MX2013014650A - Composiciones de peptidos y metodos para tratar lesion pulmonar, asma, anafilaxis, angioedema, sindromes de permeabilidad vascular sistemica, y congestion nasal. - Google Patents

Abstract

Se proveen en la presente inhibidores de péptidos de la interacción entre la Proteína 3 de Unión de Extremos (EB3) y Receptor de 1,4,5-Trifosfato de Inositol Tipo 3 (1P3R3) También se proveen métodos y materiales para tratar la lesión pulmonar, incluyendo la lesión pulmonar aguda, la cual puede incluir la híperpermeabilidad de vasos pulmonares, pérdida vascular, el desarrollo de edema, asma, anafilaxis, angioedema, síndromes de permeabilidad vascular sistémica, y congestión nasal.

Description

COMPOSICIONES DE PÉPTIDOS Y MÉTODOS PARA TRATAR LESIÓN PULMONAR, ASMA, ANAFILAXIS , ANGIOEDEMA, SÍNDROMES DE PERMEABILIDAD VASCULAR SISTEMICA, Y CONGESTIÓN NASAL CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a péptidos para tratar lesiones pulmonares, incluyendo pérdida vascular mediada por inflamación y el desarrollo de edema. La presente invención también se refiere al tratamiento del asma, anafilaxis, angioedema, síndromes de permeabilidad vascular sistémica, y congestión nasal utilizando los péptidos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El citoesqueleto de microtúbulos (MT) provee un importante punto de control de la regulación de la barrera endotelial; sin embargo, el papel de este elemento cito-esquelético no se ha estudiado adecuadamente. Se ha mostrado que el fármaco estabilizador del MT taxol atenúa la lesión pulmonar en modelos de ratones que sugieren que los MTs pueden ser importantes en la mediación de la permeabilidad vascular pulmonar aumentada. Sin embargo, el taxol exhibe una toxicidad general que lo vuelve un fármaco inconveniente para los doctores y sus pacientes.

Las proteínas de unión de extremos de los microtúbulos son factores secundarios de rastreo de más extremos de los microtúbulos, altamente conservados, que se vinculan a microtúbulos (MTs) en crecimiento y suprimen los eventos catastróficos de los MT. Dos de tales proteínas de unión de extremos, EBl y EB3, juegan papeles en la regulación de la dinámica cito-esquelética endotelial y cambio de forma celular, las determinantes primarias de la permeabilidad de la barrera endotelial.

Ca2+ es un segundo mensaje altamente versátil que regula la permeabilidad endotelial y homeostasis vascular. La activación de la fosfolipasa C ß (???ß) , corriente abajo o de emisor a receptor de la activación PAR-1 media la hidrólisis del inositolbisfosfato de fosfatidilo (PIP2) en el 1,4,5-trifosfato de inoditol (IP3) y diacilglicerol (DAG) . IP3 estimula la liberación de Ca2+ de depósitos intracelulares sensibles al IP3, es decir, el retículo endoplásmico (ER) . La depleción de Ca2+ de depósitos de ER es mediado por la activación de IP3R en la membrana ER y lleva a un incremento transitorio en el Ca2+ intracelular . La entrada o "influjo" de Ca2+ es mediada por canales canónicos potenciales de receptores transitorios (TRPC) son permeables a varios cationes incluyendo Ca2+ y Mg2+. Los TRPC1 y 4 son canales de Ca2+ operados por el depósito (SOC) en células microvasculares pulmonares endoteliales que son activados por la depleción del ER.

El incremento en la concentración intracelular de Ca2+ sobre-regula la actividad de la proteína cinasa Ca (PKC a) . La PKC OÍ es un regulador clave de la respuesta de permeabilidad endotelial a los múltiples mediadores 2. PKC a fosforila la pl20-catenina y media su disociación de la VE-cadherina, dan como resultado por consiguiente la internalización de la cadherina VE. La PKC a también actúa de receptor a emisor o corriente arriba de la activación RhoA fosforilando la pll5hoGEF y GDI-1. El RhoA a su vez facilita la inhibición inducida por fosforilación de la fosfatasa de cadena ligera de miosina (MLCP) activando la cinasa Rho (ROCK) . La inhibición del MLCP es acompañada por la activación dependiente de la Ca2+/calmodulina de MLCK que lleva a la fosforilación de MLC e induce la contracción de la acto-miosina en respuesta a mediadores pro-inflamatorios tales como la trombina e histamina .

La integridad del citoesqueleto MT se requiere para la liberación de Ca2+ inducido por IP3 de los depósitos de ER. La alteración de la dinámica de MT mediante agentes desestabilizantes de MT o estabilizantes de MT nocodazol, colchicina y taxol inhibe la liberación activada con IP3 de Ca2+ , que sugiere que la dinámica de MT se requieren para la completa activación del IP3R. El citoesqueleto MT está involucrado en la remodelación del ER, asegurando asi la organización y propagación de ondas de Ca2+ en respuesta a estímulos externos. El ER se adhiere a y alarga junto con los extremos en crecimiento MT a través de la interacción directa de EB1 y EB3 con la molécula 1 de interacción estromal (STIM1) . La depleción de EB1 en HeLa (las células HeLa no expresan EB3) disminuye los eventos de protrusión del ER, sin embargo no inhiben la activación de SOC mediante la tapsigargina que sugiere que algunos otros mecanismos están involucrados en la activación de SOC y propagación de señalización de calcio en células epiteliales. En las células endoteliales, la localización del IP3R en las caveolas es critica tanto para la depleción del depósito de Ca2+ de ER y activación de SOC. Esto indica que la activación de IP3R y/o su receptividad de IP3 es un elemento importante de la señalización de calcio. Se propone que el ci oesqueleto MT regula de manera positiva la activación de IP3R en respuesta al IP3 y por consiguiente transmite señales extracelulares en toda la célula, provocando una respuesta fisiológica.

A pesar de la asistencia complementaria avanzada en los Estados Unidos, aproximadamente 100,000 pacientes mueren anualmente de Lesión Pulmonar Aguda (ALI), una respuesta inflamatoria compleja asociada con la infiltración de neutrófilos y liberación de citocina y mediadores pro-inflamatorios durante la sepsis. La híperpermeabilidad de vasos pulmonares, un aspecto característico del padecimiento, lleva a la formación de edema pulmonar. Son necesarias nuevas terapias para prevenir o tratar la disfunción de la barrera endotelial .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En la presente se provee un péptido aislado. El péptido puede comprender la KFARLWTEIPTAIT (SEQ ID NO: 1), FTEIPTI (SEQ ID NO: 3), un fragmento de la misma, o una variante de la misma. El péptido también puede consistir de KFARLWTEIPTAIT (SEQ ID NO: 1), FTEIPTI (SEQ ID NO: 3), un fragmento de la misma, o una variante de la misma. La variante puede comprender una sustitución conservativa. La variante también puede comprender cualquier secuencia de péptidos que contienen la secuencia Ser/Thr-x-Ile-Pro, secuencia de motivos de consenso de unión EB mínima. El péptido portador puede ser un péptido de antenapedios (AP) . El péptido puede ser parte de una - formulación farmacéutica, la cual puede incluir un excipiente farmacéuticamente aceptable.

También se provee en la presente un método para tratar una lesión pulmonar, el cual puede comprender administrar a un paciente en necesidad de la misma una composición que comprende el péptido. La lesión pulmonar puede ser edema, pérdida vascular mediada con inflamación, o asma, que puede ser asma alérgica. El asma alérgica puede ser crónica o aguda.

También se provee en la presente un método para tratar síndromes de permeabilidad vascular sistémica, los cuales pueden comprender administrar a un paciente en necesidad de la misma una composición que comprende el péptido. Los síndromes pueden deberse a endotoxemia, traumatismo, o múltiples transfusiones. Los síndromes también pueden incurrir como un efecto secundario de un tratamiento con fármacos, el cual puede ser el uso sistémico de IL-2 para tratar cánceres.

En la presente se provee un método para tratar el angioedema, el cual puede comprender administrar a un paciente en necesidad de la misma una composición que comprende el péptido. El angioedema puede ser un angioedema inducido por alérgenos o angioedema no inducido por alérgenos. El angioedema inducido por alérgenos puede ser angioedema laríngeo, el cual puede ir después de una alergia a alimentos o envenenamiento por picadura de himenópteros . El angioedema no inducido por alérgenos puede ser la deficiencia del inhibidor del factor 1 complementario o angioedema inducido por tinte de contraste para imágenes.

También se provee en la presente un método para tratar la anafilaxis, la cual puede comprender administrar a un paciente en necesidad de la misma una composición que comprende el péptido. La anafilaxis puede ser inducida por alérgenos o una reacción anafilactoide no alérgica. La reacción anafilactoide no alérgica puede deberse a un tinte de contraste .

En la presente se provee un método para tratar la permeabilidad vascular sistémica, la cual puede comprender administrar a un paciente en necesidad de la misma una composición que comprende el péptido. La permeabilidad vascular sistémica puede asociarse con endotoxemia.

También se provee en la presente un método para tratar la congestión nasal, que comprende administrar a un paciente en necesidad en la misma una composición que comprende .el péptido. La congestión nasal puede estar asociada con la rinitis alérgica o no alérgica. La congestión nasal puede estar relacionada con sustancias irritantes, o relacionada con virus respiratorios.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1A y IB muestran la depleción de EB3 inhibe la liberación de Ca2+ de los depósitos en respuesta a la activación del receptor activado con Proteasa (PAR) -figura 1A. Las HMVECs que expresan ya sea shARN a EB1, EB3 y Luciferasa se cargaron con una relación de Fura 2- AM y 340 (unido con Ca2+) Fura/380 (Libre de Fura) , se calculó después de la estimulación de células con trombina (50 nM) en la ausencia (-[Ca2+]0) y en la presencia de (1.5 mM [Ca2+]0) de Ca2+ extracelular . Flecha, momento de adición de la trombina. Se observa que la eliminación de EDB3 reduce marcadamente el incremento en la concentración de Ca2+ intracelular . Figura IB. La gráfica muestra la media ± SD de la liberación de Ca2+ inducida con trombina y la entrada calcula como un incremento máximo por encima del valor basal. El incremento se normaliza para controlar las células no transíectadas del mismo cubreobjetos (n = 9) .

La Figura 2 muestra la interacción EB3 con IP3R3 y TRPC1 en el contexto de la inflamación pulmonar. Los ratones WT y TLR4 KO recibieron una sola inyección intraperitoneal (i.p.) de Lipopolisacáridos (LPS) de endotoxina, el componente de la membrana externa de bacterias Gram-negativas , las cuales provocan una fuerte respuesta inmune en mamíferos, en 10 mg/kg de peso corporal. Los pulmones se aislaron en los momentos indicados. El EB3 trató con IP de homogenados de pulmón completo. Los precipitados resultantes buscaron TRPC1, IP3R3 y EB3. Se observa que, la eliminación de TLR4 (receptor LPS) altera la interacción con TRPC1. Se observa que, La unión de EB3 a IP3P3 en pulmones TLR4_ " es comparable con W . Los datos son representativos de 2 experimentos independientes.

La Figura 3 muestra una alineación de receptores IP3 ' humanos (794-814 aa de IP3R tipo 3) con el motivo de unión del EB (resaltado con color rojo) . El péptido IP3R3 (SEQ ID NO: 1) se muestra abajo con color verde.

La Figura 4 muestra una estructura de las proteínas de la estructura de EB3 (color magenta) y el péptido derivado de IP3R (SEQ ID NO: 1) (bolas y barras de color verde) acoplados en la ranura de unión hidrófoba EB3 de EB3; se muestra la rotación de 180°. El péptido derivado de IP3R3 se acopló utilizando un programa Z-Dock en conjunción con el programa informático Discovery Studio 3.0. La energía de unión entre el péptido y EB3 se calculó que es de -68.882 kcal/mol.

Las Figuras 5A y 5B muestran el péptido IP3R3 (SEQ ID NO: 1) inhibe la liberación de Ca2+ de ER en respuesta a la activación de PAR-1. Las HMVECs pre-tratados con el péptido IP3R3 adherido a AP o péptido de control (AP) se cargaron con Fura 2-AM y la relación de 340/380 se calculó después de la estimulación de células con trombina (50 nM) en la ausencia y en la presencia de Ca2+ extracelular . Flecha, momento de la adición de trombina. La gráfica muestra la media ± SD de la liberación de Ca2+ inducida con trombina y entrada calculada como un incremento máximo por encima del valor basal. El incremento es normalizado para controlar las células no tratadas del mismo experimento (n = 4) .

La Figura 6 muestra que el péptido IP3R3 (SEQ ID NO: 1) inhibe la interacción entre el EB3 e IP3R3 en preparaciones para pulmones ex vivo. Los pulmones aislados se someten a perfusión de equilibro 20 min seguido por 30 min de perfusión con AP-péptido IP3R3 10 µ?. 5 min después de esto, 30 µ? del péptido agonista PAR-1 TFLLRN-NH2 (PAR-1 a.p.) se infundió 20 min (grupo IP3R3 + PAR-1) . Otro grupo se infundió solamente con el péptido agonista PAR-1 30 pm (grupo PAR-1). Los pulmones se utilizaron después de esto para preparar homogenado de pulmón el cual se utilizó para determinar el efecto del péptido IP3R3 en la interacción EB3/IP R3. EB3 se inmuno-precipitó con un anticuerpo especifico y se buscaron los precipitados resultantes EB3 e IP3R3. Se observa que, la activación del receptor PAR-1 incrementa significativamente la interacción EB3/IP3R3 (grupo PAR-1) en comparación con el nivel basa (grupo de control) mientras que la profusión del péptido IP3R3 inhibe esta interacción en la microvasculatura pulmonar activada.

La Figura 7 muestra el péptido IP3R3 (SEQ ID NO: 1) mitiga el incremento en la permeabilidad vascular pulmonar (Kf.cr coeficiente de filtración microvascular ) en respuesta a la activación de PAR-1. Las preparaciones para pulmón ex vivo se sometieron a 20 min de perfusión de equilibrio seguido por 30 min de perfusión con AP-péptido IP3R3 10 µ?. 5 min después de esto, el péptido agonista PAR-1 30 µ? TFLLRN-NH2 (PAR-1 a.p.) se infundió 20 min antes de la medición del Kf C. n=3-5 por grupo. Barras ± SD *p<0.05 mediante ANOVA. Se observa, que, no han un cambio significativo en la permeabilidad vascular en respuesta a la activación de PAR-1 en pulmones inundados con AP-IP3R3.

La Figura 8 muestra que el péptido IP3R3 (SEQ ID NO: 1) mitiga la infiltración de neutrófilos en los pulmones en el contexto de la inflamación inducida por LPS. Los ratones recibieron una sola inyección i.p. de LPS (30 mg/kg de peso corporal; E. Coli LPS 0111:B4; dosis LD50) y se utilizaron para análisis a 2 y 6 horas. Los pulmones se inundaron con PBS, se pesaron, se congelaron y utilizaron para medir la actividad de la mieloperoxidasa (MPO) pulmonar, una medición de neutrófilos pulmonares (PMN) en los pulmones. n=6 ratones/grupo .

Las Figuras 9A y 9B muestran el péptido IP3R3 (SEQ ID NO: 1) previene la letalidad en la asepsia inducida con LPS. Los ratones tratados con el péptido IP3R3 antes de la inyección de LPS demostraron la reducción de mortalidad en el grupo ratones de control estimulados con LD50-(30 mg/kg de LPS, figura 9A) y LD90 (50 mg/kg de LPS, figura 9B) . (n=ll-15 ratones/grupo, p<0.001 AP-IP3R3 vs tratamiento de control (control AP) mediante ANOVA. Los ratones se anestesiaron antes de la inyección i.v. retro-orbital de IP3R3 con una mezcla de ketamina, 10 mg/ml; xilazina, 0.25 mg/ml y acepromazina, 0.25 mg/ml .

La Figura 10 muestra que el péptido IP3R3 (SEQ ID NO: 1) previene la letalidad en la asepsia polimicrobiana . Los ratones tratados con el péptido IP3R3 experimentaron mortalidad reducida en el periodo de 120 hr después de que los ratones CD-1 de 6-8 semanas de edad se inyectaron i.v. con péptido IP3R3 (1 µ?/kg de peso corporal) 30 min antes de y 24 y 48 horas después de la cirugía CLP. El saco intestinal ciego se ligó en su punto medio y el contenido cecal se empujó suavemente hacia la parte distal. El saco intestinal ciego se perforó a la mitad entre la ligadura y la punta del saco intestinal cerrado en una dirección mesentérica-a-anti-mesentérica utilizando una aguja de calibre 16. Una cantidad pequeña de heces se sacó forzadamente de ambos orificios de penetración mesentérica y anti-mesentérica . En controles simulados, solamente se realizó una laparotomía. Los ratones se anestesiaron. La supervivencia fue significativamente más alta en el grupo del péptido IP3R3 que el del control (n=10 ratones/grupo) . La diferencia en la mortalidad se examinó mediante una prueba de log-rango (p<0.05).

La Figura 11 muestra la respuesta a la dosis de IP3R3 en la supervivencia de los ratones. Los ratones CD-1 tratados con las dosis indicadas del péptido IP3R3 se inyectaron i.p. con LPS en la dosis LD80 (50 mg/kg de LPS) y se monitorearon 5 días. El índice de supervivencia (%) se gráfico vs dosis de péptido en la escala logarítmica . La curva de dosis-respuesta sigmoidea se ajustó a los puntos de datos. n=10 ratones/grupo. Los ratones se anestesiaron antes de la inyección retro-orbital del péptido con isoflurano 2.5% en aire ambiental en una cámara de inducción de anestesia. La anestesia se mantuvo durante la inyección i.v. utilizando una máscara facial diseñada especialmente para roedores con un tubo coaxial (Aparato Harvard, AH 72-3026) .

La Figura 12 muestra una estructura de las proteínas de EB3 (color magenta) en el complejo con EBIN (SEQ ID NO: 3) (Barra de color verde) y el péptido IP3R3 (Barra de color amarillo) (SEQ ID NO: 1) . La energía de unión computada es de -68.882 y -60.251 de IPR y EBIN, respectivamente.

La Figura 13 muestra que EBIN (SEQ ID NO: 3) inhibe la interacción entre IP3R3 y EB3. Las HPAECs pre-tratadas con AP-EBIN 1 µ? o péptido de control (AP) se estimularon con trombina 50 nM. La interacción entre EB3 e IP3R3 se analizó en diferentes puntos de tiempo después de la estimulación con trombina. El EB3 se inmuno-precipitó con Abs especifico y los precipitados resultantes buscaron EB3 e IP3R3. El EBIN redujo marcadamente la interacción de EB3-IP3R3 basalmente y después del tratamiento con trombina.

Las Figuras 14A y 14B muestran que el Myr-EBIN (SEQ ID NO: 3) mitiga el incremento inducido con agonista en el calcio intracelular . [Ca2+]i transitorio después de la estimulación de las monocapas de HPAEC con trombina 50 nM (figura 14A) o histamina 90 µ? (figura 14B) . Valor medio; n=20 células. Flecha, momento de la estimulación. Se observa que el EBIN (indicadores de color azul) redujo marcadamente el [Ca2+]i transitorio en el péptido de control (pérdida de unión; FAEIPTI (SEQ ID NO: 4)) células tratadas (indicadores de color roj o) .

Las Figuras 15A y 15B muestran que EBIN (SEQ ID NO: 3) atenúa la hiperpermeabilidad paracelular endotelial inducida con agonistas. Los cambios en la resistencia eléctrica transendotelial (TER) de monocapas de HPAEC en respuesta a la a-trómbina 50 nM (figura 15A) e histamina 50 µ? (figura 15B) . Los valores TER se normalizaron hasta la resistencia de linea base. El Myr-EBIN (trazo color rojo) previno el cambio de forma e híperpermeabilidad paracelular en respuesta a la trombina e histamina cuando se observó en las células tratadas con el péptido de control (trazo color azul) .

Las Figuras 16A y 16B muestran gue el EBIN (SEQ ID NO: 3) inhibe la producción de NO inducida con agonistas. Las HPAECs se pre-trataron con el péptido de control (pérdida de actividad) o la producción de NO inducida con Myr-EBIN y basal (figura 16A, en respuesta a la adición de L-arginina) e inducido con agonistas (figura 16B, trombina e histamina) se midió la estimulación de los primeros 20 min. EBIN no afectó el nivel de NO basal aungue atenuó significativamente el NO inducido por agonistas. *, p<0.01 y **, p<0.01.

La Figura 17 muestra gue EBIN (SEQ ID NO: 3) previno la vasodilatación inducida por histamina in vivo. La Medición de Presión Arterial al Despertar en los Ratones. Los ratones se anestesiaron y prepararon guirúrgicamente para la colocación de catéteres arteriales (carótidas) y venosos (yugular externa) . Una hora después de la cirugía la presión sanguínea se monitoreó directamente utilizando un transductor de presión. Las subsecuentes inyecciones intravenosas (i.v.) del péptido AP-EBIN (1 µ?/kg de peso corporal; verde) o péptido AP (rojo) e histamina (10 mg/kg de peso corporal) se realizaron a través del catéter de la vena yugular; la flecha indica el momento de la inyección. Se observa gue, EBIN no tuvo efecto en la presión arterial base y previno la caída de presión arterial en respuesta a la histamina. n=6 ratones/grupo.

La Figura 18 muestra que el EBIN (SEQ ID NO: 3) previene la letalidad de la asepsia inducida con LPS. Los ratones tratados con EBIN experimentaron la mortalidad reducida en el periodo de 120 hr después de la inyección de LPS en la dosis LD90 (50 mg/kg de LPS de E. Coli 0111:B4). Los ratones CDl macho se estimularon con la inyección intraperitoneal (i.p.) de dosis LD90 de LPS. Los grupos experimentales y de control recibieron la inyección retro-orbital intravenosa (i.v.) de EBIN adherido al C-terminal del péptido de antenapedios penetrante celular (AP) o AP solo a una concentración de 1 microM/kg. Los ratones se inyectaron tres veces, 30 minutos antes de y 1 hr y 24 horas después de la administración de LPS. Los ratones se anestesiaron antes de la inyección retro-orbital con una mezcla de ketamina (10 mg/ml), xilazina (0.25 mg/ml), y acepromazina (0.25 mg/ml) .

¦ La Figura 19 compara el efecto del pre- y posttratamiento con EBIN (SEQ ID NO: 3) en la letalidad de la asepsia inducida por LPS. Los ratones tratados con EBIN experimentaron la mortalidad reducida en el periodo de 120 hr después de la inyección de LPS a dosis LD90 (50 mg/kg de LPS de E. Coli 0111:B4). Los ratones CDl macho se estimularon mediante la inyección intraperitoneal (i.p.) de dosis LD90 de LPS. Los grupos experimentales y de control recibieron la inyección (i.v.) en la vena de la cola de Myr-EBIN 30 min antes (pre-tratamiento) o 30 min después (post-tratamiento) de LPS o péptido de pérdida de unión con Myr-control a una concentración de 1 microM/kg. El grupo de pre-tratamiento, los ratones se inyectaron tres veces, 30 minutos antes de y 1 hr y 24 horas después de la administración de LPS; grupo de tratamiento, los ratones se inyectaron dos veces, 30 minutos y 24 horas después de la administración de LPS. Los ratones se anestesiaron antes de la inyección retro-orbital con una mezcla de ketamina (10 mg/ml) , xilazina (0.25 mg/ml), y acepromazina (0.25 mg/ml). El post-tratamiento con EBIN muestra cierta mejora aunque no significativa de la supervivencia.

• Las Figuras 20A a 20C muestran que el EBIN (SEQ ID NO: 3) previene la pérdida vascular subcutánea después de una reacción anafiláctica mediada con IgE. Los ratones recibieron una inyección intradérmica de IgE-HSA en el oído (figura 20A) y espalda (figura 20B) y 24 horas después, una inyección iv de Evans Blue y HSA (1-3) o solución salina (4-5). Los grupos 1 y 4 recibieron solución salina, 2 - péptido de control (pérdida de unión) y 3 y 5 - inyección iv de- Myr-EBIN (1 µ?/kg) 30 min antes de HSA. Se observa que, la inyección de HSA da como resultado la pérdida vascular local, que se atenuó significativamente mediante EBIN (grupo 3). Figura 20C. El trazo de barras demuestra la pérdida vascular de Evans Blue. El Evans Blue se extrajo del tejido del oído y la concentración de Evans Blue se midió a ?= 620 nm y se normalizó hasta el peso del tejido. *, p<0.05, n=6 ratones/grupo.

La Figura 21 muestra el rol de EB3 en la hiperpermeabilidad inducida inflamatoria de la barrera endotelial. EB3 establece interacciones transitorias de extremos de MT en crecimiento con el IP3R3, sensibiliza el IP3R3 respeto al IP3 y regula de manera positiva tanto la liberación de Ca2+ de los depósitos como la entrada de Ca2+ dependiente de SOC durante la inflamación. Esto da como resultado la amplificación de señalización de Ca2+ y permeabilidad incrementada a través de la fosforilación mediada por PKCa de pl20-catenina y contractibilidad de la acto-miosina .

DESCRIPCIÓN DETALLADA Los inventores han hecho el sorprendente descubrimiento de que los péptidos derivados del dominio de interacción de EB3 del receptor de 1 , , 5-trifosfato de inositol (IP3) tipo 3 (IP3R3) reduce la interacción entre la Proteina 3 de Unión de Extremos (EB3) e IP3R3 y mitiga la respuesta de permeabilidad endotelial incrementada asociada con los cambios de forma celular .

En base a los Ejemplos presentados más adelante, aunque sin limitarse por alguna teoría, el rol del EB3 en la hiperpermeabilidad inducida inflamatoria de la barrera endotelial se centra en su capacidad de establecer las interacciones transitorias de los extremos MT en crecimiento con IP3R3. Como resultado el EB3 sensibiliza el IP3R3 al IP3 y regula de manera positiva la liberación de Ca2+ desde el retículo endoplasmático (ER) . Esto lleva a la entrada de Ca2+ dependiente de SOC y amplificación de señalización de Ca2+. La concentración incrementada de Ca2+ citos'ólico induce la fosforilación mediada por PKCa de pl20-catenina da como resultado el desmontaje de las adhesiones de VE-cadherina . También facilita la contractibilidad de acto-miosina dependiente de RhoA da como resultado los cambios de las formas celulares. Ver la Figura 21.

Los métodos y materiales descritos más adelante mitigan la respuesta de la permeabilidad endotelial incrementada asacada con los cambios de las formas celulares y, por lo tanto, son útiles en el tratamiento de lesiones pulmonares, incluyendo la pérdida vascular mediada con inflamación en los pulmones y el desarrollo de edema o edema de cualquier otro órgarto, el cual puede estar asociado con asepsia, reacción anafiláctica o respuesta inmune aguda. Los métodos y materiales también pueden utilizarse para atenuar la pérdida vascular crónica durante los procesos patológicos, tales como inflamación crónica, cáncer, asma, y arterogénesis . 1. Definiciones La terminología utilizada en la presente es con el objeto de describir las modalidades particulares solamente y no se pretende que sea limitante. Cuando se utilizan en la especificación y las reivindicaciones anexadas, las formas singulares "un", "y" y "el o la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto estipule claramente lo contrario.

Para la relación de rangos numéricos de la presente, cada número intermedio que está entre el mismo grado de precisión se contempla explícitamente. Por ejemplo, para el rango de 6-9, los números 7 y 8 se contemplan además de 6 y 9, y para el rango de 6.0-7.0, el número 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6,9, y 7.0 se contempla explícitamente. a. fragmento Cuando se utiliza "fragmento" en la presente puede significar una porción de un péptido o polipéptido o secuencia de ácido nucleico de referencia. b. idéntico Cuando se utiliza "idéntico" o "identidad" en la presente en el contexto de dos o más secuencias de polipéptidos o nucleótidos, puede significar que las secuencias tienen un porcentaje especificado de residuos o nucleótidos que son iguales a través de una región especificada. El porcentaje puede calcularse alineando óptimamente las dos secuencias, comparando las dos secuencias a través de la región especificada, determinando el número de posiciones en las cuales el residuo idéntico ocurre en ambas secuencias para dar el número de posiciones igualadas, dividiendo el número de posiciones igualadas entre el número total de posiciones en la región especificada, y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de la identidad de secuencia. En caso donde las dos secuencias son de longitudes diferentes o la alineación produce uno o más extremos intercalados y la región de comparación especificada incluyen solamente una sola secuencia, los residuos de una sola secuencia se incluyen en el denominador aunque no el numerador del cálculo. c . Péptido , Cuando se utiliza un "péptido" o "polipéptido" en la presente, puede referirse a una secuencia de aminoácidos enlazada y puede ser una modificación natural o sintética o combinación de natural y sintética. d. sustancialmente idéntica Cuando se utiliza en la presente "sustancialmente idéntica" puede significar que una primera y segunda proteina o secuencia de nucleótidos son al menos 50%-99% idénticas por encima de una región de 6-100 o más nucleótido de aminoácidos. e . tratar Cada uno de "que trata", "tratamiento", o "tratar" puede significar aliviar, suprimir, reprimir, eliminar, prevenir o retardar la aparición de síntomas, signos clínicos, o patología subyacente de una condición o padecimiento sobre una base temporal o permanente. La prevención de una condición o padecimiento involucra administrar un agente de la presente invención a un sujeto antes del inicio del padecimiento. La supresión de una condición o padecimiento involucra administrar un agente de la presente invención a un sujeto después de la inducción de la condición o padecimiento aunque antes de su aparición clínica. La contención o represión de la condición o padecimiento involucra administrar una gente de la presente invención a un sujeto después de la aparición clínica del padecimiento, f . variante I Una "variante" puede significar un péptido o polipéptido que difiere en la secuencia de aminoácidos mediante la inserción, eliminación, o sustitución conservativa de aminoácidos, aunque mantiene al menos una actividad biológica. Los ejemplos representativos de "actividad biológica" incluyen la capacidad de unirse a una proteína de Unión de Extremos, un receptor de tipo toll (TLR) y que está unido mediante un anticuerpo específico. La variante también puede significar una ' proteína con una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una proteína mencionada con una secuencia de aminoácidos que mantiene al menos una actividad biológica. Una sustitución conservativa de un aminoácido, es decir, remplazando un aminoácido con un diferente aminoácido de propiedades similares (por ejemplo, hidrofilicidad, grado y distribución de regiones cargadas) es reconocida en la técnica puesto que típicamente involucra un cambio menor. Estos cambios menores se pueden identificar, en parte, considerando el índice hidropático de aminoácidos, como se entiende en la técnica Kyte et al., J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982). El índice hidropático de un aminoácido se basa en una consideración de su hidrofobicidad y carga. Se sabe en la técnica que los aminoácidos de índices hidropáticos similares se pueden sustituir y todavía mantener su función proteínica. En un aspecto, se sustituyen los aminoácidos que tienen índices hidropáticas de +2. La hidrofilicidad de aminoácidos también se puede utilizar para revelar sustituciones que pudieran dar como resultado proteínas que mantienen su función biológica. Una consideración de la hidrofilicidad de aminoácidos en el contexto de un péptido permite el cálculo de la gran hidrofilicidad promedio local de ese péptido, una medida útil que ha sido reportada para correlacionarse bien con la antigenicidad e inmunogenicidad. La Patente Norteamericana No. 4,554,101, incorporada completamente en la presente como referencia. La sustitución de aminoácidos que tiene valores de hidrofilicidad similares puede dar como resultado péptidos que mantienen su actividad biológica, por ejemplo, inmunogenicidad, como se entiende en la técnica. Pueden realizarse sustituciones con aminoácidos que tienen valores de hidrofilicidad dentro de +2 entre sí. Tanto el índice de hidrofobicidad como el valor de hidrofilicidad de los aminoácidos son influenciados por la cadena lateral particular de ese aminoácido. Consistentes con esta observación, son las sustituciones de aminoácidos que son compatibles con la función biológica se entiende que dependen de la similitud relativa de los aminoácidos, y particularmente las cadenas laterales de aquellos aminoácidos, que son revelados por la hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño, y otras propiedades. 2. Péptido Se proporciona en la presente un péptido, el cual puede comprender la secuencia de aminoácidos KFARLWTEIPTAIT (SEQ ID NO: 1), KFARLWAEIPTAIT (SEQ ID NO: 2) (también mencionada en la presente como el Péptido IP3R3) , (FTEIPTI (SEQ ID NO: 3) (también referido en la presente como un Péptido Inhibidor de Unión de Extremos, o "EBIN"), un péptido descrito en la Tabla 3 de la presente, un fragmento, o una variante del mismo. El variante puede comprender una sustitución conservativa. El péptido puede comprender una secuencia de motivos de consenso de unión EB, tal como la secuencia de consenso de unión EB de IP3R3, o un fragmento de la misma. La secuencia de consenso de unión EB de IP3R3 puede ser Ser/Thr-x-Ile-Pro . El péptido puede consistir de KFARLWTEIPTAIT (SEQ ID NO: 1), KFARLWAEIPTAIT (SEQ ID NO: 2), FTEIPTI (SEQ ID NO: 3), una secuencia de consenso que comprende Ser/Thr-x-Ile-Pro, un péptido descrito en la Tabla 3 de la presente, un fragmento de lo anterior, o una variante conservativo de lo anterior. La variante puede comprender cualquier secuencia de péptidos que contiene la secuencia Ser/Thr-x-Ile-Pro, la secuencia de motivos de consenso de unión EB.

El péptido puede conjugarse, tratarse con miristoilo o enlazarse a otro péptido, tal como un péptido portador. El péptido puede ser un péptido de antenapedios . 3. Métodos de Tratamiento Se provee en la presente un método para tratar lesiones pulmonares. La lesión pulmonar puede ser inflamación pulmonar, la cual puede ser una pérdida vascular mediada con inflamación y/o el desarrollo de edema. La lesión pulmonar puede ser una lesión pulmonar aguda. La lesión pulmonar también puede ser una pérdida vascular cónica tal como se observa en pacientes con asma. El tratamiento puede atenuar la pérdida vascular crónica. La lesión pulmonar puede ser la híperpermeabilidad de vasos en el pulmón, incluyendo la permeabilidad vascular sistémica, tal como en la endotoxemia. La lesión pulmonar puede asociarse con asepsia, inflamación, traumatismo múltiple severo, aspiración de saliva/contenidos gástricos, neumonía por aspiración, contusión, ahogamiento, transfusiones múltiples, inhalación de irritantes o humos tóxicos, arterogénesis , lesión mecánica (lesión inducida por ventilación) o exposición a radiación. También se proporciona en la presente un método para tratar el asma y/o mejorar la función pulmonar y la salud en general de pacientes con asma. El asma puede ser asma alérgica, el cual puede ser crónico o agudo .

También se proporciona un método para tratar la anafilaxis, tal como anafilaxis inducida por alérgenos, y reacciones anafilácticas no alérgicas, tales como para tintes de contraste. Además se provee en la presente un método para tratar el angioedema, incluyendo el angioedema inducido por alérgenos, tal como edema laríngeo, al cual puede seguir una alergia por alimentos o envenenamiento por picadura de himenópteros . El angioedema puede ser un angioedema no inducido por alérgenos tal como la deficiencia del inhibidor del . factor 1 complementario o reacciones anafilactoides inducidas por tinte de contraste para imágenes.

Se proporciona en la presente un método para tratar síndromes de permeabilidad vascular sistémica. Los síndromes pueden deberse a endotoxemia, traumatismo, o múltiples transfusiones. Los síndromes también pueden incurrir como un efecto secundario de un tratamiento con fármacos. El tratamiento con fármacos puede ser el uso sistémico de IL-2 para tratar cánceres. También se provee un método para tratar la congestión nasal. La congestión puede estar asociada con rinitis alérgica o no alérgica. La congestión puede estar relacionada con sustancias irritantes, o relacionada con virus respiratorios .

El método puede comprender administrar al mamífero una composición que comprenda una cantidad terapéuticamente efectiva del péptido. La composición puede ser una formulación farmacéutica. La composición que comprende el péptido puede administrarse en combinación con uno o más de otros péptidos, compuestos, y/o composiciones farmacéuticas útiles para tratar la lesión pulmonar. Uno o más de otros péptidos, compuestos, y/o composiciones farmacéuticas pueden ser cualquier agente que trata la lesión pulmonar incluyendo, pero no limitada a reductores de precarga tal como nitroglicerina y diuréticos, tal como furosemida (Lasix) . Tales medicaciones dilatan las venas en los pulmones y en otra parte en el cuerpo, lo cual disminuye la presión del fluido que va hacia el corazón y pulmones. Otros o más compuestos incluyen reductores de la presión diastólica. Estos fármacos dilatan los vasos periféricos y toman una carga de presión fuera del ventrículo izquierdo. Algunos ejemplos de mediciones de reductores de presión diastólica incluyen nitroprusiato (Nitropress) , enalaprilo (Vasotec) y captoprilo (Capoten) . a. Sujeto El sujeto puede ser un mamífero, el cual puede ser un humano. Antes del diagnóstico, el sujeto puede estar en riesgo de lesión pulmonar debido a la exposición a uno o más factores de riesgo, problema cardiaco, etc. Uno o más factores de riesgo pueden incluir, por ejemplo, el sujeto que tiene un historial familiar de cáncer, edad, tabaquismo, bebidas alcohólicas, y/o deficiencia alimenticia. El sujeto puede estar expuesto a humos tóxicos o radiación, ventilación mecánica. El sujeto puede tener heridas por quemaduras, inflamación, traumatismo múltiple severo, aspiración de saliva/contenidos gástricos, neumonía por aspiración, asepsia, contusión, ahogamiento o asfixia, múltiples transfusiones, b. Administración La administración de los péptidos que utilizan el método descrito en la presente puede ser administración sistémica, oral,, parenteral, sublingual, transdérmica, rectal, vía transmucosa, tópicamente, vía inhalación, vía bucal, nasalmente, o combinaciones de las mismas. La administración parenteral incluye, pero no se limita a, intravenosa, intraarterial , intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intratecal, e intraarticular . La administración también puede ser subcutánea, intravenosa, vía intra-conductos aéreos, o intra-tumoral . Para uso veterinario, el péptido puede administrarse como una formulación adecuadamente aceptable de acuerdo con la práctica veterinaria normal. El veterinario puede determinar fácilmente el régimen de dosificación y vía de administración que sea más apropiado para un animal particular. Los péptidos pueden administrarse a un paciente humano, gato, perro, animal grande, o un ave.

El péptido puede administrarse como una monoterapia o de manera simultánea o metronómica con otros tratamientos, los cuales pueden ser una cirugía o remoción , de un tumor. El término "simultáneo" o "simultáneamente" cuando se utiliza en la presente, significa que el péptido y otro tratamiento se administra dentro de 48 horas, preferiblemente 24 horas, más preferiblemente 12 horas, aún más preferiblemente 6 horas, y más preferiblemente 3 horas o menos, entre si. El término "metronómicamente" cuando se utiliza en la presente significa la administración del péptido en momentos diferentes al de otro tratamiento y a cierta frecuencia relativa para repetir la administración.

El péptido puede administrarse en cualquier momento antes de otro tratamiento incluyendo aproximadamente 120 hr, 118 hr, 116 hr, 114 hr, 112 hr, 110 hr, 108 hr, 106 hr, 104 hr, 102 hr, 100 hr, 98 hr, 96 hr, 94 hr, 92 hr, 90 hr, 88 hr, 86 hr, 84 hr, 82 hr, 80 hr, 78 hr, 76 hr, 74 hr, 72 hr, 70 hr, 68 hr, 66 hr, 64 hr, 62 hr, 60 hr, 58 hr, 56 hr, 54 hr, 52 hr, 50hr, 48 hr, 46 hr, 44 hr, 42 hr, 40 hr, 38 hr, 36 hr, 34 hr, 32 hr, 30 hr, 28 hr, 26 hr, 24 hr, 22 hr, 20 hr, 18 hr, 16 hr, 14 hr, 12 hr, 10 hr, 8 hr, 6 hr, 4 hr, 3 hr, 2 hr, 1 hr, 55 mins . , 50 mins . , 45 mins . , 40 mins . , 35 mins., 30 mins . , 25 mins., 20 mins., 15 mins, 10 mins, 9 mins, 8 mins, 7 mins., 6 mins., 5 mins., 4 mins., 3 mins, 2 mins, y 1 mins. El péptido puede administrarse en cualquier momento previo a un segundo tratamiento del péptido incluyendo aproximadamente 120 hr, 118 hr, 116 hr, 114 hr, 112 hr, 110 hr, 108 hr, 106 hr, 104 hr, 102 hr, 100 hr, 98 hr, 96 hr, 94 hr, 92 hr, 90 hr, 88 hr, 86 hr, 84 hr, 82 hr, 80 hr, 78 hr, 76 hr, 74 hr, 72 hr, 70 hr, 68 hr, 66 hr, 64 hr, 62 hr, 60 hr, 58 hr, 56 hr, 54 hr, 52 hr, 50hr, 48 hr, 46 hr, 44 hr, 42 hr, 40 hr, 38 hr, 36 hr, 34 hr, 32 hr, 30 hr, 28 hr, 26 hr, 24 hr, 22 hr, 20 hr, 18 hr, 16 hr, 14 hr, 12 hr, 10 hr, 8 hr, 6 hr, 4 hr, 3 hr, 2 hr, 1 hr, 55 mins., 50 mins., 45 mins., 40 mins., 35 mins., 30 mins., 25 mins., 20 mins., 15 mins., 10 mins . , 9 mins . , 8 mins., 7 mins . , 6 mins., 5 rains . , 4 mins . , 3 mins, 2 mins, y 1 min.

El péptido puede administrarse en cualquier momento después de otro tratamiento incluyendo aproximadamente 1 min, 2 mins., 3 mins., 4 mins., 5 mins., 6 mins., 7 mins., 8 mins., 9 mins., 10 mins., 15 mins., 20 mins., 25 mins., 30 mins., 35 mins., 40 mins., 45 mins., 50 mins., 55 mins., 1 hr, 2 hr, 3 hr, 4 hr, 6 hr, 8 hr, 10 hr, 12 hr, 14 hr, 16 hr, 18 hr, 20 hr, 22 hr, 24 hr, 26 hr, 28 hr, 30 hr, 32 hr, 34 hr, 36 hr, 38 hr, 40 hr, 42 hr, 44 hr, 46 hr, 48 hr, 50 hr, 52 hr, 54 hr, 56 hr, 58 hr, 60 hr, 62 hr, 64 hr, 66 hr, 68 hr, 70 hr, 72 hr, 74 hr, 76 hr, 78 hr, 80 hr, 82 hr, 84 hr, 86 hr, 88 hr, 90 hr, 92 hr, 94 hr, 96 hr, 98 hr, 100 hr, 102 hr, 104 hr, 106 hr, 108 hr, 110 hr, 112 hr, 114 hr, 116 hr, 118 hr, y 120 hr. El péptido puede administrarse en cualquier momento después de un segundo tratamiento del péptido incluyendo aproximadamente 120 hr, 118 hr, 116 hr, 114 hr, 112 hr, 110 hr, 108 hr, 106 hr, 104 hr, 102 hr, 100 hr, 98 hr, 96 hr, 94 hr, 92 hr, 90 hr, 88 hr, 86 hr, 84 hr, 82 hr, 80 hr, 78 hr, 76 hr, 74 hr, 72 hr, 70 hr, 68 hr, 66 hr, 64 hr, 62 hr, 60 hr, 58 hr, 56 hr, 54 hr, 52 hr, 50hr, 48 hr, 46 hr, 44 hr, 42 hr, 40 hr, 38 hr, 36 hr, 34 hr, 32 hr, 30 hr, 28 hr, 26 hr, 24 hr, 22 hr, 20 hr, 18 hr, 16 hr, 14 hr, 12 hr, 10 hr, 8 hr, 6 hr, 4 hr, 3 hr, 2 hr, 1 hr, 55 mins . , 50 mins . , 45 mins . , 40' mins . , 35 mins . , 30 mins . , 25 mins . , 20 mins . , 15 mins., 10 mins., 9 mins . , 8 mins., 7 mins., 6 mins . , 5 mins., 4 mins . , 3 mins, 2 mins, y 1 min. c . Formulación El método puede comprender administrar el péptido. Los péptidos provistos en la presente pueden estar en la forma de tabletas o grageas formuladas de una manera convencional. Por ejemplo, las tabletas y cápsulas para administración oral pueden contener excipientes convencionales pueden ser agentes aglutinantes, agentes de relleno, lubricantes, desintegradores, y agentes humectantes. Los agentes aglutinantes incluyen, pero no están limitados a, jarabe, acacia, gelatina, sorbitol, tragacanto, mucilago de almidón y poliyinilpirrolidona . Los agentes de relleno pueden ser lactosa, azúcar, celulosa microcristalina, almidón de maíz, fosfato de calcio, y sorbitol. Los lubricantes incluyen, pero no están limitados a, estearato de magnesio, ácido esteárico, talco, polietilenglicol, y sílice. Los desintegradores pueden ser almidón de patata y glicolato de almidón sódico. Los agentes humectantes pueden ser lauril-sulfato de sodio. Las tabletas pueden revestirse de acuerdo a los métodos bien conocidos en la técnica.

Los péptidos provistos en la presente también pueden ser formulaciones liquidas tales como suspensiones acuosas o aceitosas, soluciones, emulsiones, jarabes, y elixires. Los péptidos también pueden formularse como un producto seco para su constitución con agua u otro vehículo adecuado antes de usarse. Tales preparaciones líquidas pueden contener aditivos tales como agentes de suspensión, agentes de emulsión, vehículos no acuosos y conservadores. El agente de suspensión puede ser jarabe de sorbitol, metilcelulosa, jarabe de glucósa/azucar, gelatina, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa , gel de estearato de aluminio, y grasas comestibles hidrogenadas. Los agentes de emulsión pueden ser lecitina, monooleato de sorbitán, y acacia. Los vehículos no acuosos pueden ser aceites comestibles, aceite de almendras, aceite de coco fraccionado, ésteres aceitosos, propilenglicol, y alcohol etílico. Los conservadores pueden ser p-hidroxibenzoato de metilo o propilo y ácido sórbico.

Los péptidos provistos en la presente también pueden formularse como supositorios, los cuales pueden contener bases para supositorio tales como manteca de cacao o glicéridos. Los péptidos provistos en la presente también pueden formularse para inhalación, los cuales pueden estar en una forma tal como una , solución, suspensión, o emulsión que puede administrarse comó un polvo seco o en la forma de un aerosol utilizando un propelente, tal como diclorodifluorometano o triclorofluorometano . Los péptidos provistos en la presente también pueden formularse como formulaciones transdérmicas que comprenden vehículos acuosos o no acuosos tales como cremas, ungüentos, lociones, pastas, emplastos medicados, parche, o membrana .

Los péptidos provistos en la presente también pueden formularse para la administración parental tal como mediante inyección, inyección intratumoral o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden estar en la forma de suspensiones, soluciones, o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación que incluyen, pero no están limitados a, agentes de suspensión, estabilización y dispersión. El péptido también puede proveerse en una forma de polvo para su reconstitución con un vehículo adecuado incluye, pero no está limitado a, agua estéril libre de pirógenos.

' Los péptidos provistos en la presente también pueden formularse como una preparación de depósito, la cual puede administrarse mediante implantación o mediante inyección intramuscular. Los péptidos pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (como una emulsión en un aceite aceptable, por ejemplo) , resinas de intercambio de ione:s, o como derivados bastante solubles (como una sal bastante soluble, por ejemplo) . d. Dosificación El método puede comprender administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del péptido a un paciente en necesidad del mismo. La cantidad terapéuticamente efectiva requerida para usarse en la terapia varia con la naturaleza de la condición a ser tratada, la duración de tiempo deseada para activar la actividad TLR, y la edad/condición del paciente. En general, sin embargo, las dosis empleadas para el tratamiento para humanos adultos típicamente están en el rango de 0.001 mg/kg hasta -aproximadamente 200 mg/kg por día. La dosis puede ser aproximadamente 0.05 mg/kg hasta aproximadamente 10 g/kg por dia . La dosis deseada puede administrarse convenientemente en una sola dosis, o como múltiples dosis administradas a intervalos apropiados, por ejemplo, como dos, tres, cuatro o más sub-dosis por día. Las dosis múltiples pueden desearse, o requerirse .

La dosificación puede ser a cualquier dosificación tal como aproximadamente 0.05 mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.07 mg/kg, 0.08 mg/kg, 0.09 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg, 75 mg/kg, 100 mg/kg, 125 mg/kg, 150 mg/kg, 175 mg/kg, 200 mg/kg, 225 mg/kg, 250 mg/kg, 275 mg/kg, 300 mg/kg, 325 mg/kg, 350 mg/kg, 375 mg/kg, 400 mg/kg, 425 mg/kg, 450 mg/kg, 475 mg/kg, 500 mg/kg, 525 mg/kg, 550 mg/kg, 575 mg/kg, 600 mg/kg, 625 mg/kg, 650 mg/kg, 675 mg/kg, 700 mg/kg, 725 mg/kg, 750 mg/kg, 775 mg/kg, 800 mg/kg, 825 mg/kg, 850 mg/kg, 875 mg/kg, 900 mg/kg, 925 mg/kg, 950 mg/kg, 975 mg/kg, 1 g/kg, 2 g/kg, 3 g/kg, 4 g/kg, 5 g/kg, 6 g/kg, 7 g/kg, 8 g/kg, 9 g/kg, o 10 g/kg. 4. Kit o equipo Se provee en la presente un kit o equipo, el cual puede ajustarse para tratar una lesión pulmonar. El kit puede comprender uno o más de los péptidos. Los péptidos pueden ser parte de una composición farmacéutica. El kit puede comprender además instrucciones para utilizar el kit y realizar la administrar del péptido o formulación.

El kit también puede comprender uno o más contenedores, tales como viales o frascos, con cada contenedor que contiene un reactivo aparte. El kit puede comprender además instrucciones escritas, las cuales pueden describir cómo realizar o interpretar el método descrito en la presente.

La presente invención tiene múltiples aspectos, ilustrados por los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Depleción de EB3 que inhibe la liberación de Ca2+ de los depósitos El trabajo previo sugiere el rol del citoesqueleto MT en la regulación de la liberación de IP3 de Ca2+ de los depósitos de ¦ ER. Se prueba la capacidad de EB3 para regular la liberación de Ca2+ de los depósitos sensibles a IP3 de receptor a emisor de la señalización de PAR-1. Se determinó que los cambios en la concentración de Ca2+ intracelular en HMECs que expresan shARN a EBl, EB3 y Luciferasa en respuesta a la activador de PAR-1 (Figura 1A) . Debido a que nuestros constructos de siARN a base de vectores se clonaron en un vector GFP-1, fuimos capaces de comparar los cambios en la célula no transfectada y transfectada del mismo cubreob etos. La depleción de EBl no tiene ningún efecto en la liberación de Ca2+ de los depósitos en comparación con las células no transfectadas de control o células que expresan el shARN a la Luciferasa. En contraste, la depleción de EB3 lleva a la marcada inhibición de la liberación de Ca2+, por consiguiente da como resultado el influjo de Ca2+ disminuido. El efecto de la depleción simultánea de EBl y EB3 fue comparable con la depleción de EB3 solo (Figura IB) . Estos datos sugieren que EB3 se requiere para la depleción de Ca2+ del ER.

Ejemplo 2 Rol de la interacción de EB3 con IP3R en el mecanismo de la liberación de IP3 de Ca2+ Se determinó si EB3 interactúa con la actividad tipo IP3R3 de la cual es critica para la liberación inducida con trombina de Ca2+ en los ECs. Los ratones se estimularon con la dosis sub-letal de LPS y se determinó la asociación de EB3 con IP3R3 y canal TRPC1 (SOC) . Como se muestra en la Figura 2, EB3 interactúa con IP3R3 en la microvasculatura endotelial en reposo y el nivel de esta interacción se incrementa durante la inflamación pulmonar inducida por LPS. De modo interesante, también se encontró TRPC1 en el EB3 precipitado en los pulmones que padecen inflamación (3 hrs de estimulación con LPS) . Estos cambios no se observaron en ratones KO con TLR4 (receptor LPS) que indican la relación causal de estar interacciones e inflamación.

De modo interesante, IP3R3 contiene un motivo de consenso de unión EB Ser/Thr-x-Ile-Pro (SxIP) . Un péptido corto en base a la secuencia de IP3R3 (KFARLWTEIPTAIT - SEQ ID NO: 1) (Figura 3) múestra una alta actividad de unión para EB3 con unión de energía libre de -68.882 kcal/mol (Figura 4). El pre-tratamiento de célula con la secuencia IP3R3 adherida al término C del péptido de antenapedios permeable a las células (AP) a 10 n disminuye marcadamente la libración de Ca2+ de los depósitos en respuesta a la trombina (Figura 5A) , que sugiere que la interacción entre la IP3R3 y EB3 es crítica en el mecanismo de activación de IP3R3. Los efectos del péptido IP3R3 y taxol se compararon en la regulación de la liberación de Ca2+. Se encontró que el pre-tratamiento de células con 5 yg/ml de taxol durante 20 min antes de la estimulación con trombina inhibe la liberación de Ca2+ de ER en la misma medida que el péptido IP3R3 (Figura 5B) .

Ejemplo 3 Péptido IP3R3 que previene la pérdida vascular pulmonar inducida por inflamación y letalidad en la asepsia Para tratar el rol de la interacción EB3/IP3R en la regulación de la permeabilidad endotelial vascular utilizamos preparaciones pulmonares ex vivo. El péptido se infundió en los pulmones 30 minutos antes de la infusión del péptido agonista PAR-1 y la interacción entre EB3 e IP3R3 se determinó mediante un ensayo IP (Figura 6) . La activación del receptor PAR-1 incrementó significativamente la interacción EB3/IP3R3 en comparación con un nivel basa mientras que la profusión del péptido IP3R3 inhibió esta interacción en la microvasculatura pulmonar. Consecuentemente, el péptido IP3R3 mitiga el incremento en la permeabilidad de los vasos pulmonares cuando se miden mediante los cambios en el coeficiente de filtración microvascula , Kf/C. La Figura 7 demuestra que el péptido IP3R3 atenúa marcadamente el incremento en la permeabilidad microvascular en respuesta a la activación de PAR-1. Estos datóos sugieren que la interacción entre EB3 e IP3R podrían ser importantes para la pérdida vascular inducida con inflamación y el desarrollo de edema en los pulmones.

Estudios recientes demostraron que la pérdida vascular es un factor crítico que contribuye a la letalidad en la asepsia. El efecto farmacológico del péptido IP3R3 se probó en el modelo de asepsia murina inducida con LPS. Los ratones CD1 macho se estimularon con inyección intraperitoneal (i.p.) de LPS (30 mg/kg de peso corporal) e infiltración de neutrófilos en el pulmón, una medida de inflamación pulmonar se determinó. Los pulmones se bombearon con PBS, se pesaron, congelaron y utilizaron para medir la actividad de la mieloperoxidasa pulmonar (MPO) , distintiva de los neutrófilos activados. Como se muestra en la Figura 8, el tratamiento de ratones con IP3R3 30 minutos antes de la estimulación con LPS, redujo significativamente la infiltración de neutrófilos en el pulmón a las 2 y 6 horas de la estimulación con LPS en comparación con el grupo tratado con el péptido de control. Esta observación sugiere que el IP3R3 atenuó la inflamación y lesión pulmonar inducida con LPS. Consecuentemente, los ratones recibieron un tratamiento de péptido IP3R3, 30 minutos antes de y 1 hr después de la administración de LPS, demostró una mejora marcada en el índice de supervivencia de los grupos de control en ambos, estimulación con LD50 y LD80 (Figuras 9A y 9B) . Además, se determinó si el IP3R3 se protege de la asepsia polimicrobiana inducida por la ligadura y punción cecal. La CLP causa peritonitis letal que es acompañada por una lesión pulmonar aguda (ALI) . El mismo es un método muy excluido y clínicamente relevante en roedores experimentales. La Figura 10 muestra que el péptido IP3R3 mejoró la supervivencia del animal después de la CLP. Mientras que el 90% de los ratones de control murieron dentro de las primeras 48 horas, los animales inyectados con IP3R3 antes de la cirugía y 24 y 48 horas después de la cirugía, demostraron un índice de supervivencia significativamente más alto.

Estos datos sugieren que el péptido derivado del péptido IP3R3' se puede utilizar potencialmente para prevenir la híperpermeabilidad pulmonar y para atenuar la pérdida vascular crónica durante los procesos patológicos tales como la inflamación y arterogénesis . La dosis-respuesta del péptido IP3R3 se probó además en el modelo de asepsia murina inducida con LPS. Los ratones CD1 macho se estimularon con la inyección i.p.1 de LPS a la dosis de LD80. Los ratones recibieron una inyección i.v. retro-orbital de péptido IP3R3 a dosis de 0.01, 0.033, 0.1, 0.33, 1.0, 3.3 y 10 µ? por kg del peso corporal. Un porcentaje de animales sobrevivientes en cada grupo se gráfico como una función de la dosis IP3R3. La Figura 11 muestra que el IP3R3 mejora el índice de supervivencia de los grupos de control partiendo a 0.033 µ??/kg y alcanzaron una eficacia máxima a 1 µ?/kg. El incremento en la dosis de IP3R3 no llevó a una mejora posterior aunque notable, ni causó la muerte de los animales. Estos datos sugieren que el péptido IP3R3 tiene baja toxicidad dentro de este rango de dosis. La ED50 (dosis efectiva, 50%) como 80 nM/kg se calculó utilizando una ecuación logística de tres parámetros: y = min + (max+min) /l+10LogED50_x Donde min y máx son el mínimo y máximo de la respuesta. Los datos presentados sugieren que IP3R3 es un fármaco potencial con una potencia elevada y baja toxicidad. En contraste con el taxol, no se espera que este fármaco exhiba una toxicidad general .

EB3 regula positivamente la liberación de Ca2+ de los depósitos de ER, e incrementa asi la permeabilidad de la barrera endotelial en respuesta a estímulos pro-inflamatorios. La interacción entre EB3 e IP3R es importante en el mecanismo de la liberación de IP3 del péptido IP3R3 de Ca2+ previene la pérdida vascular mediada con inflamación en los pulmones y el desarrollo de edema y mejora marcadamente la supervivencia de los ratones en dos diferentes modelos de asepsia.

Ejemplo 4 Determinar el rol de la regulación de EB3 de la señalización de Ca2+ en el mecanismo de la permeabilidad endotelial incrementada y formación de edema pulmonar.

Postulamos que la interacción dinámica de EB3 en los extremos T con ER se requiere para la propagación de ondas de Ca2+ y permeabilidad de barrera endotelial incrementada en repuesta a los mediadores pro-inflamatorios.

Hipótesis: Se requiere la regulación de EB3 de la liberación de IP3 de Ca2+ de ER para el incremento dependiente de MT en la permeabilidad endotelial. Trataremos la idea de que la acumulación de EB3 en los extremos MT en crecimiento facilita la interacción transitoria de EB3 con IP3R y regula positivamente la liberación de Ca2+ de los depósitos dando como resultado por consiguiente la entrada de Ca2+ dependiente de SOC, la activación de la isoforma de PKCa dependiente de Ca2+, la fosforilación mediada con PKCa de pl20-catenina y la internalización de VE-cadherina (como se postula por el modelo en la Figura 21) .

Ejemplo 5 Rol del EB3 en la regulación del crecimiento de MT persistente y activación de IPER.

Los agentes de desestabilización y estabilización de MT inhiben la liberación 11-13 de Ca2+ inducida con IP3. Nuestros Datos Preliminares demuestran que la depleción del EB3 pero no del , EB1 en las células endoteliales también inhibe la liberación mediada con PAR-1 de Ca2+ de los depósitos. Determinaremos si el EB3 regula la liberación de Ca2+ inducida por IP3 del ER indirectamente a través de la regulación de la dinámica de MT . Determinaremos si la restauración del crecimiento persistente del MT en las células vacias de EB3 expresando el dimero EB3 artificial como se muestra por nuestro número 20 también se puede restaurar la liberación mediada de PAR-1 del Ca2+ de ER. Puesto que el dimero artificial EB3-NL-LZ está completamente carente de cualquier dominio respuesta de la unión a los socios EB conocidos, no se espera restaurar la liberación de Ca2+ inducida por IP3 si la interacción entre el EB3 e IP3R es critica para la activación de IP3R. Por lo tanto, si observáramos una restauración de la actividad IP3R en las células que expresan los dimeros EB3 artificiales, concluiremos que EB3 regula la liberación de Ca2+ inducida por agonistas de ER indirectamente, a través de la dinámica de MT. Este experimento tratará la liberación mediada con trombina de Ca2+ del ER y el influjo del Ca2+ extracelular cuando se evalúa mediante las imágenes radiométricas 340/380 de Fura2-AM en HMLVECs. En base a la validez de nuestra hipótesis, predecimos que la expresión de EB3-NL-LZ no restaurará la liberación inducida con agonistas del Ca2+ de ER.

Ejemplo 6 Rol de la interacción del EB3 con IP3R en la distribución intracelular de IP3R.

Sobre la premisa de nuestros Datos proponemos que la interacción entre EB3 e IP3R tipo 3 podría ser importante en el mecanismo de la activación del receptor. IP3R contiene el motivo del consenso Ser/Thr-x-Ile-Pro (SxIP) (Figura 17), el cual es un distintivo específico de los socios interactivos de EB. La fosforilación de Ser o Thr en las cercanías de este motivo disminuye marcadamente la afinidad de EB1 para sus socios conocidos. Determinaremos si el péptido de la secuencia IP3R corto (798-811; KFARLWTEI PTAIT - SEQ ID NO: 1) fusionado con la secuencia de AP afecta la interacción entre el IP3R y EB3 y si el mismo inhibe la liberación de IP3 inducida con trombina de Ca2+. Debido a que hay cierta - posibilidad de que el péptido se pueda fosforilar en las células, expresaremos el péptido IP3R etiquetado con Avi y determinaremos su fosforilación por la auto-radiografia . Si encontramos que el péptido padece fosforilación, utilizaremos el péptido carente de fosforilación en el cual primer el Thr se sustituirá por Ala (péptido carente de fosforilación; KFARLWAEIPTAIT - SEQ ID NO: 2) que es más potente en todos los otros estudios. La unión del péptido a EB3 se confirmará en las células e in vitro mediante co-IP y ensayo de inmunoprecipitación . Utilizaremos este péptido para alterar la interacción entre EB3 e IP3R en las células. Es nuestra expectativa que el péptido IP3R inhibirá la liberación de Ca2+ de los depósitos en réspuesta a la trombina.

Investigaremos si la depleción de EB3 o inhibición de la interacción entre EB3 e IP3 con en el péptido bloqueador cambia la distribución intracelular de IP3R. El IP3R tipo 2 y 3 se expresan predominantemente en la microvasculatura endotelial pulmonar. El reclutamiento del IP3R tipo 3 en las caveolas se requiere para la liberación de Ca2+ inducida por agonistas de los depósitos. Considerando la afinidad intrínseca relativamente baja de la localización de IP3 al IP3R. tipo 3 del receptor en la proximidad cercana a los sitios de generación de IP3 podría ser crítica para la liberación activada con IP3de Ca2+. Por lo tanto, analizaremos si EB3 regula el atado de la membrana ER a las caveolas a través de la formación del complejo IP3R3/TRPC1/TRPC4. Determinaremos la distribución intracelular del receptor IP3R3 mediante transferencia inmuno-fluorescente y mediante imágenes de células vivas en el transcurso de la estimulación con trombina. Si encontramos que el EB3 regula la liberación activada con IP3 de Ca2+ atando el IP3R3 a las caveolas, determinaremos si EB3 facilita la interacción entre IP3R3 y TRPC1/TRPC4.

Ejemplo 7 Rol del EB3 en el mecanismo de la fosforilación de IP3R inducida con agonistas IP3R contiene 16 sitios potenciales para la cinasa II CaM (CaMKII) 26-28 y la fosforilación mediada con CaMKII incrementa la sensibilidad del receptor a IP3. Thr804, un sitio de fosforilación CaMKII previsto (Figura 17) está ubicado dentro de la región 651-1130, la cual es critica para el acoplamiento funcional entre la unión IP3 y abertura de canal. Por lo tanto, la fosforilación de Thr804 podría ser importante en el mecanismo de abertura de canal inducido de IP3. EB3 se une a CaM y podría orquestar la activación espacial y temporal de CaMKII y la fosforilación del receptor. Para centrarse esta idea determinaremos si la depleción de EB3 o perturbación de la interacción entre EB3 e IP3R con un péptido específico inhibe la fosforilación de IP3R. El nivel de la fosforilación de IP3R se examinará mediante auto-radiografía. Esperamos que tanto la depleción de EB3 como del péptido IP3R reducirá el nivel de fosforilación de IP3R. Los sitios de fosforilación se determinarán mediante análisis fosfoproteómico . El IP3R endógeno se purificará de HLMVECs antes y después del tratamiento con trombina utilizando perlas de conconavalina A. La especificidad de sitios CaMKII se determinará mediante la comparación de los perfiles de fosforilación obtenidos con y sin inhibidores de CaMKII. Mutaremos los sitios CaMKII y determinaremos su significado en la distribución intracelular de IP3R3 y en el mecanismo de liberación activada con IP3 de Ca2+.

Otras series de experimentos determinarán si la fosforilación dependiente de CaMKII de IP3R se acopla para la unión del receptor al TRPC1/4 en la membrana de plasma. La fosforilación podría liberar el IP3R de puntas de MT en crecimiento e induce su unión a TRPC1/4. La co-localización de CaMKII e IP3R3 se observa en la región apical de enterocitos intestinales, células acinares pancreáticas y células mucosas superficiales. Por lo tanto, podría ocurrir la co-distribución de CaMKII e IP3R3 en la superficie luminal de las células endoteliales . Confirmaremos primero la co-localización de IP3R3 con :CaMKII en reposo y HLMVECs estimuladas con trombina. También determinaremos la interacción entre el receptor y la cinasa mediante análisis FRET. La actividad del CaMKII se examinará utilizando el biosensor en base al FRET, Camui 33 (obtenido de Yasunori Hayashi, Japón) . El rol de EB3 en la activación espacial de CaMKII se determinará utilizando las mismas metodologías.

Ejemplo 8 Rol de la interacción de EB3 con IP3R en el mecanismo de la entrada de Ca2+ suscitada con SOC.

La depleción de depósitos de ER es el mecanismo importante de la activación SOC y entrada 34-36 de Ca2+. Consistentemente, encontramos que la depleción de EB3 aunque EB1 reduce el influjo de Ca2+. Sobre la premisa de nuestros Datos Preliminares, teorizamos que la depleción de EB3 inhibe la activación inducida con trombina de TRPCl y TRPC4, los principales canales de SOC en las células endoteliales . Para tratar esta posibilidad directamente, las HLMVECs tratadas con siARN de EB3 o con el péptido IP3R3 se utilizarán en el ensayo con pinza de forcipresión de células completas para medir la corriente interior inducida con trombina y sensible a La3+ a -50 mV. También evaluaremos la relación del voltaje de corriente (I-V) (-100 a +100 mV) para demostrar el potencial de reversión de los canales activados. Este resultado se comparará con los datos obtenidos en las HLMVECs en los cuales el IP3R3 se reducirá drásticamente con siARN o inhibirá con el agonista IP3R, borato de 2-aminoetoxidifenilo (2-APB) . Se dirigirán experimentos complementarios si la inactivación separada o simultánea de TRPCl y TRPC4 con Ab especifico o con siARN producirá el efecto similar en la conductancia de células completas en comparación con la depleción de EB3. En la validez de nuestra hipótesis, predecimos que la depleción de EB3 inhibirá la entrada de Ca2+ a través de canales de TRPCl/4. Estos experimentos serán acompañados por mediciones de cambios en la concentración de Ca2+ intracelular por imágenes radiométricas Fura2-AM.

Otro conjunto de experimentos determinará si la depleción de EB3 puede inhibir la activación inducida con tapsigargina (TG) o IP3 (microinyección my de suministro intracelular) de SOC y entrada de Ca2+. TG inhibe la ATPasa de Ca2+ ¡ del sarco/retículo endoplasmático y da como resultado la depleción de Ca2+ de ER independientemente de la activación de IP3R. Se espera que ambas metodologías induzcan la activación de la entrada de Ca2+ suscitada con SOC en células de control tratadas con siARN, sin embargo la depleción de EB3 podría inhibir la entrada de Ca2+ solamente en el caso de la activación inducida con IP3 de IP3R. Este experimento distinguirá entre la intervención del EB3 en la regulación de la entrada de Ca2+ suscitada con SOC indirectamente, a través de la activación de IP3R' y directamente, si EB3 (o la dinámica de MT cambia) tiene cualquier efecto en la activación del canal SOC per se. Evaluaremos la conductancia de las células completas y la relación del voltaje de corriente (I-V) para demostrar la actividad de los canales TRPCl/4 en estos experimentos.

Ejemplo 9 Rol de la interacción EB3 con IP3R en el mecanismo de permeabilidad endotelial incrementado y formación de edema.

Determinares si la interacción entre EB3 e IP3R que da como resultado la propagación de señalización de Ca2+ potencia la respuesta de permeabilidad incrementada a la activación de PAR-1. En este contexto, trataremos el incremento de la barrera de permeabilidad en las células y en pulmones tratados con péptidos de bloqueo IP3R. Examinaremos el incremento la permeabilidad endotelial midiendo los cambios en TER y los flujos de albúmina transendotelial cuando las medidas funcionales de alteraciones de barrera endotelial. La integridad de AJs y formación de vacíos intracelulares se determinará mediante inmunotransferencia, mediante análisis cuantitativo de internalización de VE-cadherina (utilizando un ensayo de biotinilación) , mediante interacción entre VE-cadherina y pl20-catenina . En la validez de nuestra hipótesis, esperamos que la inhibición del incremento en la concentración de Ca intracelular hará que se reduzca la respuesta de permeabilidad reflejada por menos formación de vacío intracelular y adhesiones de VE-cadherina más estable. Puesto que ' el Ca2+ intracelular incrementado activa la PKCa media el desmontaje de AJs fosforilando la pl20-catenina, determinaremos el nivel de activación de PKCa y el nivel de fosforilación de pl20-catenina en el sitio específico de la PKCa, Ser879. Para determina si la contractibilidad celular media por PAR-1 también es inhibida en las células vacías de EB3 o en células pre-tratadas con péptido IP3R3 analizaremos el nivel de activación de RhoA y LCK-L. Las células carentes de IP3R3 o células endoteliales microvasculares pulmonares aisladas de ratones 37 IP3R3-/- se utilizarán para comparación.

Para determinar si la interacción entre EB3 e IP3R potencia el incremento inducido por agonistas en la permeabilidad microvascular y edema pulmonar utilizaremos modelo ex vivo de pulmón. La preparación de pulmón bombeado de ratón se utilizará para determinar si el péptido IP3R permeable a la célula inhibe el incremento mediado por PAR-1 en la permeabilidad vascular pulmonar. La permeabilidad microvascular endotelial se evaluará midiendo el coeficiente de filtración capilar (Kf,c) y flujo de 1251-albúmina transvascular pulmonar después de la infusión del péptido del agonista PARI. También utilizaremos ratones IP3R3-/- (obtenidos de Katshiko Mikoshiba, Japón) o ratones en los cuales el IP3R3 se reducirá drásticamente mediante siARN para verificar los resultados obtenidos con un péptido. Si nuestra hipótesis que la interacción entre IP3R y EB3 es esencial para regular el incremento inducido con agonista en la permeabilidad microvascular pulmonar, esperamos que tanto el péptido IP3R3 como IP3R3-/- producirá resultados comparables revelando una inhibición parcial de la permeabilidad microvascular incrementada en respuesta a la activación de PAR-1.

La meta de estos estudios es determinar el rol de EB3 que 'da como resultado la liberación activada con IP3 de Ca2+ de los depósitos de ER. Determinaremos la importancia de la interacción entre EB3 e IP3R en el mecanismo de la fosforilación del IPER y translocación del ER al plasmalema apical o membrana plasmática. Prevemos en base a nuestra hipótesis que la interacción entre la EB3 e IP3R provee un punto de control de la activación del IP3R. Sobre la validez de nuestra hipótesis, predecimos que la alteración de la interacción del EB3 con IP3R inhibirá la liberación de Ca2+ de los ¿depósitos de ER y revocará la respuesta de permeabilidad incrementada en el cultivo de células y en los pulmones. Investigaremos los siguientes modelos mecánicos en los que la interacción de EBE/IP3R regula la liberación activada con IP3 de Ca2+ 1) mediante el atado de IP3R3 a las caveolas, a la cercana proximidad de la generación de IP3 y 2) facilitando la fosforilación mediante CaMKII. Por consiguiente, los experimentos con cultivos celulares, junto con los estudios de micróvasos pulmonares identificarán el mecanismo mediante el cual EB3 regula la actividad del IP3R3. No vislumbramos problemas con respecto a que sea posible sacar nuevas conclusiones de estos estudios en base al análisis de las hipótesis. Todas las técnicas propuestas se establecen en nuestro laboratorio o en el laboratorio de co-investigadores y por lo tanto son factibles.

El citoesqueleto MT juega un rol importante en el mantenimiento de la barrera endotelial en las células en reposo y provee el mecanismo para- potenciar la permeabilidad endotelial incrementada cuando es mediada por estímulos pro-inflamatorios. EB3, una proteína de unión de extremos del MT, que regula la dinámica del MT propiciando el crecimiento persistente de MT y por lo tanto, la actividad anticatastrófica del EB3 podría ser un mecanismo primario que controle la re-organización del citoesqueleto MT y la pérdida de la función de barrera endotelial en los padecimientos inflamatorios tales como lesión pulmonar aguda (ALI) y Síndrome de Insuficiencia Respiratoria del Adulto (ARDS) . Los estudios propuestos tratan los papeles de del EB3 en la regulación de la liberación activada con IP3 de Ca2+ de los depósitos de ER en respuesta a la activación PAR-1 en el mecanismo de la permeabilidad vascular endotelial incrementada y .formación de edema. Definiremos la interacción potencialmente importante entre EB3 e IP3R3 en el mecanismo de la organización y propagación de ondas Ca2+ que media la permeabilidad endotelial incrementada a través del desmontaje de AJ mediado con PKCa y contractibilidad de la acto-miosina accionada con RhoA/MLCK-L.

Ejemplo 10 Efécto del truncamiento del péptido IP3R3 en la unión al EB3 1 Se utilizó modelación in silico computacional para estimar la contribución energética a la energía libre de unión provista por cada residuo en el péptido KFARLWTEIPTAIT péptido (SEQ ID NO: 1) . Una variante truncada de la secuencia de aminoácidos: KFARLWTEIPTAIT péptido (SEQ ID NO: 1) se acopló en la interfaz EB3 y se computó la energía libre de la interacción (Tabla 1) . Los datos demostraron que Thr-x-Ile-Pro tiene la energía de unión más baja y los aminoácidos de flanqueo juegan un rol crítico en la interacción de estabilización entre EB3 y el péptido.

Tabla 1. Cambios computados en la energía libre de unión después del truncamiento de residuos de aminoácidos los cuales rodean el motivo Thr-x-Ile-Pro del péptido IP3R3 Ejemplo 11 Diseño basado en la Estructura del Péptido Inhibidor de la Unión de Extremos (EBIN) El péptido Inhibidor de la Unión de Extremos, es decir EBIN, fue designado en base al escaneo de alanina in silico computacional y acoplamiento completamente flexible de péptido IPR a la cavidad de unión EB (Tablas 2 y 3). Se utilizó energía libre de unión (AG) para determina una contribución de cadai residuo en la estabilización de interacción del péptido con la proteina EB.

Se utilizaron los siguientes criterios: Valor AG = 1 = Residuo de estabilización Valor AG = -1 = Residuo de desestabilización Valor ñG < -1 a 0 a <1 = Residuo neutral El escaneo de alanina revela residuos de estabilización (con una energía de unión positiva de 0.50 Kj /mol o más; mostrada en color negro) y desestabilización (con una energía de unión negativa de -1, mostrada en color azul) .

Tabla 2. Cambios computados en la energía de unión libre después de la mutación de cada residuo de aminoácido del péptido IP3R3de alanina: K^AaRaLsW^EalgPioTiiAj^IiaTi Tabla 3. Cambios computados en la energía de unión libre mutando cada residuo de aminoácido de EBI de alanina.

Como resultado, el péptido IPR de 14 aminoácidos se redujo al péptido Inhibidor de la Unión de Extremos de 7 aminoácidos (EBIN; FTEIPTI (SEQ ID NO: 3) . La Figura 12 demuestra la interacción entre EB3 y EBIN. De manera similar al IP3R3 (se muestra en barras de color amarillo en la Figura 12), EBIN se une a la ranura hidrófoba entre la disminución progresiva ácida de EB y el dominio de bobinada en espiral. La unión de energía calculada de EBIN a EB3 es -60.251 kcal/mol, que es similar a la unión de energía entre IPR y EB3. La treonina en la posición 2 de EBIN juega un rol crítico en la unión a la interfaz EB3 debido a que la mutación de este residuo a la alanina suprime completamente la unión. Por lo tanto, una mutación de un solo aminoácido del péptido T A, FAEIPTI (SEQ ID NO: 4), se utilizó como un control de la pérdida de unión.

Ejemplo 12 EBIN inhibe la interacción IP3R3 de EB3 y atenúa el flujo de calcio intracelular en respuesta a los mediadores pro- inflamatorios Para determinar las propiedades inhibidoras de EBIN en células, Monocapas de Células Endoteliales de la Aorta Pulmonar (HPAECs) pre-tratadas con EBIN o con un péptido de control a la concentración de 1 µ? se estimularon con trombina. La interacción entre EB3 y receptor de IP3R3 se analizó utilizando un análisis de Inmunotransferencia . Como se demuestra en la Figura 13, la interacción inducida con trombina y basal atenuado con tratamiento EBIN entre EB3 e IP3R3. Consistentemente con la idea del rol del EB3 en la modulación de la respuesta del IP3R3 a IP3, EBIN inhibió significativamente el flujo de calcio intracelular en respuesta a la trombina e histamina. Las Figuras 14A y 14B demuestran los cambios en la proporción 340/380 (unido con/libre de Fura-2M) en HPAECs pre-tratadas con Myr-EBIN 1 µ? o péptido de control y prueba de provocación con trombina 50 nM o histamina 90 µ?. EBIN aunque no un incremento inducido con agonista mitigado con el péptido de control en el calcio intracelular. El [Ca2+]i transitorio después de la estimulación de monocapas de HPAEC con citocinas pro-inflamatorias.

; Para determinar el efecto del EBIN en el cambio de la forma celular y permeabilidad paracelular, se midió resistencia trans-endotelial de monocapas HPAEC. Las Figuras 15A y 15B demuestran que EBIN, aunque no con un péptido de pérdida de unión, inhibió el cambio de forma celular e hiperpermeabilidad paracelular de monocapas HPAEC en respuesta a los mediadores pro-inflamatorios. Estos resultados demuestran que el efecto protector de barrera del EBI está asociado con la inhibición de la señalización de calcio y cambio de forma celular del endotelio .

Ejemplo 3 EBIN inhibe la producción de NO y vasodilatacion inducida con histamina en ratones .

La actividad de la sintetasa 3 de óxido nítrico (eNOS) , una enzima endotelial específica que produce NO, es regulada por la señalización de calcio, particularmente, a través de la interacción de eNOS con calmodulina, y es una causa conocida de hiperpermeabilidad de la barrera endotelial durante la inflamación. Debido a que EBIN inhibe la señalización de calcio se postuló que el efecto protector de barrera de EBIN, en parte, se debe a la inhibición de la eNOS. Por lo tanto, el efecto del EBIN en la producción basal e inducida con agonistas. La formación de NO se midió utilizando electrodos de NO porfírinicos acoplados a un femtostato FAS1 y una computadora personal con un programa informático electroquímico (Gamry Instruments) . La corriente de electrodos, que es proporcional a la concentración de NO, se midió como una función de tiempo. De modo interesante, EBIN no mostró un efecto en la producción basal de NO, sugiriendo que no inhibe la actividad de eNOS constitutiva. EBIN, sin embargo, la producción de NO inducida con agonistas significativamente atenuada (Figuras 16A y 16B) . Consistentemente con estos resultados, la inyección i.v. de AP-EBIN en ratones no mostró efecto en la presión sanguínea sistólica, sin embargo EBIN inhibió significativamente la vasodilatación inducida con histamina (Figura 17) . Estos datos están de acuerdo con datos obtenidos en los experimentos de cultivos celulares. Estos resultados demuestran que EBIN atenúa la vasodilatación inhibiendo la generación de NO en respuesta a la histamina.

Ejemplo 14 EBIN previene la letalidad en la asepsia inducida con LPS y pérdida vascular después de una anafilaxis.

Se determinó el efecto de EBIN en el índice de mortalidad de la asepsia inducida con LPS. Los ratones recibieron inyección retro-orbital i.v. de AP-EBIN o péptido de control AP, 30 minutos antes de y 1 hr después de la administración de LPS a dosis LD90. Los ratones tratados con EBIN demostraron una denotada mejora en el índice de supervivencia de los grupos de control (Figura 18) . Además, se determinó si el post-tratamiento de EBIN también muestra algún efecto protector. En este experimento, Myr-EBIN se inyectó en la vena de la cola 30 min y 24 hrs después de la prueba de provocación con LPS. Como se muestra en la Figura 19, el posttratamiento con EBIN llevó a una mejora insignificante en el Indice de supervivencia en comparación con el grupo de control (péptido de pérdida de unión) . Consistentemente con los resultados previos con Ap-EBIN, pre-tratamiento con Myr-EBIN demostró un incremento significativo (p<0.05) en el índice de supervivencia (Figura 19) . Se concluye que la administración de EBIN antes de la inflamación sistemica tiene un resultado mucho más benéfico.

La híperpermeabilidad microvascular de las vías respiratorias, el resultado del elevado VEGF en plasma, es uno de los factores críticos que contribuyen a la función anormal de las vías áreas en pacientes con asma clásico y su variante de tos. Debido a la respuesta asmática alérgica aguda principalmente se debe a la hipersensibilidad mediada con IgE, también determinamos si EBIN protege de la pérdida vascular subcutánea después de una reacción anafiláctica mediada con IgE. Las Figuras 20A a 20C muestran que la inyección intravenosa de EBIN aunque no el péptido de control de la pérdida de unión atenúa significativamente la pérdida vascular subcutánea (tamaño e intensidad del área positiva a Evan Blue) en el oído (alta vascularización, figura 20A) y espalda (baja vascularización figura 20B) . Estos datos indican que EBIN podría utilizarse más eficazmente para mejorar la función pulmonar y salud en general de los pacientes con formas crónicas y agudas de asma alérgico, y reducir la repuesta inflamatoria asmática.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. - Un péptido aislado caracterizado porque consiste de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de KFARLWTEIPTAIT (SEQ ID NO: 1), FTEIPTI (SEQ ID NO: 3), un fragmento de la misma, y una variante de la misma. 2. - El péptido de la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido se enlaza a un péptido portador. 3. - El péptido de la reivindicación 2, caracterizado porque el péptido portador es un péptido de antenapedios (??) . 4. - El péptido de la reivindicación 3, caracterizado porque el péptido se trata con miristoilo. 5. - Una formulación farmacéutica caracterizada porque comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y el péptido de la reivindicación 1. 6. - Un método para tratar lesión pulmonar, caracterizado porque comprende administrar a un paciente en necesidad de la misma una composición que comprende el péptido de la reivindicación 1. 7. - El método de la reivindicación 6, caracterizado porque la lesión pulmonar es edema. 8.- El método de la reivindicación 6, caracterizado porque la lesión pulmonar es pérdida vascular mediada con inflamación . 9.- El método de la reivindicación 6, caracterizado porque la lesión pulmonar es asma. 10. - El método de la reivindicación 9, caracterizado porque el asma es asma alérgica. 11. - El método de la reivindicación 10, caracterizado porque el asma es crónica o aguda. 12. - Un método para tratar síndromes de permeabilidad vascular sistémica, caracterizado porque comprende administrar a un paciente en necesidad de la misma una composición que comprende el péptido de la reivindicación 1. 13. - El método de la reivindicación 12, caracterizado porque los síndromes de permeabilidad vascular sistémica se deben a endotoxemia. 14. - El método de la reivindicación 12, caracterizado porque los síndromes de permeabilidad vascular sistémica se deben a un traumatismo. 15. - El método de la reivindicación 12, caracterizado porque la permeabilidad vascular sistémica se deben a transfusiones múltiples. 16. - El método de la reivindicación 12, caracterizado porque los síndromes de permeabilidad vascular sistémica incurren como un efecto secundario de un tratamiento farmacéutico. 17. - El método de la reivindicación 16, caracterizado porque el tratamiento farmacéutico es el uso sistémico de IL-2 para tratar cánceres. 18.- Un método para tratar angioedema, caracterizado porque comprende administrar a un paciente en necesidad de la misma una composición que comprende el péptido de la reivindicación 1. 19.- El método de la reivindicación 18, caracterizado porque el angioedema se selecciona del grupo que consiste de angioedema inducido por alérgenos y angioedema no inducido por alérgenos . 20. - El método de la reivindicación 19, caracterizado porque el angioedema inducido por alérgenos es angioedema laríngeo . 21. - El método de la reivindicación 20, caracterizado porque el angioedema laríngeo después de una alergia por alimentos o envenenamiento por picadura de himenópteros. 22.- El método de la reivindicación 19, caracterizado porque el angioedema no inducido por alérgenos es la deficiencia del inhibidor del factor 1 complementario o angioedema inducido por tinte de contraste para creación de imágenes . , 23.- Un método para tratar la anafilaxis, caracterizado porque comprende administrar a un paciente en necesidad de la misma una composición que comprende el péptido de la reivindicación 1. 24.- El método de la reivindicación 23, caracterizado porque la anafilaxis se selecciona del grupo que consiste de una reacción anafilactoide inducida por alérgenos y no alérgica . 25. - El método de la reivindicación 24, caracterizado porque la reacción anafilactoide no alérgica se debe a un tinte de contraste. 26. - Un método para tratar la congestión nasal asociada con rinitis alérgica o no alérgica, caracterizado porque comprende administrar a un paciente en necesidad de la misma una composición que comprende el péptido de la reivindicación 1. 27. - El método de la reivindicación 26, caracterizado porque la congestión nasal está relacionada con sustancias irritantes o virus respiratorios. 28. - Un péptido aislado caracterizado porque comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, un fragmento de las mismas, y una variante de las mismas. RESUMEN DE LA INVENCIÓN Se proveen en la presente inhibidores de péptidos de la interacción entre la Proteína 3 de Unión de Extremos (EB3) y Receptor de 1, 4, 5-Trifosfato de Inositol Tipo 3 (IP3R3) . También se proveen métodos y materiales para tratar la lesión pulmonar, incluyendo la lesión pulmonar aguda, la cual puede incluir la híperpermeabilidad de vasos pulmonares, pérdida vascular, el desarrollo de edema, asma, anafilaxis, angioedema, síndromes de permeabilidad vascular sistémica, y congestión nasal.