácido nucleico artificial o vector de acurdo con la invención. Tales componentes pueden ser, por ejemplo, portadores o compuestos catiónicos o policatiónicos que pueden servir como un agente de transfección o formación en complej o .

Los agentes de transfección o formación en complejo particularmente preferidos en este contexto son compuestos catiónicos o policatiónicos , incluyendo protamina, nucleolina, espermina o espermidina, u otros péptidos o proteínas catiónicas, tales como poli-L-lisina (PLL), poli-arginina, poli-péptidos básicos, péptidos de penetración de células (CPPs) , incluyendo péptidos de ligación de VIH, VIH-1 Tat (VIH) , péptidos derivados de Tat, Penetratina, péptidos derivados o análogos de VP22, HSV VP22 (Herpes simple), MAP, KALA o dominios de transducción de proteínas (PTDs), PpT620, péptidos ricos en prolina, péptidos ricos en arginina, péptidos ricos en lisina, MPG-péptido ( s ) , Pep-1, L-oligómeros, péptido(s) de Calcitonina, péptidos derivados de Antennapedia (particularmente de Drosophila antennapedia) , pAntp, plsl, FGF, Lactoferrina, Transportano, Buforina-2, Bac715-24, SynB, SynB(l), pVEC, péptidos derivados de hCT, SAP, o histonas.

Adicionalmente , tales compuestos catiónicos o policatiónicos o portadores pueden ser péptidos o proteínas catiónicas o policatiónicas , que comprenden de manera preferente o se modifican adicionalmente para comprender por lo menos una porción -SH. De manera preferente, un portador catiónico o policatiónico se selecciona de péptidos catiónicos que tienen la siguiente fórmula de suma (I) : { (Arg) 1; (Lys)m; (His) n; (Orn) 0; (Xaa) x} ; fórmula (I) en donde I + m + n + o + x = 3-100, e I, m, n u o independientemente entre si es cualquier número seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90 y 91-100 con la condición de que el contenido total de Arg (Arginina) , Lis (Lisina) , His (Histidina) y Orn (Ornitina) representa por lo menos 10% de todos los aminoácidos del oligopéptido; y Xaa sea cualquier aminoácido seleccionado de aminoácidos nativos (= de origen natural) o no nativos excepto para Arg, Lis, His u Orn; y x es cualquier número seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90, con la condición de que el contenido total de Xaa no exceda el 90 % de todos los aminoácidos del oligopéptido. Cualquiera de los aminoácidos Arg, Lis, His, Orn y Xaa se puede posicionar en cualquier lugar del péptido. En este contexto los péptidos o proteínas catiónicas en un intervalo de 7-30 aminoácidos son particularmente preferidos.

Adicionalmente , el péptido o proteína catiónica o policatiónica, cuando se define de acuerdo con la formula { (Arg) x ; (Lys ) m; (His ) n; (Orn ) D; (Xaa ) x } (formula (I)) como se muestra en lo anterior y que comprende o se modifica adicionalmente para comprender por lo menos una porción de -SH, puede ser, sin ser restringido al mismo, seleccionado de la fórmula ( la ) : { (Arg) i; (Lys)m; (His) n; (Orn) 0; (Xaa' ) x (Cys)y} subfórmula (la) en donde (Arg) z; (Lys) m; (His) n; (Orn) 0; y x son como se definen en la presente , Xaa' es cualquier aminoácido seleccionado de aminoácidos nativos (= de origen natural) o no nativos excepto de Arg, Lis, His, Orn o Cys e y es cualquier número seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80 y 81-90, con la condición de que el contenido completo de Arg (Arginina) , Lis (Lisina), His (Histidina) y Orn (Ornitina) representa por lo menos 10% de todos los aminoácidos del oligopéptido . Adicionalmente , el péptido catiónico o policatiónico se puede seleccionar de la fórmula ( Ib) : Cysi { ( rg^; (Lys)m; (His)n; (Orn)0; (Xaa)x} Cys2 subfórmula (Ib) en donde la fórmula empírica { (Arg) i; (Lys)m; (His) n; (Orn) 0; (Xaa) x} (fórmula (III)) es como se define en la presente y forma un núcleo de una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la fórmula (semi empírica) (III) y en donde Cysi y Cys2 son Cisteínas próximas a, o terminales a (Arg) i; (Lys)m; (His)n; (Orn)0; (Xaa)x.

Los compuestos catiónicos o policatiónicos preferidos adicionales, que se pueden utilizar como un agente de transfección o formación en complejo puede incluir polisacáridos catiónicos, por ejemplo quitosan, polibreno, polímeros catiónicos, por ejemplo polietilenimina (PEI), lipidos catiónicos, por ejemplo DOTMA: cloruro de [l-(2,3-sioleiloxi) propil ) ]-N, N, N-trimetilamonio, DMRIE, di-C14-amidina, DOTIM, SAINT, DC-Chol, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE: Dioleil fosfatidiletanol-amina, DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS: Dioctadecilamidoglicilespermina , DIMRI : bromuro de Dimiristo-oxipropil dimetil hidroxietil amonio, DOTAP: dioleoiloxi-3- (trimetilamonio) propano, DC-6-14: cloruro de 0, O-ditetradecanoil-N- (a trimetilamonioacetil ) dietanolamina, CLIP1: cloruro de rac-[ ( 2 , 3-dioctadeciloxipropil ) ( 2-hidroxietil ) ]-dimetilamonio, CLIP6: rac-[2(2,3-dihexadeciloxipropil-oximetiloxi ) etiljtrimetilamonio , CLIP9 : rac-[2 (2, 3-dihexadeciloxipropil-oxisucciniloxi ) etil]-trimetilamonio, oligofectamina , o polímeros catiónicos o policatiónicos , por ejemplo poliaminoácidos modificados, tales como polímeros ß-aminoácido o poliamidas inversas, etc., polietilenos modificados, tales como PVP bromuro de (poli (N-etil-4-vinilpiridinio) ) , etc., acrilatos modificados, tales como pDMAEMA (poli (dimetilaminoetil metilacrilato) ) , etc., Amidoaminas modificadas tales como pAMAM (poli ( amidoamina ) ) , etc., polibetaaminoéster modificado (PBAE) , tal como polímeros de 1,4 butanediol diacrilato-co-5-amino-l-pentanol modificados en el extremo de diamina, etc., dendrímeros, tales como dendrímeros de polipropilamina o dendrímeros basados en pAMA , etc., poliimina ( s ) , tal como PEI: poli (etilenimina) , poli (propilenimina ) , etc., polialilamina, polímeros basados en cadena principal de azúcar, tales como polímeros basados en ciclodextrina, polímeros basados en dextrano, quitosan, etc., polímeros basados en cadena principal de silano, tales como copolímeros PMOXA-PDMS, etc., polímeros de bloque que consisten de una combinación de uno o más bloques catiónicos (por ejemplo seleccionados de un polímero catiónico como se menciona en lo anterior) y de uno o más bloques hidrofílicos o hidrofóbicos (por ejemplo polietilenglicol ) ; etc.

En este contexto, se prefiere particularmente que la molécula de ácido nucleico artificial inventiva o el vector inventivo se forme en complejo por lo menos parcialmente con un compuesto catiónico o policatiónico , de manera preferente proteínas o péptidos catiónicos. Parcialmente significa que solo una parte de la molécula de ácido nucleico artificial inventiva o el vector inventivo se forme en complejo con un compuesto catiónico o policatiónico y que el resto de la molécula de ácido nucleico artificial inventiva o el vector inventivo esté en forma no en complejo (libre) . De manera preferente la relación del ácido nucleico formado en complejo a: ácido nucleico libre se selecciona de un intervalo de aproximadamente 5:1 (p/p) a aproximadamente 1:10 (p/p) , de manera más preferente de un intervalo de aproximadamente 4 : 1 (p/p) a aproximadamente 1:8 (p/p), aún de manera más preferente de un intervalo de aproximadamente 3:1 (p/p) a aproximadamente 1:5 (p/p) o 1:3 (p/p), y de manera mucho más preferente la relación del ácido nucleico formado en complejo a ácido nucleico libre se selecciona de una relación de aproximadamente 1:1 (p/p).

La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede comprender opcionalmente además uno o más adyuvantes, por ejemplo, adyuvantes para estimular el sistema inmunitario innato o para mejorar la captación celular de la molécula de ácido nucleico artificial o vector. En este contexto, un adyuvante se puede entender como cualquier compuesto, que sea adecuado para iniciar o incrementar una respuesta inmunitaria del sistema inmunitario innato, es decir una respuesta inmunitaria no especifica. En otras palabras, cuando se administra, la composición farmacéutica inventiva induce de manera preferente una respuesta inmunitaria innata debido al adyuvante, contenido opcionalmente en el mismo. De manera preferente, tal adyuvante puede ser un adyuvante que soporté la inducción de una respuesta inmunitaria innata en un mamífero. Tal adyuvante puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico inmunoestimulador , es decir un ácido nucleico que se puede ligar a un receptor similar a Toll o el similar, de manera preferente un ARN inmunoestimulador.

Tales adyuvantes, de manera preferente tales ácidos nucleicos inmunoestimuladores , pueden inducir una respuesta innata, es decir no específica, inmunitaria que puede soportar una respuesta específica, adaptativa, inmune al péptido o proteína, es decir al antígeno, codificado por la molécula de ácido nucleico artificial de la composición farmacéutica, de manera preferente la vacuna.

La composición farmacéutica inventiva también puede comprender adicionalmente cualquier compuesto adicional que es conocido por ser inmunoestimulador debido a su afinidad de ligación (como ligandos) a los receptores similares a Toll humanos TLR1, TLR2, TLR3, TLR4 , TLR5, TLR6, TLR7 , TLR8 , TLR9, TLR10, o debido a su afinidad de ligación (como ligandos) a los receptores similares a Toll de murino TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 , TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 o TLR13.

Los aditivos adicionales que se pueden incluir en la composición farmacéutica inventiva son, por ejemplo, emulsificantes , tales como, por ejemplo, TweenMR; agentes humectantes, tales como, por ejemplo, lauril sulfato de sodio; agentes colorantes; agentes de impartición de sabor, portadores farmacéuticas; agentes formadores de comprimidos; estabilizantes, antioxidantes; conservadores, etc.

La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención comprende de manera preferente una "cantidad segura y efectiva" de los componentes de la composición farmacéutica, particularmente de la secuencia de ácido nucleico inventiva, el vector y/o las células como se define en la presente. Como se utiliza en la presente, una "cantidad segura y efectiva" significa una cantidad suficiente para inducir significativamente una modificación positiva de una enfermedad o trastorno como se define en la presente. Al mismo tiempo, sin embargo, una "cantidad segura y efectiva" evita de manera preferente efectos secundarios serios y permite una relación sensible entre la ventaja y el riesgo. La determinación de estos limites se sitúa típicamente dentro del alcance del juicio médico sensible.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención, o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención para el uso como un medicamento, por ejemplo, como una vacuna (en la vacunación genética) o en la terapia génica.

La molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención, o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención son particularmente adecuados para cualquier aplicación medica que hace uso de la acción terapéutica o efecto de los péptidos, polipéptidos o proteínas, o donde la suplementación de un péptido o proteína particular es necesaria. De esta manera, la presente invención proporciona la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención, o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención para el uso en tratamiento o prevención de_ enfermedades o trastornos sensibles al tratamiento por la acción terapéutica o efecto de los péptidos, polipéptidos o proteínas son sensibles al tratamiento por suplementación de un péptido particular, polipéptido o proteína. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención, o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se puede utilizar para el tratamiento o prevención de enfermedades genéticas, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades cancerosas o relacionadas a tumor, enfermedades infecciosas, enfermedades crónicas o similares, por ejemplo, por vacunación genética o terapia génica.

En particular, tales tratamientos terapéuticos que se benefician de una presencia estable, prolongada y/o incrementada de péptidos terapéuticos, polipéptidos o proteínas en un sujeto a ser tratado son especialmente adecuados como aplicación medica en el contexto de la presente invención, puesto que el elemento 5'UTR opcionalmente en combinación con el elemento 3'UTR proporciona un expresión de proteínas incrementada del ORF y el elemento 3'UTR proporciona una expresión estable y prolongada del ORF de la molécula de ácido nucleico inventiva. De esta manera, una aplicación medica particularmente adecuada para la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención, o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención es la vacunación, por ejemplo contra infecciones o tumores. De esta manera, la presente invención proporciona la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención, o composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención para vacunación de un sujeto, de manera preferente un sujeto mamífero, de manera más preferente un sujeto humano. Los tratamientos de vacunación preferidos son la vacunación contra enfermedades infecciosas, tales como infecciones bacterianas, de protozoarios o virales, y la vacunación anti-tumor. Tales tratamientos de vacunación pueden ser profilácticos o terapéuticos.

Dependiendo de la enfermedad que se trata o previene, el ORF se puede seleccionar. Por ejemplo, el marco de lectura abierto puede codificar una proteína que tiene que ser suministrada a un paciente que sufre de carencia total o por lo menos pérdida parcial de la función de una proteína, tal como un paciente que sufre de una enfermedad genética. Adicionalmente , el marco de lectura abierto se puede elegir de un ORF que codifica un péptido o proteína que influye benéficamente una enfermedad o la condición de un sujeto. Adicionalmente, el marco de lectura abierto puede codificar un péptido o proteína que afecta la regulación por decremento de una sobreproducción patológica de un péptido o proteína natural o eliminación de células que expresan patológicamente una proteína o péptido. Tal carencia, pérdida de función o sobreproducción pueden, por ejemplo, presentarse en el contexto de tumor y neoplasia, enfermedades autoinmunitarias, alergias, infecciones, enfermedades crónicas o similares. Adicionalmente, el marco de lectura abierto puede codificar el antigeno inmunógeno, por ejemplo un epitopo de un patógeno o para un antigeno tumoral. De esta manera, en modalidades preferidas, la molécula de ácido nucleico artificial o el vector de acuerdo con la presente invención comprende un ORF que codifica la secuencia de aminoácidos que comprende o que consiste de un antigeno o inmunógeno, por ejemplo un epitopo de un patógeno o un antigeno asociado a tumor, un elemento 3'UTR como se describe en lo anterior, y componentes adicionales opcionales, tal como una secuencia poli (A) etc.

En el contexto de la aplicación médica, en particular, en el contexto de la vacunación, se prefiere que la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención se ARN, de manera preferente ARNm, puesto que el ADN aloja el riesgo de inducir una respuesta inmunitaria anti-ADN y tiende a insertarse en el ADN genómico. Sin embargo, en algunas modalidades, por ejemplo, si un vehículo de suministro viral, tal como un vehículo adenoviral se utiliza para la administración de la molécula de ácido nucleico artificial o el vector de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, en el contexto de los tratamientos terapéuticos génicos, puede ser deseable que la molécula de ácido nucleico artificial o el vector sea una molécula de ADN.

La molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención, o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se pueden administrar oralmente, parenteralmente, por roció por inhalación, tópicamente, rectalmente, nasalmente, bucalmente, vaginalmente o a través de un depósito implantado. El término parenteral como se utiliza en la presente incluye subcutáneo, intravenoso, intramuscular, intra-articular, intra-sinovial , intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional , intracraneal, transdérmica, intradérmica, intrapulmonar, intraperitoneal , intracardiaca, intraarterial , e inyección sublingual o técnicas de infusión.

De manera preferente, la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención, o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se administran parenteralmente, por ejemplo, por inyección parenteral, de manera más preferente por inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-sinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática , intralesional, intracraneal, transdérmica, intradérmica, intrapulmonar, intraperitoneal, intracardiaca, intraarterial , inyección sublingual o a través de técnicas de infusión. Se prefiere particularmente la inyección intradérmica e intramuscular. Las formas inyectables estériles de la composición farmacéutica inventiva puede ser una suspensión acuosa u oleaginosa. Estas suspensiones se pueden formular de acuerdo con técnicas conocidas en el campo utilizando agentes de dispersión o humectantes adecuados y agentes de suspensión.

La molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención, o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención también se pueden administrar oralmente en cualquier forma de dosificación oralmente aceptable incluyendo, pero no limitado a, cápsulas, comprimidos, suspensiones o soluciones acuosas.

La molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención, o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención también se pueden administrar tópicamente, especialmente cuando el objetivo del tratamiento incluye áreas u órganos fácilmente accesibles por la aplicación tópica, por ejemplo incluyendo enfermedades de la piel o de cualquier otro tejido epitelial accesible. Las formulaciones tópicas adecuadas se preparan fácilmente para cada una de estas áreas u órganos. Para aplicaciones tópicas, la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención, o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se puede formular en un ungüento adecuado suspendido disuelto en uno o más portadores.

En una modalidad, el uso como un medicamento comprende la etapa de transfección de células de mamífero, de manera preferente transfección in vitro de células de mamífero, de manera más preferente transfección in vitro de células aisladas de un sujeto que se trata por el medicamento. Si el uso comprende la transfección in vitro de células aisladas, el uso como un medicamento puede comprender además la (re) administración de las células transíectadas al paciente. El uso de las moléculas de ácido nucleico artificiales inventivas o el vector como un medicamento puede comprender adicionalmente la etapa de selección de las células aisladas exitosamente transfectadas . De esta manera, puede ser benéfico si el vector comprende además un marcador de selección. También, el uso como un medicamento puede comprender la transfección in vitro de células aisladas y purificación de un producto de expresión, es decir la proteina o péptido codificado de estas células. Este péptido o proteina purificada se puede administrar subsecuentemente a un sujeto en necesidad del mismo.

La presente invención proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno como se describe en lo anterior que comprende administrar la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención, o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención a un sujeto en necesidad del mismo.

Adicionalmente , la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno que comprende la transfección de una célula con una molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención o con el vector de acuerdo con la presente invención. La transfección se puede llevar a cabo in vitro o in vivo. En una modalidad preferida, la transfección de una célula se lleva a cabo in vitro y la célula transfectada se administra a un sujeto en necesidad del mismo, de manera preferente un paciente humano. De manera preferente, la célula que se va a transfectar ín vitro es una célula aislada del sujeto, de manera preferente del paciente humano. De esta manera, la presente invención proporciona un método de tratamiento que comprende las etapas de aislar una célula de un sujeto, de manera preferente de un paciente humano,' transfectar la célula aislada con la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención o el vector de acuerdo con la presente invención, y administrar la célula transfectada al sujeto, de manera preferente el paciente humano.

El método para tratar o prevenir un trastorno de acuerdo con la presente invención es de manera preferente un método de vacunación y/o un método de terapia génica como se describe en lo anterior.

Como se describe en lo anterior, el elemento 3'UTR inventivo es capaz de estabilizar una molécula de ARNm y/o de estabilizar y/o prolongar la producción de proteínas de una molécula de ARNm. De esta manera, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para estabilizar una molécula de ARN, de manera preferente una molécula de ARNm, que comprende la etapa de asociar la molécula de ARN, de manera preferente la molécula de ARNm, o un vector que codifica la molécula de ARN, con un elemento 3'UTR que comprende o consiste de una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3' UTR de un gen de albúmina o de una variante de la 3' UTR de un gen de albúmina, de manera preferente con el elemento 3' UTR como se describe en lo anterior.

Adicionalmente , la presente invención se refiere a un método para implementar la producción de proteínas de una molécula de ácido nucleico o de un vector, de manera preferente de una molécula de ARNm, y/o para estabilizar y/o prolongar la producción de proteínas de una molécula de ácido nucleico artificial o de un vector, de manera preferente de una molécula de ARNm, el método gue comprende la etapa de asociar la molécula de ácido nucleico o el vector, de manera preferente la molécula ARNm, con un elemento 3' UTR que comprende o consiste de una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3' UTR de un gen de albúmina o de una variante de la 3' UTR de un gen de albúmina, de manera preferente con el elemento 3' UTR como se describe en lo anterior.

El término "que asocia la molécula de ácido nucleico artificial o el vector con un elemento 3' UTR" en el contexto de la presente invención significa de manera preferente asociar funcionalmente o combinar funcionalmente la molécula de ácido nucleico artificial o el vector con el elemento 3' UTR. Esto significa que la molécula de ácido nucleico artificial o el vector y el elemento 3'UTR, de manera preferente el elemento 3'UTR como se describe en lo anterior, se asocian o se acoplan tal que la función del elemento 3'UTR, por ejemplo, la función de estabilización de producción de ARN y/o proteínas, se ejerce. Típicamente, esto significa que el elemento 3'UTR se integra en la molécula de ácido nucleico artificial o el vector, de manera preferente la molécula ARNm, 3' a un marco de lectura abierto, de manera preferente inmediatamente 3' a un marco de lectura abierto, de manera preferente entre el marco de lectura abierto y una secuencia poli (A) o una señal de poliadenilación . De manera preferente, el elemento 3'UTR se integra en la molécula de ácido nucleico artificial o el vector, de manera preferente el ARNm, como 3'UTR, es decir tal que el elemento 3'UTR es la 3'UTR de la molécula de ácido nucleico artificial o el vector, de manera preferente el ARNm, es decir, tal que se extiende desde el lado 3' del marco de lectura abierto al lado 5' de una secuencia poli (A) o una señal de poliadenilación, conectado opcionalmente a través del ligador corto, tal como una secuencia que comprende o consiste de uno o más sitios de restricción. De esta manea, de manera preferente, el término "que asocia la molécula de ácido nucleico artificial o el vector con un elemento 3'UTR" significa asociar funcionalmente el elemento 3'UTR con un marco de lectura abierto situado dentro de la molécula de ácido nucleico artificial o el vector, de manera preferente dentro de la molécula de ARNm. La 3'UTR y el ORF son como se describen en lo anterior para la molécula de ácido nucleico artificial acuerdo con la presente invención, por ejemplo, de manera preferente el ORF y la 3'UTR son heterólogos, por ejemplo derivados de los genes diferentes, como se describe en lo anterior.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de un elemento 3'UTR, de manera preferente el elemento 3'UTR como se describe en lo anterior, para incrementar la estabilidad de una molécula de ARN, de manera preferente de una molécula ARNm, en donde el elemento 3'UTR comprende o consiste de una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen de albúmina o de una variante de la 3'UTR de un gen de albúmina.

Adicionalmente , la presente invención proporciona el uso de un elemento 3'UTR, de manera preferente el elemento 3'UTR como se describe en lo anterior, para incrementar la producción de proteínas de una molécula de ácido nucleico o un vector, de manera preferente de una molécula de ARNm, y/o para estabilizar y/o prolongar la producción de proteína de una molécula de ácido nucleico artificial o una molécula vector, de manera preferente de una molécula de ARNm, en donde el elemento 3'UTR comprende o consiste de una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen de albúmina o de una variante de la 3'UTR de un gen de albúmina como se describe en lo anterior.

Los usos de acuerdo con la presente invención comprenden de manera preferente asociar la molécula de ácido nucleico, el vector, o el ARN con el elemento 3'UTR como se describe en lo anterior.

Los compuestos e ingredientes de la composición farmacéutica inventiva también se pueden fabricar y tratar separadamente entre si. De esta manera, la invención se refiere adicionalmente a un kit o kit de partes que comprenden una molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con la invención, un vector de acuerdo con la invención, una célula de acuerdo con la invención, y/o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención. De manera preferente, tal kit o kit de partes pueden, adicionalmente, comprender instrucciones para el uso, células para transfección, un adyuvante, un medio para la administración de la composición farmacéutica, un portador farmacéuticamente aceptable y/o una solución farmacéuticamente aceptable para disolución o dilución de la molécula de ácido nucleico artificial, el vector, las células o la composición farmacéutica.

Las siguientes Secuencias y Ejemplos se proponen para ilustrar la invención adicionalmente. No se proponen para limitar el contenido de la invención a la misma.

EJEMPLOS 1. Preparación de plantillas de ADN Se construyó un vector para la transcripción in vitro que contiene un promotor T7 seguido por una secuencia enriquecida con GC que codifica la luciferasa de Photinus pyralis (PpLuc(GC)) y una secuencia A64 poli (A) . La secuencia poli (A) fue seguida inmediatamente por un sitio de restricción utilizada para la linealización del vector antes de la transcripción in vitro a fin de obtener un ARNm que termina en una secuencia poli (A) A64. El ARNm obtenido de este vector por consiguiente por la transcripción in vitro se designa como "PpLuc(GC) - A64N64".

Este vector se modificó para incluir las secuencias no traducidas 3' del marco de lectura abierto (3'UTR). Los vectores que comprenden las siguientes secuencias de codificación de ARNm (Figuras 4 a 6 y Figuras 22 a 23): SEQ ID NO. 5 (Figura 4): PpLuc(GC) - A64 SEQ ID NO. 6 (Figura 5): PpLuc(GC) - albúmina - A64 SEQ ID NO. 7 (Figura 6): PpLuc(GC) - albúmina 2 - A64 SEQ ID NO. 8 (Figura 7): PpLuc(GC) - albúmina 3 - A64 SEQ ID NO. 9 (Figura 8): PpLuc(GC) - albúmina 4 - A64 SEQ ID NO. 10 (Figura 9): PpLuc(GC) - albúmina 5 - A64 SEQ ID NO. 11 ( Figura 10) : PpLuc (GC) - albúmina 6 A64 SEQ ID NO. 12 (Figura 11) : PpLuc (GC) - albúmina 7 - A64 SEQ ID NO. 13 ( Figura 12) : PpLuc(GC) · - ag - A64 SEQ ID NO. 14 ( Figura 13) : PpLuc (GC) ¦ - gusb - A64 SEQ ID NO. 15 ( Figura 14) : PpLuc (GC) ¦ - atp5o - A64 SEQ ID NO. 16 ( Figura 15) : PpLuc (GC) ¦ - ndufal - A64 SEQ ID NO. 17 (Figura 16) : PpLuc (GC) ¦ - atp51 - A64 SEQ ID NO. 40 ( Figura 22) : PpLuc (GC) - albúmina 8 A64 SEQ ID NO. 41 ( Figura 23) : PpLuc (GC) albúmina 9 A64 Los ARNms utilizados en los ejemplos se han obtenido por transcripción in vitro de los vectores. 2. Transcripción in vitro La plantilla de ADN de acuerdo con el Ejemplo 1 se linealizó y se transcribió in vitro utilizando la T7-Polimerasa. La plantilla de ADN luego se digirió por el tratamiento de DNAasa. Los transcriptos de ARNm contuvieron una estructura de tapa 5' obtenida al agregar un exceso de N7-Metil-Guanosina-5 ' -Trifosfato- ' -Guanosina a la reacción de transcripción. El ARNm de esta manera obtenido se purificó y se resuspendió en agua. 3. Transfección de células 3.1 Electroporacion del ARNm Las células se tripsinaron y se lavaron en opti- EM. 5xl04 o lxlO5 células en 200 µ? de opti-MEM se electroporaron cada una con 0.3 o 1 \ig de ARNm que codifica PpLuc . Como un control, el ARNm que no codifica el PpLuc se electroporó separadamente. En algunos experimentos, el ARNm que codifica la luciferasa de Renilla reniformis (RrLuc) se electroporó junto con el ARNm de PpLuc para controlar la eficiencia de transfección (0.1 µg de ARNm de RrLuc). Las células electroporadas se sembraron en placas de 24 pocilios en 1 mi de medio. 6, 24, o 48 horas después de la transfección (o 72 horas en algunos experimentos) , el medio se aspiró y las células se Usaron en 200 µ? de solución amortiguadora de lisis (Tris 25 mM, pH 7.5 (HC1), EDTA 2 mM, 10% de glicerol, 1% de Tritón X-100, DTT 2 mM, PMSF 1 mM o alternativamente Solución Amortiguadora de Lisis Pasiva, Promega) . Los Usados se almacenaron a -20°C hasta que la actividad de la luciferasa se midió. 3.2 Lipofeccion del ARNm Las células se sembraron en placas de 96 pocilios tres días antes de la transfección (2500 o 5000 células por pocilio) . Inmediatamente antes de la lipofeccion, las células se lavaron en opti-MEM. Las células se lipofectaron con 25 ng de ARNm que codifica PpLuc por pocilio formado en complejo con Lipofectamine2000. El ARNm que codifica la luciferasa de Renílla reniformis (RrLuc) se con-transfectó junto con el ARNm de PpLuc para controlar la eficiencia de transfección (2.5 ng de ARNm de RrLuc por pocilio). 6, 24, 48, o 72 horas después de la transfección, el medio se aspiró y las células se Usaron en 100 µ? de solución amortiguadora de lisis (Passive Lysis Buffer, Promega) . Los Usados se almacenaron a -80°C hasta que la actividad de la luciferasa se midió. 4. Medición de la luciferasa La actividad de la luciferasa se midió como unidades de luz relativas (RLU) en un lector de placas BioTek SynergyHT. La actividad de PpLuc se midió en 15 segundos de tiempo de medición utilizando 50 µ? de lisado y 200 µ? de solución amortiguadora de luciferina (75 µ? de luciferina, Glicilglicina 25 mM, pH 7.8 (NaOH) , MgS04 15 mM, ATP 2 m ) . La actividad de RrLuc se midió en 15 segundos de tiempo de medición utilizando 15 segundos de tiempo de medición utilizando 50 µ? de lisado 200 µ? de solución amortiguadora de coelenterazina (40 µ? de coelenterazinan EDTA 2.2 mM, KH2P04/K2HP04 220 mM, pH 5.0, NaCl 1.3 mM, 0.44 g/1 BSA) .

Alternativamente, la actividad de luciferasa se midió como unidades de luz relativas (RLU) en el lector de placas Hidex Chameleon. La actividad de PpLuc se midió a 2 segundos del tiempo de medición utilizando 20 µ? de lisado y 100 µ? de solución amortiguadora de luciferina (Beetle-Juice, PJK GmbH) . La actividad de RrLuc se midió a 2 segundos de tiempo de medición utilizando 20 µ? de lisado y 100 µ? de solución amortiguadora de coelenterazina (Renilla-Juice, PJK GmbH) . 5. Resultados 5.1 3' -UTR de albúmina prolonga la expresión de proteínas del ARNm notablemente más que la 3' -UTR de cx-globina bien conocida Para investigar el efecto de las regiones 3' -no traducidas en la expresión de proteínas del ARNm, los ARNms con diferentes 3'-UTRs se sintetizaron de acuerdo con los Ejemplos 1-2: el ARNm contuvo ya sea la porción de ligación a a-complejo, central de la 3' -UTR de la oí-globina (PpLuc (GC)-ag-A64 humana de acuerdo con SEQ ID No. 13), puesto que la 3' -UTR a-globina se ha reportado para estabilizar el ARNm independiente de la secuencia de región de codificación (Rodgers, N.D., Wang, Z. & Kiledjian, M . , 2002. Regulated alpha-globin mRNA decay is a cytoplasmic event proceeding through 3'-to-5' exosome-dependent decapping. RNA, 8(12), S.1526 -1537.). Alternativamente, el ARNm contuvo la 3'-UTR de la albúmina humana ( PpLuc (GC) -albúmina-A64 de acuerdo con SEQ ID No. 6) . El ARNm de albúmina humana se ha reportador que es estable (Johnson, T.R. y colaboradores, 1991. Newly synthesized RNA: simultaneous measurement in intact cells of transcription rates and RNA stability of ínsulin-like growth factor I, actin, and albúmina in growth hormone-stimulated hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences, 88(12), S.5287-5291) . Finalmente, el ARNm que contiene la 3'-UTR de la ß-glucuronidasa ( PpLuc (GC) -gusb-A64 humana de acuerdo con SEQ ID No. 14) se utilizó. Esta ARNm de ß-glucuronidasa humana también se ha reportado que es estable (Watson, G. & Paigen, K., 1987. Genetic variations in kinetic constants that describe beta-glucuronidase mRNA induction in androgen-treated mice. Molecular and Cellular Biology, 7(3), S.1085 -1090.). Para comparación, el ARNm que carece de una 3'-UTR también se utilizó ( PpLuc (GC) -A64 acuerdo con SEQ ID No. 5) . Los ARNms que codifican la luciferasa se electroporaron en las células HeLa . Los niveles de Luciferasa se midieron a 6, 24, y 48 horas después de la transfección (ver la siguiente Tabla 1 y la Figura 1) .

Tabla 1: El nivel de luciferasa de ARNm que carece de una 3' -UTR descendió de 6 horas a 48 horas, 10% de la señal de 6 horas que permanece a 48 horas. La 3 ' -UTR de a-globina estabilizó la expresión de luciferasa de ARNm solamente de manera moderada. Sorprendentemente sin embargo, la 3' -UTR de albúmina humana prolongó notablemente de manera adicional la expresión de luciferasa del ARNm. En contraste, la 3' -UTR de la ß-glucuronidasa no prolongó la expresión de luciferasa al grado observado para la 3' -UTR de albúmina.

La relación del nivel de luciferasa a 48 horas y 6 horas, las figuras más altas indican la estabilización de la expresión de proteínas, se calculó. Estos datos, indicando que tanto cualquiera de las 3' -UTR estabilizó el curso de tiempo de la expresión de proteínas, se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2: La 3'-UTR de albúmina estabilizó la expresión de proteínas mucho más que la 3'-UTR de a-globina bien conocido y más que la 3'-UTR del ARNm de ß-glucuronidasa estable. Este resultado muestra que la 3'-UTR de albúmina es particularmente eficiente en prolongar la expresión de proteínas del ARNm. 5.2 La 3' -UTR de albúmina es única en prolongar la expresión de proteínas mientras que mantiene la expresión de proteínas total .

La extensión de la expresión de proteínas por la 3' -UTR de albúmina podría manifestar un efecto genérico de 3' -UTRs de los ARNms estable (aunque el efecto muy limitado de la 3'-UTR de oí-globina observado en el Ejemplo 5.1 no da fe de este argumento) . De esta manera, se sintetizaron los ARNms que contienen la 3' -UTR de los ARNms estables (Friedel, C.C. et el., 2009. Conserved principies of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Research, 37(17), S.ell5.) atp5o o ndufal o atp51 (subunidad O de ATP sintasa humana, subunidad 1 de subcomplejo a de NADH deshidrogenase [ubiquinona ] , o subunidad g ATP sintasa humana, respectivamente) . Los ARNms que codifican luciferasa se electroporaron en células HeLa. Los niveles de luciferasa se midieron a 6, 24, y 48 horas después de la transfección (ver la siguiente Tabla 3 y la Figura 2) .

Tabla 3: El nivel de luciferasa del ARNm que carece de una 3'-UTR descendió de 6 horas a 48 horas, 14% de la señal de 6 horas que permanece a 48 horas. La 3'-UTR de -globina estabilizó la expresión de luciferasa del ARNm moderadamente. Sorprendentemente sin embargo, loa 3'-UTR de albúmina humana prolongó notablemente además la expresión de luciferasa del ARNm. Comparada con la 3'-UTR de albúmina las 3'-UTRs de varios ARNms estables diferentes afectaron la expresión de luciferasa del ARNm en una manera mucho menos favorable: Las 3'-UTRs atp5o y atp51 estabilizaron la expresión de luciferasa mucho menos que la 3'-UTR de albúmina. Además redujo los niveles de luciferasa de las atp5o y atp51 se comparó sustancialmente a la 3'-UTR de albúmina. La 3'-UTR del ARNm ndufal estable no estabilizó la expresión de luciferasa notablemente. Sin embargo, la 3'-UTR ndufal también redujo los niveles de luciferasa sustancialmente.

La relación del nivel de luciferasa a 48 horas y 6 horas, figuras más altas que indican la estabilización de la expresión de proteínas, se calculó. Estos datos, indicando que tanto cualquiera de las 3'-UTR estabilizó el curso del tiempo de la expresión de proteínas, se resume en la Tabla 4. Tabla 4: La 3'-UTR de albúmina fue única en prolongar la expresión de proteínas mientras que mantiene la expresión de proteínas total. La 3'-UTR de albúmina produjo una expresión de proteínas sustancialmente más alta en el último punto de tiempo comparada con la 3'-UTR de a-globina bien conocida y 3'-UTRs de varios ARNms estables diferentes. Este resultado muestra que la 3'-UTR de albúmina es particularmente adecuada para prolongar la expresión de proteínas del ARNm. 5.3 Diferentes variantes de la 3' -UTR de albúmina prolongaron la expresión de proteínas del ARNm La 3' -UTR de albúmina humana contiene un sitio de restricción HindIII, un sitio de restricción Xbal, un sitio de restricción, y una señal de terminación T7. De esta manera, el ARNm se sintetizó conteniendo variantes de la 3'-UTR de albúmina humana con los sitios de restricción HindIII y/o Xbal y/o la señal de terminación T7 removida por la mutación (es) puntual ( PpLuc (GC) -albúmina 2-7 de acuerdo con SEQ ID Nos. 17-12). Los ARNms que codifican luciferasa se electroporaron en las células HeLa. Los niveles de luciferasa se midieron a 6, 24, 48, y 72 horas después de la transíección . La señal PpLuc se corrigió para la eficiencia de transfección para la señal de RrLuc co-transfectada (ver la siguiente Tabla 5 y la Figura 3) .

Tabla 5: La relación del nivel de luciferasa a 72 horas y 6 horas, las figuras más altas que indican la estabilización de la expresión de proteínas, se calculó. Estos datos, indicando que tanto cualquiera de 3'-UTR estabilizó el curso de tiempo de la expresión de proteínas, se resumen en la Tabla 6.

Tabla 6: El nivel de luciferasa del ARNm que carece de una 3'-UTR descendió de 6 horas a 72 horas, 5% de la señal de 6 horas que permanece a 72 horas. La 3'-UTR de a-globina estabilizó la expresión de luciferasa de ARNm solo muy moderadamente. En contraste, todas las variantes de la 3'-UTR de albúmina prolongaron notablemente la expresión de luciferasa de ARNm. 5.4 La 3' -UTRs de albúminas de primates prolongaron la expresión de proteínas de ARNm La prolongación de la expresión de proteínas por la 3'-UTR de albúmina podría ser específica de especie. Comparando las 3' -UTRs de albúmina de diferentes primates, la 3' -UTR de albúmina de Olive baboon fue la última homologa a la 3' -UTR de albúmina humana (chimpancé común: 99% de identidad, Pygmy chimpanzee: 99% de identidad, orangután de Sumatran: 99% de identidad, Olive baboon: 96% de identidad). De esta manera, el mRNA el sintetizó conteniendo la 3' -UTR del gen de albúmina de Olive baboon ( PpLuc (GC) -albúmina 0-A64 de acuerdo con SEQ ID No. 40). Los ARNms que codifican luciferasa se electroporaron en fibroblastos dérmicos humanos (HDF) . Los niveles de luciferasa se midieron a 6, 24, 48, y 72 horas después de la transíección . La señal de PpLuc se corrigió para la eficiencia de transfección por la señal del RrLuc co-transfectado (ver siguiente Tabla 7 y Figura 18).

Tabla 7: La relación del nivel de luciferasa a 72 horas y 6 horas, las figuras más altas que indican estabilización de la expresión de proteínas, se calculó. Estos datos, indicando que tanto de cualquiera de 3'-UTR estabilizó el curso del tiempo de la expresión de proteínas, se resumen en la Tabla 8.

Tabla 8: El nivel de luciferasa del ARNm que carece de una 3'-UTR descendió de 6 horas a 72 horas, 5% de la señal de 6 horas restantes a 72 horas. La 3'-UTR de albúmina humana prolongó notablemente la expresión de luciferasa del mRNA. La 3'-UTR de albúmina de Olive baboon prolongó la expresión de luciferasa del ARNm al mismo grado como la secuencia humana.

Este resultado muestra que las 3' -UTRs de albúmina de primate son particularmente adecuadas para prolongar la expresión de proteínas del ARNm.

La prolongación de la expresión de proteínas por tanto la 3'-UTR de albúmina de humano como de Olive baboon también se observó si los ARNms se lipofectaron antes de electroporarse . Los ARNms que codifican luciferasa se lipofectaron en HDF. Los niveles de luciferasa se midieron a 6, 24, 48, y 72 horas después de la transfección. La señal de PpLuc se corrigió para la presencia de transfección por la señal de RrLuc co-transfectado (ver la siguiente Tabla 9 y la Figura 19) .

Tabla 9: Las relaciones del nivel de luciferasa a 48 horas y 6 horas, figuras más altas que indican la estabilización de la expresión de proteínas, se calculó. Estos datos, indicando que tanto cualquiera de las 3'-UTR estabilizó el curso de tiempo de la expresión de proteínas, se resumen en la Tabla 10.

Tabla 10: En la lipofección antes que la electroporación, nuevamente tanto la 3'-UTR de albúmina humana como la 3'-UTR de albúmina de Olive baboon prolongó la expresión de luciferasa del ARNm notablemente. Este resultado confirma que las 3'-UTRs de albúmina de primates son particularmente adecuadas para prolongar la expresión de proteina délo ARNm. 5.5 Las 3'-UTRs de albúmina de primates prolongaron la expresión de proteínas del ARNm en células de ratón La prolongación de la expresión de proteínas por la 3'-UTR de albúmina podría ser específica de especie. De esta manera, se probó si la 3'-UTR de albúmina humana y la 3'-UTR de albúmina de Olive baboon prolongó la expresión de luciferasa del ARNm en células de ratón. Los ARNms que codifican luciferasa se lipofectaron en células L-929, una línea de células de fibroblasto de murino. Los niveles de luciferasa se midieron a 6, 24, 48, y 72 horas después de la transfección . La señal de PpLuc se corrigió para la eficiencia de transfección por la señal del RrLuc co- transfectado (ver la siguiente Tabla 11 y la Figura 20) .

Tabla 11: La relación del nivel de luciferasa a 48 horas y 6 horas, figuras más altas que indican la estabilización de la expresión de proteínas, se calculó. Estos datos, indicando que tanto cualquiera de las 3'-UTR estabilizó el curso de tiempo de la expresión de proteínas, se resumen en la Tabla 12.

Tabla 12: nivel de luciferasa del ARNm que carece de una 3'-UTR descendió de 6 horas a 48 horas, 23% de la señal de 6 horas restante a 48 horas. La 3'-UTR de albúmina humana prolongó notablemente la expresión de luciferasa del ARNm en la línea de células de ratón. La 3'-UTR de albúmina de Olive baboon también prolongó la expresión de luciferasa del ARNm en la línea de células de ratón. Este resultado muestra que las 3'-UTRs de albúmina de primates son particularmente adecuadas para prolongar la expresión de proteínas de ARNm de tipos de célula de mamífero. 5.6 Las 3'-UTRs de albúmina de mamífero prolongaron la expresión de protexnas de ARNm La prolongación de la expresión de proteínas por la 3'-UTR de albúmina podría ser específica de especie. Comparando las 3'-UTRs de albúmina de diferentes mamíferos, las 3'-UTR de albúmina de ratón fue menos homologa a la 3'-UTR de albúmina humana (Caballo: 86% de identidad, perro doméstico: 84% de identidad, ganado vacuno: 74% de identidad, Rata: 73% de identidad, Ratón: 72% de identidad). De esta manera, el ARNm se sintetizó conteniendo la 3'-UTR del gen de albúmina de ratón (PpLuc (GC) -albúmina 9-A64 de acuerdo con SEQ ID No. 41) . Los ARNms que codifican luciferasa se lipofectaron en células HeLa. Los niveles de luciferasa se midieron a 6, 24, 48, y 72 horas después de la transíección . La señal de PpLuc se corrigió para la eficiencia de transfección por la señal del RrLuc co-transfectado (ver siguiente Tabla 13 y Figura 21) .

Tabla 13: La relación del nivel de luciferasa a 48 horas y 6 horas, figuras más altas que indican la estabilización de la expresión de proteínas, se calculó. Estos datos, indicando que tanto cualquiera de las 3'-UTR estabilizó el curso de tiempo de la expresión de proteínas, se resumen en la Tabla 14.

Tabla 14: El nivel de luciferasa del ARNm que carece de una 3'-UTR descendió de 6 horas a 48 horas, 49% de la señal de 6 horas que permanece a 48 horas. La 3'-UTR de albúmina humana y la 3'-UTR de albúmina de Olive baboon prolongaron notablemente la expresión de luciferasa del ARNm. De manera importante, la 3'-UTR de albúmina de ratón prolongó similarmente la expresión de luciferasa del ARNm en la línea de células HeLa humanas. Este resultado muestra que las 3'-UTRs de albúmina de mamífero son particularmente adecuadas para prolongar la expresión de proteínas del ARNm.

Secuencias : SEQ ID No. 1: CATCACATTT AAAAGCATCT CAGCCTACCA TGAGAATAAG AGAAAGAAAA TGAAGATCAA AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT TTAATCATTT TGCCTCTTTT CTCTGTGCTT CAATTAATAA AAAATGGAAA GAATCT SEQ ID No. 2: CAUCACAUÜU AAAAGCAUCU CAGCCUACCA ÜGAGAAUAAG AGAAAGAAAA UGAAGAUCAA AAGCUUAUUC AUCUGUUUUU CUUUUUCGUU GGUGUAAAGC CAACACCCUG UCUAAAAAAC AUAAAUUUCU UUAAUCAUUU UGCCUCUUUU CUCUGUGCUU CAAUUAAUAA AAAAUGGAAA GAAUCU SEQ ID No. 3: CATCACATTT AAAAGCATCT CAGCCTACCA TGAGAATAAG AGAAAGAAAA TGAAGATCAA AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT TTAATCATTT TGCCTCTTTT CTCTGTGCTT CAATTAATAA AAAATGGAAA GAATCTAGAT CTAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA SEQ ID No. 4: CAUCACAUUU AAAAGCAUCU CAGCCUACCA UGAGAAUAAG AGAAAGAAAA UGAAGAUCAA AAGCUUAUUC AUCUGUUUUU CUUUUUCGUU GGUGUAAAGC CAACACCCUG UCUAAAAAAC AUAAAUUUCU UUAAUCAUUU UGCCUCUUUU CUCUGÜGCUU CAAUUAAUAA AAAAUGGAAA GAAUCUAGAU CUAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA SEQ ID No. 5: GGGAGAAAGCTTGAGGATGGAGGACGCCAAGAACATCAAGAAGGGCCCGGCGCCCTTCTA CCCGCTGGAGGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCTCCACAAGGCCATGAAGCGGTACGCCCT GGTGCCGGGCACGATCGCCTTCACCGACGCCCACATCGAGGTCGACATCACCTACGCGGA GTACTTCGAGATGAGCGTGCGCCTGGCCGAGGCCATGAAGCGGTACGGCCTGAACACCAA CCACCGGATCGTGGTGTGCTCGGAGAACAGCCTGCAGTTCTTCATGCCGGTGCTGGGCGC CCTCTTCATCGGCGTGGCCGTCGCCCCGGCGAACGACATCTACAACGAGCGGGAGCTGCT GAACAGCATGGGGATCAGCCAGCCGACCGTGGTGTTCGTGAGCAAGAAGGGCCTGCAGAA GATCCTGAACGTGCAGAAGAAGCTGCCCATCATCCAGAAGATCATCATCATGGACAGCAA GACCGACTACCAGGGCTTCCAGTCGATGTACACGTTCGTGACCAGCCACCTCCCGCCGGG CTTCAACGAGTACGACTTCGTCCCGGAGAGCTTCGACCGGGACAAGACCATCGCCCTGAT CATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCGAAGGGGGTGGCCCTGCCGCACCGGACCGC CTGCGTGCGCTTCTCGCACGCCCGGGACCCCATCTTCGGCAACCAGATCATCCCGGACAC CGCCATCCTGAGCGTGGTGCCGTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACGACCCTGGGCTA CCTCATCTGCGGCTTCCGGGTGGTCCTGATGTACCGGTTCGAGGAGGAGCTGTTCCTGCG GAGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCGCTGCTCGTGCCGACCCTGTTCAGCTTCTT CGCCAAGAGCACCCTGATCGACAAGTACGACCTGTCGAACCTGCACGAGATCGCCAGCGG GGGCGCCCCGCTGAGCAAGGAGGTGGGCGAGGCCGTGGCCAAGCGGTTCCACCTCCCGGG CATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACCGAGACCACGAGCGCGATCCTGATCACCCCCGAGGG GGACGACAAGCCGGGCGCCGTGGGCAAGGTGGTCCCGTTCTTCGAGGCCAAGGTGGTGGA CCTGGACACCGGCAAGACCCTGGGCGTGAACCAGCGGGGCGAGCTGTGCGTGCGGGGGCC GATGATCATGAGCGGCTACGTGAACAACCCGGAGGCCACCAACGCCCTCATCGACAAGGA CGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCGCCTACTGGGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGT CGACCGGCTGAAGTCGCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCGCCGGCCGAGCTGGA GAGCATCCTGCTCCAGCACCCCAACATCTTCGACGCCGGCGTGGCCGGGCTGCCGGACGA CGACGCCGGCGAGCTGCCGGCCGCGGTGGTGGTGCTGGAGCACGGCAAGACCATGACGGA GAAGGAGATCGTCGACTACGTGGCCAGCCAGGTGACCACCGCCAAGAAGCTGCGGGGCGG CGTGGTGTTCGTGGACGAGGTCCCGAAGGGCCTGACCGGGAAGCTCGACGCCCGGAAGAT CCGCGAGATCCTGATCAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTGTAAGACTAGTAGAT CTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAA SEQ ID No. 6: GGGAGAAAGCTTGAGGATGGAGGACGCCAAGAACATCAAGAAGGGCCCGGCGCCCTTCTA CCCGCTGGAGGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCTCCACAAGGCCATGAAGCGGTACGCCCT GGTGCCGGGCACGATCGCCTTCACCGACGCCCACATCGAGGTCGACATCACCTACGCGGA GTACTTCGAGATGAGCGTGCGCCTGGCCGAGGCCATGAAGCGGTACGGCCTGAACACCAA CCACCGGATCGTGGTGTGCTCGGAGAACAGCCTGCAGTTCTTCATGCCGGTGCTGGGCGC CCTCTTCATCGGCGTGGCCGTCGCCCCGGCGAACGACATCTACAACGAGCGGGAGCTGCT GAACAGCATGGGGATCAGCCAGCCGACCGTGGTGTTCGTGAGCAAGAAGGGCCTGCAGAA GATCCTGAACGTGCAGAAGAAGCTGCCCATCATCCAGAAGATCATCATCATGGACAGCAA GACCGACTACCAGGGCTTCCAGTCGATGTACACGTTCGTGACCAGCCACCTCCCGCCGGG CTTCAACGAGTACGACTTCGTCCCGGAGAGCTTCGACCGGGACAAGACCATCGCCCTGAT CATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCGAAGGGGGTGGCCCTGCCGCACCGGACCGC CTGCGTGCGCTTCTCGCACGCCCGGGACCCCATCTTCGGCAACCAGATCATCCCGGACAC CGCCATCCTGAGCGTGGTGCCGTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACGACCCTGGGCTA CCTCATCTGCGGCTTCCGGGTGGTCCTGATGTACCGGTTCGAGGAGGAGCTGTTCCTGCG GAGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCGCTGCTCGTGCCGACCCTGTTCAGCTTCTT CGCCAAGAGCACCCTGATCGACAAGTACGACCTGTCGAACCTGCACGAGATCGCCAGCGG GGGCGCCCCGCTGAGCAAGGAGGTGGGCGAGGCCGTGGCCAAGCGGTTCCACCTCCCGGG CATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACCGAGACCACGAGCGCGATCCTGATCACCCCCGAGGG GGACGACAAGCCGGGCGCCGTGGGCAAGGTGGTCCCGTTCTTCGAGGCCAAGGTGGTGGA CCTGGACACCGGCAAGACCCTGGGCGTGAACCAGCGGGGCGAGCTGTGCGTGCGGGGGCC GATGATCATGAGCGGCTACGTGAACAACCCGGAGGCCACCAACGCCCTCATCGACAAGGA CGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCGCCTACTGGGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGT CGACCGGCTGAAGTCGCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCGCCGGCCGAGCTGGA GAGCATCCTGCTCCAGCACCCCAACATCTTCGACGCCGGCGTGGCCGGGCTGCCGGACGA CGACGCCGGCGAGCTGCCGGCCGCGGTGGTGGTGCTGGAGCACGGCAAGACCATGACGGA GAAGGAGATCGTCGACTACGTGGCCAGCCAGGTGACCACCGCCAAGAAGCTGCGGGGCGG CGTGGTGTTCGTGGACGAGGTCCCGAAGGGCCTGACCGGGAAGCTCGACGCCCGGAAGAT CCGCGAGATCCTGATCAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTGTAAGACTAGTGCAT CACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAAAAG CTTATTCATCTGTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATA AATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAA TCTAGATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAA SEQ ID No. 7: GGGAGAAAGCTTGAGGATGGAGGACGCCAAGAACATCAAGAAGGGCCCGGCGCCCTTCTA CCCGCTGGAGGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCTCCACAAGGCCATGAAGCGGTACGCCCT GGTGCCGGGCACGATCGCCTTCACCGACGCCCACATCGAGGTCGACATCACCTACGCGGA GTACTTCGAGATGAGCGTGCGCCTGGCCGAGGCCATGAAGCGGTACGGCCTGAACACCAA CCACCGGATCGTGGTGTGCTCGGAGAACAGCCTGCAGTTCTTCATGCCGGTGCTGGGCGC CCTCTTCATCGGCGTGGCCGTCGCCCCGGCGAACGACATCTACAACGAGCGGGAGCTGCT GAACAGCATGGGGATCAGCCAGCCGACCGTGGTGTTCGTGAGCAAGAAGGGCCTGCAGAA GATCCTGAACGTGCAGAAGAAGCTGCCCATCATCCAGAAGATCATCATCATGGACAGCAA GACCGACTACCAGGGCTTCCAGTCGATGTACACGTTCGTGACCAGCCACCTCCCGCCGGG CTTCAACGAGTACGACTTCGTCCCGGAGAGCTTCGACCGGGACAAGACCATCGCCCTGAT CATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCGAAGGGGGTGGCCCTGCCGCACCGGACCGC CTGCGTGCGCTTCTCGCACGCCCGGGACCCCATCTTCGGCAACCAGATCATCCCGGACAC CGCCATCCTGAGCGTGGTGCCGTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACGACCCTGGGCTA CCTCATCTGCGGCTTCCGGGTGGTCCTGATGTACCGGTTCGAGGAGGAGCTGTTCCTGCG GAGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCGCTGCTCGTGCCGACCCTGTTCAGCTTCTT CGCCAAGAGCACCCTGATCGACAAGTACGACCTGTCGAACCTGCACGAGATCGCCAGCGG GGGCGCCCCGCTGAGCAAGGAGGTGGGCGAGGCCGTGGCCAAGCGGTTCCACCTCCCGGG CATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACCGAGACCACGAGCGCGATCCTGATCACCCCCGAGGG GGACGACAAGCCGGGCGCCGTGGGCAAGGTGGTCCCGTTCTTCGAGGCCAAGGTGGTGGA CCTGGACACCGGCAAGACCCTGGGCGTGAACCAGCGGGGCGAGCTGTGCGTGCGGGGGCC GATGATCATGAGCGGCTACGTGAACAACCCGGAGGCCACCAACGCCCTCATCGACAAGGA CGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCGCCTACTGGGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGT CGACCGGCTGAAGTCGCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCGCCGGCCGAGCTGGA GAGCATCCTGCTCCAGCACCCCAACATCTTCGACGCCGGCGTGGCCGGGCTGCCGGACGA CGACGCCGGCGAGCTGCCGGCCGCGGTGGTGGTGCTGGAGCACGGCAAGACCATGACGGA GAAGGAGATCGTCGACTACGTGGCCAGCCAGGTGACCACCGCCAAGAAGCTGCGGGGCGG CGTGGTGTTCGTGGACGAGGTCCCGAAGGGCCTGACCGGGAAGCTCGACGCCCGGAAGAT CCGCGAGATCCTGATCAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTGTAAGACTAGTGCAT CACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAAAAG CTTATTCGTCTGTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATA AATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAA TCTAGATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAA SEQ ID No. 8: GGGAGAAAGCTTGAGGATGGAGGACGCCAAGAACATCAAGAAGGGCCCGGCGCCCTTCTA CCCGCTGGAGGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCTCCACAAGGCCATGAAGCGGTACGCCCT GGTGCCGGGCACGATCGCCTTCACCGACGCCCACATCGAGGTCGACATCACCTACGCGGA GTACTTCGAGATGAGCGTGCGCCTGGCCGAGGCCATGAAGCGGTACGGCCTGAACACCAA CCACCGGATCGTGGTGTGCTCGGAGAACAGCCTGCAGTTCTTCATGCCGGTGCTGGGCGC CCTCTTCATCGGCGTGGCCGTCGCCCCGGCGAACGACATCTACAACGAGCGGGAGCTGCT GAACAGCATGGGGATCAGCCAGCCGACCGTGGTGTTCGTGAGCAAGAAGGGCCTGCAGAA GATCCTGAACGTGCAGAAGAAGCTGCCCATCATCCAGAAGATCATCATCATGGACAGCAA GACCGACTACCAGGGCTTCCAGTCGATGTACACGTTCGTGACCAGCCACCTCCCGCCGGG CTTCAACGAGTACGACTTCGTCCCGGAGAGCTTCGACCGGGACAAGACCATCGCCCTGAT CATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCGAAGGGGGTGGCCCTGCCGCACCGGACCGC CTGCGTGCGCTTCTCGCACGCCCGGGACCCCATCTTCGGCAACCAGATCATCCCGGACAC CGCCATCCTGAGCGTGGTGCCGTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACGACCCTGGGCTA CCTCATCTGCGGCTTCCGGGTGGTCCTGATGTACCGGTTCGAGGAGGAGCTGTTCCTGCG GAGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCGCTGCTCGTGCCGACCCTGTTCAGCTTCTT CGCCAAGAGCACCCTGATCGACAAGTACGACCTGTCGAACCTGCACGAGATCGCCAGCGG GGGCGCCCCGCTGAGCAAGGAGGTGGGCGAGGCCGTGGCCAAGCGGTTCCACCTCCCGGG CATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACCGAGACCACGAGCGCGATCCTGATCACCCCCGAGGG GGACGACAAGCCGGGCGCCGTGGGCAAGGTGGTCCCGTTCTTCGAGGCCAAGGTGGTGGA CCTGGACACCGGCAAGACCCTGGGCGTGAACCAGCGGGGCGAGCTGTGCGTGCGGGGGCC GATGATCATGAGCGGCTACGTGAACAACCCGGAGGCCACCAACGCCCTCATCGACAAGGA CGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCGCCTACTGGGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGT CGACCGGCTGAAGTCGCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCGCCGGCCGAGCTGGA GAGCATCCTGCTCCAGCACCCCAACATCTTCGACGCCGGCGTGGCCGGGCTGCCGGACGA CGACGCCGGCGAGCTGCCGGCCGCGGTGGTGGTGCTGGAGCACGGCAAGACCATGACGGA GAAGGAGATCGTCGACTACGTGGCCAGCCAGGTGACCACCGCCAAGAAGCTGCGGGGCGG CGTGGTGTTCGTGGACGAGGTCCCGAAGGGCCTGACCGGGAAGCTCGACGCCCGGAAGAT CCGCGAGATCCTGATCAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTGTAAGACTAGTGCAT CACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAAAAG CTTATTCATCAGTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATA AATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAA TCTAGATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAA SEQ ID No. 9: GGGAGAAAGCTTGAGGATGGAGGACGCCAAGAACATCAAGAAGGGCCCGGCGCCCTTCTA CCCGCTGGAGGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCTCCACAAGGCCATGAAGCGGTACGCCCT GGTGCCGGGCACGATCGCCTTCACCGACGCCCACATCGAGGTCGACATCACCTACGCGGA GTACTTCGAGATGAGCGTGCGCCTGGCCGAGGCCATGAAGCGGTACGGCCTGAACACCAA CCACCGGATCGTGGTGTGCTCGGAGAACAGCCTGCAGTTCTTCATGCCGGTGCTGGGCGC CCTCTTCATCGGCGTGGCCGTCGCCCCGGCGAACGACATCTACAACGAGCGGGAGCTGCT GAACAGCATGGGGATCAGCCAGCCGACCGTGGTGTTCGTGAGCAAGAAGGGCCTGCAGAA GATCCTGAACGTGCAGAAGAAGCTGCCCATCATCCAGAAGATCATCATCATGGACAGCAA GACCGACTACCAGGGCTTCCAGTCGATGTACACGTTCGTGACCAGCCACCTCCCGCCGGG CTTCAACGAGTACGACTTCGTCCCGGAGAGCTTCGACCGGGACAAGACCATCGCCCTGAT CATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCGAAGGGGGTGGCCCTGCCGCACCGGACCGC CTGCGTGCGCTTCTCGCACGCCCGGGACCCCATCTTCGGCAACCAGATCATCCCGGACAC CGCCATCCTGAGCGTGGTGCCGTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACGACCCTGGGCTA CCTCATCTGCGGCTTCCGGGTGGTCCTGATGTACCGGTTCGAGGAGGAGCTGTTCCTGCG GAGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCGCTGCTCGTGCCGACCCTGTTCAGCTTCTT CGCCAAGAGCACCCTGATCGACAAGTACGACCTGTCGAACCTGCACGAGATCGCCAGCGG GGGCGCCCCGCTGAGCAAGGAGGTGGGCGAGGCCGTGGCCAAGCGGTTCCACCTCCCGGG CATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACCGAGACCACGAGCGCGATCCTGATCACCCCCGAGGG GGACGACAAGCCGGGCGCCGTGGGCAAGGTGGTCCCGTTCTTCGAGGCCAAGGTGGTGGA CCTGGACACCGGCAAGACCCTGGGCGTGAACCAGCGGGGCGAGCTGTGCGTGCGGGGGCC GATGATCATGAGCGGCTACGTGAACAACCCGGAGGCCACCAACGCCCTCATCGACAAGGA CGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCGCCTACTGGGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGT CGACCGGCTGAAGTCGCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCGCCGGCCGAGCTGGA GAGCATCCTGCTCCAGCACCCCAACATCTTCGACGCCGGCGTGGCCGGGCTGCCGGACGA CGACGCCGGCGAGCTGCCGGCCGCGGTGGTGGTGCTGGAGCACGGCAAGACCATGACGGA GAAGGAGATCGTCGACTACGTGGCCAGCCAGGTGACCACCGCCAAGAAGCTGCGGGGCGG CGTGGTGTTCGTGGACGAGGTCCCGAAGGGCCTGACCGGGAAGCTCGACGCCCGGAAGAT CCGCGAGATCCTGATCAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTGTAAGACTAGTGCAT CACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAAAAG CTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATA AATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAA TCTAGATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAA SEQ ID No. 10: GGGAGAAAGCTTGAGGATGGAGGACGCCAAGAACATCAAGAAGGGCCCGGCGCCCTTCTA CCCGCTGGAGGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCTCCACAAGGCCATGAAGCGGTACGCCCT GGTGCCGGGCACGATCGCCTTCACCGACGCCCACATCGAGGTCGACATCACCTACGCGGA GTACTTCGAGATGAGCGTGCGCCTGGCCGAGGCCATGAAGCGGTACGGCCTGAACACCAA CCACCGGATCGTGGTGTGCTCGGAGAACAGCCTGCAGTTCTTCATGCCGGTGCTGGGCGC CCTCTTCATCGGCGTGGCCGTCGCCCCGGCGAACGACATCTACAACGAGCGGGAGCTGCT GAACAGCATGGGGATCAGCCAGCCGACCGTGGTGTTCGTGAGCAAGAAGGGCCTGCAGAA GATCCTGAACGTGCAGAAGAAGCTGCCCATCATCCAGAAGATCATCATCATGGACAGCAA GACCGACTACCAGGGCTTCCAGTCGATGTACACGTTCGTGACCAGCCACCTCCCGCCGGG CTTCAACGAGTACGACTTCGTCCCGGAGAGCTTCGACCGGGACAAGACCATCGCCCTGAT CATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCGAAGGGGGTGGCCCTGCCGCACCGGACCGC CTGCGTGCGCTTCTCGCACGCCCGGGACCCCATCTTCGGCAACCAGATCATCCCGGACAC CGCCATCCTGAGCGTGGTGCCGTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACGACCCTGGGCTA CCTCATCTGCGGCTTCCGGGTGGTCCTGATGTACCGGTTCGAGGAGGAGCTGTTCCTGCG GAGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCGCTGCTCGTGCCGACCCTGTTCAGCTTCTT CGCCAAGAGCACCCTGATCGACAAGTACGACCTGTCGAACCTGCACGAGATCGCCAGCGG GGGCGCCCCGCTGAGCAAGGAGGTGGGCGAGGCCGTGGCCAAGCGGTTCCACCTCCCGGG CATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACCGAGACCACGAGCGCGATCCTGATCACCCCCGAGGG GGACGACAAGCCGGGCGCCGTGGGCAAGGTGGTCCCGTTCTTCGAGGCCAAGGTGGTGGA CCTGGACACCGGCAAGACCCTGGGCGTGAACCAGCGGGGCGAGCTGTGCGTGCGGGGGCC GATGATCATGAGCGGCTACGTGAACAACCCGGAGGCCACCAACGCCCTCATCGACAAGGA CGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCGCCTACTGGGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGT CGACCGGCTGAAGTCGCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCGCCGGCCGAGCTGGA GAGCATCCTGCTCCAGCACCCCAACATCTTCGACGCCGGCGTGGCCGGGCTGCCGGACGA CGACGCCGGCGAGCTGCCGGCCGCGGTGGTGGTGCTGGAGCACGGCAAGACCATGACGGA GAAGGAGATCGTCGACTACGTGGCCAGCCAGGTGACCACCGCCAAGAAGCTGCGGGGCGG CGTGGTGTTCGTGGACGAGGTCCCGAAGGGCCTGACCGGGAAGCTCGACGCCCGGAAGAT CCGCGAGATCCTGATCAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTGTAAGACTAGTGCAT CACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAAAAG CTTATTCATCTGTTGGTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATA AATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAA TCTAGATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAA SEQ ID No. 11: GGGAGAAAGCTTGAGGATGGAGGACGCCAAGAACATCAAGAAGGGCCCGGCGCCCTTCTA CCCGCTGGAGGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCTCCACAAGGCCATGAAGCGGTACGCCCT GGTGCCGGGCACGATCGCCTTCACCGACGCCCACATCGAGGTCGACATCACCTACGCGGA GTACTTCGAGATGAGCGTGCGCCTGGCCGAGGCCATGAAGCGGTACGGCCTGAACACCAA CCACCGGATCGTGGTGTGCTCGGAGAACAGCCTGCAGTTCTTCATGCCGGTGCTGGGCGC CCTCTTCATCGGCGTGGCCGTCGCCCCGGCGAACGACATCTACAACGAGCGGGAGCTGCT GAACAGCATGGGGATCAGCCAGCCGACCGTGGTGTTCGTGAGCAAGAAGGGCCTGCAGAA GATCCTGAACGTGCAGAAGAAGCTGCCCATCATCCAGAAGATCATCATCATGGACAGCAA GACCGACTACCAGGGCTTCCAGTCGATGTACACGTTCGTGACCAGCCACCTCCCGCCGGG CTTCAACGAGTACGACTTCGTCCCGGAGAGCTTCGACCGGGACAAGACCATCGCCCTGAT CATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCGAAGGGGGTGGCCCTGCCGCACCGGACCGC CTGCGTGCGCTTCTCGCACGCCCGGGACCCCATCTTCGGCAACCAGATCATCCCGGACAC CGCCATCCTGAGCGTGGTGCCGTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACGACCCTGGGCTA CCTCATCTGCGGCTTCCGGGTGGTCCTGATGTACCGGTTCGAGGAGGAGCTGTTCCTGCG GAGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCGCTGCTCGTGCCGACCCTGTTCAGCTTCTT CGCCAAGAGCACCCTGATCGACAAGTACGACCTGTCGAACCTGCACGAGATCGCCAGCGG GGGCGCCCCGCTGAGCAAGGAGGTGGGCGAGGCCGTGGCCAAGCGGTTCCACCTCCCGGG CATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACCGAGACCACGAGCGCGATCCTGATCACCCCCGAGGG GGACGACAAGCCGGGCGCCGTGGGCAAGGTGGTCCCGTTCTTCGAGGCCAAGGTGGTGGA CCTGGACACCGGCAAGACCCTGGGCGTGAACCAGCGGGGCGAGCTGTGCGTGCGGGGGCC GATGATCATGAGCGGCTACGTGAACAACCCGGAGGCCACCAACGCCCTCATCGACAAGGA CGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCGCCTACTGGGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGT CGACCGGCTGAAGTCGCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCGCCGGCCGAGCTGGA GAGCATCCTGCTCCAGCACCCCAACATCTTCGACGCCGGCGTGGCCGGGCTGCCGGACGA CGACGCCGGCGAGCTGCCGGCCGCGGTGGTGGTGCTGGAGCACGGCAAGACCATGACGGA GAAGGAGATCGTCGACTACGTGGCCAGCCAGGTGACCACCGCCAAGAAGCTGCGGGGCGG CGTGGTGTTCGTGGACGAGGTCCCGAAGGGCCTGACCGGGAAGCTCGACGCCCGGAAGAT CCGCGAGATCCTGATCAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTGTAAGACTAGTGCAT CACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAG CTTATTCATCTGTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATA AATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAA CCTAGATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAA SEQ ID No. 12: GGGAGAAAGCTTGAGGATGGAGGACGCCAAGAACATCAAGAAGGGCCCGGCGCCCTTCTA CCCGCTGGAGGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCTCCACAAGGCCATGAAGCGGTACGCCCT GGTGCCGGGCACGATCGCCTTCACCGACGCCCACATCGAGGTCGACATCACCTACGCGGA GTACTTCGAGATGAGCGTGCGCCTGGCCGAGGCCATGAAGCGGTACGGCCTGAACACCAA CCACCGGATCGTGGTGTGCTCGGAGAACAGCCTGCAGTTCTTCATGCCGGTGCTGGGCGC CCTCTTCATCGGCGTGGCCGTCGCCCCGGCGAACGACATCTACAACGAGCGGGAGCTGCT GAACAGCATGGGGATCAGCCAGCCGACCGTGGTGTTCGTGAGCAAGAAGGGCCTGCAGAA GATCCTGAACGTGCAGAAGAAGCTGCCCATCATCCAGAAGATCATCATCATGGACAGCAA GACCGACTACCAGGGCTTCCAGTCGATGTACACGTTCGTGACCAGCCACCTCCCGCCGGG CTTCAACGAGTACGACTTCGTCCCGGAGAGCTTCGACCGGGACAAGACCATCGCCCTGAT CATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCGAAGGGGGTGGCCCTGCCGCACCGGACCGC CTGCGTGCGCTTCTCGCACGCCCGGGACCCCATCTTCGGCAACCAGATCATCCCGGACAC CGCCATCCTGAGCGTGGTGCCGTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACGACCCTGGGCTA CCTCATCTGCGGCTTCCGGGTGGTCCTGATGTACCGGTTCGAGGAGGAGCTGTTCCTGCG GAGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCGCTGCTCGTGCCGACCCTGTTCAGCTTCTT CGCCAAGAGCACCCTGATCGACAAGTACGACCTGTCGAACCTGCACGAGATCGCCAGCGG GGGCGCCCCGCTGAGCAAGGAGGTGGGCGAGGCCGTGGCCAAGCGGTTCCACCTCCCGGG CATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACCGAGACCACGAGCGCGATCCTGATCACCCCCGAGGG GGACGACAAGCCGGGCGCCGTGGGCAAGGTGGTCCCGTTCTTCGAGGCCAAGGTGGTGGA CCTGGACACCGGCAAGACCCTGGGCGTGAACCAGCGGGGCGAGCTGTGCGTGCGGGGGCC GATGATCATGAGCGGCTACGTGAACAACCCGGAGGCCACCAACGCCCTCATCGACAAGGA CGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCGCCTACTGGGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGT CGACCGGCTGAAGTCGCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCGCCGGCCGAGCTGGA GAGCATCCTGCTCCAGCACCCCAACATCTTCGACGCCGGCGTGGCCGGGCTGCCGGACGA CGACGCCGGCGAGCTGCCGGCCGCGGTGGTGGTGCTGGAGCACGGCAAGACCATGACGGA GAAGGAGATCGTCGACTACGTGGCCAGCCAGGTGACCACCGCCAAGAAGCTGCGGGGCGG CGTGGTGTTCGTGGACGAGGTCCCGAAGGGCCTGACCGGGAAGCTCGACGCCCGGAAGAT CCGCGAGATCCTGATCAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTGTAAGACTAGTGCAT CACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAG CTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATA AATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAA CCTAGATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAA SEQ ID No. 13: GGGAGAAAGCTTGAGGATGGAGGACGCCAAGAACATCAAGAAGGGCCCGGCGCCCTTCTA CCCGCTGGAGGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCTCCACAAGGCCATGAAGCGGTACGCCCT GGTGCCGGGCACGATCGCCTTCACCGACGCCCACATCGAGGTCGACATCACCTACGCGGA GTACTTCGAGATGAGCGTGCGCCTGGCCGAGGCCATGAAGCGGTACGGCCTGAACACCAA CCACCGGATCGTGGTGTGCTCGGAGAACAGCCTGCAGTTCTTCATGCCGGTGCTGGGCGC CCTCTTCATCGGCGTGGCCGTCGCCCCGGCGAACGACATCTACAACGAGCGGGAGCTGCT GAACAGCATGGGGATCAGCCAGCCGACCGTGGTGTTCGTGAGCAAGAAGGGCCTGCAGAA GATCCTGAACGTGCAGAAGAAGCTGCCCATCATCCAGAAGATCATCATCATGGACAGCAA GACCGACTACCAGGGCTTCCAGTCGATGTACACGTTCGTGACCAGCCACCTCCCGCCGGG CTTCAACGAGTACGACTTCGTCCCGGAGAGCTTCGACCGGGACAAGACCATCGCCCTGAT CATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCGAAGGGGGTGGCCCTGCCGCACCGGACCGC CTGCGTGCGCTTCTCGCACGCCCGGGACCCCATCTTCGGCAACCAGATCATCCCGGACAC CGCCATCCTGAGCGTGGTGCCGTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACGACCCTGGGCTA CCTCATCTGCGGCTTCCGGGTGGTCCTGATGTACCGGTTCGAGGAGGAGCTGTTCCTGCG GAGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCGCTGCTCGTGCCGACCCTGTTCAGCTTCTT CGCCAAGAGCACCCTGATCGACAAGTACGACCTGTCGAACCTGCACGAGATCGCCAGCGG GGGCGCCCCGCTGAGCAAGGAGGTGGGCGAGGCCGTGGCCAAGCGGTTCCACCTCCCGGG CATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACCGAGACCACGAGCGCGATCCTGATCACCCCCGAGGG GGACGACAAGCCGGGCGCCGTGGGCAAGGTGGTCCCGTTCTTCGAGGCCAAGGTGGTGGA CCTGGACACCGGCAAGACCCTGGGCGTGAACCAGCGGGGCGAGCTGTGCGTGCGGGGGCC GATGATCATGAGCGGCTACGTGAACAACCCGGAGGCCACCAACGCCCTCATCGACAAGGA CGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCGCCTACTGGGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGT CGACCGGCTGAAGTCGCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCGCCGGCCGAGCTGGA GAGCATCCTGCTCCAGCACCCCAACATCTTCGACGCCGGCGTGGCCGGGCTGCCGGACGA CGACGCCGGCGAGCTGCCGGCCGCGGTGGTGGTGCTGGAGCACGGCAAGACCATGACGGA GAAGGAGATCGTCGACTACGTGGCCAGCCAGGTGACCACCGCCAAGAAGCTGCGGGGCGG CGTGGTGTTCGTGGACGAGGTCCCGAAGGGCCTGACCGGGAAGCTCGACGCCCGGAAGAT CCGCGAGATCCTGATCAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTGTAAGACTAGTTATA AGACTGACTAGCCCGATGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGCACCGAGATTA ATAGATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAA SEQ ID No. 14 : GGGAGAAAGCTTGAGGATGGAGGACGCCAAGAACATCAAGAAGGGCCCGGCGCCCTTCTA CCCGCTGGAGGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCTCCACAAGGCCATGAAGCGGTACGCCCT GGTGCCGGGCACGATCGCCTTCACCGACGCCCACATCGAGGTCGACATCACCTACGCGGA GTACTTCGAGATGAGCGTGCGCCTGGCCGAGGCCATGAAGCGGTACGGCCTGAACACCAA CCACCGGATCGTGGTGTGCTCGGAGAACAGCCTGCAGTTCTTCATGCCGGTGCTGGGCGC CCTCTTCATCGGCGTGGCCGTCGCCCCGGCGAACGACATCTACAACGAGCGGGAGCTGCT GAACAGCATGGGGATCAGCCAGCCGACCGTGGTGTTCGTGAGCAAGAAGGGCCTGCAGAA GATCCTGAACGTGCAGAAGAAGCTGCCCATCATCCAGAAGATCATCATCATGGACAGCAA GACCGACTACCAGGGCTTCCAGTCGATGTACACGTTCGTGACCAGCCACCTCCCGCCGGG CTTCAACGAGTACGACTTCGTCCCGGAGAGCTTCGACCGGGACAAGACCATCGCCCTGAT CATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCGAAGGGGGTGGCCCTGCCGCACCGGACCGC CTGCGTGCGCTTCTCGCACGCCCGGGACCCCATCTTCGGCAACCAGATCATCCCGGACAC CGCCATCCTGAGCGTGGTGCCGTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACGACCCTGGGCTA CCTCATCTGCGGCTTCCGGGTGGTCCTGATGTACCGGTTCGAGGAGGAGCTGTTCCTGCG GAGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCGCTGCTCGTGCCGACCCTGTTCAGCTTCTT CGCCAAGAGCACCCTGATCGACAAGTACGACCTGTCGAACCTGCACGAGATCGCCAGCGG GGGCGCCCCGCTGAGCAAGGAGGTGGGCGAGGCCGTGGCCAAGCGGTTCCACCTCCCGGG CATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACCGAGACCACGAGCGCGATCCTGATCACCCCCGAGGG GGACGACAAGCCGGGCGCCGTGGGCAAGGTGGTCCCGTTCTTCGAGGCCAAGGTGGTGGA CCTGGACACCGGCAAGACCCTGGGCGTGAACCAGCGGGGCGAGCTGTGCGTGCGGGGGCC GATGATCATGAGCGGCTACGTGAACAACCCGGAGGCCACCAACGCCCTCATCGACAAGGA CGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCGCCTACTGGGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGT CGACCGGCTGAAGTCGCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCGCCGGCCGAGCTGGA GAGCATCCTGCTCCAGCACCCCAACATCTTCGACGCCGGCGTGGCCGGGCTGCCGGACGA CGACGCCGGCGAGCTGCCGGCCGCGGTGGTGGTGCTGGAGCACGGCAAGACCATGACGGA GAAGGAGATCGTCGACTACGTGGCCAGCCAGGTGACCACCGCCAAGAAGCTGCGGGGCGG CGTGGTGTTCGTGGACGAGGTCCCGAAGGGCCTGACCGGGAAGCTCGACGCCCGGAAGAT CCGCGAGATCCTGATCAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTGTAAGACTAGTGCAA GACTGATACCACCTGCGTGTCCCTTCCTCCCCGAGTCAGGGCGACTTCCACAGCAGCAGA ACAAGTGCCTCCTGGACTGTTCACGGCAGACCAGAACGTTTCTGGCCTGGGTTTTGTGGT CATCTATTCTAGCAGGGAACACTAAAGGTGGAAATAAAAGATTTTCTATTATGGAAATAA AGAGTTGGCATGAAAGTGGCTACTGAGATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID No. 15: GGGAGAAAGCTTGAGGATGGAGGACGCCAAGAACATCAAGAAGGGCCCGGCGCCCTTCTA CCCGCTGGAGGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCTCCACAAGGCCATGAAGCGGTACGCCCT GGTGCCGGGCACGATCGCCTTCACCGACGCCCACATCGAGGTCGACATCACCTACGCGGA GTACTTCGAGATGAGCGTGCGCCTGGCCGAGGCCATGAAGCGGTACGGCCTGAACACCAA CCACCGGATCGTGGTGTGCTCGGAGAACAGCCTGCAGTTCTTCATGCCGGTGCTGGGCGC CCTCTTCATCGGCGTGGCCGTCGCCCCGGCGAACGACATCTACAACGAGCGGGAGCTGCT GAACAGCATGGGGATCAGCCAGCCGACCGTGGTGTTCGTGAGCAAGAAGGGCCTGCAGAA GATCCTGAACGTGCAGAAGAAGCTGCCCATCATCCAGAAGATCATCATCATGGACAGCAA GACCGACTACCAGGGCTTCCAGTCGATGTACACGTTCGTGACCAGCCACCTCCCGCCGGG CTTCAACGAGTACGACTTCGTCCCGGAGAGCTTCGACCGGGACAAGACCATCGCCCTGAT CATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCGAAGGGGGTGGCCCTGCCGCACCGGACCGC CTGCGTGCGCTTCTCGCACGCCCGGGACCCCATCTTCGGCAACCAGATCATCCCGGACAC CGCCATCCTGAGCGTGGTGCCGTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACGACCCTGGGCTA CCTCATCTGCGGCTTCCGGGTGGTCCTGATGTACCGGTTCGAGGAGGAGCTGTTCCTGCG GAGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCGCTGCTCGTGCCGACCCTGTTCAGCTTCTT CGCCAAGAGCACCCTGATCGACAAGTACGACCTGTCGAACCTGCACGAGATCGCCAGCGG GGGCGCCCCGCTGAGCAAGGAGGTGGGCGAGGCCGTGGCCAAGCGGTTCCACCTCCCGGG CATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACCGAGACCACGAGCGCGATCCTGATCACCCCCGAGGG GGACGACAAGCCGGGCGCCGTGGGCAAGGTGGTCCCGTTCTTCGAGGCCAAGGTGGTGGA CCTGGACACCGGCAAGACCCTGGGCGTGAACCAGCGGGGCGAGCTGTGCGTGCGGGGGCC GATGATCATGAGCGGCTACGTGAACAACCCGGAGGCCACCAACGCCCTCATCGACAAGGA CGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCGCCTACTGGGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGT CGACCGGCTGAAGTCGCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCGCCGGCCGAGCTGGA GAGCATCCTGCTCCAGCACCCCAACATCTTCGACGCCGGCGTGGCCGGGCTGCCGGACGA CGACGCCGGCGAGCTGCCGGCCGCGGTGGTGGTGCTGGAGCACGGCAAGACCATGACGGA GAAGGAGATCGTCGACTACGTGGCCAGCCAGGTGACCACCGCCAAGAAGCTGCGGGGCGG CGTGGTGTTCGTGGACGAGGTCCCGAAGGGCCTGACCGGGAAGCTCGACGCCCGGAAGAT CCGCGAGATCCTGATCAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTGTAAGACTAGTAAGT GTTGGTTTTCTGCCATCAGTGAAAATTCTTAAACTTGGAGCAACAATAAAAAGCTTCCAG AACAGATCAGATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID No. 16: GGGAGAAAGCTTGAGGATGGAGGACGCCAAGAACATCAAGAAGGGCCCGGCGCCCTTCTA CCCGCTGGAGGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCTCCACAAGGCCATGAAGCGGTACGCCCT GGTGCCGGGCACGATCGCCTTCACCGACGCCCACATCGAGGTCGACATCACCTACGCGGA GTACTTCGAGATGAGCGTGCGCCTGGCCGAGGCCATGAAGCGGTACGGCCTGAACACCAA CCACCGGATCGTGGTGTGCTCGGAGAACAGCCTGCAGTTCTTCATGCCGGTGCTGGGCGC CCTCTTCATCGGCGTGGCCGTCGCCCCGGCGAACGACATCTACAACGAGCGGGAGCTGCT GAACAGCATGGGGATCAGCCAGCCGACCGTGGTGTTCGTGAGCAAGAAGGGCCTGCAGAA GATCCTGAACGTGCAGAAGAAGCTGCCCATCATCCAGAAGATCATCATCATGGACAGCAA GACCGACTACCAGGGCTTCCAGTCGATGTACACGTTCGTGACCAGCCACCTCCCGCCGGG CTTCAACGAGTACGACTTCGTCCCGGAGAGCTTCGACCGGGACAAGACCATCGCCCTGAT CATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCGAAGGGGGTGGCCCTGCCGCACCGGACCGC CTGCGTGCGCTTCTCGCACGCCCGGGACCCCATCTTCGGCAACCAGATCATCCCGGACAC CGCCATCCTGAGCGTGGTGCCGTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACGACCCTGGGCTA CCTCATCTGCGGCTTCCGGGTGGTCCTGATGTACCGGTTCGAGGAGGAGCTGTTCCTGCG GAGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCGCTGCTCGTGCCGACCCTGTTCAGCTTCTT CGCCAAGAGCACCCTGATCGACAAGTACGACCTGTCGAACCTGCACGAGATCGCCAGCGG GGGCGCCCCGCTGAGCAAGGAGGTGGGCGAGGCCGTGGCCAAGCGGTTCCACCTCCCGGG CATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACCGAGACCACGAGCGCGATCCTGATCACCCCCGAGGG GGACGACAAGCCGGGCGCCGTGGGCAAGGTGGTCCCGTTCTTCGAGGCCAAGGTGGTGGA CCTGGACACCGGCAAGACCCTGGGCGTGAACCAGCGGGGCGAGCTGTGCGTGCGGGGGCC GATGATCATGAGCGGCTACGTGAACAACCCGGAGGCCACCAACGCCCTCATCGACAAGGA CGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCGCCTACTGGGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGT CGACCGGCTGAAGTCGCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCGCCGGCCGAGCTGGA GAGCATCCTGCTCCAGCACCCCAACATCTTCGACGCCGGCGTGGCCGGGCTGCCGGACGA CGACGCCGGCGAGCTGCCGGCCGCGGTGGTGGTGCTGGAGCACGGCAAGACCATGACGGA GAAGGAGATCGTCGACTACGTGGCCAGCCAGGTGACCACCGCCAAGAAGCTGCGGGGCGG CGTGGTGTTCGTGGACGAGGTCCCGAAGGGCCTGACCGGGAAGCTCGACGCCCGGAAGAT CCGCGAGATCCTGATCAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTGTAAGACTAGTGGAA GCATTTTCCTGATTGATGAAAAAAATAACTCAGTTATGGCCATCTACCCCTGCTAGAAGG TTACAGTGTATTATGTAGCATGCAATGTGTTATGTAGTGCTTAATAAAAATAAAATGAAA AAAATGCAGATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID No. 17 : GGGAGAAAGCTTGAGGATGGAGGACGCCAAGAACATCAAGAAGGGCCCGGCGCCCTTCTA CCCGCTGGAGGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCTCCACAAGGCCATGAAGCGGTACGCCCT GGTGCCGGGCACGATCGCCTTCACCGACGCCCACATCGAGGTCGACATCACCTACGCGGA GTACTTCGAGATGAGCGTGCGCCTGGCCGAGGCCATGAAGCGGTACGGCCTGAACACCAA CCACCGGATCGTGGTGTGCTCGGAGAACAGCCTGCAGTTCTTCATGCCGGTGCTGGGCGC CCTCTTCATCGGCGTGGCCGTCGCCCCGGCGAACGACATCTACAACGAGCGGGAGCTGCT GAACAGCATGGGGATCAGCCAGCCGACCGTGGTGTTCGTGAGCAAGAAGGGCCTGCAGAA GATCCTGAACGTGCAGAAGAAGCTGCCCATCATCCAGAAGATCATCATCATGGACAGCAA GACCGACTACCAGGGCTTCCAGTCGATGTACACGTTCGTGACCAGCCACCTCCCGCCGGG CTTCAACGAGTACGACTTCGTCCCGGAGAGCTTCGACCGGGACAAGACCATCGCCCTGAT CATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCGAAGGGGGTGGCCCTGCCGCACCGGACCGC CTGCGTGCGCTTCTCGCACGCCCGGGACCCCATCTTCGGCAACCAGATCATCCCGGACAC CGCCATCCTGAGCGTGGTGCCGTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACGACCCTGGGCTA CCTCATCTGCGGCTTCCGGGTGGTCCTGATGTACCGGTTCGAGGAGGAGCTGTTCCTGCG GAGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCGCTGCTCGTGCCGACCCTGTTCAGCTTCTT CGCCAAGAGCACCCTGATCGACAAGTACGACCTGTCGAACCTGCACGAGATCGCCAGCGG GGGCGCCCCGCTGAGCAAGGAGGTGGGCGAGGCCGTGGCCAAGCGGTTCCACCTCCCGGG CATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACCGAGACCACGAGCGCGATCCTGATCACCCCCGAGGG GGACGACAAGCCGGGCGCCGTGGGCAAGGTGGTCCCGTTCTTCGAGGCCAAGGTGGTGGA CCTGGACACCGGCAAGACCCTGGGCGTGAACCAGCGGGGCGAGCTGTGCGTGCGGGGGCC GATGATCATGAGCGGCTACGTGAACAACCCGGAGGCCACCAACGCCCTCATCGACAAGGA CGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCGCCTACTGGGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGT CGACCGGCTGAAGTCGCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCGCCGGCCGAGCTGGA GAGCATCCTGCTCCAGCACCCCAACATCTTCGACGCCGGCGTGGCCGGGCTGCCGGACGA CGACGCCGGCGAGCTGCCGGCCGCGGTGGTGGTGCTGGAGCACGGCAAGACCATGACGGA GAAGGAGATCGTCGACTACGTGGCCAGCCAGGTGACCACCGCCAAGAAGCTGCGGGGCGG CGTGGTGTTCGTGGACGAGGTCCCGAAGGGCCTGACCGGGAAGCTCGACGCCCGGAAGAT CCGCGAGATCCTGATCAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTGTAAGACTAGTAGAC CAATCTTTAACATCTGATTATATTTGATTTATTATTTGAGTGTTGTTGGACCATGTGTGA TCAGACTGCTATCTGAATAAAATAAGATTTGTCAAAACTCAGTGTTTTCTCCATCAGACA CTCCATGAAAGGTCACAATTTCTCTTGATATTAAGCTGGGTTGTCTTTAAACAACCCTAA ATACACGTCTGTTTAGCCCGCAATTGGAAAGGATATATGTGGCAATATTAACCTGGTACA TGAATATATGGGGATAACATTTTAATTTGAAGGTTTGGAATATATATATTTAAGCTTTAT TTCCAGAACAGTGAGGGTTAGGTCTTGGGAAAACTATAACTTGCCAAAGTAGAAGAAATA GTAGTACCATATGCCAAAGTGATAGAGATGAATCATGTCAGTAGTTAGAATAACATTTCA ACTGTTTTCTTTGCTAAAATCACAGAAAGACCCTATTGACAACATCTATGTCTGTAAAAA TGTTAGAGTACTTGTCATCTTGAATATAGCCTCCCCAAGAGAGAACAGGGTGGTATTCTA AGTATGTTTCTTTGTAACATCTTTAGCAGTAGGACAGAGCCATACATGTGAAATCTGATT TTTATGTGTGTTATTCGTTTGTCTGGTTTTACTACCTTTGCAAAAACAAAATACCCCAAA GATATTTAAACAAGGTTATAATTTAGCATCTTCCCTGGATCTAAATAGTATATTATATCC TGAAATAAATGAAA GATTGCTATAGATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID No. 18: AAAAGCATCT CAGCCTACCA TGAGAATAAG AGAAAGAAAA TGAAGATCAA AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT TTAATCATTT TGCCTCTTTT CTCTGTGCTT CAATT SEQ ID No. 19: CATCACATTT AAAAGCATCT CAGCCTACCA TGAGAATAAG AGAAAGAAAA TGAAGATCAA AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG SEQ ID No. 20: AAAAGCATCT CAGCCTACCA TGAGAATAAG AGAAAGAAAA TGAAGATCAA AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC SEQ ID No. 21 CAGCCTACCA TGAGAATAAG AGAAAGAAAA TGAAGATCAA AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT SEQ ID No. 22 TGAGAATAAG AGAAAGAAAA TGAAGATCAA AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT TTAATCATTT SEQ ID No. 23: AGAAAGAAAA TGAAGATCAA AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT TTAATCATTT TGCCTCTTTT SEQ ID No. 24: TGAAGATCAA AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT TTAATCATTT TGCCTCTTTT CTCTGTGCTT SEQ ID No. 25: AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT TTAATCATTT TGCCTCTTTT CTCTGTGCTT CAATTAATAA SEQ ID No. 26: ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT TTAATCATTT TGCCTCTTTT CTCTGTGCTT CAATTAATAA AAAATGGAAA SEQ ID No. 27: CAGCCTACCA TGAGAATAAG AGAAAGAAAA TGAAGATCAA AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT TTAATCATTT TGCCTCTTTT CTCTGTGCTT CAATTAATAA A SEQ ID No. 28: TGAAGATCAA AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT TTAATCATTT TGCCTCTTTT CTCTGTGCTT CAATTAATAA A SEQ ID No. 29: CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT TTAATCATTT TGCCTCTTTT CTCTGTGCTT CAATTAATAA A SEQ ID No. 30: AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC SEQ ID No. 31: CAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCA SEQ ID No. 32: AAACATCACA ATTAAGAACA TCTCAGCCTA CCATGAGAAC AAGAGAAATA AAATGAAGAT CAAAAGCTTA TTCATCTGTT TTTCTTTTTC ATTGGTATAA AGCCAACACC CTGTCTAAAA AACTATAAAT TTCTTTAATC ATTTTGCCTC TTTTCTCTGT GCTTCAATTA ATAAAAAATG GAAAGAATCT AGATCTAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA SEQ ID No. 33: AAACAUCACA AUUAAGAACA UCUCAGCCUA CCAUGAGAAC AAGAGAAAUA AAAUGAAGAU CAAAAGCUUA UUCAUCUGUU UUUCUUUUUC AUUGGUAUAA AGCCAACACC CUGUCUAAAA AACUAUAAAU UUCUUUAAUC AUUUUGCCUC UUUUCUCUGU GCUUCAAUUA AUAAAAAAUG GAAAGAAUCU AGAUCUAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA SEQ ID No. 34 : ACACATCACA ACCACAACCT TCTCAGGCTA CCCTGAGAAA AAAAGACATG AAGACTCAGG ACTCATCTTT TCTGTTGGTG TAAAATCAAC ACCCTAAGGA ACACAAATTT CTTTAAACAT TTGACTTCTT GTCTCTGTGC TGCAATTAAT AAAAAATGGA AAGAATCTAC AGATCTAAAA AAAA SEQ ID No. 35: ACACAUCACA ACCACAACCU UCUCAGGCUA CCCUGAGAAA AAAAGACAUG AAGACUCAGG ACUCAUCUUU UCUGUUGGUG UAAAAUCAAC ACCCUAAGGA ACACAAAUUU CUUUAAACAU UUGACUUCUU GUCUCUGUGC UGCAAUUAAU AAAAAAUGGA AAGAAUCUAC AGAUCUAAAA AAAA SEQ ID No. 36: AAACATCACA ATTAAGAACA TCTCAGCCTA CCATGAGAAC AAGAGAAATA AAATGAAGAT CAAAAGCTTA TTCATCTGTT TTTCTTTTTC ATTGGTATAA AGCCAACACC CTGTCTAAAA AACTATAAAT TTCTTTAATC ATTTTGCCTC TTTTCTCTGT GCTTCAATTA ATAAAAAATG GAAAGAATCT AGATCTAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA SEQ ID No. 37: AAACAUCACA AUUAAGAACA UCUCAGCCUA CCAUGAGAAC AAGAGAAAUA AAAUGAAGAU CAAAAGCUUA UUCAUCUGUU UUUCUUUUUC AUUGGUAUAA AGCCAACACC CUGUCUAAAA AACUAUAAAU UUCUTTAATC ATTTTGCCTC TTTTCTCTGT GCTTCAATTA ATAAAAAATG GAAAGAATCT AGATCTAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA SEQ ID No. 38 : ACACATCACA ACCACAACCT TCTCAGGCTA CCCTGAGAAA AAAAGACATG AAGACTCAGG ACTCATCTTT TCTGTTGGTG TAAAATCAAC ACCCTAAGGA ACACAAATTT CTTTAAACAT TTGACTTCTT GTCTCTGTGC TGCAATTAAT AAAAAATGGA AAGAATCTAC AGATCTAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA SEQ ID No. 39: ACACAUCACA ACCACAACCU UCUCAGGCUA CCCUGAGAAA AAAAGACAUG AAGACUCAGG ACUCAUCUUU UCUGUUGGUG UAAAAUCAAC ACCCUAAGGA ACACAAAUUU CUUUAAACAU UUGACUUCUÜ GUCUCUGUGC UGCAAUUAAU AAAAAAUGGA AAGAAUCUAC AGAUCUAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA SEQ ID No. 40 : GGGAGAAAGC TTGAGGATGG AGGACGCCAA GAACATCAAG AAGGGCCCGG CGCCCTTCTA CCCGCTGGAG GACGGGACCG CCGGCGAGCA GCTCCACAAG GCCATGAAGC GGTACGCCCT GGTGCCGGGC ACGATCGCCT TCACCGACGC CCACATCGAG GTCGACATCA CCTACGCGGA GTACTTCGAG ATGAGCGTGC GCCTGGCCGA GGCCATGAAG CGGTACGGCC TGAACACCAA CCACCGGATC GTGGTGTGCT CGGAGAACAG CCTGCAGTTC TTCATGCCGG TGCTGGGCGC CCTCTTCATC GGCGTGGCCG TCGCCCCGGC GAACGACATC TACAACGAGC GGGAGCTGCT GAACAGCATG GGGATCAGCC AGCCGACCGT GGTGTTCGTG AGCAAGAAGG GCCTGCAGAA GATCCTGAAC GTGCAGAAGA AGCTGCCCAT CATCCAGAAG ATCATCATCA TGGACAGCAA GACCGACTAC CAGGGCTTCC AGTCGATGTA CACGTTCGTG ACCAGCCACC TCCCGCCGGG CTTCAACGAG TACGACTTCG TCCCGGAGAG CTTCGACCGG GACAAGACCA TCGCCCTGAT CATGAACAGC AGCGGCAGCA CCGGCCTGCC GAAGGGGGTG GCCCTGCCGC ACCGGACCGC CTGCGTGCGC TTCTCGCACG CCCGGGACCC CATCTTCGGC AACCAGATCA TCCCGGACAC CGCCATCCTG AGCGTGGTGC CGTTCCACCA CGGCTTCGGC ATGTTCACGA CCCTGGGCTA CCTCATCTGC GGCTTCCGGG TGGTCCTGAT GTACCGGTTC GAGGAGGAGC TGTTCCTGCG GAGCCTGCAG GACTACAAGA TCCAGAGCGC GCTGCTCGTG CCGACCCTGT TCAGCTTCTT CGCCAAGAGC ACCCTGATCG ACAAGTACGA CCTGTCGAAC CTGCACGAGA TCGCCAGCGG GGGCGCCCCG CTGAGCAAGG AGGTGGGCGA GGCCGTGGCC AAGCGGTTCC ACCTCCCGGG CATCCGCCAG GGCTACGGCC TGACCGAGAC CACGAGCGCG ATCCTGATCA CCCCCGAGGG GGACGACAAG CCGGGCGCCG TGGGCAAGGT GGTCCCGTTC TTCGAGGCCA AGGTGGTGGA CCTGGACACC GGCAAGACCC TGGGCGTGAA CCAGCGGGGC GAGCTGTGCG TGCGGGGGCC GATGATCATG AGCGGCTACG TGAACAACCC GGAGGCCACC AACGCCCTCA TCGACAAGGA CGGCTGGCTG CACAGCGGCG ACATCGCCTA CTGGGACGAG GACGAGCACT TCTTCATCGT CGACCGGCTG AAGTCGCTGA TCAAGTACAA GGGCTACCAG GTGGCGCCGG CCGAGCTGGA GAGCATCCTG CTCCAGCACC CCAACATCTT CGACGCCGGC GTGGCCGGGC TGCCGGACGA CGACGCCGGC GAGCTGCCGG CCGCGGTGGT GGTGCTGGAG CACGGCAAGA CCATGACGGA GAAGGAGATC GTCGACTACG TGGCCAGCCA GGTGACCACC GCCAAGAAGC TGCGGGGCGG CGTGGTGTTC GTGGACGAGG TCCCGAAGGG CCTGACCGGG AAGCTCGACG CCCGGAAGAT CCGCGAGATC CTGATCAAGG CCAAGAAGGG CGGCAAGATC GCCGTGTAAG ACTAGTAAAC ATCACAATTA AGAACATCTC AGCCTACCAT GAGAACAAGA GAAATAAAAT GAAGATCAAA AGCTTATTCA TCTGTTTTTC TTTTTCATTG GTATAAAGCC AACACCCTGT CTAAAAAACT ATAAATTTCT TTAATCATTT TGCCTCTTTT CTCTGTGCTT CAATTAATAA AAAATGGAAA GAATCTAGAT CTAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA SEQ ID No. 41: GGGAGAAAGC TTGAGGATGG AGGACGCCAA GAACATCAAG AAGGGCCCGG CGCCCTTCTA CCCGCTGGAG GACGGGACCG CCGGCGAGCA GCTCCACAAG GCCATGAAGC GGTACGCCCT GGTGCCGGGC ACGATCGCCT TCACCGACGC CCACATCGAG GTCGACATCA CCTACGCGGA GTACTTCGAG ATGAGCGTGC GCCTGGCCGA GGCCATGAAG CGGTACGGCC TGAACACCAA CCACCGGATC GTGGTGTGCT CGGAGAACAG CCTGCAGTTC TTCATGCCGG TGCTGGGCGC CCTCTTCATC GGCGTGGCCG TCGCCCCGGC GAACGACATC TACAACGAGC GGGAGCTGCT GAACAGCATG GGGATCAGCC AGCCGACCGT GGTGTTCGTG AGCAAGAAGG GCCTGCAGAA GATCCTGAAC GTGCAGAAGA AGCTGCCCAT CATCCAGAAG ATCATCATCA TGGACAGCAA GACCGACTAC CAGGGCTTCC AGTCGATGTA CACGTTCGTG ACCAGCCACC TCCCGCCGGG CTTCAACGAG TACGACTTCG TCCCGGAGAG CTTCGACCGG GACAAGACCA TCGCCCTGAT CATGAACAGC AGCGGCAGCA CCGGCCTGCC GAAGGGGGTG GCCCTGCCGC ACCGGACCGC CTGCGTGCGC TTCTCGCACG CCCGGGACCC CATCTTCGGC AACCAGATCA TCCCGGACAC CGCCATCCTG AGCGTGGTGC CGTTCCACCA CGGCTTCGGC ATGTTCACGA CCCTGGGCTA CCTCATCTGC GGCTTCCGGG TGGTCCTGAT GTACCGGTTC GAGGAGGAGC TGTTCCTGCG GAGCCTGCAG GACTACAAGA TCCAGAGCGC GCTGCTCGTG CCGACCCTGT TCAGCTTCTT CGCCAAGAGC ACCCTGATCG ACAAGTACGA CCTGTCGAAC CTGCACGAGA TCGCCAGCGG GGGCGCCCCG CTGAGCAAGG AGGTGGGCGA GGCCGTGGCC AAGCGGTTCC ACCTCCCGGG CATCCGCCAG GGCTACGGCC TGACCGAGAC CACGAGCGCG ATCCTGATCA CCCCCGAGGG GGACGACAAG CCGGGCGCCG TGGGCAAGGT GGTCCCGTTC TTCGAGGCCA AGGTGGTGGA CCTGGACACC GGCAAGACCC TGGGCGTGAA CCAGCGGGGC GAGCTGTGCG TGCGGGGGCC GATGATCATG AGCGGCTACG TGAACAACCC GGAGGCCACC AACGCCCTCA TCGACAAGGA CGGCTGGCTG CACAGCGGCG ACATCGCCTA CTGGGACGAG GACGAGCACT TCTTCATCGT CGACCGGCTG AAGTCGCTGA TCAAGTACAA GGGCTACCAG GTGGCGCCGG CCGAGCTGGA GAGCATCCTG CTCCAGCACC CCAACATCTT CGACGCCGGC GTGGCCGGGC TGCCGGACGA CGACGCCGGC GAGCTGCCGG CCGCGGTGGT GGTGCTGGAG CACGGCAAGA CCATGACGGA GAAGGAGATC GTCGACTACG TGGCCAGCCA GGTGACCACC GCCAAGAAGC TGCGGGGCGG CGTGGTGTTC GTGGACGAGG TCCCGAAGGG CCTGACCGGG AAGCTCGACG CCCGGAAGAT CCGCGAGATC CTGATCAAGG CCAAGAAGGG CGGCAAGATC GCCGTGTAAG ACTAGTACAC ATCACAACCA CAACCTTCTC AGGCTACCCT GAGAAAAAAA GACATGAAGA CTCAGGACTC ATCTTTTCTG TTGGTGTAAA ATCAACACCC TAAGGAACAC AAATTTCTTT AAACATTTGA CTTCTTGTCT CTGTGCTGCA ATTAATAAAA AATGGAAAGA ATCTACAGAT CTAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico artificial, caracterizada porque comprende a. por lo menos un marco de lectura abierto (ORF) ; y b. por lo menos un elemento de región 3' -no traducida (elemento 3'UTR) que comprende una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen de albúmina o de una variante de la 3'UTR de un gen de albúmina, en donde el marco de lectura abierto no codifica de manera preferente la beta-globina , en particular en el caso en que el elemento 3'UTR se derive de la 3'UTR del gen de albúmina de rata, y en donde el marco de lectura abierto no codifica de manera preferente el factor IX humano, en particular en caso de que el elemento 3'UTR se derive de la 3'UTR del gen de albúmina humana.

2. La molécula de ácido nucleico artificial de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el por lo menos un elemento 3'UTR estabiliza/prolonga la producción de proteínas de la molécula de ácido nucleico artificial .

3. La molécula de ácido nucleico artificial de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque el por lo menos un elemento 3'UTR comprende una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen de albúmina de vertebrado o de una variante del mismo, de manera preferente de la 3'UTR de un gen de albúmina de mamífero por ejemplo del gen de albúmina de ratón o de una variante del mismo, de manera más preferente de la 3'UTR de un gen de albúmina de primate, particularmente del gen de albúmina humana o el gen de albúmina de Olive baboon, o de una variante del mismo, de manera aún más preferente de la 3'UTR del gen de albúmina humana de acuerdo con el número de Acceso de GenBank NM_000477.5 o de una variante del mismo.

4. La molécula de ácido nucleico artificial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque el por lo menos un elemento 3'UTR comprende o consiste de una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad por lo menos aproximadamente 40%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 50%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 60%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 70%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 80%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 95%, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 99% a la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID No. 34, o SEQ ID No. 35, o en donde el por lo menos un elemento 3'UTR comprende o consiste de un fragmento de una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad por lo menos aproximadamente 40%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 50%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 60%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 70%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 80%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 95%, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 99% a la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID No. 34, o SEQ ID No. 35.

5. La molécula de ácido nucleico artificial de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el fragmento muestra una longitud de por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos, de manera preferente por lo menos aproximadamente 75 nucleótidos, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 100 nucleótidos, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 125 nucleótidos, de manera mucho más preferente de por lo menos aproximadamente 150 nucleótidos.

6. La molécula de ácido nucleico artificial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque el por lo menos un elemento 3'UTR muestra una longitud de por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos, de manera preferente por lo menos aproximadamente 75 nucleótidos, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 100 nucleótidos, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 125 nucleótidos, de manera mucho más preferente por lo menos aproximadamente 150 nucleótidos .

7. La molécula de ácido nucleico artificial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque además comprende c. una secuencia poli (A) y/o una señal de poliadenilación.

8. La molécula de ácido nucleico artificial de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la señal de poliadenilación se sitúa dentro del elemento 3'UTR.

9. La molécula de ácido nucleico artificial de conformidad con la reivindicación 7 o 8, caracterizada porque la señal de poliadenilación comprende la secuencia consenso NN (U/T) ANA, con N = A o U, de manera preferente AA (U/T) AAA o A(U/T) (U/T) AAA.

10. La molécula de ácido nucleico artificial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-9, caracterizada porque la señal de poliadenilación, de manera preferente la secuencia consenso NNUANA, se sitúa menor que aproximadamente 50 nucleótidos cadena arriba del extremo 3' de la 3'UTR.

11. La molécula de ácido nucleico artificial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-10, caracterizada porque la secuencia poli (A) tiene una longitud de aproximadamente 20 a aproximadamente 300 nucleótidos de adenina, de manera preferente de aproximadamente 40 a aproximadamente 200 nucleótidos de adenina, de manera más preferente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 nucleótidos de adenina, de manera aún más preferente de aproximadamente 60 a aproximadamente 70 nucleótidos de adenina .

12. La molécula de ácido nucleico artificial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizada porque el marco de lectura abierto no codifica la albúmina, de manera preferente no la albúmina humana.

13. La molécula de ácido nucleico artificial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizada porque además comprende una estructura de tapa 5', una secuencia poli (C) , un tallo-asa de histona, y/o una porción IRES.

14. La molécula de ácido nucleico artificial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizada porque el ácido nucleico comprende un elemento 5' adicional, de manera preferente una 5'UTR, un promotor, o una 5'UTR y una secuencia que contiene promotor.

15. La molécula de ácido nucleico artificial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizada porque de la molécula de ácido nucleico artificial, de manera preferente el marco de lectura abierto, está por lo menos parcialmente modificado con G/C, de manera preferente en donde el contenido de G/C del marco de lectura abierto se incrementa comparado con el marco de lectura abierto de tipo natural.

16. La molécula de ácido nucleico artificial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizada porque el marco de lectura abierto comprende una reqión optimizada con codón, de manera preferente, en donde el marco de lectura abierto se optimiza con codón.

17. La molécula de ácido nucleico artificial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, caracterizada porque es una ARN, de manera preferente una molécula de ARNm.

18. Un vector, caracterizado porque comprende a. un marco de lectura abierto y/o un sitio de clonación; y b. por lo menos un elemento de región 3' no traducida (elemento 3'UTR) que comprende una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen de albúmina o de una variante de la 3'UTR de un gen de albúmina en donde el marco de lectura abierto no codifica de manera preferente la beta-globina , en particular en caso de que el elemento 3'UTR se derive de la 3'UTR del gen de albúmina de rata, y en donde el marco de lectura abierto no codifica de manera preferente el factor IX humano, en particular en caso de que el elemento 3'UTR se derive de la 3'UTR del gen de albúmina humana.

19. El vector de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el por lo menos un elemento 3'UTR comprende o consiste de una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen de albúmina de vertebrado o de una variante del mismo, de manera preferente de la 3'UTR de un gen de albúmina de mamífero por ejemplo del gen de albúmina de ratón o de una variante del mismo, de manera más preferente de la 3'UTR de un gen de albúmina de primate, en particular del gen de albúmina humana o el gen de albúmina de Olive baboon, o de una variante del mismo, de manera aún más preferente de la 3'UTR del gen de albúmina humana de acuerdo con el número de acceso de GenBank NM_000477.5 o de una variante del mismo.

20. El vector de conformidad con la reivindicación 18 o 19, caracterizado porque el por lo menos un elemento 3'UTR comprende o consiste de una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad por lo menos aproximadamente 40%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 50%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 60%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 70%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 80%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 95%, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 99% a la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID No. 34, o SEQ ID No. 35, o en donde el por lo menos un elemento 3'UTR comprende o consiste de un fragmento de una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad por lo menos aproximadamente 40%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 50%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 60%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 70%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 80%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 95%, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 99% a la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID No. 34, o SEQ ID No. 35.

21. El vector de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el fragmento muestra una longitud de por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos, de manera preferente por lo menos aproximadamente 75 nucleótidos, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 100 nucleótidos, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 125 nucleótidos, de manera mucho más preferente de por lo menos aproximadamente 150 nucleótidos.

22. El vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-21, caracterizado porque el por lo menos un elemento 3'UTR muestra una longitud de por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos, de manera preferente por lo menos aproximadamente 75 nucleótidos, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 100 nucleótidos, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 125 nucleótidos, de manera mucho más preferente por lo menos aproximadamente 150 nucleótidos.

23. El vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-22, caracterizado porque además comprende c. una secuencia poli (A) y/o una señal de poliadenilación .

24. El vector de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la señal de poliadenilación se sitúa dentro del elemento 3'UTR.

25. El vector de conformidad con la reivindicación 23 o 24, caracterizado porque la señal de poliadenilación comprende la secuencia consenso NN(U/T)ANA, con N = A o U, de manera preferente A (U/T) AA o A(U/T) (U/T ) AAA .

26. El vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23-25, caracterizado porque la señal de poliadenilación, de manera preferente la secuencia consenso NNUANA, se sitúa menor que aproximadamente 50 nucleótidos cadena arriba del extremo 3' del elemento 3'UTR.

27. El vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23-26, caracterizado porque la secuencia poli (A) tiene una longitud de aproximadamente 20 a aproximadamente 300 nucleótidos de adenina, de manera preferente de aproximadamente 40 a aproximadamente 200 nucleótidos de adenina, de manera más preferente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 nucleótidos de adenina, de manera más preferente de aproximadamente 60 a aproximadamente 70 nucleótidos de adenina.

28. El vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-27, caracterizado porque el marco de lectura abierto no codifica la albúmina humana, de manera preferente no la albúmina.

29. El vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-28, caracterizado porque el marco de lectura abierto no codifica el factor IX humano o una proteina reportera, de manera preferente no para una proteina GFP, una proteina luciferasa o una proteina globina, o variantes de las mismas.

30. El vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-29, caracterizado porque además comprende una secuencia poli(C), un bucle-asa de histona y/o una porción IRES.

31. El vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-30, caracterizado porque además comprende un elemento 5', de manera preferente una 5'UTR, un promotor, o una 5'UTR y una secuencia que contiene promotor.

32. El vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-31, caracterizado porque está por lo menos parcialmente modificado con G/C, de manera preferente en donde el marco de lectura abierto se modifica por lo menos parcialmente con G/C, de manera preferente en donde el contenido de G/C del marco de lectura abierto se incrementa comparado con el narco de lectura abierto de tipo natural.

33. El vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-32, caracterizado porque el marco de lectura abierto comprende una región optimizada con codón, de manera preferente en donde el marco de lectura abierto se optimiza con codón.

34. El vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-33, caracterizado porque es un vector de ADN.

35. El vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-34, caracterizado porque es un vector plásmido o un vector viral, de manera preferente un vector plásmido .

36. El vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-35, caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico acuerdo artificial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17.

37. El vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-36, caracterizado porque es una molécula circular .

38. El vector de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la secuencia poli (A) o el elemento 3'UTR de la hebra de codificación se sigue en la dirección 5'- 3' por un sitio de restricción para la linealización de la molécula vector circular.

39. Una célula, caracterizada porque comprende la molécula de ácido nucleico artificial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 o el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-38.

40. La célula de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque es una célula de mamífero.

41. La célula de conformidad con la reivindicación 39 o 40, caracterizada porque es una célula de un sujeto o mamífero, de manera preferente una célula aislada de un sujeto mamífero, de manera preferente de un sujeto humano.

42. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende la molécula de ácido nucleico artificial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-38, o la célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39-41.

43. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada porque además comprende uno o más diluyentes y/o excipientes y/o uno o más adyuvantes farmacéuticamente aceptables.

44. La molécula de ácido nucleico artificial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-38, la célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39-41, o la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 42 o 43, caracterizados porque son para el uso como un medicamento.

45. La molécula de ácido nucleico artificial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-38, la célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39-41, o la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 42 o 43, caracterizados porque son para el uso como una vacuna o para uso en la terapia génica.

46. Un método para tratar o prevenir un trastorno, caracterizado porque comprende administrar la molécula de ácido nucleico artificial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-38, la célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39-41, o la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 42 o 43 a un sujeto en necesidad del mismo.

47. Un método para tratar o prevenir un trastorno, caracterizado porque comprende la transfección de una célula con una molécula de ácido nucleico artificial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 o con el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-38.

48. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la transfección en una célula se lleva a cabo in vitro/ex vivo y la célula transfectada se administra a un sujeto en necesidad del mismo, de manera preferente un paciente humano.

49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la célula que se va a transfectar in vitro es una célula aislada del sujeto, de manera preferente del paciente humano.

50. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 46-49, caracterizado porque es un método de vacunación o un método de terapia génica.

51. Un método para estabilizar y/o prolongar la producción de proteínas de una molécula de ácido nucleico, de manera preferente de una molécula de ARNm o un vector, el método caracterizado porque comprende la etapa de asociar la molécula de ácido nucleico, de manera preferente la molécula de ARNm o el vector, con un elemento 3'UTR, en donde el elemento 3'UTR comprende o consiste de una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen de albúmina o de una variante de la 3'UTR de un gen de albúmina.

52. Uso de un elemento 3'UTR para estabilizar y/o prolongar la producción de proteina de una molécula de ácido nucleico, de manera preferente de una molécula de ARNm o un vector, en donde el elemento 3'UTR comprende o consiste de una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen de albúmina o de una variante de la 3'UTR de un gen de albúmina .

53. El método de conformidad con la reivindicación 51 o el uso de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el elemento 3'UTR comprende o consiste de una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen de albúmina de vertebrado o de una variante del mismo, de manera preferente de la 3'UTR de un gen de albúmina de mamífero por ejemplo el gen de albúmina de ratón o de una variante del mismo, de manera más preferente de la 3'UTR de un gen de albúmina de primate, en particular del gen de albúmina humana o el gen de albúmina de Olive baboon, o de una variante del mismo, de manera aún más preferente de la 3'UTR del gen de albúmina humana de acuerdo con el número de Acceso de GenBank NM_000477.5 o de una variante del mismo.

54. El método o el uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 51-53, caracterizado porque el elemento 3'UTR comprende o consiste de una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad por lo menos aproximadamente 40%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 50%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 60%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 70%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 80%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 95%, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 99% a la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID No. 34, o SEQ ID No. 35, o en donde el elemento 3'UTR comprende o consiste de un fragmento de una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de por lo menos aproximadamente 40%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 50%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 60%, de manera preferente por lo menos aproximadamente 70%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 80%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 90%, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 95%, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 99% a la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID No. 34, o SEQ ID No. 35.

55. El método o el uso de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el fragmento muestra una longitud de por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos, de manera preferente por lo menos aproximadamente 75 nucleotidos, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 100 nucleotidos, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 125 nucleotidos, de manera mucho más preferente de por lo menos aproximadamente 150 nucleotidos .

56. El método o el uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 51-55, caracterizado porque el elemento 3'UTR muestra una longitud de por lo menos aproximadamente 50 nucleotidos, de manera preferente por lo menos aproximadamente 75 nucleotidos, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 100 nucleotidos, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 125 nucleotidos, de manera mucho más preferente de por lo menos aproximadamente 150 nucleotidos.

57. Un kit o kit de partes, caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico acuerdo artificial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, un vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-38, una célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39-41, y/o una composición farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 42 o 43.

58. El kit de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque además comprende instrucciones para el uso, células para transíección, un adyuvante, un medio para administración de la composición farmacéutica, un portador farmacéuticamente aceptable y/o una solución farmacéuticamente aceptable para disolución o dilución de la molécula de ácido nucleico artificial, el vector de ADN o la composición farmacéutica.