KR102042015B1 - 폐 손상, 천식, 과민증, 혈관 부종, 전신 혈관 투과성 증후군 및 비충혈을 치료하는 펩티드 조성물과 이들로 이러한 질환을 치료하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명에서는 말단 결합 단백질 3(EB3)과 이노시톨(inositol) 1,4,5-트리스 포스페이트 수용체 타입 3(IP₃R₃) 사이의 상호 작용에 대한 펩티드 억제제가 제공된다. 또한, 급성 폐 손상을 포함하는 폐 손상을 치료하기 위한 방법들과 물질들이 제공되어 있다. 폐 손상은 폐 혈관(vessel)의 과투과성, 혈관 누출, 부종의 발생, 천식, 과민증(anaphylaxis), 혈관부종(angioedema), 전신 혈관 투과성 증후군 및 비충혈을 포함할 수 있다.

Description

폐 손상, 천식, 과민증, 혈관 부종, 전신 혈관 투과성 증후군 및 비충혈을 치료하는 펩티드 조성물과 이들로 이러한 질환을 치료하는 방법{Peptide compositions and methods for treating lung injury, asthma, anaphylaxis, angioedema, systemic vascular permeability syndromes and nasal congestion}

본 발명은 염증-매개 혈관 누출(leakage) 및 부종의 발생을 포함하는, 폐 손상을 치료하기 위한 펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 펩티드를 이용하여 천식, 과민증(아나필락시스: anaphylaxis), 혈관부종(angioedema), 전신 혈관 투과성 증후군 및 비충혈(nasal congestion)을 치료하는 방법에 관한 것이다.

미세소관(microtubule:MT) 세포 골격(cytoskeleton)은 내피벽(endothelial barrier) 조절의 중요한 제어-포인트를 제공한다.;그러나, 이러한 주요한 세포 골격 요소의 역할은 활발하게 연구되고 있지 않았다. MT 안정화 약품 탁솔(taxol)은 마우스 모델에서 폐손상을 약화시킨다고 알려졌으며, 이러한 사실은 MT가 폐혈관 투과성(lung vascular permeability)의 증가를 조절하는데 중요하다는 것을 암시하고 있다. 그러나, 탁솔은 의사들과 환자들에게 매우 불편한 약이 될 수 있도록 하는 일반적인 독성을 나타내고 있다.

미세소관 말단(end) 결합 단백질들은 성장 미세소관(MT)들에 결합하고 MT 변재 사건을 억압하는 매우 우수하게 보존된 미세소관 양성-말단(plus-end) 추적 보조 인자(accessory factors)들이다. 두 개의 이러한 말단 결합 단백질들인 EB1과 EB3은, 내피벽의 투과성의 일차 결정 인자들이 되는, 내피 세포 골격의 역동성(dynamics)과 세포 형태 변화를 조절하는데 중요한 역할을 한다.

Ca2+는 내피 투과성과 혈관 항상성(homeostasis)을 조절하는 매우 다목적(versatile) 2차 메신저이다. PAR-1 활성화의 다운스트림(downstream)에서, 포스포리파제(phospholipase) Cβ(PLCβ)의 활성화는 포스포티딜 이노시톨비스포스페이트(PIP2)의 가수 분해를 조정하여 이노시톨(inositol) 1,4,5-트리스포스페이트(IP3)와 디아실글리세롤(DAG)로 변화시킨다. IP3은 IP3-민감성 세포내 저장소, 즉 소포체(endoplasmic reticulum : ER)로부터 Ca2+ 방출을 자극한다. ER 저장소로부터 Ca2+의 결핍(depletion)은 ER 막(membrane)의 IP3R의 활성화에 의해 조정되며, 세포내 Ca2+의 일과성(transient) 증가를 유도하게 된다. Ca2+ 진입(entry) 또는“유입”은 Ca2+ 및 Mg2+를 포함하는 여러 가지 양이온(cations)들에 대해 투과성을 가지는 일과성 수용체 전위 캐노니컬(transient receptor potential canonical)(TRPC) 채널들에 의해 조정된다. TRPC1과 4는 ER의 결핍에 의해 활성화되는 폐 미세혈관 내피 세포들에 저장-작동되는(store-operated) Ca2+ 채널들(SOC)이다.

Ca2+의 세포내 농도 증가는 단백질 키나아제 Cα(PKCα)의 활동을 상향-조절한다(up-regulates). PKCα는 다중 매개체들 2에 대한 내피 투과성 반응의 주요 조절 인자이다. PKCα는 p120-카테닌을 포스포릴화시키고, VE-카데린(cadherin)으로부터 해리를 조절하여, Ve-카데린 내부화(internalization)를 가져오게 된다. PKCα는 또한 p115RhoGEF 및 GDI-1을 포스포릴화시킴으로써(phosphorylate) RhoA 활성화 업스트림(upstream)에 작용한다. 결국, RhoA는 Rho 키나아제(ROCK)를 활성화시킴으로써 마이오신 경쇄 포스파타제(myosin light chain phosphatase)(MLCP)의 포스포릴화-유도 억제를 촉진시킨다. MLCP의 억제는 MLCK의 Ca2+/칼모둘린(calmodulin)-의존 활성화가 수반되며, 이는 MLC의 포스포릴화를 유도하고 트롬빈과 히스타민과 같은 전염증성(pro-imflammatory) 매개체들에 반응하여 악토(acto)-마이오신 수축을 유도하게 된다.

MT 세포 골격의 고유성은 ER 저장소로부터 IP3-유도 Ca2+ 방출을 위해 필요하다. MT 불안정제(destabilizing agent) 또는 MT 안정제 노코다졸(nocodazole), 콜치신(colchicine) 및 탁솔에 의한 MT 역동성의 변경은 Ca2+의 Ip3-게이티드 방출을 억제하며, 이것은 IP3R의 완전 활성화에 대해 MT 역동성이 요구된다는 것을 암시해주고 있다. MT 세포 골격은 ER의 리모델링 내에 포함되며, 이리하여, 외부 자극에 반응하여 기질화(organization) 및 Ca2+ 파의 전파를 보장해 준다. EB1과 EB3가 기질(stromal) 상호 작용 분자 1(STIM1)와 직접적인 상호 작용을 하더라도, ER은 MT 성장 말단들에 대해 부착하여 함께 연장된다. HeLa(HeLa 세포들은 EB3을 발현하지 않는다)내의 EB1의 결핍은 ER 돌출 사건을 감소시키나, 탑시가르긴(thapsigargin)에 의해 SOC의 활성화를 억제하지 않는다. 이것은 몇 개의 다른 메카니즘들이 SOC의 활성화 및 상피 세포내의 칼슘 신호전달체계(signaling)의 전파와 관련된다는 것을 암시해주고 있다. 내피 세포내에서는, 포낭(caveolae) 내의 IP3R의 국부화(localization)가 ER Ca2+ 저장소 결핍과 SOC 활성화 모두를 위해 중요하다. 이것은 IP3R의 활성화 및/또는 IP3에 대한 반응성은 칼슘 신호전달체계의 중요 요소라는 것을 나타내고 있다. MT 세포 골격이 IP3에 반응하여 IP3R 활성화를 적극적으로 조절하고 세포를 통해 세포 외부의 신호들을 전달하게 된다. 그러므로, 생리적 반응을 유발시킨다.

상기 진보된 미국 내의 지지적 치료에도 불구하고, 약 100,000명의 환자들이 해마다 급성 폐손상(ALI), 호중성 백혈구 침윤(neutrophil infiltration) 및 사이토 카인(cytokine)의 방출과 관련된 복합 염증성 반응 및 폐혈증 동안 전염증성 매개체들에 의해 죽어간다. 질병의 특징이 되는, 폐 혈관의 과투과성은 폐 부종 형성을 유도한다. 새로운 치료법들이 내피 장벽의 기능 상실을 예방하거나 치료하기 위해 필요하다.

본 발명에서 제공되는 것은 단리된 펩티드(isolated peptide)이다. 이 펩티드는 KFARLWTEIPTAIT(SEQ ID NO:1), FTEIPTI(SEQ ID NO:3), 그의 프래그먼트, 또는 그의 변종을 포함할 수 있다. 또한, 이 펩티드는 KFARLWTEIPTAIT(SEQ ID NO:1), FTEIPTI(SEQ ID NO:3), 그의 프래그먼트, 또는 그의 변종으로 구성될 수 있다. 상기 변종은 보존성 치환체(substitution)를 포함할 수 있다. 그 변종은 Ser/Thr-x-ILe-Pro 서열, 최소 EB 결합 공통 모티프(consensus motif) 서열을 포함하는 어느 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 펩티드는 미리스토일화(myristoylated) 되거나 또는 캐리어 펩티드에 링크될 수 있다. 캐리어 펩티드는 안테나페디아(antennapedia) 펩티드(AP)가 될 수 있다. 펩티드는 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있는, 약학적 제제(formulation)의 한 부분이 될 수 있다.

또한, 여기에서는 상기 펩티드를 포함하는 조성물을 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 폐손상 치료 방법이 제공된다. 폐손상은 부종(edema), 염증-매개(mediated) 혈관 누출, 또는 천식이 될 수 있다. 천식은 알레르기성 천식이 될 수 있다. 알레르기성 천식은 만성이거나 또는 급성일 수 있다.

또한, 여기에서는 상기 펩티드를 포함하는 조성물을 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 전신 혈관 투과성 증후군의 치료방법이 제공된다. 이 증후군은 내독소혈증(endotoxemia), 트라우마(trauma) 또는 다중(multiple) 수혈에 의해 발생될 수 있다. 이 증후군은 또한 약물치료의 부작용으로 발생할 수 있으며, 이 약물 치료는 암을 치료하기 위해서 IL-2의 전신적 사용(systemic use)이 될 수 있다.

또한, 여기에서는 상기 펩티드를 포함하는 조성물을 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 혈관부종(angioedema) 치료 방법이 제공된다. 혈관부종은 알레르겐-유도성 혈관부종 또는 비알레르겐(non-allergen)-유도성 혈관부종이 될 수 있다. 알레르겐-유도성 혈관부종은 후두(laryngeal)의 혈관부종이 될 수 있으며, 후두의 혈관부종은 음식 알레르기 또는 막시류 스팅 유독동물성 중독증(hymenopteran sting envenomation)에 의해 발생될 수 있다. 비알레르겐-유도성 혈관부종은 보체 인자(complement factor) 1 억제제 결핍 또는 촬상 콘트라스트 염료-유도성 혈관부종이 될 수 있다.

또한, 여기에서는 상기 펩티드를 포함하는 조성물을 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 아나필락시스(anaphylaxis) 치료 방법이 제공된다. 아나필락시스는 알레르겐-유도성 및 비알레르겐-유도성 과민성 유사반응(anaphylactoid)이 될 수 있다. 비알레르겐-유도성 과민성 유사반응은 콘트라스트 염료에 의해 발생될 수 있다.

또한, 여기에서는 상기 펩티드를 포함하는 조성물을 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 전신 혈관 투과성 증후군을 치료하는 치료 방법이 제공된다. 전신 혈관 투과성은 내독소혈증(endotoxemia)과 관련될 수 있다.

또한, 여기에서는 상기 펩티드를 포함하는 조성물을 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 비충혈 치료 방법이 제공된다. 비충혈은 알레르기성 또는 비알레르기성 비염과 관련될 수 있다. 비충혈은 자극제 또는 호흡기 바이러스와 관련될 수 있다.

아래에 기재되는 방법들과 물질들은 세포 형태의 변화와 관련되는 증가된 내피 투과성 반응을 완화할 수 있다. 그러므로, 폐의 염증 매개 혈관 누출(vascular leakage) 및 패혈증, 아나필락시스 반응 또는 급성(acute) 면역 반응과 관련되는, 어느 기관의 부종 또는 부종의 발생을 포함하는 폐손상의 치료에 유효하다. 상기 방법들과 물질들은 또한 만성 염증, 암, 천식 및 아테롬성신생(artherogenesis)과 같은 병리학적인 진행 동안에 만성적인 혈관 누출을 약화시키기 위해 사용될 수 있다.

도 1은, EB3의 결핍이 프로테아제-활성 수용체 (PAR)-1의 활성화에 반응하여 저장소로부터 Ca²⁺ 방출을 억제하는 것을 도시한 도면이다.
A. EB1, EB3와 루시페라아제에 대해 shRNA를 발현하는 HMVEC는 후라(Fura) 2-AM으로 로드되었으며, 340(Ca²⁺-결합)후라/380(자유 후라) 비율은 세포 외부의 Ca²⁺의 부존재(-[Ca²⁺]₀)와 존재(1.5mM[Ca²⁺]₀) 상태에서 트롬빈(50nM)에 의한 세포의 자극 이후에 연산되었다. 화살표는 트롬빈 추가 시간. EB3의 삭제는 세포내 Ca²⁺ 농도의 증가를 현저하게 감소시켰다. B. 기초값에 대한 최대 증가로서 연산된 트롬빈-유도 Ca²⁺ 방출 및 유입에 대한 평균±SD를 도시하고 있다. 그 증가는 동일한 커버 슬립(coverslip : n=9)으로부터 대조(control) 비감염된 세포들에 대해 정규화됐다.
도 2는 폐 염증과 관련하여 IP3R3 및 TRPC1과 EB3와의 상호 작용을 나타내고 있다. WT와 TLR4 KO 마우스는 그램(Gram)-네가티브 박테리아의 외부막의 성분이 되는, 엔도톡신(endotoxin) 리포폴리사카라이드(LPS)의 10mg/kg 몸무게로 단일 복막내 주입(i.p.)을 받게 되었다. 이러한 주입은 포유류에서 강한 면역 반응을 유발하게 된다. 폐는 지시된 시간에 단리되었다. EB3은 완전체 폐(whole lung)의 균질액(homogenates)으로부터 IP되었다(IP'ed). 얻어진 침전물들은 TRPC1, IP₃R₃ 및 EB3에 대해서 조사되었다. TLR4(LPS 수용체)의 삭제는 TRPC1과 EB3의 상호 작용을 변경시킨다는 것을 주목한다. 그것은 또한, IP₃R₃에 대한 결합의 증가를 방지한다. TLR4^-/- 폐의 IP₃R₃에 결합되는 EB3은 WT와 비교될 수 있다. 데이터는 2개의 독립된 실험들을 나타낸다.
도 3은, EB 결합 모티프(붉은 색으로 표시)와 인체의 IP₃ 수용체(IP3R 타입 3의 794-814 aa)의 정렬을 도시한 도면이다. IP₃R₃ 펩티드(SEQ ID NO:1)는 아래 초록색으로 표시되어 있다.
도 4는, EB3의 구조(자홍색)의 리본 표시를 나타내고 있으며, EB3의 EB3 소수성 결합 홈(groove)에 도크된(docked); 180°회전으로 도시된 IP₃R₃ 파생(derived) 펩티드(SEQ ID NO:1)(초록 볼 및 막대)가 도시되어 있다. IP₃R₃ 파생 펩티드는 디스커버리 스튜디오 3.0 소프트웨어와 함께 Z-도크 프로그램을 이용하여 도크되었다(docked). 펩티드와 EB3 사이의 결합 에너지는 -68.882kcal/mol로 연산되었다.
도 5는, IP₃R₃ 펩티드(SEQ ID NO:1)가 PAR-1 활성화에 반응하여 ER로부터의 Ca²⁺ 방출을 억제하는 것을 도시한 도면이다. A. AP-부착 IP₃R₃ 펩티드 또는 대조 (AP) 펩티드로 사전 처리된 HMVEC는 후라 2-AM으로 로드되었으며 340/380 비율은 세포 외부의 Ca²⁺의 부존재와 존재 상태에서 트롬빈(50nM)에 의한 세포의 자극 이후에 연산되었다. 화살표는 트롬빈 추가 시간. B. 기초값에 대한 최대 증가로서 연산된 트롬빈-유도 Ca²⁺ 방출 및 유입에 대한 평균±SD를 도시하고 있다. 그 증가는 동일한 실험(n=4)으로부터 대조 처리되지 않은 세포들에 대해 정규화됐다.
도 6은, IP₃R₃ 펩티드(SEQ ID NO:1)가 탈체 폐 프레퍼레이션(preparations) 내의 EB3과 IP₃R₃ 사이의 상호 작용을 억제하는 것을 도시한 도면이다. 단리된 폐는 20분 동안 평형 관류(equilibrium perfusion)를 거쳤으며, 그 후에 30분 동안 10μm의 AP-IP₃R₃ 펩티드로 관류되었다. 5분 후에, 30μM PAR-1의 길항제 펩티드 TFLLRN-NH2(PAR-1 a.p.)가 20분 동안 주입되었다(그룹 IP₃R₃ + PAR-1). 다른 그룹에는 단지 30μM PAR-1의 길항제 펩티드가 주입되었다(그룹 PAR-1). 그 이후에 폐들은 EB3/IP₃R₃ 상호 작용에 대한 IP₃R₃ 펩티드의 영향을 판단하기 위해서 사용되는 폐 균질액(homogenate)을 준비하기 위해 사용되었다. EB3은 특정 항체에 의해 면역침강 되었다(immunoprecipitate). 그리고 최종 침전물은 EB3와 IP₃R₃와 관련되어 조사되었다. PAR-1 수용체의 활성화는 베이스 레벨(대조 그룹)과 비교하면 EB3/IP₃R₃ 상호 작용(그룹 PAR-1)을 현저하게 증가시키며, 반면에 IP₃R₃ 펩티드의 관류는 활성화된 폐의 미세혈관계에서 이러한 상호 작용을 억제한다는 것을 주목하자.
도 7은, IP₃R₃ 펩티드(SEQ ID NO: 1)가 PAR-1 활성화에 반응하는 폐혈관 투과성( K _f,c , 미세혈관계의 여과 계수)의 증가를 완화시키는 것을 도시하고 있다. 탈체의 폐 프레퍼레이션은 20분 동안 평형 관류를 거쳤으며, 그 후에 30분 동안 10μm의 AP-IP₃R₃ 펩티드로 관류되었다. 5분 후에, K _f,c 를 측정하기 이전에, 30μM PAR-1의 길항제 펩티드 TFLLRN-NH2(PAR-1 a.p.)가 20분 동안 주입되었다. 각 그룹에 대해 n=3-5. 분산 분석(ANOVA)에 의한 막대들±SD *p<0.05. AP-IP₃R₃로 관류된 폐의 PAR-1 활성화에 반응하는 혈관 투과성에 있어서는 현저한 변화가 없다는 것을 주목한다.
도 8은, IP₃R₃ 펩티드(SEQ ID NO: 1)가 LPS-유도성 염증과 관련하여 폐의 호중성 백혈구의 침윤을 완화시키는 것을 도시한 도면이다. 마우스는 LPS(30mg/kg 몸체 무게; E.Coli LPS 0111:B4; LD50 투여)의 단일 i.p. 주입을 받았다. 그리고, 2시간과 6시간의 시점에서 분석을 위해 이용되었다. 폐들은 PBS로 관류되었으며, 무게가 측정되고, 냉동되어, 폐의 미엘로페록시다아제(myeloperoxidase)(MPO) 활동, 즉 폐의 폐 호중성 백혈구(PMN)의 측정을 위해 이용되었다. n=6 마우스/그룹.
도 9는, IP₃R₃ 펩티드(SEQ ID NO: 1)가 LPS-유도성 폐혈증의 치명성을 방지하는 것을 도시한 도면이다. LPS 주입 이전에 IP₃R₃ 펩티드로 처리된 마우스는 LD50- (30mg/kg LPS, A) 및 LD90-공격된(challenged) (50mg/kg LPS, B) 대조 마우스에서의 사망률 감소를 나타낸 것을 도시한 도면이다. (n=11-15 마우스/그룹, ANOVA에 의한 p<0.001 AP-IP₃R₃ 대 대조 처리(AP 대조). IP₃R₃의 레트로-오비탈(retro-orbital) i.v 주입 이전에, 마우스는 케타민 10mg/ml; 자일라진(xylazine), 0.25mg/ml 및 아세프로마진 0.25mg/ml의 혼합물에 의해 마취되었다.
도 10은, IP₃R₃ 펩티드(SEQ ID NO: 1)가 다균성의 패혈증의 치명성을 방지하는 것을 도시한 도면이다. CLP 이후 120시간 구간에서 IP₃R₃ 펩티드로 처리된 마우스는 사망률 감소를 경험했다. 6-8주의 CD-1 마우스에게는 CLP 수술 전 30분과 CLP 수술 후 24시간 및 48시간에 IP₃R₃ 펩티드(1μM/kg 몸체 무게)로 i.v. 주입되었다. 맹장은 중간 위치에서 결찰되었다(ligated). 그리고 맹장의 내용물은 부드럽게 말단부(distal part)로 이동되었다. 맹장은 결찰과 맹장 끝 부분 사이 중간에서 창자간막(mesentric)-안티창자간막(anti-mesentric) 방향으로 16 게이지 바늘에 의해 천공되었다. 적은 양의 배설물은 창자간막(mesentric)과 안티창자간막(anti-mesentric) 관통 구멍으로부터 배출되었다. 허위 대조(sham control)에서는, 단지 개복수술(laparotomy)이 실행되었다. 마우스는 마취되었다. 생존은 대조(n=10 마우스/그룹)에 비해 IP₃R₃ 펩티드 그룹에서 현저하게 더욱 높았다. 사망률의 차이는 로그-랭크(log-rank) 실험(p<0.05)에 의해 평가되었다.
도 11은, 마우스 생존에 대한 IP₃R₃ 펩티드 투여-반응을 도시한 도면이다. 지시된 투여량의 IP₃R₃ 펩티드로 처리된 CD-1 마우스에는 LD80 투여량으로LPS(50mg/kg LPS)가 i.p. 주입되었다. 그리고 5일 동안 감시되었다. 생존율(%)은 로그 스케일에 따라 펩티드 양에 대해 도시되었다. S자형의 투여-반응 곡선은 데이터 포인트에 일치되었다. n=10 마우스/그룹. 마우스는, 펩티드의 레트로-오비탈 주입 이전에, 마취 유도실의 실내 공기 중에서 2.5% 이소플루란(isoflurane)을 가지는 마취되었다. 동축관(coaxial tube)을 가지는 특별히 설계된 설치류(rodent) 얼굴 마스크(하바드 장치, AH72-3026)를 이용하여 i.v. 주입 동안에 마취는 그대로 유지되었다.
도 12는, EBIN(SEQ ID NO:3)(녹색 막대) 및 IP₃R₃ 펩티드(노락 막대)(SEQ ID NO:1)를 함유하는 복합물 내의 EB3(자홍색)의 리본 표현(ribbon representation)을 도시한 도면이다. 연산된 결합 에너지는 IPR과 EBIN에 대해서 각각 -68.882와 -60.251이다.
도 13은, EBIN(SEQ ID NO:3)이 IP₃R₃와 EB3 사이의 상호 작용을 억제하는 것을 도시한 도면이다. 1μM AP-EBIN 또는 대조 펩티드(AP)로 전처리된 HPAEC는 50nM 트롬빈에 의해 공격되었다. IP₃R₃와 EB3 사이의 상호 작용은 트롬빈 자극 이후에 다른 시간-포인트들에서 분석되었다. EB3은 특정한 Abs로 면역침강 되었으며, 최종 침전물은 IP₃R₃ 및 EB3에 대해서 조사되었다. EBIN은 트롬빈 치료 이후에 그리고 기본 단계에서 EB3-IP₃R₃ 상호 작용을 현저하게 감소시켰다.
도 14는, Myr-EBIN(SEQ ID NO:3)이 세포내 칼슘의 길항제-유도성 증가를 완화시키는 것을 도시한 도면이다. 50nM 트롬빈(A) 또는 90μM 히스타민(B)에 의해 HPAEC 단층들(monolayers)의 자극(stimulation)이 된 이후에 [Ca²⁺]i 일과성(transient). 평균값; n=20 세포들. 화살표, 자극 시간. EBIN(청색 트레이서: blue tracer)은 대조 펩티드(결합의 손실 : FAEIPTI(SEQ ID NO:4)) 처리된 세포들(빨간 트레이서들) 내의 [Ca²⁺]i 일과성(transient)을 현저하게 감소시켰다는 것을 주목한다.
도 15는, EBIN(SEQ ID NO:3)이 길항제-유도성 내피 경세포(paracellular) 과투과성을 약화시키는 것을 나타내는 도면이다. 50nM α-트롬빈(A) 또는 50μM 히스타민(B)에 대해 반응하여 나타나는 HPAEC 단층들의 경내피(transendothelial) 전기 저항(TER)의 변화들이 도시되어 있다. TER 값들은 베이스라인 저항에 대해 정규화되었다. 대조 펩티드로 처리된 세포들에서 관찰되는 바와 같이(청색 표시) Myr-EBIN(빨간 표시)은 세포 형태 변화와 경세포 과투과성을 방지하였다.
도 16은, EBIN(SEQ ID NO:3)이 길항제-유도성 NO 생성을 억제하는 것을 도시한 도면이다. HPAEC는 대조 펩티드(활동의 손실) 또는 Myr-EBIN 및 베이스(basal)(A, L-아르기닌의 첨가에 대한 반응)에 의해 사전 처리되었다. 작용제-유도성(B, 트롬빈 및 히스타민) NO 생성은 최초의 20분 자극 동안에 측정되었다. EBIN은 베이스(basal) NO 레벨에는 영향을 끼치지 않았으나, 작용제-유도성 NO를 약화시켰다. *,p<0.01 및 **, p<0.01.
도 17은, EBIN(SEQ ID NO:3)이 생체 내부의 히스타민-유도성 혈관 확장을 방지하는 것을 도시한 도면이다. 마우스의 어웨이크(Awake) 혈압 측정-마우스는 마취되고 동맥(경동맥) 및 정맥(외부 경정맥 : external jugular) 카테터의 배치를 위해 외과 수술 형태로 준비되었다. 수술 한 시간 후에 혈압은 압력 트랜스듀서를 이용하여 직접 감시되었다. 그 뒤에 이어진 AP-EBIN 펩티드(1μM/kg 몸체 무게: 초록색) 또는 대조 AP 펩티드(빨간색) 및 히스타민(10mg/kg 몸체 무게)의 정맥(i.v.) 주입은 경정맥 카테터를 통해 실행되었다. ;화살표는 주입 시간을 나타낸다. EBIN은 베이스라인 혈압에 영향을 끼치지 않으며 히스타민에 반응하는 혈압 강하를 방지한다는 것을 주목한다. n=6 마우스/그룹.
도 18은, EBIN(SEQ ID NO:3)이 LPS-유도성 폐혈증으로부터 발생되는 치명성을 방지하는 것을 도시한 도면이다. EBIN으로 처리된 마우스는, LD90 투여량(50mg/kg E.Coli LPS 0111:B4)으로 LPS의 주입 이후에, 120시간 구간 동안에 사망률 감소를 경험하게 된다. 수컷 CD1 마우스는 LPS의 LD90 투여량의 복강내(i.p.) 주입에 의해 공격되었다. 실험 및 대조군들은 세포 투과성(permeant) 안테나페디아(antennapedia) 펩티드(AP)의 C-말단(terminus)에 부착된 EBIN 또는 AP 단독의 1μM/kg의 농도로 레트로-오비탈, 정맥(i.v.) 주입받았다. 마우스에게는 3번 주입되었다. 즉, LPS 투여 30분 이전에, 그리고 이후에 1시간과 24시간에서 주입되었다. 마우스는 레트로-오비탈 주입 이전에 케타민(10mg/ml), 자일라진(xylazine : 0.25mg/ml) 및 아세프로마진(acepromazine : 0.25mg/ml)의 혼합물에 의해 마취되었다.
도 19는, LPS-유도성 폐혈증으로부터 발생되는 치명성에 대해서, EBIN(SEQ ID NO:3)에 의한 사전 및 사후 처리 효과를 비교한 도면이다. EBIN으로 처리된 마우스는, LD90 투여량((50mg/kg E.Coli LPS 0111:B4)으로 LPS의 주입 이후에, 120시간 구간 동안에 사망률 감소를 경험하게 된다. 수컷 CD1 마우스는 LPS의 LD90 투여량의 복강 내부(i.p.) 주입에 의해 공격되었다. 실험 및 대조군들은 LPS 30분 이전(사전 처리) 또는 LPS 30분 이후(사후 처리)에 Myr-EBIN 또는 Myr-대조 펩티드 결합 손실(Myr-control loss-of-binding peptide)의 1μM/kg의 농도로 꼬리 정맥(tail vein)(i.v.) 주입받았다. 사전 처리 그룹의 마우스에게는 3번 주입되었다. 즉, LPS 투여 30분 이전에, 그리고 LPS 투여 이후에 1시간과 24시간에서 주입되었다.; 대조군의 마우스에게는 2번 주입되었다. LPS 투여 이후에 30분과 24시간에서 주입되었다. 마우스는 레트로-오비탈 주입 이전에 케타민(10mg/ml), 자일라진(0.25mg/ml) 및 아세프로마진(0.24mg/ml)의 혼합물에 의해 마취되었다. EBIN에 의한 사후 처리는 생존률의 개선을 나타냈으나, 현저한 생존률은 나타내지 못했다.
도 20은, EBIN(SEQ ID NO:3)이 IgE-매개 과민성 반응에 따르는 피하 혈관 누출을 방지하는 것을 도시한 도면이다. IgE-HSA를 마우스의 귀(A)와 등(B)에다 피부 내부를 통해 주입하였다. 그리고 24시간 이후에 에반스 블루(Evans Blue)와 HSA(1-3) 또는 염류 용액(saline)(4-5)의 iv 주입이 이루어졌다. HSA 주입 30분 이전에, 그룹 1과 4는 염류 용액을, 2는 대조 펩티드(결합의 손실)를 3과 5는 Myr-EBIN iv 주입(1μm/kg)을 받았다. HSA의 주입은 국부 혈관 누출을 가져오며, 그 누출은 EBIN(그룹 3)에 의해 현저하게 약화되었다는 것을 주목한다. C. 막대기 표시는 에반스 블루의 혈관 누출을 나타낸다. 에반스 블루는 귀 조직으로부터 추출되었다. 에반스 블루 농도는 λ=620nm에서 측정되었으며, 조직 무게로 정규화되었다. *,p<0.05, n=6 마우스/그룹.
도 21은, 내피 장벽의 염증-유도성 과투과성에 있어서 EB3의 역할을 도시한 도면이다. EB3은 IP₃R₃와 성장하는 MT 말단들과의 일과성 상호작용을 설정하며, IP₃R₃를 IP₃에 대해 민감하게 만들며(sensitizes), 염증이 있는 동안에 저장소로부터 Ca²⁺ 방출과 SOC-의존 Ca²⁺ 진입(entry) 모두를 적극적으로 조절한다. 이것은 Ca²⁺ 신호전달체계 증폭과, p120-카테닌의 PKCα-매개 인산화(phosphorylation)와 악토-마이오신 수축성을 통한 투과성의 증가를 초래한다.

본 발명자들은 놀라운 발견을 하였다. 즉, 이노시톨(inositol) 1,4,5-트리스 포스페이트(IP3) 수용체 타입 3(IP₃R₃)의 EB3-상호 작용 영역(domain)으로부터 파생되는 펩티드들은 말부 결합 단백질 3(EB3)과 IP₃R₃과의 상호 작용을 감소시키고, 세포 형태 변화들과 관련된 내피 투과성 반응의 증가를 완화시킨다는 발견을 하였다.

아래에 제시된 실시예들에 근거하고 있으나, 이론에 의해 구애 받지 않으며, 내피 장벽 염증-유도성 과투과성에 있어서의 EB3의 역할은 성장하는 MT 말단들과 IP₃R₃와의 일과성 상호 작용을 설정하는 기능에 중점을 둔다. 결과적으로, EB3는IP₃R₃를 IP3에 대해 민감하게 만들며(sensitizes), 소포체(ER)로부터의 Ca²⁺ 방출을 적극적으로 조절한다. 이에 의해 SOC-의존 Ca²⁺ 진입(entry)과 Ca²⁺ 신호전달체계의 증폭이 이루어진다. 시토졸(cytosolic) Ca²⁺의 농도 증가는 p120 카테닌의 PKCα-조절 인산화(phosphorylation)를 유도하며, 그로 인해 VE-카데린(cadherin) 부착의 분해가 일어난다. 그것은 또한 RhoA-의존 악토-마이오신 수축성(contractability)을 촉진하며 그 결과, 세포 형태 변화가 이루어진다. 도 21을 참조하시기 바랍니다.

1. 정의들

여기에서 사용되는 용어는 단지 특정한 예시들을 기재하기 위해 사용되며 제한되지는 않는다. 첨부된 청구항들과 명세서에서 사용되는 바와 같이, “하나”, “그리고” 및 “그”는 문맥상에서 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수를 지시하게 된다.

여기에 기재된 수치 범위의 인용에 대해서는, 동일한 정밀도를 가지는 각각의 중간 수치는 충분히 고려된 것이다. 예를 들면, 6-9의 범위에 대해서는, 7과 8은 6과 9에 추가되는 것으로 고려된다. 6.0-7.0의 범위에 대해서는, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 및 7.0의 수치가 명백하게 고려된다.

a. 프래그먼트(fragment)

여기에서 사용되는 "프래그먼트“는 기준 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 핵산 서열의 한 부분을 의미할 수 있다.

b. 동일

여기에서 두 개 이상의 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열에 관련해서 사용되는“동일하다” 또는 “동일”은, 서열들이 특정한 영역상에서 동일하며 특정한 비율의 잔기(residues) 또는 뉴클레오티드를 가진다는 것을 의미할 수 있다. 두 개의 서열들을 최적으로 정렬하고, 두 개의 서열들을 특정한 영역상에서 비교하고, 동일한 잔기가 두 개의 서열 내에서 발생하는 위치들의 개수를 결정하여 매칭(matching) 위치들의 개수를 산출하고, 특정한 영역상에서 위치들의 총 개수만큼 매칭위치의 개수를 분할하고, 그 결과를 100을 증배하여 서열 동일성 비율을 산출하여, 상기 특정한 비율이 계산된다. 두 개의 서열들이 서로 다른 길이를 가지거나, 또는 그 정렬이 한 개 이상의 지그재그(staggered) 형태의 말단들을 생성하고, 상기 특정한 비교 영역이 단지 단일한 서열을 가지고 있는 경우에는, 단일한 서열의 잔기들은 계산 분모에 포함되고 분자에는 포함되지 않는다.

c. 펩티드

여기에서 사용되는 "펩티드“ 또는”,“폴리펩티드”는 아미노산의 연쇄 서열을 언급하며 자연적이고, 합성적이며, 또는 변형(modification) 또는 자연 및 합성의 결합을 의미할 수 있다.

d. 실제적으로 동일

여기에서 사용되는“실제적으로 동일”이라는 용어는 제 1과 제 2단백질 또는 뉴클레오티드 서열이 6-100 또는 그 이상의 아미노산 뉴클레오티드의 영역에서 최소한 50-99%가 동일하다는 것을 의미한다.

e. 치료하다

“치료함”,“치료”또는“치료하다”는 각각 증상의 발생, 임상학적 징후, 또는 일시적 또는 영구적인 상태의 질환 또는 장애의 근본적인 병리 상태를 경감, 억제(suppress), 억압(repress), 제거, 예방 또는 지연시킨다는 것을 의미한다. 질환 또는 장애를 예방한다는 것은 본 발명의 작용제를 질병의 발생 이전에 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 질환 또는 장애를 억제하는 것은, 질환 또는 장애의 임상학적인 증상이 나타나기 이전이 아니라, 질환 또는 장애의 유발(induction) 이후에 대상에게 본 발명의 작용제를 투여하는 단계를 포함한다. 질환 또는 장애를 억제한다는 것은 질병의 임상학적 증상 이후에 대상에게 본 발명의 작용제를 투여하는 단계를 포함한다.

f. 변종(variant)

"변종“은 아미노산의 삽입, 삭제 또는 보존성 치환(conservative substitution)에 의해 아미노산 서열이 다르나, 최소한 한 개의 생물학적인 활동을 유보하고 있는 펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. “생물학적 활동”의 대표적인 보기들은 말단 결합(End Binding) 단백질, 톨-유사 수용체(TLR)에 결합되고 특정 항체에 의해 결합되는 기능을 포함한다. 변종은 또한 최소한 한 개의 생물학적 활동을 보유하고 있는 아미노산 서열을 가지는 기준 단백질과 실제적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 아미노산의 보존성 치환, 예를 들면, 아미노산을 유사한 성질(예를 들면, 친수성, 대전 영역(charged region)의 정도 및 분포)의 다른 아미노산으로 대체하는 것은 종래의 기술에서 사소한 변화를 전형적으로 포함하는 것으로 인식된다. 이러한 사소한 변화들은 종래의 기술에서 이해되는 바와 같이, 아미노산의 수치료 지수(hydrophatic index)를 고려함으로써 부분적으로 파악될 수 있다. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157: 105-132(1982). 아미노산의 수치료 지수는 소수성(hydrophobicity)과 전하를 고려하여 결정되는 것이다. 유사한 수치료 지수를 가지는 아미노산들은 치환되어도 여전히 단백질 기능을 보유할 수 있다는 것은 종래의 기술에서 알려져 있다. 한 양태에서는, ±2의 수치료 지수를 가지는 아미노산들은 치환된다. 아미노산의 친수성(hydrophilicity)은 또한 생물학적 기능을 가지는 단백질을 생성하는 치환을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 펩티드와 관련하여 아미노산의 친수성을 고려하면, 그 펩티드의 가장 큰 로컬 평균 친수성, 즉 항원성(antigenecity) 및 면역원성(immunogenecity)과 상당히 상관관계를 가진다고 보고되어 있는 유용한 측정 항목의 연산이 가능하다. 미국 특허 번호 제 4,554,101호는 여기에서 참조로 그 명세서가 포함되어 있다. 종래의 기술에서 이미 알려진 바와 같이, 유사한 친수성 수치를 가지는 아미노산의 치환은 생물학적 활동, 예를 들면 면역원성을 가지는 펩티드를 생성할 수 있다. 치환은 각각의 ±2의 범위내에서 친수성 수치를 가지는 아미노산들에 의해 실행될 수 있다. 아미노산의 소수성 지수 및 친수성 수치는 그 아미노산의 특정한 측쇄(side chain)에 의해 영향을 받는다. 소수성, 친수성, 전하, 크기 및 다른 특성에 의해 밝혀진 바와 같이, 상기 관찰에 의하면, 생물학적인 기능과 양립하는(compatible) 아미노산 치환들은 아미노산의 상대적 유사성, 그리고 특히 그 아미노산들의 측쇄들에 의해 영향을 받는다.

2. 펩티드

여기에서 주어진 것은 펩티드이며, 아미노산 서열 KFARLWTEIPTAIT(SEQ ID NO:1), KFARLWAEIPTAIT(SEQ ID NO:2)(또한 여기에서는 IP₃R₃ 펩티드라고도 부른다), FTEIPTI(SEQ ID NO:3)(또한 말단 결합 억제 펩티드 또는“EBIN"으로도 부른다), 본 명세서 표 3에 기재된 펩티드, 그의 프래그먼트, 또는 그의 변종을 포함하는 펩티드가 제공되고 있다. 변종은 보존성 치환을 포함할 수 있다. 펩티드는 IP₃R₃의 EB 결합 공통 서열, 또는 그의 프래그먼트와 같은, EB 결합 공통 모티프(binding consensus motif) 서열을 포함할 수 있다. IP₃R₃의 EB 결합 공통 서열은 Ser/Thr-x-Ile-Pro가 될 수 있다. 펩티드는 KFARLWTEIPTAIT(SEQ ID NO:1), KFARLWAEIPTAIT(SEQ ID NO:2), FTEIPTI(SEQ ID NO:3), Ser/Thr-x-Ile-Pro를 포함하는 공통 서열, 표 3에 기재된 펩티드, 상기 기재된 프래그먼트, 또는 상기 보존성 변종으로 구성될 수 있다. 변종은 Ser/Thr-x-Ile-Pro 서열을 포함하는 어느 펩티드 서열, 즉 최소 EB 결합 공통 모티프 서열을 포함할 수 있다.

펩티드는 캐리어(carrier) 펩티드와 같은, 또 다른 펩티드에 대해 접합되거나(conjugated), 미리스토일화(myristoylated) 되거나 또는 연결될 수 있다. 펩티드는 안테나페디아 펩티드(antennapedia peptide)가 될 수 있다.

3. 치료의 방법들

여기에서는 폐 손상을 치료하는 방법이 제공되어 있다. 폐 손상은 폐렴이 될 수 있다. 폐렴은 염증 매개 혈관 누출 및/또는 부종의 발생이 될 수 있다. 폐 손상은 급성 폐 손상일 수 있다. 폐 손상은 또한 천식 환자에게서 관찰되는 바와 같이 만성 혈관 누출이 될 수 있다. 치료는 만성 혈관 누출을 약화시킬 수 있다. 폐 손상은 내독소혈증(endotoxemia)의 경우와 같이, 전신 혈관 투과성을 포함하는, 폐 혈관의 과투과성(hyperpermeability)이 될 수 있다. 폐 손상은 패혈증, 염증, 심각한 다중 트라우마, 침/위 내용물의 흡입, 흡인(aspiration) 폐렴, 충격, 익사 사고, 다중 수혈, 유해한 또는 자극적인 연기의 흡입, 아테롬성신생(artherogenesis), 기계적인 손상(환기-유도성 손상), 또는 방사능 노출이 될 수 있다. 여기에서 제공되는 것은 또한 천식을 치료하고/또는 천식 환자의 폐 기능과 전반적인 건강 상태를 개선하는 방법이다. 천식은 알레르기성 천식일 수 있으며, 만성 또는 급성일 수 있다. 여기에서는 알레르겐-유도성 과민증(anaphlyaxis)과 같은 과민증 및, 콘트라스트 염료(contrast dye)과 같은, 비알레르기성 과민성 유사반응을 치료하는 방법이 제공된다. 게다가, 여기에서는 후두부(laryngeal) 부종과 같은 알레르겐 유도성 혈관부종(angioedema)을 포함하는 혈관부종을 치료하는 방법이 제공된다. 후두부 부종은 음식 알레르기 또는 막시류 스팅 유독동물성 중독증(hymenopteran sting evenomation)에 의해 발생될 수 있다. 혈관부종은 보체 인자(complement factor) 1 억제제 결핍 또는 촬상 콘트라스트 염료에 의해 유도되는 과민성 유사반응과 같은, 비알레르겐(non-allergen)에 의한 혈관부종이 될 수 있다.

여기에서 제공되는 것은 전신 혈관 투과성 증후군을 치료하는 방법이 제공된다. 증상들은 내독소혈증, 트라우마, 또는 다중 수혈이 될 수 있다. 그 증후군들은 또한, 약물 치료의 부작용으로서 발생될 수 있다. 약물 치료는 암을 치료하기 위해 IL-2의 전신 사용이 될 수 있다. 또한 여기에서 제공되는 것은 비충혈(nasal congestion)을 치료하는 방법이다. 충혈은 알레르기성 또는 비알레르기성 비염(rhinitis)과 연관될 수 있다. 충혈은 자극제와 관련되거나 또는 호흡기 바이러스와 관련될 수 있다.

본 방법은 펩티드의 치료학적 유효량을 포함하는 조성물을 포유류에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 그 조성물은 약학적 제제(formulation)가 될 수 있다. 펩티드를 포함하는 그 조성물은 폐 손상을 치료하는데 유용한 한 개 이상의 다른 펩티드, 화합물들 및/또는 약학적 조성물들과 결합되어 투여될 수 있다. 한 개 이상의 다른 펩티드, 화합물들 및/또는 약학적 조성물들은 폐 손상을 치료하고, 니트로글리세린과 같은 프리로드 리듀서(preload reducer)와 푸로세미드(furosemide)(Lasix)와 같은 이뇨제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 어느 약제가 될 수 있다. 이러한 약물들은 폐의 정맥들과 인체의 다른 부분을 팽창시킨다. 이것은 심장과 폐의 내부에 대한 액체 압력을 감소시키게 된다. 한 개 이상의 다른 화합물들은 애프터로드(afteroad) 리듀서를 포함한다. 이러한 약품들은 주변 혈관을 팽창시키고 좌측 심실(ventricle)로부터 압력 로드(load)를 제거해 준다. 애프터로드 리듀서 약물들의 몇 가지 보기들은 니트로프루사이드(nitroprusside)(Nitropress), 에날라프릴(enalapril)(Vasotec) 및 캡토프릴(captopril)(Capoten)을 포함한다.

a. 치료대상(subject)

치료대상은 포유류, 즉 인간이 될 수 있다. 진단 이전에, 치료대상은 한 개 이상의 위험 인자, 심장 질환 등으로 인해 폐 손상의 위험성을 가질 수 있다. 한 개 이상의 위험 인자들은, 예를 들면, 암의 가족 이력, 나이, 흡연, 알코올 음주 및/또는 식이 부족을 가지고 있는 치료대상을 포함할 수 있다. 치료대상은 유해성 연기 또는 방사능, 기계적인 환기에 노출될 수 있다. 치료대상은 화상의 상처, 염증, 심한 트라우마, 침/위의 내용물의 흡입, 흡인 폐렴, 폐혈증, 충격, 익사 사고, 다중 수혈을 경험할 수 있다.

b. 투여

여기에 기재된 방법을 이용하는 펩티드의 투여는 전신, 입, 비경구, 설하, 경피(transdermal), 직장, 점막, 국소(topical), 흡입, 구강 투여, 코, 또는 그들의 조합을 통해 이루어질 수 있다. 비경구 투여는 정맥 투여, 동맥 투여, 복막내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 수막 공간내 투여, 및 관절 투여를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 투여는 또한 내부 기도관(intra-air duct) 또는 종양 내부를 통해 피하 및 정맥으로 실행될 수 있다. 수의학적 이용을 위해, 펩티드는 정상적인 수의학적 관습에 따라 이용에 적합하고 허용가능한 제제로서 투여될 수 있다. 수의사는 특정한 동물을 위해 가장 적합한 투여 경로와 투여 요법을 용이하게 결정할 수 있다. 펩티드는 환자, 고양이, 개, 큰 동물 또는 조류에 대해 투여될 수 있다.

펩티드는 단일 치료법으로 투여되거나, 또는 종양의 수술 또는 제거가 될 수 있는, 다른 치료들과 동시에 또는 그와 템포를 일치시켜 투여될 수 있다. 여기에서 사용되는 용어 “동시” 또는 “동시에”는 펩티드와 다른 치료가, 48시간 이내에, 바람직하게는 24시간 이내에, 더욱 바람직하게는 12시간 이내에, 더욱 더 바람직하게는 6시간 이내에, 가장 바람직하게는 3시간 이내에 투여된다는 것을 의미한다. 용어“템포를 일치시켜 투여(metronomically)"는 다른 치료와는 다른 시간에 그리고 반복 투여와 관련되는 어느 정도의 빈도수에 따라 이루어지는 펩티드의 투여를 의미한다.

펩티드는 다른 치료 이전의 어느 시점에서 투여될 수 있다. 상기 어느 시점은 약 120시간, 118시간, 116시간, 114시간, 112시간, 110시간, 108시간, 106시간, 104시간, 102시간, 100시간, 98시간, 96시간, 94시간, 92시간, 90시간, 88시간, 86시간, 84시간, 82시간, 80시간, 78시간, 76시간, 74시간, 72시간, 70시간, 68시간, 66시간, 64시간, 62시간, 60시간, 58시간, 56시간, 54시간, 52시간, 50시간, 48시간, 46시간, 44시간, 42시간, 40시간, 38시간, 36시간, 34시간, 32시간, 30시간, 28시간, 26시간, 24시간, 22시간, 20시간, 18시간, 16시간, 14시간, 12시간, 10시간, 8시간, 6시간, 4시간, 3시간, 2시간, 1시간, 55분, 50분, 45분, 40분, 35분, 30분, 25분, 20분, 15분, 10분, 10분, 9분, 8분, 7분, 6분, 5분, 4분, 3분, 2분, 및 1분을 포함한다. 펩티드는 펩티드의 제 2치료 이전의 어느 시점에서 투여될 수 있다. 상기 어느 시점은 약 120시간, 118시간, 116시간, 114시간, 112시간, 110시간, 108시간, 106시간, 104시간, 102시간, 100시간, 98시간, 96시간, 94시간, 92시간, 90시간, 88시간, 86시간, 84시간, 82시간, 80시간, 78시간, 76시간, 74시간, 72시간, 70시간, 68시간, 66시간, 64시간, 62시간, 60시간, 58시간, 56시간, 54시간, 52시간, 50시간, 48시간, 46시간, 44시간, 42시간, 40시간, 38시간, 36시간, 34시간, 32시간, 30시간, 28시간, 26시간, 24시간, 22시간, 20시간, 18시간, 16시간, 14시간, 12시간, 10시간, 8시간, 6시간, 4시간, 3시간, 2시간, 1시간, 55분, 50분, 45분, 40분, 35분, 30분, 25분, 20분, 15분, 10분, 9분, 8분, 7분, 6분, 5분, 4분, 3분, 2분, 및 1분을 포함한다.

펩티드는 다른 치료 이후의 어느 시점에서 투여될 수 있다. 상기 어느 시점은 약 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분, 45분, 50분, 55분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 24시간, 26시간, 28시간, 30시간, 32시간, 34시간, 36시간, 38시간, 40시간, 42시간, 44시간, 46시간, 48시간, 50시간, 52시간, 54시간, 56시간, 58시간, 60시간, 62시간, 64시간, 66시간, 68시간, 70시간, 72시간, 74시간, 76시간, 78시간, 80시간, 82시간, 84시간, 86시간, 88시간, 90시간, 92시간, 94시간, 96시간, 98시간, 100시간, 102시간, 104시간, 106시간, 108시간, 110시간, 112시간, 114시간, 116시간, 118시간, 및 120시간을 포함한다. 펩티드는 펩티드의 제 2치료 이후의 어느 시점에서 투여될 수 있다. 상기 어느 시점은 약 120시간, 118시간, 116시간, 114시간, 112시간, 110시간, 108시간, 106시간, 104시간, 102시간, 100시간, 98시간, 96시간, 94시간, 92시간, 90시간, 88시간, 86시간, 84시간, 82시간, 80시간, 78시간, 76시간, 74시간, 72시간, 70시간, 68시간, 66시간, 64시간, 62시간, 60시간, 58시간, 56시간, 54시간, 52시간, 50시간, 48시간, 46시간, 44시간, 42시간, 40시간, 38시간, 36시간, 34시간, 32시간, 30시간, 28시간, 26시간, 24시간, 22시간, 20시간, 18시간, 16시간, 14시간, 12시간, 10시간, 8시간, 6시간, 4시간, 3시간, 2시간, 1시간, 55분, 50분, 45분, 40분, 35분, 30분, 25분, 20분, 15분, 10분, 9분, 8분, 7분, 6분, 5분, 4분, 3분, 2분, 및 1분을 포함한다.

c. 제제(formulation)

본 발명의 방법은 펩티드의 투여를 포함한다. 여기에서 제공되는 펩티드들은 종래의 방법에 따라 조제되는 태블릿 또는 정제(lozenge)의 형태가 된다. 예를 들면, 입의 투여를 위한 태블릿 및 캡슐은 결합제, 충전제(filler), 윤활제, 붕괴제(disintegrants) 및 습윤제가 될 수 있는 종래의 부형제(excipient)를 포함할 수 있다. 결합제는 시럽, 아카시아, 젤라틴, 소르비톨, 트라가칸트, 녹말의 점액 및 폴리비닐피롤리돈을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 충전제는 락토스, 설탕, 미세결정성 셀룰로스, 옥수수 녹말, 칼슘 인산, 및 소르비톨(sorbitol)이 될 수 있다. 윤활제는 마그네슘 스테아르산염, 스테아릭산, 탈크, 폴리에틸렌 글리콜 및 실리카를 포함하나 이들에 한정되지는 않는다. 붕괴제는 감자 녹말과 나트륨 녹말 글리콜산염(glycollate)이 될 수 있다. 습윤제는 라우릴 황산나트륨이 될 수 있다. 태블릿은 기존의 알려진 방법에 따라 코팅될 수 있다.

여기에서 제공되는 펩티드들은 수용성 또는 지용성 현탁제, 용액, 에멀션, 시럽 및 일릭서(elixir)와 같은 액체 제제가 될 수 있다. 펩티드들은 또한 사용 이전에 물 또는 다른 적합한 비히클(vehicle)과의 구성을 위해 건조 생성물로 조제될 수 있다. 이러한 액체 제제는 현탁화제, 유화제(emulsifying agent), 비수용성 매체 및 보존제들과 같은 첨가제를 포함할 수 있다. 현탁화제는 소르비톨 시럽, 메틸 셀룰로스, 글루코스/설탕 시럽, 젤라틴, 하이드록시에틸렌셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 알루미늄 스테아르산염 젤 및 수소 처리된 식용 지방이 될 수 있다. 유화제는 레시틴, 소르비탄 모노올레산염 및 아카시아가 될 수 있다. 비수용성 매체는 식용유기름, 아몬드유, 분류된 코코넛유, 지용성 에스테르, 프로필렌 글리콜 및 에틸 알코올이 될 수 있다. 보존제는 메틸 또는 프로필 p-하이드록시벤조에이트 및 소르빅산이 될 수 있다.

여기에서 제공되는 펩티드들은 또한 좌약(suppository)으로 조제될 수 있다. 이러한 좌약은 코코아 버터 또는 글리세라이드와 같은 좌약 기제들(bases)을 포함할 수 있다. 여기에서 제공되는 펩티드들은 또한 흡입(inhalation) 투여를 위해 조제될 수 있다. 이러한 흡입용 펩티드는 액체, 현탁제, 또는 건조 분말이나 디크클로로디플루오로메탄 또는 트리클로로플루오로메탄과 같은 추진체를 이용하는 에어로졸의 형태로 투여되는 에멀션의 형태로 제공될 수 있다. 여기에서 제공되는 펩티드들은 또한 크림, 고약, 로션, 연고, 약물 처리된 고약(plaster), 패치 또는 막(membrane)과 같은 수용성 또는 비수용성 매체를 포함하는 경피성(transdermal) 제제로서 조제될 수 있다.

여기에서 제공되는 펩티드들은 또한 주입, 종양내 주입 또는 연속 주입과 같은 비경구성 투여(parenteral administration)를 위해 조제될 수 있다. 주입을 위한 제제는 지용성 또는 수용성 매체로 된 현탁제, 용액 또는 에멀젼의 형태로 될 수 있다. 그리고 현탁화제, 안정화제 및 분산제를 포함하나 이들에 한정되지 않는 제제 물질을 포함한다. 펩티드는 또한, 멸균 주사용 증류수를 포함하나 이에 한정되지 않는 적합한 매체와의 재구성을 위해 분말 형태로 제공될 수 있다.

여기에서 제공되는 펩티드는 또한 피하주입(implanation) 또는 근육내 주입에 의해 투여 가능한, 데포제(depot preparation)로 조제될 수 있다. 펩티드는 적합한 폴리머 또는 소수성 물질(예를 들면, 허용가능한 기름내의 에멀션), 이온 교환 수지와 함께 조제되거나, 또는 거의 용해되지 않는 유도체들(예를 들면, 용해가 거의 안되는 염류)로서 조제될 수 있다.

d. 투여량

본 방법은 필요한 환자에게 치료 가능한 유효한 양의 펩티드를 투여하는 단계를 포함한다. 치료 사용시 요구되는 치료 가능한 유효한 양은 치료되는 질환의 특성, TLR 활동을 활성화시키는데 요구되는 시간, 및 환자의 나이/상태에 따라 달라진다. 그러나 일반적으로, 성인의 치료에 사용되는 매일의 투여량은 일반적으로 0.001mg/kg - 약 200mg/kg의 범위에 있다. 매일의 투여량은 매일 약 0.05mg/kg - 약 10g/kg의 범위에 있을 수 있다. 요구되는 투여량은 단일 투여로 간편하게 투여될 수 있거나, 또는 적절한 구간, 예를 들면, 2, 3, 4, 또는 그 이상의 매일 분할 투여로서 반복 투여가 가능하다. 반복 투여량이 요구되거나 필요로 될 수 있다.

그 투여량은 다음과 같은 어느 투여량이 될 수 있다. 즉, 약 0.05mg/kg, 0.06mg/kg, 0.07mg/kg, 0.08mg/kg, 0.09mg/kg, 0.1mg/kg, 0.2mg/kg, 0.3mg/kg, 0.4mg/kg, 0.5mg/kg, 0.6mg/kg, 0.7mg/kg, 0.8mg/kg, 0.9mg/kg, 1mg/kg, 25mg/kg, 50mg/kg, 75mg/kg, 100mg/kg, 125mg/kg, 150mg/kg, 175mg/kg, 200mg/kg, 225mg/kg, 250mg/kg, 275mg/kg, 300mg/kg, 325mg/kg, 350mg/kg, 375mg/kg, 400mg/kg, 425mg/kg, 450mg/kg, 475mg/kg, 500mg/kg, 525mg/kg, 550mg/kg, 575mg/kg, 600mg/kg, 625mg/kg, 650mg/kg, 675mg/kg, 700mg/kg, 725mg/kg, 750mg/kg, 775mg/kg, 800mg/kg, 825mg/kg, 850mg/kg, 875mg/kg, 900mg/kg, 925mg/kg, 950mg/kg, 975mg/kg, 1g/kg, 2g/kg, 3g/kg, 4g/kg, 5g/kg, 6g/kg, 7g/kg, 8g/kg, 9g/kg, 또는 10g/kg가 될 수 있다.

4. 키트(kit)

여기에서는 키트가 제공된다. 이 키트는 폐 손상을 치료하는데 이용될 수 있다. 키트는 한 개 이상의 펩티드를 포함할 수 있다. 펩티드는 약학적 조성물의 한 부분이 될 수 있다. 키트는 키트를 이용하고 펩티드 또는 제제를 투여하기 위한 지시 사항들을 추가적으로 포함할 수 있다.

키트는 또한 바이알, 또는 병과 같은 한 개 이상의 용기들을 포함할 수 있으며, 각 용기는 각각의 시약을 포함하고 있다. 키트는 추가적으로 문서 형태의 지시 사항들을 포함할 수 있다. 각 지시 사항은 여기에 기재된 방법을 해석하거나 또는 실행하는 방법을 기재할 수 있다.

본 발명은 다음의 비제한적인 실시예들에 의해 설명되는 여러 가지의 양태를 가지고 있다.

실시예들

실시예 1

EB3의 결핍은 저장소로부터의 Ca ²⁺ 방출을 억제한다.

이전 연구는 ER 저장소로부터 IP3-게이티드 Ca²⁺의 방출을 조절하는 MT 세포 골격의 역할을 제시하였다. PAR-1 신호전달체계의 다운스트림(downstream)에 IP3 민감성(IP3-sensivitve) 저장소로부터 Ca²⁺의 방출을 조절하는 EB3의 능력을 실험했다. EB1, EB3와 루시페라아제(Luciferase)에 대한 shRNA를 발현하는 HMECs에서 PAR-1의 활성화에 반응하여 세포내 Ca²⁺ 농도의 변화가 확인되었다 (도 1). 우리의 벡터 기반 siRNA 구조물들이 GFP-C1 벡터안으로 클론화 되어졌기 때문에 우리는 같은 커버슬립에서 감염된 세포와 감염되지 않은 세포의 변화를 비교할 수 있었다. EB1의 결핍은 대조 비감염 세포나 루시페라아제에 대한 shRNA를 발현하는 세포와 비교하여 저장소로부터 Ca²⁺의 방출에 어떠한 영향도 미치지 않았다. 반면에 EB3의 결핍은 Ca²⁺의 방출에 뚜렷한 억제를 이끌었고 결과적으로 감소된 Ca²⁺ 유입을 초래했다. EB1과 EB3의 동시적 결핍의 효과는 EB3 단독 결핍과 비슷했다 (도 1B). 이 결과들은 EB3가 ER Ca²⁺ 결핍에 필요하다는 것을 제시한다.

실시예 2

IP3-게이티드 Ca ²⁺ 방출 메카니즘에서 IP ₃ R과 상호작용하는 EB3의 역할.

ECs에서 트롬빈 유도 Ca²⁺의 방출을 위해 중요한 활성인 IP₃R 타입 3과 EB3의 상호 작용 여부가 밝혀졌다. 쥐에게 치사량에 가까운 양의 LPS를 공격하여 EB3가 IP₃R₃와 TRPC1 (SOC) 채널과 관련이 있음을 확인하였다. 도 2에서 도시된 바와 같이, EB3는 내피 미소혈관계에 존재하는 IP₃R₃과 상호 작용하며 이 상호작용의 수준은 LPS 유도 폐 염증 동안 증가한다. 흥미롭게도, TRPC1는 염증이 진행되는 폐에 침전된 EB3에서도 발견되었다 (LPS 공격 후 3시간). 이러한 변화들은 이들 상호작용과 염증의 인과관계를 나타내는 TLR4 (LPS 수용체) KO 쥐에서 관찰되지 않았다.

흥미롭게도, IP₃R₃는 EB3 결합 공통 모티프인 Ser/Thr-x-Ile-Pro(SxIP)를 포함한다. IP₃R₃서열(KFARLWTEIPTAIT-서열 ID NO: 1) (도 3)에 기반한 짤막한(short) 펩티드는 EB3에 대해 자유 에너지 결합 -68.882kcal/mol (도 4)을 가지는 높은 결합 활성을 보인다. 세포 투과 안테나페디아 펩티드 (AP)의 C-말단에 부착된 IP₃R₃ 서열을 10nM로 전처리한 세포는 트롬빈에 반응한 저장소로부터의 Ca²⁺ 방출이 현저하게 감소되었고 (도 5), 이는 IP₃R₃와 EB3 사이의 상호작용이 IP₃R 활성화 메카니즘에서 대단히 중요하다는 것을 제시한다. IP₃R 펩티드와 탁솔의 효능은 Ca²⁺ 방출 조절에서 비교된다. 트롬빈 자극 전 20분 동안 5μg/ml의 탁솔로 전저리된 세포는 IP₃R₃ 펩티드만큼 ER로부터 Ca²⁺ 방출을 억제하는 것으로 나타났다 (도 5).

실시예 3

IP ₃ R ₃ 펩티드는 패혈증의 염증 유도 폐 혈관 누출과 치사율을 막아준다.

혈관 내피 투과성을 조절하는데 EB3/IP3R 상호 작용의 역할을 말하기 위해 우리는 탈체 폐 표본(preparation)을 사용했다. 펩티드는 PAR-1 작용제(agonist) 펩티드의 주입 전 30분 동안 폐에 주입 하였고, EB3와 IP₃R₃ 사이의 상호 작용은 IP 분석(도 6)에 의해 확인되었다. PAR-1 수용체의 활성화는 기저 수준에 비해 EB3/IP₃R₃ 상호작용을 현저하게 증가시킨 반면 다량의 IP₃R₃ 펩티드는 활성화된 폐 미세 혈관에서 이 상호 작용을 억제 했다. 결과적으로, IP₃R₃ 펩티드는 미세 혈관 여과 계수인 Kf,c 변화로 측정된 것처럼 폐 혈관 투과성의 증가를 완화시켰다. 도 7은 IP₃R₃펩티드가 PAR-1 활성화에 반응하여 미세 혈관 투과성의 증가를 현저하게 약화시킨다는 것을 입증한다. 이 데이터는 EB3와 IP3R 사이의 상호 작용이 염증 유도 혈관 누출과 폐 부종의 발생에 중요할 수 있다는 것을 제시한다.

최근의 연구들은 혈관 누출이 패혈증의 치사율에 기여하는 중요한 요소임을 보여 주었다. IP₃R₃ 펩티드의 약리 작용은 패혈증의 LPS 유도 쥣과 모델에서 테스트되었다. 수컷 CD1 마우스는 LPS (30mg/kg 체중)의 복강 주사(i.p)가 공격되었고, 폐 내 호중구(neutrophils)의 침윤이 폐 염증의 척도로 측정되었다. 폐는 PBS로 관류하여 무게를 재고 동결되었으며, 활성화된 호중구의 특징인 폐 마이엘로퍼옥시다제(MPO) 활성을 측정하는데 사용되었다. 도 8에서 보여지는 바와 같이, LPS 공격 30분 전 IP₃R₃ 펩티드로 처리된 마우스는 대조 펩티드 처리 그룹과 비교하여 LPS 공격 후 2 및 6시간에서 폐 내 호중구의 침윤이 크게 감소하였다. 이 관측은 IP₃R₃ 펩티드가 LPS-유도 폐 염증과 손상을 약화시킨다는 것을 시사한다. 따라서, LPS 투여 전 30분 및 투여 후 1시간에 IP₃R₃ 펩티드 처리를 받은 마우스는 LD50- 및 LD80-공격 모두에서 대조군의 생존율을 크게 상회함을 보여주었다 (도 9). 또한, IP₃R₃펩티드가 맹장 결찰과 천공(CLP)으로 유도된 다균성 패혈증으로부터 보호하는지 여부가 확인되었다. CLP는 급성 폐 손상(ALI)에 의해 수반되는 치명적인 복막염을 초래한다. 이는 매우 예외적이지만 실험용 설치류에 임상적으로 적절한 방법이다. 도 10은 IP₃R₃ 펩티드가 CLP 후 동물의 생존을 향상시키는 것을 보여준다. 대조 마우스의 90%가 첫 48시간 이내에 죽는 반면, 수술 전과 수술 후 24 및 48시간에 IP₃R₃가 주입된 동물은 훨씬 더 높은 생존율을 보여 주었다.

이러한 데이터는 IP₃R₃ 펩티드 유도체 펩티드가 폐 과도(hyper)-투과성을 막고 염증 및 아테롬성신생(artherogenesis)과 같은 병리 과정에서 만성적 혈관 누출 감쇠를 위해 잠재적으로 사용될 수 있다는 것을 시사한다. IP₃R₃펩티드의 투여량-반응은 패혈증의 LPS-유도된 쥣과 모델에서 추가로 테스트되었다. 수컷 CD1 마우스는 LD80 투여량으로 LPS의 i.p. 주사법에 의해 공격되었다. 마우스는 체중 kg 당 0.01, 0.033, 0.1, 0.33, 1.0, 3.3 그리고 10μΜ 투여량으로 IP₃R₃ 펩티드의 레트로-오비탈(retro-obital) i.v. 주입을 받았다. 마우스는 LPS 투여 30분 전과 투여 후 1 및 24시간, 세 번 IP₃R₃ 펩티드가 주입되었다. 각 그룹에서 생존한 동물의 백분율은 IP₃P₃ 투여량의 함수로서 도표화되었다. 도 11은 IP₃R₃ 펩티드가 대조군의 생존율을 0.033 μΜ/kg을 시작으로 개선시켰고 1 μΜ/kg에서 최대 효능에 도달했음을 보여준다. IP₃R₃ 투여량의 증가는 추가 개선으로 이어지지 않았으나, 중요하게도, 동물 죽음의 원인은 되지 않았다. 이러한 데이터는 IP₃R₃ 펩티드가 이 투여량의 범위 내에서 낮은 독성을 가지고 있다는 것을 시사한다. 80nM/kg의 ED₅₀ (유효량, 50%)는 아래 3-매개변수 논리 방정식을 사용하여 계산되었다.

y = min+(max+min)/1+10^LogED50-x

여기서 min 및 max는 반응의 최소와 최대를 나타낸다. 제시된 데이터는 IP₃R₃가 높은 효능 및 낮은 독성을 가진 잠재적인 약물임을 시사한다. 탁솔과 달리, 이 약물은 일반적인 독성이 나타나지 않을 것으로 기대된다.

EB3는 ER 저장소로부터 Ca²⁺ 방출을 적극적으로 조절하고, 그로 인해 전염증성(pro-inflammatory) 자극에 대한 반응으로 내피 장벽의 투과성을 증가시킨다. EB3와 IP₃R 사이의 상호 작용은 IP3-게이티드 Ca²⁺ 방출 메카니즘에서 중요하다. IP₃R₃ 펩티드는 폐 내 염증 매개 혈관 누출과 부종의 발생을 방지하고 두 개의 서로 다른 패혈증 모델에서 마우스의 생존을 현저하게 증가시킨다.

실시예 4

증가된 내피의 투과성과 폐 부종 형성 메카니즘에서 Ca ²⁺ 신호전달체계를 조절하는 EB3의 역할 규명하기.

우리는 ER과 MT 말단에서의 EB3의 동적 상호작용이 Ca²⁺ 파동의 전파에 필요하며 전염증성 매개체들에 대한 반응으로 내피 장벽 투과성이 증가되는 것을 가정한다.

가설: ER로부터 IP3-게이티드 Ca²⁺ 방출에서 EB3 조절은 내피의 투과성에서 MT-의존적 증가를 위해 요구된다. 우리는 성장하는 MT 말단에서 EB3의 축적이 EB3와 IP3R과의 일과성(transient) 상호작용을 촉진시키며 저장소로부터의 Ca²⁺ 방출을 적극적으로 조절하여, 결과적으로 SOC-의존적 Ca²⁺ 진입(entry), Ca²⁺-의존적 PKCα 아형(isoform)의 활성화, p120-카테닌의 PKCα-매개 인산화 및 VE-카데린 내면화(internalization) 한다는 발상을 다룰 것이다 (도 21에서 모델로 가정했다).

실시예 5

지속적인 MT 성장과 IP3R 활성화 조절에서 EB3의 역할.

MT-불안정화 및 안정화 물질은 IP3-유도 Ca²⁺ 방출 11-13을 억제한다. 우리의 예비 데이터는 EB1이 아닌 EB3의 내피 세포 내 결핍이 저장소로부터 PAR-1 매개 Ca²⁺ 방출을 또한 억제함을 보여주었다. 우리는 MT 역동성 조절을 통해 간접적으로 EB3이 ER로부터 IP3-유도 Ca²⁺ 방출을 조절하는 지 여부를 밝히고자 한다. 우리는 우리의 20에서 보여준 바와 같이 인공 EB3 이합체(dimer) 발현에 의한 EB3 결핍 세포에서 MT의 지속적인 생장의 복원은 ER로부터 PAR-1 매개 Ca²⁺ 방출을 회복시킬 수 있는지 여부를 밝힐 것이다. 인공 이합체 EB3-NL-LZ은 알려진 EB의 파트너와 결합을 담당하는 어느 도메인이 완전히 결여되어 있기 때문에, EB3과 IP3R 사이의 상호작용이 IP3R의 활성화에 중요하다면 이 경우 IP3-유도 Ca²⁺ 방출은 복원되지 않는다. 그러므로, 우리가 인공 EB3 이합체를 발현하는 세포에서 IP3R 활성의 복원을 관찰한다면 EB3은 MT 역동성을 통해 간접적으로 ER로부터의 작용제-유도 Ca²⁺ 방출을 조절한다는 결론을 내릴 것이다. 이 실험은 HMLVECs에서 Fura2-AM의 340/380 레이셔메트릭 이미징(ratiometric imaging)으로 평가하여 ER로부터 트롬빈-매개 Ca²⁺의 방출과 세포외 Ca²⁺의 유입을 다룰 것이다. 우리 가설의 타당성을 바탕으로, 우리는 EB3-NL-LZ의 발현은 ER로부터 작용제-유도 Ca²⁺ 방출을 회복시키지 않을 것으로 예측한다.

실시예 6

IP3R의 세포 내 분포에서 IP3R와 EB3 상호작용의 역할.

우리 데이터의 전제하에 우리는 EB3과 IP3R 타입 3 사이의 상호작용이 수용체의 활성화메카니즘에 중요할 수 있다고 제시했다. IP3R은 Ser/Thr-x-Il-Pro (SxIP) 공통 모티프(motif)를 포함하는데(도 17), 이는 EB-상호작용하는 파트너들의 특이적인 특징이다. 이 모티프의 부근에서 Ser 혹은 Thr의 포스포릴화는 EB1과 그의 알려진 파트너들에 대한 친화력을 현저하게 감소시킨다. 우리는 AP 서열로 융합된 짧은 IP3R 서열 펩티드(798-811; KFARLWTEIPTAIT-SEQ ID NO: 1)가 IP3R과 EB3 사이의 상호작용을 방해하는지 여부와 트롬빈-유도 IP3-게이티드 Ca²⁺ 방출을 억제하는지 여부를 알아낼 것이다. 펩티드가 세포 내에서 포스포릴화될 수 있는 몇몇 가능성이 있기 때문에, 우리는 Avi-태그 IP3R 펩티드를 발현시키고 자동방사선사진법(autoradiography)에 의해 펩티드의 포스포릴화를 알아낼 것이다. 만약 펩티드가 포스포릴화함을 발견한다면 우리는 첫 Thr이 Ala(포스포릴화 결함 펩티드; KFARLWAEIPTAIT-SEQ ID NO:2)로 교체된 다른 모든 연구에 대해 더 강력한 포스포릴화 결함 펩티드를 사용할 것이다. EB3와 펩티드의 결합은 세포 안과 co-IP와 pull-down 분석으로 생체외에서 확인될 것이다. 우리는 세포 내 EB3와 IP3R 사이의 상호작용을 방해하는 이 펩티드를 사용할 것이다. IP3R 펩티드가 트롬빈에 반응한 저장소로부터의 Ca²⁺ 방출을 억제할 것이라는 게 우리의 예상이다.

우리는 EB3 결핍 또는 블로킹 펩티드에 의한 EB3와 IP3R 사이의 상호작용의 억제가 IP3R의 세포 내 분포를 변화시키는지 여부를 조사할 것이다. IP3R 타입 2와 3은 주로 폐 내피 미세혈관에서 발현된다. 포낭(caveolae) 내로의 IP3R 타입 3의 모임은 저장소로부터의 작용제-유도 Ca²⁺ 방출이 필요하다. IP3 생성 위치와 인접한 수용체의 IP3R 타입 3 국부화(localization)에 대한 상대적으로 낮은 IP3의 내재적 친화력의 고려는 IP3-게이티드 Ca²⁺ 방출에 중요할 수 있다. 따라서, 우리는 EB3가 IP3R3/TRPC1/TRPC4 복합체 형성을 통해 포낭으로 ER 막의 테더링을 조절할 수 있는지를 테스트할 것이다. 우리는 면역 형광 염색과 트롬빈 자극의 시간별 실시간 세포 관찰로 IP3R3 수용체의 세포 내 분포를 밝힐 것이다. 만약 우리가 EB3이 포낭으로 IP3R3의 테더링에 의해 IP3-게이티드 Ca²⁺ 방출을 조절한다는 사실을 찾으면, 우리는 EB3이 IP3R3와 TRPC1/TRPC4 사이의 상호작용을 촉진하는지 밝혀낼 것이다.

실시예 7

작용제-유도 IP3R 포스포릴화 메카니즘에서 EB3의 역할.

IP3R는 CaM 키나아제 II (CaMKII)에 대한 16개의 잠재적인 지역을 포함하며, CaMKII-매개 포스포릴화는 IP3에 대한 수용체 민감성을 증가시킨다. 651-1130 지역내에 위치한 예측된 CaMKII 포스포릴화 지역(도 17)인 Thr804는 IP3 결합과 채널 열림 사이에서 기능적인 결합을 위해 중요하다. 따라서 Thr804의 포스포릴화는 IP3-유도 채널 열림 메카니즘에서 중요할 수 있다. EB3은 CaM에 결합하여 CaMKII의 공간적 및 시간적 활성화와 수용체의 포스포릴화를 조율할 수 있을지도 모른다. 이 아이디어를 다루기 위해 우리는 EB3의 결핍 또는 특이적인 펩티드에 의한 EB3와 IP3R 사이의 상호작용의 붕괴가 IP3R 포스포릴화를 억제하는지를 확인할 것이다. IP3R 인산화의 수준은 자동방사선사진법으로 평가될 것이다. 우리는 EB3 결핍과 IP3R 펩티드 모두에서 IP3R 포스포릴화의 수준이 감소할 것으로 기대한다. 포스포릴화의 지역은 포스포릴화된 단백질체적 분석으로 확인될 것이다. 내재성(endogenous) IP3R은 트롬빈 처리 전후 콘카나발린(conconavalin) A 비즈를 이용하여 HLMVECs로부터 정제되어 질것이다. CaMKII 지역의 특이성은 CaMKII 억제제 유무에 따라 얻어진 포스포릴화의 프로필의 비교에 의해 결정될 것이다. 우리는 CaMKII 지역을 변형시키고 세포 내 IP3R3의 분포와 IP3-게이티드 Ca²⁺ 방출 메카니즘에서 그 중요성을 밝힐 것이다.

또 다른 실험은 IP3R의 CaMKII-의존 포스포릴화가 원형질막에서 TRPC1/4 수용체의 결합과 연동되는지 여부를 확인할 것이다. 포스포릴화는 생장하는 MT 끝(tip)으로부터 IP3R를 방출할 것이며 TRPC1/4에의 결합을 유도할 것이다. CaMKII와 IP3R3의 공유 국소화(co-localization)는 창자 장세포, 췌장 샘꽈리(acinar)세포와 표면 점액세포의 정점 지역에서 발견된다. 따라서, 내피세포의 내강 표면에서 CaMKII와 IP3R3의 공동 분포가 존재할 수 있다. 우리는 보통 때와 트롬빈-자극 HLMVECs에서 CaMKII와 IP3R3의 공유 국소화를 처음으로 확인하고자 한다. 우리는 또한 FRET 분석으로 수용체와 키나아제 사이의 상호작용을 밝힐 것이다. CaMKII의 활성은 FRET-기반 바이오센서인 Camui 33(야스노리 하야시으로부터 얻은, 일본)을 사용하여 평가될 것이다. CaMKII의 공간적 활성화에서 EB3의 역할은 동일한 방법을 사용하여 파악할 것이다.

실시예 8

SOC-유발(evoked) Ca²⁺ 진입(entry) 메카니즘에서 IP3R과 EB3 상호작용의 역할

ER 저장소의 결핍은 SOC 활성화와 Ca²⁺ 진입 34-36 메카니즘에서 중요하다. 일관되게, 우리는 EB1이 아닌 EB3의 결핍이 Ca²⁺ 유입을 감소시킴을 발견했다. 우리의 예비 데이터 전제하에, 우리는 EB3 결핍이 내피 세포의 주요 SOC 채널인 TRPC1과 TRPC4의 트롬빈-유도 활성화를 억제한다는 가설을 세웠다. 이 가능성을 직접적으로 다루기 위하여, EB3 siRNA 또는 IP3R3 펩티드로 처리된 HLMVECs가 -50mV에서 트롬빈-유도와 La3+ 민감한 내향성 전류 측정을 위해 완전체 세포(whole cell) 패치클램프 분석에서 사용될 것이다. 우리는 또한 활성화된 채널의 반전 전위를 보여주기 위하여 전류-전압(I-V) 관계(-100에서 +100mV)를 평가할 것이다. 이 결과는 IP3R3가 siRNA로 결핍되거나 IP3R 길항제인 2-아미노에톡시다이페닐 붕산염(aminoethoxydiphenyl borate)(2-APB)으로 억제된 HLMVECs에서 얻어진 데이터와 비교될 것이다. 보충 실험들은 특이적인 Ab 혹은 siRNA에 의한 TRPC1 및 TRPC4의 별도 혹은 동시 불활성화가 EB3의 결핍과 비교해서 완전체 세포 전기 전도력에 유사한 효과를 산출할지 여부를 다룰 것이다. 우리 가설의 유효성으로 우리는 EB3 결핍이 TRPC1/4 채널을 통해 Ca²⁺ 진입을 억제할 것으로 예측한다. 이 실험들은 Fura2-AM 레이셔메트릭 이미징(ratiometric imaging)에 의한 세포 내 Ca²⁺ 농도의 변화 측정을 동반할 것이다.

실험의 또 다른 세트는 EB3의 결핍이 탑시가르긴(thapsigargin, TG)- 또는 IP3-유도 (세포 내 운반 my 미세주입) SOC의 활성화 및 Ca²⁺ 진입을 억제할 수 있는지 여부를 알아낼 것이다. TG는 사르코/소포체(sarco/endoplasmic reticulum) Ca²⁺ ATPase를 억제하고 IP3R 활성화에 독립적으로 ER로부터의 Ca²⁺의 결핍을 초래한다. 두 접근법 모두 대조 siRNA-처리 세포에서는 SOC-유발 Ca²⁺ 진입의 활성화를 유도할 것으로 기대되지만 EB3의 결핍은 IP3-유도 IP3R 활성화시 Ca²⁺ 진입만을 억제할 것이다. 이 실험은 EB3(또는 MT 역동성 변화)가 시어(ser) 당 SOC 채널의 활성화에 어떠한 영향을 가진다면, IP3R의 활성화를 통한, 간접적으로 SOC-유발 Ca²⁺ 진입을 조절하는 EB3의 참여와 직접적인 참여 사이를 구별할 것이다. 우리는 이번 실험으로 TRPC1/4 채널의 활성을 입증하기 위한 완전체 세포 전도력과 전류-전압(I-V) 관계를 평가할 것이다.

실시예 9

증가된 내피 투과성 및 부종 형성 메카니즘에서 IP3R과 EB3 상호작용의 역할.

우리는 Ca²⁺ 신호전달체계의 전파를 초래하는 EB3와 IP3R 사이의 상호작용은 PAR-1 활성화에 반응하여 증가된 투과성을 강화하는지의 여부를 확인할 것이다. 이와 관련해서, 우리는 IP3R 블로킹 펩티드로 처리된 폐와 세포 내 투과성 장벽의 증가를 다룰 것이다. 우리는 내피 장벽 변화의 기능적 척도로서 TER과 경내피(transendothelial) 알부민 흐름에서의 변화를 측정함으로서 내피 투과성 증가를 평가할 것이다. AJs의 무결성과 세포 내 틈(gap)의 형성은 면역염색법, VE-카데린 내면화 (바이오티닐레이션 분석을 이용), VE-카데린과 p120-카테닌 사이의 상호작용으로 확인할 것이다. 우리 가설의 타당성을 바탕으로, 우리는 세포 내 Ca²⁺ 농도 증가의 억제가 더 적은 세포 내 틈 형성과 조금 더 안정한 VE-카데린 부착으로 반영되는 감소된 투과성 반응을 초래할 것으로 기대한다. 증가된 세포 내 Ca²⁺이 p120-카테닌을 인산화하여 AJs의 분해를 매개하는 PKCα을 활성화하기 때문에, 우리는 PKCα 활성화 수준과 PKCα-특이적인 지역인 Ser879에서의 p120-카테닌 포스포릴화 수준을 측정할 것이다. EB3 결핍 세포 혹은 IP3R3 펩티드로 전처리된 세포에서 PAR-1 매개 세포 수축성이 또한 억제되는지 여부를 확인하기 위하여 우리는 RhoA와 MLCK-L 활성화의 수준을 분석할 것이다. IP3R3-/- 쥐 37에서 단리된 IP3R3 결핍 세포 혹은 폐 미세혈관 내피 세포는 비교를 위해 사용될 것이다.

EB3와 IP3R 사이의 상호작용이 미세혈관 투과성과 폐 부종에서 작용제-유도 증가를 강화하는지 확인하기 위해 우리는 폐 탈체(ex vivo) 모델을 이용할 것이다. 관류된 쥐 폐 표본은 세포-투과성 IP3R 펩티드가 폐 혈관 투과성에서 PAR-1-매개 증가를 억제하는지 확인하기 위해 사용될 것이다. 내피 미세혈관 투과성은 PAR1 작용제 펩티드의 투입 후 모세혈관 여과 계수 (Kf,c)와 폐 경혈관(transvascular) 125I-알부민 흐름을 측정함으로써 평가될 것이다. 우리는 또한 펩티드로 얻어진 결과를 입증하기 위해 IP3R3-/- 쥐(가츠히코 미코시바로부터 얻은, 일본) 또는 IP3R3가 siRNA에 의해 결핍된 쥐를 사용할 것이다. IP3R과 EB3 사이의 상호작용이 폐 미세혈관 투과성에서 작용제-유도 증가를 조절하기 위해 필수적이라는 우리의 가설에 따라, 우리는 IP3R 펩티드와 IP3R3-/- 모두 PAR-1 활성화에 반응하여 증가된 미세혈관 투과성의 부분적인 억제를 나타내는 비교할 만한 결과들을 나타낼 것으로 예상한다.

이 연구의 목표는 ER 저장소로부터 IP3-게이티드 Ca²⁺ 방출을 조절하는 EB3의 역할을 규명하는 것이다. 우리는 정점 세포질막으로의 ER 전좌와 IP3R 포스포릴화의 메카니즘에서 EB3와 IP3R 사이의 상호작용의 중요성을 밝힐 것이다. 우리는 우리의 가설을 바탕으로 EB3와 IP3R 사이의 상호작용이 IP3R 활성화의 제어지점을 제공함을 예상한다. 우리 가설의 타당성을 바탕으로, 우리는 IP3R과 EB3 상호작용의 파괴는 ER 저장소로부터 Ca²⁺ 방출을 억제할 것이며 폐와 세포 배양에서 증가된 투과성 반응을 제거할 것으로 예상한다. 우리는 EB3/IP3R 상호작용이 1) IP3 발생과 인접한 포낭으로의 IP3R3의 테더링 및 2) CaMKII에 의한 IP3R3 포스포릴화 촉진으로 IP3-게이티드 Ca²⁺ 방출을 조절한다는 다음의 역학모델을 추궁할 것이다. 이와 함께, 폐 미세혈관 연구와 세포 배양 실험은 EB3가 IP3R3 활성을 조절하는 메카니즘을 확인한다. 우리는 가설 테스트를 기반으로 이 연구로부터 새로운 결론을 도출할 수 있는가에 대해서는 문제를 예견하지 않는다. 제안된 모든 기술들은 우리의 실험실 또는 공동 연구자의 실험실에서 설립되었기 때문에 실현 가능하다.

MT 세포 골격은 휴지 세포에서 내피 장벽의 유지에 중요한 역할을 하고 전염증성 자극에 의한 매개로서 증가된 내피 투과성을 강화하기 위한 메카니즘을 제공한다. MT 말단 결합 단백질인 EB3는 지속적인 MT 생장을 촉진하여 MT 역동성을 조절하므로 EB3 안티-카타스트로피(anti-catastrophe) 활성은 MT 세포 골격의 재조직과 급성 폐손상(ALI)과 성인호흡장애증후군(ARDS) 같은 염증성질환 동안 내피 장벽 기능의 상실을 조절하는 주요한 메카니즘일 것이다. 제안된 연구들은 증가된 내피 혈관 투과성과 부종 형성 메카니즘에서 PAR-1 활성화에 반응하여 ER 저장소로부터 IP3-게이티드 Ca²⁺ 방출을 조절하는 EB3의 역할을 다룰 것이다. 우리는 PKCα-매개 AJ 분해와 RhoA/MLCK-L-주도 악토 마이오신 수축으로 증가된 내피 투과성을 매개하는 Ca²⁺ 파의 전파 및 기질화(organization)의 메카니즘에서 EB3와 IP3R3 사이의 잠재적으로 중요한 상호작용을 명백히 할 것이다.

실시예 10

EB3에 결합시 IP₃R₃의 절단 효과

컴퓨터 인실리코(in silico) 모델링은 KFARLWTEIPTAIT 펩티드(SEQ ID NO : 1)의 각 잔기에서 제공된 결합 자유에너지(binding free energy)의 활동적 기여를 측정하기 위해 사용되어졌다. 아미노산 서열의 절단된 변이체들: KFARLWTEIPTAIT(SEQ ID NO : 1)을 EB3 경계면에 도킹시키고 상호작용의 자유에너지를 계산하였다 (표 1). 데이터는 Thr-x-Ile-Pro이 가장 낮은 결합 에너지를 가지며 측면(flanking) 아미노산은 EB3과 펩티드 사이의 상호작용을 안정화하는 결정적인 역할을 한다.

표 1. IP₃R₃ 펩티드의 Thr-x-Ile-Pro 모티프를 둘러싼 아미노산 잔기의 절단 후 결합 자유에너지의 계산 변화

실시예 11

말단 결합 억제 펩티드(EBIN)의 구조 기반 설계

말단 결합 억제 펩티드, 즉 EBIN은 EB 바인딩 포킷(binding pocket)으로의 IPR 펩티드의 완전 유연한 도킹과 컴퓨터 인실리코(in silico) 알라닌-스캐닝을 기반으로 설계되었다(표 2와 3). 결합 자유에너지(ΔG)는 EB 단백질과 펩티드의 상호작용의 안정화에서 각 잔기의 기여 정도를 알아보기 위하여 사용되었다.

다음의 기준이 사용되었다:

ΔG 값 ≥1 = 안정화 잔기

ΔG 값 ≥-1 = 불안정화 잔기

ΔG 값 <-1에서 0에서 <1 = 중성 잔기

알라닌-스캐닝은 안정화 잔기(0.50 Kj/mole 또는 그 이상의 양성 결합 에너지를 가진; 검은색 표시)와 불안정화 잔기(-1의 음성 결합 에너지를 가진; 파란색 표시)를 보여준다.

표 2. 알라닌에 대한 IP₃R₃ 펩티드의 각 아미노산 잔기 변형 후 결합 자유에너지의 계산 변화: K₁F₂A₃R₄L₅W₆T₇E₈I₉P₁₀T₁₁A₁₂I₁₃T₁₄

표 3. 알라닌에 대한 EBIN의 각 아미노산 잔기 변형 후 결합 자유에너지의 계산 변화.

결과적으로, 14 아미노산 IPR 펩티드는 7 아미노산 말단 결합 억제 펩티드(EBIN; FTEIPTI(SEQ ID NO: 3)로 줄어들었다. 도 12는 EB3와 EBIN 사이의 상호작용을 입증한다. IP₃R₃과 유사하게 (도 12에서 노란 막대로 표기된), EBIN은 EB 산성 꼬리와 코일-코일드(coil-coiled) 도메인 사이의 소수성 그로브(grove)에 결합한다. EB3과 EBIN의 계산된 에너지 결합은 -60.251 kcal/mol이며, 이는 IPR과 EB3 사이의 에너지 결합과 유사하다. EBIN의 포지션 2의 트레오닌은 이 알라닌 잔기의 변형이 결합을 완전히 파기하므로 EB3 경계면에 결합하는데 있어 중요한 역할을 수행한다. 따라서, T→A 펩티드로 단일 아미노산 변형인 FAEIPTI(SEQ ID NO: 4)는 대조 결합손실(loss-of-binding control)로 사용되었다.

실시예 12

EBIN은 EB3/IP ₃ R ₃ 상호작용을 억제하고 전염증성 매개체에 반응하여 세포 내 칼슘 흐름을 약화시킨다.

세포에서 EBIN의 억제 특성을 규명하기 위해, 1μM의 농도로 EBIN 혹은 대조 펩티드로 전처리된 인간 폐 대동맥 내피 세포(HPAECs) 단층을 트롬빈으로 공격했다. EB3와 IP₃R₃ 수용체 사이의 상호작용은 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석법을 이용하여 분석하였다. 도 13에서 보여준 것처럼, EBIN 처리는 베이스(basal)와 트롬빈-유도 EB3과 IP3R3 사이의 상호작용을 약화시켰다. IP3에 대한 IP₃R₃의 반응성을 조절하는 데 있어 EB3의 역할에 대한 견해와 일관되게, EBIN은 트롬빈과 히스타민에 반응한 세포 내 칼슘 흐름을 뚜렷하게 억제했다. 도 14는 1μM Myr-EBIN 또는 대조 펩티드(FAEIPTI)(SEQ ID NO: 4)로 전처리되고 50nM 트롬빈 또는 90μM 히스타민이 공격된 HPAECs에서 340/380 (결합/자유 Fura-2M) 비율의 변화를 보여준다. 대조 펩티드는 아니지만 EBIN은 작용제-유도 세포 내 칼슘의 증가를 완화시켰다. 전염증성 사이토카인으로 HPAEC 단층을 자극한 후 세포 내 칼슘([Ca²⁺]i) 일과성(transient).

세포 형태 변화와 경세포 투과성에서 EBIN의 효과를 확인하기 위해, HPAEC 단층들의 경내피(trans-endothelial) 내성이 측정되었다. 도 15는 펩티드 결합 손실이 아닌 EBIN이 전염증성 매개체 둘 모두에 반응하여 세포 형태의 변화와 HPAEC 단층들의 경세포 과투과성을 억제함을 보여준다. 이러한 결과들은 내피 세포 형태 변화와 칼슘 신호전달체계의 억제에 관여되는 EBIN의 장벽 보호 효과를 입증한다.

실시예 13

EBIN은 마우스에서 NO 생산과 히스타민-유도 혈관 확장을 억제한다.

NO를 생산하는 내피-특이적 효소인 산화 질소 합성효소 3(eNOS)의 활성은 칼슘 신호전달체계에 의해, 특히 칼모듈린(Calmodulin)과 상호작용하는 eNOS을 통해 조절되며, 염증 동안 내피 장벽의 과투과성 원인으로 알려져 있다. EBIN은 칼슘 신호전달체계를 억제하기 때문에 EBIN의 장벽-보호 효과가 부분적으로는 eNOS의 억제 때문으로 가정되었다. 그러므로, 베이스(basal)와 작용제-유도의 NO 생산에서 EBIN의 효과가 측정되었다. NO 형성은 FAS1 페모스태트(femostat)와 연결된 포르피린 NO 전극(porphyrinic NO electrodes)과 전기화학의 소프트웨어를 탑재한 퍼스널 컴퓨터(독일 기기)를 사용하여 측정되었다. NO 농도에 비례하는 전극 전류는 시간 함수로 측정되었다. 흥미롭게도, EBIN은 베이스(basal) NO 생산에 아무런 영향을 나타내지 않았는데, 이는 구성적(constitutive) eNOS 활성을 억제하지 않음을 말해준다. 그러나 EBIN은 작용제-유도 NO 생산을 크게 약화시켰다(도 16). 이 결과와 일관되게, 마우스에 AP-EBIN의 i.v. 주입은 수축기 혈압에서는 영향을 나타내지 않았지만, EBIN은 히스타민-유도 혈관확장을 크게 억제하였다(도 17). 이러한 데이터는 세포 배양 실험에서 얻어진 데이터와 일치했다. 이 결과들은 EBIN이 히스타민에 반응으로 NO 발생을 억제함으로써 혈관확장을 약화시킨다는 것을 입증한다.

실시예 14

EBIN은 LPS-유도 패혈증의 치사율과 아나필락시스 이후에 오는 혈관 누출을 막는다.

LPS-유도 패혈증의 사망률에서 EBIN의 효과를 밝혔다. 마우스는 LD90 투여량의 LPS 투여 전 30분 및 투여 후 1시간에 AP-EBIN 또는 AP 대조 펩티드의 i.v. 레트로-오비탈 주입을 받았다. EBIN이 처리된 마우스는 대조군의 생존률에서 뚜렷한 향상을 보였다(도 18). 게다가, EBIN의 후처리 역시 어떤 보호 효과를 나타내는지 여부가 밝혀졌다. 이번 실험에서, Myr-EBIN이 LPS 공격 후 30분 및 24시간에 꼬리 정맥에 주입되었다. 도 19에서 보여진 것처럼, EBIN의 후처리는 대조군(펩티드 결합 손실)과 비교해서 생존률에서 무의미한 향상을 이끌었다. Ap-EBIN의 이전 결과들과 일관되게 Myr-EBIN의 전처리는 생존률에서 두드러진 증가(p<0.05)를 보였다(도 19). 이는 전신성 염증 이전에 EBIN의 투여가 훨씬 더 유익한 결과를 가진다는 결론이 내려졌다.

증가된 혈장 VEGF의 결과인 기도 미세혈관 과투과성은 일반 천식과 기침 변이형 천식 환자의 비정상적 기도 기능의 원인이 되는 중요한 인자 중 하나이다. 급성 알레르기성 천식 반응은 주로 IgE-매개 과투과성 때문이므로, 우리는 EBIN이 IgE-매개 아나필락시스 반응 이후에 오는 피하 혈관 누출을 막는지 알아보았다. 도 20은 대조 펩티드 결합 손실이 아닌 EBIN의 정맥 주입이 귀(높은 혈관신생((vascularization), A)와 등(낮은 혈관신생, B)에서 피하 혈관 누출(에반스 블루 양성 영역의 크기 및 강도)을 크게 약화시킴을 보여준다. 이 데이터는 EBIN이 만성 혹은 급성 알레르기성 천식 환자의 폐 기능과 전반적인 건강을 개선하기 위해 효율적으로 사용될 수 있으며, 천식 염증 반응을 축소시킬 수 있음을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> Board of Trustees of the University of Illinois Komarova, Yulia <120> PEPTIDE COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING LUNG INJURY <130> 053839.02800.01PC00 <150> 61496409 <151> 2011-06-13 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> EB binding peptide <400> 1 Lys Phe Ala Arg Leu Trp Thr Glu Ile Pro Thr Ala Ile Thr 1 5 10 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> EB binding peptide <400> 2 Lys Phe Ala Arg Leu Trp Ala Glu Ile Pro Thr Ala Ile Thr 1 5 10 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> EB binding peptide <400> 3 Phe Thr Glu Ile Pro Thr Ile 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> EB non-binding control peptide <400> 4 Phe Ala Glu Ile Pro Thr Ile 1 5

Claims (28)

1. KFARLWTEIPTAIT(SEQ ID NO:1), FTEIPTI(SEQ ID NO:3), 및 그의 프래그먼트로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 단리된(isolated) 펩티드에 있어서,
   상기 프래그먼트는 말부 결합 단백질 3(EB3)과 이노시톨(inositol) 1,4,5-트리스 포스페이트(IP3) 수용체 타입 3(IP₃R₃)과의 상호 작용을 감소시키는 단리된 펩티드.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 펩티드는 캐리어 펩티드에 링크되어 있는 단리된 펩티드.
3. 제 2항에 있어서,
   상기 캐리어 펩티드는 안테나페디아 펩티드(AP)인 단리된 펩티드.
4. 제 3항에 있어서,
   상기 펩티드는 미리스토일화된(myristoylated) 단리된 펩티드.
5. KFARLWTEIPTAIT(SEQ ID NO:1) 및 FTEIPTI(SEQ ID NO:3)로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 접합된(conjugated) 펩티드에 있어서,
   상기 접합된 펩티드는 캐리어 펩티드 또는 미리스토일 그룹(myristoyl group)에 링크되는 접합된 펩티드.
6. 폐 손상의 치료를 위한 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 펩티드를 포함하는 약학적 조성물.
7. 제 6항에 있어서,
   상기 폐 손상은 부종(edema)인 약학적 조성물.
8. 제 6항에 있어서,
   상기 폐 손상은 염증-매개(mediated) 혈관 누출인 약학적 조성물.
9. 제 6항에 있어서,
   상기 폐 손상은 천식인 약학적 조성물.
10. 제 9항에 있어서,
    상기 천식은 알레르기성 천식인 약학적 조성물.
11. 제 10항에 있어서,
    상기 천식은 만성 또는 급성인 약학적 조성물.
12. 전신 혈관 투과성 증후군의 치료를 위한 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 펩티드를 포함하는 약학적 조성물.
13. 제 12항에 있어서,
    상기 전신 혈관 투과성 증후군이 내독소혈증(endotoxemia)에 의해 발생되는 약학적 조성물.
14. 제 12항에 있어서,
    상기 전신 혈관 투과성 증후군이 트라우마(trauma)에 의해 발생되는 약학적 조성물.
15. 제 12항에 있어서,
    상기 전신 혈관 투과성 증후군이 다중(multiple) 수혈에 의해 발생되는 약학적 조성물.
16. 제 12항에 있어서,
    상기 전신 혈관 투과성 증후군이 약물 치료의 부작용으로 발생되는 약학적 조성물.
17. 제 16항에 있어서,
    상기 약물 치료는 암을 치료하기 위해서 IL-2의 전신 사용(systemic use)인 약학적 조성물.
18. 혈관 부종의 치료를 위한 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 펩티드를 포함하는 약학적 조성물.
19. 제 18항에 있어서,
    상기 혈관 부종은 알레르겐-유도성 혈관 부종과 비알레르겐(non-allergen)-유도성 혈관 부종으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 약학적 조성물.
20. 제 19항에 있어서,
    상기 알레르겐-유도성 혈관 부종은 후두(laryngeal)의 혈관 부종인 약학적 조성물.
21. 제 20항에 있어서,
    상기 후두의 혈관 부종은 음식 알레르기 또는 막시류 스팅 유독동물성 중독증(hymenopteran sting envenomation)에 의해 발생되는 약학적 조성물.
22. 제 19항에 있어서,
    상기 비알레르겐-유도성 혈관 부종은 보체 인자(complement factor) 1 억제제 결핍 또는 촬상 콘트라스트 염료-유도성 혈관 부종인 약학적 조성물.
23. 아나필락시스(anaphylaxis)의 치료를 위한 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 펩티드를 포함하는 약학적 조성물.
24. 제 23항에 있어서,
    상기 아나필락시스는 알레르겐-유도성 및 비알레르겐-유도성 과민성 유사반응(anaphylactoid)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 약학적 조성물.
25. 제 24항에 있어서,
    상기 비알레르겐-유도성 과민성 유사반응은 콘트라스트 염료에 의해 발생되는 약학적 조성물.
26. 알레르기성 및 비알레르기성 비염과 관련된 비충혈(nasal congestion)의 치료를 위한 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 펩티드를 포함하는 약학적 조성물.
27. 제 26항에 있어서,
    상기 비충혈은 자극제 또는 호흡기 바이러스와 관련된 약학적 조성물.
28. 삭제

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