MX2014010527A

MX2014010527A - Anticuerpos humanos para toxinas de clostridium difficile.

Info

Publication number: MX2014010527A
Application number: MX2014010527A
Authority: MX
Inventors: Anne Gurnett-Bander; Carlos Arrecubieta; Israel Lowy
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2012-03-02
Filing date: 2013-03-01
Publication date: 2014-10-14
Also published as: UY34652A; US20130230531A1; NZ628943A; IL233884A0; JP2015509962A; US9399674B2; SG10201610123UA; US20160264650A1; AR090219A1; CN104203976A; WO2013130981A1; TW201350501A; SG11201405087PA; BR112014021251A2; CA2863536A1; AU2013203942B2; RU2014139552A; RU2017127772A; TWI592422B; AU2013203942A1

Abstract

La presente invención proporciona anticuerpos completamente humanos que se unen a ya sea toxina A o toxina B de Clostridium difficile, o tanto a toxina A como B, comprendiendo las composiciones los anticuerpos y métodos de uso. Los anticuerpos de la invención son útiles para neutralizar las toxinas de C. difficile, proporcionando así un medio para tratar la enfermedad y síntomas asociados con una infección de C. difficile, incluyendo el tratamiento de diarrea, o colitis pseudomembranosa provocada por C. difficile. Los anticuerpos también pueden prevenir la severidad y/o duración de la enfermedad primaria, o pueden prevenir el número, duración y/o la severidad de recurrencias o recaídas de la enfermedad atribuida a la presencia de C. difficile. Los anticuerpos de la invención también pueden ser útiles para el diagnóstico de una infección por C. difficile.

Description

ANTICUERPOS HUMANOS PARA TOXINAS DE CLOSTRIDIUM DIFFICILE Campo de la invención La presente invención se refiere a anticuerpos humanos y fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos humanos que se unen específicamente a toxina A y/o toxina B de Clostridium difficile.

Técnica anterior El Clostridum difficile (C. difficile) es una bacteria formadora de esporas, anaeróbica, gram positiva, la cual es una causa mayor de enfermedad gastrointestinal adquirida en hospital en humanos, resultando en síntomas que varían de diarrea suave a severa y colitis. Se cree que el tratamiento con antibióticos de amplio espectro, tal como ampicilina, amoxicilina, cefalosporinas, fluoroquinolonas y clindamicina, pueden resultar en ruptura de flora intestinal normal, lo cual permite entonces la colonización en el intestino con C. difficile (Kelly and Lamont, (1998), Ann. Rev. Med. 49:375-90). El tratamiento de infecciones de C. difficile pueden involucrar detención o modificación del uso de antibióticos de amplio espectro y requiere comenzar tratamiento con antibióticos anticlostrid iales específicos, tales como, por ejemplo, vancomicina, metronidazol o fidaxomicina.

Se cree que la diarrea e inflamación observadas en pacientes que sufren de una infección de C. difficile se debe a la producción de dos toxinas por la bacteria, enterotoxina (toxina A) y citotoxina (toxina B).

Las toxinas de C. difficile A y B son glucosiltransferasas de alto peso molecular que inhiben los miembros de la familia Rho de las GTPasas. La Toxina A tiene un peso molecular de 308 kDa y la Toxina B tiene un peso molecular de 270 kDa. Ambas toxinas A y B desactivan pequeñas GTPasas tales como Rho, Rae y Cdc42 mediante glucosilación de un residuo de treonina. La inhibición de estas GTPasas provoca el cierre de cascadas de transducción de señales que conducen a: despolimerización del citoesqueleto, transcripción de genes de ciertas proteína cinasas activadas por tensión, una caída en la síntesis de fosfatidilinositol bisfosfato, y posiblemente incluso la pérdida de polaridad celular. La pérdida de estructura citoesquelética resulta en redondeo celular, y esta pérdida de estructura puede responder por las reacciones de huésped a C. difficile. La toxina B es al menos 1,000 veces más citotóxica que la toxina A en ensayos de redondeo celular.

Las toxinas A y B de C. difficile son 63% homologas en contenido de aminoácidos y tienen una estructura tridimensional similar (Davies, AH, (2011), Biochem., J., 436:517-526). El tercio C-terminal de cada toxina es hecho de secuencias llamadas oligopéptidos repetitivos clostridiales (CROPs), los cuales son altamente antigénicos. Los dos tercios N-terminales restantes de toxinas Ay B son menos similares unos a otros con respecto a la homología de secuencia; sin embargo, es esta porción de cada proteína la que contiene la actividad de glucosiltransferasa.

El soporte para el papel de toxina A y/o toxina B en el inicio de diarrea e inflamación siguiendo infección con C. difficile deriva de observaciones en modelos animales. Por ejemplo, la dosificación oral con las toxinas imita la enfermedad (Kelly y Lamont, (1998), Ann. Rev. Med. 49:375-90). Las cepas mutantes que carecen de toxina A y B tienen virulencia reducida o alterada (Lyras D, O'Connor JR, PK et al., Nature 458(72429, 1176-1179 (2009), Kuehne SA, Cartman ST, Heap JT, Kelly L, Cockayne A, Minton NP, Nature 15, 467/7316), 711-713 (2010).). Adicionalmente, la administración de anticuerpos policlonales a las toxinas ha mostrado proteger hámsters de la enfermedad (Gianasca et al., (1999), Infec. Immun. 66(2): 527-38). En la clínica, estudios han mostrado que existe una correlación entre la presencia de anticuerpos anti-toxina A o anti-toxina B y protección contra diarrea asociada con C. difficile y recurrencia de la enfermedad (Warny, M. et al., (1994), Inf. Immun. 62(2): 384-389; Kyne, L. et al. (2001), Lancet 357:189-193; Leav, B.A., (2010), Vaccine 28(4):965-969). El desarrollo de anticuerpo anti-toxina está asociado con portadores asintomáticos (Kyne, L. et al. (2000), NEJM 342(6), 390-397). Adicionalmente, un ensayo clínico que usa una combinación de anticuerpos antitoxina A y anti-toxina B de C. difficile en conjunción con metronidazol o vancomicina, resultó en una reducción en la tasa de infección recurrente con C. difficile (Lowy, I. et al., (2010), NEJM 362(3): 197-25.

Los anticuerpos monoclonales para toxina A de C. difficile han sido descritos por Wilkins, et al. En la patente estadounidense 4,879,218. Además, Rothman et al. Describieron un anticuerpo monoclonal de murino que reacciona cruzado con toxinas A y B de C. difficile. Además, Coughlin et al. describieron un anticuerpo monoclonal específico para toxina B de C. difficile, el cual no reacciona cruzado con la toxina A. Otros anticuerpos para las toxinas de C. difficile han sido descritos (ver, por ejemplo, US7,151,159; US7,625,559; US8,236,311; US8,257,709; publicaciones estadounidenses nos. 2009/0087478; US2010/0233182; US2010/0233181 ; US2012/0288508; US2012/012160; US2011/0020356; US2012/01261607; EP1766093B1, EP1024826B1, EP1568378A1, EP2305303A2; EP2305293A2, EP24050401 A1 , EP2261253A2, WO2006/121422; WO2011/130650; WO2010/094970; WO2009/108652; WO2011/063346 y WO2005/058353).

Breve descripción de la invención La invención proporciona anticuerpos monoclonales completamente humanos (mAbs) y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a cualquier toxina A o a toxina B producidas por Clostridium difficile (C. difficile), o los cuales se unen a ambas toxinas A y B de C. difficile (es decir, anticuerpos monoclonales humanos que reaccionan cruzado tanto con toxina A como toxina B). Tales anticuerpos pueden ser útiles para neutralizar la toxicidad asociada con ya sea toxina A o toxina B, o ambas, y como tales pueden actuar para disminuir la severidad de la condición o enfermedad asociada con C. difficile primaria, o reducir el número, la duración o la severidad de recurrencia de enfermedad, o mejorar al menos un síntoma asociado con la condición o enfermedad asociada con C. difficile. Tales anticuerpos pueden ser usados solos o en conjunción con un segundo agente útil para tratar una condición o enfermedad asociada con C. difficile. E n ciertas modalidades, los anticuerpos específicos para toxina, toxi na B, o am bas, pueden ser adm inistrados terapéuticamente en conjunción con un segundo agente para disminuir la severidad de la condición o enfermedad asociada con C. difficile primaria , o para reducir el número, la duración , o la severidad de recurrencia de enfermedad , o mejorar al menos un síntoma asociado con la condición o enfermedad asociada con C. difficile. En ciertas modalidades, los anticuerpos pueden ser usados profilácticamente como terapia sola para proteger pacientes que están en riesgo de desarrollar una condición o enfermedad asociada con C. difficile. Por ejemplo, ciertas poblaciones de pacientes pueden estar en riesgo de desarrol lar una condición o enfermedad de C. difficile, incluyendo pacientes mayores, o pacientes que tienen condiciones médicas subyacentes crónicas y/o concom itantes que pueden predisponerlos a u na infección de C. difficile. Otras poblaciones de pacientes en riesgo incluyen pacientes q uienes son hospitalizados durante periodos prolongados y quienes están tomando antibióticos de amplio espectro que pueden romper la flora intestinal normal y lo cual puede pred isponerlos a infección con C. difficile. Datos más recientes sugieren que los pacientes que toman in hibidores de bomba de protones (PPIs) están en riesgo de desarrol lar diarrea asociada con C. difficile (Yearsley, K. et al . (2006) , Aliment. Pharmacol. Ther. 24(4) :61 3-61 9; Lowe, DO, et al . Clin . I nfect. Dis. (2006) , 43( 1 0) : 1 272- 1 276) . Otras poblaciones de pacientes en riesgo para desarrol lar una infección de C. difficile incluyen pacientes quienes están experimentando cualqu ier tipo de terapia inmunosupresora , tal como, pero no limitada a un medicamento anti-cáncer, radioterapia general para tratar ciertos tipos de cáncer, o un medicamento o régimen de medicamentos para prevenir rechazo de injerto de órgano o tejido siguiendo un trasplante. Los pacientes que reciben un trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) pueden estar en un riesgo particularmente alto para desarrollar una infección de C. difficile debido a hospitalizaciones largas, recepción de antibióticos de amplio espectro y ruptura relacionada con quimioterapia de barreras de mucosa entérica (Thibault, A. et al., ((1991), Infecí. Control Hosp. Epidemiol. 12:345-8; Anand, A. et al. (1993), Clin. Infect. Dis. 17:109-13). Los pacientes que reciben un trasplante de órgano sólido también pueden estar en riesgo de desarrollar una infección de C. difficile. Los pacientes que reciben un trasplante de órgano sólido también pueden estar en riesgo de desarrollar una infección de C. difficile. Están incluidos en la población en riesgo los pacientes que sufren de una enfermedad autoinmune, o pacientes en diálisis. Estudios más recientes demostraron que los pacientes que recibieron ya sea un HSCT autólogo o alogeneico no solo estuvieron en mayor riesgo de desarrollar una infección de C. difficile, sino que estos pacientes también estuvieron en mayor riesgo de desarrollar enfermedad injerto gastrointestinal versus huésped (Gl-GVHD) (Alonso, C.D., et al. (2012), Clin Inf. Dis, 54:1053-1063). Aunque este estudio demostró claramente que las infecciones de C. difficile fueron una complicación temprana frecuente siguiendo HSCT, la relación o interacción exacta entre las infecciones de C. difficile (CDI) y GVHD involucrando el tracto Gl necesita ser explorada en mayor detalle.

Cualquiera de estas poblaciones de pacientes pueden beneficiarse del tratamiento con los anticuerpos de la invención, cuando se les da solo o en conjunción con un segundo agente, tal como metronidazol, vancomicina o fidaxomicina.

Los anticuerpos de la invención pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgG 1 o lgG4) o pueden comprender solo una porción de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento de Fab, F(ab')2 o scFv), y pueden modificarse para afectar la funcionalidad, por ejemplo, para eliminar las funciones efectoras residuales (Reddy et al., (2000), J. Immunol. 164:1925-1933).

De acuerdo con esto, en un primer aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal completamente humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a ya sea toxina A, o a toxina B, o que se une a o reacciona cruzado con tanto toxina A como toxina B de Clostridium difficile, en donde: a) el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina A de Clostridium difficile comprende las tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (HCDR1 , HCDR2 y HCDR3) contenidas dentro de una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada (HCVR) seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 98, 114, 130, 146 y 162; y las tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) contenidas dentro de una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera (LCVR) seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 10, 106, 122, 138, 154 y 170; b) el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina B de Clostridium difficile comprende la HCDR1, HCDR2 y HCDR3 contenida dentro de una secuencia de aminoácidos de HCVR seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 3389 y 354; y las LCDR1, LCDR2 y LCDR3 contenidas dentro de una secuencia de aminoácidos de LCVR seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346 y 362; y c) el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno que se une a, o reacciona cruzado con tanto toxina A como toxina B de Clostridium difficile comprende las HCDR1, HCDR2 y HCDR3 contenidas dentro de una secuencia de aminoácidos de HCVR seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 18, 34, 50, 66 y 82; y las LCDR1, LCDR2 y LCDR3 contenidas dentro de una secuencia de aminoácidos de LCVR seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 26, 42, 58, 74 y 90.

En una modalidad, el anticuerpo monoclonal humano que se une a/reacciona cruzado tanto con toxina A como toxina B de C. difficile, se une específicamente al dominio de unión de receptor carboxi terminal (CBD) tanto de toxina A (CBD-A: SEQ ID NO: 375) como toxina B (CBD-B:SEQ ID NO: 376) de C. difficile.

En una modalidad, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, el cual se une a/reacciona cruzado tanto con toxina A como toxina B de C. difficile, se une a toxina A y toxina B con una D igual a o menor que 1 0"7 M .

En una modalidad, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, el cual se une a/reacciona cruzado tanto con toxina A como toxina B de C. difficile, comprende las tres CDRs de cadena pesada (HCDR1 , HCDR2 y HCDR3) contenidas dentro de cualquiera de las secuencias de región variable de cadena pesada (HCVR) seleccionadas del grupo que consiste de SEQ I D NOs: 18, 34, 50, 66 y 82; y las tres CDRs de cadena ligera (LCDR1 , LCDR2 y LCDR3) contenidas dentro de cualquiera de las secuencias de región variable de cadena ligera (LCVR) seleccionadas del grupo que consiste de SEQ I D NOs: 26, 42, 58, 74 y 90. Los métodos y técnicas para identificar CDRs dentro de secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR son bien conocidas en la técnica y pueden ser usadas para identificar CDRs dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y/o LCVR especificadas descritas en la presente. Convenciones ejemplares que pueden ser usadas para identificar los límites de CDRs incluyen, por ejemplo, la definición de Kabat, la definición de Chothia y la definición de AbM . En términos generales, la definición de Kabat es basada en variabilidad de secuencia, la definición de Chothia es basada en la ubicación de las regiones de bucle estructural , y la definición de AbM es un compromiso entre las aproximaciones de Kabat y Chothia. Ver, por ejemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" , National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991 ); Al-Lazikani et al. , (1 997), J . Mol. Biol . 273:927-948; y Martin et al. , (1989), Proc. Nati.

Acad. Sci. EE.UU. 86:9268-9272. Las bases de datos públicas también están disponibles para identificar las secuencias de CDR dentro de un anticuerpo.

En una modalidad, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, el cual se une a/reacciona cruzado tanto con la toxina A como toxina B de C. difficile, comprende una HCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 18, 34, 50, 66 y 82.

En una modalidad, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo el cual se une a/reacciona cruzado tanto con toxina A como toxina B de C. difficile, comprende una LCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 26, 42, 58, 74 y 90.

En una modalidad, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, el cual se une a/reacciona cruzado tanto con toxina A como toxina B de C. difficile, comprende (a) una HCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 18, 34, 50, 66 y 82; y (b) una LCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 26, 42, 58, 74 y 90.

En una modalidad, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, el cual se une a/reacciona cruzado tanto con toxina A como toxina B de C. difficile comprende: (a) un dominio de HCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 20, 36, 52, 68 y 84; (b) un dominio de HCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 22, 38, 54, 70 y 86; (c) un dominio de HCDR3 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 24, 40, 56, 72 y 88; (d) un dominio de LCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 28, 44, 60, 76 y 92; (e) un dominio de LCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 30, 46, 62, 78 y 94; y (f) un dominio de LCDR3 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 32, 48, 64, 80 y 96.

En una modalidad, el anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a/reacciona cruzado tanto con toxina A como toxina B de C. difficile, comprende las secuencias de aminoácidos de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 20, 22 y 24, respectivamente y secuencias de aminoácidos de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 28, 30 y 32, respectivamente.

En una modalidad, el anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a/reacciona cruzado tanto con toxina A como toxina B de C. difficile, comprende las secuencias de aminoácidos de HCDR1 , HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 36, 38 y 40, respectivamente y las secuencias de aminoácidos de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO:44, 46 y 48, respectivamente.

En una modalidad, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión del mismo, el cual se une a/reacciona cruzado con tanto toxina A como toxina B de C. difficile comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 18/26, 34/42, 50/58, 66/74 y 82/90.

En una modalidad, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, el cual se une a/reacciona cruzado con tanto toxina A como toxina B de C. difficile comprende el par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR de SEQ ID NOs: 18/26 Y 34/42.

En una modalidad, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a/reacciona cruzado con tanto toxina A como toxina B se une a: un epitope dentro del dominio de unión de receptor carboxi terminal tanto de toxina A como toxina B de Clostridium difficile, en donde el anticuerpo comprende un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 18/26 y 34/42; o un epitope fuera del dominio de unión de receptor carboxi terminal tanto de toxina A como toxina B de Clostridium difficile, en donde el anticuerpo comprende un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 50/58, 66/74 y 82/90.

En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal completamente humano o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a/reacciona cruzado con tanto toxina A como toxina B de C. difficile, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo exhibe una o más de las siguientes características: (i) comprende una HCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NO: 18, 34, 50, 66 y 82, o una secuencia substancialmente similar del mismo que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; (ii) comprende una LCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 26, 42, 58, 74 y 90, o una secuencia substancialmente similar de la misma que consiste de SEQ ID NO: 26, 42, 58, 74 y 90, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; (iii) comprende un dominio de HCDR3 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 24, 40, 56, 72 y 88, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; y un dominio de LCDR3 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 32, 48, 64, 80 y 96, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; (iv) comprende un dominio de HCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ I D NO: 20, 36, 52, 68 y 84, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; un dominio de HCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ I D NO: 22, 38, 54, 70 y 86, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; un dominio de LCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 28, 44, 60, 76 y 92, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90% , al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; y un dominio de LCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 30, 46, 62, 78 y 94, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; (v) se une a toxina A y a toxina B con una KD igual a o menor que 1 0"9M .

En una modalidad, el anticuerpo monoclonal completamente humano o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a/reacciona cruzado con tanto toxina A como toxina B de C. difficile, comprende una secuencia HCDR1 comprendiendo la fórmula X1 -X2-X3-? .?5.?6.?7.?8 (S EQ I D N O : 381 ) e n d o n de ?? es G|y, X2 es Phe, Val o I Le, X3 es Thr, Ala o Ser, X4 es Phe o Leu, X5 es Ser, Arg o Asn, X6 es Gly, Thr, Asp o Ser, X7 es His, o Tyr, y X8 es Gly, o Glu; una secuencia de HDR2 comprendiendo la fórmula X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 382), en donde X1 es ILe, X2 es Leu, Ser, o Asp, X3 es Tyr, Phe o Ser, X4 es Asp, o ser, X5 es Gly, X6 es Ser, Gly, Asp o Thr, X7 es Ser, His o lie, y X8 es Glu, Gln o lie; una secuencia HDR3 comprendiendo la fórmula X1-X2-X3-X -X5-X6-X7-X8-X9-X10-X 1-X12-X 3-X14-X15-X16-X17 (SEQ ID NO: 383), en donde X1 es Ala, o Val, X2 es Lys o Arg, X3 es Gly o Glu, X4 es Ser, o Arg, X5 es Me, Asp o Tyr, X6 es Leu, Ser o Asp, X7 es Asn, Ser, Gln o His, X8 es Arg, Tyr o Ser, X9 es Pro o Gly, X10 es Phe o Tyr, X11 es Asp, Gly o Tyr, X12 es Tyr, X13 es Phe, Leu o ausente, X14 es Gly o ausente, X15 es Met o ausente, X16 es Asp o ausente, X17 es Val o ausente; una secuencia de LCDR1 comprendiendo la fórmula X1-X2-X3- ?4.?5.?6.?7.?8.?9.?10.?11.?12 (SEQ |D NQ. 334) ep donde ?1 eS Gln, X2 es Ser, o Glu, X3 es lie, Val o Thr, X4 es Leu o Asp, X5 es Phe, Lys o Asn, y X6 es Ser, o Trp, X es Ser, o ausente, X8 es Asn, Asp o ausente, X9 es Asn, o ausente, X10 es Lys o ausente, X11 es Me, Asn o ausente, X12 es Tyr o ausente; una secuencia LCDR2 comprendiendo la fórmula X1-X2-X3 (SEQ ID NO: 385), en donde X1 es Trp, Lys o Arg, X2 es Ala o Thr, y X3 es Ser; y una secuencia LCDR3 que comprende la fórmula X1-?2.?3.?4.?5.?6.?7.?8.?9 (SEQ ID NO: 386), en donde X1 es Gln o His, X2 es Gln o Glu, X3 es Tyr, X4 es Tyr o Asn, X5 es Thr o Ser, X6 es Leu, Ala o Tyr, X7 es Pro, Phe o Ser, X8 es Leu, pHe o Arg y X9 es Thr o Ala.

En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina A de Clostridium difficile, en donde el anticuerpo comprende las tres CDRs de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) contenidas dentro de cualquiera de la secuencias de aminoácidos de HCVR seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 98, 114, 130, 146 y 162; y las tres CDRs de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) contenidas dentro de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de ICVR seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 10, 106, 122, 138, 154 y 170.

En una modalidad, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina A de Clostridium difficile, comprende una HCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 98, 114, 130, 146 y 162.

En una modalidad, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina A de Clostridium difficile, comprende una LCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 10, 106, 122, 138, 154 y 170.

En una modalidad, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina A de Clostridium difficile, comprende (a) una HCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 98, 114, 130, 146 y 162; y (b) una LCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 10, 106, 122, 138, 154 y 170.

En una modalidad, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina A de Clostridium difficile, comprende: (a) un dominio de HCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ I D NOs: 4, 100, 1 1 6, 1 32, 148 y 164; (b) un dominio de HCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 6, 102, 1 18, 1 34, 1 50y 166; (c) un dominio de HCDR3 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 8, 104, 120, 1 36, 152 y 168; (d) un dominio de LCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ I D NOs: 1 2, 108, 124, 140, 156 y 172; (e) un dominio de LCDR2teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ I D NOs: 14, 1 10, 126, 142, 158 y 174; y (f) un dominio de LCDR3teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ I D NOs: 16, 1 12, 128, 144, 160 y 176.

En una modalidad, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina A de Clostridium difficile, comprende las secuencias de aminoácidos HCDR1 , HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 148, 150 y 1 52, respectivamente y secuencias de aminoácidos LCDR1 , LCDR2 y LCDR3 de SEQ I D NO: 156, 1 58 y 160, respectivamente.

En una modalidad, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina A de Clostridium difficile, comprende un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2/10, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154 y 162/170.

En una modalidad, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina A de Clostridium difficile, comprende el par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR de SEQ ID NOs: 146/154.

En una modalidad, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina A de Clostridium difficile se une a: un epitope dentro del dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina A de Clostridium difficile, en donde el anticuerpo comprende un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2/10, 98/106, 130/138, 146/154 y 162/170; o un epitope fuera del dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina A de Clostridium difficile, en donde el anticuerpo comprende un par de secuencias de aminoácidos HVR/LCVR de SEQ ID NOs: 114/122.

En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal completamente humano o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina A de C. difficile, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo exhibe una o más de las siguientes características: (i) comprende una HCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ I D NO: 2, 98, 1 14, 1 30, 146 y 162, o una secuencia substancialmente similar de las mismas teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; (ii) comprende una LCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ I D NO: 1 0, 106, 122, 1 38, 154 y 1 70, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; (iii) comprende un dominio de HCDR3 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 8, 104, 120, 1 36, 1 52 y 168, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90% , al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; y un dominio de LCDR3teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 16, 1 12, 128, 144, 160 y 176, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; (iv) comprende un dominio de HCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ I D NO: 4, 1 00, 1 16, 132, 148 y 164, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; un dominio de HCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 6, 102, 1 18, 134, 150 y 166, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; un dominio de LCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 12, 108, 124, 140, 156 y 172, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; y un dominio de LCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ IDNO: 14, 110, 126, 142, 158 y 174, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; (v) demuestra una KD igual a o menor que 10"9M; (vi) demuestra neutralización de Toxina A (a una concentración de 32 pM) con una IC50 que varía desde aproximadamente 7pM hasta aproximadamente 65pM en un ensayo de viabilidad celular.

En una modalidad, el antígeno monoclonal completamente humano o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina A de C. difficile, comprende una secuencia de HCDR1 comprendiendo la fórmula X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 387), en donde X1 es Gly, o Arg, X2 es Phe, X3 es Asn o Thr, X4 es Phe, X5 es Gly, Ser, Asn o Thr, X6 es Thr, Ser, Asn o Asp, X7 es His, Tyr o Phe y X8 es Asp, Val, Ala o Tyr; una secuencia de HCDR2 que comprende la fórmula X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO:388), en donde X1 es Leu o Me, X2 es Thr, Gly, Ser o Trp, X3 es Ser, Thr, Gly o Phe, X4 es Thr, Val, Tyr, Val, Asp o Gly, X5 es Gly, X6 es Gly, Asp, Ser o Ala, X7 es Ser, Thr, Asn o Ala, y X8 es Ala, Thr, Glu, Lys o ausente; una secuencia de HCDR3 que comprende la fórmula X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11- ??2.?13.??4.??5.??6.??7.?18.??9.?20.?21.?22.?23.?24 (SEQ |Q NQ. 38g) en donde X1 es Ala, X2 es Lys o Arg, X3 es Thr, Asp o Ser, X4 es Phe, Arg, His, Ala o Leu, X5 es Asn, Gly o Lys, X6 es Trp, Gly, Asp o ILe, X7 es Asn, Ala o Phe, X8 es Ser, Asn, Tyr, Gly o Asp, X9 es Tyr, lie, Ala, Thr, Glu o Leu, X10 es Phe, Tyr, Ser, Gly o ausente, X11 es Asp, Ser, Gly o ausente, X12 es Tyr, Phe, Ser, Pro o ausente, X13 es Tyr, Leu o ausente, X14 es Tyr, Phe o ausente, X15 es Gly, Asn, Asp o ausente, X16 es Met, Arg, Tyr o ausente, X17 es Asp o ausente, X18 es Tyr, Val o ausente, X19 es Tyr o ausente, X20 es Tyr o ausente, X21 es Gly o ausente, X22 es Met o ausente, X23 es Asp o ausente, X24 es Val o ausente; una secuencia de LCDR1 comprendiendo la fórmula X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (SEQ ID NO: 390), en donde X1 es Gln, X2 es Ser, Asp o Thr, X3 es lie o Val, X4 es Ser, X5 es Thr, Asn o Ser, X6 es Tyr, Trp, Phe o Ser y X7 es Tyr o ausente; una secuencia de LCDR2 comprendiendo la fórmula X1-X2-X3 (SEQ ID NO: 391), en donde X1 es Gly, Ala, Lys o Thr, X2 es Ala, Thr o Val y X3 es Ser; y una secuencia de LCDR3 comprendiendo la fórmula X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10 (SEQ ID N0.392), en donde X1 es Gln o ausente, X2 es Gln, Lys o ausente, X3 es Tyr, Asn o asuente, X4 es Gly, Asn, Thr, Tyr, His o ausente, X5 es Asn, Ser o ausente, X6 es Ser, Ala, Tyr, Asp, Trp o ausente, X7 es Leu, Pro, Ser o ausente, X8 es Tyr, Phe, Arg, Pro o ausente, X9 es Thr, Tyr o ausente, y X10 es Thr.

En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina B de Clostridium difficile, en donde el anticuerpo comprende las tres CDRs de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) contenidas dentro de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338 y 354; y las tres CDRs de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) contenidas dentro de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346 y 362.

En una modalidad, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une especificamente a toxina B de Clostridium difficile comprende una HCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338 y 354.

En una modalidad, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina B de Clostridium difficile comprende una LCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346 y 362.

En una modalidad, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina B de Clostridium difficile comprende (a) una HCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338 y 354; y (b) una LCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346 y 362.

En una modalidad, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina B de Clostridium difficile comprende (a) un dominio de HCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340 y 356; (b) un dominio de HCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 182, 198, 214, 3230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342 y 358; (c) un dominio de HCDR3 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344 y 360; (d) un dominio de LCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348 y 364; (e) un dominio de LCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350 y 366; y (f) un dominio de LCDR3 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352 y 368.

En una modalidad, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la toxina B de Clostridium difficile, comprende las secuencias de aminoácidos HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 276, 278 y 280, respectivamente y secuencias de aminoácidos LCDR1 , LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 284, 286 y 288, respectivamente.

En una modalidad, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina B de Clostridium difficile comprende un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346 y 354/362.

En una modalidad, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina B de Clostridium difficile comprende el par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR de SEQ ID NOs: 274/282.

En una modalidad, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina B de Clostridium difficile se une a: un epitope dentro del dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina B de Clostridium difficile, en donde el anticuerpo comprende un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR de SEQ ID NOs: 178/186; o un epitope fuera del dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina B de Clostridium difficile, en donde el anticuerpo comprende un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282 y 290/298.

En una modalidad , la invención proporciona un anticuerpo monoclonal completamente humano o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina B de C. difficile, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo exhibe una o más de las siguientes características: (i) comprende una HCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ I D NO: 178, 194, 21 0, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338 y 354, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; (ii) comprende una LCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ I D NO: 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346 y 362, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; (¡ii) comprende un dominio de HCDR3 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ I D NO: 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344 y 360, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; y un dominio de LCDR3 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 92, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352 y 368, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; (iv) comprende un dominio de HCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340 y 356, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; un dominio de HCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342 y 358, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; un dominio de LCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348 y 364, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% identidad de secuencia; y un dominio de LCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350 y 366, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; (v) demuestra una KD igual a o menor que 10"9M; (vi) demuestra neutralización de Toxina B (a una concentración de 0.03pM) con una IC50 que varía desde aproximadamente 25pM hasta aproximadamente 320p en un ensayo de viabilidad celular.

En una modalidad, el anticuerpo monoclonal completamente humano o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina B de C. difficile comprende una secuencia de HCDR1 que comprende la fórmula X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10 (SEQ ID NO: 393), en donde X1 es Gly, X2 es Phe, Asp o Tyr, X3 es Thr, Asn, Ser o Val, X4 es Phe, o Val, X5 es Ser, Arg, Lys, Glu o Thr, X6 es Ser, ILe, Asp o Arg, X7 es Phe, Tyr o Asn, Xs es Gly, Ala, Ser o Tyr; X9 es Ala, o ausente y X1 0 es Ala o ausente; una secuencia de HCDR2 que comprende la fórmula X1-X2-X3-X -X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ I D NO: 394), en donde X1 es Me o Thr, X2 es Ser, Gly, Tyr o Asn, X3 es Thr, Gly, Tyr, Trp, Pro o Ser, X4 es Asp, Ser, Asn , Arg, Lys o Asp, Xs es Gly, Ser o Thr, X6 es Ser, Asp, Gly, Lys o Asn, X7 es Lys, Arg, Asn, Ser, Trp o Gly, X8 es Lys, Thr, lie o Tyr, X9 es His o ausente; una secuencia de HCDR3 que comprende la fórmula X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X1 1-X12-X 3-X14-X 5-X16 (SEQ I D NO: 395), en donde X1 es Ala, o Val, X2 es Arg, Lys, Thr o Ser, X3 es Val, Gly, Asp, Arg o Tyr, X4 es Gly, Trp, Arg, Lys o Asn, X5 es Glu, Tyr, Arg, Ser o Trp, X6 es Leu, Tyr, Ser, Pro o Asn, X7 es Leu, Asp, Tyr, Ser o Asp, X8 es Asn, Ser, Phe, Lys, Arg, Asp o Gly, X9 es Tyr, Gly, Phe, Asp, Trp o Val, X10 es Ser, Tyr, Asn, Asp o ausente, X1 1 es Tyr, Leu, Val, Gly o ausente, X12 es Tyr, Leu, Phe, Val o ausente, X1 3 es Asn, Gly, Asp, Phe o ausente, X14 es Tyr, Met, Asp, o ausente, X15 es Asp, Tyr o ausente, y X16 es Val o ausente; una secuencia de LCDR1 que comprende la fórmula X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (SEQ I D NO: 396), en donde X1 es Gln, Leu o Arg, X2 es Gly, Asp o Ser, X3 es Me o Val, X4 es ARg, Ser, Gly o Tyr, X5 es Ser, o Asn, X6 es Trp, His, Asn, Phe, Ser o Asp, y X7 es Tyr, o ausente; una secuencia de LCDR2 que comprende la fórmula X1-X2-X3 (SEQ I D NO: 397), en donde X1 es Ala, Ser, Asp o Gly, X2 es Ala o Thr y X3 es Ser; y una secuencia de LCDR3 que comprende la fórmula X1-X2-X3-X -X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 398), en donde X1 es Gln, His o Leu, X2 es Gln, X3 es Ala, Tyr, Arg, Asp, His o Val, X4 es Tyr, Gly, Asn, Ser, Me o Lys, X5 es Ser, Leu, Pro, Me, Asn, Thr o Gly, X6 es Phe, Tyr, Trp o Ser, X7 es Pro, X8 es Leu, Pro, Phe, Val o Tyr y X9 es Thr.

En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que compite para unión específica a toxina A y/o toxina B de C. difficile con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de una región variable de cadena pesada (HCVR), en donde la HCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338 y 354; y las CDRs de una región variable de cadena ligera (LCVR), en donde la LCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346 y 362.

En una modalidad relacionada, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que compite por unión específica a toxina A y/o toxina B de C. difficile con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende las CDRs de cadena pesada y ligera contenidas dentro de los pares de secuencia de cadena pesada y ligera seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 18/26, 34/42, 146/154 y 274/282.

En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epitope sobre toxina A y/o toxina B de C. difficile como un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende las CDRs de una región variable de cadena pesada (HCVR), en donde la HCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 1 14, 1 30, 146, 162, 178, 1 94, 210, 226, 242, 258, 274, 390, 306, 322, 338 y 354; y las CDRs de una región variable de cadena ligera (LCV R), en donde la LCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 1 06, 122, 138, 154, 1 70, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346 y 362.

En una modalidad relacionada, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epitope sobre toxina A y/o toxina B de C. difficile como un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende las CDRs de cadena pesada y ligera contenidas dentro de pares de secuencias de cadena pesada y ligera seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 18/26, 34/42, 146/1 54, 274/282.

En ciertas modalidades de la invención, los anticuerpos pueden interactuar con, o unirse a, residuos de aminoácidos 468-863 del dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina A producida por Clostridium difficile, la secuencia de la cual es mostrada en SEQ I D NO:375. Esta región corresponde a los residuos de aminoácidos que varían desde residuos 231 5-271 0 de SEQ I D NO: 378 (toxina A de longitud completa). En ciertas modalidades de la invención, los anticuerpos pueden interactuar con, o unirse a, un epitope en el dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina A producido por Clostridium difficile, en donde el epitope es seleccionado del grupo que consiste de residuos 468-488 de SEQ ID NO: 375, residuos 510-530 de SEQ ID NO: 375, residuos 602-610 de SEQ ID NO: 375, residuos 644-703 de SEQ ID NO: 375, residuos 724-794 de SEQ ID NO: 375, residuos 799-814 de SEQ ID NO: 375 y residuos 858-863 de SEQ ID NO: 375. Estos residuos corresponden a las secuencias de aminoácidos encontradas en la secuencia de toxina A de longitud completa teniendo SEQ ID NO: 378, con las regiones particulares identificadas como los residuos 2315-2335 de SEQ ID NO: 378, residuos 2357-2377 de SEQ ID NO: 378; residuos 2449-2457 de SEQ ID NO: 378, residuos 2491-2550 de SEQ ID NO: 378, residuos 2571-2641 de SEQ ID NO: 378, residuos 2646-2661 de SEQ ID NO: 378 y residuos 2705-2710 de SEQ ID NO: 378. En una modalidad, el anticuerpo que se une a o interactúa con un epitope en el dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina A producido por Clostridium difficile, seleccionado del grupo que consiste de los residuos 468-488 de SEQ ID NO: 375, residuos 510-530 de SEQ ID NO: 375, residuos 602-610 de SEQ ID NO: 375, residuos 644-703 de SEQ ID NO: 375, residuos 724-794 de SEQ ID NO: 375, residuos 799-814 de SEQ ID NO: 375 y residuos 858-863 de SEQ ID NO: 375 comprende el par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR de SEQ ID NOs: 146/154. En una modalidad, el anticuerpo que se une a o interactúa con un epitope en el dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina A producido por Clostridium difficile, seleccionado del grupo que consiste de los residuos 468-488 de SEQ I D NO: 375, residuos 510-530 de SEQ ID NO: 375, residuos 602-6710 de SEQ I D NO: 375, residuos 644-703 de SEQ I D NO: 375, residuos 724-794 de SEQ ID NO: 375, residuos 799-814 de SEQ ID NO: 375 y residuos 858-863 de SEQ I D NO: 375 es combinado con un segundo anticuerpo que se une específicamente a toxina B de Clostridium difficile en una composición farmacéutica. En una modalidad, este segundo anticuerpo que interactúa con o se une a toxina B de Clostridium difficile comprende el par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR de SEQ ID NOs: 274/282.

En un segundo aspecto, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-toxina A y/o anti-toxina B o fragmentos de los mismos. Los vectores de expresión recombinante que portan los ácidos nucleicos de la invención, y células huésped en las cuales tales vectores han sido introducidos, también son abarcados por la invención, ya que son métodos para producir los anticuerpos al cultivar las células huésped bajo condiciones que permiten la producción de los anticuerpos y recuperar los anticuerpos producidos.

En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una HCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ I D NO: 1 , 17, 33, 49, 65, 81 , 97, 1 1 3, 120, 145, 161 , 1 77, 1 93, 209, 225, 241 , 257, 273, 289, 305, 321 , 337 y 353 o una secuencia substancialmente idéntica que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de homología de la misma.

En una modalidad, la HCVR es codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 17, 33, 145 y 273.

En una modalidad, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende además una LCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, 329, 345 y 361, o una secuencia substancialmente idéntica teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% de homología de la misma.

En una modalidad, la LCVR es codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 25, 41, 153 y 281.

En una modalidad, la invención también proporciona un anticuerpo o fragmento de un anticuerpo que comprende un dominio de HCDR3 codificado por una secuencia de nucieótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 199, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311, 327, 343 y 359 o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; y un dominio de LCDR3 codificado por una secuencia de nucieótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319, 335, 351 y 367, o una secuencia substancialmente similar de la misma que tiene a menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia.

En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende además un dominio de HCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ I D NO: 3, 19, 35, 51 , 67 , 83, 99, 1 15, 131 , 147 , 163, 179, 195, 21 1 , 227, 243, 259, 275, 291 , 307, 232, 339 y 355, o una secuencia substancialmente similar de la misma que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; un dominio de HCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ I D NO: 5, 21 , 37, 53, 69, 85, 1 01 , 1 17, 1 33, 149, 165, 181 , 1 97, 213, 229, 245, 261 , 277, 293, 309, 325, 341 y 357, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; un dominio de LCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 1 , 27, 43, 59, 75, 91 , 107, 123, 139, 155, 171 , 1 87, 203, 219, 235, 251 , 267, 283, 299, 315, 331 , 347 y 363, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; y un dominio de LCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 3, 29, 45, 61 , 77, 93, 109, 125, 141 , 157, 1 73, 1 89, 205, 221 , 237, 253, 269, 285, 301 , 317, 333, 349 y 365, o una secuencia substancialmente similar de la misma que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia .

En un tercer aspecto, la invención caracteriza un anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno específico para toxina A y/o toxina B de C. difficile que comprende u na H CVR cod ificada por segmentos de secuencia de nucieótidos derivados de secuencias de línea germinal VH , DH y J H , y una LCVR codificada por segmentos de secuencias de nucieótidos derivados de secuencias de líneas germinales VK y J K, con combinaciones como se muestran en la Tabla 2.

La invención abarca anticuerpos teniendo un patrón de glicosi lación modificado. En algunas aplicaciones, la modificación para remover los sitios de g licosi lación indeseables pueden ser útiles, o por ejem plo, la remoción de una porción de fucosa para aumentar la función de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADC C) (ver Sh ield et al. (2002) J BC 277 : 26733) . En otras apl icaciones, la modificación de galactosilación puede hacerse con el fin de modificar la citotoxicidad dependiente de com plemento ( C DC) .

En un cuarto aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que com prende al menos un anticuerpo monoclonal completamente h umano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo q ue se une a ya sea toxina A o toxina B de C. difficile, que se une a tanto toxina A como toxina B de C. difficile, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En una modal idad, la invención proporciona una com posición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal completamente humano o fragmento de unión a antígeno del m ismo que se une específicamente a solo toxi na A de C. difficile, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal completamente humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a solo toxina B de C. difficile, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende dos anticuerpos monoclonales completamente humanos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, uno que se une específicamente a toxina A y uno que se une específicamente a toxina B de C. difficile y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, la invención proporciona una composición farmacéutica comprendiendo un anticuerpo monoclonal completamente humano de unión dual (un anticuerpo que se une tanto a toxina A como toxina B) y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende dos anticuerpos monoclonales completamente humanos de unión dual (un anticuerpo que se une tanto a toxina A como toxina B) y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los anticuerpos duales usados en la composición farmacéutica pueden reconocer y/o unirse al mismo epitope sobre toxina A o toxina B, o pueden reconocer y/o unirse a diferentes epitopes sobre toxina A o toxina B. Se entenderá que cualquier combinación de anticuerpos como se describe en la presente pueden ser usados en una composición farmacéutica para lograr los resultados deseados en la población del paciente en necesidad de tal terapia . Por ejemplo , dos anticuerpos que reconocen y/o se unen solo a toxina A pueden ser usados en una composición . De manera alternativa, dos anticuerpos que reconocen y/o se unen solo a toxina B pueden ser usados en una com posición . En una modalidad , u n anticuerpo que reconoce/se une solo a toxina A o toxina B puede combinarse con un anticuerpo de unión dual en una composición . En una modalidad, un anticuerpo que reconoce/se u ne solo a toxina A puede combinarse con un anticuerpo que reconoce/se une solo a toxina B y esta combinación puede usarse en una composición .

En una modalidad, la com posición farmacéutica comprende un anticuerpo monoclonal com pletamente humano que se une al dominio de unión de receptor carboxi term inal tanto de toxina A como toxina B de C. difficile teniendo cualquiera de una o más de las características descritas en la presente. El anticuerpo que se une al dom inio de unión de receptor carboxi term inal tanto de toxina A como toxina B de C. difficile, se une a toxina A y toxina B con una KD igual a o menor que 1 0" 7M .

En u na modalidad , la composición com prende un anticuerpo que se une tanto a toxina A como toxi na B de C. difficile, y tiene un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste de SEQ I D NOs: 1 8/26 , 34/42 , 50/58 , 66/74 y 82/90.

En una modalidad , la composición com prende un anticuerpo que se une tanto a toxina A como toxina B de C. difficile, y tiene un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR seleccionadas del grupo q ue consiste de SEQ I D NOs: 1 8/26 y 34/42.

En una modalidad, la composición farmacéutica comprende al menos un anticuerpo que se une a toxina de Clostridium difficile, en donde el anticuerpo es seleccionado de: a) un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina A de Clostridium difficile, en donde el anticuerpo comprende las tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (HCDR1 , HCDR2 y HCDR3) contenidas dentro de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de región variable de cadena pesada (HCVR) seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 98, 1 14 , 130, 146 y 162; y las tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (LCDR1 , LCDR2 y LCDR3) contenidas dentro de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de región variable de cadena ligera (LCVR) seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1 0, 106, 122, 1 38, 1 54 y 170; b) un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina B de Clostridium difficile, en donde el anticuerpo comprende las tres CDRs de cadena pesada (HCDR1 , HCDR2 y HCDR3) contenidas dentro de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR seleccionadas del grupo que consiste de SEQ I D NOs: 1 78, 194, 21 0, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338 y 354; y las tres CDRs de cadena ligera (LCDR1 , LCDR2 y LCDR3) contenidas dentro de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LVR seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 186, 202, 21 8, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346 y 362; y c) un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno que se une a/reacciona cruzado tanto con toxina A y toxina B de Clostridium difficile, en donde el anticuerpo comprende las tres CDRs de cadena pesada (HCDR 1 , HCDR2 y HCDR3) contenidas dentro de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR seleccionadas del grupo q ue consiste de S EQ I D NOs: 18, 3 4, 50, 66 y82; y las tres CDRs de cadena ligera (LCDR1 , LC DR2 y LCDR3) contenidas dentro de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR seleccionadas del grupo que consiste de SEQ I D NOs: 26, 42 , 58 , 74 y 90.

En una modalidad, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo monoclonal completamente humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina A de Clostridium difficile, como se describe en la presente, y un segundo anticuerpo monoclonal completamente humano o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina B de Clostridium difficile, como se descri be en la presente, y u n portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad , la composición comprende al menos un anticuerpo, o un fragmento de un ión a antígeno del m ismo que se une específicamente a toxina A de Clostridium difficile y al menos un anticuerpo, o un fragmento de un ión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina B de Clostridium difficile, en donde: a) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina A comprende las tres regiones determinantes de com plementariedad de cadena pesada (HCDR 1 , HCDR2 y H CDR3) contenidas dentro de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de región variable de cadena pesada (HCVR) seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 98, 114, 130, 146 y 162; y las tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) contenidas dentro de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de región variable de cadena ligera (LCVR) seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 10, 106, 122, 138, 154 y 170; y en donde b) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina B comprende las tres CDRs de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) contenidas dentro de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338 y 354; y las tres CDRs de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) contenidas dentro de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346 y 362.

En una modalidad, la composición farmacéutica comprende: a) un primer anticuerpo monoclonal completamente humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina A de Clostridium difficile, el cual comprende una HCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 98, 114, 130, 146 y 162; y un LCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 10, 106, 122, 138, 154 y 170; y b) un segundo anticuerpo monoclonal completamente humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina B de Clostridium difficile, el cual comprende una HCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338 y 354; y una LCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282,298, 314, 330, 346 y 362.

En una modalidad, la composición farmacéutica comprende un primer anticuerpo monoclonal completamente humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina A de C. difficile, el cual comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2/10, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154 y 162/170; y un segundo anticuerpo monoclonal completamente humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina B de C. difficile, el cual comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346 y 354/362.

En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende un primer anticuerpo monoclonal completamente humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina A de C. difficile, el cual comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR de SEQ ID NOs: 146/54; y un segundo anticuerpo completamente humano aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo que se une específicamente a toxina B de C. difficile, el cual comprende un par de secuencias de aminoácidos de HVR/LCVR de SEQ ID NOs: 274/282.

En otra modalidad relacionada, la composición farmacéutica comprende: a) un primer anticuerpo humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina A de Clostridium difficile, comprendiendo una HCDR1 teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 148, una HCDR2 teniendo al secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150, una HCDR3 teniendo al secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 152, una LCDR1 teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 156, una LCDR2 teniendo al secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 158, una LCDR3 teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 160; b) un segundo anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina B de Clostridium difficile, comprendiendo una HCDR1 teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 276, una HCDR2 teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 278, una HCDR3 teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.280, un LCDR1 teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 284, una LCDR2 teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 286, una LCDR3 teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 288; y c) un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad, los anticuerpos de la invención, o composiciones conteniendo uno o más anticuerpos de la invención pueden ser usados para neutral izar ya sea toxi na A, o toxina B , o tanto toxina A como B de cualquier cepa de Clostridium difficile.

En una modalidad , los anticuerpos de la i nvención, o composiciones conteniendo uno o más anticuerpos de la invención pueden ser usados para neutral izar toxinas A y/o B de una cepa hipervirulenta de Clostridium difficile.

En una modalidad, los anticuerpos de la invención, o composiciones conteniendo uno o más anticuerpos de la invención pueden ser usados para neutralizar toxinas A y/o B de una cepa BI/NAP 1 /027.

En una modalidad , los anticuerpos de la i nvención, o composiciones conteniendo u no o más anticuerpos de la invención , pueden ser usados para neutralizar toxinas A y/o B de una cepa BI/NAP 1 /027, en donde la cepa BI/NAP 1 /027 es seleccionada del grupo que consiste de VA5 , VA1 7, 6336 y 6443.

En u na modalidad , la composición de anticuerpo comprendiendo un primer anticuerpo que se u ne específicamente a toxina A, puede adm in istrarse sola como una composición separada y la composición de anticuerpo com prendiendo el segundo anticuerpo que se une específicamente a toxina B también puede administrarse como una composición separada. Cada com posición pude prepararse para entrega al paciente en jeringas separadas, o dispositivos de entrega , o viales. Cuando se formulan por separado como dos composiciones, ambas composiciones pueden ser entregadas por separado, con una composición de anticuerpo siendo administrada justo antes de la otra composición de anticuerpo. De manera alternativa , las dos composiciones de anticuerpo pueden mezclarse jutas poco antes de la adm in istración y darse concurrentemente .

En una modalidad , la invención caracteriza una composición, la cual es una combinación de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención , y un segundo agente terapéutico.

El segundo agente terapéutico puede ser un medicamento de molécula pequeña, una proteína/polipéptido, un anticuerpo, una molécula de ácido nucleico, tal como una molécula anti-sentido, o un siRNA. El segundo agente terapéutico puede ser sintético o derivado de manera natural .

El segundo agente terapéutico puede ser cualquier agente q ue se com bi ne ventajosamente con el anticuerpo o fragmento del mismo de la invención , por ejem plo , un probiótico, un antibiótico, un toxoide, una vacuna específica para C. difficile, o un segundo anticuerpo diferente contra toxina A y/o toxina B de C. difficile.

En ciertas modalidades, el segundo agente terapéutico puede ser un agente que ayude a contrarrestar o reducir cualquier efecto lateral posible asociado con el anticuerpo o fragmento de un ión a antígeno de un anticuerpo de la invención, si tal o tales efectos laterales pudieran ocurrir.

También se apreciará que los anticuerpos y composiciones farmacéuticamente aceptables de la presente invención pueden ser empleadas en terapias de combinación , es decir, los anticuerpos y com posiciones farmacéuticamente aceptables pueden ser administradas concurrentemente con , antes de, o subsecuente a, uno o más de otros procedimientos médicos o terapéuticos deseados. La combinación particular de terapias (terapéuticos o procedim ientos) a em plear en un régimen de combinación considerará la compatibilidad de los terapéuticos y/o procedimientos deseados y el efecto terapéutico deseado a ser log rado. Tam bién se apreciará que las terapias empleadas pueden lograr un efecto deseado para el m ismo desorden (por ejemplo, un anticuerpo puede ser administrado concurrentemente con otro agente usado para tratar el m ismo desorden) , o pueden lograr diferentes efectos (por ejem plo, control de cualquier efecto adverso) . Como se usa en la presente, agentes terapéuticos ad iciona les que son normalmente adm inistrados para tratar o prevenir una enfermedad particular, o condición , son apropiados para la enfermedad , o condición, siendo tratada.

Cuando se co-administran múltiples terapéuticos , las dosificaciones pueden ser ajustadas de manera conveniente, como es reconocido en la técnica perti nente.

Un qu into aspecto de la invención proporciona un método para tratar un paciente que sufre de una condición o enfermedad asociada con Clostridium difficile, o para tratar al menos un síntoma o complicación asociado con la cond ición o enfermedad , o para prevenir el desarrol lo de una condición o enfermedad asociada con Clostridium difficile, en un paciente en riesgo del mismo, com prendiendo el método admin istrar al paciente una cantidad efectiva de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a toxina A y/o toxina B de C. difficile; o una com posición farmacéutica comprendiendo una cantidad efectiva de un anticuerpo o un fragmento de un ión a antígeno del mismo que se une a toxina A y/o toxina B de Clostridium difficile, de manera que la condición o enfermedad asociada con Clostridium difficile, es ya sea prevenida , o dism inu ida en severidad y/o duración , o al menos un síntoma o complicación asociado con la condición o enfermedad es prevenido, o mejorado, o que la frecuencia y/o duración de, o la severidad de recurrencias, o recaídas con Clostridium difficile es reducida.

En una modalidad , la invención proporciona el uso de uno o más anticuerpos de la invención , o composiciones farmacéuticas comprendiendo uno o más a nticuerpos de la invención en la fabricación de un medicamento para uso para tratar un paciente que sufre de una condición o enfermedad asociada con Clostridium difficile, o para tratar al menos un síntoma o complicación asociada con la cond ición o enfermedad , o para prevenir el desarrol lo de u na condición o enfermedad asociada con Clostridium difficile en un paciente en riesgo del mismo , en donde la cond ición o enfermedad asociada con Clostridium difficile es ya sea prevenida , o dism in u ida en severidad y/o duración , o al menos u n síntoma o com plicación asociada con la cond ición o enfermedad es prevenida , o mejorada, o que la frecuencia y/o duración de , o la severidad de recurrencias o recaídas con Clostridium difficile es red ucida. El al menos un sí ntoma o complicación asociado con la condición o enfermedad asociada con Clostridium difficile, puede ser seleccionada del grupo que consiste de anorexia, dolor abdominal, distención abdominal, diarrea con o sin sangrado, deshidratación, desnutrición, colitis pseudomembranosa, resección colónica completa o de segmento, fiebre e infección sistémica (sepsis), muerte, recaída de la condición o enfermedad de Clostridium difficile, y rechazo de un tejido u órgano trasplantado.

En una modalidad, el paciente a ser tratado con los anticuerpos de la invención, o con la composiciones farmacéuticas comprendiendo uno o más anticuerpos de la invención son infectados con un aislado hipervirulento de Clostridium difficile, tal como uno perteneciente al grupo BI/NAP1/027, o pueden estar en riesgo de desarrollar una infección con una cepa hipervirulenta, como se describe en la presente.

En una modalidad relacionada, los anticuerpos de la invención, o una composición farmacéutica conteniendo uno o más anticuerpos de la invención, pueden ser usados para neutralizar las toxinas producidas por una cepa hipervirulenta de Clostridium difficile, tal como pero no limitada a cualquiera de aquéllas pertenecientes al grupo de cepas BI/NAP1/027. Incluidas en estas cepas hipervirulentas se encuentran los aislados clínicos notados en la presente como VA5, VA17, 6336 y 6443, descritos en la presente en el Ejemplo 10.

En una modalidad, el paciente en riesgo de desarrollar una condición o enfermedad asociada con Clostridium difficile, quien puede beneficiarse de tratamiento con los anticuerpos de la invención, o con una composición comprendiendo uno o más anticuerpos de la invención puede seleccionarse de un paciente mayor (= 65 años de edad), un paciente que está inmunocomprometido debido a enfermedad subyacente o debido a administración de terapéuticos inmunosupresores, un paciente que tiene alguna condición médica subyacente que puede predisponerlo a adquirir una infección de Clostridium difficile, un paciente hospitalizado durante un periodo prolongado (una semana o más), un paciente que ha sido tratado durante un periodo extendido (= 14 días) con antibióticos de amplio espectro, un paciente de cáncer, un paciente de trasplante, y un paciente sobre terapia con agentes, tales como pero no limitados a un inhibidor de bomba de protones, o inhibidor de receptor H2 de histamina que se usan para tratamiento de enfermedades o condiciones gastrointestinales para reducir o tratar acidez gástrica, enfermedad de reflujo gastroesofágico (GERD), úlceras de estómago e intestino delgado o acidez estomacal.

En una modalidad, el paciente en riesgo de desarrollar una condición o enfermedad asociada con Clostridium difficile es un paciente de cáncer. En una modalidad relacionada, el paciente de cáncer está experimentando tratamiento con un medicamento anti-cáncer, o experimentando radioterapia para tratar un cáncer.

En una modalidad, el paciente en riesgo de desarrollar una condición o enfermedad asociada con Clostridium difficile es un paciente de trasplante. En una modalidad relacionada, el paciente de trasplante es un paciente que recibe un trasplante de células madre hematopoyéticas, o un trasplante de órgano o tejido sólido. En ciertas modal idades, el paciente de trasplante está siendo tratado con un medicamento inmunosupresor, o cualquier medicamento de rechazo de trasplante, o es un paciente q ue está experimentando tratam iento con un régimen de medicamento para prevenir rechazo de injerto de órgano o tejido después del trasplante.

En una modalidad , el anticuerpo es adm inistrado terapéuticamente (adm inistrado después de que la infección ha sido establecida y es administrado a lo largo del curso de la infección) a un paciente que sufre de una condición o enfermedad asociada con Clostridium difficile, o que sufre de al menos un síntoma o complicación asociado con la condición o enfermedad . En una modalidad , el anticuerpo es administrado profilácticamente (administrado antes del desarrollo de la infección) a un paciente en riesgo de desarrol lar una condición o enfermedad asociada con Clostridium difficile, o en riesgo de desarrollar al menos un síntoma o complicación asociado con la condición o enfermedad de Clostridium difficile. Por ejemplo, tales "pacientes en riesgo para desarrollar u na infección de Clostridium difficile" incluyen los pacientes mayores (65 años de edad o más) , o pacientes que pueden estar inm unocomprometidos debido a enfermedad o debido a administración de terapéuticos inmunosupresores , o pacientes que tienen algu na condición médica subyacente que puede predisponerlos a adquirir una infección de Clostridium difficile, o pacientes hospitalizados durante largos periodos (generalmente u na semana o más) , o pacientes que han sido tratados durante un largo periodo con antibióticos de am pl io espectro (generalmente 14 días o más) , o pacientes en terapia con inhibidores de bomba de protones para tratamiento de enfermedades o condiciones gastrointestinales. Otros pacientes en riesgo de desarrolla r una infección de Clostridium difficile son aquellos pacientes q ue están en necesidad de un trasplante de órgano o tejido, quienes estarían experimentando tratamiento con medicamentos inmunosupresores para prevenir el rechazo de órgano o tejido . Esta población de pacientes incluye individuos en necesidad de ya sea un trasplante de células madre hematopoyéticas autólogas o alogeneicas. La larga hospitalización requerida para estos pacientes , además de la recepción de altas dosis de terapia de antibióticos para prevenir otros tipos de infecciones , pueden predisponer a estos pacientes a adquirir una infección de Clostridium difficile primaria. De manera alternativa , si un paciente en necesidad de tal trasplante y sufre de una i nfección de Clostridium difficile, o tiene síntomas exh ibidos de una i nfección de Clostridium difficile, ese paciente puede ser propenso a una recurrencia, o exacerbación de tal infección cuando se coloca en terapia de antibióticos de alta dosis, entonces seguido por terapia inmunosupresora para prevenir el rechazo de injerto. Adicionalmente, estos pacientes de trasplante pueden estar en riesgo no solo de adquirir una infección de Clostridium difficile, sino también pueden estar en riesgo de rechazo del trasplante debido a enfermedad de injerto relacionado con G l versus huésped (G I-GVH D), la cual parece ser intensificada en pacientes de trasplante que sufren de infección con C. difficile (Ver Alonso, C . D. et al . , (201 2) , Clin . I nfect. Dis. 54, 1053-1063. La relación entre infección de C. difficile, y GVH D que involucra el tracto G l es poco clara en este momento, pero parece q ue esta población de pacientes se beneficiaría de terapia con los anticuerpos anti-toxina A y/o anti-toxina B de la invención . Aunque se prevé que esta población de pacientes puede ser tratada terapéuticamente (después del inicio de la infección), también se contem pla que estos pacientes se beneficiarían de adm in istración profiláctica (antes de la infección) de cualquiera de los anticuerpos de la invención. Los pacientes que son candidatos para tratamiento con los anticuerpos de la invención pueden ser administrados con las com posiciones comprendiendo uno o más anticuerpos por cualquier ruta de entrega adecuada para administración , incluyendo pero no lim itando a inyección intravenosa o inyección subcutánea .

En u na modalidad , la com posición farmacéutica comprendiéndolos anticuerpos de la invención es adm inistrada al paciente en combinación con uno o más agentes terapéuticos útiles para tratar una i nfección de C. difficile.

En una modal idad , el uno o más agentes terapéuticos pueden ser seleccionados del grupo que consiste de un toxoide, un probiótico, una vacuna de Clostridium difficile (por ejemplo, toxinas A y B inactivadas, tal como pero no l im itado a ACAM-CDI FFMR) , un anti biótico (por ejemplo, metronidazol, vancomicina o fidaxomicina), otro anticuerpo diferente a toxina A y/o B de C. difficile, y cualqu ier otra terapia pa liativa útil para reducir la severidad de la enfermedad de C. difficile o para reducir la frecuencia de recurrencia de la enfermedad de C. difficile, o para mejorar al menos un síntoma asociado con una condición o enfermedad asociada con C. difficile.

En otra modalidad, un síntoma o complicación asociado con la condición o enfermedad asociada con Clostridium difficile es seleccionado del grupo que consiste de diarrea, colitis pseudomembranosa, recaída/recurrencia de la condición o enfermedad de Clostridium difficile, y rechazo de un órgano o tejido trasplantado.

Otras modalidades se volverán evidentes a partir de una revisión de la descripción detallada subsiguiente.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 muestra las estructuras de dominio de Toxina A y Toxina B de Clostridium difficile (ver Davies AH, et al., Biochem. J. (2011), 436:517-526).

La Figura 2 es una gráfica que muestra los resultados de ensayos de recaída de hámster como el porcentaje de hámsters que sobreviven tratamiento de clindamicina y vancomicina siguiendo reto de C. difficile, y el efecto de tratamiento con mAbs anti-toxina A y anti-toxina B. Todos los anticuerpos fueron administrados subcutáneamente una vez al día en los días 3-6. Los anticuerpos de control positivo son anticuerpos comparadores, anti-toxina A (control I) y anti-toxina B (control II). La vancomicina fue administrada como una dosis oral a 10 mg/kg en los días 1-3 a todos los animales (· con línea punteada: control de PBS; ? con línea punteada: control de isotipo negativo a 10 mg/kg; ? con línea sólida: Control l/Control II a 5 mg/kg cada 5/5): ? con línea sólida: H1H3330P/H1H3347P a 5 mg/kg cada uno (5/5)).

La Figura 3 es una gráfica que muestra los resultados de los ensayos de recaída de hámster como el porcentaje de hámsters que sobreviven el tratamiento de clindamicina y vancomicina siguiendo el reto de C. difficile y el efecto de mAbs anti-toxina A y anti-toxina B. Todos los anticuerpos fueron administrados subcutáneamente una vez en el día 3. Los anticuerpos de control positivo son anticuerpos comparadores, anti-toxina A (control I) y anti-toxina B (control II). La vancomicina fue administrada como una dosis oral a 10 mg/kg en los días 1-3 a todos los animales. (? con línea punteada: control de isotipo negativo a 10 mg/kg; ? con línea sólida: control l/control II a 5 mg/kg cada uno (5/5); ? con línea sólida: H1H3330P/H1 H3347P a 5 mg(kg cada uno (5/5); o con línea sólida: control l/control II a 2 mg/kg cada uno (2/2); O con línea sólida: H1 H3330P/H1 H3347P a 2 mg/kg cada uno (2/2)).

La Figura 4 es una gráfica que muestra los resultados de supervivencia en un modelo agudo de infección de C. difficile, en hámsters. Los resultados son mostrados como el porcentaje de hámsters que sobreviven el reto de C. difficile (día 0) siguiendo el tratamiento de clindamicina (día -1). Todos los anticuerpos fueron administrados de manera subcutánea en cada uno de 4 días del día 3 al día 0. Los anticuerpos fueron administrados a 50 mg/kg cada uno (50/50), 16.6 mg/kg cada uno (16.6/16.6), 5.5 mg/kg cada uno (5.5/5.5) y 1.85 mg/kg cada uno (1.85/1.85). (V con línea sólida: sin infectar; · con línea punteadas: control de PBS; ? con línea punteada; control de isotipo negativo a 100 mg/kg; ? con línea sólida: H1 H3330P/H1 H3347P a 50 mg/kg cada uno (50/50); o con línea sólida: H1 H3330P/H1 H3347P a 16.6 mg(kg cada uno (16.6/16.6); ? con línea sólida: H1H3330P/H1H3347P a 5.5 mg/kg cada uno (5.5/5.5); + con una línea sólida: H1 H3330P/H1 H3347P a 1.85 mg/kg cada uno (1.85/1.85).

La Figura 5 es una gráfica que muestra resultados de supervivencia en un modelo agudo de infección de C. difficile en hámsters. Los resultados son mostrados como el porcentaje de hámsters que sobreviven el reto de C. difficile (día 0) siguiendo el tratamiento de clindamicina (día -1). Todos los anticuerpos fueron administrados subcutáneamente en cada uno de 4 días del día -3 al día 0. Los anticuerpos fueron administrados a 20m g/kg cada uno (20/20), o a 5 mg/kg cada uno (5/5). (V con línea sólida: sin infectar; · con línea punteada: control de PBS; ? con línea punteada: control de isotipo negativo a 40 mg/kg; ? con línea sólida: Control l/control II a 20 mg/kg cada uno (20/20); ? con línea sólida: Control l/Control II a 5 mg/kg cada uno (5/5); ? con línea sólida: H1 H3330P/H1 H3347P a 20 mg/kg cada uno (20/20); 0 con línea sólida: H1 H3330P/H1 H3347P a 5 mg/kg cada uno (5/5)).

Descripción detallada Antes de que se describan los presentes métodos, se entiende que esta invención no está limitada a métodos particulares, y las condiciones experimentales descritas, tales como métodos y condiciones pueden variar. También se entenderá que la terminología usada en la presente es para el propósito de describir las modalidades particulares solamente , y no se pretende l imitar, debido a que el alcance de la presente invención será lim itado ún ica mente por las reivi ndicaciones anexas .

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el m ismo significado como se entiende comúnmente por alg u ien de habilidad ordinaria en la técnica a la cual pertenece esta invención . Aunque cualquier método y material sim ilar o equivalente aquél los descritos en la presente pueden ser usados en la práctica o prueba de la presente i nvención, se describen ahora métodos y materiales preferidos.

Definiciones El térm ino "toxina A" (también referido como "tcdA") se refiere a la proteína de toxina A producida por Clostridium difficile (también referido en la presente como " C. difficile") . La secuencia de am inoácidos de "toxina A" es provista en GenBank como número de acceso CAA63564 y también se refiere en la presente como SEQ I D NO: 387. La toxina A es codificada por el ácido nucleico provisto en la presente como SEQ I D NO: 377 , y tam bién es encontrado en GenBank como el número de acceso AM 1 80355.

El térm ino "toxina B" (también referido como "tcdB") se refiere a la proteína de toxina B producida por Clostridium difficile. La secuencia de aminoácidos de "toxina B" es provista en Gen Bank como número de acceso CAJ67492 y también referida en la presente como SEQ I D NO: 380. La toxi na B es codificada por el ácido n ucleico provisto en la presente como SEQ ID NO: 379, y también es encontrado en GenBank como el número de acceso AM180355.

El "dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina A y toxina B de Clostridium difficile" se refiere a la porción de toxina A y toxina B de C. difficile, C. difficile que es responsable de unirse a la célula objetivo, permitiendo así endocitosis mediada por receptor subsecuente. Como se describe en la presente, la secuencia de aminoácido del dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina A es mostrado en SEQ ID NO: 375. La secuencia de aminoácidos del dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina B es mostrada en SEQ ID NO: 376. Los diversos dominios de toxina A y toxina B de C. difficile son ilustrados en la Figura 1 y descritos adicionalmente en Davies et al. (Davies, AH, et al., Biochem. J. (2011), 436:517-526).

La designación "BI/NAP1/027" para Clostridium difficile se refiere a un grupo altamente virulento de aislados de Clostridium difficile que ha sido asociado con un aumento en morbidez y mortalidad a través de Europa y Norteamérica (Loo, VG, et al., (2005), N Engl J Med, 353:2442-9; McDonald, LC et al. (2006), Emerg INfect Dis, 12:409-15; McDonald, LC, et al., (2005), N Engl J Med, 353:2433-41; Redelings, MD, et al., (2007), Emerg Infect Dis 13:1417-9). La designación 2BI/NAP1/027" se refiere además a campo pulsado norteamericano tipo I (NAP1), ribotipo 027, y grupo Bl mediante análisis de endunucleasa de restricción. Fue identificado originalmente en la década de 1980, pero no fue identificado originalmente como resistente a los más nuevos agentes de fluoroquinolona y no fue epidémico antes de 2000 (Warny, M. et al., (2005), Lancet 366: 1079-84; Kelly, P, et al., N Engl J Med 359:1932-40). La cepa "BI/NAP1/027" de Clostridium difficile también es caracterizada por producción de toxina A y toxina B incrementada, por la presencia de una toxina adicional (toxina binaria) y resistencia incrementada a fluoroquinolonas (McDonald, LC, et al. (2005), N Engl J Med, 353:2433-41; Warny, M. et al., (2005), Lancet 366:1079-84).

El término "anticuerpo", como se usa en la presente, pretende referirse a moléculas de ¡nmunoglobulina comprendidas por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro (es decir, "moléculas de anticuerpo completas"), así como multímeros de las mismas (por ejemplo, IgM) o fragmentos de unión a antígeno de las mismas. Cada cadena pesada está comprendida por una región variable de cadena pesada ("HCVR" o "VH") y una región constante de cadena pesada (comprendida de dominio CH1, CH2 y CH3). Cada cadena ligera está comprendida por una región variable de cadena ligera ("LCVR o "VL") y una región constante de cadena ligera (CL). Las regiones VH y VL pueden ser subdivididas adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), interespaciadas con regiones que son más conservadas, llamadas regiones de marco (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDRs y cuatro FRs, dispuestos de extremo amino a extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En ciertas modalidades de la invención, los FRs del anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) pueden ser idénticos a las secuencias de línea germinal humana, o pueden ser modificados de manera natural o artificial. Una secuencia de consenso de aminoácidos puede definirse con base en un análisis lado-a-lado de dos o más CDRs.

La substitución de uno o más residuos de CDR u omisión de una o más CDRs también es posible. Los anticuerpos han sido descritos en la literatura científica en la cual, una o dos CDRs pueden dispensarse para unión. Padlan et al. (1995 FASEB J . 9: 1 33-1 39) analizaron las regiones de contacto entre los anticuerpos y sus antígenos, con base en las estructuras de cristal publicadas y concluyeron que solo aproximadamente un quinto a un tercio de residuos de CDR realmente contactan el antígeno. Padlan también encontró muchos anticuerpos en los cuales uno o dos CDRs no tuvieron aminoácidos en contacto con un antígeno (ver además, Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:41 5-428).

Los residuos de CDR que no contactan antigeno pueden ser identificados con base en estudios previos (por ejemplo, residuos H60-H65 en CDRH2 no son con frecuencia requeridos), de las regiones de CDRs de Kabat que quedan fuera de las CDRs de Chothia, mediante modelado molecular y/o empíricamente. Si una CDR o residuo(s) de la misma es omitido, es usualmente substituido con un aminoácido que ocupa la posición correspondiente en otra secuencia de anticuerpo humano o un consenso de tales secuencias. Las posiciones para substitución dentro de las CDRs y aminoácidos para substituir también pueden ser seleccionados empíricamente. Las substituciones empíricas pueden ser substituciones conservadoras o no conservadoras.

Los anticuerpos monoclonales anti-toxina A y/o anti-toxina B completamente humanos descritos en la presente pueden comprender una o más substituciones de aminoácidos, inserciones y/o supresiones en el marco y/o regiones de CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera como se compara con las secuencias de línea germinal correspondientes. Tales mutaciones pueden ser valoradas fácilmente al comparar las secuencias de aminoácidos descritas en la presente a secuencias de línea germinal disponibles de, por ejemplo, bases de datos públicas de secuencias de anticuerpos. La presente invención incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, los cuales son derivados de cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en la presente, en donde uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones de CDR y/o marco mutan al o a los residuos correspondientes de la secuencia de línea germinal a partir de la cual el anticuerpo fue derivado, o al o a los residuos correspondientes de otra secuencia de línea germinal humana, o a una substitución de aminoácido conservadora del o de los residuos de línea germinal correspondiente (tales cambios de secuencia son referidos en la presente de manera colectiva como "mutaciones de línea germinal"). Una persona de habilidad ordinaria en la técnica, que inicia con las secuencias de región variable de cadena pesada y ligera descritas en la presente, pueden producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno, los cuales comprenden una o más mutaciones de línea germinal individual o combinaciones de las mismas. En ciertas modalidades, todos los residuos de CDR y/o marco dentro de los dominios VH y/o VL mutan nuevamente a los residuos encontrados en la secuencia de línea germinal original a partir de la cual el anticuerpo fue derivado. En otras modalidades, solo ciertos residuos mutan nuevamente a la secuencia de línea germinal original, por ejemplo, solo los residuos mutados encontrados dentro de los primeros 8 aminoácidos de FR1 o dentro de los últimos aminoácidos de FR4, o solo los residuos mutados encontrados dentro de CDR1 , CDR2 o CDR3. En otras modalidades, uno o más del o de los residuos de CDR y/o marco son mutados al o a los residuos correspondientes de una secuencia de línea germinal diferente (es decir, una secuencia de línea germinal que es diferente de la secuencia de línea germinal a partir de la cual el anticuerpo fue derivado originalmente) . Además, los anticuerpos de la presente invención pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de línea germinal dentro de las regiones de CDR y/o marco, por ejemplo, en donde ciertos residuos individuales son mutados al residuo correspondiente de una secuencia de línea germinal particular, mientras que otros ciertos residuos que difieren de la secuencia de línea germinal original son mantenidos o mutados al residuo correspondiente de una secuencia de línea germinal diferente. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de línea germinal pueden ser probados fácilmente para una o más propiedades deseadas, tales como especificidad de unión mejorada, afinidad de unión incrementada, propiedades biológicas antagonistas o agonistas mejoradas o intensificadas (según pueda ser el caso) , inmunogenicidad reducida, etc.

Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno obtenidos en esta manera general son abarcados dentro de la presente invención.

La presente invención también incluye anticuerpos monoclonales anti-toxina A y/o anti-toxina B completamente humanos comprendiendo variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR descritas en la presente teniendo una o más substituciones conservadoras. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-toxina A y anti-toxina B teniendo secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR con, por ejemplo, 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc. substituciones de aminoácidos conservadoras en relación a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR descritas en la presente.

El término "anticuerpo humano", como se usa en la presente, pretende incluir anticuerpos teniendo regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humanas. Los mAbs humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humanas (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o de sitio específico in vitro o mediante mutación somática in vivo), por ejemplo en las CDRs y en particular CDR3. Sin embargo, el término "anticuerpo humano", como se usa en la presente, no pretende incluir mAbs en los cuales las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero (por ejemplo, ratón), han sido injertadas sobre secuencias de FR humanas.

El término "se une específicamente" o "se une específicamente a", o sim ilares , significa que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo forma un complejo con un antígeno que es relativamente estable bajo condiciones fisiológicas. La unión específica puede ser caracterizada por una constante de disociación de equilibrio de al menos aproximadamente 1 x 10 6 M o menos (por ejemplo, una KD más pequeña denota una unión más fuerte). Los métodos para determinar si dos moléculas que se unen específicamente son bien conocidas en la técnica e incl uyen, por ejemplo, diálisis de equi librio, resonancia de plasmón de superficie y sim ilares. Como se describe en la presente, los anticuerpos han sido identificados por resonancia de plasmón de superficie, por ejem plo , BIACOREM R, los cuales se unen específicamente a ya sea la toxina A, o específicamente a la toxina B de C. difficile, mientras que otros han sido identificados porque se unen específicamente al dom inio de unión de receptor carboxi terminal tanto de toxina A como B . Más aún , los anticuerpos multi-específicos que se unen a toxi na A o toxina B y uno o más antígenos adicionales o uno bi-específico q ue se u ne a dos regiones d iferentes de toxina A o toxina B son, no obstante, considerados anticuerpos que "se unen específicamente" , como se usa en la presente.

El término anticuerpo de "alta afinidad" se refiere a esos mAbs teniendo u na afinidad de unión a toxina A o toxina B, expresados como KD, de al menos 1 0"8 M ; de preferencia 1 0~9 M; más preferiblemente 1 0" 10M , incluso más preferiblemente 1 0"1 1 M , aún más preferiblemente 1 0"1 2 M , como se m ide mediante resonancia de plasmón de superficie, por ejemplo, BIACOREMR o ELISA de afinidad en solución .

Por el término "velocidad de apagado" , "Koff" o "kd" se quiere decir un anticuerpo que se disocia de la toxina A o toxina B, o ambas, con u na constante de velocidad de 1 x 1 0 3 s" 1 o menos, de preferencia 1 x 1 0"4 s o menos, como es determi nado por resonancia de plasmón de superficie, por ejem plo, BIACOREM R.

Los términos "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo , y similares, como se usa en la presente, incluyen cualquier polipéptido o glicoproteína que ocurre de manera natural , enzimáticamente obten ible, sintético o genéticamente diseñado que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Los términos "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, o "fragmento de anticuerpo" , como se usa en la presente, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad para unir a toxina A o toxina B o am bos.

Las modalidades específicas, anticuerpo o fragmentos de anticuerpo de la i nvención pueden conjugarse a una porción terapéutica ("inm unoconjugado") , tal como un antibiótico, un segundo anticuerpo anti-toxina A o B, o una vacuna de C. difficile, o un toxoide, o cualquier otra porción terapéutica útil para tratar una enfermedad o condición provocada por C. difficile.

Un "anticuerpo a islado" , como se usa en la presente, pretende referirse a un anticuerpo que está substancialmente libre de otros anticuerpos (Abs) teniendo especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a toxi na A o toxina B, o un fragmento del mismo, está substancialmente libre de Abs que se unen específicamente a antígenos diferentes de toxina A o toxina B.

Un "anticuerpo de bloqueo" o un "anticuerpo neutralizante" , como se usa en la presente (o un "anticuerpo que neutraliza la actividad de toxina A y/o toxina B"), pretende referirse a un anticuerpo cuya unión a toxina A y/o toxina B resulta en inhibición de al menos una actividad biológica de toxina A y/o toxina B. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede ayudar en la prevención de la enfermedad primaria provocada por C. difficile. De manera alternativa, un anticuerpo de la invención puede demostrar la capacidad para prevenir una recurrencia o recaída de la enfermedad provocada por C. difficile, o al menos un síntoma provocado por infección de C. difficile, incluyendo diarrea o colitis pseudomembranosa. Esta inhibición de la actividad biológica de toxina A y/o toxina B puede ser valorada al medir uno o más indicadores de actividad biológica de toxina A y/o toxina B por uno o más de varios ensayos in vitro estándares (tal como un ensayo de neutralización, como se describe en la presente) o ensayos in vivo conocidos en la técnica (por ejemplo, modelos animales para observar la protección del reto con C. difficile siguiendo la administración de uno o más de los anticuerpos descritos en la presente).

El término "resonancia de plasmón de superficie", como se usa en la presente, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones biomoleculares de tiempo real mediante detección de alteraciones en concentraciones de proteína dentro de una matriz de biosensor, por ejemplo, usando el sistema BIACOREMR (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala , Suecia y Piscataway N . J . ) .

El término "KD" , como se usa en la presente , pretende referirse a la constante de disociación de equ il ibrio de una interacción anticuerpo-antigeno particu lar.

El término "epitope" se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la reg ión variable de una molécula de anticuerpo conocida como paratope. U n antígeno simple puede tener más de un epitope. Así, diferentes anticuerpos pueden unirse a diferentes áreas sobre un antígeno y pueden tener efectos biológ icos diferentes . El térm ino "epitope" también se refiere a un sitio sobre un antígeno al cual responden las células B y/o T. Tam bién se refiere a una región de un antígeno que está unido por un anticuerpo . Los epitopes pueden ser definidos como estructurales o funcionales. Los epitopes funcionales son generalmente un subconj unto de los epitopes estructurales y tienen esos residuos que contribuyen directamente a la afinidad de la interacción . Los epitopes también pueden ser conformacionales, es decir, com puestos de aminoácidos no lineales . En ciertas modalidades, los epitopes pueden inclu ir determi nantes que son agrupam ientos de superficie qu ímicamente activa de molécu las tales como ami noácidos, cadenas laterales de azúcares, grupos fosforilo o grupos sufonilo, y en ciertas modalidades, pueden tener características estructurales tridimensionales, y/o características de ca rga específica.

El término " identidad su bstancial" o "substancialmente idéntica", cuando se refiere a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinean de manera óptima con inserciones o supresiones de nucleótidos apropiados con otro ácido nucleico (o su filamento complementario), existe una identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente 90%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de las bases de nucleótidos, como se mide mediante cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tal como FASTA, BLAST o GAP, como se discute más adelante. Una molécula de ácido nucleico teniendo identidad substancial a una molécula de ácido nucleico de referencia puede codificar, en ciertos casos, un polipéptido teniendo la misma o substancialmente la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de referencia.

Conforme se aplica a polipéptidos, el término "similitud substancial" o "substancialmente similar" significa que dos secuencias de péptidos, cuando se alinean de manera óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando ponderaciones de aberturas de fallas, comparten al menos 90% de identidad, aún más preferiblemente al menos 95%, 98% o 99% de identidad de secuencia. De preferencia, las posiciones de residuos, las cuales no son idénticas, difieren por substituciones de aminoácidos conservadores. Una "substitución de aminoácido conservador" es una en la cual un residuo de aminoácido es substituida por otro residuo de aminoácido teniendo una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general , una substitución de aminoácidos conservadora no cambiarán substancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En casos donde dos o más secuencias de aminoácidos difieren unas de otras por substituciones conservadoras, el porcentaje o grado de similitud puede ser ajustado hacia arriba para corregir para la naturaleza conservadora de la substitución. Medios para hacer este ajuste son bien conocidos para aquéllos de habilidad en la técnica. Ver, por ejemplo, Pearson ( 1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331 . Ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1 ) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales de hidroxilo alifáticas; serina y treonina; 3) cadenas laterales conteniendo amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas; fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: Usina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y 7) cadenas laterales conteniendo azufre: cisteína y metionina. Grupos de substitución de aminoácidos conservadores preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. De manera alternativa, un reemplazo conservado es cualquier cambio teniendo un valor positivo en la matriz de log-verosimilitud PAM250 descrita en Gonnet et al. ( 1992) Science 256: 1443 45. Un reemplazo "moderadamente conservador" es cualquier cambio teniendo un valor no negativo en la matriz de log-verosimilitud PAM250.

La similitud de secuencia para polipéptidos es normalmente medida usando un programa de análisis de secuencias. El programa de cómputo de análisis de proteínas iguala secuencias similares usando medidas de similitud asignada a varias substituciones, supresiones y otras modificaciones, incluyendo substituciones de aminoácidos conservadoras. Por ejemplo, el programa de cómputo GCG contiene programas tales como GAP y BESTFIT, los cuales pueden ser usados con parámetros de falla para determinar la homología de secuencias o identidad de secuencias entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína tipo natural y una muteína de la misma. Ver, por ejemplo, GCG Versión 6.1 . Las secuencias de polipéptidos también pueden ser comparadas usando FASTA con parámetros de falla o recomendados; un programa en GCG Versión 6.1 . FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentaje de identidad de las regiones del mejor traslape entre las secuencias de consulta y búsqueda (Pearson (2000) supra). Otro algoritmo preferido cuando se compara con una secuencia de la invención a una base de datos conteniendo un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa de cómputo BLAST, especialmente BLASTP O TBLASTN , usando parámetros de falla. Ver, por ejemplo, Altschul et al. (1 0) J . Mol. Biol. 21 5: 403 41 0 y ( 1 997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402.

En modalidades específicas, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo para uso en el método de la invención puede ser mono-específico, bi-específico o multi-específico. Anticuerpos multi-específicos pueden ser específicos para diferentes epitopes de un polipéptido objetivo o puede contener dominios de unión a antígeno específicos para epitopes de más de un polipéptido objetivo. Un formato de anticuerpo bi-específico ejemplar que puede ser usado en el contexto de la presente invención involucra el uso de un primer dominio de CH3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio de CH3 de Ig, en donde los primero y segundo dominios de CH3 de Ig difieren uno de otro por al menos un aminoácidos, y en donde al menos una diferencia de aminoácidos reduce la unión del anticuerpo bi-específico a Proteína A como se compara con un anticuerpo bi-específico que carece de la diferencia de aminoácidos. En una modalidad, el primer dominio Ig CH 3 se une a Proteína A y el segundo dominio Ig CH3 contiene una mutación que reduce o suprime la unión a Proteína A, tal como una modificación H95R (por numeración de exones IMGT; H435R por numeración EU). El segundo CH3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y435F por EU). Las modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo CH3 incluyen: D1 6E, L18M, N44S, K52N , V57M y V82I (por IMGT, D356E, L358M, N384S, K392N , V397M y V422I por EU) en el caso de mAbs de lgG 1 ; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V4221 por EU) en el caso de mAbs de lgG2; y Q 1 5R, N44S, K52N, V57M, 469K, E79Q y V82I (por I MGT; Q355R, N384S, K39SN , V397M, R409K, E41 9Q y V422I por EU) en el caso de mAbs de lgG4. Las variaciones sobre el formato de anticuerpo bi-específico descritas antes son contempladas dentro del alcance de la presente invención.

Por la frase "cantidad terapéuticamente efectiva" se quiere decir una cantidad que produce el efecto deseado para el cual es administrada. La cantidad exacta dependerá del propósito del tratamiento, y será valorable por alguien experto en la técnica usando técnicas conocidas (ver, por ejemplo, Lloyd (192) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).

Descripción general El Clostridium difficile es una bacteria productora de toxinas, formadora de esporas, gram-positiva, la cual es una causa principal de diarrea asociada a antibiótico nosocomial y colitis en humanos (Bartlett, J.G. et al. (1978), N . Engl. J. Med. 298:531 -534; Kyne, L , et al. (2001 ) , Clin. N. Am . 30:753-777). La perturbación del ambiente colónico que resulta de la administración de antibióticos de amplio espectro conduce a la colonización del intestino por la bacteria (Johnson, S.C. et al. (1990), Lancet 336:97-100). Un gran porcentaje de esta población de pacientes que se vuelve colonizada con C. difficile desarrolla diarrea, que en ciertos casos conduce a colitis pseudomembranosa, la cual se cree que es debida a la producción de dos exotoxinas por C. difficile, toxina A y toxina B. El tratamiento consiste de la descontinuación del antibiótico ofensor, o alteraciones en la dosificación del antibiótico ofensor, o sin cambio en el antibiótico ofensor, seguido por la administración de metronidazol, vancomicina o fidaxomicina. Aunque este régimen de tratamiento es usualmente útil, muchos pacientes recaen cuando la terapia es descontinuada (Fekety, R. , (1 997), Am. J . Gastroenterology, 92:739-750) . Adicionalmente, en muchos casos, la bacteria C. difficile se vuelve resistente a la terapia usada, conduciendo así a fallas de tratamiento y en algunos casos tasas de mortalidad incrementadas (Dworczynski , A. et al. ( 1991 ) , Cytobios. 65: 149-1 53; Fekety, R. et al . (1993) , JAMA, 269:71 -75) . De acuerdo con esto , existe la necesidad de terapias más efectivas para com batir esta enfermedad y/o preven ir la recurrencia de esta enfermedad en pacientes colonizados con C. difficile. Además, existe la necesidad de tratar pacientes quienes están en riesgo de desarrollar una infección de C. difficile mediante adm in istración profiláctica de un agente efectivo. I ncluidos en esta población de pacientes en riesgo se encuentran los pacientes mayores, en particular de 65 años de edad y más, aunque pacientes más jóvenes que 65 pueden estar en mayor riesgo dependiendo de la presencia de cualquier enfermedad subyacente q ue pueda predisponerlos a infección con C. difficile. Los pacientes que han sido infectados con C. difficile previamente pueden estar en mayor riesgo de recurrencias. Otros pacientes en riesgo incluyen pacientes quienes están pred ispuestos a infección de C. difficile debido a una cond ición médica subyacente, o pacientes quienes son hospitalizados durante periodos largos (al menos una semana o más) y/o, qu ienes están en tratamiento de largo plazo (= 14 días) con antibióticos de amplio espectro, así como pacientes quienes están sobre i nhibidores de bomba de protones para tratar enfermedad de reflujo gastroesofág ico (G ERD) , úlceras de estómago e intestino delgado e inflamación del esófago. Estos agentes incluyen dexlansoprazol , esomeprazol , lansoprazol , omeprazol , pantoprazol sódico, o rabeparzol sódico . Otros agentes que están bajo estudio para colocar un paciente en riesgo para desarrollar una infección de C. difficile, incluyen bloqueadores de receptor de h¡stamina-H2, tales como cimetidina, famotidina, nizatidina y ranitidia. Otros estudios notaron una incidencia específica de la edad de 50 años, y un aumento en la tasa de mortalidad en pacientes después de la edad de 60 (Loo, VG, et al., (2005), N Engl J Med 353:2442-9). Este estudio fue consistente, de hecho, con un estudio anterior que mostró un aumento relacionado con la edad en la incidencia de ensayos positivos para toxina de C. difficile (Karlstróm, O. et al. (1998), Clin Infect Dis 26:141-5).

Para abordar la necesidad de terapias más efectivas contra C. difficile, se han conducido muchos estudios para determinar si los anticuerpos anti-toxina A y/o B, cuando se usan solos, o como terapia auxiliar, podrían ser usados como un medio para tratar esta enfermedad, o al menos como un medio para prevenir la recurrencia de la diarrea o colitis asociada con infección de C. difficile. (Corthier, et al. (1991), Infect. Immun. 59(3):1192-1195; Kink, J.A. y Williams, J.A. (1998), Infect. Immun. 66(5):2018-2025; Lowy, I. et al. (2010), N. Engl. J. Med. 362(3):197-205; Babcock, G.J., et al.; (2006), Infection and Immunity, 74(11):6339-6347). De manera más particular, los modelos animales de infección con C. difficile han sido usados para estudiar el efecto de anticuerpos a toxina A y/o toxina B a partir de C. difficile, en infección primaria, así como un tasas de recaídas in vivo (Corthier, G. et al. (1991), Infect. Immun. 59(3):1192-1195; Kink, J.A. et al. (1998), Infect. Immun. 66(5):2018-2025; Babcock, G.J. et al. (2006), 74(11):6339-6347). Los resultados en modelos animales de C. difficile, mostraron protección significativa, promoviendo así ensayos clínicos adicionales usando anticuerpos anti-toxina A y anti-toxina B en pacientes humanos con la enfermedad (Lowy, I . , (201 0) , N . Engl . J . Med . 362(3) : 197-205) .

Los anticuerpos descritos en la presente dem uestran la unión específica a toxina A y/o a toxina B de C. difficile, y pueden ser útiles para tratar pacientes que sufren de infección con C. difficile. El uso de tales anticuerpos pueden ser un medio efectivo para tratar pacientes que sufren de una infección primaria con C. difficile, o pueden ser usados para prevenir una recaída de la enfermedad y los síntomas acompañantes asociados con la enfermedad, o pueden usarse para dism inuir la severidad de la diarrea o colitis asociadas con una infección primaria o con la recurrencia de la infección. Pueden ser usados solos o como terapia auxiliar con otras porciones terapéuticas o modalidades conocidas en la técnica para tratar infecciones de C. difficile, tales como, pero no lim itadas a , terapia antibiótica , por ejemplo, con metronidazol , vancom ici na o fidaxo m icina. Pueden ser usadas en conjunción con una vacuna de C. difficile, o con el uso de un toxoide, o con un segundo o tercer anticuerpo diferente específico de toxi na A y/o B.

En ciertas modalidades de la invención , las combinaciones de los anticuerpos de la i nvención pueden ser usadas para tratar una infección provocada por una cepa hipervirulenta de C. difficile. El grupo aislado epidémico h iperviru lento más notable a la fecha es uno referido como "BI/NAP 1 /027" . Este ha sido asociado con brotes de infecciones de C. difficile a través de Europa y Norteamérica. Los aislados que caen en esta desig nación son caracterizados por la producción de toxina A y toxina B incrementada, por la presencia de una toxina adicional (toxina binaria) y por una resistencia incrementada a fluoroquinolonas (McDonald, LC, et al., (2005), N Engl J Med 353:2433-41; Warny, ME, et al., (2005), Lancet 366:1079-84). Este grupo de aislados también puede ser referido como las cepas de grupo Bi, ribotipo 027, de campo pulsado norteamericano tipo 1 (NAP1). Este grupo de cepas contiene una supresión de gene tcdC de 18 pares de bases y la toxina binaria, que produce es codificada por genes cdtA y cdtB. Se ha reportado que este grupo produce toxina A y toxina B en cantidades de 16 y 23 veces, respectivamente, más que las cepas de control (Warny, ME, et al, (2005), Lancet 366:17079-84). Debido a que se ha mostrado que los anticuerpos de la presente invención neutralizan la toxina producida por cuatro cepas BI/NAP1/027 de C. difficile, clínicamente aisladas (VA5, VA17, 6336 y 6443), se prevé que las composiciones comprendiendo los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse terapéuticamente a pacientes que sufren de una infección con las cepas hipervirulentas antes notadas, de C. difficile, o pueden administrarse profilácticamente a pacientes quienes están en riesgo de desarrollar una infección con las cepas hipervirulentas notadas en la presente, así como con cualquier otra cepa hipervirulenta clínicamente relevante. Los medios por los cuales identificar estas cepas son conocidos para aquéllos expertos en la técnica, y estos métodos pueden incluir electroforesis de gel de campo pulsado (PFGE) de aislados de C. difficile (Ver, por ejemplo, Fawley, WN, et al., (2002), J. Clin Microbiol 40:3546-7), los análisis de PCR para genes de toxinas binarias y supresiones parciales del gene tcdC (Vewr, por ejemplo, Gongalves, C. et al. (2004), J Clin Microbiol 42:1933-9; y Cophen, SH et al., (2000), J Infect Dis 181:659-63) y análsis de endonucleasa de restricción (ver, por ejemplo, Clabots, CR, et al., (1993), J Clin Microbiol 31:1870-5).

En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención son obtenidos de ratones inmunizados con un inmunogeno primario, tal como una toxina A inactivada, natural (ver GenBank número de acceso CAA63564 (SEQ ID NO: 378)), o toxina B (Ver GenBank número de acceso CAJ67492 (SEQ ID NO: 380)) de C. difficile, o con un recombinante, pero la forma inactivada de las toxinas, o fragmentos de toxinas, seguido por inmunización con un inmunogeno secundario, o con un fragmento inmunogénicamente activo de la toxina natural. Los animales pueden ser inmunizados con ya sea toxina A inactivada sola o toxina B inactivada sola, o tanto con toxina A inactivada como toxina B inactivada concurrentemente. Las toxinas pueden ser inactivadas antes de usarse como un inmunogeno usando procedimientos estándares para preparar toxoides, incluyendo por tratamiento con formaldehído, glutaraldehído, peróxido o tratamiento con óxido (Relyveld, et al. Methods in Enzymology, 93:24, 1983, Woodrow y Levine, eds. New Generation Vaccines, Marcel Dekker, Inc., New York, 1990). Otros medios de inactivación es mediante el uso de UDP-dialdehído (Genth et al., (2000), Infect. Immun. 68(3):1094-1101), los cuales pueden actuar para preservar la estructura natural de la toxina comparada con otros métodos de inactivación, intensificando por ello la probabilidad de provocar anticuerpos que son más reactivos con la toxina natural.

De manera alternativa, las toxinas mutantes de C. difficile, las cuales exhiben toxicidad reducida, pueden ser producidas usando técnicas recombinantes estándares y usadas como inmunógenos (ver, por ejemplo, US 5,085,862; 5,221 ,618; 5,244,657; 5,332, 583; 5,358,868; y 5,433,945). Tales mutantes pueden contener supresiones o mutaciones puntuales en el sitio activo de la toxina.

El inmunógeno puede ser un fragmento biológicamente activo y/o inmunogénico de toxina A o toxina B natural, o DNA que codifica el fragmento activo del mismo. El fragmento puede ser derivado del dominio N-terminal o C-terminal de ya sea toxina A o toxina B. El fragmento puede ser derivado de cualquiera de los dominios conocidos de toxina A o toxina B. el fragmento puede ser derivado de cualquiera de los dominios conocidos de toxina A o toxina B (Ver Figura 1 ), incluyendo el dominio enzimático de glucosilación (A), el dominio procesador autocatalítico (C), el dominio transubicador (D) o el dominio de unión (B). En ciertas modalidades de la invención, el inmunógeno es el dominio de unión de receptor carboxi terminal de la toxina A que varía desde aproximadamente los residuos de aminoácidos 1832-271 0 de SEQ ID NO: 378. En ciertas modalidades de la invención, el inmunógeno es el dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina A que es mostrado en SEQ ID NO: 375. En ciertas modalidades de la invención, el inmunógeno es el dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina B que varía desde aproximadamente los residuos de aminoácidos 1834-2366 de SEQ I DNO: 380. En ciertas modalidades de la invención, el inmunóogeno es el dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina B que es mostrado en SEQ I D NO: 376.

La secuencia de aminoácidos de longitud completa de toxina A de C. difficile, es mostrada como SEQ I D NO: 378.

La secuencia de aminoácidos de longitud completa de toxina B de C. difficile, es mostrada como SEQ I D NO: 380.

En ciertas modalidades, los anticuerpos que se unen específicamente a toxina A o toxina B de C. difficile, pueden ser preparados usando los fragmentos de las regiones notadas antes, o péptidos que se extienden más allá de las regiones designadas por aproximadamente 5 hasta aproximadamente 20 residuos de aminoácidos desde cualquiera, o ambos, los extremos N o c terminales de las regiones descritas en la presente. En ciertas modalidades, cualquier combinación de las regiones antes notadas o fragmentos de los mismos pueden ser usadas en la preparación de anticuerpos específicos de toxina A o toxina B. En ciertas modalidades, cualquiera de una o más de las regiones antes notadas de toxina A o toxina B, o fragmentos de las mismas pueden usarse para preparar anticuerpos monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos.

Fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos A menos que se indique específicamente de otra manera, el término "anticuerpo", como se usa en la presente, deberá ser entendido como que abarca moléculas de anticuerpo comprendiendo dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina (es decir, "moléculas de anticuerpo completas") así como fragmentos de unión a antígeno de las mismas. Los términos "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de una anticuerpo, y similares, como se usa en la presente, incluyen cualquier polipéptido o glicoproteína que ocurre de manera natural, enzimáticamente obtenible, sintético, o genéticamente diseñado, que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Los términos "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, o "fragmento de anticuerpo", como se usa en al presente, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad para unirse específicamente a ya sea toxina A y/o toxina B de C. difficile. Un fragmento de anticuerpo puede incluir un fragmento Fab, un fragmento F(ab' )2 , un fragmento Fv, un fragmento dAb, un fragmento conteniendo una CDR, o una CDR aislada. Fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo pueden ser derivados, por ejemplo, de moléculas de anticuerpo completas usando cualquier técnica estándar adecuada, tal como técnicas de ingeniería genética recombinante o digestión proteolítica que involucran la manipulación y expresión de DNA que codifica dominios variables y constantes (opcionalmente) de anticuerpos. Tal DNA es conocido y/o está fácilmente disponible de, por ejemplo, fuentes comerciales, genotecas de DNA (incluyendo, por ejemplo, genotecas de fagos-anticuerpos), o puede ser sintetizado. El DNA puede ser secuenciado y manipulado químicamente o al usar técnicas de biología molecular, por ejemplo para arreglar uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear residuos de cisteína, modificar, adicionar o dilu ir aminoácidos, etc.

Ejemplos no limitantes de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (i i) fragmentos F(ab')2 ; (iii) fragmentos Fd ; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv de cadena simple (scFv) ; (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento m ínimo consistiendo de los resid uos de aminoácidos que imitan la reg ión hipervariable de un anticuerpo (por ejem plo, una región determinante de complementariedad aislada (CDR) tal como un péptido CDR3) , o un péptido FR3-CDR3-FR4. Otras moléculas diseñadas, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de dominio simple, anticuerpos suprimidos de dom in io, anticuerpos quiméricos, anticuerpos de CDR-injertada, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejem plo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc. ) , inmunofarmacéuticos modulares peq ueños (SMI Ps) , y dominios de IgNAR variable de tiburón , también son abarcados dentro de la expresión "fragmento de un ión a antígeno" , como se usa en la presente.

Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo comprenderá normalmente al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una CDR, la cua l es adyacente a o en marco con una o más secuencias de marco. En los fragmentos de un ión a antígeno teniendo un dom in io VH asociado con un domi nio VL , los dominios VH y VL pueden ser situados en relación u nos a otros en cualquier arreglo adecuado. Por ejem plo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros VH - VH , VH - VL o L - VL . De manera alternativa, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio de VH O VL monomérico.

En ciertas modalidades, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable covalentemente enlazado a al menos un dominio constante. Configuraciones ejemplares, no limitantes, de dominios variables y constante que pueden encontrarse dentro de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención incluyen: (i) VH -CH1; (Ü) VH -CH2; (iii) VH -CH3; (iv) VH -CH1-CH2; (v) VH -CH1-CH2-CH3; (vi) VH -CH2-CH3; (vii) VH -C; (viii) VL -CH1 ; (ix) VL -CH2; (x) VL -CH3; (xi) VL -CH1-CH2; (xii) VL -CH1-CH2-CH3; (xiii) VL -CH2-CH3; (vii) VL -CL. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluyendo cualquiera de las configuraciones ejemplares listadas antes, los dominios variables y constantes pueden ser enlazados ya sea directamente uno a otro o pueden enlazarse mediante una región de gozne o enlazadora completa o parcial. Una región de gozne puede consistir de al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos, los cuales resultan en un enlace flexible o semi-flexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una molécula de polipéptidos simple. Más aún, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención puede comprender un homo-dímero o hetero-dímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variables y constantes listadas antes en asociación no covalente unas con otras y/o con uno o más dominios de HH O VL monoméricos (por ejemplo, por enlace(s) disulfuro).

Como con moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión a antígeno pueden ser mono-específicos o multi-específicos (por ejemplo, bi-específicos). Un fragmento de unión a antígeno multi-específico de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos dos dominios variables diferentes, en donde cada dominio variable es capaz de unirse específicamente a un antígeno separado o a un epitope diferente en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multi-específico, incluyendo los formatos de anticuerpo bi-específico ejemplares descritos en la presente, pueden ser adaptados para usarse en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención usando técnicas de rutina disponibles en la técnica.

Preparación de anticuerpos humanos Los métodos para generar anticuerpos humanos en ratones transgénicos son conocidos en la técnica. Cualquiera de tales métodos conocidos pueden ser usados en el contexto de la presente invención para hacer anticuerpos humanos que se unen específicamente a C. difficile.

Usando tecnología VELOCIMMUNE® (ver, por ejemplo, US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) o cualquier otro método conocido para generar anticuerpos monoclonales, los anticuerpos quiméricos de alta afinidad a toxina A y/o toxina B de C. difficile son aislados inicialmente teniendo una región variable humana y una región constante de ratón. La tecnología VELOCIMMUNE® involucra la generación de un ratón transgénico teniendo un genoma comprendiendo regiones variables de cadena pesada y ligera humanas operablemente enlazadas a sitios de región constante de ratón endógenos, de manera que el ratón produce un anticuerpo comprendiendo una región variable humana y una región constante de ratón en respuesta a la estimulación antigénica. El DNA que codifica las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo son aisladas y operablemente enlazadas a DNA que codifica las regiones constantes de cadena pesada y ligera humanas. El DNA es expresado entonces en una célula capaz de expresar el anticuerpo completamente humano.

En general, un ratón VELOCI MMU NE® es retado con el antígeno de interés, y las células linfáticas (tales como células B) son recuperadas de los ratones que expresan anticuerpos. Las células linfáticas pueden fusionarse con una línea de células de mieloma para preparar líneas de células de hibridoma inmortales, y tales líneas de células de hibridoma son clasificadas y seleccionadas para identificar líneas de células de hibridoma que producen anticuerpos específicos al antígeno de interés. El DNA que codifica las regiones variables de la cadena pesada y cadena ligera pueden aislarse y enlazarse a regiones constantes isotípicas deseables de la cadena pesada y cadena ligera. Tal proteína de anticuerpo puede ser producida en una célula, tal como una célula CHO. De manera alterntiva, el DNA que codifica los anticuerpos quiméricos específicos de antígeno o los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas pueden aislarse directamente de linfocitos específicos de antígeno.

I nicialmente , los a nticuerpos quiméricos de alta afinidad son aislados teniendo una región variable human y una reg ión constante de ratón . Como en la sección experimental más adelante, los anticuerpos son caracterizados y seleccionados por características deseables, incluyendo afinidad , selectividad , epitope , etc. Las regiones constantes de ratón son reemplazadas con una región constante h umana deseada para generar el anticuerpo completamente humano de la invención, por ejem plo, lgG 1 o lgG4 tipo natural o modificada . Aunque la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, la unión a antígeno de alta afinidad y características de especificidad objetivo residen en la región variable.

En general , los anticuerpos de la presente invención poseen muy altas afinidades, que normalmente poseen KD desde aproximadamente 1 0 1 2 a aproximadamente 1 0 9 M, cuando se m ide mediante unión a antígeno ya sea inmovilizado sobre fase sól ida o en fase de solución . Las regiones constantes de ratón son reem plazadas con regiones constantes humanas deseadas para generar los anticuerpos completamente humanos de la invención . Aunque la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de especificidad objetivo y unión a antígeno de alta afinidad residen en la región variable .

Bioequivalentes Los anticuerpos anti-toxina A y anti-toxina B y fragmentos de anticuerpo de la presente invención abarcan proteínas teniendo secuencias de aminoácidos que varían a partir de aquéllas de los anticuerpos descritos, pero que retienen la capacidad para unir toxina A o toxina B. Tales anticuerpos variantes y fragmentos de anticuerpo comprenden una o más adiciones, supresiones o substituciones de aminoácidos cuando se compara con secuencia padre, pero exhiben actividad biológica que es esencialmente equivalente a aquélla de los anticuerpos descritos. De igual manera, las secuencias de DNA que codifican anticuerpo de la presente invención abarcan secuencias que comprenden una o más adiciones, supresiones o substituciones de nucleótidos cuando se comparan con la secuencia descrita, pero que codifican un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que es esencialmente bioequivalente a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención.

Las dos proteínas de unión a antígeno, o anticuerpos, son consideradas bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya velocidad y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar bajo condiciones experimentales similares, ya sea dosis simple o múltiples dosis. Algunos anticuerpos serán considerados equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en el grado de su absorción pero no en su velocidad de absorción y todavía pueden ser considerados bioequivalentes debido a que tales diferencias en la velocidad de absorción son intencionales y son reflejadas en el etiquetado, son no esenciales para alcanzar las concentraciones de medicamento corporales efectivas sobre, por ejemplo, uso crónico, y son consideradas médicamente insignificante para el producto de medicamento particular estudiado.

En una modalidad, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si no existen diferencias clínicamente significativas en su seguridad, pureza y potencia.

En una modalidad, dos proteínas de unión a antigeno son bioequivalentes si un paciente puede ser intercambiado una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, incluyendo un cambio clínicamente significativo en inmunogenicidad, o efectividad disminuida, como se compara con la terapia continua sin tal intercambio.

En una modalidad, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si ambas actúan mediante un mecanismo o mecanismos comunes de acción para la condición o condiciones de uso, al grado de que tales mecanismos son conocidos.

La bioequivalencia puede ser demostrada mediante métodos in vivo y/o in vivo. Las medidas de bioequivalencia incluyen , por ejemplo, (a) una prueba in vivo en humanos u otros mamíferos, en las cuales la concentración del anticuerpo o sus metabolitos es medida en sangre, plasma, suero u otro fluido biológico como una función de tiempo; (b) una prueba in vitro que ha sido correlacionada con y es razonablemente predictiva de datos de biodisponibilidad in vivo humanos; (c) una prueba in vivo en humanos u otros mamíferos en los cuales el efecto farmacológico agudo apropiado del anticuerpo (o su objetivo) es medido como una función de tiempo; y (d) en un ensayo clínico bien controlado que establece seguridad, eficacia o biodisponibilidad o bioequivalencia de un anticuerpo.

Las variantes bioequivalentes de los anticuerpos de la invención pueden ser construidas al, por ejemplo, hacer varias substituciones de residuos o secuencias o suprimir residuos o secuencias terminales o internos no necesarios para la actividad biológica. Por ejemplo, los residuos de cisteína no esenciales para la actividad biológica pueden ser suprimidos o reemplazados con otros aminoácidos para prevenir la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos sobre la renaturalización. En otros contextos, los anticuerpos bioequivalentes pueden incluir variantes de anticuerpo comprendiendo cambios de aminoácidos, los cuales modifican las características de glicosilación de los anticuerpos, por ejemplo, mutaciones que elimina o remueven la glicosilación.

Características biológicas de los anticuerpos En general, los anticuerpos de la presente invención pueden funcionar al unirse a ya sea toxina A o toxina B de C. difficile, o tanto a toxina A como toxina B de C. difficile (anticuerpos de reacción cruzada), o a un fragmento de ya sea A o B.

En ciertas modalidades, los anticuerpos de la presente invención pueden unirse a un epitope ubicado en al menos el dominio de unión de receptor C-terminal de toxina A y/o toxina B de C. difficile. En una modalidad , los anticuerpos pueden unirse a la región C-terminal de toxina A, variando desde residuo de aminoácidos 1832-2710 del dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina A, el cual se expande los residuos de aminoácidos 1832-2710 de SEQ ID NO: 378. En ciertas modalidades de la invención, los anticuerpos pueden unir el dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina A que se muestra en SEQ I D NO: 375. En ciertas modalidades de la invención, los anticuerpos pueden interactuar con, o unirse a, residuos de aminoácidos 468-863 del dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina A producido por Clostridium difficile, cuya secuencia es mostrada en SEQ I D NO: 375. En ciertas modalidades de la invención, los anticuerpos pueden interactuar con, o unirse a, un epitope en el dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina A producido por Clostridium difficile, en donde el epitope es seleccionado del grupo que consiste de residuos 468-488 de SEQ ID NO: 375, residuos 51 0-530 de SEQ I D NO: 375, residuos 602-610 de SEQ I D NO: 375, residuos 644-703 de SEQ I D NO: 375, residuos 724-794 de SEQ ID NO: 375, residuos 799-814 de SEQ ID NO: 375 y residuos 858-863 de SEQ I D NO: 375. En una modalidad, el anticuerpo que se une a o interactúa con un epitope en el dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina A producido por Clostridium difficile, seleccionado del grupo que consiste de residuos 468-488 de SEQ I D NO: 375, residuos 51 0-530 de SEQ I D NO: 375, residuos 602-610 de SEQ I D NO. 375, residuos 644-703 de SEQ ID NO: 375, residuos 724-794 de SEQ I DNO: 375, residuos 799-814 de SEQ I D NO: 375 y residuos 858-863 de SEQ I D NO: 375 comprende el par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR de SEQ I D NOs: 146/154. En una modalidad, el anticuerpo que se une a o interactúa con un epitope en el dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina A producida por Clostridium difficile, seleccionado del grupo que consiste de residuos 468-488 de SEQ I D NO: 375, residuos 510-530 de SEQ I D NO: 375, residuos 602-61 0 de SEQ I DNO: 375, residuos 644-703 de SEQ I D NO: 375, residuos 724-794 de SEQ I DNO: 375, residuos 799-814 de SEQ I D NO: 375 y residuos 858-863 de SEQ ID NO: 375 se combina con un segundo anticuerpo que se une específicamente a toxina B de Clostridium difficile en una composición farmacéutica. En una modalidad, este segundo anticuerpo que interactúa con o se une a toxina B de Clostridium difficile comprende el par de secuencias de aminoácidos HCVR6/LCVR de SEQ ID NOs: 274/282.

En ciertas modalidades de la invención , los anticuerpos pueden unirse al dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina B que varía desde aproximadamente los residuos de aminoácidos 1834-2366 de SEQ I D NO: 380. En ciertas modalidades de la invención, los anticuerpos pueden unirse al dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina B que es mostrado en SEQ ID NO: 376.

En ciertas modalidades, los anticuerpos de la presente invención pueden funcionar al bloquear o inhibir la toxicidad asociada con toxina A de C. difficile al unir a cualquier otra región o fragmento de la proteína de toxina A natural de longitud completa, la secuencia de aminoácidos que es mostrada en SEQ I D NO: 378, el cual es codificado por la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ I D NO: 377.

En ciertas modalidades, los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos bi-específicos. Los anticuerpos bi-específicos de la invención pueden un irse a un epitope en toxina A y también pueden un irse a u n epitope en la toxina B . En ciertas modalidades, los anticuerpos bi-específicos de la invención pueden unirse a dos epitopes diferentes en la toxi na A. En ciertas modalidades , los anticuerpos bi-específicos de la invención pueden un irse a dos diferentes epitopes en la toxina B. En ciertas modalidades, los anticuerpos bi-específicos de la invención pueden unirse a dos sitios diferentes dentro del mismo dominio ya sea en una toxina A o toxina B, o pueden unirse al mismo dominio tanto en la toxi na A como toxina B.

En u na modalidad , la invención proporciona un anticuerpo monoclonal completamente humano o fragmento de unión a antigeno del mismo que se une al dominio de un ión de receptor carboxi terminal tanto de toxina A como toxina B de C. difficile, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo exhibe una o más de las siguientes características: (i) com prende una HCVR teniendo una secuencia de am inoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ I D NO: 1 8, 34 , 50, 66 y 82, o una secuencia substancialmente si milar de la m isma teniendo al menos 90% , al menos 95% , al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia ; (ii) com prende una LCVR ten iendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 26, 42, 58, 74 y 90, o una secuencia substancialmente sim ilar de la misma teniendo al menos 90% , al menos 95% , al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia ; (i ii) comprende u n dom inio de HCDR3 teniendo una secuencia de am i noácidos seleccionada del grupo q ue consiste de SEQ ID NO: 24, 40, 56, 72 y 88, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; y un dominio de LCDR3 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 32, 48, 64, 80 y 96, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; (iv) comprende un dominio de HCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 20, 36, 52, 68 y 84, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; un dominio de HCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 22, 38, 54, 70 y 86, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; un dominio de LCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 28, 44, 60, 76 y 92, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; y un dominio de LCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO. 30, 46, 62, 78 y 94, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; (v) se une a toxina A y toxina B con una KD igual a o menor que 10-9 M.

En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal completamente humano o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina A (pero no a toxina B) de C. difficile, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo exhibe una o más de las siguientes características: (i) comprende una HCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 2, 98, 114, 130, 146 y 162, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; (ii) comprende una LCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 10, 106, 122, 138, 154 y170, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; (iii) comprende un dominio de HCDR3 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 8, 104, 120, 136, 152 y 168, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; y un dominio de LCDR3 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 16, 112, 128, 144, 160 y 176, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; (iv) comprende un dominio de HCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 4, 100, 116, 132, 148 y 164, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; un dominio de HCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO. 6, 102, 118, 134, 150 y 166, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; un dominio de LCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 12, 108, 124, 140, 156 y 172, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; y un dominio de LCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEAQ ID NO: 14, 110, 126, 142, 158 y 174, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; (v) demuestra una KD igual a o menor que 109 M; (vi) demuestra neutralización de toxina A (a una concentración de 32pM) con una IC50 variando desde aproximadamente 7pM hasta aproximadamente 65pM en un ensayo de viabilidad celular.

En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal completamente humano o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina B (pero no a toxina A) de C. difficile, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo exhibe una o más de las siguientes características: (i) comprende una HCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ I D NO: 1 78, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338 y 354 o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; (ii) comprende una LCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ I D NO: 1 86, 202, 21 8, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346 y 362, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; (iii) comprende un dominio de HCDR3 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ I D NO: 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344 y 360, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; y un dominio de LCDR3 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352 y 368, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; (iv) comprende un dominio de HCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ I D NO>: 1 80, 196, 21 2, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340 y 356, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90%, al menos 95% , al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; un dominio de HCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 82, 1 98, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342 y 358, o una secuencia su bstancialmente similar de la m isma ten iendo al menos 90% , al menos 95% , al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; un dominio de LCDR 1 teniendo u na secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ I D NO: 1 88, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332 , 348 y 364, o una secuencia substancialmente similar de la m isma teniendo al menos 90% , al menos 95% , al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; y un dominio de LCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del gru po que consiste de SEQ I D NO: 1 90, 206, 222 , 238 , 254, 270, 286, 302 , 31 8, 334, 350 y 366, o una secuencia substancialmente similar de la misma teniendo al menos 90% , al menos 95% , al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia ; (v) dem uestra una KD igual a o menor que 1 0"9M ; (vi) demuestra la neutralización de toxina B (a una concentración de 0.03pM) con una IC50 variando desde aproximadamente 25pM hasta aproximadamente 320pM en un ensayo de viabi lidad celular.

Ciertos anticuerpos anti-toxina A o anti-toxina B de la presente invención son capaces de u nirse a y neutralizar la toxicidad de ya sea la toxina A, o toxina B, o ambaas, de C. difficile, como es determinado por ensayos in vitro o in vivo. La capacidad de los anticuerpos de la invención para u nirse a y neutralizar la actividad de las toxinas puede medirse usando cualq uier método estándar conocido para aquéllos expertos en la técnica, incluyendo ensayos de unión, o neutralización de ensayos de toxicidad (protección de muerte celular) , como se describe en la presente.

Ensayos in vitro ejemplares, no limitantes para medir la actividad de unión son ilustrados en los Ejemplos 4, 5, y 6, en la presente. En los Ejemplos 4 y 5, las afinidades de unión y constantes cinéticas de anticuerpos anti-toxina A o anti-toxina B humanos fueron determinadas mediante resonancia de plasmón de superficie y las mediciones fueron conducidas en un instrumento T200 Biacore. En el Ejemplo 6, los estudios de unión fueron conducidos usando cromatografía de exclusión por tamaño. En el Ejemplo 7, un bioensayo de neutralización fue desarrollado en células Vero para detectar la viabilidad celular después del tratamiento con toxina A o B y anticuerpos para ya sea toxina A o toxina B.

La presente invención también incluye anticuerpos anti-toxina A o B y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, los cuales se unen a al menos un fragmento biológicamente activo de cualquiera de las siguientes proteínas, o péptidos: SEQ ID NO: 378 (toxina A de longitud completa), números de residuos 1832-2710 de SEQ I D NO: 378 (dominio C-terminal de toxina A); SEQ ID NO: 380 (toxina B de longitud completa), residuos 1 834-2366 de SEQ I D NO: 380; SEQ ID NO: 375 (dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina A) ; o SEQ ID NO: 376. La presente invención también proporciona anticuerpos que interactúan con o se unen a un epitope dentro del dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina A producida por Clostridium difficile. O un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el epitope está contenido dentro de residuos que varían desde aproximadamente el residuo 468 hasta aproximadamente 863 de SEQ I D NO: 375. En una modalidad, el epitope para un anticuerpo que se une a toxina A es seleccionado del grupo que consiste de residuos 468-488 de SEQ ID NO: 375, los residuos 510-530 de SEQ I D NO: 375, residuos 602-610 de SEQ I D NO: 375, residuos 644-7093 de SEQ ID NO: 375, residuos 724-794 de SEQ ID NO: 375, residuos 799-814 de SEQ I D NO: 375 y residuos 858-863 de SEQ ID NO: 375. Cualquiera de los péptidos de toxina A o toxina B descritos en la presente, o fragmentos de los mismos, pueden ser usados para generar anticuerpos anti-toxina A o anti-toxina B.

Los péptidos pueden ser modificados para incluir adición o substitución de ciertos residuos para etiquetar o para fines de conjugación a moléculas portadoras, tales como, KLH. Por ejemplo, una cisteína puede ser adicionada a ya sea el extremo N terminal o C terminal de un péptido, o una secuencia enlazadora puede ser adicionada para preparar el péptido para conjugación a, por ejemplo, KLH para inmunización . Los anticuerpos específicos para toxina A o toxina B pueden no contener etiquetas o porciones adicionales, o pueden contener una etiqueta o porción N-terminal o C-terminal. En una modalidad, la etiqueta o porción es biotina. En un ensayo de unión, la ubicación de una etiqueta (si la hay) puede determinar la orientación del péptido en relación a la superficie sobe la cual el péptido está unido. Por ejemplo, si una superficie es recubierta con avidina, un péptido conteniendo una biotina N-terminal será orientado de manera que la porción C-terminal del péptido será distal a la superficie.

Mapeo de epitope y tecnologías relacionadas Varias técnicas conocidas para personas de habilidad ordinaria en la técnica pueden ser usadas para determinar si un anticuerpo "interactúa con uno o más aminoácidos" dentro de un polipéptido o proteína. Técnicas ejemplares incluyen, por ejemplo, un ensayo de bloqueo cruzado de rutina, tal como aquél descrito en Antibodies, Harlow y Lañe (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb. , NY) puede ser realizado. Otros métodos incluyen análisis de mutaciones de exploración de alanina, análisis de mancha de péptido (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), análisis de corte de péptido, estudios cristalográficos y análisis de NMR. Además, los métodos tales como excisión de epitope, extracción de epitope y modificación química de antígenos pueden ser empleados (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496). Otro método que puede ser usado para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con el cual un anticuerpo interactúa es intercambio de hidrógeno/deuterio detectado por espectrometría de masa. En términos generales, el método de intercambio de hidrógeno/deuterio involucra etiquetar con deuterio la proteína de interés, seguido por unir el anticuerpo a la proteína etiquetada con deuterio. A continuación, el complejo de proteína/anticuerpo es transferido a agua y protones intercambiables dentro de aminoácidos que son protegidos por el complejo de anticuerpo, experimentan retro-intercambio de deuterio-a-hidrógeno a una velocidad menor que los protones intercambiables dentro de aminoácidos que no son parte de la interfase. Como resultado, los aminoácidos que forman parte de la interfase de proteína/anticuerpo pueden retener deuterio y por lo tanto, exhibir masa relativamente mayor comparada con aminoácidos no incluidos en la interfase. Después de la disociación del anticuerpo, la proteína objetivo es sometida a corte de proteasa y análisis de espectrometría de masa, revelando por ello los residuos etiquetados con deuterio que corresponden a los aminoácidos específicos con los cuales interactúa el anticuerpo. Ver, por ejemplo, Ehring (1 999) Analytical Biochemistry 267(2) :252-259; Engen y Smith (2001 ) Anal. Che. 73:256A-265A.

El término "epitope" se refiere a un sitio sobre un antígeno al cual responden las células B y/o T. Los epitopes de células B pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como aminoácidos no contiguos juxtapuestos mediante doblado terciario de una proteína. Los epitopes formados a partir de aminoácidos contiguos son normalmente retenidos sobre exposición a solventes desnaturalizantes, mientras que los epitopes formados mediante doblado terciario son normalmente perdidos en el tratamiento con solventes desnaturalizantes. Un epitope normalmente incluye al menos 3, y más usualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única.

El perfilado asistido por modificación (MAP), también conocido como perfilado de anticuerpo basado en estructura de antígeno (ASAP) es un método que categoriza grandes cantidades de anticuerpos monoclonales (mAbs) dirigidos contra el mismo antígeno de acuerdo con las similitudes del perfil de unión de cada anticuerpo a superficies de antígeno química o enzimáticamente modificadas (US 2004/0101 920).

Cada categoría puede reflejar un epitope único ya sea distintamente diferente de o que se traslapa parcialmente con epitope representado por otra categoría. Esta tecnología permite un rápido filtrado de anticuerpos genéticamente idénticos, de manera que la caracterización puede ser enfocada sobre anticuerpos genéticamente distintos. Cuando se aplica a clasificación de hibridoma, MAP puede facilitar la identificación de clones de hibridoma raros que producen mAbs teniendo las características deseadas. MAP puede usarse para clasificar los anticuerpos de la invención en grupos de anticuerpos que se unen a diferentes epitopes.

En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-toxina A o anti-toxina B o fragmentos de unión a antígeno del mismo se une a un epitope dentro de cualquiera de las regiones ejemplificadas en la Figura 1 , o en SEQ ID NOS: 378, o 380, o al menos uno de los dominios de unión de receptor carboxi terminal de toxina A o toxina B, o a un fragmento del mismo, en donde el dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina A es mostrado en SEQ I D NO. 375, y en donde el dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina B es mostrado como SEQ ID NO: 376.

La presente invención incluye anticuerpos anti-toxina A o antitoxina B que se unen al mismo epitope que cualquiera de los anticuerpos ejemplares específicos descritos en la presente en la Tabla 1 . De igual manera, la presente invención también incluye anticuerpos anti-toxina A o anti-toxina B que compiten para unirse a toxina A o B o a un fragmento de toxina A o B con cualquiera de los anticuerpos ejemplares específicos descritos en la Tabla 1 .

Uno puede determinar fácilmente si un anticuerpos e une al mismo epitope como, o compite para unirse con, un anticuerpo anti-toxina A o anti-toxina B de referencia al usar métodos de rutina conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo e prueba se une al mismo epitope como un anticuerpo anti-toxina A o anti-toxina B de referencia de la invención, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una protelna o péptido de toxina A o B bajo condiciones de saturación. A continuación, la capacidad de un anticuerpo de prueba para unirse a la molécula de toxina A o B es valorada. Si el anticuerpo de prueba es capaz de unirse a la toxina A o B siguiendo la unión de saturación con el anticuerpo anti-toxina A o anti-toxina B de referencia, puede concluirse que el anticuerpo de prueba se une a un epitope diferente que el anticuerpo anti-toxina A o anti-toxina B de referencia. Por otra parte, si el anticuerpo de prueba no es capaz de unirse a la molécula de toxina A o B, siguiendo la unión de saturación con el anticuerpo anti-toxina A o anti-toxina B de referencia, entonces el anticuerpo de prueba puede unirse al mismo epitope que el epitope unido por el anticuerpo anti-toxina A o anti-toxina B de referencia de la invención.

Para determinar si un anticuerpo compite para unirse con un anticuerpo anti-toxina A o anti-toxina B de referencia, la metodología de unión antes descrita es realizada en dos orientaciones: En una primera orientación, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una molécula de toxina A o B bajo condiciones de saturación seguido por valoración de unión del anticuerpo de prueba a la molécula de toxina A o B. En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de prueba se una a una molécula de toxina A o B bajo condiciones de saturación seguido por valoración de unión del anticuerpo de referencia a la molécula de toxina A o B. Si , en ambas orientaciones, solo el primer anticuerpo (saturación) es capaz de unirse a la molécula de toxina A o B, entonces se concluye que el anticuerpo de prueba y el anticuerpo de referencia compiten por unión a toxina A o B. Como será apreciado por una persona de habilidad ordinaria en la técnica, un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia puede no necesariamente unirse al epitope idéntico como el anticuerpo de referencia, pero puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia al unir un epitope traslapante o adyacente. ' Dos anticuerpos se unen al mismo epitope o uno traslapante si cada uno inhibe (bloque) competitivamente la unión del otro al antígeno. Esto es, un exceso de 1 , 5, 10, 20 o 100 veces de un anticuerpo inhibe la unión del otro por al menos 50%, pero de preferencia 75%, 90% o incluso 99% como se mide en un ensayo de unión competitiva (ver, por ejemplo, Junghans et al. , Cáncer Res. 1 990 50: 1495-1592). De manera alternativa, dos anticuerpos tienen el mismo epitope si esencialmente todas las mutaciones de aminoácidos en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Dos anticuerpos tienen epitopes traslapantes si alguna de las mutaciones de aminoácidos que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo, reduce o elimina la unión del otro.

Puede realizarse entonces experimentación de rutina adicional (por ejemplo, anál isis de mutación y unión de péptido) para confirmar si la falta de un ión observada del anticuerpo de prueba es de hecho debida a la unión al m ismo epitope como el anticuerpo de referencia o si el bloque estérico (u otro fenómeno) es responsable de la falta de unión observada . Los experimentos de esta clase pueden ser realizados usando ELI SA, RIA, resona ncia de plasmón de superficie, citometría de flujo o cualqu ier otro ensayo de unión de anticuerpo cuantitativa o cualitativa d isponible en la técnica.

Inmunoconjugados La invención abarca un anticuerpo monoclonal anti-toxina A o antitoxina B humano conjugado con una porción terapéutica ("inmunoconjugado") , tal como un agente que es capaz de reducir la severidad o infección primaria con C. difficile, o para mejorar al menos un síntoma asociado con infección de C. difficile, incluyendo diarrea o col itis, o la severidad de la m isma . Tal agente puede ser un seg undo anticuerpo diferente a cualquiera o ambas toxina A o toxi na B de C. difficile, o u n toxoide, o una vacuna de C. difficile. El tipo de porción terapéutica que puede conjugarse al anticuerpo anti-toxi na A o antitoxina B y considerará la cond ición a ser tratada y el efecto terapéutico deseado a ser alcanzado. De manera alternativa, si el efecto terapéutico deseado es tratar las secuelas o síntomas asociados con infección de C. difficile, o cualquier otra condición resultante de tal infección , tal como, pero no l im itado a, colitis pseudomembranosa, puede ser ventajoso conjugar un agente apropiado para tratar las secuelas o síntomas de la condición, o aliviar cualquier efecto lateral de los anticuerpos de la invención. Ejemplos de agentes adecuados para formar inmunoconjugados son conocidos en la técnica, ver por ejemplo, WO 05/103081.

Anticuerpos multi-específicos Los anticuerpos de la presente invención puede ser mono-específico, bi-específico o multi-específico. Los anticuerpos multi-específicos pueden ser específicos para epitopes diferentes de un polipéptido objetivo o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido objetivo. Ver, por ejemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotoechnol. 22:238-244. Los anticuerpos de la presente invención pueden enlazarse a o co-expresarse con otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede estar enlazado funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más entidades moleculares diferentes, tal como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo para producir un anticuerpo bi-especifico o multi-específico con una segunda especificidad de unión. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos bi-específicos en donde un brazo de una inmunoglobulina es específica para toxina A de C. difficile, o un fragmento de la misma, y el otro brazo de la inmunoglobuina es específico para toxina B de C. difficile, o un segundo objetivo terapéutico, o es conjugado con una porción terapéutica. En ciertas modalidades de la invención, un brazo de una inmunoglobulina es específico para un epitope sobre el dominio C-terminal de toxina A o un fragmento de la misma, y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico para un epitope sobre el dominio C-terminal de toxina B, o un fragmento de la misma.

Un formato de anticuerpo bi-específico ejemplar que puede usarse en el contexto de la presente invención involucra el uso de un primer dominio CH3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio Ig CH3, en donde el primero y segundo dominios Ig CH3 difieren uno de otro por al menos un aminoácido, y en donde al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo bi-específico a Proteína A como se compara con un anticuerpo bi-específico que carece de la diferencia de aminoácidos. En una modalidad, el primer dominio Ig CH3 diferente se une a Proteína A y el segundo dominio Ig CH3 contiene una mutación que reduce o suprime la unión de Proteína A tal como una modificación H95R (por numeración de exones IMGT; H435R por numeración EU). El segundo CH3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo CH3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de anticuerpos de lgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, 392N y V422I por EU) en el caso de anticuerpos lgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E791 y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de anticuerpos de lgG4. Variaciones en el formato de anticuerpo bi-específico descrito antes son contempladas dentro del alcance de la presente invención.

Administración terapéutica y formulaciones La invención proporciona composiciones terapéuticas comprendiendo los anticuerpos anti-toxina A o anti-toxina B o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención. La administración de composiciones terapéuticas de acuerdo con la invención será administrada con portadores, excipientes y otros agentes adecuados que son incorporados en las formulaciones para proporcionar transferencia, entrega, tolerancia mejoradas y similares. Una multitud de formulaciones apropiadas pueden ser encontradas en los formularios conocidos para todos los químicas farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton , PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, jaleas, ceras, aceites, lípidos, vesículas conteniendo lípido (catiónico o aniónico) (tal como LI POFECTI NM R), conjugados de DNA, pastas de absorción anhidras, emulsiones aceite-en-agua y agua-en-aceite, emulsiones carbowax (polietilenglicoles de varios pesos moleculares), geles semi-sólidos y mezclas semisólidas conteniendo carbowax. Ver también Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1 998) J Pharm Sci Technol 52:238-31 1 .

La dosis de cada uno de los anticuerpos de la invención puede variar dependiendo de la edad y el tamaño de un sujeto a ser administrado, enfermedad objetivo , condiciones, ruta de ad ministración y similares. Cuando los anticuerpos de la presente invención son usados para tratar una infección de C. difficile en un paciente, o para tratar uno o más síntomas asociados con una infección de C. difficile, al como la diarrea o colitis asociada con una infección de C. difficile en un paciente, o para preven ir una recaída de la enfermedad , o para disminuir la severidad de la enfermedad , es ventajoso adm inistrar cada uno de los anticuerpos de la presente invención de manera intravenosa subcutánea normalmente en una dosis simple de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal, más preferiblemente aproximadamente 0. 1 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal , o aproximadamente 0. 1 a aproximadamente 1 5 mg/kg de peso corporal , o aproximadamente 0.02 a aproximadamente 7 mg/kg de peso corporal , o aproximadamente 0.03 a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal , o aproximadamente 0.05 a aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal , o aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal , o aproximadamente 3.0 mg/kg de peso corporal , o aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal , o aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal . Pueden adm inistrarse múlti ples dosis segú n sea necesario. Dependiendo de la severidad de la condición, la frecuencia y la duración del tratam iento pueden ser ajustadas. En ciertas modal idades, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención pueden ser administrados como una dosis inicial de al menos aproximadamente 0. 1 mg hasta aproximadamente 800 mg , aproximadamente 1 hasta aproximadamente 600 mg , aproximadamente 5 hasta aproximadamente 300 mg, o aproximadamente 10 hasta aproximadamente 150 mg, hasta aproximadamente 1 00 mg, o hasta aproximadamente 50 mg. En ciertas modalidades, la dosis inicial puede ser seguida por administración de una segunda o una pluralidad de dosis subsecuentes de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos en una cantidad que puede ser aproximadamente la misma o menor que aquélla de la dosis inicial, en donde las dosis subsecuentes son separadas por al menos 1 día a 3 días; al menos una semana, al menos 2 semanas; al menos 3 semanas; al menos 4 semanas; al menos 5 semanas; al menos 6 semanas; al menos 7 semanas; al menos 8 semanas; al menos 9 semanas; al menos 10 semanas; al menos 12 semanas; o al menos 14 semanas.

Varios sistemas de entrega son conocidos y pueden ser usados para administrar la composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (ver, por ejemplo, Wu et al. (1987) J. Biol. Chem . 262:4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero no están limitados a, rutas intradérmica, transdérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición puede ser administrada por cualquier ruta conveniente, por ejemplo, mediante infusión o inyección de bolo, mediante absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectar e intestinal, etc.) y pueden ser administrados junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local .

La composición farmacéutica también puede ser entregada en una vesícula, en particular un liposoma (ver, por ejemplo, Langer (1990) Science 249: 1527-1 533).

En ciertas situaciones, la composición farmacéutica puede ser entregada en un sistema de liberación controlada. En una modalidad, puede usarse una bomba. En otra modalidad, los materiales poliméricos pueden ser usados. Todavía en tora modalidad, un sistema de liberación controlada puede ser reemplazado en proximidad del objetivo de composición, requiriendo así solo una fracción de la dosis sistémica.

Las preparaciones inyectables pueden incluir formas de dosificación para inyecciones intravenosa, subcutánea, intracutánea e intramuscular, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse mediante métodos públicamente conocidos. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden ser preparadas, por ejemplo, al disolver, suspender o emulsificar el anticuerpo o su sal descrito antes en un medio acuoso estéril o un medio oleoso convencionalmente usado para inyecciones. Como el medio acuoso para inyecciones, hay, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica conteniendo glucosa y otros agentes auxiliares, etc. , los cuales pueden usarse en combinación con un agente solubilizante apropiado, tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un surfactante no iónico (por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como el medio oleoso, se emplean, por ejemplo, aceite de ajonjolí, aceite de soya, etc. , lo cual puede ser usado en combinación con un agente solubilizante, tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección así preparada es llenada preferiblemente en una ampolleta apropiada.

Una composición farmacéutica de la presente invención puede ser entregada de manera subcutánea o intravenosa con una aguja y jeringa estándares. Además, con respecto a entrega subcutánea, un dispositivo de entrega de pluma fácilmente tiene aplicaciones para entregar una composición farmacéutica de la presente invención . Tal dispositivo de entrega de pluma puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo de entrega de pluma reutilizable utiliza un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que la composición farmacéutica dentro del cartucho ha sido administrada y el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede ser desechado fácilmente y reemplazado con un nuevo cartucho que contenga la composición farmacéutica. El dispositivo de entrega de pluma puede ser entonces reutilizado. En un dispositivo de entrega de pluma desechable, no hay cartucho reemplazable. En su lugar, el dispositivo de entrega de pluma desechable viene prellenado con la composición farmacéutica sostenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito es vaciado de la composición farmacéutica, el dispositivo entero es desechado.

Numerosos dispositivos de entrega autoinyectores y de pluma reutilizables tienen aplicaciones en la entrega subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención. Ejemplos incluyen, pero ciertamente no están limitados a AUTOPENMR (Owen Mumford, Inc. , Woodstock, UK), pluma DISETRONIC R (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Suiza), pluma H UMALOG MIX 75/25M R, pluma HUMALOGM R, pluma HUMALI N 70/30M R (Eli Lilly and Co. , I ndianapolis, I N), NOVOPENMR I , I I y I I I (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIORM R (Novo Nordis. k, Copenhague, Dinamarca), pluma BDMR (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTI PENMR, OPTIPEN P R OMR OPTI PEN STARLETM R, y OPTICLKMR (sanofis-aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar solo algunos. Ejemplos de dispositivos de entrega de pluma desechables teniendo aplicaciones en la entrega subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, pero ciertamente no están limitados a la pluma SOLOSTARMR (Sanofi-aventis), FLEXPENMR (Novo Nordisk) y KWI KPENMR (Eli Lilly), SU RECLICKMR Autoinjector (Amgen, Thousands Oaks, CA), PENLETMR (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), EPI PEN (Dey, L. P.) y la pluma HUM I RAM R (Abbott Labs, Abbott Park, I L) por nombrar solo algunos.

Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para uso oral o parenteral descritas antes son preparadas en formas de dosificación en una dosis unitaria adecuad para ajustar una dosis de los ingredientes activos. Tales formas de dosificación en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, tabletas, pildoras, cápsulas, inyecciones (ampolletas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo antes mencionado contenida es generalmente aproximadamente 5 hasta aproximadamente 500 mg por forma de dosificación en una dosis unitaria, especialmente en la forma de inyección, se prefiere que el anticuerpo antes mencionado esté contenido en aproximadamente 5 hasta aproximadamente 100 mg y en aproximadamente 10 hasta aproximadamente 250 mg para las otras formas de dosificación.

Regímenes de administración De acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención, pueden administrarse a un sujeto múltiples dosis de un anticuerpo para toxina A y/o B de Clostridium difficile durante un tiempo definido. Los métodos de acuerdocon este aspecto de la invención comprenden admisnitrar secuencialmente a un sujeto múltiples dosis de un anticuerpo para toxina A y/o B. Como se usa en la presente, "adminisstrar secuencialmente" significa que cada dosis de anticuerpo a toxina A y/o B es administrada al sujeto en un punto en el tiempo diferente, por ejemplo, en diferentes días separados por un intervalo predeterminado (por ejemplo, horas, días, semanas o meses). La presente invención incluye métodos que comprenden administrar secuencialmente al paciente una dosis inicial simple de un anticuerpo para toxina A y/o B, seguido por una o más dosis secundarias del anticuerpo para toxina Ay/o B, y seguido opcionalmente por una o más dosis terciarias del anticuerpo para toxina A y/o B.

Los términos "dosis inicial", "dosis secundarias" y "dosis terciarias", se refieren a la secuencia temporal de administración del anticuerpo para toxina A y/o B. Así, la "dosis inicial" es la dosis que es administrada al inicio del régimen de tratamiento (también referido como la "dosis de línea de base"); las "dosis secundarias" son las dosis que son administradas después de la dosis inicial; y las "dosis terciarias" son las dosis que son administradas después de las dosis secundarias. Las dosis inicial, secundaria y terciaria pueden contener todas las mismas cantidades de anticuerpo para toxina A y/o B, pero generalmente pueden diferir unas de otras en términos de frecuencia de administración. Sin embargo, en ciertas modalidades, la cantidad de anticuerpo para toxina A y/o B contenidas en las dosis inicial, secundaria y/o terciara varían unas de otras (por ejemplo, ajustadas para arriba o abajo según sea apropiado) durante el curso de tratamiento. En ciertas modalidades, dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, o 5) dosis son administradas al inicio del régimen de tratamiento como "dosis de carga" seguidas por dosis subsecuentes que son administradas en una base menos frecuente (por ejemplo, "dosis de mantenimiento").

En una modalidad ejemplar de la presente invención, cada dosis secundaria y/o terciaria son administradas 1 a 26 (por ejemplo, 1 , 1 ½, 2, 2 ½, 3, 3 ½, 4, 4 ½, 5, 5 1/2, 6, 6 ½, 7, 7 ½, 8, 8 ½, 9, 9 ½, 10, 10 ½, 1 1 , 1 1 ½, 1 2, 12 ½, 13, 1 3 ½, 14, 14 ½, 1 5, 15 ½, 16, 16 ½, 17, 17 1/2, 1 8, 18 ½, 19, 19 ½, 20, 20 1/2, 21 , 21 ½, 22, 22 ½, 23, 23 ½, 24, 24 ½, 25, 25 ½, 26, 26 ½, o más) semanas después de la dosis justo precedente. La frase "la dosis justo precedente" , como se usa en la presente, significa, en una secuencia de múltiples administraciones, la dosis de anticuerpo para toxina A y/o B, la cual es administrada a un paciente antes de la administración de la dosis más cercana en la secuencia sin que intervenga otra dosis.

Los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención pueden comprender administrar a un paciente cualquier número de dosis secundarias y/o terciarias de un anticuerpo para toxina A y/o B. Por ejemplo, en ciertas modalidades, solo una dosis secundaria simple es administrada al paciente. En otras modalidades, dos o más dosis secundarias (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8) son administradas al paciente. De igual manera, en ciertas modalidades, solo una dosis terciaria simple es administrada al paciente. En otras modalidades, dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis terciarias son administradas al paciente.

En modalidades que involucran múltiples dosis secundarias, cada dosis secundaria puede ser administrada a la misma frecuencia que las otras dosis secundarias. Por ejemplo, cada dosis secundaria puede ser administrada al paciente 1 a 2 semanas después de la dosis justo precedente. De manera similar, en modalidades que involucran múltiples dosis terciarias, cada dosis terciaria puede ser administrada a la misma frecuencia que las otras dosis terciarias. Por ejemplo, cada dosis terciaria puede ser administrada al paciente 2 a 4 semanas después de la dosis justo precedente. De manera alternativa, la frecuencia en la cual las dosis secundarias y/o terciarias son administradas a un paciente, puede variar durante el curso del régimen de tratamiento. La frecuencia de administración también puede ser ajustada durante el curso de tratam iento por un médico dependiendo de las necesidades del paciente individual siguiendo la examinación clínica.

Usos terapéuticos de los anticuerpos Debido a su interacción con toxina A y/o toxina B de C. difficile, los presentes anticuerpos son útiles para tratar la enfermedad o condición de C. difficile, o al menos un síntoma asociado con la enfermedad o condición , tal como diarrea o colitis , o para prevenir una recaída de la enfermedad , o para dism in u ir la severidad , duración y/o frecuencia de recurrencias de la enfermedad . Los anticuerpos de la invención también son contem plados para uso profiláctico en pacientes en riesgo de desarrollar o adq uirir una infección de C. difficile. Estos pacientes incluyen las personas mayores (por ejemplo, cualquiera de 63 años de edad o mayor) , o pacientes ¡n munocom prometidos debido a la enfermedad o tratamiento con terapéuticos inm unosupresores, o pacientes quienes pueden tener una condición médica subyacente que los pred ispone a una infección de C. difficile (por ejemplo , cáncer, enfermedad inflamatoria del i ntestino, pacientes de pre-trasplante de hígado con acum ulación de ascitis) , o pacientes que son hospitalizados durante largos periodos (por ejemplo, en algunos casos este periodo puede variar desde tan poco como dos o tres d ías, pero en general pueden ser desde una semana , hasta dos semanas o más) , haciéndolos propensos a adqu irir infecciones nosocomiales, o pacientes en tratamiento de largo plazo (= 1 4 días) con antibióticos de amplio espectro (en algunos casos, pacientes que pueden adquirir la infección dentro de 24 horas si el intestino es desregulado, pero en otros caos esto puede tomar mucho más, por ejem plo, u na semana o más) , o pacientes en terapia con i nhibidores de bomba de protones para tratamiento de desórdenes gastrointestinales. Se contempla que los anticuerpos de la invención pueden ser usados solos, o en conjunción con un segundo agente, o tercer agente para tratar la infección de C. difficile, o para aliviar al menos un síntoma o complicación asociada con la infección de C. difficile, tal como la diarrea o colitis asociada con, o que resulta de tal infección. Los segundo o tercer agentes pueden ser entregados concurrentemente con los anticuerpos de la invención, o pueden ser administrados por separado, ya sea antes o después de los anticuerpos de la invención.

Todavía en una modalidad adicional de la invención, los presentes anticuerpos son usados para la preparación de una composición farmacéutica para tratar pacientes que sufren de una infección de C. difficile, incluyendo esas infecciones provocadas por una cepa hipervirulenta clínicamente relevante de Clostridium difficile, o la diarrea y colitis asociada con una infección de C. difficile. Todavía en otra modalidad de la invención, los presentes anticuerpos son usados para la preparación de una composición farmacéutica para reducir la severidad de una infección primaria con C. difficile, o para reducir la severidad, duración de, y/o número de recurrencias con C. difficile. En una modalidad adicional de la invención, los presentes anticuerpos son usados como terapia auxiliar con cualquier otro agente útil para tratar infecciones de C. difficile, incluyendo probióticos, antibióticos, toxoides, vacunas o cualquier otra terapia paliativa conocida para aquéllos expertos en la técnica.

Terapias de com bi nación Los métodos de la presente invención , de acuerdo con ciertas modal idades, comprenden adm in istrar al sujeto uno o más agentes terapéuticos adicionales en combinación con u n anticuerpo para toxina A y/o toxina B de Clostridium difficile. Como se usa en la presente, la expresión "en combinación con" significa que los agentes terapéuticos adicionales son ad m inistrados antes, después , o concurrente con la composición farmacéutica comprendiendo los anticuerpos anti-toxina A y/o B. El térm ino "en combinación con" también incluye la administración secuencial o concomitante de los anticuerpos anti-toxina A y/o B y un segu ndo agente terapéutico.

Por ejem plo, cuando se admi nistra "antes" la composición farmacéutica comprend iendo los anticuerpos anti-toxina A y/o B, el agente terapéutico adiciona l puede ser admi nistrado aproximadamente 72 horas, aproximadamente 60 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 1 2 horas, aproximadamente 1 0 horas, aproximadamente 8 horas , aproxi madamente 6 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 1 hora , aproximadamente 30 m inutos, aproximadamente 1 5 minutos o aproximadamente 1 0 minutos antes de la adm inistración de la composición farmacéutica comprendiendo los anticuerpos anti-toxina A y/o B. Cuando se admi n istra "después" la com posición farmacéutica com prendiendo los anticuerpos anti-toxina A y/o B, el agente terapéutico adicional puede ser administrado aproximadamente 1 0 m inutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 1 0 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 60 horas o aproximadamente 72 horas después de la administración de la composición farmacéutica comprendiendo los anticuerpos anti-toxina A y/o B. La administración "concurrente" o con la composición farmacéutica comprendiendo los anticuerpos anti-toxina A y/o B, significa que el agente terapéutico adicional es administrado al sujeto en una forma de dosificación separada dentro de menos de 5 minutos (antes, después o al mismo tiempo) de administración de la composición farmacéutica comprendiendo los anticuerpos anti-toxina A y/o B, o administrada al sujeto como una formulación de dosificación combinada simple comprendiendo tanto el agente terapéutico adicional como los anticuerpos anti-toxina A y/o B.

Las terapias de combinación pueden incluir un anticuerpo antitoxina A o anti-toxina B de la invención y cualquier agente terapéutico adicional que pueda ser combinado ventajosamente con un anticuerpo de la invención, o con un fragmento biológicamente activo de un anticuerpo de la invención.

Por ejemplo, un segundo o tercer agente terapéutico puede ser empleado para ayudar a reducir la carga bacteriana en el intestino, tal como un antibiótico que es bacteriostático o bacteriocida con respecto a C. difficile. Antibióticos ejemplares incluyen vancom icina, metronidazol o fidaxom icina. Los anticuerpos también pueden ser usados en conjunción con otras terapias, tales como toxoides , vacunas específicas para C. difficile, o agentes probióticos, tal como Saccharomyces boulardii.

Usos diagnósticos de los anticuerpos Los anticuerpos anti-toxina A o anti-toxina B de la presente invención tam bién pueden ser usados para detectar y/o medir toxina A o B en una m uestra, por ejemplo, para fines diagnósticos . Se prevé que la confirmación de ya sea toxina A o toxina B a través del uso de cualquiera de uno o más de los anticuerpos de la invención . Ensayos diagnósticos ejemplares para toxina A o toxina B pueden com prender, por ejemplo, contactar una muestra , obtenida de un paciente, con un anticuerpo anti-toxina A o anti-toxi na B de la invención , en donde el anticuerpo anti-toxina A o anti-toxina B es etiquetado con una etiqueta o molécula reportadora detectable o usado como u n ligando de captura para aislar selectivamente proteína de toxina A o toxi na B de las muestras del paciente. De manera alternativa , un anticuerpo anti-toxina A o anti-toxina B si n etiq uetar puede ser usado en aplicaciones diagnósticas en combinación con un anticuerpo secundario, que es por sí mismo etiquetado de manera detectable. La etiqueta o molécula reportadora detectable puede ser un radioisótopo, tal como 3H , 14C, 32P, 35S o 1 2 l , una porción fluorescente o quimiolum iniscente , tal como isotiocianato de fluoresceí na , o rodamina ; o una enzima tal como fosfatasa alcalina , ß-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante o luciferasa. Ensayos ejemplares específicos que pueden ser usados para detectar o med ir toxina A o toxina B en una m uestra i ncluyen ensayo inmunosorbente enlazado a enzima (ELI SA), radioinmunoensayo (RIA) , y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).

Las muestras q ue pueden ser usadas en ensayos diagnósticos de C. difficile de acuerdo con la presente invención incluyen cualq uier muestra de fluido o tejido obtenible de un paciente, el cual contiene cantidades detectables de ya sea proteína de toxina A o toxina B de C. difficile, o fragmentos de las mismas , bajo condiciones normales o patológicas . En general , los niveles de toxina A o toxina B en una muestra particular obtenida de u n paciente saludable (por ejemplo, un paciente no afligido con una enfermedad o cond ición asociada con la presencia de C. difficile) será medida para establecer inicialmente una línea de base, o estándar, n ivel de toxina A o toxina B de C. difficile. Este nivel de línea de base de toxina A o toxina B puede compararse entonces contra los niveles de toxina A o toxina B medidos en las muestras obtenidas de los individuos que se sospecha que tienen una enfermedad o condición relacionada con C. difficile, o síntomas asociados con tal enfermedad o condición .

Ejemplos Los sigu ientes ejem plos son expuestos con el fin de proporcionar a aquéllos de habi lidad ordinaria en la técnica con una divu lgación y descripción completa de cómo hacer y usar los métodos y composiciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los i nventores consideran su invención . Se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a las cifras usadas (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc. ) pero algunos errores experimentales y desviaciones deberían ser considerados. A menos que se indique de otra manera, partes son partes en peso, peso molecular es peso molecular promed io, temperatura está en grados centígrados y presión está a o cerca de la atmosférica .

Ejemplo 1 . Generación de anticuerpos humanos para toxina A y/o toxina B de Clostridium difficile Un inmunogeno com prendiendo cualquiera de los siguientes puede ser usado para generar anticuerpos a toxina A y/o toxina B de c. difficile. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención son obtenidos de ratones inmun izados con un inm unogeno primario, tal como una toxina A inactivada , natural , de longitud completa (ver GenBank acceso número CAA63564 (SEQ I D NO. 378)) , y/o toxina B (Ver GenBank acceso n ú mero CAJ67492 (S EQ I D NO: 380)) de C. difficile, o con una forma recombinante pero inactivada de las toxinas, o fragmentos de toxinas, o un toxoide, seguido por inmunización con un inmunogeno secundario, o con un fragmento inmunogénicamente activo de la toxina natural . Los animales pueden ser inm unizados con ya sea toxina A inactivada sola o toxina B inactivada sola, o tanto con toxina A inactivada como toxina B inactivada , concurrentemente. Las toxinas pueden ser inactivadas antes de usarse como un inmunogeno usando los procedimientos estándares para preparar toxoides, incluyendo por tratamiento con formaldehído, glutaraldehído, peróxido o tratamiento con oxígeno (Relyveld, et al. Methods in Enzymology, 93:24, 1983, Woodrow y Levine, eds. New Generation Vaccines, Marcel Dekker, Inc., New York, 1990). Otro medio de inactivación es mediante el uso de UDP-dialdehído (Genth et al., (2000), Infect. Immun. 68(3): 1094-1101 ), el cual puede actuar para preservar la estructura natural de la toxina comparada con otros métodos de inactivación, intensificando por ello la probabilidad de provocar anticuerpos que sean más reactivos con la toxina natural. De manera alternativa, las toxinas mutantes de C. difficile, las cuales exhiben toxicidad reducida, pueden ser producidas usando técnicas recombinantes estádnares y usadas como inmunógenos (Ver, por ejemplo, US 5,085,862; 5,221,618; 5,244,657; 5,332,583; 5,358,868; y 5,433,945). Tales mutantes pueden contener supresiones o mutaciones puntuales en el sitio activo de la toxina.

En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención son obtenidos de ratones inmunizados con un inmunogeno primario, tal como un fragmento biológicamente activo y/o inmunogénico de toxina A o toxina B natural, o DNA que codifica el fragmento activo de la misma. En ciertas modalidades, el inmunogeno puede ser un péptido del extremo N terminal o C terminal de toxina A y/o toxina B, o un fragmento derivado del péptido N o C terminal de toxina A y/o toxina B. En ciertas modalidades de la invención, el inmunogeno es el dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina A que varía desde aproximadamente residuos de aminoácidos 1832-2710' de SEQ ID NO: 378. En ciertas modalidades de la invención, el inmunógeno es el dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina A que es mostrado en SEQ ID NO: 375. En ciertas modalidades de la invención, el inmunógeno es el dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina B que varía desde aproximadamente residuos de aminoácidos 1834-2366 de SEQ ID NO. 380. En ciertas modalidades de la invención, el inmunógeno es el dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina B que es mostrado en SEQ ID NO: 376.

De acuerdo con esto, en una modalidad, los anticuerpos de la invención son obtenidos a partir de ratones inmunizados con ya sea una toxina A de longitud completa inactivada (toxoide), o una toxina B de longitud completa inactivada (toxoide), o ambos toxoides. Adicionalmente, en una modalidad, los anticuerpos fueron obtenidos de ratones inmunizados con un polipéptido comprendiendo secuencias de aminoácidos del dominio de unión de receptor carboxi-terminal de toxina A de C. difficile, o con un polipéptido comprendiendo secuencias de aminoácidos del dominio de unión de receptor carboxi-terminal de toxina B de C. difficile, o ambos, concurrentemente.

En ciertas modalidades, los anticuerpos que se unen específicamente a toxina A o toxina B de C. difficile pueden prepararse usando fragmentos de las regiones antes notadas, o péptidos que se extienden más allá de las regiones designadas por aproximadamente 5 hasta aproximadamente 20 residuos de aminoácidos de cualquiera, o ambos, extremos N o C terminales de las regiones descritas en la presente. En ciertas modalidades, cualquier combinación de las regiones antes notadas o fragmentos de las mismas pueden usarse en la preparación de anticuerpos específicos de toxina A o toxina B. En ciertas modalidades, cualquiera de una o más de las regiones antes notadas de toxina A o toxina B, o fragmentos de las mismas pueden ser usadas para preparar anticuerpos monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos.

Las proteínas de longitud completa, o fragmentos carboxi-terminales de las mismas, que fueron usados como inmunógenos, como se nota antes, fueron administrados directamente, con un auxiliar para estimular la respuesta inmune, a un ratón VELOCI MMUNE® comprendiendo DNA que codifica regiones variables de cadena ligera kappa y pesada de inmunoglobulina humana. La respuesta inmune de anticuerpo fue monitoreada por un inmunoensayo específico de toxina A y/o toxina B de C. difficile. Cuando se alcanzó una respuesta inmune deseada, se recolectaron esplenocitos y se fusionaron con células de mieloma de ratón para conservar su viabilidad y formar líneas de células de hibridoma. Las líneas de células de hibridoma fueron clasificadas y seleccionadas para identificar líneas de células que producen anticuerpos específicos de toxina A y/o toxina B de C. difficile. Usando esta técnica, y los diversos inmunógenos descritos antes, se obtuvieron varios anticuerpos de toxina A y toxina B de C. difficile, así como quiméricos, reactivos cruzados (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes de ratón); ciertos anticuerpos ejemplares generados en esta manera fueron designados como H 1 H3067N , H 1 H31 34N , H 1 H31 17N, H 1 M3123N, H 1 M3121 H y H1M3124N.

Anticuerpos de anti-toxina A y toxina de C. difficile también fueron aislados directamente de células B antígeno-positivas sin fusión a células de mieloma, como se describe en U.S. 2007/0280945A1. Usando este método, varios anticuerpos anti-toxina A y toxina B de C. difficile completamente humanos (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes humanos) fueron obtenidos; anticuerpos ejemplares generados en esta manera fueron designados como sigue: H1H3328P, H1H3324P, H1H3325P, H1H3330P, H1H3350P, H1H3347P, H1H3335P, H1H3344P, H1H3339P, H1H3337P, H1H3343P, H1H3411P, H1H3354P, H1H3317P, H1H3355P, H1H3394P y H1H3401P.

Las propiedades biológicas de los anticuerpos ejemplares generados de acuerdo con los métodos de este Ejemplo son descritas en detalle en los Ejemplos expuestos a continuación.

Ejemplo 2. Secuencias de aminoácidos de región variable de cadena pesada y ligera La Tabla 1 expone los pares de secuencias de aminoácidos de región variable de cadena pesada y ligera de anticuerpos seleccionados específicos para toxina A y/o toxina B de C. difficile y sus identificadores de anticuerpos correspondientes. Los anticuerpos son normalmente referidos en la presente de acuerdo con la siguiente nomenclatura: prefijo Fe (por ejemplo, "H4H", "H1M", "H2M"), seguido por un identificador numérico (por ejemplo, "3117" como se muestra en la Tabla 1 ), seguido por un sufijo "P" o "N". Así, de acuerdo con esta nomenclatura, un anticuerpo puede ser referido como, por ejemplo "H1 H31 17" . Los prefijos H4H, H 1 y H2M sobre las designaciones de anticuerpos usadas en la presente indican la región Fe particular del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo "H2M" tiene una Fe de lgG2 de ratón, mientras que un anticuerpo "H4H" tiene una Fe de lgG4 humana. Como será apreciado por una persona de habilidad ordinaria en la técnica, un anticuerpo H 1 M o H2M puede convertirse a un anticuerpo H4H, y viceversa, pero en cualquier caso, los dominios variables (incluyendo las CDRs), las cuales son indicadas por los identificadores numéricos mostraos en la Tabla 1 , permanecerán iguales. Los anticuerpos que tienen la misma designación de anticuerpo numérica, pero que difieren por un sufijo de letra de N , B o P, se refieren a anticuerpos teniendo cadenas pesadas y ligeras con secuencias de CDR idénticas, pero con variaciones de secuencias en regiones que caen fuera de las secuencias de CDR (es decir, en las regiones de marco). Así, las variantes N, B y P de un anticuerpo particular tienen secuencias de CDR idénticas dentro de sus regiones variables de cadena pesada y ligera pero difieren unas de otras dentro de sus regiones de marco.

Comparadores de anticuerpos Los controles anti-toxina A y anti-toxina B fueron incluidos en los siguientes Ejemplos para fines comparativos. Los controles negativos igualados de isotipo también fueron usados en los Ejemplos. Un anticuerpo de control anti-toxina A es designado en la presente como Control I y es un anticuerpo anti-toxina A con secuencias de dominios variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo "3D8" como se expone en US7625559 y US2005/02871 50. Un anticuerpo anti-toxina B es designado en la presente como Control I I y es un anticuerpo anti- toxina B con secuencias de dominio variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo "124-1 52" como se expone en US7625559 y US2005/0287150. Otro anticuerpo anti-toxina A es designado en la presente como Control I I I y es un anticuerpo anti-toxina A con secuencias de dominio variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo "3358" como se expone en US2009/0087478.

Tabla 1 Ejemplo 3. Análisis de utilización de genes variables Para analizar la estructura de anticuerpos producidos, los ácidos nucleicos que codifican regiones variables de anticuerpos fueron clonados y secuenciados. A partir de la secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos predicha de los anticuerpos, el uso de genes fue identificado para cada Región Variable de Cadena Pesada HCVR) y Región variable de Cadena Ligera (LCVR). La Tabla 2 expone el uso de genes para anticuerpos seleccionados de acuerdo con la invención.

Tabla 2 Ejemplo 4. U nión de anticuerpo a Toxina A y/o Toxina B de C. difficile como es determ inada mediante resonancia de plasmón de superficie Las afinidades de unión y constantes cinéticas de anticuerpos anti-toxina A y/o B de Clostridium difficile fueron determinadas mediante resonancia de plasmón de superficie a 37°C (Tablas 3-5) . Las mediciones fueron conducidas en un i nstrumento T200 Biacore.

Los anticuerpos, expresados como Ge de lgG 1 humana (AbPI D prefijo H 1 H) o hibridoma (AbPI D prefijo HxM) , fueron capturados sobre una superficie de sensor anti-Fc humana o anti-Fc de ratón , respectivamente (formato de captura de Mab) . La toxina A o B de longitud com pleta soluble (Tech Lab) , variando desde 5 hasta 1 0 nM, fue inyectada sobre la superficie con anticuerpo capturado. La asociación de anticuerpo-antígeno fue monitoreada durante 150 segundos al tiempo que la disociación en amortiguador fue monitoreada d urante 480 segundos. El análisis cinético fue realizado para calcular KD y vida media de d isociación de complejo antígeno/anticuerpo usando programa de cómputo de evaluación Biacore T200 1 .0.

Como se ve en las Tablas 3-5, tres tipos de anticuerpos fueron aislados: anticuerpos que se unen tanto a toxina A y toxina B ("ligantes duales" , ver Tabla 3) , anticuerpos que se unen solo a toxina A (Tabla 4) , y anticuerpos que se unen solo a toxina B (Tabla 5). Varios anticuerpos fueron identificados que ligaron tanto toxina A como toxina B, incluyendo aquéllos designados como H2M3121N, H2M3123N, H2 3124N, H1H3067N y H1H3134N y así fueron clasificados como ligantes duales. Anticuerpos anti-toxina A aislados ligaron toxina en el rango sub- nanomolar (nM) similar al Mab comparador igualado de isotipo (control I, ver patente estadounidense US7625559 para secuencias comparadoras para clon 3D8 (Ab de toxina A) y clon 124-152 (Ab de toxina B)), mientras que solo unos cuantos ligantes anti-toxina B mostraron afinidades en el rango de Mab comparador igualado con isotipo de control II (clon 124-152) (~200-300pM). Las constantes de equilibrio de disociación de unión y vías medias disociativas fueron calculadas a partir de las constantes de velocidad cinética como: KD = kd / ka; T1/2 (min) = (ln2/kd)/60 Afinidades de Biacore de mAbs de unión dual anti-C. difficile a Tabla 5: Afinidades de Biacore de mAbs de Toxina B anti-C. difficile a 37°C NB = si n unión bajo las condiciones probadas Ejemplo 5. Determinación del domi nio de unión para anticuerpos antitoxina A y B de Clostridium difficile usando resonancia de plasmón de superficie Los estud ios fueron hechos para determinar si los anticuerpos anti-toxina A y/o B de Clostridium difficile, ligados al Domin io de Un ión de receptor C-termi nal (CBD, por sus sig las en inglés) de cada toxina. En estos estudios, se emplearon dos formatos Biacore experimentales. Las primeras superficies de anticuerpos anti-C. difficile, capturadas utilizadas en las cuales 1 00n M de CBD-toxi na A-Fc (SEQ I D NO: 375) o CBD-toxina B-Fc (SEQ I D NO: 376) se hicieron fluir y las respuestas (RU) se reg istraron . Los reactivos de CBD-toxina fueron formateados tanto en Fe de humano como ratón para permitir tanto análisis de anticuerpos formateados de Fe humana e h ibridoma . El segu ndo formato empleó superficies con antígeno capturado (CBD-Fc) en las cuales 500 nM de mAb anti-C. difficile se hicieron fluir. En este formato, los anticuerpos formatedos de Fe humana o hibridoma se hicieron fluir sobre antígenos capturados de Fe de ratón y humano, respectivamente. En ambos formatos, una respuesta que estuvo significativamente por arriba del respaldo (>50 RU) fue considerada que se un ía al CBD de toxina A o B (ver Tabla 6) . Tanto para anticuerpos anti-toxina A como anti-toxina B, epitopes que estuvieron dentro y fuera del CBD fueron obtenidos . Tanto el control I (anticuerpo 3D8 de US7625559 y US 2005/02871 50) como el control I I (anticuerpo 1 24- 1 52 de US7625559 y US 2005/02871 50) fueron mapeados al CBD de sus toxinas respectivas de acuerdo con los reportes previos (datos no mostrados, ver US 2005/02871 50 y US7625559).

Tabla 6: Determinación del dominio de unión para anticuerpos de C. difficile # Sin CBD indica que no hay unión a dominio de unión de receptor C- term de Toxina A o B.

Ejemplo 6. Determinación del dominio de unión para anticuerpos antitoxina A y B de Clostridium difficile usando cromatografía de exclusión por tamaño Como un método complementario para determinar si anticuerpos anti-toxina A y/o B de Clostridium difficile unidos al Dominio de Unión de receptor C-terminal (CBD), se utilizó cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Brevemente, la CBD de toxina A (SEQ ID NO: 375) o la CBD de toxina B (SEQ ID NO: 376), a -500 nM se mezcló con anticuerpo en exceso a proporciones molares especificadas (1:5 y 1:20, CBD:Mab) en solución salina amortiguada con fosfato conteniendo 5% de glicerol pH 7.4 (PBS/G) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora.

Cualquier precipitación visible después de 1 h se registró como +++ (fuerte), ++ (moderada), + (mínima) o - (no observada). Siguiendo la centrifugación (5 min @ 16,000 x g), la mezcla de anticuerpo y CBD fue sometida a análisis SEC usando una columna Superóse 6 (GE Healthcare) con PBS/G como la fase móvil. Los picos de proteína correspondientes a complejos más grandes que el anticuerpo o CBD solo fueron interpretados como que se unen al dominio C-terminal.

Los resultados demostraron que la unión de CBD corresponde bien con la predicha a partir del dominio de unión inferida de estudios de SPR (Biacore) y CBD (ver ejemplo 5). Una notable excepción fue H1H3134N, donde la unión a CBD-A no fue observada vía SEQ pero valores de KD indicaron propiedades de unión dual para el anticuerpo.

Tabla 7: Dominio de unión para anticuerpos de toxina A y B anti- Clostridium difficile NT = No probado. TBD = A realizarse Sin CBD indica no unión a dominio de unión de receptor C-Term de Toxina A o B.

Ejemplo 7. Determinación de la potencia de neutralización de anticuerpos anti-toxina A y/o toxina B de Clostridium difficile Para determinar la potencia de neutralización (IC50) de anticuerpos anti-C. difficile, in vitro, se condujo un ensayo de viabilidad celular. Brevemente, las células Vero (1 .25x103) cultivadas en medio MEM alfa, complementado con 10% FBS, fueron sembradas en microplacas de 96 cavidades y se incubaron durante 16-18 horas a 37°C, en 5% de CO2. Los anticuerpos de anti-toxina de C. difficile, a varias concentraciones (9-66nM) , fueron adicionadas a las células y se incubaron subsecuentemente con toxina A de C. difficile (32 o 25pM) o toxina B (0.03p o 0.01 pM) durante 48 h. Los controles que no contienen toxina (100% viabilidad) controles conteniendo toxina pero sin anticuerpo (1 00%de letalidad relativa) fueron utilizados. Todas las diluciones de anticuerpo fueron conducidas por triplicado. Siguiendo la incubación de 2 días, la viabilidad celular fue media al adicionar sal de tetrazolio (WST-1 ; Toche Biochemicals), esperando durante 4 h para permitir el desarrollo de color y entonces registrar la absorbancia a 450 nm. Los valores de absorbancia fueron analizados por una ecuación logística de cuatro parámetros sobre una curva de respuesta de 1 1 puntos (GraphPad Prism) .

Los resultados mostraron que diez anticuerpos exhibieron neutralización contra toxina A con valores de I C50 variando desde 7pM hasta 65pM a 25-32pM de toxina A constante (Tabla 8A). Es de notar, que H 1 H3330P demostró potencia de neutralización igual a aquélla del Control I I I (anticuerpo comparador igualado de isotipo, clon 3358 como se expone en US2009/0087478) y potencia de aproximadamente 20 veces más que el control I (ver US2005/0287150 para el clon 3D8). Varios anticuerpos neutralizantes de toxina B mostraron potencia significativamente mayor que el control I I (anticuerpo comparador igualado de isotipo, ver clon 1 24-1 52 de US2005/02871 50) con I C 50S variando desde 25-120pM a 0.03pM de toxina B constante (Tabla 8B). Los anticuerpos H1 M3067N y H 1 M3134N , aunque capaces de unirse tanto a toxina A como B mostraron solo actividad de neutralización contra toxina A. Aunque la razón para esto no es conocida aún, una posible explicación para este hallazgo puede ser que aunque los anticuerpos pueden ligarse a muchos sitios en las regiones repetitivas de la porción C terminal de la toxina, otras partes del mismo dominio de toxina todavía pueden ser capaces de interactuar con la membrana de mamífero, permitiendo así la entrada de la toxina en la célula.

Tabla 8A: Potencia de neutralización ( I C50) para mAbs seleccionados contra Toxina A NT: No probado Tabla 8B: Potencia de neutralización ( I C50) para mAbs seleccionados contra Toxina B concentración NT: No probado Ejemplo 8. Generación de un anticuerpo bi-específico Varios anticuerpos bi-específicos son generados para uso en la práctica de métodos de la invención. Por ejemplo, los anticuerpos específicos de toxina A o toxina B de C. difficile son generados en un formato bi-específico (un "bi-específico") en el cual las reg iones variables que se unen a distintos dominios de toxina A y/o B son enlazadas juntas para conferir dom inio dual y/o especificidad de toxina dual dentro de una molécula de unión simple. Los bi-específicos apropiadamente diseñados pueden mejorar la eficacia de neutralización de toxina g lobal a través de incrementar tanto especificidad como avidez de unión . Las regiones variables con especificidad para dom inios ind ividuales, como se mesura en la Figura 1 , (por ejem plo, segmentos del dominio N-term inal , el cual es el dominio enzimático glucosilante (designado como domin io "A") , o el dom inio de procesam iento autocatalítico (designado como dom inio "C"), o el dominio de transubicación (designado como dominio " D") , o el dominio de unión de receptor carboxi terminal (designado como dominio "B") o que puede unirse a diferentes regiones dentro de un domi nio, son emparejadas en un andam io estructural que permite que cada región se una simultáneamente a los epitopes separados, o a diferentes regiones dentro de un dom inio. En un ejemplo para un bi-específico, las reg iones variables de cadena pesada (VH) a partir de un ligante con especificidad para un domi nio son recombi nadas con regiones variables de cadena ligera (VL) a partir de una serie de ligantes con especificidad para un segundo domi nio para identificar compañeros de VL no cognados que pueden emparejarse con VH orig inal sin romper la especificidad original para esa VH . De esta manera , un segmento VL si mple (por ejemplo, VL 1 ) puede com binarse con dos dominios VH diferentes (por ejemplo, VH 1 y VH2) para generar un bi-específico comprend ido por dos "brazos" ligantes (VH 1 -VL 1 y VH2-VL 1 ) . El uso de un segmento de VL simple reduce la complejidad del sistema y por ello simplifica y aumenta la eficiencia en procesos de clonación, expresión y purificación usados para generar el bi-específico (Ver, por ejem plo, U SS N 1 3/022759 y U S201 0/0331 527) .

De manera alternativa, los anticuerpos que se unen tanto a toxina A y/o toxina B y un segundo objetivo, tal como, pero no lim itado a, por ejem plo, u n segundo anticuerpo anti-toxina A o anti-toxina B diferente, o un toxoide, o una vacuna, puede prepararse en un formato bi-específico usando técnicas descritas en la presente, u otras técnicas conocidas para aquel los expertos en la técnica. Regiones variables de anticuerpo que se unen a distintas reg iones de toxina A pueden enlazarse junto con regiones variables que se unen a sitios relevantes en , por ejemplo, toxina B, para conferir especificidad de antígeno dual dentro de una molécula ligante si mple. Bi-específicos apropiadamente diseñados de esta naturaleza sirven una función dual . Por ejem plo , en el caso de un anticuerpo bi-específico que une tanto toxina A como toxina B, u no puede ser capaz de neutralizar mejor tanto toxina A como toxina B concurrentemente, sin la necesidad de administración de una composición conteniendo dos anticuerpos separados. Las regiones variables con especificidad para toxina A, son combinadas con una región variable con especificidad para toxina B y son emparejadas en un andamio estructural que permite a cada región variable unirse a los antígenos separados .

Los ligantes bi-específicos son probados para unión y bloqueo funcional de los antígenos objetivo, por ejemplo, toxina A y toxina B, en cualquiera de los ensayos descritos antes para los anticuerpos. Por ejem plo, los métodos estándares para medir la unión de proteína soluble son usados para valorar la interacción biespecífica, tal como Biacore, ELISA, cromatografía de exclusión por tamaño, dispersión de luz láser multi-ángulos, calorimetría de exploración directa y otros métodos. La unión de anticuerpos bi-específicos tanto a toxina A como toxi na B es determinada a través del uso de un ensayo de unión a ELISA en la cual los péptidos sintéticos que representan las diferentes toxinas son recubiertas sobre las cavidades de placas de microtítu lo y la unión de un bi-específico es determ inada a través del uso de un anticuerpo de detección secundario. Los experimentos de unión también pueden ser conducidos usando experimentos de resonancia de plasmón de superficie, en los cuales la interacción de unión de tiem po real de péptido a anticuerpo es med ida al hacer fluir un péptido o bi-específico a través de una su perficie sensorial en la cual el bi-específico o péptido, respectivamente, es capturado . El bloque in vitro funcional tanto de toxina A como toxina B por u n bi-específico es determinado usando cualquier bioensayo tal como el ensayo de neutralización descrito en la presente, o mediante estudios de protección in vivo en modelos animales apropiados , tales como aquél los descritos en la presente.

Ejemplo 9. Evaluación de eficacia in vivo de anticuerpos anti-toxina A y/o anti-toxina B contra infección de C. difficile (CDI ) en modelo de recaída de hámster (A) y en modelo de hámster agudo (B) La eficacia de anticuerpos específica para toxina A y/o toxina B de C. difficile, contra infección de C. difficile, fue evaluada en hámster en dos modelos diferentes descritos a continuación. Los hámsters, en la presencia de clindamicina, son sensibles a infección de C. difficile, y usualmente mueren dentro de 2-4 días después de la infección.

(A) Modelo de recaída: Hámsters dorados sirios machos fueron administrados con una suspensión oral conteniendo una mezcla de esporas de C. difficile, y células vegetativas (106 en total) en el día -1. Veinticuatro horas después de la infección (día 0), los animales recibieron una inyección subcutánea simple de clindamicina (10 mg/kg). En los días 1-3, los hámsters fueron administrados con vancomicina oral (10 mg/kg) una vez al día para mejorar la infección. El antibiótico vancomicina es usado clínicamente para tratar una infección de C. difficile. Después de la última dosis de vancomicina, los anticuerpos fueron administrados subcutáneamente q.d. durante 4 días (días 3-6), o día 1 (día 3) de acuerdo con su grupo de tratamiento y dosificación (ver Tablas 9A y 9B más adelante).

Se condujeron dos diferentes ensayos (Ver Figuras 2 y 3) que usan el modelo de recaída como un substituto para eficacia clínica. Ambos ensayos compararon dos combinaciones de anticuerpo: 1. Anticuerpos designados H1H3330P y H1H3347P 2. Anticuerpos anti-toxina A comparador (Control I; ver patente estadounidense 7625559 para la secuencia de clon 3D8) y anti-toxina B comparador (Control II; ver patente estadounidense 7625559 para secuencia 124-152 de clon) En el Ensayo 1 , cuatro dos s de anticuerpo fueron administradas a 5 mg/kg de cada anticuerpo (una dosis de 10 mg/kg total). En el Ensayo 2, una dosis de anticuerpo fue administrada ya sea a 5 mg/kg o 2 mg/kg de cada anticuerpo (un total de ya sea 1 0 mg/kg o 4 mg/kg).

Tabla 9A: Diseño de ensayo 1 : modelo de recaída: Tratamientos de combinación con H 1 H3330P + H 1 H3347P o comparador anti-Toxina A + comparador anti-Toxina B *Todos los animales recibieron vancomicina como se nota antes.

Tabla 9B: Diseño de ensayo 2: Modelo de recaída: Tratamientos de combinación con H 1 H3330P + H 1 H3347P o comparador anti-Toxina A + comparador anti-Toxina B Grupo Tratamiento* Dosis (mg(kg x # dosis) Anticuerpo de control negativo 10 x 1 14 (irrelevante) Todos los animales recibieron vancomicina como se nota antes.

Los animales fueron observados dos veces al día por la duración del experimento. Observaciones generales incluyeron signos de mortalidad y morbidez, la presencia de diarrea ("cola húmeda") y apariencia general (actividad, respuesta general a manejo, tacto, piel rizada). Los animales que se juzgaron en un estado moribundo fueron sometidos a eutanasia. Los criterios usados para asignar un estado moribundo fueron periodos prolongados (5 días) de pérdida de peso, progresión a un estado demacrado, letargía prolongada (más de 3 días), signos de parálisis, erosiones o trauma en la piel, postura encorvada y un abdomen distendido. Las observaciones continuaron, con muertes o eutanasia registradas durante un periodo de 18 días post-infección para el modelo de recaída.

(B) Modelo agudo: Hámsters dorados sirios machos fueron tratados con clindamicina intraperitonealmente a una dosis de 10 mg/kg en el día -1 . En el día 0, las esporas de C. difficile, fueron diluidas con PBS estéril para dar 100 esporas/300 µ? y se administraron mediante sonda oral. Los anticuerpos fueron administrados cada día durante 4 días, comenzando en el día -3 y continuando al día 0, usando una ruta subcutánea. La dosis de los anticuerpos es indicada en la leyenda de la figura. Ver también la Tabla 9C a continuación para el esquema de estudio.

Tabla 9C: Ensayo 3: modelo agudo: tratamientos de combinación con H 1 H3330P + H 1 H3347P a varias dosis Los animales fueron observados dos veces al día por la duración del experimento. Observaciones generales incluyeron signos de mortalidad y morbidez, la presencia de diarrea ("cola húmeda") y apariencia general (actividad, respuesta general a manejo, tacto, piel rizada). Los animales que se juzgaron en un estado moribundo fueron sometidos a eutanasia. Los criterios usados para asignar un estado moribundo fueron periodos prolongados (5 días) de pérdida de peso, progresión a un estado demacrado, letargía prolongada (más de 3 días), signos de parálisis, erosiones o trauma de piel, postura encorvada y un abdomen distendido. Las observaciones continuaron, con las muertes o eutanasia registradas durante un periodo de 10 días para el modelo agudo.

Resultados Se hizo el análisis estadístico de los datos para modelos de hámster usando la prueba de Log-Rank (mantel Cox). Para comparaciones en forma de pares, se aplicó la corrección de Bonferroni al valor P crítico.

En el primer ensayo, el cual fue un estudio de múltiples dosis usando un modelo de recaída de hámster, (ver la Figura 2), el tratamiento de combinación con H 1 H3330P más H 1 H3347P, o tratamiento de combinación con los anticuerpos comparadores, mostraron un aumento en la supervivencia global vs control de isotipo, o vancomicina sola, (74-78%; combinación de anticuerpos anti-toxina A y anti-toxina B vs 27-43%; brazos de control). Específicamente, por día 19, 27% de los hámsters que recibieron solo PBS sobrevivieron; 43% que recibieron el control de isotipo sobrevivieron; 74% que recibieron la combinación de anticuerpos comparadores anti-toxina A más anti-toxina B sobrevivieron; y 78% que recibieron la combinación H 1 H3330P (anticuerpo anti-A) más H 1 H3347P (anticuerpo anti-B) sobrevivieron.

En el segundo ensayo, el cual fue un estudio de dosis simple usando un modelo de recaída de hámster (ver Figura 3), el tratamiento de combinación con ya sea H 1 H3330P más H 1 H3347P, o los anticuerpos comparadores, aumentaron la supervivencia como se compara con el control de isotipo (anticuerpo de control negativo), aunque no hubo discriminación entre las dosis de 2 mg/kg y 5 mg/kg.

En un primer estudio de modelo agudo en hámster (Ver Figura 4), el tratamiento con la combinación H 1 H3330P más H 1 H3347P mostró protección significativa de los hámsteres de muerte en una manera titulable comparada con los controles negativos (p<0.0001 para todos los grupos vis controles de isotipo). Las dosis tituladas de 50 mg/kg a 1 .85 mg/kg (de cada anticuerpo dado como una combinación) , con la dosis alta proporcionando protección para todos los animales hasta el día 7 comparado con el día 1 para la dosis más baja.

En estudios adicionales usando el modelo de hámster agudo (ver Figura 5), el tratamiento de combinación con ya sea H 1 H3330P más H 1 H3347P, o una combinación de los anticuerpos comparadores, aumentaron significativamente la supervivencia como se compara con el control de isotipo (Figura 5; control de isotipo a 40 mg/kg vs Control I/Control I I a 20 mg/kg cada uno, p<0.0001 ; control de isotipo a 40 mg/kg vs Control I/Control II a 5 mg/kg cada uno, p=0.0003¡ control de isotipo a 40 mg/kg vs H 1 H3330P/H 1 H3347P a 20 mg/kg cada uno, p<0.0001 ; control de isotipo a 40 mg/kg vs H 1 H3330P/H 1 H3347P a 5 mg/kg cada uno, p<0.0001 ). Sin embargo, el tratamiento con una combinación de H 1 H3330P más H 1 H3347P protegieron los hámsteres de la muerte en una manera superior a controles de anticuerpos comparadores cuando se prueban a la dos s baja de 5 mg/kg de cada anticuerpo (p<0.0001 ), mientras que no hubo diferencia significativa entre la combinación de H 1 H3330P más H 1 H3347P vs la combinación de los anticuerpos comparadores a la dos s más alta de 20 mg/kg de cada anticuerpo (p=0.73). Este resultado demuestra claramente la superioridad a una dosis baja en el modelo de hámster agudo y sugiere que dosis de los anticuerpos H 1 H3330P más H 1 H3347P podrían ser efectivas en la clínica a menores concentraciones comparadas con los anticuerpos comparadores.

Ejemplo 10. El efecto de anticuerpos anti-toxina A y anti-toxina B sobre el bloqueo de la citoxicidad inducida por sobrenadante de cultivo de varias cepas de C. difficile hipervirulentas de grupo Bl: comparación con mAbs comparadores Los pacientes infectados con cepas BI/NAP1/027 clínicamente hipervirulentas tienen menores tasas de cura que pacientes infectados con cepas no Bl cuando se tratan con ya sea fidaxomicina o vancomicina (Petrella, LA, et al. (2012), Clinical Infectious Diseases, 55(3): 351-357). Adicionalmente, las cepas BI/NAP1/027 son asociadas con una tasa de recurrencia de CDI mayor y mayor tasa de mortalidad esperada cuando se compara con cepas prototípicas (Loo, VG, et al. (2005), N Engl J Med, 353:23; Petrella, LA et al. (2012), Clinical Infectious Diseases, 55(3): 351-357. Estas cepas hipervirulentas son caracterizadas por un aumento en la producción de toxina A y B, la presencia de toxina binaria y resistencia incrementada a fluoroquinolinas. El aumento en la producción de toxina A y B es muy probablemente probada por una mutación de pérdida de función en fcfcC, un regulador negativo putativo de expresión tcdA y tcdB, que resultan en la producción de toxina sostenida a lo largo del ciclo de vida.

La capacidad de una mezcla de proporción molar 1:1 de H1H330P y H1H3347P para neutralizar la toxina de cuatro cepas BI/NAP1/027 DE C. difficile clínicamente aisladas, fue probada en un ensayo de neutralización basado en células. Las cepas hipervirulentas clínicamente aisladas de VA5 y VA17 fueron obtenidas de Case Western Reserve University, Cleveland, OH. Las cepas hipervirulentas clínicamente aisladas 6336 y 6443 fueron obtenidas del Dept. of Veterans Affairs, Edward Hiñes, Jr. Hospital, Hiñes, IL. Los ensayos de neutralización utilizaron células Vero, una línea de células epiteliales de riñon de mono, debido a su susceptibilidad a ambas toxinas de C. difficile. Las células fueron incubadas con cantidades variantes de coctel de anticuerpo y una cantidad fija de sobrenadante de cultivo aisladas de varias cepas de C. difficile durante 48 horas. La citoxicidad fue determinada mediante la adición de reactivo WST-1 , un indicador redox que produce un cambio colorimétrico cuando se redujo; actividad metabólica durante el crecimiento celular reduce WST1 -1 , que resulta en absorbancia incrementada a 450 nm.

El sobrenadante de cultivo de varias cepas Bl clínicamente aisladas exhibió un amplio rango de actividad citotóxica en células Vero, con valores de EC5o para inducir citotoxicidad celular que varía desde una dilución de 3700 veces para la cepa VA5 a dilución de 88200 veces para la cepa 6443. Una mezcla de proporción molar 1 : 1 de H1 H3330P y H 1 H3347P bloqueó la citotoxicidad inducida por sobrenadantes de cultivo de todas las cepas de grupo Bl probadas con una potencia de neutralización de más de 34 veces mejor comparada con una mezcla de proporción molar 1 : 1 de anti-toxina A comparadora (control I; ver patente estadounidense 7625559 para secuencia de clon 3D8) y anti-toxina B comparadora (control II ; ver patente estadounidense 7625559 para secuencia de clon 124-1 52). Estos datos demuestran que el par de anticuerpo H 1 H3330P/H 1 H3347P fue capaz de neutralizar la citotoxicidad de cultivo con valores de I C50 en el rango picomolar (31 -45pM) para cepas Bl hipervirulentas probadas, comparadas con el coctel de mAb comparador (rango de I C50 : 1200-1 700pM; ver Tabla 10).

Tabla 1 0 Ejemplo 1 1. Mapeo de epitope del anticuerpo anti-toxina A H 1 H3330P El epitope del Dominio de Unión de receptor C-terminal (CBD) de toxina A (SEQ I D:375) unido por H 1 H3330P fue determinado usando proteómicos basados en espectrometría de masa. Brevemente, el CBD de toxina A fue sometido a digestión con tripsina durante un periodo de 12 horas y las muestras se corrieron en SDS-PAGE de gradiente de 10- 14%, seguido por transferencia a membranas de nitrocelulosa y análisis Western blot usando ya sea el anticuerpo H 1 H3330P, o el anticuerpo de control I (Ver patente estadounidense 7625559 para secuencia de anticuerpos 3D8) como anticuerpos primarios. Análisis adicional de las secuencias de péptido que se unen al anticuerpo H 1 H3330P se hizo usando electroforesis 2D seguido por análisis MALDI-TOF MS. Los procedimientos son descritos con mayor detalle a continuación.

Digestión de tripsina limitada de toxina A El dominio de unión de receptor C-terminal recombinante (CBD) de toxina A (0.4 g/µ I en PBS) se adicionó con tripsina modificada grado secuencia (Promega, Cat # V51 1 C) a una proporción de masa 1 :80 y se incubó a 37°C durante 0-12 h. La enzima fue inactivada al adicionar 2 volúmenes de amortiguador de muestra Laemmli 1 X y se calentó a 95°C durante 5 min. Las muestras fueron almacenadas a -20°C hasta análisis.

Análisis Wester blot El grado de la proteólisis fue examinada primero mediante SDS- PAGE de gradiente de 10-14%. La cantidad de cada muestra cargada fue equivalente a 1 g de CBD inicial de Toxina A, y las proteínas separadas en el gel fueron visualizadas con tinción de coomassie SimplyBlue (I nvitrogen, Cat# LC6065).

Las muestras digeridas durante 0 y 12 horas fueron seleccionadas entonces para separación de SDS-PAGE de gradiente de 10-14% con un equivalente a 50 ng de CBD inicial de toxina A cargada para cada muestra. Las proteínas separadas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa, y se probaron con anticuerpo primario H 1 H3330P o Anticuerpo de control I a una concentración de 1 g/ml en TBST (solución salina de amortiguador Tris conteniendo 0.05% Tween-20) durante la noche a 4°C, seguido por anticuerpo secundario conjugado de IgG HRP anti-humano (Pierce.Cat # 3141 2; a dilución de 1 : 15,000 en TBST). Ambos anticuerpos H 1 H330P y Control 1 tuvieron un dominio constante de lgG 1 humana. La membrana fue incubada con substrato e quimioluminiscencia (Perkin Elmer, Cat # NEL103E001 EA) y la imagen fue capturada sobre película de rayos X.

Electroforesis de gel 2D Para determinar cuáles aminoácidos fueron representados en la banda de proteína única para Western blots realizados usando el anticuerpo H 1 H3330P, se realizó un gel bidimensional (2D) usando la digestión de tripsina de 12 horas del CBD de toxina A.

Digestión de tripsina en-gel y mapeo de péptido por MALDI-TOF MS El análisis de gel 2D reveló 4 manchas de proteína, agrupadas estrechamente en la dimensión de pH (valores de pl ~ 9), que compuso la banda de 50kDa que se visualizó mediante Western blot usando H 1 H3330P. Las 4 manchas de proteína con pesos moleculares correspondientes de -50 kDa del gel 2D usando la digestión de tripsina de 12 horas fueron cortadas, desteñidas por 50% de acetonitrilo, reducidas por 65 mM DTT y alquiladas por 1 35 mM yodoacetamida. Después de la deshidratación por acetonitirlo, 20 ul de 2.5 ng/µ? de tripsina grado secuencia (Promega, Cat # V51 1 1 ) se adicionaron para cubrir las bandas de gel y la digestión en-gel se realizó mediante incubación durante la noche a 37°C.

Los péptidos resultantes fueron desalados por Ziptip C18 (Millipore, Cat # ZTC18S096) y se analizaron mediante Bruker UltrafleXtreme MALDI-TOF-TOF MS. El espectro fue procesado mediante programa de cómputo FlexAnalysis y se calibró internamente con picos de fragmento de tripsina autolítica. Las listas de picos calibrados fueron buscadas contra una base de datos de casa conteniendo la secuencia de la toxina A de CBD a una precisión de masa de 10 ppm.

Resultados Los resultados mostraron que el manchado con H 1 H3330P reveló una banda de proteína mayor a alrededor de 50 kDa a 1 2 horas post digestión de tripsina, mientras que ninguna banda de proteína teniendo un peso molecular de alrededor de 50kDa fue observada cuando el manchado fue realizado con el anticuerpo de control 1 a 1 2 horas post digestión de tripsina .

Para determinar cuáles aminoácidos fueron representados en la banda de proteína 50kDa, únicas para Western blots realizadas usando H 1 H3330P, un gel bidimensional (2D) fue realizado usando la digestión de tripsina de 12 horas, como se describe antes. Como se nota, el análisis de gel 2D reveló 4 manchas de proteínas, agrupadas estrechamente en la dimensión de pH (valores de pl ~ 9), que compuso la banda de 50kDa visualizada mediante Western blot usando H1 H3330P. El análisis de espectrometría de masa de estas 4 manchas de proteína identificaron 1 7 péptidos de igualación que cubren los residuos 468-863 del CBD de toxina A (SEQ ID: 375). Este fragmento de toxina A (aminoácidos que abarcan los residuos 468 a 863) tiene un peso molecular predicho de 45 kDa y un punto isoeléctrico predicho de 9.01 que corresponde bien a los valores obtenidos del análisis de gel 2- D.

Este ejemplo ilustra que el anticuerpo anti-toxina A H 1 H3330P tiene un epitope único de aquél de Control 1 (3D8 en US 7625559) y une el CBD de toxina A dentro de aminoácidos 468 a 863. Las secuencias de aminoácidos particulares fueron identificadas dentro de esta región la cual interactuo con el anticuerpo H 1 H3330P y estas secuencias de aminoácidos fueron residuos 468-488 de SEQ I D NO: 375, los residuos 51 0-530 de SEQ ID NO: 375, residuos 602-61 0 de SEQ I D NO: 375, residuos 644-703 de SEQ I D NO: 724-794 de SEQ I D NO: 375, residuos 799-814 de SEQ I D NO: 375 y residuos 858-863 de SEQ I D NO: 375.

Claims

REIVI NDICACIONES

1 . Un anticuerpo aislado que se une específicamente a toxina A o a toxina B de Clostridium difficile, o que se une a, o reacciona cruzado con, tanto toxina A como B, en donde: a) el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina A de Clostridium difficile comprende las tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (HCDR1 , HCDR2 y HCDR3) contenidas dentro de una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada (HCVR) seleccionada de SEQ I D NOs: 2, 98, 1 14, 1 30, 146 y 162; y las tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (LCDR1 , LCDR2 y LCDR3) contenidas dentro de una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera (LCVR) seleccionadas de SEQ ID NOs: 1 0, 1 06, 122, 138, 1 54 y 170; b) el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina B de Clostridium difficile comprende las HCDR1 , HCDR2 y HCDR3 contenidas dentro de una secuencia de aminoácidos de HCVR seleccionada de SEQ ID NOs: 1 78, 1 94, 21 0, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338 y 354; y las LCDR1 , LCDR2 y LCDR3 contenidas dentro de una secuencia de aminoácidos de LCVR seleccionadas de SEQ I D NOs: 186, 202, 21 8, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346 y 362; y c) el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno que se une a, reacciona cruzado con tanto toxina A y toxina B de Clostridium difficile comprende las HCDR1, HCDR2 y HCDR3 contenidas dentro de una secuencia de aminoácidos de HCVR seleccionada de SEQ ID NOs: 18, 34, 50, 66 y seleccionadas de SEQ ID NOs: 26, 42, 58, 74 y 90.

2. El anticuerpo aislado o fragmento de unión de antígeno del mismo de la reivindicación 1 que se une específicamente a toxina A de Clostridium difficile, en donde el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende: (a) una HCVR teniendo una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 146; y (b) una LCVR teniendo una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 154.

3. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 que se une específicamente a toxina A de Clostridium difficile, en donde el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado de SEQ ID NOs: 2/10, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154 y 162/170.

4. El anticuerpo aislado de ya sea la reivindicación 1 o 3, o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina A de Clostridium difficile, en donde el anticuerpo comprende: (a) un dominio de HCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 4, 100, 116, 132, 148 y 164; (b) un dominio de HCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionado de SEQ ID NOs: 6, 102, 118, 134, 150 y 166; (c) un dominio de HCDR3 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 8, 104, 120, 136, 152 y 168; (d) un dominio de LCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ I D NOs: 12, 108, 124, 140, 1 56 y 172; (e) un dominio de LCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ I D NOs: 14, 1 1 0, 126, 142, 1 58 y 1 74; y (f) un dominio de LCDR3 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ I D NOs: 16, 1 1 2, 1 28, 144, 160 y 176.

5. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina A de Clostridium difficile, en donde el anticuerpo comprende: (a) un dominio de HCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 148; (b) un dominio de HCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150; (c) un dominio de HCDR3 teniendo una secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 1 52; (d) un dominio de LCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 156; (e) un dominio de LCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 1 58; y (f) un dominio de LCDR3 teniendo una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 60.

6. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1 , o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina B de Clostridium difficile, en donde el anticuerpo comprende: (a) una HCVR teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 274; y (b) una LCVR teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 282.

7. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina B de Clostridium difficile, en donde el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende: un par de secuencia de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado de SEQ ID NOs: 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346 y 354/362.

8. El anticuerpo aislado de ya sea la reivindicación 1 o 7, o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina B de Clostridium difficile, en donde el anticuerpo comprende: (a) un dominio de HCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340 y 356; (b) un dominio de HCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326,342 y 358; (c) un dominio de HCDR3 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344 y 360; (d) un dominio de LCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348 y 364; (e) un dominio de LCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350 y 366; y (f) un dominio de LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352 y 368.

9. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1, o 6-8, o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina B de Clostridium difficile, en donde el anticuerpo comprende: (a) un dominio de HCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 276; (b) un dominio de HCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 278; (c) un dominio de HCDR3 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 280; (d) un dominio de LCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 284; (e) un dominio de LCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 286; y (f) un dominio de LCDR3 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 288.

10. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a, o reacciona cruzado con tanto toxina A como toxina B de Clostridium difficile, en donde el anticuerpo comprende (a) una HCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 18 y 34; y (b) una LCVR teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 26 y 42.

11. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a, o reacciona cruzado con tanto toxina A como toxina B de Clostridium difficile, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR seleccionado de SEQ ID NOs: 18/26, 34/42, 50/58, 66/74 y 82/90.

12. El anticuerpo aislado de ya sea la reivindicación 1 u 11, o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a o reacciona cruzado tanto con toxina A como toxina B de Clostridium difficile, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado de SEQ ID NOs: 18/26 y 34/42.

13. El anticuerpo aislado de ya sea la reivindicación 1 u 11, o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a, o reacciona cruzado tanto con toxina A como toxina B de Clostridium difficile, en donde el anticuerpo comprende: (a) un dominio de HCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 20, 36, 52, 68 y 84; (b) un dominio de HCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 22, 38, 54, 70 y 86; (c) un dominio de HCDR3 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionado de SEQ ID NOs: 24, 40, 56, 72 y 88; (d) un dominio de LCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ I D NOs: 28, 44, 60, 76 y 92; (e) un dominio de LCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ I D NOs: 30, 46, 62, 78 y 94; y (f) un dominio de LCDR3 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 32, 48, 64, 80 y 96.

14. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 , 1 1 o 13, o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a, o reacciona cruzado tanto con toxina A como toxina B de Clostridium difficile, en donde el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno comprende: (a) un dominio de HCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ I D NOs: 20 y 36; (b) un dominio de HCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ I D NOs: 22 y 38; (c) un dominio de HCDR3 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ I D NOs: 24 y 40; (d) un dominio de LCDR1 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionado de SEQ I D NOs: 28 y 44; (e) un dominio de LCDR2 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ I D NOs: 30 y 46; y (f) un dominio de LCDR3 teniendo una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ I D NOs: 32 y 48.

15. El anticuerpo aislado de la reivindicación 2 que interactúa con, o se une a, un epitope dentro de residuos de aminoácidos 468-863 del dominio de unión de receptor carboxi terminal de toxina A producido por Clostridium difficile, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el dominio que une receptor carboxi terminal de la toxina A comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 375.

16. El anticuerpo aislado de la reivindicación 2 que interactúa con o se une a un epitope dentro del dominio de unión a receptor carboxi terminal de toxina A producida por Clostridium difficile, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el epitope es seleccionado del grupo que consiste de residuos 468-488 de SEQ I D NO: 375, residuos 510-530 de SEQ I D NO:375, residuos 602-61 0 de SEQ I D NO: 375, residuos 644-703 de SEQ I D NO: 375, residuos 724-794 de SEQ ID NO: 375, residuos 799-814 de SEQ ID NO: 375 y residuos 858-863 de SEQ I D NO: 375.

17. Una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1 -16 y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

18. La composición farmacéutica de la reivindicación 17 , en donde la composición comprende al menos un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a toxina A de Clostridium difficile y al menos un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina B de Clostridium difficile, en donde: a) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina A comprende las tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (HCDR1 , HCDR2 y HCDR3) contenidas dentro de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de región variable de cadena pesada (HCVR) seleccionadas de SEQ ID NOs: 2, 98, 1 14, 130, 146 y 162; y las tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (LCDR1 , LCDR2 y LCDR3) contenidas dentro de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de región variable de cadena ligera (LCVR) seleccionadas de SEQ ID NOS: 1 0, 1 06, 122, 1 38, 1 54 y 170; y en donde b) el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que se une específicamente a toxina B comprende las tres CDRs de cadena pesada (HCDR1 , HCDR2 y HCDR3) contenidas dentro de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR seleccionadas de SEQ I D NOs: 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338 y 354; y las tres CDRs de cadena ligera (LCDR1 , LCDR2 y LCDR3) contenidas dentro de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR seleccionadas de SEQ I D NOs: 186, 202, 21 8, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346 y 362.

19. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 17 o 1 8, en donde el anticuerpo o un fragmento de unión a antigeno del mismo que se une específicamente a toxina A de Clostridium difficile, comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR de SEQ I D NO: 146/1 54, y en donde el anticuerpo o un fragmento de unión a antigeno del mismo que se une específicamente a toxina B de Clostridium difficile, comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR de SEQ I D NO: 274/282.

20. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 17-19, que comprende: a) un primer anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina A de Clostridium difficile, comprendiendo un HCDR1 teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 148, una HCDR2 teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150, una HCDR3 teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 152, una LCDR1 teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 156, una LCDR2 teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 158, una LCDR3 teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 160; b) un segundo anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a toxina B de Clostridium difficile, comprendiendo una HCDR1 teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 276, una HCDR2 teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 278, una HCDR3 teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 280, un LCDR1 teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 284, una LCDR2 teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 286, una LCDR3 teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 288; y c) un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

21. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 17-20, en donde los anticuerpos contenidos dentro de la composición son efectivos para neutralizar las toxinas A y B de una cepa hipervirulenta de Clostridium difficile.

22. La composición farmacéutica de la reivindicación 21, en donde la cepa hiperviru lenta de Clostridium difficile es una cepa BI/NAP 1 /027.

23. La com posición farmacéutica de la reivindicación 22 , en donde la cepa BI/NAP1 /027 es seleccionada de VA5, VA1 7 , 6336 y 6443.

24. Un método para tratar un paciente que sufre de una condición o enfermedad asociada con Clostridium difficile, o para tratar al menos un síntoma o compl icación asociado con la condición o enfermedad , o para preven ir el desarrollo de una condición o enfermedad asociada con Clostridium difficile en un paciente en riesgo del mismo, comprendiendo el método adm in istrar al paciente una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 7-23, en donde la condición o enfermedad asociada a Clostridium difficile es ya sea prevenida o dism inuida en severidad y/o duración, o al menos un síntoma o compl icación asociado con la condición o enfermedad es preven ido, o mejorado , o que la frecuencia y/o duración de, o la severidad de recurrencia o recaídas con Clostridium difficile, es reducida .

25. El método de la reivind icación 24, en donde el al menos un síntoma o complicación asociado con la condición o enfermedad asociada con Clostridium difficile es seleccionado del grupo que consiste de anorexia , dolor abdominal , distensión abdomi nal , diarrea con o sin sangrado, deshidratación, desnutrición , colitis pseudomem branosa , resección colónica com pleta o de segmento, fiebre e infección sistém ica (sepsis) , muerte, recaída de la condición o enfermedad de Clostridium difficile, y rechazo de un tejido u órgano trasplantado .

26. El método de la reivi ndicación 24 o 25, en donde el paciente en riesgo de desarrollar una condición o enfermedad asociado con Clostridium difficile es seleccionado del grupo que consiste de un paciente mayor (> 65 años de edad) , un paciente que está inm unocomprometido debido a la enfermedad subyacente o debido a administración de terapéuticos inmunosupresores, un paciente quien tiene alguna condición médica subyacente que puede predisponerlo a adquirir una i nfección de Clostridium difficile, un paciente hospitalizado durante un periodo prolongado (al menos una semana) , un paciente q ue ha sido tratado durante un periodo prolongado (= 14 d ías) con antibióticos de ampl io espectro, un paciente de cáncer, un paciente de trasplante, y un paciente en terapia con agentes, tales como pero no lim itados a in hibidor de bomba de protones , o inhibidor de receptores H2 de histam ina que son usados para tratamiento de enfermedades o condiciones gastrointestinales para reducir o tratar acidez gástrica , enfermedad de reflujo gastroesofág ico (GERD) , úlceras de estómago e intestino delgado, o acidez.

27. La composición farmacéutica de cualqu iera de las reivindicaciones 1 7-23 para uso para tratar un paciente que sufre de una condición o enfermedad asociada con Clostridium difficile, o para tratar al menos un síntoma o compl icación asociado con la condición o enfermedad , o para prevenir el desarrol lo de u na condición o enfermedad asociada con Clostridium difficile, en un paciente en riesgo del m ismo, en donde la cond ición o enfermedad asociada con Clostridium difficile, es ya sea prevenida, o disminuida en severidad y/o duración, o al menos un síntoma o complicación asociado con la condición o enfermedad es prevenida, o mejorada, o que la frecuencia y/o duración de, o la severidad de recurrencias, o recaídas con Clostridium difficile, es reducida.

28. El uso de la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 7-23 en la fabricación de un medicamento para uso para tratar un paciente que sufre de una condición o enfermedad asociada con Clostridium difficile, o para tratar al menos un síntoma o complicación asociado con la condición o enfermedad, o para prevenir el desarrollo de una condición o enfermedad asociada con Clostridium difficile en un paciente en riesgo del mismo, en donde la condición o enfermedad asociada con Clostridium difficile, es ya sea prevenida, o disminuida en severidad y/o duración, o al menos un síntoma o complicación asociado con la condición o enfermedad es prevenida, o mejorada, o que la frecuencia y/o duración de, o la severidad de recurrencias, o recaídas con Clostridium difficile es reducida.

29. El uso de la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 27 o 28, en donde el paciente en riesgo de desarrollar una condición o enfermedad asociada con Clostridium difficile es seleccionada de un paciente mayor, un paciente que está inmunocomprometido debido a enfermedad o debido a la administración de terapéuticos inrnunosupresores, un paciente que tiene alguna condición médica subyacente que puede predisponerlo a adquirir una infección de Clostridium difficile, un paciente hospitalizado durante un periodo prolongado, un paciente que ha sido tratado durante un periodo prolongado con antibióticos de amplio espectro, un paciente en terapia con un inhibidor de bomba de protones para tratamiento de enfermedades o condiciones gastrointestinales, una paciente de cáncer, y un paciente de trasplante.

30. El uso de la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 29, en donde el paciente de cáncer está experimentando tratamiento con un medicamento anti-cáncer, o experimentando radioterapia para tratar un cáncer.

31 . El uso de la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 29, en donde el paciente de trasplante es un paciente que recibe un trasplante de células madre hematopoyéticas, o un trasplante de órgano o tejido sólido.

32. El uso de la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 29 o 31 , en donde el paciente de trasplante está siendo tratado con un medicamento inmunosupresor, o cualquier medicamento de rechazo de trasplante, o quien está experimentando tratamiento con un régimen de medicamento para prevenir rechazo de injerto de órgano o tejido siguiendo el trasplante.

33. El uso de la composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 7-32, en donde la composición farmacéutica es administrada al paciente en combinación con un segundo agente terapéutico.

34. El uso de la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 33, en donde el segundo agente terapéutico es seleccionado de un toxoide, una vacuna de Clostridium difficile, un antibiótico, otro anticuerpo diferente a toxina A y/o B de Clostridium difficile, Clostridium difficile, y cualquier otra terapia paliativa útil para mejorar al menos un síntoma asociado con una condición o enfermedad asociada con Clostridium difficile.

35. El uso de acuerdo con la reivindicación 34, en donde el al menos un síntoma o complicación asociado con la condición o enfermedad asociada a Clostridium difficile es seleccionado del grupo que consiste de anorexia, dolor abdominal, distensión abdominal, diarrea con o sin sangrado, deshidratación, desnutrición, colitis pseudomembranosa, resección colónica completa o de segmento, fiebre e infección sistémica (sepsis), muerte, recaía de la condición o enfermedad de Clostridium difficile, y rechazo de un órgano o tejido trasplantado.

36. Un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo contenido dentro de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

37. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 36.

38. Una célula huésped aislada que comprende el vector de expresión de la reivindicación 37. RES U ME N La presente invención proporciona anticuerpos com pletamente humanos q ue se unen a ya sea toxina A o toxina B de Clostridium difficile, o tanto a toxi na A como B, com prendiendo las composiciones los anticuerpos y métodos de uso. Los anticuerpos de la invención son úti les para neutralizar las toxinas de C. difficile, proporcionando así un medio para tratar la enfermedad y síntomas asociados con una infección de C. difficile, incluyendo el tratam iento de d iarrea , o colitis pseudomembranosa provocada por C. difficile. Los anticuerpos también pueden prevenir la severidad y/o duración de la enfermedad primaria, o pueden preven ir el número, duración y/o la severidad de recurrencias o recaídas de la enfermedad atribuida a la presencia de C. difficile. Los anticuerpos de la invención también pueden ser útiles para el diagnóstico de una infección por C. difficile.