MX2013009570A - Ensayos para detectar autoanticuerpos contra farmacos anti-tnfa. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona ensayos para detectar y medir la presencia o nivel de autoanticuerpos contra terapéuticos de fármaco anti-TNFa en una muestra. La presente invención es útil para optimizar terapia y monitorear pacientes que reciban terapéuticos de fármaco anti-TNFa para detectar la presencia o nivel de autoanticuerpos contra el fármaco. La presente invención también proporciona métodos para seleccionar terapia, optimizar terapia y/o reducir toxicidad en sujetos que reciban fármacos anti-TNFa para el tratamiento de enfermedades o trastornos mediados por TNFa.

Description

ENSAYOS PARA DETECTAR AUTOANTICUERPOS CONTRA FÁRMACOS ANTI- TNFoc Referencia cruzada a solicitudes relacionadas Esta solicitud reclama prioridad de la solicitud provisional de E.U.A. No. 61/444,097, presentada el 17 de febrero de 201 1 , solicitud provisional de E.U.A. No. 61/484,594, presentada el 10 de mayo de 201 1 , y solicitud provisional de E.U.A. No. 61/496,501 , presentada el 13 de junio de 201 1 , las descripciones de las cuales se incorporan en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

Antecedentes de la invención Los trastornos autoinmunes son un problema médico significativo y ampliamente difundido. Por ejemplo, la artritis reumatoide (RA) es una enfermedad autoinmune que afecta a más de dos millones de personas en los Estados Unidos. RA Causa inflamación crónica de las articulaciones y es típicamente una enfermedad progresiva que tiene el potencial de causar destrucción de las articulaciones y discapacidad funcional. La causa de la artritis reumatoide se desconoce, aunque la predisposición genética, agentes infecciosos y factores ambientales han estado todos implicados en la teología de la enfermedad. En RA activa, los síntomas pueden incluir fatiga, falta de apetito, fiebre de bajo grado, dolores y rigidez en músculos y articulaciones. También durante las llamaradas de enfermedad, las articulaciones frecuentemente se vuelven rojas, hinchadas, dolorosas y blandas, debido a la inflamación del sinovio. Más aún, ya que RA es una enfermedad sistémica, la inflamación puede afectar órganos y áreas del cuerpo que no sean las articulaciones, incluyendo glándulas de los ojos y boca, el recubrimiento pulmonar, el pericarpio y vasos sanguíneos.

Tratamientos adicionales para el manejo de RA y otros trastornos autoinmunes incluye "fármacos de primera línea" de rápida acción y "fármacos de segunda línea" de acción más lenta. Los fármacos de primera línea reducen dolor e inflamación. Ejemplos de estos fármacos de primera línea incluyen aspirina, naproxeno, ibuprofeno, etodolaco y otros fármacos anti-inflamatorios no esteroides, AINES, así como corticosteroides, dados oralmente o inyectados directamente en tejidos y articulaciones. Los fármacos de segunda línea promueven la remisión de la enfermedad y previenen la destrucción progresiva de las articulaciones y se conocen también como fármacos antirreumáticos modificadores de enfermedad o DMARDs. Ejemplos de fármacos de segunda línea incluyen oro, hidrocloroquina, azulfidina y agentes inmunosupresores, tales como metotrexato, azatioprina, ciclofosfamida, clorambucilo y ciclosporina. Sin embargo, muchos de estos fármacos tienen efectos secundarios dañinos. Así, se han buscado terapias tradicionales para artritis reumatoide y otros trastornos autoinmunes.

El factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) es una citocina producida por numerosos tipos de células, incluyendo monocitos y macrófagos, que se identificó originalmente con base en su capacidad para inducir la necrosis de ciertos tumores al ratón. Posteriormente, un factor llamado caquectina, asociado con caquexia, demostró ser idéntico a TNFa. TNFa Ha estado implicado en la patofisiología de una variedad de otras enfermedades y trastornos en humanos, incluyendo choque, sepsis, infecciones, enfermedades autoinmunes, RA, enfermedad de Crohn, rechazo de trasplantes y enfermedad de injerto contra huésped.

Debido al papel dañino del TNFa humano (hTNFa) en una variedad de trastornos humanos, se han diseñado estrategias terapéuticas para inhibir o contrarrestar la actividad de hTNa. En particular, se han buscado anticuerpos que se unan a, y neutralicen, hTNFa como un medio para inhibir la actividad de hTNFa. Algunos de los más iniciales de estos anticuerpos fueron anticuerpos monoclonales de ratón (mAbs) secretados por hibridomas preparados a partir de linfocitos de ratones inmunizados con hTNFa (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,231 ,024 a Moeller et al.). Aunque estos anticuerpos anti-hTNFa de ratón comúnmente desplegaban alta afinidad para hTNFa y eran capaces de neutralizar la actividad de hTNFa, su uso in vivo ha sido limitado por problemas asociados con la administración de anticuerpos de ratón a humanos, tales como una corta vida media en suero, una incapacidad para desencadenar ciertas funciones efectoras en humanos y la provocación de una respuesta inmune no deseada contra el anticuerpo de ratón en un humano (la reacción de "anticuerpo anti-ratón humano" (HAMA)).

Más recientemente, se han aplicado terapias biológicas al tratamiento de trastornos autoinmunes tales como artritis reumatoide. Por ejemplo, cuatro inhibidores de TNFa REMICADE™ (infliximab), un mAb anti-TNFa quimérico, ENBREL™ (etanercept), una proteína de fusión a Fe TNFR-lg, HUMIRA™ (adalimumab), un mAb anti-TNFa humano y CIMZIA® (certolizumab pegol), un fragmento de FabPEGilado, han sido probados por la FDA para el tratamiento de artritis reumatoide. CIMZIA® también se usa para el tratamiento de enfermedad de Crohn (CD) moderada a severa. Aunque estas terapias biológicas han demostrado éxito en el tratamiento de artritis reumatoide y otros trastornos autoinmunes tales como CD, no todos los efectos tratados responden, o responden bien, a esta terapia. Además, la administración de inhibidores de TNFa puede inducir una respuesta inmune al fármaco y llevar a la producción de autoanticuerpos tales como anticuerpos anti-quiméricos humanos (HACA), anticuerpos anti-humanizados humanos (HAHA), y anticuerpos anti-ratón humanos (HAMA). Estas respuestas inmunes HACA, HAHA o HAMA pueden estar asociadas con reacciones hipersensibles y cambios dramáticos en la farmacocinética y biodistribución del inhibidor de TNFa inmunoterapéutico que impidan un tratamiento adicional con el fármaco. En consecuencia, existe la necesidad en la técnica por ensayos para detectar la presencia de autoanticuerpos contra biológicos anti-TNFa en una muestra de paciente para monitorear terapia inhibidora de TNFa y para guiar decisiones de tratamiento. La presente invención satisface estas necesidades y proporciona ventajas relacionadas también.

Breve descripción de la invención La presente invención proporciona ensayos para detectar y medir la presencia o nivel de autoanticuerpos contra terapéuticos de fármacos anti-TNFa en una muestra. La presente invención es útil para optimizar terapia y monitorear pacientes que reciben terapéuticos de fármacos anti-TNFa para detectar la presencia o nivel de autoanticuerpos (por ejemplo, HACA y/o HAHA) contra el fármaco. La presente invención también proporciona métodos para seleccionar terapia, optimizar terapia y/o reducir toxicidad en sujetos que reciban fármacos anti-TNFa para el tratamiento de enfermedad o trastornos mediados por TNFa.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para detectar la presencia o nivel de un autoanticuerpo contra un fármaco anti-TNFa en una muestra sin interferencia del fármaco anti-TNFa en la muestra, el método comprende: (a) poner en contacto la muestra con un ácido para disociar complejos preformados del autoanticuerpo y el fármaco anti-TNFa, en donde la muestra tiene o se sospecha que tiene un autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNFa; (b) poner en contacto la muestra con un fármaco anti-TNFa marcado después de la disociación de los complejos preformados; (c) neutralizar el ácido en la muestra para formar complejos marcados (es decir, inmunocomplejos o conjugados) del fármaco anti-TNFa marcado y el autoanticuerpo (es decir, en donde el fármaco anti-TNFa marcado y autoanticuerpo no se unen covalentemente entre sí); (d) someter los complejos marcados a cromatografía de exclusión de tamaño para separar los complejos marcados (por ejemplo, del fármaco anti-TNFa marcado libre); y (e) detectar los complejos marcados, detectando de esta manera la presencia o nivel del autoanticuerpo sin interferencia del fármaco anti-TNFa en la muestra.

En algunas modalidades, el fármaco anti-TNFa se selecciona del grupo que consiste en REMICADE™ (¡nfliximab), ENBREL™ (etanercept), HUMIRA™ (adalimumab), CIMZIA® (certolizumab pegol), SI PONI® (golimumab; CNTO 148), y combinaciones de los mismos.

En otras modalidades, el autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNFa incluye, pero no está limitado a, anticuerpos anti-quiméricos humanos (HACA), anticuerpos anti-humanizados humanos (HAHA) y anticuerpos anti-ratón humanos (HAMA), así como combinaciones de los mismos.

En ciertas modalidades alternativas, las etapas (a) y (b) se llevan a cabo simultáneamente, por ejemplo, la muestra se pone en contacto con un ácido y un fármaco anti-TNFa marcado al mismo tiempo. En ciertas otras modalidades alternativas, la etapa (b) se lleva a cabo antes de la etapa (a), por ejemplo, la muestra se pone en contacto primero con un fármaco anti-TNFa marcado, y luego se pone en contacto con un ácido. En modalidades adicionales, las etapas (b) y (c) se llevan a cabo simultáneamente, por ejemplo, la muestra se pone en contacto con un fármaco anti-TNFa marcado y se neutraliza (por ejemplo, al poner en contacto la muestra con uno o más agentes neutralizantes) al mismo tiempo.

En modalidades particulares, la muestra se pone en contacto con una cantidad de un ácido que es suficiente para disociar complejos preformados del autoanticuerpo y el fármaco anti-TNFa, de tal manera que el fármaco anti-TNFa marcado, el fármaco anti-TNFa no marcado y el autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNFa puedan equilibrarse y formar complejos entre ellos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para optimizar terapia y/o reducir toxicidad contra un fármaco anti-TNFa en un sujeto que reciba un curso de terapia con el fármaco anti-TNFa, el método comprende: (a) detectar la presencia o nivel de un autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNFa en una muestra del sujeto sin interferencia del fármaco anti-TNFa en la muestra, el método comprende: (i) poner en contacto la muestra con un ácido para disociar complejos preformados del autoanticuerpo y el fármaco anti-TNFa, en donde la muestra tiene o se sospecha que tiene un autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNFa; (ii) poner en contacto la muestra con un fármaco anti-TNFa marcado después de la disociación de los complejos preformados; (¡ii) neutralizar el ácido en la muestra para formar complejos marcados (es decir, inmuno-complejos o conjugados) del fármaco anti-TNFa marcado y el autoanticuerpo (es decir, en donde el fármaco anti-TNFa marcado y autoanticuerpo no están unidos covalentemente uno al otro); (iv) someter los complejos marcados a cromatografía de exclusión de tamaño para separar los complejos marcados (por ejemplo, del fármaco anti-TNFa marcado libre); y (v) detectar los complejos marcados (por ejemplo, detectando de esta manera la presencia o nivel del autoanticuerpo sin interferencia del fármaco anti- TNFa en la muestra); y (b) determinar una dosis subsecuente del curso de terapia para el sujeto o si un curso de terapia diferente debe ser administrado al sujeto con base en la presencia o nivel del autoanticuerpo, optimizando de esta manera la terapia y/o reduciendo la toxicidad para el fármaco antl-TNFa.

Métodos para detectar fármacos anti-TNFa y anticuerpos anti-fármaco se describen además en la publicación de PCT No. WO 201 1/056590, cuya descripción se incorpora en la presente con referencia en su totalidad para todos los propósitos.

En otros aspectos, la presente invención proporciona un método para seleccionar un curso de terapia (por ejemplo, seleccionar un fármaco anti-TNFa adecuado) para el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por TNFa en un sujeto, el método comprende: (a) analizar una muestra obtenida del sujeto para determinar la presencia, nivel o genotipo de uno o más marcadores en la muestra; (b) aplicar un algoritmo estadístico a la presencia, nivel o genotipo del uno o más marcadores determinados en la etapa (a) para generar un índice de actividad/severidad de enfermedad; y (c) seleccionar un curso de terapia adecuado (por ejemplo, terapia anti-TNFa) para el sujeto con base en el índice de actividad/severidad de enfermedad.

En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona un método para optimizar terapia y/o reducir toxicidad en un sujeto que reciba un curso de terapia para el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por TNFa, el método comprende: (a) analizar una muestra obtenida del sujeto para determinar la presencia, nivel o genotipo de uno o más marcadores en la muestra; (b) aplicar un algoritmo estadístico a la presencia, nivel o genotipo del uno o más marcadores determinados en la etapa (a) para generar un índice de actividad/severidad de la enfermedad; y (c) determinar una dosis subsecuente del curso de terapia para el sujeto o si un curso de terapia diferente debe ser administrado al sujeto con base en el índice de actividad/severidad de la enfermedad.

En modalidades particulares, los métodos de la presente invención comprenden detectar, medir o determinar la presencia, nivel (concentración (por ejemplo, total) y/o activación (por ejemplo, fosforilación)), o genotipo de uno o más marcadores específicos en una o más de las siguientes categorías de biomarcadores: (1 ) Marcadores inflamatorios (2) Factores de crecimiento (3) Serología (por ejemplo, marcadores inmunes) (4) Citocinas y quimiocinas (5) Marcadores de estrés oxidante (6) Receptores de superficie celular (por ejemplo, CD64, otros) (7) Vías de señalización (8) Otros marcadores (por ejemplo, marcadores genéticos tales como genes de la vía inflamatoria).

En modalidades adicionales, la presencia y/o nivel de uno o ambos de los siguientes marcadores también puede ser detectada, "medida o determinada en una muestra de paciente (por ejemplo, una muestra de suero de un paciente en terapia con fármaco anti-TNF): (9) niveles de fármaco anti-TNF (por ejemplo, niveles de anticuerpo terapéutico anti-TNFa libre); y/o (10) niveles de anticuerpos anti-fármaco (ADA) (por ejemplo, niveles de autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNF).

En modalidades particulares, un solo algoritmo estadístico o una combinación de dos o más algoritmos estadísticos pueden ser entonces aplicados a la presencia, nivel de concentración, nivel de activación o genotipo de los marcadores detectados, medidos o determinados en la muestra para generar así el índice de actividad/severidad de enfermedad.

En ciertos casos, la muestra se obtiene al aislar PBMCs y/o células PMN usando cualquier técnica conocida en la técnica. En otras modalidades, la muestra es una biopsia de tejido, por ejemplo, de un sitio de inflamación tal como una porción del tracto gastrointestinal o tejido sinovial.

En consecuencia, en algunos aspectos, los métodos de la invención proporcionan información útil para guiar decisiones de tratamiento para pacientes que reciban o estén a punto de recibir terapia con fármacos anti-TNFa, por ejemplo, al seleccionar una terapia anti-TNFa adecuada para tratamiento inicial, al determinar cuándo o cómo ajusfar o modificar (por ejemplo, incrementar o reducir) la dosis subsecuente de un fármaco anti-TNFa, al determinar cuándo o cómo combinar un fármaco anti-TNFa (por ejemplo, a una dosis inicial, incrementada, reducida o igual) con uno o más agentes inmunosupresores tales como metotrexato (MTX) y/o azatioprina (AZA), y/o al determinar cuándo o cómo cambiar el curso de terapia actual (por ejemplo, cambiar a un diferente fármaco anti-TNFa o a un fármaco que se dirija a un mecanismo diferente tal como un anticuerpo monoclonal que inhiba al receptor de IL-6).

Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención serán aparentes para un experto en la técnica a partir de la siguiente descripción detallada y figuras.

Breve descripción de los dibujos La figura 1 muestra una modalidad ejemplar de los ensayos de la presente invención en los que se usa HPLC de exclusión de tamaño para detectar la unión entre TNFa-Alexa647 y HUMIRA™.

Las figuras 2A-2C muestran curvas de respuesta a dosis de la unión de HUMIRA™ a TNFa-Alexa647.

La figura 3 muestra un método a base de ELISA actual para medir los niveles de HACA, conocidos como ensayos de puenteo.

La figura 4 ilustra un contorno ejemplar de los ensayos de detección de autoanticuerpos de la presente invención para medir las concentraciones de HACA/HAHA generados contra REMICADE™.

Las figuras 5A-5J muestran un análisis de respuesta a dosis de anticuerpo anti-lgG humana que se une a REMICADE™-Alexa647.

La figura 6 muestra un segundo análisis de respuesta a dosis de anticuerpo anti-lgG humana que se une a REMICADE™-Alexa647.

Las figuras 7A-7B muestran curvas de respuesta a dosis de anticuerpo anti-lgG humana que se une a REMICADE-Alexa6 7.

Las figuras 8A-8D muestran la formación de inmunocomplejos de REMICADE™-Alexa647 en suero humano normal y suero positivo a HACA.

La figura 9 proporciona un resumen de las mediciones de HACA de 20 muestras de suero de pacientes que se llevaron a cabo usando el ensayo de puenteo o el ensayo de desplazamiento por movilidad de la presente invención.

La figura 10 proporciona un resumen y comparación de los métodos actuales para medir las concentraciones séricas de HACA para el ensayo HACA novedoso de la presente invención.

Las figuras 1 1 A-1 1 D muestran los perfiles de SE-HPLC de IFX marcado con fluoróforo (Fl) incubado con suero normal (NHS) o positivo HACA (HPS). La adición de cantidades cada vez más altas de suero positivo a HACA a la mezcla de incubación desplazó de manera dependiente de dosis el pico de IFX-FI a las posiciones de elución de masa molecular más alta, C1 y C2.

Las figuras 12A-12B muestran curvas de respuesta a dosis del IX-FI unido y libre generados con diluciones cada vez más altas en suero positivo a HACA según se determina por el ensayo de desplazamiento por movilidad. (12A) Diluciones cada vez más altas de suero positivo a HACA se incubaron con 37.5 ng de IFX-FI. Entre más alta la dilución (menos HACA) más IFX-FI libre se encontró en el análisis SE-HPLC (12B). Diluciones cada vez más altas de suero positivo HACA se incubaron con 37.5 ng de IFX-FI. Entre más alta la dilución (menos HACA) menor IFX-FI unido HACA se encontró en el análisis SE-HPLC.

Las figuras 13A-13D muestran perfiles de SE-HPLC de TNFa-FI incubado con suero normal (NHS) o salpicado con IFX. La adición de cantidades cada vez más altas de suero salpicado con IFX a la mezcla de incubación desplazó de manera dependiente de dosis el pico de TNFa fluorescente a las posiciones de elución de masa molecular más alta.

La figura 14 muestra curvas de respuesta a dosis del TNFa unido y libre generadas con diluciones cada vez más altas de suero salpicado con IFX según se determina por el ensayo de desplazamiento por movilidad. Concentraciones cada vez más altas de IFX añadidas a la mezcla de incubación reducen el porcentaje de TNFa libre mientras que incrementan el porcentaje de TNFa unido.

Las figuras 15A-15B muestran la medición del nivel de HACA relativo y concentración de IFX en pacientes de IBD tratados con IFX en diferentes puntos de tiempo mediante el ensayo de desplazamiento por movilidad.

Las figuras 16A-16C muestran la medición manejo de pacientes del nivel de HACA y la concentración de IFX en los sueros de pacientes de IBD tratados con IFX en diferentes puntos de tiempo.

Las figuras 17A-17B muestran modalidades ejemplares dé los ensayos de la presente invención para detectar la presencia de autoanticuerpos (17A) no neutralizantes o (1 B) neutralizantes tales como HACA.

La figura 18 muestra una modalidad alternativa de los ensayos de la presente invención para detectar la presencia de autoanticuerpos neutralizantes tales como HACA.

Las figuras 19A-19H muestran perfiles de desplazamiento por movilidad de ADL marcado con Fl incubado con suero humano normal (NHS) en presencia de diferentes cantidades de IgG anti-humana. La adición de cantidades cada vez más altas de IgG anti-humana a la mezcla de incubación desplazó de manera dependiente de dosis el pico de FI-ADL libre (FA) a las posiciones de elución de masa molecular más alta, C1 y C2, mientras que el control interno (IC) no cambió.

La figura 20 muestra una curva de respuesta a dosis de IgG anti-humana en e1 desplazamiento de FI-ADL libre. Cantidades cada vez más altas de IgG antihumana se incubaron con 37.5 ng de FI-ADL y control interno. Entre más anticuerpos se añadiera a la mezcla de reacción más baja fue la relación de FI-ADL libre a control interno.

Las figuras 21 A-21J muestran la perfiles de desplazamiento por movilidad de TNF-a marcado con Fl incubado con suero humano normal (NHS) en presencia de diferentes cantidades de ADL. Ex = 494 nm; Em = 519 nm. La adición de cantidades cada vez más altas de ADL a la mezcla de incubación desplazó de manera dependiente de dosis el pico de TNF-FI (FT) a las posiciones de elución de masa molecular o más alta, mientras que el pico de control interno (IC) no cambió.

La figura 22 muestra una curva de respuesta a dosis de ADL en el desplazamiento de TNF-a Fl libre. Cantidades cada vez más altas de ADL se incubaron con 100 ng de TNF-a y control interno. Entre más anticuerpo ADL se añadiera a la mezcla de reacción más baja la relación de TNF-a-FI libre a control interno.

Las figuras 23A-23H muestran los perfiles de desplazamiento por movilidad de Remicade marcado con F1 (IFX) incubado con Suero de Paciente Positivo a HACA Agrupado o Normal (NHS).

Las figuras 24A-24H muestran los perfiles de desplazamiento por movilidad de HUMIRA marcado con F1 (ADL) incubado con Anticuerpo IgG 1 Anti-Humano Normal (NHS) o de ratón.

La figura 25 muestra los perfiles de desplazamiento por movilidad de HUMIRA marcado con F1 (ADL) incubado con suero de paciente positivo HAHA normal (NHS) o agrupado.

La figura 26 muestra una ilustración del efecto de la etapa de disociación con ácido. "A" Representa Remicade marcado, "B" representa HACA, "C" representa Remicade.

La figura 27 muestra el porcentaje de infliximab marcado libre como una función de porcentaje de Suero de Paciente Logarítmico sin una etapa de disociación con ácido.

La figura 28 muestra el porcentaje de infliximab marcado libre como una función de porcentaje de Suero de Paciente Logarítmico con una etapa de disociación con ácido.

La figura 29 muestra los niveles de IFX en suero en un paciente tratado con ¡nfliximab como una función de tiempo para Caso de Paciente 1.

La figura 30 muestra los niveles de IFX en suero en un paciente tratado con infliximab como una función de tiempo para Caso de Paciente 3.

La figura 31 muestra los niveles de TNFa en suero en un paciente tratado con ¡nfliximab como una función de tiempo para el Caso de Paciente 3.

Las figuras 32A-32B muestran los perfiles de desplazamiento por movilidad de IFX marcado con F1 para Caso de Paciente 1 (32A); Caso de Paciente 2 (32B, 32C) y Caso de Paciente 4 (32D).

Las figuras 33A-33E muestran los perfiles de desplazamiento por movilidad de IFX marcado con F1 para Caso de Paciente 5 (33A); Caso de Paciente 6 (33B, 33C) y Caso de Paciente 7 (33D, 33E).

La figura 34 muestra los niveles de citocina en diferentes grupos de sueros de paciente.

La figura 35 muestra el análisis de muestras que contienen TNF-Alexa488 yt Remicade por ensayo de desplazamiento por movilidad usando un detector de fluorescencia con ajustes de ganancia a diferentes valores.

La figura 36 muestra gráficas de isoabsorbancia tomadas para suero humano normal (panel superior) y TNF-Alexa488 (panel inferior) en fase móvil de HPLC (1 X PBS, 0.1 % de BSA en agua). Las longitudes de onda de excitación se grafican en el eje Y y las longitudes de onda de emisión se grafican en el eje X.

La figura 37 muestra el análisis HPLC de suero humano normal (izquierda) y TNF-Alexa488 25 ng (derecha) detectado con ajustes indicados. El nivel de fondo de la fluorescencia proveniente de suero humano normal se reduce ampliamente.

La figura 38 muestra la curva estándar generada por análisis HPLC de muestras que contienen una cantidad fija de TNF-Alexa488 y titulado con varias cantidades de Remicade.

La figura 39 muestra una comparación de determinación de infliximab en muestras clínicas mediante ensayo de desplazamiento por movilidad y ELISA. Los puntos gris oscuro son para muestras positivas a HACA y los puntos gris claro son para muestras negativas a HACA. Las líneas punteadas representan límites inferiores de cuantificaciones para los métodos respectivos.

La figura 40 muestra una comparación de la determinación de HACA en muestras clínicas mediante el ensayo de desplazamiento por movilidad y ELISA.

La figura 41 muestra los recuentos acumulativos de muestras clínicas positivas para HACA según se determina por el ensayo de desplazamiento por movilidad y ELISA.

Descripción detallada de la invención I. Introducción La presente invención se base en parte en el descubrimiento de que un ensayo de desplazamiento por movilidad homogéneo usando cromatografía por exclusión de tamaño y disociación con ácido para hacer posible el equilibrio de complejos inmunes es particularmente adecuado para medir la presencia o nivel de autoanticuerpos (por ejemplo, HACA, HAHA, etc.) que se generan contra fármacos anti-TNFa. Estos autoanticuerpos también se conocen como anticuerpos anti-fármaco o ADA. Como resultado, la presencia o nivel de autoanticuerpos contra un fármaco anti-TNFa administrado a un sujeto que lo requiera pueden medirse sin interferencia sustancial a partir del fármaco anti-TNFa administrado que está también presente en la muestra del sujeto. En particular, una muestra de sujeto puede ser incubada con una cantidad de ácido que sea suficiente para proporcionar la medición de la presencia o nivel de autoanticuerpos en presencia de fármaco anti-TNFa sin interferencia sustancial de altos niveles de fármaco anti-TNFa.

Altos niveles de fármaco anti-TNFa en una muestra (por ejemplo, altos niveles de infliximab) interfieren con la medición de los niveles de anticuerpos antifármaco (por ejemplo, niveles de HACA) bajo ciertas condiciones de alto fármaco, el anticuerpo anti-fármaco presente en una muestra es acomplejado con el fármaco no marcado también presente en la muestra. Cuando un fármaco marcado, por ejemplo, infliximab marcado, es puesto en contacto con la muestra, el anticuerpo anti-fármaco presente en la muestra es atrapado cinéticamente contra formar un complejo con el fármaco marcado. De esta manera, los complejos preformados de anticuerpo antifármaco y el fármaco no marcado interfieren con la medición de un anticuerpo antifármaco, lo cual depende de la formación de un complejo entre el anticuerpo anti-fármaco presente y el fármaco marcado. La etapa de disociación con ácido descrita en la presente permite que el anticuerpo anti-fármaco presente en la muestra se disocie del fármaco no marcado y reforme complejos tanto con el fármaco marcado como no marcado. Al disociar al anticuerpo anti-fármaco del fármaco no marcado, el anticuerpo anti-fármaco presente en una muestra puede equilibrarse entre el fármaco marcado y el fármaco no marcado.

Como se muestra en la figura 27, altos niveles de fármaco anti-TNFa (por ejemplo, infliximab) interfieren con la detección de anticuerpos anti-fármaco (por ejemplo, anticuerpos contra infliximab o ATI) cuando el ensayo de desplazamiento por movilidad se lleva a cabo sin una etapa de disociación con ácido. Sin embargo, la figura 28 muestra que la disociación con ácido seguida por cinéticas de unión a base de solución homogénea para permitir el equilibrio y reformación de complejos inmunes incrementó significativamente la tolerancia a fármacos anti-TNFa de tal manera que anticuerpos antifármaco pueden ser medidos en presencia de altos niveles de fármaco anti-TNFa (por ejemplo, hasta o al menos aproximadamente 60 pg/mL). De esta manera, los ensayos de la presente invención son particularmente adecuados sobre los métodos actualmente disponibles porque hacen posible la detección y medición de anticuerpos anti-fármaco en cualquier momento durante terapia con un fármaco anti-TNFa (por ejemplo, no obstante de niveles bajos, medios o altos de fármaco anti-TNFa en una muestra tal como una muestra de sangre), superando así una gran limitación de los métodos en la técnica que requieren recolección de muestras a concentraciones mínimas del fármaco.

En ciertos aspectos, la presente invención es adecuada toda vez que resuelve y supera las limitaciones actuales asociadas con la administración de fármacos anti-TNFa tales como infliximab, en parte, al proporcionar información útil para guiar a las decisiones de tratamiento para aquellos pacientes que reciban o estén a punto de recibir terapia con fármacos anti-TNFa. En particular, los métodos de la presente invención encuentran utilidad para seleccionar una terapia anti-TNFa adecuada para tratamiento inicial, para determinar cuándo o cómo ajustar o modificar (por ejemplo, incrementar o reducir) la dosis subsecuente de un fármaco anti-TNFa para optimizar la eficacia terapéutica y/o para reducir toxicidad, para determinar cuándo o cómo combinar un fármaco anti-TNFa (por ejemplo, a una dosis inicial, incrementada, reducida o igual) con uno o más agentes inmunosupresores tales como metotrexato (MTX) o azatioprina (AZA), y/o para determinar cuándo o cómo cambiar el curso de terapia actual (por ejemplo, cambiar a un fármaco anti-TNFa diferente o a un fármaco que se dirija a un mecanismo diferente).

En consecuencia, la presente invención es particularmente útil en los siguientes métodos para mejorar el manejo del paciente al guiar decisiones de tratamiento: 1. Pronóstico de enfermedad de Crohn: tratar pacientes que muy probablemente se beneficiarán de terapia 2. Monitoreo de anticuerpos anti-terapéuticos (ATM) + índice de actividad de enfermedad a base de biomarcadores 3. Sub-estratificación de ATM 4. ATM Con modelado farmacocinético 5. Monitorear respuesta y predecir riesgo de recaída: a. Evitar terapia de mantenimiento crónica en pacientes con bajo riesgo de recurrencia b. Marcadores de sanación de mucosas c. Selección de terapia: si se combina o no se combinan terapia con fármaco anti-TNF y un agente inmunosupresor tal como MTX o AZA 6. Selección de pacientes para biológica.

II. Definiciones Según se usa en la presente, los siguientes términos tienen los significados adscritos a ellos a menos que se especifique lo contrario.

Los términos "fármaco anti-TNFa" o "inhibidor de TNFa" según se usan en la presente intentan abarcar agentes que incluyen proteínas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, proteínas de fusión (por ejemplo, proteínas de fusión a Ig o proteínas de fusión a Fe), proteínas de unión multivalentes (por ejemplo, DVD Ig), antagonistas de TNFa de molécula pequeña y moléculas de origen natural o no natural similares, y/o formas recombinantes y/o manipuladas de los mismos, que, directa o indirectamente, inhiben la actividad de TNFa, tal como al inhibir la interacción de TNFa con un receptor de superficie celular para TNFa, inhibir la producción de proteínas de TNFa, inhibir la expresión de genes de TNFa, inhibir la secreción de TNFa de células, inhibir la señalización de receptores de TNFa o cualquier otro medio que resulte en actividad TNFa reducida en un sujeto. El término "fármaco anti-TNFa" o "inhibidor de TNFa" incluye de preferencia agentes que interfieren con la actividad de TNFa. Ejemplos de fármacos anti-TNFa incluyen, sin limitación, infliximab (REMICADE™, Johnson and Johnson), anticuerpo monoclonal anti-TNF humano adalimumab (D2E7/HUMIRA™, Abbott Laboratories), etanercept (ENBREL™, Amgen), certolizumab pegol (CIMZIA®, UCB, Inc.), golimumab (SIMPONI®, CNTO 148), CDP 571 (Celltech), CDP 870 (Celltech), así como otros compuestos que inhiben actividad TNFa, de tal manera que cuando se administre a un sujeto que sufra de o esté en riesgo de sufrir un trastorno en el cual la actividad TNFa sea dañina (por ejemplo, RA), el trastorno sea tratado.

El término "TNFa" intenta incluir una citocina humana que existe como una forma secretada de 17 kDa y una forma asociada a membrana de 26 kDa, la forma biológicamente activa de la cual está compuesta de un trímero de moléculas de 17 kDa unidas no covalentemente. La estructura de TNFa se describe más en, por ejemplo, Jones et al. (1989) Nature, 338:225-228. El término TNFa intenta incluir TNFa humano, un TNFa humano recombinante (rhTNFa) o un polipéptido que tenga al menos aproximadamente 80% de identidad con la proteína TNFa humana. TNFa Humano consiste en un dominio citoplásmico de 35 aminoácidos (aa), un segmento de transmembrana de 21 aa y un dominio extracelular de 177 aa (ECD) (Pennica et al. (1984) Nature 312:724). Dentro del ECD, TNFa humano comparte 97% de identidad de secuencia de aminoácidos con TNFa de rhesus y 71 % a 92% con TNFa de bovino, canino, rata algodón, equino, felino, ratón, porcino y rata. TNFa Puede ser preparado mediante métodos de expresión recombinantes estándares o comprarse comerctalmente (por ejemplo, R & D Systems, No. de catálogo 210-TA, Minneapolis, Minn.).

En ciertas modalidades, "TNFa" es un "antígeno", el cual incluye una molécula o una porción de la molécula capaz de ser aglutinada por un fármaco anti-TNFa. TNFa Puede tener uno o más de un epítopo. En ciertos casos, TNFcc reaccionará, de una manera altamente selectiva, con un anticuerpo anti-TNFa. Antígenos preferidos que se unen a anticuerpos, fragmentos y regiones de anticuerpos anti-TNFa incluyen al menos 5 aminoácidos de TNFa humano. En ciertos casos, TNFa tiene una longitud suficiente con un epítopo de TNFa que es capaz de unirse a anticuerpos anti-TNFa, fragmentos y regiones de los mismos.

El término "predecir la respuesta a un fármaco anti-TNFa" intenta referirse a una capacidad para evaluar la probabilidad de que el tratamiento de un sujeto con un fármaco anti-TNFa será o no efectivo en el sujeto (por ejemplo, proporcionará un beneficio mesurable al sujeto). En particular, esta capacidad para evaluar la probabilidad de que el tratamiento sea o no efectivo se ejerce típicamente después de que el tratamiento ha iniciado, y un indicador de efectividad (por ejemplo, un indicador de beneficio mesurable) ha sido observado en el sujeto. Los fármacos anti-TNFa particularmente preferidos son agentes biológicos que han sido aprobados por la FDA para su uso en humanos en el tratamiento de enfermedades o trastornos mediados por TNFAa e incluyen aquellos fármacos anti-TNFa descritos en la presente.

El término "cromatografía de exclusión de tamaño" o "SEC" incluye un método cromatográfico en el cual moléculas en solución son separadas con base en su tamaño y/o volumen hidrodinámico. Se aplica a moléculas grandes o complejos macromoleculares tales como proteínas y sus conjugados. Típicamente, cuando una solución acuosa se usa para transportar la muestra a través de la columna, la técnica se conoce como cromatografía de filtración en gel.

Los términos "complejo", "imuno-complejo", "conjugado" y "inmunoconjugado" incluyen, pero no están limitados a, TNFa unido (por ejemplo, por medios no covalentes) a un fármaco anti-TNFa, un fármaco anti-TNFa unido (por medio, por medios no covalentes) a un autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNF, y un fármaco anti-TNFa unido (por ejemplo, por medios no covalentes) tanto a TNFa como un autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNFa.

Según se use en la presente, una entidad que es modificada por el término "marcado" incluye cualquier entidad, molécula, proteína, enzima, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, citocina o especie relacionada que se conjuga con otra molécula o entidad química que es empíricamente detectable. Las especies químicas adecuadas como marcadores para entidades marcadas incluyen, pero no están limitadas a, colorantes fluorescentes, por ejemplo colorantes Alexa Fluor® tales como Alexa Fluor® 647, puntos cuánticos, colorantes ópticos, colorantes luminiscentes y radionúclidos, por ejemplo, 125l.

El término "cantidad efectiva" incluye una dosis de un fármaco que es capaz de lograr un efecto terapéutico en un sujeto que lo requiera así como la cantidad biodisponible de un fármaco. El término "biodisponible" incluye la fracción de una dosis administrada de un fármaco que está disponible para actividad terapéutica. Por ejemplo, una cantidad efectiva de un fármaco útil para tratar enfermedades y trastornos en los cuales TNFa ha estado implicado en la patofisiología puede ser la cantidad que sea capaz de prevenir o aliviar uno o más síntomas asociados con la misma.

La frase "detección de marcadores por fluorescencia" incluye un medio para detectar un marcador fluorescente. Los medios de detección incluyen, pero no están limitados a, un espectrómetro, un fluorímetro, un fotómetro, un dispositivo de detección incorporado comúnmente con un instrumento de cromatografía tal como, pero no limitado a, una cromatografía de líquidos de alto rendimiento-exclusión de tamaño, tal como, pero no limitado a, un sistema de HPLC Agilent-1200.

El término "optimización de terapia" u "optimizar terapia" incluye optimizar la dosis (por ejemplo, la cantidad de nivel efectivo) y/o el tipo de una terapia particular. Por ejemplo, optimizar la dosis de un fármaco anti-TNFa incluye incrementar o reducir la cantidad del fármaco anti-TNFa administrado subsecuentemente a un sujeto. En ciertos casos, optimizar el tipo de un fármaco anti-TNFa incluye cambiar el fármaco anti-TNFa administrado de un fármaco a otro fármaco diferente (por ejemplo, un fármaco anti-TNFa diferente). En ciertos otros casos, optimizar la terapia puede incluir co-administrar una dosis de un fármaco anti-TNFa (por ejemplo, a una dosis incrementada, reducida o igual que la dosis previa) en combinación con un fármaco ¡nmunosupresor.

El término "co-administrar" incluye administrar más de un agente activo de tal manera que la duración del efecto fisiológico de un agente activo se superponga con el efecto fisiológico de un segundo agente activo.

El término "sujeto", "paciente" o "individuo" se refiere típicamente a humanos, pero también a otros animales incluyendo, por ejemplo, otros primates, roedores, caninos, felinos, equinos, ovinos, porcinos y similares.

El término "curso de terapia" incluye cualquier enfoque terapéutico tomado para aliviar o prevenir uno o más síntomas asociados con una enfermedad o trastorno mediado por TNFa. El término abarca administrar cualquier compuesto, fármaco, procedimiento y/o régimen útil para mejorar la salud de un individuo con una enfermedad o trastorno mediado por TNFa e incluye cualquiera de los agentes terapéuticos descritos en la presente. Un experto en la técnica apreciará que ya sea el curso de terapia o la dosis del curso de terapia actual pueden ser cambiados (por ejemplo, incrementados o reducidos) con base en la presencia o nivel de concentración de TNFa, fármaco anti- TNFa y/o anticuerpo anti-fármaco usando los métodos de la presente invención.

El término "fármaco inmunosupresor" o "agente inmunosupresor" incluye cualquier sustancia capaz de producir un efecto inmunosupresor, por ejemplo, la prevención o disminución de la respuesta inmunológica, tal como mediante irradiación o por administración de fármacos tales como anti-metabolitos, sueros anti-linfocitos, anticuerpos, etc. Ejemplos de fármacos inmunosupresores incluyen, sin limitación, fármacos de tiopurina tales como azatioprina (AZA) y metabolitos de la misma; anti-metabolitos tales como metotrexato (MTX); sirolimus (rapamicina); temsirolimus; everolimus; tacrolimus (FK-506); FK-778; anticuerpos de globulina anti-linfocitos, anticuerpos de globulina anti-timocitos, anticuerpos anti-CD3, anticuerpos anti-CD4 y conjugados de anticuerpo-toxina; ciclosporina; micofenolato; monofosfato de mizoribina; escoparona; acetato de glatirámero; metabolitos de los mismos; sales farmacéuticamente aceptables de los mismos; derivados de los mismos; profármacos de los mismos y combinaciones de los mismos.

El término "fármaco de tiopurina" incluye azatioprina (AZA), 6-mercaptopurina (6-MP) o cualquier metabolito de los mismos que tenga eficacia terapéutica e incluye, sin limitación, 6-tioguanina (6-TG), ribósido de 6-metilmercaptopurina, nucleotidos de 6-tioinosina (por ejemplo, monofosfato de 6-tioinosina, difosfato de 6-tioinosina, trifosfato de 6-tioinosina), nucleotidos de 6-tioguanina (por ejemplo, monofosfato de 6-tioguanosina, difosfato de 6-tioguanosina, trifosfato de 6-tioguanosina), nucleotidos de 6-tioxantosina (por ejemplo, monofosfato de 6-tioxantosina, difosfato de 6-tioxantosina, trifosfato de 6-tioxantosina), derivados de los mismos, análogos de los mismos y combinaciones de los mismos.

El término "muestra" incluye cualquier espécimen biológico obtenido de un individuo. Las muestras incluyen, sin limitación, sangre entera, plasma, suero, glóbulos rojos, glóbulos blancos (por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica (PB C), células polimorfonucleares (PMN)), fluido de lavado ductal, aspirado de pezón, linfa (por ejemplo, células tumorales diseminadas del nodulo linfático), aspirado de médula ósea, saliva, orina, excremento (es decir, heces), esputo, fluido de lavado bronquial, lágrimas, aspirado con aguja fina (por ejemplo, cosechado mediante aspiración con aguja fina periareolar aleatoria), cualquier otro fluido corporal, una muestra de tejido tal como una biopsia de un sitio de inflamación (por ejemplo, biopsia con aguja), extractos celulares de los mismos y una fracción enriquecida con inmunoglobulina derivada de uno o más de estos fluidos corporales o tejidos. En algunas modalidades, la muestra es sangre entera, un componente fraccional de la misma tal como plasma, suero o un sedimento celular, o una fracción enriquecida con inmunoglobulina de los mismos. Un experto en la técnica apreciará que las muestras tales como muestras de suero pueden ser diluidas antes del análisis. En ciertas modalidades, la muestra se obtiene al aislar PBCMs y/o células PMN usando cualquier técnica conocida en la técnica. En ciertas otras modalidades, la muestra es una biopsia de tejido tal como, por ejemplo, de un sitio de inflamación tal como una porción del tracto gastrointestinal o tejido sinovial.

Las etapas de los métodos de la presente invención no necesariamente tienen que llevarse a cabo en el orden particular en el cual se presentan. Una persona de capacidad ordinaria en la técnica entendería que otros órdenes de las etapas de los métodos de la invención son abarcados dentro del alcance de la presente invención.

Los corchetes, "[ ]" indican que la especie dentro de los corchetes es denominada por su concentración.

III. Descripción de las modalidades La presente invención proporciona ensayos para detectar y medir la presencia o nivel de autoanticuerpos contra terapéuticos de fármaco anti-TNFa en una muestra. La presente invención es útil para optimizar terapia y monitorear pacientes que reciban terapéuticos de fármaco anti-TNFa para detectar la presencia o nivel de autoanticuerpos (por ejemplo, HACA y/o HAHA) contra el fármaco. La presente invención también proporciona métodos para seleccionar terapia, optimizar terapia y/o reducir toxicidad en sujetos que reciban fármacos anti-TNFa para el tratamiento de una enfermedad o trastornos mediados por TNFa.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para detectar la presencia o nivel de un autoanticuerpo contra un fármaco anti-TNFa en una muestra sin interferencia del fármaco anti-TNFa en la muestra, el método comprende: (a) poner en contacto la muestra con un ácido para disociar complejos preformados del autoanticuerpo y el fármaco anti-TNFa, en donde la muestra tiene 0 se sospecha que tiene un autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNFa; (b) poner en contacto la muestra con un fármaco anti-TNFa marcado, después de la disociación de los complejos preformados; (c) neutralizar el ácido en la muestra para formar complejos marcados (es decir, inmuno-complejos o conjugados) del fármaco anti-TNFa marcado y el autoanticuerpo (es decir, en donde el fármaco anti-TNFa marcado y autoanticuerpo no están unidos covalentemente uno al otro); (d) someter los complejos marcados a cromatografía de exclusión de tamaño para separar los complejos marcados (por ejemplo, de fármaco anti-TNFa marcado libre); y (e) detectar los complejos marcados, detectando de esta manera la presencia o nivel del autoanticuerpo sin interferencia del fármaco anti-TNFa en la muestra.

Sin ser limitados por ninguna teoría particular, se cree que la disociación ácida cambia la Kd entre el autoanticuerpo (conocido también como un anticuerpo antifármaco o ADA) y el fármaco anti-TNFa. En particular, se teoriza que la disociación ácida interrumpe los enlaces entre el ADA y el fármaco anti-TNFa. Estos enlaces incluyen, pero no están limitados a, enlaces de hidrógeno, enlaces electrostáticos, fuerzas de Van der Waals y/o enlaces hidrófobos. La adición de ácido incrementa el pH y de esta manera la concentración de iones de hidrógeno se incrementa. Los iones de hidrógeno pueden ahora competir para las interacciones no covalentes mencionadas previamente. Esta competencia reduce la Kd entre el ADA y el fármaco anti-TNFa.

En algunas modalidades, el fármaco anti-TNFa se selecciona del grupo que consiste en REMICADE™ (infliximab), ENBREL™ (etanercept), HUMIRA™ (adalimumab), CIMZIA® (certolizumab pegol), SIMPONI® (golimumab; CNTO 148), y combinaciones de los mismos.

' En otras modalidades, el autoanticuerpo anti-fármaco de TNFa incluye, pero no está limitado a, anticuerpos anti-quiméricos humanos (HACA), anticuerpos anti-humanizados humanos (HAHA) y anticuerpos anti-ratón humanos (HAMA), así como combinaciones de los mismos.

En ciertas modalidades alternativas, las etapas (a) y (b) se llevan a cabo simultáneamente, por ejemplo, la muestra se pone en contacto con un ácido y un fármaco anti-TNFa marcado al mismo tiempo. En ciertas otras modalidades alternativas, la etapa (b) se lleva a cabo antes de la etapa (a), por ejemplo, la muestra se pone en contacto primero con un fármaco anti-TNFa marcado, y luego se pone en contacto con un ácido.

En modalidades adicionales, las etapas (b) y (c) se llevan a cabo simultáneamente, por ejemplo, la muestra se pone en contacto con un fármaco anti-TNFa marcado y se neutraliza (por ejemplo, al poner en contacto la muestra con uno o más agentes neutralizantes) al mismo tiempo.

En modalidades particulares, la muestra se pone en contacto con una cantidad de un ácido que es suficiente para disociar complejos preformados del autoanticuerpo y el fármaco anti-TNFct, de tal manera que el fármaco anti-TNFa marcado, el fármaco anti-TNFa no marcado y el autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNF puedan equilibrarse y formar complejos entre ellos.

En modalidades preferidas, los métodos de la invención comprenden detectar la presencia o nivel del autoanticuerpo sin interferencia sustancial del fármaco anti-TNFa que también está presente en la muestra. En tales modalidades, la muestra puede ser puesta en contacto con una cantidad de un ácido que sea suficiente para permitir la detección y/o medición del autoanticuerpo en presencia de un alto nivel del fármaco anti-TNFa.

En algunas modalidades, la frase "alto nivel de un fármaco anti-TNFa" incluye niveles de fármaco de aproximadamente 10 a alrededor de 100 µ9/?t??_, aproximadamente 20 a alrededor de 80 µ9/?t??_, aproximadamente 30 a alrededor de 70 g/mL o aproximadamente 40 a alrededor de 80 µ9/???_. En otras modalidades, la frase "alto nivel de un fármaco anti-TNFa" incluye niveles de fármaco mayores que o iguales a aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100 µg mL.

En algunas modalidades, el ácido comprende un ácido orgánico. En otras modalidades, el ácido comprende un ácido inorgánico. En modalidades adicionales, el ácido comprende una mezcla de un ácido orgánico y un ácido inorgánico. Ejemplos no limitativos de ácidos orgánicos incluyen ácido cítrico, ácido isocítrico, ácido glutámico, ácido acético, ácido láctico, ácido fórmico, ácido oxálico, ácido úrico, ácido trifluoroacético, ácido bencensulfónico, ácido aminometansulfónico, ácido alcanfor-10-sulfónico, ácido cloroacético, ácido bromoacético, ácido yodoacético, ácido propanoico, ácido butanoico, ácido glicérico, ácido succínico, ácido málico, ácido aspártico y combinaciones de los mismos. Ejemplos no limitativos de ácidos inorgánicos incluyen ácido clorhídrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido bórico, ácido fluorhídrico, ácido bromhídrico y combinaciones de los mismos.

En ciertas modalidades, la cantidad de un ácido corresponde a una concentración de aproximadamente 0.1 M a alrededor de 10 M, aproximadamente 0.1 M a alrededor de 5M, aproximadamente 0.1 M a alrededor de 2M, aproximadamente 0.2M a alrededor de 1 M, o aproximadamente 0.25M a alrededor de 0.75M de un ácido o una mezcla de ácidos. En otras modalidades, la cantidad de un ácido corresponde a una concentración de más de o igual a aproximadamente 0.01 M, 0.05M, 0.1 M, 0.2M, 0.3M, 0.4M, 0.5M, 0.6M, 0.7M, 0.8M, 0.9M, 1 M, 2M, 3M, 4M, 5M, 6M, 7 , 8M, 9M o 10M de un ácido o una mezcla de ácidos. El pH del ácido puede ser, por ejemplo, aproximadamente 0.1 , 0.5, 1.0, 1 .5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0 ó 6.5.

En algunas modalidades, la muestra se pone en contacto con un ácido en una cantidad de tiempo que es suficiente para disociar complejos preformados del anticuerpo y el fármaco anti-TNFa. En ciertos casos, la muestra se pone en contacto (por ejemplo, se incuban) con un ácido durante un periodo de tiempo que varía de aproximadamente 0.1 hora a alrededor de 24 horas, aproximadamente 0.2 hora a alrededor de 16 horas, aproximadamente 0.5 hora a alrededor de 10 horas, aproximadamente 0.5 hora a alrededor de 5 horas, o aproximadamente 0.5 hora a alrededor de 2 horas. En otros casos, la muestra se pone en contacto (por ejemplo, se incuba) con un ácido durante un periodo de tiempo que es mayor que o igual a aproximadamente 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1 , 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 horas. La muestra se puede poner en contacto con un ácido a 4°C, temperatura ambiente (RT) o 37°C.

En ciertas modalidades, la etapa de neutralizar el ácido comprende elevar el pH de la muestra para permitir la formación de complejos entre el fármaco anti-TNFa marcado y el autoanticuerpo cuando el fármaco anti-TNFa así como complejos entre el fármaco anti-TNFa no marcado y el autoanticuerpo. En algunas modalidades, el ácido es neutralizado por la adición de uno o más agentes neutralizantes tales como, por ejemplo, bases fuertes, bases débiles, soluciones reguladores de pH y combinaciones de los mismos. Un experto en la técnica apreciará que las reacciones de neutralización no necesariamente implican un pH resultante de 7. En algunos casos, la neutralización ácida se traduce en una muestra que es básica. En otros casos, la neutralización ácida se traduce en una muestra que es ácida (pero más alta que el pH de la muestra antes de añadir el agente neutralizante). En modalidades particulares, el agente neutralizante comprende un regulador de pH tal como solución salina de pH regulado con fosfato (por ejemplo, 10x PBS) a un pH de aproximadamente 7.3.

En algunas modalidades, la etapa (b) comprende además poner en contacto un control interno con la muestra junto con un fármaco anti-TNFa marcado (por ejemplo, antes, durante o después de la disociación de los complejos preformados). En ciertos casos, el control interno comprende un control interno marcado tal como, por ejemplo, Biocitina-Alexa 488. En ciertos otros casos, la cantidad del control interno marcado varía de aproximadamente 20 ng, alrededor de 1 ng a aproximadamente 20 ng, alrededor de 1 ng a aproximadamente 10 ng, o alrededor de 1 ng a aproximadamente 5 ng por 100 µ?_ de muestra analizada. En casos adicionales, la cantidad del control interno marcado es mayor que o igual a aproximadamente 1 ng, 5 ng, 10 ng, 15 ng, 20 ng o 25 ng por 100 µ?_ de muestra analizada.

Como un ejemplo no limitativo de los métodos de la presente invención, muestras tales como muestras de suero (por ejemplo, suero de sujetos que reciben terapia con un fármaco anti-TNFa tal como Remicade (IFX)) pueden ser incubadas con ácido cítrico 0.5M, pH 3.0 durante una hora a temperatura ambiente. Después de la disociación de los complejos preformados entre fármaco anti-TNFa (no marcado) y autoanticuerpos contra el fármaco anti-TNFa (por ejemplo, anticuerpos anti-fármaco tales como anticuerpos anti-IFX (ATI)), fármaco anti-TNFa marcado (por ejemplo, IFX-Alexa 488) y un control interno pueden añadirse y la mezcla de reacción y (por ejemplo, inmediatamente) neutralizarse con agentes neutralizantes tales como 10x PBS, pH 7.3. Después de la neutralización, la mezcla de reacción puede incubarse durante otra hora a temperatura ambiente (por ejemplo, en un agitador de placa) para permitir el equilibrio y completar la reformación de complejos inmunes entre el fármaco anti-TNFa y el anticuerpo anti-fármaco ya sea marcado o no marcado. Las muestras pueden ser luego filtradas y analizadas por SEC-HPLC como se describe en la presente.

En modalidades particulares, los métodos de la presente invención (por ejemplo, que comprenden disociación con ácido seguida por cinética de unión en fase de solución homogénea) incrementan significativamente la tolerancia a fármaco IFX de tal manera que el ATI pueda medirse en presencia de IFX hasta aproximadamente 60 µg/mL. Véase ejemplo 14 y figuras 27-28. En otras palabras, los métodos de la invención pueden detectar la presencia o nivel de autoanticuerpos contra fármacos anti-TNFa tales como ATI así como autoanticuerpos contra otros fármacos anti-TNFa en presencia de altos niveles de fármacos anti-TNFa (por ejemplo, IFX), pero sin interferencia sustancial de los mismos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para optimizar terapia y/o reducir toxicidad contra un fármaco anti-TNFa en un sujeto que reciba un curso de terapia con el fármaco anti-TNFa, el método comprende: (a) detectar la presencia o nivel de un autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNFa en una muestra del sujeto sin interferencia del fármaco anti-TNFa en la muestra, el método comprende: (i) poner en contacto la muestra con un ácido par disociar complejos preformados del autoanticuerpo y el fármaco anti-TNFa, en donde la muestra tiene o se sospecha que tiene un autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNFa; (ii) poner en contacto una muestra con un fármaco anti-TNFa marcado después de la disociación de los complejos preformados; (iii) neutralizar el ácido en la muestra para formar complejos marcados (es decir, inmuno-complejos o conjugados) del fármaco anti-TNFa marcado y el autoanticuerpo (es decir, en donde el fármaco anti-TNFa marcado y autoanticuerpo no están unidos covalentemente uno al otro); (iv) someter los complejos marcados a cromatografía de exclusión de tamaño para separar los complejos marcados (por ejemplo, del fármaco anti-TNFa marcado libre); y (v) detectar los complejos marcados (por ejemplo, detectando de esta manera la presencia o nivel del autoanticuerpo sin interferencia del fármaco anti-TNFa en la muestra); y (b) determinar una dosis subsecuente del curso de terapia para el sujeto o si un curso de terapia diferente debe ser administrado al sujeto con base en la presencia o nivel del autoanticuerpo, optimizando de esta manera la terapia y/o reduciendo la toxicidad contra el fármaco anti-TNFa.

En ciertas modalidades, la dosis subsecuente del curso de terapia es incrementada, reducida o mantenida con base en la presencia o nivel del autoanticuerpo. Como un ejemplo no limitativo, una dosis subsecuente del curso de terapia se reduce cuando un alto nivel del autoanticuerpo se detecte en la muestra. En otras modalidades, el curso de terapia diferente comprende un fármaco anti-TNFa diferente, el curso de terapia actual junto con un agente ¡nmunosupresor o cambiar por un curso de terapia que no sea un fármaco anti-TNFa (por ejemplo, descontinuar el uso de un anticuerpo terapéutico anti-TNFa). Como un ejemplo no limitativo, un curso de terapia diferente se administra cuando se detecte un alto nivel del autoanticuerpo en la muestra.

En ciertas modalidades alternativas, las etapas (i) y (ii) se llevan a cabo simultáneamente, por ejemplo, la muestra se pone en contacto con un ácido y un fármaco anti-TNFa marcado al mismo tiempo. En ciertas otras modalidades y alternativas, la etapa (¡i) se lleva a cabo antes de la etapa (i), por ejemplo, la muestra es primero puesta en contacto con un fármaco anti-TNFa marcado, y luego puesto en contacto con un ácido. En modalidades adicionales, las etapas (ii) y (¡ii) se llevan a cabo simultáneamente, por ejemplo, la muestra se pone en contacto con un fármaco anti-TNFa marcado y se neutraliza (por ejemplo, al poner en contacto la muestra con uno o más agentes neutralizantes) al mismo tiempo.

Un fármaco anti-TNFa puede ser marcado con una variedad de grupos detectables. En modalidades particulares, un fármaco anti-TNFa es marcado con un fluoróforo o un colorante fluorescente. Ejemplos no limitativos de fluoróforos o colorantes fluorescentes incluyen aquellos listados en el Catálogo de Sondas Moleculares, el cual se incorpora en la presente por referencia (véase, R. Haugland, The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 10a edición, Molecular probes, Inc. (2005)). Estos fluoróforos o colorantes fluorescentes ejemplares incluyen, pero no están limitados a, colorantes Alexa Fluor® tales como Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 405, Alexa Fluor® 430, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 514, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 610, Alexa Fluor® 633, Alexa Fluor® 635, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, Alexa Fluor® 700, Alexa Fluor® 750, y/o Alexa Fluor® 790, así como otros fluoróforos incluyendo, pero no limitados a, cloruro de dansilo (DNS-CI), 5-(yodoacetamida)fluoresceína (5-IAF), 5-isotiocianato de fluoresceína (FITC), 5-(y 6-)isotiocianato de tetrametilrodamina (TRlTC), 6-acriloil-2-dimetilaminonaftaleno (acrilodan), cloruro de 7-nitrobenzo-2-oxa-1 ,3-diazol-4-ilo (NBD-CI), bromuro de etidio, amarillo Lucifer, clorhidrato de 5-carboxirrodamina 6G, cloruro de sulfonilo de lisamina rodamina B, cloruro de sulfonilo Rojo Texas®, BODIPY™, ácidos sulfónicos de naftalamina (por ejemplo, ácido 1 -anilinonaftaleno-8-sulfónico (ANS), ácido 6-(p-toluidinil)naftalen-e-2-sulfónico (TNS), y similares), ácido graso de antroilo, DPH, ácido parinárico, TMA-DPH, ácido graso de fluorenilo, fluoresceína-fosfatidiletanolamina, Rojo Texas-fosfatidiletanolamina, pirenilo-fosfatidilcolina, fluorenil-fosfotidilcolina, merocianina 540, 1 -(3-sulfonatopropil)-4-[3-[2[(di-n-butilamino)-6-naftil]vinil]piridinio betaína (naftilo estirilo), 3,3'-dipropiltiadicarbocianina (diS-C3-(5)), 4-(p-dipentilaminoestiril)-1 -metilpiridinio (di-5-ASP), Cy-3-yodo-acetamida, Cy-5-?-hidroxisuccinimida, Cy-7-isotiocianato, rodamina 800, IR-125, anaranjado de tiazol, azure B, azul Nilo, ftalocianina de aluminio, oxaxina 1 ,4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), Hoechst 33342, TOTO, anaranjado de acridina, homodímero de etidio, N(etoxicarbonilmetil)-6-metoxiquinolinio (MQAE), Fura-2, verde calcio, carboxi SNARF-6, BAPTA, cumarina, fitofluoros, coroneno, complejos de metales-ligandos, IRDye® 700DX, IRDye® 700, IRDye® 800RS, IRDye® 800CW, IRDye® 800, Cy5, Cy5.5, Cy7, DY 676, DY680, DY682, DY780, y mezclas de los mismos. Los fluoróforos adecuados adicionales incluyen cofactores de enzimas; lantánido, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente amarilla, proteína fluorescente roja o mutantes y derivados de los mismos. En una modalidad de la invención, el segundo miembro del par de unión específico tiene un grupo detectable unido al mismo.

Típicamente, el grupo fluorescente es un fluoróforo seleccionado de la categoría de colorantes que comprenden polimetinas, ftalocianinas, cianinas, xantenos, fluorenos, rodaminas, cumarinas, fluoresceínas y BODIPY™.

En una modalidad, el grupo fluorescente es un fluoróforo casi infrarrojo (NIR) que emite en el intervalo de entre aproximadamente 650 a alrededor de 900 nm. El uso de tecnología de fluorescencia casi infrarroja es adecuado en ensayos biológicos toda vez que elimina o reduce sustancialmente el fondo de auto-fluorescencia de biosubstratos. Otro beneficio para la tecnología fluorescente casi IR es que la luz dispersada desde la fuente de excitación se reduce ampliamente toda vez que la intensidad de dispersión es proporcional a la cuarta potencia inversa de la longitud de onda. Baja fluorescencia de fondo y baja dispersión se traducen en una alta relación señal a ruido, lo cual es esencial para la detección altamente sensible. Más aún, la ventana ópticamente transparente en la región casi IR (650 nm a 900 nm) en tejido biológico hacia la fluorescencia NIR una valiosa tecnología para la formación de imágenes in vivo y aplicaciones de detección subcelular que requieran la transmisión de luz a través de componentes biológicos. Dentro de los aspectos de esta modalidad, el fluoróforo casi infrarrojo (NIR) se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en IRDye® 700DX, IRDye® 700, IRDye® 800RS, IRDye® 800CW, IRDye® 800, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, Alexa Fluor® 700, Alexa Fluor® 750, Alexa Fluor® 790, Cy5, Cy5.5, Cy7, DY 676, DY680, DY682 y DY780. En ciertas modalidades, el grupo casi infrarrojo es IRDye® 800CW, IRDye® 800, IRDye® 700DX, IRDye® 700, o Dynomic DY676.

El marcado fluorescente se logra usando un derivado químicamente reactivo de un fluoróforo. Los grupos reactivos comunes incluyen derivados de isotiocianato reactivos con amina tales como FITC y TRITC (derivados de fluoresceína y rodamina), ásteres de succinimidilo reactivos con amina tales como NHS-fluoresceína, y flúores activados con maleimida reactivos con sulfhidrilo tales como fluoresceína-5-maleimida, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. La reacción de cualquiera de estos colorantes reactivos con un fármaco anti-TNFoc se traduce en una unión covalente estable formada entre un fluoróforo y un fármaco anti-TNFa.

En ciertos casos, después de una reacción de marcado fluorescente, comúnmente es necesario remover cualquier fluoróforo no reaccionado en la molécula objetivo marcada. Esto se logra comúnmente mediante cromatografía de exclusión de tamaño, tomando ventaja de la diferencia en tamaño entre fluoróforo y proteína marcada.

Los colorantes fluorescentes reactivos están disponibles de muchas fuentes. Se pueden obtener con diferentes grupos reactivos para fijación a varios grupos funcionales dentro de la molécula objetivo. También están disponibles en kits de marcado que contienen todos los componentes para llevar a cabo una reacción de marcado. En una modalidad particular, Alexa Fluor® 647 C2 maleimida se usa de Invitrogen (No. de catálogo A-20347).

La unión inmunológica específica de un anticuerpo anti-fármaco (ADA) a un fármaco anti-TNFa puede detectarse directa o indirectamente. Los marcadores directos incluyen marcadores fluorescentes o luminiscentes, metales, colorantes, radionúclidos y similares, unidos al anticuerpo. En ciertos casos, un fármaco anti-TNFa que es marcado con yodo-125 (125l) puede usarse para determinar la concentración de ADA en una muestra. En otros casos, un ensayo de quimioluminiscencia usando un fármaco anti-TNFa quimioluminiscente que sea específico para ADA en una muestra es adecuado para la detección sensible y no radiactiva de los niveles de concentración de ADA. En casos particulares, un fármaco anti-TNFa que sea marcado con un fluorocromo también es adecuado para determinar los niveles de concentración de ADA en una muestra. Ejemplos de fluorocromos incluyen, sin limitación, colorantes Alexa Fluor®, DAPI, fluoresceína, Hoechst 33258, R-f¡coc¡an¡na, B-ficoeritrina, R-ficoeritrina, rodamina, rojo Texas, y Nsamina. Los anticuerpos secundarios ligados a fluorocromos pueden ser obtenidos comercialmente, por ejemplo, IgG-FITC anti-humano de F(ab')2 de cabra está disponible de Tago Immunologicals (Burlingame, CA).

Los marcadores indirectos incluyen varias enzimas bien conocidas en la técnica, tales como peroxidasa de rábano (HRP), fosfatasa alcalina (AP), ß-galactosidasa, ureasa, y similares. Se puede usar un sistema de detección de peroxidasa de rábano, por ejemplo, con el substrato cromogénico de tetrametilbencidina (TMB), el cual produce un producto soluble en presencia de peróxido de hidrógeno que es detectable a 450 nm. Un sistema de detección con fosfatasa alcalina puede usarse con el substrato cromogénico fosfato de p-nitrofenilo, por ejemplo, el cual crea un producto soluble fácilmente detectable a 405 nm. Similarmente, un sistema de detección de ß-galactosidasa puede usarse con el substrato cromogénico o-nitrofenil-p-D-galactopiranósido (ONPG), el cual crea un producto soluble detectable a 410 nm. Se puede usar un sistema de detección de ureasa con un substrato tal como púrpura de urea-bromocresol (Sigma Immunochemicals; St. Louis, O). Un anticuerpo secundario útil ligado a una enzima puede obtenerse de un número de fuentes comerciales, por ejemplo, IgG anti-humana-fosfatasa alcalina de F(ab')2 de cabra puede comprarse de Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA).

Una señal del marcador directo o indirecto puede analizarse, por ejemplo, usando un espectrofotómetro para detectar el color de un substrato cromogénico; un contador de radiación para detectar radiación tal como un contador gama para detección de 125l; o un fluorómetro para detectar fluorescencia en presencia de luz de cierta longitud de onda. Para la detección de anticuerpos ligados a enzimas, se puede hacer un análisis cuantitativo de la cantidad de uno o una pluralidad de isotipos de ADA usando un espectrofotómetro tal como un lector de microplaca EMAX (Molecular Devices, Menlo Park, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Si se desea, los ensayos de la presente invención pueden ser automáticos o llevarse a cabo robóticamente, y la señal de varias muestras puede detectarse simultáneamente.

En ciertas modalidades, se usa cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). El principio subyacente de SEC es que partículas de diferentes tamaños eluirán (se filtrarán) a través de una fase estacionaria a diferentes velocidades. Esto se traduce en la separación de una solución de partículas con base en tamaño. Siempre y cuando todas las partículas se carguen simultáneamente o casi simultáneamente, las partículas del mismo tamaño son eluidas juntas. Cada columna de exclusión de tamaño tiene una gama de pesos moleculares que pueden ser separados. El límite de exclusión define el peso molecular en el extremo superior de este intervalo y es donde las moléculas son demasiado grandes como para ser atrapadas en la fase estacionaria. El límite de permeacion define el peso molecular en el extremo inferior del intervalo de separación y es donde las moléculas de un tamaño suficientemente pequeño pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria completamente y todas las moléculas debajo de esta masa molecular son tan pequeñas que eluyen como una sola banda.

En ciertos aspectos, el eluyente se recoge en volúmenes constantes, o fracciones. Entre más similares sean las partículas en tamaño, más probable que estén en la misma fracción y no se detecten por separado. De preferencia, las fracciones recogidas son examinadas por técnicas espectroscópicas para determinar la concentración de las partículas eluidas. Típicamente, las técnicas de detección por espectroscopia útiles en la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, fluorometría, índice de refracción (Rl) y ultravioleta (UV). En ciertos casos, el volumen de elución se reduce casi linealmente con el logaritmo del volumen hidrodinámico molecular (es decir, las porciones más pesadas se desprenden primero).

La presente invención proporciona además un kit para detectar la presencia o nivel de un autoanticuerpo contra un fármaco anti-TNFa en una muestra. En modalidades particulares, el kit comprende uno o más de los siguientes componentes: un ácido (o mezcla de ácidos), un fármaco anti-TNFa marcado (por ejemplo, un anticuerpo anti-TNFa marcado), un control interno marcado, un agente neutralizante (o mezclas de los mismos), medios para detección (por ejemplo, un detector de fluorescencia), un instrumento de cromatografía de líquidos de alto rendimiento-exclusión de tamaño (SE-HPLC) y/o instrucciones para usar el kit.

En otros aspectos, la presente invención proporciona un método para seleccionar un curso de terapia (por ejemplo, seleccionar un fármaco anti-TNFa adecuado) para el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por TNFa en un sujeto, el método comprende: (a) analizar una muestra obtenida del sujeto para determinar la presencia, nivel o genotipo de uno o más marcadores en la muestra; (b) aplicar un algoritmo estadístico a la presencia, nivel o genotipo del uno o más marcadores determinados en la etapa (a) para generar un índice de actividad/severidad de enfermedad; y (c) seleccionar un curso de terapia adecuado (por ejemplo, terapia con anti-TNFa) para el sujeto con base en el índice de actividad/severidad de enfermedad.

En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona un método para optimizar terapia y/o reducir toxicidad en un sujeto que reciba un curso de terapia para el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por TNFa, el método comprende: (a) analizar una muestra obtenida del sujeto para determinar la presencia, nivel o genotipo de uno o más marcadores en la muestra; (b) aplicar un algoritmo estadístico a la presencia, nivel o genotipo del uno o más marcadores determinados en la etapa (a) para generar un índice de actividad/severidad de enfermedad; y (c) determinar una dosis subsecuente del curso de terapia para el sujeto o si un curso de terapia diferente debe ser administrado al sujeto con base en el índice de actividad/severidad de enfermedad.

En algunas modalidades, el curso de terapia comprende un anticuerpo anti-TNFa. En ciertos casos, el anticuerpo anti-TNFoc es un miembro seleccionado del grupo que consiste en REMICADE™ (infliximab), ENBREL™ (etanercept), HUMIRA™ (adalimumab), CIMZIA® (certolizumab pegol), SIMPONI® (golimumab; CNTO 148), y combinaciones de los mismos. En otras modalidades, el curso de terapia comprende un anticuerpo anti-TNFa junto con un agente inmunosupresor.

En ciertas modalidades, el nivel de uno o más marcadores comprende un nivel total, un nivel de activación o combinaciones de los mismos. En casos particulares, el uno o más marcadores es un miembro seleccionado del grupo que consiste en un marcador inflamatorio, un factor de crecimiento, un marcador de serología, una citocina y/o quimiocina, un marcador de estrés oxidante, un receptor de superficie celular, un marcador de vía de señalización, un marcador genético, un anticuerpo anti-TNFa, un anticuerpo anti-fármaco (ADA) y combinaciones de los mismos.

En algunos casos, el marcador inflamatorio es un miembro seleccionado del grupo que consiste en CRP, SAA, VCAM, ICAM, calprotectina, lactoferrina, IL-8, Rantes, TNFa, IL-6, IL-1 ß, S100A12, M2-piruvato cinasa (PK), IFN, IL-2, TGF, IL-13, IL-15, IL-12, y combinaciones de los mismos. En otros casos, el factor de crecimiento es un miembro seleccionado del grupo que consiste en GM-CSF, VEGF, EGF, factor de crecimiento de queratinocitos (KGF; FGF7), y combinaciones de los mismos. En otros casos más, el marcador de serología es un miembro seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo anti-neutrófilos, un anticuerpo anti-microbiano, un anticuerpo anti-Saccharomyces cerevisiae, y combinaciones de los mismos. En casos adicionales, la citocina es un miembro seleccionado del grupo que consiste en TNFoc, IL-6, I L- 1 ß , IFN-?, IL-10, y combinaciones de los mismos. En otros casos, el receptor de superficies celular es CD64. En otros casos más, el marcador de vía de señalización es una molécula de transducción de señales. En otros casos, el marcador genético es una mutación en un gen de la vía inflamatoria.

En ciertas modalidades, la etapa (a) comprende determinar la presencia, nivel y/o genotipo de al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, quince, veinte, treinta, cuarenta, cincuenta o más marcadores en la muestra. En ciertos casos, la muestra se selecciona del grupo que consiste en suero, plasma, sangre entera, heces, células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células polimorfonucleares (PMN) y una biopsia de tejido.

En otras modalidades, el algoritmo estadístico comprende un sistema clasificador estadístico de aprendizaje. En algunos casos, el sistema clasificador estadístico de aprendizaje se selecciona del grupo que consiste en un bosque aleatorio, árbol de clasificación y regresión, árbol reforzado, red neural, máquina de vectores de soporte, modelo detector de interacción automático de cuadrados chi general, árbol interactivo, estría de regresión muitiadaptiva, clasificador de aprendizaje de máquina y combinaciones de los mismos. En ciertos casos, el algoritmo estadístico comprende un solo sistema clasificador estadístico de aprendizaje. En ciertos otros casos, el algoritmo estadístico comprende una combinación de al menos dos sistemas clasificadores estadísticos de aprendizaje. En algunos casos, los por lo menos dos sistemas clasificadores estadísticos de aprendizaje se aplican en tándem. Ejemplos no limitativos de algoritmos estadísticos y análisis adecuados para usarse en la invención se describen en la solicitud internacional No. PCT/US201 1/056777, presentada el 18 de octubre de 201 1 , la descripción de la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

En algunas modalidades, el método comprende además enviar los resultados de la selección o determinación de la etapa (c) a un médico. En otras modalidades, la etapa (c) comprende seleccionar un curso de terapia inicial para un sujeto.

En otras modalidades, la etapa (b) comprende además aplicar un algoritmo estadístico a la presencia, nivel o genotipo de uno o más marcadores determinados en un momento anterior durante el curso de terapia para generar un índice de actividad/severidad de enfermedad anterior. En algunos casos, el índice de actividad/severidad de enfermedad anterior se compara con el índice de actividad/severidad de enfermedad generada en la etapa (b) para determinar una dosis subsecuente del curso de terapia o si un curso de terapia diferente debe ser administrado. En ciertas modalidades, la dosis subsecuente del curso de terapia es incrementada, reducida o mantenida con base en el índice de actividad/severidad de enfermedad generado en la etapa (b). En algunos casos, el curso de terapia diferente comprende un anticuerpo anti-TNFa diferente. En otros casos, el curso de terapia diferente comprende el curso de terapia actual junto con un agente inmunosupresor.

Métodos para detectar anticuerpos anti-TNFa y anticuerpos anti-fármaco (ADA) se describen en la presente y en la publicación de PCT No. WO 201 1/056590, la descripción de la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos. En modalidades particulares, la presencia o nivel de anticuerpos anti-fármaco se determina de acuerdo con los métodos de la invención que comprenden una etapa de disociación con ácido al poner en contacto una muestra con un ácido antes de, durante y/o después de poner en contacto la muestra con un fármaco anti-TNFa marcado.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para predecir el curso de una enfermedad o trastorno mediada por TNFa en un sujeto, el método comprende: (a) analizar una muestra obtenida del sujeto para determinar la presencia, nivel o genotipo de uno o más marcadores en la muestra; (b) aplicar un algoritmo estadístico a la presencia, nivel o genotipo del uno o más marcadores determinados en la etapa (a) para generar un índice de actividad/severidad de enfermedad; y (c) predecir el curso de la enfermedad o trastorno mediado por NTFa con base en el índice de actividad/severidad de enfermedad generado en la etapa (b).

En algunas modalidades, la etapa (b) comprende además aplicar un algoritmo estadístico a la presencia, nivel o genotipo de uno o más de los marcadores determinados en un momento anterior para generar un índice de actividad/severidad de enfermedad anterior. En ciertos casos, el índice de actividad/severidad de enfermedad "anterior se compara con el índice de actividad/severidad de enfermedad generado en la etapa (b) para predecir el curso de la enfermedad o trastorno mediado por TNFa.

Una vez que el diagnóstico o pronóstico de un sujeto que reciba terapia con fármacos anti-TNFa ha sido determinado o la probabilidad de respuesta a un fármaco anti-TNFa ha sido predicha en un sujeto diagnosticado con una enfermedad y trastorno en el cual TNFa ha estado implicado en la patofisiología, por ejemplo, pero no limitado a, choque, sepsis, infecciones, enfermedades autoinmunes, RA, enfermedad de Crohn, rechazo de trasplante y enfermedad de injerto contra huésped, de acuerdo con los métodos descritos aquí, la presente invención puede comprender además recomendar un curso de terapia con base en el diagnóstico, pronóstico o predicción. En ciertos casos, la presente invención puede comprender además administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un fármaco anti-TNFa útil para tratar uno o más síntomas asociados con el trastorno o enfermedad mediado por TNFo . Para aplicaciones terapéuticas, el fármaco anti-TNFocpuede ser administrado solo o co-administrado en combinación con uno o más fármacos anti-TNFa adicionales y/o uno o más fármacos que reduzcan los eventos secundarios asociados con el fármaco anti-TNFa (por ejemplo, un agente inmunosupresor). Así, la presente invención hace posible adecuadamente que un médico practique "medicina personalizada" al guiar decisiones de tratamiento e informar selección de terapia y optimización para fármacos anti-TNFa de tal manera que el fármaco correcto se dé al paciente correcto en el momento correcto.

IV. índice de actividad/severidad de enfermedad En ciertos aspectos, la presente invención proporciona un análisis a base de algoritmos de uno o una pluralidad (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más) biomarcadores para mejorar la precisión de seleccionar terapia, optimizar terapia, reducir toxicidad y/o monitorear la eficacia de tratamiento terapéutico para terapia con fármacos anti-TNFa.

Como un ejemplo no limitativo, el índice de actividad/severidad de enfermedad en una modalidad comprende detectar, medir o determinar la presencia, nivel (concentración (por ejemplo, total) y/o activación (por ejemplo, fosforilación)), o genotipo de uno o más biomarcadores específicos en una o más de las siguientes categorías de biomarcadores: (1 ) Marcadores inflamatorios (2) Factores de crecimiento (3) Serología (por ejemplo, marcadores inmunes) (4) Citocinas y quimosinas (5) Marcadores de estrés oxidante (6) Receptores de superficie celular (por ejemplo, CD64, otros) (7) Vías de señalización (8) Otros marcadores (por ejemplo, marcadores genéticos tales como genes de la vía inflamatoria).

En modalidades adicionales, la presencia y/o nivel de uno o ambos de los siguientes marcadores también puede ser detectada, medida o determinada en una muestra de paciente (por ejemplo, una muestra de suero de un paciente en una terapia con fármaco anti-TNFa): (9) niveles de fármacos anti-TNFa (por ejemplo, niveles de anticuerpo terapéutico anti-TNFa libre); y/o (10) niveles de anticuerpo anti-fármaco (ADA) (por ejemplo, niveles de autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNFa).

Un solo algoritmo estadístico o una combinación de dos o más algoritmos estadísticos descritos en la presente pueden ser entonces aplicados a la presencia, nivel de concentración, nivel de activación o genotipo de los marcadores detectados, medidos o determinados en la muestra para de esta manera seleccionar terapia, optimizar terapia, reducir toxicidad o monitorear la eficacia del tratamiento terapéutico con un fármaco anti-TNFa. De esta manera, los métodos de la invención encuentran utilidad en la determinación del manejo de pacientes al determinar el estado inmunológico del paciente.

El entendimiento del curso clínico de enfermedad hará posible a los médicos tomar mejores decisiones de tratamiento informadas para sus pacientes con enfermedades inflamatorias (por ejemplo, IBD (por ejemplo, enfermedad de Crohn), artritis reumatoide (RA), otras) y puede ayudar a dirigir el desarrollo de nuevos fármacos en el futuro. Los biomarcadores ideales para usarse en el índice de actividad/severidad de enfermedad descrito en la presente deben ser capaces de identificar individuos en riesgo de la enfermedad y deben ser específicos de enfermedad. Además, los biomarcadores deben ser capaces de detectar actividad de enfermedad y monitorear el efecto de tratamiento; y deben tener un valor predictivo hacia recaída o recurrencia de la enfermedad. Predecir el curso de enfermedad, sin embargo, ha sido ahora expandido más allá de sólo recurrencia de la enfermedad, pero tal vez más importantemente para incluir predictores de complicaciones de enfermedad incluyendo cirugía. La presente invención es particularmente adecuada porque proporciona indicadores de actividad y/o severidad de enfermedad que hace posible una predicción del riesgo de recaída en aquellos pacientes en remisión. Además, los biomarcadores e índice de actividad/severidad de enfermedad de la presente invención tienen enormes implicaciones para el manejo de pacientes así como la toma de decisiones terapéuticas y podría ayudar o asistir en dirigir la terapia adecuada para aquellos pacientes quienes muy probablemente se beneficiarían de ella y evitar el gasto y potencial toxicidad de la terapia de mantenimiento crónica en aquellos quienes estén en bajo riesgo de recurrencia.

A. Marcadores inflamatorios Aunque el curso de enfermedad de una enfermedad inflamatoria se mide típicamente en términos de actividad inflamatoria por pruebas no invasivas usando recuentos de glóbulos blancos, este método tiene baja especificidad y muestra correlación limitada con la actividad de la enfermedad.

De esta manera, en ciertas modalidades, una variedad de marcadores inflamatorios, incluyendo marcadores bioquímicos, marcadores serológicos, marcadores de proteínas, marcadores genéticos y otras características clínicas o ecográficas, son particularmente útiles en los métodos de la presente invención para seleccionar terapia, optimizar terapia, reducir toxicidad y/o monitorear la eficacia de tratamiento terapéutico con uno o más agentes terapéuticos tales como biológicos (por ejemplo, fármacos anti-TNFa). En ciertos aspectos, los métodos descritos en la presente utilizan la aplicación de un algoritmo (por ejemplo, análisis estadístico) para la presencia, nivel de concentración y/o genotipo determinados para uno o más marcadores inflamatorios (por ejemplo, solos o en combinación con biomarcadores para otras categorías) para ayudar o asistir en predecir curso de enfermedad, seleccionar una terapia adecuada con fármaco anti-TNFa, optimizar la terapia con fármaco anti-TNFa, reducir toxicidad asociada con una terapia con fármaco anti-TNFa, o monitorear la eficacia de tratamiento terapéutico con un fármaco anti-TNFa.

Ejemplos no limitativos de marcadores inflamatorios adecuados para usarse en la presente invención incluyen marcadores bioquímicos, serológicos y proteínicos, tales como por ejemplo, citocinas, quimiocinas, proteínas de fase aguda, moléculas de adhesión celular, proteínas S100 y/u otros marcadores inflamatorios. 1. Citocinas y quimiocinas La determinación de la presencia o nivel de al menos una citocina o quimiocina en una muestra es particularmente útil en la presente invención. Según se usa en la presente, el término "citocina" incluye cualquiera de una variedad de polipéptidos o proteínas secretados por células inmunes que regulan una gama de funciones de sistema inmunológico y abarca citocinas pequeñas tales como quimiocinas. El término "citocina" incluye también adipocitocinas, las cuales comprenden un grupo de citocinas secretadas por adipocitos que funcionan, por ejemplo, en la regulación del peso corporal, hematopoyesis, angiogénesis, sanación de heridas, resistencia a insulina, la respuesta inmune y la respuesta inflamatoria.

En ciertos aspectos, se determina en una muestra la presencia o nivel de al menos una citocina que incluye, pero no está limitada a, TNF- , inductor de apoptosis débil relacionado con TNF (TWEAK), osteoprotegerina (OPG), IFN-a, IFN-ß, IFN-?, ll_-1 a, ??_-1 ß, antagonista del receptor de IL-1 (IL-1 ra), IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, receptor de IL-6 soluble (SIL-6R), IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-23 e IL-27. En ciertos otros aspectos, la presencia o nivel de al menos una quimiocina tal como, por ejemplo, CXCL1/GR01/GROoc, CXCL2/GR02, CXCL3/GR03, CXCL4/PF-4, CXCL5/ENA-78, CXCL6/GCP-2, CXCL7/NAP-2, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CXCL1 1/l-TAC, CXCL12/SDF-1 , CXCL13/BCA-1 , CXCL14/BRAK, CXCL15, CXCL16, CXCL17/DMC, CCL1 , CCL2/MCP-1 , CCL3/MIP-1 a, CCL4/MIP-13, CCL5/RANTES, CCL6/C10, CCL7/MCP-3, CCL8/MCP-2, CCL9/CCL10, CCL1 1/Eotaxin, CCL12/MCP-5, CCL13/ CP-4, CCL14/HCC-1 , CCL15/MIP-5, CCL16/LEC, CCL17/TARC, CCL18/MIP-4, CCL19/MIP-3ß, CCL20/MIP-3a, CCL21/SLC, CCL22/MDC, CCL23/MPIF1 , CCL24/Eotaxin-2, CCL25/TECK, CCL26/Eotaxin-3, CCL27/CTACK, CCL28/MEC, CL1 , CL2 y CX3CL1 se determina en una muestra. En ciertos aspectos adicionales, la presencia o nivel de al menos una adipocitocina incluyendo, pero no limitada a, leptina, adiponectina, resistina, inhibidor de activador de plasminógeno-1 (PAI-1 ) activo o total, visfatina y proteína de unión a retinol 4 (RBP4) se determina en una muestra. De preferencia, se determina la presencia o nivel de TNFa, IL-6, I L- 1 ß , IL-2, IL-12, IL-13, IL-15, IFN (por ejemplo, IFN-a, IFN-ß, IFN-?), IL-10, CCL5/RANTES, y/u otras citocinas o quimiocinas.

En ciertos casos, la presencia o nivel de una citocina o quimiocina particular se detecta al nivel de expresión de ARNm con un ensayo tal como, por ejemplo, un ensayo de hibridación o un ensayo a base de amplificación. En ciertos otros casos, la presencia o nivel de una citocina o quimiocina particular se detecta al nivel de expresión de proteínas usando, por ejemplo, un inmunoensayo (por ejemplo, ELISA) o un ensayo inmunohistoquímico. Los kits de ELISA adecuados para determinar la presencia o nivel de una citocina o quimiocina de interés en una muestra de suero, plasma, saliva u orina están disponibles de, por ejemplo, R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN), Neogen Corp. (Lexington, KY), AIpco Diagnostics (Salem, NH), Assay Designs, Inc. (Ann Arbor, MI), BD Biosciences Pharmingen (San Diego, CA), Invitrogen (Camarillo, CA), Calbiochem (San Diego, CA), CHEMICON International, Inc. (Temecula, CA), Antigenix America Inc. (Huntington Station, NY), QIAGEN Inc. (Valencia, CA), Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hércules, CA), y/o Bender MedSystems Inc. (Bulingame, CA).

La secuencia de polipéptidos de IL-6 humana se muestra en, por ejemplo, Genbank No. de registro NP_000591 . La secuencia de ARNm de IL-6 humana (codificación) se muestra en, por ejemplo, Genbank No. de registro NM_000600. Un experto en la técnica apreciará que IL-6 también se conoce como inteferón beta 2 (IFNB2), HGF, HSF y BSF2.

La secuencia de polipéptidos de IL-1 ß humana se muestra en, por ejemplo, Genbank No. de registro NP_000567. La secuencia (de codificación) de ARNm de I L-1 ß humana se muestra en, por ejemplo, Genbank No. de registro NM_000576. Un experto en la técnica apreciará que I L-1 ß también se conoce como IL1 F2 e IL-1 beta.

La secuencia de polipéptidos de IL-8 humana se muestra en, por ejemplo, Genbank No. de registro NP_000575. La secuencia (de codificación) de ARNm de IL-8 humana se muestra en, por ejemplo, Genbank No. de registro NM_000584. Un experto en la técnica apreciará que IL-8 también se conoce como CXCL8, K60, NAF, GCP1 , LECT, LUCT, NAP1 , 3-1 OC, GCP-1 , LYNAP, MDNCF, MONAP, NAP-1 , SCYB8, TSG-1 , AMCF-I y b-ENAP.

La secuencia de polipéptidos de TWEAK humano se muestra en, por ejemplo, Genbank Nos. de registro NP_003800 y AAC51923. La secuencia (de codificación) ARNm de TWEAK humano se muestra en, por ejemplo, Genbank Nos. de registro NM_003809. y BC104420. Un experto en la técnica apreciará que TWEAK también se conoce como miembro de la superfamilia 12 del ligando de factor de necrosis tumoral (TNFSF12), ligando AP03 (AP03L), CD255, ligando DR3, ligando inducible por factor de crecimiento 14 (Fn14) y UNQ181/PRO207. 2. Proteínas de fase aguda La determinación de la presencia o nivel de una o más proteínas de fase aguda en una muestra también es útil en la presente invención. Las proteínas de fase aguda son una clase de proteínas cuyas concentraciones en plasma se incrementan (proteínas de fase aguda positivas) o se reduce (proteínas de fase aguda negativas) en respuesta a inflamación. Esta respuesta es llamada la reacción de fase aguda (también llamada respuesta de fase aguda). Ejemplos de proteínas de fase aguda positivas incluyen, pero no están limitadas a, proteína C-reactiva (CRP), proteína de dímero D, proteína de unión a mañosa, alfa 1 -antitripsina, alfa 1 -antiquimotripsina, alfa 2-macroglobulina, fibrinógeno, protrombina, factor VIII, factor de von Willebrand, plasminógeno, factores de complemento, ferritina, componente amiloide P sérico, amiloide A sérico (SAA), orosomucoide (glicproteína 1 -ácida alfa, AGP), ceruloplasmina, haptoglobina y combinaciones de las mismas. Ejemplos no limitativos de proteínas de fase aguda negativas incluyen albúmina, transferrina, transtiretina, transcortina, proteína de unión a retinol y combinaciones de las mismas. De preferencia, se determina la presencia o nivel de CRP y/o SAA.

En ciertos casos, la presencia o nivel de una proteína de fase aguda particular se detecta al nivel de expresión de ARNm con un ensayo tal como, por ejemplo, un ensayo de hibridación o un ensayo a base de amplificación. En ciertos otros casos, la presencia o nivel de una proteína de fase aguda particular se detecta al nivel de expresión de proteínas usando, por ejemplo, un inmunoensayo (por ejemplo, ELISA) o un ensayo inmunohistoquímico. Por ejemplo, un ensayo ELISA colorimétrico emparedado disponible de AIpco Diagnostics (Salem, NH) se puede usar para determinar el nivel de CRP en una muestra de suero, plasma, orina o heces. De manera similar, un kit de ELISA disponible de Biomeda Corporation (Foster City, CA) se puede usar para detectar niveles de CRP en una muestra. Otros métodos para determinar niveles de CRP en una muestra se describen en, por ejemplo, patentes de E.U.A. Nos. 6,838,250 y 6,406,862; y patentes de E.U.A. Nos. de publicación 20060024682 y 20060019410. Métodos adicionales para determinar niveles de CRP incluyen, por ejemplo, ensayos de inmunoturbidimetría, ensayos de inmunodifusión rápida y ensayos de aglutinación visual. Los kits de ELISA adecuados para determinar la presencia o nivel de SAA en una muestra tal como suero, plasma, saliva, orina o heces están disponibles de, por ejemplo, Antigenix America Inc. (Huntington Station, NY), Abazyme (Neddham, MA), USCN Life (Missouri City, TX), y/o U.S. Biological (Swampscott, MA).

La proteína C-reactiva (CRP) es una proteína que se encuentra en la sangre en respuesta a inflamación (una proteína de fase aguda). CRP Se produce típicamente por el hígado y por células grasas (adipocitos). Es un miembro de la familia pentraxina de proteínas. La secuencia de polipéptidos de CRP humana se muestra en, por ejemplo, Genbank No. de registro NP_000558. La secuencia (de codificación) de ARNm de CRP humana se muestra en, por ejemplo, Genbank No. de registro NM_000567. Un experto en la técnica apreciará que CRP también se conoce como PTX1 , MGC88244 y MGC149895.

Las proteínas de amiloide sérico A (SAA) son una familia de apolipoproteínas asociadas con lipoproteína de alta densidad (HDL) en plasma. Diferentes isoformas de SAA son expresadas constitutivamente (SAAs constitutivas) a diferentes niveles o en respuesta a estímulos inflamatorios (SAAs de fase aguda). Estas proteínas se producen predominantemente por el hígado. La conservación de estas proteínas a lo largo de invertebrados y vertebrados sugiere que las SAAs juegan un papel altamente esencial en todos los animales. Las proteínas amiloide A sérico de fase aguda (A-SAAs) son secretadas durante la fase aguda de inflamación. La secuencia de polipéptidos de SAA humana se muestran en, por ejemplo, Genbank No. de registro NP_000322. La secuencia (de codificación de ARNm de SAA humana se muestra en, por ejemplo, Genbank No. de registro NM_000331 . Un experto en la técnica apreciará que SAA también se conoce como PIG4, TP53I4, MGC1 1 1216 y SAA1 . 3. Moléculas de adhesión celular (IgSF CAMs) La determinación de la presencia o nivel de una o más moléculas de adhesión celular de la superíamilia de inmunoglobulina en una muestra también es útil en la presente invención. Según se usa en la presente, el término "molécula de adhesión celular de la superíamilia de inmunoglobulina" (IgSF CAM) incluye cualquiera de una variedad de polipéptidos o proteínas localizados sobre la superficie de una célula que tiene uno o más dominios de doblez tipo inmunoglobulina, y las cuales funcionan en la adhesión intracelular y/o transducción de señales. En muchos casos, IgSF CAMs son proteínas de transmembrana. Ejemplos no limitativos de IgSF CAMs incluyen Moléculas de Adhesión a Células Neurales (NCAMs, por ejemplo, NCAM-120, NCAM-125, NCAM-140, NCAM-145, NCAM-180, NCAM-185, etc.), Moléculas de Adhesión Intercelular (ICAMs, por ejemplo, ICAM-1 , ICAM-2, ICAM-3, ICAM-4 e ICAM-5), Molécula de Adhesión a Células Vasculares-1 (VCAM- ), Molécula de Adhesión a Células Endoteliales Plaquetarias-1 (PECAM-1 ), Molécula de Adhesión a Células L1 (L1 CAM), molécula de adhesión a células con homología a L1 CAM (homólogo cercano de L1 ) (CHL1 ), lectinas tipo Ig de unión a ácido siálico (SIGLECs; por ejemplo, SIGLEC-1 , SIGLEC-2, SIGLEC-3, SIGLEC-4, etc.), nectinas (por ejemplo, nectina-1 , nectina-2, nectina-3, etc.), y moléculas tipo nectina (por ejemplo, Necl-1 , Necl-2, Necl-3, Necl-4 y Necl-5). De preferencia, se determina la presencia o nivel de ICAM-1 y/o VCAM-1 .

ICAM-1 es una proteína de adhesión celular de transmembrana que está presente continuamente a bajas concentraciones en las membranas de leucocitos y células endoteliales. Después de la estimulación de citocinas, las concentraciones se incrementan ampliamente. ICAM-1 Puede inducirse por IL-1 y TNFa y se expresa por el endotelio vascular, macrofagos y linfocitos. En IBD, las citocinas pro-inflamatorias causan inflamación al sobrerregular la expresión de moléculas de adhesión tales como ICAM-1 y VCAM-1. La expresión incrementada de moléculas de adhesión recluta más linfocitos al tejido infectado, dando como resultado inflamación tisular (véase, Goke et al., J., Gastroenterol., 32:480 (1997); y Rijcken et al., Gut, 51 :529 (2002)). ICAM-1 Es codificada por el gen de la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM1 ; Entrez GeneID 3383, Genbank No. de acceso NM_000201 ) y se produce después del procesamiento del polipéptido precursor de molécula de adhesión intercelular 1 (Genbank No. de registro NP_000192).

VCAM-1 es una proteína de adhesión celular de transmembrana que media la adhesión de linfocitos, monocitos, eosinófilos y basófilos al endotelio vascular. La sobrerregulación de VCAM-1 en células endoteliales por citocinas se presenta como resultado de transcripción génica incrementada (por ejemplo, en respuesta a factor de necrosis tumoral-alfa (TNFa) e interleucina-1 (IL-1 )). VCAM-1 Es codificada por el gen de molécula de adhesión a células vasculares 1 (VCAM1 ; Entrez GenelD:74 ) y se produce después del empalme diferencial del transcripto (Genbank No. de registro NM_001078 (variante 1 ) o NM_080682 (variante 2)), y procesamiento de la isoforma de empalme de polipéptido precursor (Genbank No. de registro NP_001069 (isoforma a) o NP_542413 (isoforma b)).

En ciertos casos, la presencia o nivel de una IgSF CA se detecta al nivel de expresión de ARNm con un ensayo tal como, por ejemplo, un ensayo de hibridación o un ensayo a base de amplificación. En ciertos otros casos, la presencia o nivel de una IgSF CAM se detecta al nivel de expresión de proteínas usando, por ejemplo, un ¡nmunoensayo (por ejemplo, ELISA) o un ensayo inmunohistoquímico. Los anticuerpos y/o kits de ELISA adecuados para determinar la presencia o nivel de ICAM-1 y/o VCAM-1 en una muestra tal como una muestra de tejido, biopsia, suero, plasma, saliva, orina o heces están disponibles de, por ejemplo, Invitrogen (Camarillo, CA), Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA) y/o Abcam Inc. (Cambridge, MA). 4. Proteínas S100 La determinación de la presencia o nivel de al menos una proteína S100 en una muestra también es útil en la presente invención. Según se usa aquí, el término "proteína S100" incluye cualquier miembro de una familia de proteínas ácidas de baja masa molecular caracterizadas por expresión específica de tipo de células y la presencia de dominios de unión a calcio de 2 EF-manos. Existen al menos 21 tipos diferentes de proteínas S100 en humanos. El nombre se deriva del hecho de que las proteínas S100 son 100% solubles en sulfato de amonio a pH neutro. La mayoría de las proteínas S 00 son homodiméricas, consistiendo en dos polipéptidos idénticos mantenidos juntos por enlaces no covalentes. Aunque las proteínas S100 son estructuralmente similares a calmodulina, difieren en que son específicas de célula, expresadas en células particulares a diferentes niveles dependiendo de los factores ambientales. Las proteínas S100 normalmente están presentes en células derivadas de la cresta neural (por ejemplo, células de Schwann, melanocitos, células gliales), condrocitos, adipocitos, células mioepiteliales, macrófagos, células de Langerhans, células dendríticas y queratinocitos. Las proteínas S100 han estado implicadas en una variedad de funciones intraceluiares y extracelulares tales como la regulación de la fosforilación de proteínas, factores de transcripción, homeostasis de Ca2+, la dinámica de constituyentes de citoesqueleto, actividades enzimáticas, crecimiento y diferenciación celular, y la respuesta inflamatoria.

La calgranulina es una proteína S100 que es expresada en varios tipos de células, incluyendo células epiteliales renales y neutrófilos, y son abundantes en los monocitos y granulocitos infiltrantes bajo condiciones de inflamación crónica. Ejemplos de calgranulinas incluyen, sin limitación, calgranulina A (también conocida como S100A8 o MRP-8), calgranulina B (conocida también como S100A9 o MRP-14), y calgranulina C (también conocida como S100A12).

En ciertos casos, la presencia o nivel de una proteína S100 particular se detecta al nivel de expresión de ARNm con un ensayo tal como, por ejemplo, un ensayo de hibridación o un ensayo a base de amplificación. En ciertos otros casos, la presencia o nivel de una proteína S100 particular se detecta al nivel de expresión de proteínas usando, por ejemplo, un inmunoensayo (por ejemplo, ELISA) o un ensayo inmunohistoquímico. Los kits de ELISA adecuados para determinar la presencia o nivel de una proteína S100 tales como calgranulina A (S100A8), calgranulina B (S100A9), o calgranulina C (S100A12) en una muestra de suero, plasma u orina están disponibles de, por ejemplo, Península Laboratories Inc. (San Carlos, CA) y Hycult biotechnology b.v. (Uden, Holanda).

La calprotectina, el complejo de S100A8 y S100A9, es una proteína de unión a calcio y zinc en el citosol de neutrófilos, monocitos y queratinocitos. La calprotectina es una gran proteína en granulocitos neutrofílicos y macrófagos y equivale a tanto como el 60% de la proteína total en la fracción citosólica en estas células. Es por lo tanto un marcador sustituto del volumen de neutrófilos. Su concentración en las heces se correlaciona con la intensidad de la infiltración de neutrófilos de la mucosa intestinal y con la severidad de inflamación. En algunos casos, la calprotectina puede ser medida con un ELISA usando muestras fecales pequeñas (50-100 mg) (véase, por ejemplo, Johne et al, Scand J Gastroenterol., 36:291 -296 (2001 )). 5. Otros marcadores inflamatorios La determinación de la presencia o nivel de lactoferrina en una muestra también es útil en la presente invención. En ciertos casos, la presencia o nivel de lactoferrina se detecta al nivel de expresión de ARNm con un ensayo tal como, por ejemplo, un ensayo de hibridación o un ensayo a base de amplificación. En ciertos otros casos, la presencia o nivel de lactoferrina se detecta al nivel de expresión de proteínas usando, por ejemplo, un inmunoensayo (por ejemplo, ELISA) o un ensayo inmunohistoquímico. Un kit de ELISA para lactoferrina disponible de Calbiochem (San Diego, CA) puede usarse para detectar lactoferrina humana en una muestra de plasma, orina, lavado broncoalveolar o fluido cerebroespinal. Similarmente, un kit de ELISA disponible de U.S. Biological (Swampscott, MA) se puede usar para determinar el nivel de lactoferrina en una muestra de plasma. La patente de E.U.A. No. de publicación 20040137536 describe un ensayo de ELISA para determinar la presencia de niveles elevados de lactoferrina en una muestra de heces. Asimismo, la patente de E.U.A. No. de publicación 20040033537 describe un ensayo ELISA para determinar la concentración de lactoferrina endógena en una muestra de heces, moco o bilis. En algunas modalidades, la presencia o nivel de anticuerpos anti-lactoferrina pueden detectarse en una muestra usando, por ejemplo, proteína lactoferrina o un fragmento de la misma.

La determinación de la presencia o nivel de una o más isozimas piruvato cinasa tales como M1 -PK y M2-PK en una muestra también es útil en la presente invención. En ciertos casos, la presencia o nivel de M1 -PK y/o M2-PK se detecta al nivel de expresión de ARNm con un ensayo tal como, por ejemplo, un ensayo de hibridación o un ensayo a base de amplificación. En ciertos otros casos, la presencia o nivel de M1 -PK y/o M2-PK se detecta al nivel de expresión de proteínas usando, por ejemplo, un inmunoensayo (por ejemplo, ELISA) o un ensayo inmunohistoquímico. Las isozimas piruvato cinasa M1/M2 también se conocen como isozima de músculo piruvato cinasa (PKM), piruvato cinasa tipo K, proteína de unión a hormona tiroides citosólica (CTHBP), proteína de unión a hormona tiroides 1 (THBP1 ) o proteína de interacción con opa 3 (OIP3).

En modalidades adicionales, la determinación de la presencia o nivel de uno o más factores de crecimiento en una muestra también es útil en la presente invención. Ejemplos no limitativos de factores de crecimiento incluyen factores de crecimiento por transformación (TGF) tales como TGF-a, TGF-ß, TGF-32, TGF-(33, etc., los cuales se describen en detalle abajo. 6. Conjunto ejemplar de marcadores inflamatorios En modalidades particulares, por lo menos uno o una pluralidad (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más tal como, por ejemplo, un panel) de los siguientes marcadores inflamatorios pueden detectarse (por ejemplo, solos o en combinación con biomarcadores de otras categorías) para ayudar o asistir en predecir curso de enfermedad, y/o para mejorar la precisión de seleccionar terapia, optimizar terapia, reducir toxicidad y/o monitorear la eficacia de tratamiento terapéutico para una terapia con fármacos anti-TNFa: a. CRP b. SAA c. VCAM d. ICAM e. Calprotectina f. Lactoferrina g. IL8 h. Rantes i. TNFalfa j. IL-6 k. I beta I. S100A12 m. M2-p¡ruvato cinasa (PK) n. IFN o. IL2 p. TGF q. IL-13 r. IL-15 s. IL12 t. Otras quimiocinas y citocinas.

B. Factores de crecimiento Una variedad de factores de crecimiento, incluyendo marcadores bioquímicos, marcadores serológicos, marcadores proteínicos, marcadores genéticos y otras características clínicas o ecográficas, son adecuados para usarse en los métodos de la presente invención para seleccionar terapia, optimizar terapia, reducir toxicidad y/o monitorear la eficacia de tratamiento terapéutico con uno o más agentes terapéuticos tales como biológicos (por ejemplo, fármacos anti-TNFa). En ciertos aspectos, los métodos descritos en la presente utilizan la aplicación de un algoritmo (por ejemplo, análisis estadístico) para la presencia, nivel de concentración y/o genotipo determinado para uno o más factores de crecimiento (por ejemplo, solos o en combinación con biomarcadores de otras categorías) para ayudar o asistir en predecir curso de enfermedad, seleccionar una terapia con fármacos anti-TNFa adecuada, optimizar terapia con fármacos anti-TNFa, reducir toxicidad asociada con terapia con fármacos anti-TNFa, o monitorear la eficacia de tratamiento terapéutico con un fármaco anti-TNFa.

De esta manera, en ciertas modalidades, la determinación de la presencia o nivel de uno o más factores de crecimiento en una muestra es útil en la presente invención. Según se usa aquí, el término "factor de crecimiento" incluye cualquiera de una variedad de péptidos, polipéptidos o proteínas que son capaces de estimular la proliferación celular y/o diferenciación celular.

En ciertos aspectos, se determina en una muestra la presencia o nivel de por lo menos un factor de crecimiento incluyendo, pero no limitado a, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina (HB-EGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor derivado de epitelio pigmento (PEDF; conocido también como SERPINF1 ), anfirregulina (AREG; conocida también como factor de crecimiento derivado de Schwanoma (SDGF)), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento por transformación-a (TGF-a), factor de crecimiento por transformación-ß (TGF-ß? , TGF- 2, TGF- 3, etc.), endotel¡na-1 (ET-1 ), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF; también conocido como FGF7), proteínas morfogenéticas de hueso (por ejemplo, BMP1 , BMP15), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento de nervio (NGF), factor de crecimiento de nervio ß (ß-NGF), factores neurotróficos (por ejemplo, factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofina 3 (NT3), neurotrofina 4 (NT4), etc.), factor de diferenciación de crecimiento-9 (GDF-9), factor estimulador de colonia de granulocitos (G-CSF), factor estimulador de colonia de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), miostatina (GDF-8), eritropoyetina (EPO) y trombopoyetina (TPO). En modalidades particulares, se determina la presencia o nivel de al menos uno de VEGF, EGF, bFGF, ET-1 , TGF-p2 y/o TGF-p3. Se ha encontrado que estos marcadores son significativamente más altos en IBD activo que en controles, indicando que pueden jugar un papel en promover la sanación después de lesión en mucosas de la superficie luminal del intestino en IBD.

En ciertos casos, la presencia o nivel de un factor de crecimiento particular se detecta a nivel de expresión de ARNm con un ensayo tal como, por ejemplo, un ensayo de hibridación o un ensayo a base de amplificación. En ciertos otros casos, la presencia o nivel de un factor de crecimiento particular se detecta a nivel de expresión de proteínas usando, por ejemplo, un inmunoensayo (por ejemplo, ELISA) o un ensayo inmunohistoquímico. Los kits de ELISA adecuados para determinar la presencia o nivel de un factor de crecimiento en una muestra de suero, plasma, saliva u orina están disponibles de, por ejemplo, Antigenix America Inc. (Huntington Station, N.Y.), Promega ( adison, Wl), R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN), Invitrogen (Camarillo, CA), CHEMICON International, Inc. (Temecula, CA), Neogen Corp. (Lexington, KY), PeproTech (Rocky Hill, NJ), Alpco Diagnostics (Salem, NH), Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL), y/o Abazyme (Needham, A).

La secuencia de polipéptidos de factor de crecimiento epidérmico (EGF) humano se muestra en, por ejemplo, Genbank No. de registro NP_001954 (SEQ ID NO: 19). La secuencia de ARNm (codificación) de EGF humano se muestra en, por ejemplo, Genbank No. de Registro NM_001963 (SEQ ID NO:20). Un experto en la técnica apreciará que EGF también se conoce como beta-urogastrona, URG y HOMG4.

La secuencia de polipéptidos de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) humano se muestra en, por ejemplo, Genbank Nos. de registro NP_001020537 (SEQ ID NO-.21 ), NP_001020538, NP_001020539, NP_001020540, NP_001020541 , NP_001028928, y NPJD03367. La secuencia (de codificación) de ARNm de VEGF humano se muestra en, por ejemplo, Genbank No. de registro NM_001025366 (SEQ ID NO:22), NM_001025367, NM_001025368, NM_001025369, M_001025370, N _001033756, y NM_003376. Un experto en la técnica apreciará que VEGF también se conoce como VPF, VEGFA, VEGF-A, y MGC70609.

En modalidades particulares, al menos uno o una pluralidad (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más tal como, por ejemplo, un panel) de los siguientes factores de crecimiento pueden detectarse (por ejemplo, solos o en combinación con biomarcadores de otras categorías) para ayudar o asistir en predecir curso de enfermedad, y/o para mejorar la precisión de seleccionar terapia, optimizar terapia, reducir toxicidad y/o monitorear la eficacia de tratamiento terapéutico para terapia con fármacos anti-TNFa: GM-CSF; VEGF; EGF; factor de crecimiento de queratinocitos (KGF, FGF7); y otros factores de crecimiento.

C. Serología (marcadores inmunes) La determinación de marcadores serológicos o inmunes tales como autoanticuerpos en una muestra (por ejemplo, muestra de suero) también es útil en la presente invención. Anticuerpos contra moléculas anti-inflamatorias tales como IL-10, TGF-ß y otras podrían suprimir la capacidad del cuerpo para controlar inflamación y la presencia o nivel de estos anticuerpos en el paciente indica el uso de medicamentos ¡nmunosupresores poderosos tales como fármacos anti-TNFa. La sanación de mucosas podría dar como resultado una reducción del título de anticuerpos de anticuerpos contra antígenos bacterianos tales como, por ejemplo, OmpC, flagelinas (cBir-1 , Fla-A, Fla-X, etc.), 12, y otros (pANCA, ASCA, etc.).

De esta manera, en ciertos aspectos, los métodos descritos en la presente utilizan la aplicación de un algoritmo (por ejemplo, análisis estadístico) para la presencia, nivel de concentración y/o genotipo determinado para uno o más marcadores inmunes (por ejemplo, solos o en combinación con biomarcadores de otras categorías) para ayudar o asistir en predecir curso de enfermedad, seleccionar una terapia con fármacos anti-TNFa adecuada, optimizar una terapia con fármacos anti-TNFa, reducir toxicidad asociada con terapia con fármacos anti-TNFa, o monitorear la eficacia el tratamiento terapéutico con un fármaco anti-TNFa.

Ejemplos no limitativos de marcadores inmunes serológicos adecuados para usarse en la presente invención incluyen anticuerpos anti-neutrófilos, anticuerpos anW-Saccharomyces cerevisiae, y/u otros anticuerpos anti-microbianos. 1. Anticuerpos anti-neutrófilos La determinación de los niveles de ANCA y/o la presencia y ausencia de pANCA en una muestra es útil en los métodos de la presente invención. Según se usa en la presente, el término "anticuerpo citoplásmico anti-neutrófilos" o "ANCA" incluye anticuerpos dirigidos hacia componentes citoplásmicos y/o nucleares de neutrófilos. La actividad ANCA puede dividirse en varias categorías amplias con base en el patrón de tinción de ANCA en neutrófilos: (1 ) tinción de neutrófilos citoplásmica sin resalte perinuclear (cANCA); (2) tinción perinuclear alrededor del borde exterior del núcleo (pANCA); (3) tinción perinuclear alrededor del borde interior del núcleo (NSNA); y (4) tinción difusa con moteado a través del neutrófilo completo (SAPPA). En ciertos casos, la tinción de pANCA es sensible al tratamiento con DNasa. El término ANCA abarca todas las variedades de reactividad anti-neutrófilos, incluyendo, pero no limitado a, cANCA, pANCA, NSNA, y SAPPA. Similarmente, el término ANCA abarca todos los isotipos de ¡nmunoglobulina incluyendo, sin limitación, inmunoglobulina A y G.

Los niveles de ANCA en una muestra de un individuo pueden determinarse, por ejemplo, usando un inmunoensayo tal como un ensayo ¡nmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) con neutrófilos fijados a alcohol. La presencia o ausencia de una categoría particular de ANCA tal como pANCA puede determinarse, por ejemplo, usando un ensayo inmunohistoquímico tal como un ensayo de anticuerpos fluorescentes indirecto (IFA). De preferencia, la presencia o ausencia de pANCA en una muestra se determina usando un ensayo de inmunofluorescencia con neutrófilos fijos y tratados con DNasa. Además de los neutrófilos fijos, antígenos específicos para ANCA que son adecuados para determinar los niveles de ANCA incluyen, sin limitación, extractos de neutrófilos no purificados o parcialmente purificados; proteínas purificadas, fragmentos de proteínas o péptidos sintéticos tales como histona H1 o fragmentos reactivos con ANCA de la misma (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 6,074,835); antígenos tipo histona H1 , antígenos de porina, antígenos bacteroides, o fragmentos reactivos con ANCA de los mismos (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 6,033,864); antígenos de vesícula secretora o fragmentos reactivos con ANCA de los mismos (véase, por ejemplo, solicitud de patente de E.U.A. No. 08/804, 106); y anticuerpos idiotípicos anti-ANCA. Un experto en la técnica apreciará que el uso de antígenos adicionales específicos para ANCA está dentro del alcance de la presente invención. 2. Anticuerpos anti- Saccharomyces cerevisiae La determinación de los niveles de ASCA (por ejemplo, ASCA-lgA y/o ASCA-lgG) en una muestra es útil en la presente invención. Según se usa en la presente, el término "inmunoglobulina A anti- Saccharomyces cerevisiae" o "ASCA-lgA" incluye anticuerpos del isotipo de inmunoglobulina A que reaccionan específicamente con S. cerevisiae. Similarmente, el término "inmunoglobulina G anti- Saccharomyces cerevisiae" o "ASCA-lgG" incluye anticuerpos de isotipo de inmunoglobulina G que reaccionan específicamente con S. cerevisiae.

La determinación de si una muestra es positiva para ASCA-lgA o ASCA-lgG es hace usando un antígeno específico para ASCA. Este antígeno puede ser cualquier antígeno o mezcla de antígenos que se une específicamente por ASCA-lgA y/o ASCA-lgG. Aunque los anticuerpos ASCA fueron inicialmente caracterizados por su capacidad para unirse a S. cerevisiae, aquellos de capacidad en la técnica entenderán que un antígeno que se una específicamente por ASCA puede sr obtenido de S. cerevisiae o de una variedad de otras fuentes siempre y cuando el antígeno sea capaz de unirse específicamente a anticuerpos ASCA. En consecuencia, ejemplos de fuentes de un antígeno específico para ASCA, que se pueden usar para determinar los niveles de ASCA-lgA y/o ASCA-lgG en una muestra, incluyen, sin limitación, células de levadura eliminadas enteras tales como células de Saccharomyces o Candida; mañano de pared de células de levadura tal como fosfopeptidomanano (PPM); oligosacáridos tales como oligomanósidos; neoglicolípidos; anticuerpos idiotípicos anti-ASCA y similares. Diferentes especies y cepas de levadura, tales como las cepas Su1 , Su2, CBS 1315, o BM 156 de S. cerevisiae o la cepa VW32 de Candida albicans, son adecuados para usarse como un antígeno específico para ASCA-lgA y/o ASCA-lgG. Los antígenos purificados y sintéticos específicos para ASCA también son adecuados para usarse en determinar los niveles de ASCA-lgA y/o ASCA-lgG en una muestra. Ejemplos de antígenos purificados incluyen, sin limitación, antígenos de oligosacáridos purificados tales como oligomanósidos. Ejemplos de antígenos sintéticos incluyen, sin limitación, oligomanósidos sintéticos tales como aquellos descritos en la patente de E.U.A. No. de publicación 20030105060, por ejemplo, D-Man ß(1 -2) D-Man ß(1 -2) D-Man ß(1 -2) D-Man-OR, D-Man a(1 -2) D-Man (1 -2) D-Man a(1 -2) D-Man-OR, en donde R es un átomo de hidrógeno, un alquilo de Ct a C20 o un grupo conector opcionalmente marcado.

Preparaciones de mananos de pared de células de levadura, por ejemplo, PPM, se pueden usar para determinar los niveles de ASCA-lgA y/o ASCA-lgG en una muestra. Antígenos de superficie hidrosolubles pueden prepararse mediante cualquier técnica de extracción adecuada conocida en la técnica, incluyendo, por ejemplo, al someter autoclave, o se pueden obtener comercialmente (véase, por ejemplo, Lindberg et al., Gut, 33:909-913 (1992)). La fracción estable en ácido de PPM también es útil en los algoritmos estadísticos de la presente invención (Sendid et al., Clin. Diag. Lab. Immunol., 3:219-226 (1996)). Un PPM ejemplar que es útil para determinar los niveles de ASCA en una muestra se deriva de la cepa ATCC #38926 de S. uvarum.

Antígenos de oligosacáridos purificados tales como oligomanósidos también pueden ser útiles determinar los niveles de ASCA-lgA y/o ASCA-lgG en una muestra. Los antígenos de oligomanósido purificados se convierten de preferencia en neoglicolípidos como se describe en, por ejemplo, Faille et al., Eur. J. Microbiol. Infecí Dis., 1 1 :438-446 (1992). Un experto en la técnia entiende que la reactividad de este antígeno oligomanósido con ASCA puede optimizarse al variar la longitud de la cadena de manosilo (Frosh et al., Proc Nati. Acad. Sci. E. U.A., 82: 1 194-1 198 (1985)); la configuración anomérica (Fukazawa et al., In "Immunology of Fungal Disease", E. Kurstak (ed.), Marcel Dekker Inc., Nueva York, páginas 37-62 (1989); Nishikawa et al., Microbiol. Immunol., 34:825-840 (1990); Poulain et al., Eur. J. Clin. Microbiol., 23:46-52 (1993); Shibata et al., Arch. Biochem. Biophys., 243:338-348 (1985); Trinel et al., Infect. Immun., 60:3845-3851 (1992)); o la posición del enlace (Kikuchi et al., Planta, 190:525-535 (1993)).

Los oligomanósidos adecuados para usarse en los métodos de la presente invención incluyen, sin limitación, un oligomanósido que tiene la manotetraosa Man(1 -3) Man(1 -2) Man(1 -2) Man. Este oligomanósido puede ser purificado a partir de PPM como se describe en, por ejemplo, Faille et al., citado arriba. Un ejemplo de neoglicolípido específico para ASCA puede construirse al liberar al oligomanósido de su PPM respectiva y acoplar posteriormente el oligomanósido liberado a 4-hexadecilanilina o similares. 3. Anticuerpos anti-microbianos La determinación de los niveles de anticuerpo anti-OmpC en una muestra también es útil en la presente invención. Según se usa aquí, el término "anticuerpo anti-proteína C de membrana exterior" o "anticuerpo anti-OmpC" incluye anticuerpos dirigidos contra una porina de membrana exterior bacteriana como se describe en, por ejemplo, la publicación de patente de PCT No. WO 01/89361 . El término "proteína C de membrana exterior" u "OmpC" se refiere a una porina bacteriana que es inmunorreactiva con un anticuerpo anti-OmpC.

El nivel de anticuerpo anti-OmpC presente en una muestra de un individuo puede determinarse usando una proteína OmpC o un fragmento de la misma tal como un fragmento inmunorreactivo de la misma. Los antígenos OmpC adecuados útiles para determinar los niveles de anticuerpos anti-OmpC en una muestra incluyen, sin limitación, una proteína OmpC, un polipéptido OmpC que tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la proteína OmpC, o un fragmento de la misma tal como un fragmento inmunorreactivo de la misma. Según se usa en la presente, un polipéptido OmpC generalmente describe polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos con más de aproximadamente 50% de identidad, de preferencia más de alrededor de 60% de identidad, muy preferiblemente más de alrededor de 70% de identidad, todavía más preferiblemente más de alrededor de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con una proteína OmpC, con la identidad de aminoácidos determinada usando un programa de alineación de secuencias tal como CLUSTALW. Estos antígenos pueden ser preparados, por ejemplo, por purificación a partir de bacterias entéricas tales como E. coli, por expresión recombinante de un ácido nucleico tal como Genbank No. de registro K00541 , por medios sintéticos tales como síntesis de péptidos en solución o fase sólida, o usando despliegue de fagos.

La determinación de los niveles de anticuerpos anti-12 en una muestra también es útil en la presente invención. Según se usa en la presente, el término "anticuerpo anti-12" incluye anticuerpos dirigidos contra un antígeno microbiano que comparte homología con reguladores de transcripción bacteriana como los descritos en, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 6,309,643. El término "12" se refiere a un antígeno microbiano que es inmunorreactivo con un anticuerpo anti-12. La proteína 12 microbiana es un polipéptido de 100 aminoácidos que comparte cierta homología de similitud débil con la proteína predicha 4 de C. pasteurianum, Rv3557c de Mycobacterium tuberculosis, y un regulador de transcripción de Aquifex aeolicus. Las secuencias de ácido nucleico y proteínas para la proteína 12 se describe en, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 6,309,643.

El nivel de anticuerpo anti-12 presente en una muestra de un individuo puede determinarse usando una proteína 12 o un fragmento de la misma tal como un fragmento inmunorreactivo de la misma. Los antígenos 12 adecuados útiles para determinar niveles de anticuerpos anti-12 en una muestra incluyen, sin limitación, una proteína 12, un polipéptido 12 que tenga sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la proteína 12, o un fragmento de la misma tal como un fragmento inmunorreactivo de la misma. Estos polipéptidos 12 exhiben mayor similitud de secuencia con la proteína 12 que con la proteína 4 de C. pasteurianum e incluyen variantes de isotipo y homólogos de las mismas. Según se usa en la presente, un polipéptido 12 describe generalmente polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos con más de aproximadamente 50% de Identidad, de preferencia más de alrededor de 60% de identidad, muy preferiblemente más de alrededor de 70% de identidad, todavía más preferiblemente más de alrededor de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con una proteína 12 de origen natural, con la identidad de aminoácidos determinada usando un programa de alineación de secuencias tal como CLUSTALW. Estos antígenos 12 pueden prepararse, por ejemplo, mediante purificación a partir de microbios, por expresión recombinante de un ácido nucleico que codifique para un antígeno 12, por medios sintéticos tales como síntesis de péptidos en solución a fase sólida, o usando despliegue de fagos.

La determinación de los niveles de anticuerpos anti-flagelina en una muestra también es útil en la presente invención. Según se usa aquí, el término "anticuerpo antl-flagelina" incluye anticuerpos dirigidos a un componente proteínico de flagelas bacterianas como se describe en, por ejemplo, patente de PCT No. de publicación WO 03/053220 y patente de E.U.A. No. de publicación 20040043931 . El término "flagelina" se refiere a una proteína de flagelo bacteriano que es inmunorreactiva con un anticuerpo anti-flagelina. Las flagelinas microbianas son proteínas encontradas en flagelos bacterianos que se organizan ellas mismas en un cilindro hueco para formar el filamento.

El nivel de anticuerpo anti-flagelina presente en una muestra de un individuo puede determinarse usando una proteína flagelina o un fragmento de la misma tal como un fragmento inmunorreactivo de la misma. Los antígenos de flagelina adecuados útiles para determinar niveles de anticuerpos anti-flagelina en una muestra incluyen, sin limitación, una proteína flagelina tal como flagelina Cbir-1 , flagelina X, flagelina A, flagelina B, fragmentos de la misma, y combinaciones de la misma, un polipéptido de flagelina que tenga sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la proteína flagelina, o un fragmento de la misma tal como un fragmento inmunorreactivo de la misma, según se usa aquí, un polipéptido de flagelina generalmente describe polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos con más de aproximadamente 50% de identidad, de preferencia más de alrededor de 60% de identidad, muy preferiblemente más de alrededor de 70% de identidad, todavía más preferiblemente más de alrededor de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con una proteína flagelina de origen natural, con la identidad de aminoácidos determinada usando un programa de alineación de secuencias tal como CLUSTALW. Estos antígenos de flagelina pueden prepararse, por ejemplo, por purificación a partir de bacterias tales como Helicobacter Bilis, Helicobacter mustelae, Helicobacter pylori, Butyrivibrio fibrisolvens, y bacterias encontradas en el ciego, por expresión recombinante de un ácido nucleico que codifique para un antígeno de flagelina, por medios sintéticos tales como síntesis de péptidos en solución o fase sólida, o usando despliegue de fagos.

D. Marcadores de estrés oxidante La determinación de marcadores de estrés oxidante en una muestra también es útil en la presente invención. Ejemplos no limitativos de marcadores de estrés oxidante incluyen aquellos que son a base de proteínas o a base de ADN, los cuales pueden detectarse al medir la oxidación de proteínas y fragmentación de ADN, respectivamente. Otros ejemplos de marcadores de estrés oxidante incluyen compuestos orgánicos tales como malondialdehído.

El estrés oxidante representa un desequilibrio entre la producción y manifestación de especies de oxígenos reactivas y la capacidad de un sistema biológico para desentoxicar fácilmente los intermedios reactivos o para reparar el daño resultante. Las alteraciones en el estado de óxido redox normal de los tejidos pueden causar efectos tóxicos a través de la producción de peróxidos y radicales libres que dañan todos los componentes de la célula, incluyendo proteínas, lípidos y ADN. Algunas especies oxidantes reactivas incluso pueden actuar como mensajeros a través de un fenómeno llamado señalización redox.

En ciertas modalidades, derivados de metabolitos oxidantes reactivos (DROMs), relaciones de glutationa oxidada reducida (Eh-GSH) y/o relaciones de cisteína oxidada reducida (En CySH) pueden usarse para cuantificar el estrés oxidante. Véase, por ejemplo, Neuman et al., Clin. Chem., 53:1652-1657 (2007). Las modificaciones oxidantes de residuos de cisteína altamente reactivos en proteínas tales como tirosina fosfatasas y proteínas relacionadas con tiorredoxina también pueden detectarse o medirse usando una técnica tal como, por ejemplo, espectrometría de masas (MS). Véase, por ejemplo, Naito et al., Anti-Aging Medicine, 7(5):36-44 (2010). Otros marcadores de estrés oxidante incluyen acroleína unida a proteínas como la descrita en, por ejemplo, en Uchida er a/., PNAS, 95(9) 4882-4887 (1998), la prueba de radicales de oxígeno libre (FORT), que refleja niveles de hidroperóxidos orgánicos, y el potencial redox del par de disulfuro glutationa/glutationa reducido, (Eh) GSH/GSSG. Véase, por ejemplo, Abramson et al., Ahterosclerosis, 178(1 ): 1 15-21 (2005).

E. Receptores de superficie celular La determinación de receptores de superficie celular en una muestra también es útil en la presente invención. La vida media de fármacos anti-TNFa tales como Remicade y Humira se reduce significativamente en pacientes con un alto nivel de inflamación. CD64, El receptor de alta afinidad para inmunoglobulina (Ig) G1 e lgG3, se expresa predominantemente por fagocitos mononucleares. Células polimorfonucleares (PMN) en descanso deficientemente expresan CD64, pero la expresión de este marcador es sobrerregulada por interferón y factor de estimulación de colonia de granulocitos que actúa en precursores mieloides en la médula ósea. El entrelazamiento de CD64 con complejos de IgG ejerce un número de respuestas celulares, incluyendo la internalización de complejos inmunes por endocitosis, fagocitosis de partículas opsonizadas, desgranulación, activación del estallido oxidante y la liberación de citocinas.

Así, en ciertos aspectos, los métodos descritos en la presente utilizan la aplicación de un algoritmo (por ejemplo, análisis estadístico) para la presencia, nivel de concentración y/o genotipo determinado para uno o más receptores de superficie celular tales como CD64 (por ejemplo, solo o en combinación con biomarcadores de otras categorías) para ayudar o asistir en predecir curso de enfermedad, seleccionar una terapia con fármacos anti-TNFa adecuada, optimizar la terapia con fármacos anti-TNFa, reducir toxicidad asociada con terapia con fármacos anti-TNFa o monitorear la eficacia de tratamiento terapéutico con un fármaco anti-TNFa.

F. Vías de señalización La determinación de vías de señalización en una muestra también es útil en la presente invención. La activación de células polimorfonucleares (PMN), seguida por infiltración en la mucosa intestinal (sinovio para RA) y migración a través del epitelio crítico se considera una característica clave de IBD. Se ha calculado por la expresión de leucocitos marcados con indio 1 1 1 fecal que la migración de células PMN a partir de la circulación a la sección enferma del intestino se incrementa en 10 veces o más en pacientes de IBD. Así, en ciertos aspectos, medir la activación de células PMN a partir de sangre o inflamación tisular al medir vías de señalización usando un ensayo tal como el ImunoEnsayo Reactivo y Colaborativo Potenciado por Enzimas (CEER) es una manera ideal de entender enfermedad inflamatoria. La tecnología CEER se describe en los siguientes documentos de patente, los cuales están cada uno incorporado en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos: Nos. de publicación de PCT WO 2008/036802, WO 2009/012140, WO 2009/108637, WO 2010/132723, WO 201 1/008990 y WO 201 1/050069 y solicitud de PCT No. PCT/US201 1/066624.

De esta manera, en ciertos aspectos, los métodos descritos aquí utilizan la aplicación de un algoritmo (por ejemplo, análisis estadístico) para la presencia, nivel de concentración y/o genotipo determinado a partir de una o más moléculas de transducción de señales en una o más vías de señalización (por ejemplo, solas o en combinación con biomarcadores de otras categorías) para ayudar o asistir en predecir curso de enfermedad, seleccionar una terapia con fármacos anti-TNFa adecuada, optimizar la terapia con fármacos anti-TNFa, reducir toxicidad asociada con una terapia con fármacos anti-TNFa o monitorear la eficacia de tratamiento terapéutico con un fármaco anti-TNFa. En modalidades preferidas, se mide el nivel total y/o nivel de activación (por ejemplo, fosforilación) de una o más moléculas de transducción de señales en una o más vías de señalización.

El término "molécula de transducción de señales" o "transductor de señales" incluye proteínas y otras moléculas que llevan a cabo el proceso mediante el cual una célula convierte una señal extracelular o estímulo en una respuesta, incluyendo típicamente secuencias ordenadas de reacciones bioquímicas dentro de la célula. Ejemplos de moléculas de transducción de señales incluyen, pero no están limitadas a, tirosina cinasas receptoras tales como EGFR (por ejemplo, EGFR/HER1/ErbB1 , HER2/Neu/ErbB2, HER3/ErbB3, HER4/ErbB4), VEGFR1/FLT1 , VEGFR2/FLK1/KDR, VEGFR3/FLT4, FLT3/FLK2, PDGFR (por ejemplo, PDGFRA, PDGFRB), c-KIT/SCFR, INSR (receptor de insulina), IGF-IR, IGF-IIR, IRR (receptor relacionado con receptor de insulina), CSF-1 R, FGFR 1 -4, HGFR 1 -2, CCK4, TRK A-C, c-MET, RON, EPHA 1 -8, EPHB 1 -6, AXL, ER, TYR03, TIE 1 -2, TEK, RYK, DDR 1 -2, RET, c-ROS, V-caderina, LTK (tirosina cinasa leucocítica), ALK (linfoma cinasa anaplásica), ROR 1 -2, MUSK, AATYK 1 -3, y RTK 106; formas truncadas de tirosina cinasas receptoras tales como receptores de HER2 truncados con dominios extracelulares amino-terminales ausentes (por ejemplo, p95ErbB2 (p95m), p1 10, p95c, p95n, etc.), receptores de cMET truncados con dominios extracelulares amino-terminales ausentes y receptores HER3 truncados con dominios extracelulares amino-terminales ausentes; dímeros de tirosina cinasa receptores (por ejemplo, p95HER2/HER3; p95HER2/HER2; receptor de HER3 truncado con HER1 , HER2, HER3, o HER4; HER2/HER2; HER3/HER3; HER2/HER3; HER1/HER2; HER1/HER3; HER2/HER4; HER3/HER4; etc.); tirosina cinasas no receptoras tales como BCR-ABL, Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, y LIMK; (componentes de cascada de señalización de tirosina cinasa tales como AKT (por ejemplo, AKT1 , AKT2, AKT3), MEK (MAP2K1 ), ERK2 (MAPK1 ), ERK1 (MAPK3), PI3K (por ejemplo, PIK3CA (p1 10), PIK3R1 (p85)), PDK1 , PDK2, homólogo de fosfatasa y tensina (PTEN), SGK3, 4E- BP1 , P70S6K (por ejemplo, variante de empalme de cinasa p70 S6 alfa I), proteína tirosina fosfatasas (por ejemplo, PTP1 B, PTPN13, BDP1 , etc.), RAF, PLA2, MEKK, JNKK, JNK, p38, Shc (p66), Ras (por ejemplo, K-Ras, N-Ras, H-Ras), Rho, Rac1 , Cdc42, PLC, PKC, p53, cyclina D1 , STAT1 , STAT3, 4,5-bisfosfate de fosfatidilinositol (PIP2), 3,4,5-trifosfato de fosfatidilinositol (PIP3), mTOR, BAD, p21 , p27, ROCK, IP3, TSP-1 , NOS, GSK-3 , RSK 1 -3, JNK, c-Jun, Rb, CREB, K¡67, paxilina, NF-kB, y IKK; receptores de hormonas nucleares tales como receptor de estrógenos (ER), receptor de progesterona (PR), receptor de andrógenos, receptor de glucocorticoides, receptor de mineralocorticoides, receptor de vitamina A, receptor de vitamina D, receptor de retinoide, receptor de hormona tiroides y receptores huérfanos; coactivadores y represores de receptores nucleares tales como amplificados en cáncer de mama-1 (AIB1 ) y correpresor de receptor nuclear 1 (NCOR), respectivamente; y combinaciones de los mismos.

El término "estado de activación" se refiere a si una molécula de transducción de señales particular es activada. En forma similar, el término "nivel de activación" se refiere a qué grado se activa una molécula de transducción de señal es particular. El estado de activación corresponde típicamente al estado de fosforilación, ubiquitinación y/o complejación de una o más moléculas de transducción de señales. Ejemplos no limitativos de estados de activación (listados entre paréntesis) incluyen: HER1/EGFR (EGFRvIll, (p-) EGFR fosforilado, EGFR:Shc, (u-) EGFR ubiquitinado, p-EGFRvIll); ErbB2 (p-ErbB2, p95HER2 (ErbB2 truncado), p-p95HER2, ErbB2:Shc, ErbB2:PI3K, ErbB2:EGFR, ErbB2:ErbB3, ErbB2:ErbB4); ErbB3 (p-ErbB3, ErbB3 truncado, ErbB3:PI3K, p-ErbB3:PI3K, ErbB3:Shc); ErbB4 (p-ErbB4, ErbB4:Shc); c- ET (p-c-MET, c-MET truncado, complejo c-Met:HGF); AKT1 (p-AKT1 ); AKT2 (p-AKT2); AKT3 (p-AKT3); PTEN (p-PTEN); P70S6K (p-P70S6K); MEK (p-MEK); ERK1 (p-ERK1 ); ERK2 (p-ERK2); PDK1 (P-PDK1 ); PDK2 (p-PDK2); SGK3 (p-SGK3); 4E-BP1 (p-4E-BP1 ); PIK3R1 (p- PIK3R1 ); c-KIT (p-c-KIT); ER (p-ER); IGF-1 R (p-IGF-1 R, IGF-1 R:IRS, IRS:PI3K, p-IRS, IGF-1 R:PI3K); INSR (p-INSR); FLT3 (p-FLT3); HGFR1 (p-HGFR1 ); HGFR2 (p-HGFR2); RET (p-RET); PDGFRA (p-PDGFRA); PDGFRB (p-PDGFRB); VEGFR1 (p-VEGFR1 , VEGFRV.PLCy, VEGFR1 :Src); VEGFR2 (p-VEGFR2, VEGFR2:PLCy, VEGFR2:Src, VEGFR2:sulfato de heparina, VEGFR2:VE-cadherina); VEGFR3 (p-VEGFR3); FGFR1 (p-FGFR1 ); FGFR2 (p-FGFR2); FGFR3 (p-FGFR3); FGFR4 (p-FGFR4); TIEI (p-TIEI); TIE2 (P-TIE2); EPHA (p-EPHA); EPHB (p-EPHB); GSK-3 (p-GSK-3 ); NF-kB (complejo p-NF-kB, NF-kB-lkB alfa y otros), IkB (p-lkB, p-P65:lkB); IKK (fosfo IKK); BAD (p-BAD, BAD:14-3-3); mTOR (p-mTOR); Rsk-1 (p-Rsk-1 ); Jnk (p-Jnk); P38 (p-P38); STAT1 (p-STAT1 ); STAT3 (p-STAT3); FAK (p-FAK); RB (p-RB); «¡67; p53 (p-p53); CREB (p-CREB); c-Jun (p-c-Jun); c-Src (p-c-Src); paxilina (p-pax¡lina); GRB2 (p-GRB2), Shc (p-Shc), Ras (p-Ras), GAB1 (P-GAB1 ), SHP2 (p-SHP2), GRB2 (p-GRB2), CRKL (p-CRKL), PLCy (p-PLCy), PKC (por ejemplo, p-PKCa, ?-???ß, p-PKCó), aduciría (p-aducina), RB1 (p-RB1 ), y PYK2 (p-PYK2).

Las siguientes tablas proporcionan ejemplos adicionales de moléculas de transducción de señales para las cuales niveles totales y/o niveles de activación (por ejemplo, fosforilación) pueden determinarse en una muestra (por ejemplo, solos o en combinación con biomarcadores de otras categorías) para ayudar o asistir en predecir curso de enfermedad, seleccionar una terapia con fármacos anti-TNFa adecuada, optimizar una terapia con fármacos anti-TNFa, reducir toxicidad asociada con terapia con fármacos anti-TNFa o monitorear la eficacia de tratamiento terapéutico con un fármaco anti-TNFa.

Tabla 1 Tabla 2 G. Marcadores genéticos La determinación de la presencia o ausencia de variantes alélicas (por ejemplo, SNPs) en uno o más marcadores genéticos en una muestra (por ejemplo, solos o en combinación con biomarcadores de otras categorías) también es útil en los métodos de la presente invención para ayudar o asistir en predecir curso de enfermedad, seleccionar una terapia adecuada con fármaco anti-TNFa, optimizar la terapia con fármaco anti-TNFa, reducir toxicidad asociada con una terapia con fármaco anti-TNFa, o monitorear la eficacia de tratamiento terapéutico con un fármaco anti-TNFa.

Ejemplos no limitativos de marcadores genéticos incluyen, pero no están limitados a, cualquiera de los genes de la vía inflamatoria y SNPs correspondientes que pueden genotipificarse como se muestra en la tabla 1 (por ejemplo, un gen NOD2/CARD15, un gen de la vía IL12/IL23, etc.). De preferencia, se determina la presencia o ausencia de al menos una variante alélica, por ejemplo, un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), en el gen NOD2/CARD15 y/o uno o más genes en la vía de IL12/IL23. Véase, por ejemplo, Barrett et al., Nat. Genet., 40:955-62 (2008) y Wang et al., Amer. J. Hum. Genet, 84:399-405 (2009).

Tabla 3 SNPs Adicionales útiles en la presente invención incluyen, por ejemplo, rs2188962, rs9286879, rs1 1584383, rs7746082, rs1456893, rs1551398, rs17582416, rs3764147, rs1736135, rs4807569, rs7758080 y rs8098673. Véase, por ejemplo, Barret et al., Nal Genet., 40:955-62 (2008). 1. NOD2/CARD15 La determinación de la presencia o ausencia de variantes alélicas tales como SNPs en el gen NOD2/CARD15 es particularmente útil en la presente invención. Según se usa en la presente, el término "variante de NOD2/CARD15" o "variante NOD2" incluye una secuencia de nucleótidos de un gen de NOD2 que contiene uno o más cambios en comparación con el gen NOD2 tipo silvestre o una secuencia de aminoácidos de un polipéptido NOD2 que contiene uno o más cambios en comparación con la secuencia de polipéptidos de NOD2 tipo silvestre. NOD2, También conocido como CARD15, ha sido ubicado en el locus IBD1 en el cromosoma 16 e identificado por clonación de posición (Hugot et al., Nature, 41 1 :599-603 (2001 )) así como una estrategia de genes candidatos de posición (Ogura er a/., Nature, 41 1 :603-606 (2001 ); Hampe et al., Lancet. 357: 1925-1928 (2001 )). El locus IBD1 tiene una alta calificación de enlace multipuntos (MLS) para enfermedad inflamatoria intestinal (MLS = 5.7 en marcador D16S411 en 16q12). Véase, por ejemplo, Cho et al., Inflamm Bowel Dis., 3:186-190 (1997) ; Akolkar et al., Am. J. Gastroenterol., 96:1 127-1 132 (2001 ); Ohmen et al., Hum. Mol. Genet., 5:1679-1683 (1996); Parkes et al., Lancet, 348:1588 (1996); Cavanaugh et al., Ann. Hum. Genet, 62:291 -8 (1998); Brant et al., Gastroenterology, 1 15:1056-1061 (1998) ; Curran et al., Gastroenterology, 1 15:1066-1071 (1998); Hampe et al., Am. J. Hum. Genet., 64:808-816 (1999); y Annese er a/., Eur. J. Hum. Genet., 7:567-573 (1999).

Las secuencias de polipéptidos y (codificación) de ARNm de NOD2 humano se muestran en, por ejemplo, Genbank Nos. de registro NM_022162 y NP_071445, respectivamente. Además, la secuencia completa del clon RP1 1 -327F22 del cromosoma 16 humano, que incluye NOD2, se muestra en, por ejemplo, Genbank No. de registro AC007728. Más aún, la secuencia de NOD2 de otras especies puede encontrarse en la base de datos GenBank.

La proteína NOD2 contiene dominios de reclutamiento de caspasa amino-terminal (CARDs), los cuales pueden activar NF-kappa B (NF-kB), y varios dominios de repetición ricos en leucina carboxi-terminales (Ogura et al., J. Biol. Chem., 276:4812-4818 (2001 )). NOD2 Tiene homología estructural con el regulador de apoptosis Apaf-1/CED-4 y una clase de productos génicos resistentes a enfermedades vegetales (Ogura et al., citado arriba). En forma similar a los productos génicos resistentes a enfermedades vegetales, NOD2 tiene un dominio efector amino-terminal, un dominio de unión a nucleótido y repeticiones ricas en leucina (LRRs). NOD2 Tipo silvestre activa factor nuclear NF-kappa B, haciéndolo sensible a lipopolisacáridos bacterianos (LPS; Ogura et al., citado arriba; Inohara et al., J. Biol. Chem., 276:2551 -2554 (2001 ). NOD2 Puede funcionar como un receptor intercelular para LPS, con las repeticiones ricas en leucina requeridas para capacidad de respuesta.

Las variaciones en tres polimorfismos de un solo nucleótido en la región de codificación de NOD2 han sido descritas previamente. Estos tres SNPs, designados R702W ("SNP 8"), G908R ("SNP 12") y 1007fs ("SNP 13"), se ubican en la región carboxi-terminal del gen NOD2 (Hugot et ai, citado arriba). Una descripción adicional de SNP 8, SNP 12 y SNP 13, así como de SNPs adicionales en el gen NOD2 adecuado para usarse en la invención, se puede encontrar en, por ejemplo, patentes de E.U.A. Nos. 6,835,815, 6,858,391 ; y 7,592,437; y patentes de E.U.A. Nos. de publicación 20030190639, 20050054021 y 20070072180.

En algunas modalidades, una variante de NOD2 se ubica en una región de codificación de locus de NOD2, por ejemplo, dentro de una región que codifica para varias repeticiones ricas en leucina en la porción carboxi-termtnal del polipéptido NOD2. Estas variantes de NOD2 ubicadas en la región de repetición rica en leucina de NOD2 incluyen, sin limitación, R702W ("SNP 8") y G908R ("SNP 12"). Una variante de NOD2 útil en la invención también puede codificar para un polipéptido NOD2 con capacidad reducida para activar NF-kappa B en comparación con la activación de NF-kappa B por un polipéptido NOD2 tipo silvestre. Como un ejemplo no limitativo, la variante de NOD2 1007fs ("SNP 13") se traduce en un polipéptido NOD2 truncado que tiene capacidad reducida para inducir NF-kappa B en respuesta a estimulación con LPS (Ogura er a/., Nature, 41 1 :603-606 (2001 )).

Una variante de NOD2 útil en la invención puede ser, por ejemplo, R702W, G908R o I 007fs. R702W, G908R y 1007fs Se ubican dentro de la región de codificación de NOD2. En una modalidad, un método de la invención se practica con la variante de NOD2 R702W. Según se usa en la presente, el término "R702W" incluye un polimorfismo de un solo nucleótido dentro del exón 4 del gen NOD2, el cual se presenta dentro de un triplete que codifica para el aminoácido 702 de la proteína NOD2. El alelo de NOD2 tipo silvestre contiene un residuo de citosina (c) en la posición 138,991 de la secuencia de AC007728, que se presenta dentro de un tirplete que codifica para una arginina en el aminoácido 702. La variante NOD2 de R702W contiene un residuo de timina (t) en la posición 138,991 de la secuencia de AC007728, dando como resultado una sustitución de arginina (R) por triptófano (W) en el aminoácido 702 de la proteína NOD2. En consecuencia, esta variante de NOD2 es indicada "R702W" o "702W" y también se puede indicar "R675W" con base en el sistema de numeración inicial de Hugot et al., citado arriba. Además, la variante R702W también se conoce como el alelo "SNP 8" o un alelo "2" en SNP 8. El número de identificación del SNP NCBI para R702W o SNP 8 es rs2066844. La presencia de la variante NOD2 de R702W y otras variantes de NOD2 puede detectarse convenientemente, por ejemplo, por ensayos de discriminación alélica o análisis de secuencias.

Un método de la invención también se puede llevar a la práctica con la variante N0D2 G908R. Según se usa en la presente, el término "G908R" incluye un polimorfismo de un solo nucleótido dentro del exón 8 del gen NOD2, el cual se presenta dentro de un triplete que codifica para el aminoácido 908 de la proteína NOD2. El aminoácido 908 se ubica dentro de la región de repetición rica en leucina del gen NOD2. El alelo NOD2 tipo silvestre contiene un residuo de guanina (g) en la posición 128,377 de la secuencia de AC007728, el cual se presenta dentro de un triplete que codifica para glicina en el aminoácido 908. La variante NOD2 G908R contiene un residuo de citosina (c) en la posición 128,377 de la secuencia de AC007728, dando como resultado una sustitución de glicina (G) por arginina (R) en el aminoácido 908 de la proteína NOD2. En consecuencia, esta variante de NOD2 es indicada "G908R" o "908R" y también se puede indicar "G881 R" con base en el sistema de numeración inicial de Hugot et al., citado arriba. Además, la variante G908R también se conoce como el alelo "SNP 12" o un alelo "2" en SNP 12. El número de identificación SNP de NCBI para SNP 12 G908R es rs2066845.

Un método de la invención también se puede llevar a la práctica con la variante NOD2 1007fs. Esta variante es una inserción de un solo nucleótido que resulta en un desplazamiento de cuadro en la décima repetición rica en leucina de la proteína NOD2 y es seguido por un codón de paro prematuro. El truncamiento resultante de la proteína NOD2 parece impedir la activación de NF-kappaB en respuesta a lipopolisacáridos bacterianos (Ogura et ai., citado arriba). Según se usa en la presente, el término "1007fs" incluye un polimorfismo de un solo nucleótido dentro del exón 1 1 del gen NOD2, el cual se presenta en un triplete que codifica para el aminoácido 1007 de la proteína NOD2. La variante 1007fs contiene una citosina que ha sido añadida en la posición 121 ,139 de la secuencia de AC007728, dando como resultado una mutación por desplazamiento de cuadro en el aminoácido 1007. En consecuencia, esta variante NOD2 es llamada "1007fs" y también puede ser llamada "3020¡nsC" o "980fs" con base en el sistema de numeración inicial de Hugot et al., citado arriba. Además, la variante NOD2 de 1007fs se conoce también como el alelo "SNP 13" o un alelo "2" en SNP 13. El número ID SNP NCBI para 1007fs o SNP 13 es rs2066847.

Un experto en la técnica reconoce que un alelo de variante NOD2 particular u otro alelo polimórfico puede definirse convenientemente, por ejemplo, en comparación con un individuo de referencia del Centre-d'Etude du Polymorphisme Humain (CEPH) tal como el individuo designado 1347-02 (Dib et al., 380:152-154 (1996)), usando ADN de referencia disponible comercialmente obtenido, por ejemplo, de PE Biosystems (Foster City, CA). Además, información específica sobre SNPs puede obtenerse del dbSNP del Centro Nacional para Información de Biotecnología (NCBI).

Una variante de NOD2 también se puede ubicar en una región no codificadora del locus NOD2. Las regiones no codificadoras incluyen, por ejemplo, secuencias de intrones así como secuencias no traducidas 5' y 3'. Un ejemplo no limitativo de un alelo de variante NOD2 ubicada en una región no codificadora del gen NOD2 es la variante JW1 , la cual se describe en Sugimura et al., Am. J. Hum. Genet, 72:509-518 (2003) y patente de E.U.A. No. de publicación 20070072180. Ejemplos de alelos de variante de NOD2 ubicados en la región no traducida 3' del gen NOD2 incluyen, sin limitación, los alelos variantes JW15 y JW16, los cuales se describen en la patente de E.U.A. No. de publicación 20070072180. Ejemplos de alelos de la variante NOD2 ubicados en la región no traducida 5' (por ejemplo, región promotora) del gen NOD2 incluyen, sin limitación, los alelos variantes JW17 y JW18, los cuales se describen en la patente de E.U.A. No. de publicación 20070072180.

Según se usa en la presente, el termino "alelo variante JW1" incluye una variación genética en el nucleótido 158 de la secuencia de intervención 8 (intrón 8) del gen N0D2. En relación con la secuencia AC007728, el alelo vanante JW1 se ubica en la posición 128,143. La variación genética en el nucleotido 158 del intrón 8 puede ser, pero no está limitada a, una sustitución de un solo nucleotido, sustituciones de varios nucleótidos o una supresión o inserción de uno o más nucleótidos. La secuencia tipo silvestre del intrón 8 tiene una citosina en la posición 158. Como ejemplos no limitativos, un alelo variante JW1 puede tener una sustitución de citosina (c) por adenina (a), citosina (c) por guanina (g) o citosina (c) por timina (t) en el nucleotido 158 del intrón 8. En una modalidad, el alelo variante JW1 es un cambio de una citosina (c) por una timina (t) en el nucleotido 158 del intrón 8 de NOD2.

El término "alelo variante JW15" incluye una variación genética en la región no traducida 3' de NOD2 en la posición de nucleotido 1 18,790 de la secuencia AC007728. La variación genética en el nucleotido 1 18,790 puede ser, pero no está limitada a, una sustitución de un solo nucleotido, sustituciones de varios nucleótidos o una supresión o inserción de uno o más nucleótidos. La secuencia tipo silvestre tiene una adenina (a) en la posición 1 18,790. Como ejemplos no limitativos, un alelo variante JW15 puede tener una sustitución de adenina (a) por citosina (c), adenina (a) por guanina (g), o adenina (a) por timina (t) en el nucleotido 1 18,790. En una modalidad, el alelo variante JW15 es un cambio de una adenina (a) por una citosina (c) en el nucleotido 1 18,790.

Según se usa en la presente, el término "alelo variante JW16" incluye una variación genética en la región no traducida 3' de NOD2 en la posición de nucleotido 1 18,031 de la secuencia AC007728. La variación genética en el nucleotido 1 18,031 puede ser, pero no está limitada a, una sustitución de un solo nucleotido, sustituciones de varios nucleótidos o una supresión o inserción de uno o más nucleótidos. La secuencia tipo silvestre tiene una guanina (g) en la posición 1 18,031 . Como ejemplos no limitativos, un alelo variante JW16 puede tener una sustitución de guanina (g) por citosina (c), guanina (g) por adenina (a) o guanina (g) por timina (t) en el nucleotido 118,031 . En una modalidad, el alelo variante JW16 es un cambio de una guanina (g) por una adenina (a) en el nucleotido 1 18,031 .

El término "alelo variante JW17" incluye una variación genética en la región no traducida 5' de NOD2 en la posición de nucleotido 154,688 de la secuencia AC007728. La variación genética en el nucleotido 154,688 puede ser, pero no está limitada a, sustituciones de varios nucleotidos o una supresión o inserción de uno o más nucleotidos. La secuencia tipo silvestre tiene una citosina (c) en la posición 154,688. Como ejemplos no limitativos, un alelo variante JW17 puede tener una sustitución de citosina (c) por guanina (g), citosina (c) por adenina (a) o citosina (c) por timina (t) en el nucleotido 154,688. En una modalidad, el alelo variante JW17 es un cambio de una citosina (c) por una timina (t) en el nucleotido 154,688.

Según se usa en la presente, el término "alelo variante JW18" incluye una variación genética en la región no traducida 5' de NOD2 en la posición de nucleotidos 154,471 de la secuencia AC007728. La variación genética en el nucleotido 154,471 puede ser, pero no está limitada a, una sustitución de un solo nucleotido, sustituciones de varios nucleotidos o una supresión o inserción de uno o más nucleotidos. La secuencia tipo silvestre tiene una citosina (c) en la posición 154,471. Como ejemplos no limitativos, un alelo variante JW18 puede tener una sustitución de citosina (c) por guanina (g), citosina (c) por adenina (a) o citosina (c) por timina (t) en el nucleotido 154,471 . En una modalidad, el alelo variante JW18 es un cambio de una citosina (c) por una timina (t) en el nucleotido 154,471.

Se entiende que los métodos de la invención pueden llevarse a la práctica con estos u otros alelos variantes NOD2 ubicados en una región de codificación o región no codificadora (por ejemplo, región de intrón o promotor) del locus NOD2. Se entiende además que los métodos de la invención pueden incluir determinar la presencia de una, dos, tres, cuatro o más variantes de NOD2, incluyendo, pero no limitadas a, los alelos SNP-8, SNP-12 y SNP-13, y otras variantes de región de codificación así como de no codificación.

V. Ejemplos La presente invención se describirá en mayor detalle a manera de ejemplos específicos. Los siguientes ejemplos se ofrecen para efectos ilustrativos, y no se intenta que limiten la invención de ninguna manera. Aquellos de capacidad en la técnica reconocerán fácilmente una variedad de parámetros no críticos que pueden cambiarse o modificarse para producir esencialmente los mismos resultados.

Ejemplo 1 Novedoso ensayo de desplazamiento por movilidad para medir los niveles biológicos anti-TNFa Este ejemplo ilustra un novedoso ensayo homogéneo para medir la concentración de fármacos anti-TNFa en una muestra de paciente (por ejemplo, suero) usando cromatografía de exclusión de tamaño para detectar la unión del fármaco anti-TNFa a TNFa marcado fluorescentemente. El ensayo es adecuado toda vez que obvia la necesidad de etapas de lavado, usa fluoróforos que permiten la detección en los espectros visible y/o IR lo cual reduce los aspectos de interferencia de fondo y suero, incrementan la capacidad para detectar fármacos anti-TNFa en pacientes con un bajo título debido a la alta sensibilidad de detección de marcadores fluorescentes, y se presenta como una reacción en fase líquida, reduciendo así la probabilidad de cualquier cambio en el epítopo por fijación a una superficie sólida tal como una placa de ELISA.

En una modalidad ejemplar, TNFoc se marca con un fluoróforo (por ejemplo, Alexa647) , en donde el fluoróforo puede detectarse en cualquiera o ambos de los espectros visible e IR. El T Foc marcado es incubado con suero humano en una reacción en fase líquida para permitir que el fármaco anti-TNFa presente en el suero se una. El TNFoc marcado también puede ser incubado con cantidades conocidas del fármaco anti-TNFa en una reacción en fase líquida para crear una curva estándar. Después de la incubación, las muestras se cargan directamente en una columna de exclusión de tamaño. La unión del fármaco anti-TNFa al TNFa marcado se traduce en un desplazamiento hacia la izquierda del pico en comparación con TNFa marcado solo. La concentración del fármaco anti-TNFa presente en la muestra de suero puede compararse después con la curva estándar y controles.

La figura 1 muestra un ejemplo del ensayo de la presente invención en el que se usa HPLC de exclusión de tamaño para detectar la unión entre TNFa-Alexa647 y HUMIRA™ (adalimumab). Como se muestra en la figura 1 , la unión de HUMIRA™ a TNFa-Alexa647 causó un desplazamiento del pico de TNFa-Alexa64 a la izquierda.

Las figuras 2A-2C muestra curvas de respuesta a dosis de la unión de HUMIRA™ a TNFa-Alexa647. En particular, la figura 2A muestra que HUMIRA™ incrementó en forma dependiente de dosis el desplazamiento de TNFa-Alexa6 7 en el ensayo de cromatografía por exclusión de tamaño. La figura 2B muestra que la presencia de 1 % de suero humano no tuvo un efecto significativo en el desplazamiento de TNFa-Alexa647 en el ensayo de cromatografía por exclusión de tamaño. La figura 2C muestra que la presencia de suero positivo para RF agrupado no tuvo un efecto significativo en el desplazamiento de TNFa-Alexa647 en el ensayo de cromatografía por exclusión de tamaño.

De esta manera, este ejemplo demuestra la utilidad de la presente invención para monitorear pacientes que reciban un fármaco anti-TNFa tal como HUMIRA™: (1 ) para guiarse en la determinación de la dosis de fármaco adecuada; (2) para evaluar la farmacocinética del fármaco, por ejemplo, para determinar si el fármaco está siendo depurado del cuerpo demasiado rápido; y (3) para guiar decisiones de tratamiento, por ejemplo, de si se cambia del fármaco anti-TNFa actual por un inhibidor de TNFa diferente o por otro tipo de terapia.

Ejemplo 2 Novedoso ensayo de desplazamiento por movilidad para medir los niveles de HACA y HAHA Este ejemplo ¡lustra un novedoso ensayo homogéneo para medir concentraciones de autoanticuerpos (por ejemplo, HACA y/o HAHA) en una muestra de paciente (por ejemplo, suero) usando cromatografía de exclusión de tamaño para detectar la unión de estos autoanticuerpos a fármaco anti-TNFa marcado fluorescentemente. El ensayo es adecuado toda vez que obvia la necesidad de etapas de lavado que eliminan HACA y HAHA de baja afinidad, usa fluoróforos que permiten la detección en los espectros visible y/o IR lo cual reduce los aspectos de interferencia de fondo y suero, incrementa la capacidad para detectar HACA y HAHA en pacientes con un bajo título debido a la alta sensibilidad de la detección de marcadores fluorescentes,, y se presenta como una reacción en fase líquida, reduciendo así la probabilidad de cualquier cambio en el epítopo por fijación a una superficie sólida tal como una placa de ELISA.

La utilidad clínica de medir autoanticuerpos (por ejemplo, HACA, HAHA, etc.) que se generan contra inhibidores de TNFa se ilustra por el hecho de que los HACAs fueron afectados en 53%, 21 % y 7% de los pacientes con artritis reumatoide tratados con 1 mg/kg, 3 mg/kg y 10 mg/kg de infliximab. Cuando infliximab se combinó con metotrexato, la incidencia de anticuerpos fue inferior a 15%, 7% y 0%, lo cual indica que la terapia ¡nmunosupresora concurrente es efectiva para reducir las respuestas anti-fármaco, pero también indica que una alta dosis de anticuerpo anti-TNFa podría llevar a tolerancia. En la enfermedad de Crohn, se reportó una incidencia mucho más alta; después de la quinta infusión, 61 % de los pacientes tuvieron HACA. La respuesta clínica fue acortada cuando estuvieron presentes HACAs. Véase, Rutgeerts, N. Engl. J. Med., 348:601-608 (2003). Un estudio retrospectivo de los niveles de infliximab y HACA medidos durante un periodo de 3 años de 2005 a 2008 en 155 pacientes demostró que los HACAs se detectaban en 22.6% (N=35) de los pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal. Véase, Afif eí al., "Clinical Utility of Measuring Infliximab and Human Anti-Chimeric Antibody Levéis in Patients with Inflammatory Bowel Disease"; documento presentado en Digestive Disease Week; 30 de mayo - 3 de junio de 2009; Chicago, IL. Los autores concluyeron que cambiar el tratamiento con base en los síntomas clínicos únicamente puede llevar a un manejo inadecuado.

El ensayo de desplazamiento por movilidad homogénea es adecuado sobre los métodos actuales tales como el ensayo de puenteo mostrado en la figura 3 para medir concentraciones de autoanticuerpos (por ejemplo, HACA y/o HAHA) en una muestra de paciente toda vez que el método de la invención es capaz de medir la concentración de autoanticuerpos tales como HACA sin unión no específica e interferencia en fase sólida de la placa de ELISA, sin interferencia del fármaco anti-TNFa (por ejemplo, con el ensayo de puenteo, las mediciones de HACA deben tomarse en los niveles mínimos del fármaco anti-TNFa), y sin ninguna dependencia en la multivalencla del anticuerpo (por ejemplo, los anticuerpos lgG4 no se detectan usando el ensayo de puenteo toda vez que los anticuerpos lgG4 son biespecíficos y no pueden retro-enlazar al mismo antígeno). Así, la presente invención tiene al menos las siguientes ventajas sobre los métodos actuales.

Evita la fijación de antígenos en superficies sólidas (se evita la desnaturalización); elimina el efecto de lgG4; supera los aspectos mínimos de anticuerpos terapéuticos; detecta anticuerpos con afinidades débiles; elimina la unión específica de IgGs irrelevantes; e incrementa la sensibilidad y especificidad de detección.

En una modalidad ejemplar, un fármaco anti-TNFoc (por ejemplo, REMICADE™) se marca con un fluoróforo (por ejemplo, Alexa6 7), en donde el fluoróforo puede ser detectado en cualquiera o ambos de los aspectos visible e IR. El fármaco anti-TNFoc marcado se incuba con suero humano en una reacción en fase líquida para permitir que HACA y HAHA presentes en el suero se unan. El fármaco anti-TNFa marcado también se puede incubar con cantidades conocidas de un anticuerpo anti-lgG en una reacción en fase líquida para crear una curva estándar. Después de la incubación, las muestras se cargan directamente en una columna de exclusión de tamaño. La unión de los anticuerpos al fármaco anti-TNFa se traduce en un desplazamiento a la izquierda del pico en comparación con el fármaco marcado solo. La concentración de HACA y HAHA presentes en la muestra de suero puede ser luego comparada con una curva estándar y controles. La figura 4 ilustra un contorno ejemplar de los ensayos de detección de autoanticuerpos de la presente invención para medir las concentraciones de HACA/HAHA generados contra REMICADE™. En ciertos casos, altos niveles de HACA/HAHA indican que la terapia actual con REMICADE™ debe ser cambiada por otro fármaco anti-TNFa tal como HUMIRA™.

El principio de este ensayo se basa en el desplazamiento por movilidad del anticuerpo unido al complejo de REMICADE marcado con Alexa647 contra Remicade marcado con Alexa647 libre en cromatografía de líquidos de alto rendimiento-exclusión de tamaño (SE-HPLC) debido al incremento en peso molecular del complejo.

La cromatografía en este ejemplo se llevó a cabo en un sistema para HPLC Agilent-1200, usando una columna Bio-Sep 300x7.8 mm SEC-3000 (Phenomenex) con un intervalo de fraccionamiento de peso molecular de 5,000-700,000 y una fase móvil de 1 X PBS, pH 7.4, a una velocidad de flujo de 0.5 mLJmin con detección UV a 650 nm. Un volumen de muestra de 100 µ?_ se carga en la columna para cada análisis.

El complejo de Remicade marcado con Alexa647 unido a anticuerpo se forma al incubar una cantidad conocida del anticuerpo y Remicade marcado con Alexa647 en el regulador de pH de elución de 1 X PBS, pH 7.3, a temperatura ambiente durante 1 hora antes del análisis SE-HPLC.

Las figuras 5A-5J muestran un análisis de respuesta a dosis de la unión de anticuerpo anti-lgG humana a REMICADE™ Alexa647 según se detecta usando el ensayo de cromatografía por exclusión de tamaño de la presente invención. La unión de anticuerpo anti-lgG a REMICADE™-Alexa647 causó un desplazamiento del pico de REMICADE-Alexa647 a la izquierda. La figura 6 muestra un segundo análisis de respuesta a dosis en la unión de anticuerpo anti-lgG humana a REMICADE™-Alexa647 según se detecta usando el ensayo de cromatografía de exclusión de tamaño de la presente invención. Cantidades más altas de anticuerpo anti-lgG se tradujeron en un incremento dependiente de dosis en la formación de complejos anti-lgG/REMICADE™-Alexa647> como se indica por un desplazamiento del pico de REMICADE-Alexa647 a la izquierda. Las figuras 7A-7B muestra curvas de respuesta a dosis de la unión de anticuerpo anti-lgG a REMICADE™-Alexa647.

Las figuras 8A-8D muestran la formación del inmuno-complejo REMICADE™-Alexa647 en suero humano normal y suero positivo a HACA según se detecta usando el ensayo de cromatografía de exclusión de tamaño de la presente invención con 100 µ? de muestra inyectada. Como se muestra en las figuras 8A-8D, la unión de HACA presente en muestras de pacientes a REMICADE™-Alexa647 causó un desplazamiento del pico de REMICADE™-Alexa647 a la izquierda. De esta forma, el ensayo de cromatografía de exclusión de tamaño de la invención es particularmente adecuado toda vez que mide HACA en presencia de REMICADE™, se puede utilizar mientras el paciente está en terapia, mide la unión a HACA tanto débil como fuerte, es ensayo de desplazamiento por movilidad de mezcla y lectura, y se puede extender a otros enfoques que usen REMICADE™ marcado para equilibrar con HACA y REMICADE™.

La figura 9 proporciona un resumen de las mediciones de HACA de 20 muestras de suero de pacientes que se llevaron a cabo usando el ensayo de puenteo o el ensayo de desplazamiento por movilidad de la presente invención. Este estudio comparativo demuestra que los presentes métodos han incrementado la sensibilidad sobre los métodos actuales porque tres muestras fueron negativas para HACA según se mide usando el ensayo de puenteo fueron en realidad positivas para HACA cuando se midió usando el ensayo de desplazamiento por movilidad de la presente invención (véase, paciente # SK07070305, SK07070595 y SK071 10035).

De esta manera, este ejemplo demuestra la utilidad de la presente invención para monitorear pacientes que reciben un fármaco anti-TNF (por ejemplo, REMICADE™) para detectar la presencia o nivel de autoanticuerpos (por ejemplo, HACA y/o HAHA) contra el fármaco, toda vez que estas respuestas inmunes pueden estar asociadas con reacciones hipersensibles y cambios dramáticos en farmacocinética y biodistribución del fármaco anti-TNFa que impidan un tratamiento adicional con el fármaco.

En conclusión, los ejemplos 1 y 2 demuestran que TNFa y anticuerpos anti-TNFa pueden ser marcados eficientemente con Alexa647. Cuando TNFa-Alexa6 7 marcado se incubó con anticuerpos anti-TNFa, el tiempo de retención del complejo TNFa anticuerpo anti-TNFa marcado fue desplazado, y la cantidad de anticuerpo anti- TNFa que causó el desplazamiento pudo ser cuantificada con HPLC. Además, cuando el anticuerpo anti-TNFa se incubó con anticuerpo anti-lgG humana, el tiempo de retención del complejo anticuerpo anti-TNFa/anticuerpo anti-lgG marcado fue desplazado, y la cantidad de anticuerpo anti-lgG que causó el desplazamiento pudo ser cuantificada con HPLC. Más aún, un bajo contenido sérico en el sistema de ensayo mostró tener poco efecto en el análisis de HPLC. Finalmente, se pudo generar una curva estándar para el anticuerpo anti-TNFa y los ensayos HACA/HAHA y pudo ser usado para cuantificar anticuerpo anti-TNFa en suero de pacientes o niveles de HACA/HAHA. Adecuadamente, la presente invención proporciona en ciertos aspectos un ensayo de desplazamiento por movilidad, tal como un ensayo de mezcla y lectura homogéneo desarrollado para medir tanto fármaco como anticuerpos contra fármaco. Se generó una curva estándar para el biológico anti-TNFa Remicade y Humira y también para los anticuerpos HACA contra Remicade. El formato de ensayo de desplazamiento por movilidad, a diferencia de ELISA, elimina el recubrimiento de antígenos a superficies sólidas y no es afectado por la unión no específica de IgGs irrelevantes. El formato de ensayo es simple, pero muy sensible y se puede usar para detectar todos los fármacos biológicos anti-TNFa (por ejemplo, Remicade, Humira, Enbrel y Cimzia) así como el anticuerpo neutralizante (anti-Remicade™) en suero de pacientes.

Ejemplo 3 Medición de los niveles de anticuerpos anti-quiméricos humanos (HACA) e infliximab (IFX) en suero de pacientes usando un ensayo de desplazamiento por movilidad novedoso Antecedentes: Infliximab (IFX) es un terapéutico de anticuerpo monoclonal quimérico contra TNFa que ha mostrado ser efectivo en el tratamiento de enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide (RA) y enfermedad inflamatoria intestinal (IBD). Sin embargo, anticuerpos contra IFX se encontraron en algunos pacientes tratados con IFX a través de la detección de anticuerpos anti-quiméricos humanos (HACA), los cuales pueden reducir la eficacia del fármaco o inducir efectos adversos. El monitoreo de los niveles de HACA e IFX en pacientes individuales puede ayudar a optimizar la dosis y tratamiento con IFX. Los métodos actuales para detectar HACA se basan en ensayos en fase sólida, los cuales están limitados por el hecho de que la presencia de IFX en la circulación puede ocultar la presencia de HACA y, por lo tanto, la medición sólo se puede hacer al menos 8 semanas después de una dosis de IFX. Más aún, este lapso de tiempo confunde más los ensayos debido a la rápida depuración de los complejos inmunes de alto peso molecular en la circulación sanguínea. Para superar estas desventajas, hemos desarrollado y evaluado un nuevo método para medir niveles de IFX y HACA en suero en pacientes tratados con IFX.

Métodos: Se desarrolló un novedoso ensayo de desplazamiento por movilidad por HPLC-(SE) de exclusión de tamaño en fase líquida y no marcado radioactivamente para medir los niveles de HACA e IFX en suero de pacientes tratados con IFX. El inmuno-complejo (por ejemplo TNFa/IFX o IFX/HACA), TNFa libre o IFX, y la relación de unido/libre pueden resolverse y calcularse con alta sensibilidad. Las concentraciones en suero de IFX o HACA fueron determinadas con curvas estándares generadas al incubar con diferentes concentraciones de IFX o suero positivo para HACA agrupado. Usando este ensayo novedoso, hemos medido los niveles de IFX y HACA en sueros recolectados de pacientes con IBD tratados con IFX quienes habían recaído y comparando los resultados con aquellos obtenidos por el ensayo de ELISA de puente tradicional.

Resultados: Se generaron curvas de respuesta a dosis a partir del ensayo novedoso con alta sensibilidad. La detección de HACA se demostró en presencia de un exceso de IFX. En las 1 17 muestras de suero de pacientes tratados con IFX, se encontró que 65 muestras tenían niveles de IFX por arriba del límite de detección y el promedio fue 1 .0+6.9 mg/mL. Para niveles de HACA, 33 (28.2%) de las muestras se encontró que eran positivas mientras que el ensayo de ELISA de puente detectó sólo 24 muestras positivas. También identificamos 9 falsos negativos y 9 falsos positivos de las muestras determinadas por el ensayo de puente. Se encontró que los niveles de HACA estaban incrementados en 1 1 pacientes durante el curso de tratamiento con IFX mientras que se encontró que los niveles de IFX estaban reducidos significativamente.

Conclusiones: Se ha desarrollado un novedoso ensayo de desplazamiento por movilidad en fase líquida y no marcado radiactivamente para medir los niveles de IFX y HACA en suero de pacientes tratados con IFX. El ensayo tenía alta sensibilidad y precisión, y los resultados obtenidos fueron reproducibles. Este novedoso ensayo puede usarse adecuadamente para medir niveles de HACA e IFX mientras los pacientes están en terapia.

INTRODUCCIÓN El factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) juega un papel central en la patogénesis de enfermedades autoinmunes tales como enfermedad de Crohn (CD) y artritis reumatoide (RA). Está bien documentado que bloquear TNFa con anticuerpos terapéuticos tales como Infliximab (IgGl K monoclonal quimérico de humano-murino) o adalimumab (anticuerpo monoclonal completamente humano) reduce la actividad de enfermedad en CD y RA. Sin embargo, aproximadamente 30-40% de los pacientes no responden a la terapia con anti-TNFa y algunos pacientes requieren dosis más altas o ajustes en la frecuencia de dosificación debido a la falta de respuesta suficiente. Las diferencias de biodisponibilidad de fármaco y farmacocinética en pacientes individuales pueden contribuir a la falla del tratamiento. La inmunogenicidad de los fármacos, la cual causa que los pacientes desarrollen HACA/HAHA, podría traducirse en una gama de reacciones adversas desde respuesta alérgica leve a choque anafiláctico. Estos problemas son reconocidos ahora por nuestros investigadores, agencias de control de fármacos, compañías aseguradoras de salud y fabricantes de fármacos. Más aún, muchos pacientes con falla de respuesta secundaria a un fármaco anti-TNFa se benefician de un cambio por otros fármacos anti-TNFa sugiriendo un papel de anticuerpos neutralizantes dirigidos específicamente contra la proteína usada para tratamiento (Radstake et al., Ann. Rheum. Dis., 68(1 1 ):1739-45 (2009)). El monitoreo de pacientes para niveles de fármaco y HACA/HAHA es por lo tanto garantizado de tal manera que la administración de fármacos pueda ser diseñada para el paciente individual y terapias prolongadas puedan darse de manera efectiva y económica con muy poco o ningún riesgo para los pacientes (Bendtzen et al., Scand. J. Gastroenterol, 44(7):774-81 (2009)).

Se han usado varios inmunoensayos ligados a enzimas para evaluar los niveles circulantes de fármacos y HACA/HAHA. La figura 10 proporciona un resumen de los ensayos actuales disponibles para la medición de HACA en comparación con el novedoso ensayo HACA de la presente invención. Una de las limitaciones de las metodologías actuales es que los niveles de anticuerpo son difíciles de medir cuando existe una cantidad mesurable de fármaco en la circulación. En contraste con los métodos en fase sólida actuales para detectar HACA en los cuales sólo se pueden llevar a cabo mediciones al menos ocho semanas después de una dosis de IFX, el novedoso ensayo de la presente invención es un ensayo de (SE)-HPLC de exclusión de tamaño en fase líquida y no marcado radioactivamente que es capaz de medir niveles de HACA e IFX en suero de pacientes mientras estén siendo tratados con IFX.

Los siguientes son los razonamientos para medir las concentraciones en suero de fármacos biológicos anti-TNFa y anticuerpos contra fármacos biológicos de TNFa en pacientes: (1 ) Para estudios de PK en pruebas clínicas; (2) puede requerirse por la FDA durante las pruebas clínicas para monitorear la respuesta inmune de un paciente al fármaco biológico; (3) para monitorear la respuesta de un paciente al fármaco biológico al medir HACA o HAHA para guiar la dosis de fármaco para cada paciente; y (4) para usarse como una guía para cambiar a un fármaco biológico diferente cuando el fármaco inicial falle.

MÉTODOS Análisis SE-HPLC de los niveles de infliximab (IFX) en suero de pacientes. TNFa Recombinante humano se marcó con un fluoróforo ("F1" tal como, por ejemplo, Alexa Fluor® 488) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. TNFa Marcado se incubó con diferentes cantidades de IFX o suero de paciente durante una hora a temperatura ambiente. Muestras de 100 µ?_ en volumen se analizaron mediante cromatografía de exclusión de tamaño en un sistema HPLC. Se usó FLD para monitorear el TNFa-F1 libre y el inmuno-complejo de TNFa-F1 unido con base en sus tiempos de retención. Los niveles de IFX en suero se calcularon a partir de la curva estándar.

Análisis SE-HPLC de ¡os niveles de HACA en suero de pacientes. IFX Purificado se marcó con F1 . IFX Marcado se incubó con diferentes diluciones de suero positivo para HACA agrupado o suero de paciente diluido durante una hora a temperatura ambiente. Muestras de 100 µ? de volumen se analizaron mediante cromatografía de exclusión de tamaño en un sistema de HPLC. Se usó FLD para monitorear el IFX-F1 libre y el inmuno-complejo de IFX-F1 unido con base en sus tiempos de retención. La relación de IFX-F1 unido a libre se usó para determinar el nivel de HACA.

Procedimiento de ensayo de desplazamiento por movilidad para medir HACA en suero. El principio de este ensayo se basa en el desplazamiento por movilidad del complejo de infliximab (IFX) marcado con F1 unido a HACA contra IFX marcado con F1 libre en cromatografía de líquidos de alto rendimiento - exclusión de tamaño (SE-HPLC) debido al incremento en peso molecular del complejo. La cromatografía se lleva a cabo en un sistema para HPLC Agilent 1200, usando una columna Bio-Sep 300x7.8 mm SEC-3000 (Phenomenex) con un intervalo de fraccionamiento de peso molecular de 5,000-700,000 y una fase móvil de 1 X PBS, pH 7.3, a una velocidad de flujo de 0.5-1 .0 mL/min con detección FLD. Un volumen de muestra de 100 ? se carga en la columna para cada análisis. El complejo de IFX marcado con F1 unido a HACA se forma al incubar suero de un paciente tratado con IFX e IFX marcado con F1 en el regulador de pH de elución de 1 X PBS, pH 7.4, a temperatura ambiente durante 1 hora antes del análisis SE-HPLC. El ensayo también se corrió en presencia de agentes de interferencia variables, tales como factor reumático y TNF-a para validar el ensayo.

RESULTADOS Las figuras 1 1 A-1 1 D muestran la separación del complejo IFX-F1 unido a HACA del IFX-F1 libre debido al desplazamiento por movilidad del complejo de alto peso molecular. Como se ve en los paneles 1 1 C y 1 1 D, el tiempo de retención del pico fluorescente se desplazó de 21.8 min a 15.5-19.0 min. Entre más HACA esté presente en la mezcla de reacción, menos IFX-F1 libre permanece en el cromatograma y más inmuno-complejo se forma. Las figuras 12A-12B muestra las curvas de respuesta a dosis del desplazamiento de pico fluorescente causado por la adición de HACA. Usando la muestra positiva a HACA, pudimos detectar el desplazamiento máximo con diluciones 1 : 1000 del suero.

Las figuras 13A-13D muestran la separación del complejo TNFa-F1 unido a IFX del TNFa-F1 libre debido al desplazamiento por movilidad del complejo de alto peso molecular. Como se ve en los paneles c y d, el tiempo de retención del pico fluorescente se desplazó de 24 minutos a 13-19.5 minutos. Entre más IFX esté presente en la mezcla de reacción, menos TNFa-F1 libre permanece en el cromatograma y se forma más inmuno-complejo. La figura 14 muestra las curvas de respuesta a dosis del desplazamiento máximo de TNF -F1 causado por la adición de IFX. Con base en el IFX añadido, el límite de detección es 10 ng/mL de IFX en suero.

El novedoso ensayo de desplazamiento por movilidad de la presente invención fue validado al probar muestras de suero de pacientes positivos y negativos para HACA añadido por el ensayo Bridge (tabla 4). Usando este ensayo, hemos analizado muestras de suero de 50 sujetos saludables y 117 pacientes de IBD tratados con IFX. Todas las 50 muestras de sujetos saludables tienen un nivel de IFX debajo del límite de detección, mientras que 65 de las muestras de pacientes tienen una concentración de IFX promedio de 1 1.0 µg/mL. La tabla 5 muestra los niveles de HACA en el suero de controles saludables de pacientes con IBD tratados con IFX medido por el ensayo Bridge y el ensayo de desplazamiento por movilidad. El ensayo Bridge detectó menos pacientes positivos para HACA que el ensayo de desplazamiento por movilidad y más falsos negativos así como más falsos positivos.

Tabla 4 Correlación de niveles de HACA relativos en suero de pacientes a partir de positivo y negativo fuertes en el ensayo Bridge al ensayo SE-HPLC Tabla 5 Análisis de muestras de pacientes en niveles en suero de HACA con ensayo Bridge (límite 1.69 ua/ml) y ensayo de desplazamiento HPLC (límite 0.19, relación de IFX unido y libre) Los resultados falsos negativos son causados por suero de pacientes que contenían altos niveles de IFX, lo cual interfiere con el ensayo Bridge en la determinación de HACA mientras que el ensayo SE-HPLC no es afectado. Los resultados falsos positivos son causados por suero de pacientes que contienen altos niveles de sustancia de interferencia no específica que puede interferir con el ensayo Bridge.

Las figuras 15A-15B muestran la relación del nivel de HACA y concentración de IFX en pacientes de IBD durante el curso de tratamiento con IFX.

HACA Pudo ser detectado tan temprano como V10 (30 semanas) y continúa incrementándose en algunos pacientes durante el tratamiento con IFX. La figuras 16A- 16C muestran que HACA puede ser detectado en presencia de IFX usando el ensayo de la presente invención. Un nivel más alto de HACA en el suero estuvo asociado con un nivel más bajo de IFX que pudo ser detectado (por ejemplo, redujo la biodisponibilidad). Así, la detección temprana de HACA mientras se está en tratamiento con IFX puede guiar al médico y/o paciente a cambiar a otros fármacos anti-TNF o incrementar la dosis de IFX.

Los ensayos fueron validados en términos de precisión intra e inter-ensayos (con base en el parámetro CV) y susceptibilidad a agentes de interferencia. Este análisis se presenta en las siguientes tablas: Ensayo de Infliximab Ensayo de HACA Ensayo de Infliximab Ensayo de HACA CONCLUSIÓN Fármacos biológicos anti-TNFa pueden ser fácilmente marcados con un fluoróforo ("F1") y el formato de ensayo de desplazamiento por movilidad usado para medir HACA/HAHA es un ensayo homogéneo sin el recubrimiento de antígenos en una superficie sólida y varias etapas de lavado e incubación como en un ELISA típico. La incubación de IFX marcado con F1 con suero positivo para HACA se traduce en la formación de un complejo inmune que eluye en una posición diferente en comparación con IFX marcado con F1 libre en SE-HPLC y de esta manera la cantidad de HACA puede ser cuantificada. La presencia de estos componentes séricos tiene poco efecto en el ensayo de desplazamiento por movilidad. El formato de ensayo de desplazamiento por movilidad, a diferencia de ELISA, no es afectado por la unión no específica de IgGs irrelevantes y detecta el isotipo lgG4. Muestras de suero saludables no causan desplazamiento por movilidad del IFX marcado con F1 y 28.2% de los pacientes tratados con IFX se encontró que tenían HACA mediante el ensayo de la presente invención. De esta manera, el formato de ensayo descrito en la presente es muy sensible y puede ser aplicado para detectar todos los fármacos biológicos (por ejemplo, Remicade, Humira, Enbrel y Cimzía) así como sus anticuerpos (por ejemplo, Remicade, anti-Humira, anti-Enbrel y anti-Cimzia) en suero de pacientes. Notablemente, ya que HACA puede ser detectado en presencia de IFX usando el ensayo de desplazamiento por movilidad de la invención, la detección temprana de HACA mientras se está en tratamiento con IFX puede guiar al médico y/o paciente a cambiar a otros fármacos anti-TNF o incrementar la dosis subsecuente de IFX.

Hemos desarrollado un ensayo de SE-HPLC fase líquida no marcado radioactivamente novedoso para medir los niveles de IFX y HACA en muestras de suero obtenidas de pacientes tratados con IFX. El novedoso ensayo tiene alta sensibilidad, precisión y precisión, y los resultados son altamente reproducibles, lo cual hace a este ensayo adecuado para pruebas de rutina de un gran número de muestras de suero humano. El nuevo formato de ensayo, a diferencia de ELISA, elimina el recubrimiento de antígenos o superficies sólidas y no es afectado por unión no específica de IgGs irrelevantes. Estas ventajas del formato de ensayo descrito en la presente reducen los resultados falsos negativos y falsos positivos de la prueba. Adecuadamente, el formato de ensayo de la presente invención es muy sensible y puede usarse para detectar todos los fármacos biológicos así como sus anticuerpos presentes en el suero mientras el paciente está en terapia.

Ejemplo 4 Diferenciación entre anticuerpos anti-quiméricos humanos neutralizantes y no neutralizantes (HACA) en suero de pacientes usando ensayos de desplazamiento por movilidad novedosos Este ejemplo ilustra novedosos ensayos homogéneos para medir concentraciones de autoanticuerpos (por ejemplo, HACA) en una muestra de paciente (por ejemplo, suero) y para determinar si estos autoanticuerpos son autoanticuerpos neutralizantes o no neutralizantes usando cromatografía de exclusión de tamaño para detectar la unión de estos autoanticuerpos a fármaco anti-TNF marcado fluorescentemente en presencia de TNFc marcado fluorescentemente. Estos ensayos son adecuados toda vez que obvian la necesidad de etapas de lavado que eliminan HACA de baja afinidad, usan distintos fluoróforos que permiten la detección en los espectros visibles y/o IR lo cual reduce aspectos de interferencia de fondo y suero, incrementa la capacidad para detectar HACA neutralizante o no neutralizante en pacientes con un bajo título debido a la alta sensibilidad de la detección por marcadores fluorescentes, y se presenta como una reacción en fase líquida, reduciendo de esta manera la probabilidad de cualquier cambio en el epítopo mediante fijación a una superficie sólida tal como una placa de ELISA.

En una modalidad ejemplar, un fármaco anti-TNFa (por ejemplo, REMICADE™) se marca con un fluoróforo "F1 " (véase, por ejemplo, figura 17A), en donde el fluoróforo puede ser detectado sobre ya sea cualquiera o ambos de los espectros visible e IR. De manera similar, TNFoc se marca con un fluoróforo "F2" (véase, por ejemplo, figura 17A), en donde el fluoróforo también puede ser detectado en cualquiera o ambos de los espectros visible e IR, y en donde "F1 " y "F2" son fluoróforos diferentes. El fármaco anti-TNFa marcado se incuba con suero humano en una reacción en fase líquida y el TNFa marcado se añade a la reacción para permitir la formación de complejos (es decir, inmuno-complejos) entre el fármaco anti-TNFa marcado, TNFa marcado y/o HACA presente en el suero. Después de la incubación, las muestras se cargan directamente en una columna de exclusión de tamaño. La unión tanto del autoanticuerpo (por ejemplo, HACA), como del TNFa marcado al fármaco anti-TNFa marcado se traduce en un desplazamiento a la izquierda del pico (por ejemplo, "inmuno-complejo 1" en la figura 17A) en comparación con un complejo binario entre el autoanticuerpo y el fármaco anti-TNFa marcado (por ejemplo, "inmuno-complejo 2" en la figura 17A), el fármaco marcado solo, o el TNFa marcado solo. La presencia de este complejo ternario de autoanticuerpo (por ejemplo, HACA), TNFa marcado y fármaco anti-TNFa marcado indica que el autoanticuerpo presente en la muestra de suero es una forma no neutralizante del autoanticuerpo (por ejemplo, HACA), de tal manera que el autoanticuerpo no interfiere con la unión entre el autoanticuerpo anti-TNFa y TNFa. En una modalidad particular, como se muestra en la figura 17A, si HACA no neutralizante está presente en el suero, se observará un desplazamiento tanto para F1 -REMICADE™ como para F2-TNFa, dando como resultado un incremento en los picos tanto del inmuno-complejo 1 como del inmuno-complejo 2 y una reducción en los picos de F1 -REMICADE™ libre y F2-TNFa libre. Sin embargo, la presencia del complejo binario entre el autoanticuerpo (por ejemplo, HACA) y el fármaco anti-TNFa marcado (por ejemplo, "inmuno-complejo 2" en la figura 17B) en ausencia de un complejo ternario del autoanticuerpo (por ejemplo, HACA), TNFa marcado y fármaco anti-TNFa marcado indica que el autoanticuerpo presente en la muestra de suero es la forma neutralizante del autoanticuerpo (por ejemplo, HACA), de tal forma que el autoanticuerpo interfiere con la unión entre el anticuerpo anti-TNFa y TNFa. En una modalidad particular, como se muestra en la figura 17B, si HACA neutralizantes está presente en el suero, se observará un desplazamiento para F1 -REMICADE™, dando como resultado un incremento en el pico del inmuno-complejo 2, una reducción en el pico de F1 -REMICADE™ libre, y ningún cambio en el pico de F2-TNFoc libre. En ciertos casos, la presencia de HACA neutralizante indica que la terapia actual con REMICADE™ debe ser cambiada por otro fármaco anti-TNFa tal como HUMIRA™.

En una modalidad alternativa, el fármaco anti-TNFa es primero marcado con suero humano en una reacción en fase líquida para permitir la formación de complejos (es decir, inmuno-complejos) entre el fármaco anti-TNFa marcado y HACA presente en el suero. Después de la incubación, las muestras son cargadas directamente en una primera columna de exclusión de tamaño. La unión del autoanticuerpo (por ejemplo, HACA) al fármaco anti-TNFa marcado se traduce en un desplazamiento a la izquierda del pico (por ejemplo, inmuno-complejo 2 en la figura 18) en comparación con el fármaco marcado solo. El TNFa marcado es luego añadido a la reacción para determinar si es capaz de desplazar (por ejemplo, competir con) el autoanticuerpo (por ejemplo, HACA) para unión al fármaco anti-TNFa marcado, para de esta manera permitir la formación de complejos (es decir, inmuno-complejos) entre el fármaco anti-TNFa marcado y el TNFa marcado. Después de la incubación, las muestras se cargan directamente en una segunda columna de exclusión de tamaño. La unión del fármaco anti-TNFa marcado al TNFa marcado se traduce en un desplazamiento a la izquierda del pico (por ejemplo, "inmuno-complejo 3 en la figura 18) en comparación con el TNFa marcado solo. La interrupción de la unión entre el autoanticuerpo (por ejemplo, HACA) y el fármaco anti-TNFa marcado por la adición del TNFa marcado indica que el autoanticuerpo presente en la muestra de suero es una forma neutralizante del autoanticuerpo (por ejemplo, HACA), por lo que el autoanticuerpo interfiere con la unión entre el anticuerpo anti-TNFa y TNFa. En ciertos casos, la presencia de HACA neutralizante indica que la terapia actual con REMICADE™ debe ser cambiada por otro fármaco anti-TNFoc tal como HUMIRA Ejemplo 5 Análisis de anticuerpos anti-fármaco humanos (ADA) contra adalimumab en suero de paciente usando un novedosos ensayo de desplazamiento por movilidad homogéneo EXTRACTO Antecedentes y propósito: Anticuerpos monoclonales contra TNF- tales como inflixumab (IFX), adalimumab (HUMIRA™) y certolizumab han demostrado ser efectivos en el tratamiento de enfermedad intestinal inflamatoria (IBD) y otros trastornos inflamatorios. Los anticuerpos anti-fármaco (ADA) pueden reducir la eficacia del fármaco y/o inducir efectos adversos. Sin embargo, los ADAs se han encontrado no sólo en pacientes tratados con el anticuerpo quimérico infliximab, sino también en pacientes tratados con el anticuerpo humanizado adalimumab. El monitoreo de los niveles de ADA y fármaco en pacientes individuales puede ayudar a optimizar el tratamiento y dosificación del paciente. Hemos desarrollado un ensayo de desplazamiento por movilidad homogéneo en fase líquida no marcado radioactivamente para medir en forma precisa en el suero tanto HACA (anticuerpo anti-quimérico humano) como IFX de pacientes. Este método de ensayo supera una mayor limitante de los ensayos en fase sólida actuales para detectar HACA, en particular la incapacidad para detectar HACA en forma precisa en presencia de IFX en la circulación. En el presente estudio, hemos evaluado este nuevo método para medir ADA en suero y niveles de fármaco en pacientes tratados con el fármaco de anticuerpo humanizado, adalimumab.

Métodos: El ensayo de desplazamiento por movilidad se basó en el desplazamiento en tiempo de retención de un inmuno-complejo de antígeno libre contra antígeno-anticuerpo en separación por exclusión de tamaño. Adalimumab marcado con fluoróforo o TNF-a y control interno fueron mezclados con muestras de suero para medir el desplazamiento por movilidad de adalimumab libre y NTF-a en presencia de ADA o fármaco. Los cambios en la relación de adalimumab libre o TNF-a a control interno son indicadores de formación de inmunocomplejos. Las concentraciones en suero de ADA o adalimumab se determinaron con curvas estándares generadas al incubar con diferentes concentraciones de anticuerpo anti-lgG humana o adalimumab purificado. Usando el ensayo de desplazamiento por movilidad, medimos los niveles de adalimumab y ADA en sueros recolectados de pacientes con IBD tratados con adalimumab quienes habían perdido respuesta.

Resultados: Se generaron curvas de respuesta a dosis con anticuerpo anti-lgG humana para la medición del desplazamiento por movilidad de adalimumab marcado. El límite de detección del ensayo fue 1 ng de IgG anti-humano. Los sueros de cincuenta controles saludables fueron probados para ADA y todas las muestras tuvieron niveles de ADA debajo del límite de detección (es decir, sin desplazamiento del adalimumab marcado libre). La detección de ADA también se demostró en presencia de adalimumab añadido exógenamente. Para medir la concentración de fármaco en pacientes tratados con adalimumab, generamos una curva estándar con diferentes cantidades de adalimumab en el desplazamiento por movilidad de TNF-a marcado, y el límite de detección de adalimumab fue 10 ng.

Conclusiones: El ensayo de desplazamiento por movilidad homogéneo en fase líquida no marcado radioactivamente de la presente invención ha sido aplicado para medir niveles de ADA y adalimumab en muestras de suero de pacientes tratados con adalimumab. Se encuentra que el ensayo es reproducible con alta sensibilidad y precisión, y puede usarse para evaluar niveles de ADA en muestras de suero de pacientes tratados con adalimumab.

Ejemplo 6 Análisis de anticuerpos anti-fármaco (ADA) contra adalimumab en suero de paciente usando un ensayo de desplazamiento por movilidad privado novedoso EXTRACTO Antecedentes: Fármacos anti-TNFcc tales como infliximab (IFX) y adalimumab (ADL) han demostrado ser efectivos para tratar enfermedad intestinal inflamatoria (IBD). Sin embargo, la inducción de ADA en los pacientes tratados puede reducir la eficacia del fármaco y/o inducir efectos adversos. De hecho, se han encontrado ADAs no sólo en pacientes tratados con IFX, sino también en pacientes tratados con ADL. El monitoreo de los niveles de ADA y fármaco en pacientes individuales puede ayudar a optimizar el tratamiento y dosificación del paciente. Hemos desarrollado un ensayo de desplazamiento por movilidad privado para medir en forma precisa en el suero tanto HACA (anticuerpo anti-quimérico humano) como IFX a partir de pacientes tratados con IFX. Este ensayo supera la gran limitante de los ensayos en fase sólida actuales para detectar HACA, en particular la incapacidad para detectar en forma precisa HACA en presencia de IFX en la circulación. En el presente estudio, hemos evaluado este nuevo ensayo para medir niveles de ADA y fármaco en suero en pacientes tratados con el fármaco de anticuerpo completamente humano, ADL.

Métodos: El ensayo de desplazamiento por movilidad se basó en el desplazamiento en tiempo de retención del inmuno-complejo antígeno-anticuerpo versus antígeno libre en cromatografía de exclusión de tamaño. ADL o TNF-a Marcados fluorescentemente y control interno se mezclaron con muestras de suero para medir el desplazamiento por movilidad de ADL y TNF-a marcado en presencia de ADA o fármaco. Los cambios en la relación de ADL o TNF-a libre a control interno son los indicadores de la formación de inmuno-complejo. Las concentraciones en suero de ADA o ADL se determinaron con curvas estándares generadas al incubar con diferentes concentraciones de anticuerpo anti-lgG humano o ADL purificado. Usando este ensayo, medimos los niveles de ADL y ADA en sueros recogidos de pacientes con IBD tratados con ADL.

Resultados: Curvas de respuesta a dosis fueron generadas con anticuerpo anti-lgG humano para la medición del desplazamiento por movilidad de ADL marcado. El límite de detección del ensayo fue 10 ng de IgG anti-humano. Sueros de 100 controles saludables fueron probados para el ADA y todas las muestras tuvieron un nivel de ADA debajo del límite de detección (sin desplazamiento de ADL marcado libre). La detección de ADA se demostró en cinco de 1 14 muestras de pacientes de IBD tratados con ADL. Para medir la concentración de fármaco en pacientes tratados con ADL, generamos una curva estándar con diferentes cantidades de ADL en el desplazamiento de TNF-a marcado con el límite de detección de 10 ng.

Conclusiones: Hemos aplicado nuestro ensayo de desplazamiento por movilidad homogénea en fase líquida no marcado radiactivamente privado para medir los niveles de ADA y ADL en suero de pacientes tratados con ADL. Los ensayos son reproducíales con alta sensibilidad y precisión, y son útiles para evaluar niveles de ADA en muestras de suero de pacientes tratados con ADL.

INTRODUCCIÓN Biológicos contra factor de necrosis tumoral alfa (TNF-oc) tales como infliximab (IFX), etanercept, adalimumab (ADL) y certolizumab pegol han demostrado reducir la actividad de enfermedad en un número de enfermedades autoinmunes, incluyendo enfermedad de Crohn (CD) y artritis reumatoide (RA). Sin embargo, algunos pacientes no responden a terapia anti-TNF-a, mientras que otros requieren de una dosis más alta o más frecuente debido a la falta de respuesta suficiente, o desarrollan reacciones a la infusión.

La inmunogenicidad de anticuerpos terapéuticos que causa que los pacientes desarrollen anticuerpos contra los fármacos puede contribuir a la falla de los tratamientos y reacciones de infusión. Los anticuerpos quiméricos como IFX tienen un potencial más alto de inducir generación de anticuerpos en comparación con anticuerpos completamente humanizados tales como ADL. La prevalencia de anticuerpos contra IFX (HACA) en pacientes de RA varía de 12% a 44% y parece ser inversamente proporcional al nivel de IFX en suero de pacientes y respuesta terapéutica. Aunque el ADL completamente humanizado se supone que es menos inmunogénico que anticuerpos de murino o quiméricos, varios estudios han reportado la formación de anticuerpos anti-humanizados humanos (HAHA) y mostraron la prevalencia de generación de anticuerpos de 1 % a 87% en pacientes de RA y CD (Aikawa et al., Immunogenicity of Anti-TNF-alpha agents in autoinmune diseases. Clin. fíev. Allergy Immunol., 38(2-3):82-9 (2010)).

Muchos pacientes con falla de respuesta secundaria a un fármaco anti-TNF-a pueden beneficiarse del cambio por otro fármaco anti-TNF-a o incrementar la dosis y/o frecuencia de dosificación. El monitoreo de pacientes para niveles de fármaco y anticuerpo anti-fármaco (ADA) se garantiza por lo tanto de tal manera que la administración de fármaco puede diseñarse para el paciente individual. Este enfoque permite el ajuste de dosis cuando se garantiza o se concluye el medicamento cuando los niveles de ADA están presentes. (Bendtzen et al., Individual medicine in inflammatory bowel disease: monitoring bioavailability, pharmacokinetics and immunogenicity of anti-tumour necrosis factor-alpha antibodies. Scand. J. Gastroenterol., 44(7):774-81 (2009); Afif et al., Clinical utility of measuring infliximab and human anti-chimeric antibody concentrations in patients with inflammatory bowel disease. Am. J. Gastroenterol. 105(5):1 133-9 (2010)).

Un número de ensayos han sido desarrollados para medir HACA y HAHA. Una de las limitaciones de las metodologías actuales es que los niveles de ADA no pueden medirse en forma confiable cuando existe un alto nivel de fármacos en la circulación.

Hemos desarrollado un ensayo de desplazamiento por movilidad en fase líquida no marcado radiactivamente privado para medir los niveles de ADA y ADL en suero de pacientes tratados con ADL que no es afectado por la presencia del fármaco en suero.

MÉTODOS AADL Marcado con fluoróforo (F1 ) se incubó con suero de paciente para formar el inmuno-complejo. Un péptido pequeño marcado con F1 se incluyó como un control interno en cada reacción. Diferentes cantidades de IgG anti-humano se usaron para generar una curva estándar para determinar el nivel de ADA en suero. ADL Marcado con F1 libre se separó del complejo unido a anticuerpo con base en su peso molecular mediante cromatografía de exclusión de tamaño. La relación de ADL marcado con F1 libre a control interno de cada muestra se usó para extrapolar la concentración de HAHA a partir de la curva estándar. Se usó una metodología similar para medir los niveles de ADL en muestras de suero de pacientes con TNF-a marcado con F1.

RESULTADOS Las figuras 19A- 9H muestran la separación del complejo F1 -ADL unido a IgG anti-humano del F1-ADL libre debido al desplazamiento por movilidad del complejo de alto peso molecular. Como se ve en los paneles 19A a 19H, el tiempo de retención del pico fluorescente se desplazó de 10.1 minutos a 7.3-9.5 minutos. Entre más anti-lgG humana se añadiera a la mezcla de reacción, menos ADL libre permanece en el cromatograma y más inmuno-complejo se forma (19H a 9C). El tiempo de retención para el control interno es 13.5 minutos.

La figura 20 muestra la curva de respuesta a dosis del desplazamiento de pico presente causado por la adición de IgG anti-humana. Incrementar la concentración de IgG anti-humana reduce la relación de ADL libre a control interno debido a la formación del inmuno-complejo. La sensibilidad del ensayo es de 10 ng/ml de IgG anti-humana. El control interno "F1 -BioCyt" corresponde a un Alexa-Fluor® 488-biocitina (BioCyt) que combina el fluoróforo Alexa-Fluor® 488 fluorescente verde con biotina y una amina primaria fijable por aldehido (lisina) (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA).

Las figuras 21 A-21 J muestra la separación del complejo TNF-oc-F1 unido a ADL a partir del TNF-a-F1 libre debido al desplazamiento por movilidad del complejo de alto peso molecular. Como se ve en los paneles 21 C y 21 J, el tiempo de retención del tipo fluorescente se desplazó de 1 1 .9 minutos a 6.5-10.5 minutos. Entre más ADL se añada en la mezcla de reacción, menos pico de TNF-a-F1 libre permanece en el cromatograma y se forma más inmuno-complejo.

La figura 22 muestra las curvas de respuesta a dosis del desplazamiento de pico de TNF -F1 causado por la adición de ADL. Con base en el ADL añadido, el límite de detección es 10 ng/mL de ADL en suero.

La tabla 6 muestra que muestras de suero de 100 sujetos saludables y 1 14 pacientes de IBD tratados con ADL fueron analizados para niveles de ADA y ADL usando el ensayo de desplazamiento por movilidad de la presente invención. Todas las 100 muestras de sujetos saludables tuvieron niveles de ADA debajo del límite de detección (sin desplazamiento del F1 -ADL libre), mientras que 5 de las 1 14 muestras de pacientes tuvieron una concentración de ADA de 0.012 a <20 pg/ml. La media de niveles de ADL en 100 muestras de sujetos saludables fue 0.76 ± 1.0 Mg/ml (intervalo 0 a 9.4 µg/ml). La media de los niveles de ADL en 1 14 muestras de suero de pacientes tratados con ADL fue de 10.8 + 17.8 g/ml (intervalo 0-139 Mg/ml). Cuatro de cinco muestras positivas para ADA tuvieron niveles no detectables de ADL.

Tabla 6 Niveles en suero de pacientes de ADA y ADL medidos por el ensayo de desplazamiento por movilidad CONCLUSIONES El formato de ensayo de desplazamiento por movilidad usado para medir HACA/IFX es un ensayo homogéneo sin el recubrimiento de antígenos en una superficie sólida, y sin varias etapas de lavado e incubación como en un ELISA típico. Este ensayo puede aplicarse para medirse ADA y fármacos anti-TNF. La sensibilidad del ensayo (en la escala de 9/???) es más alta para la medición tanto de ADA como de ADL con suero de paciente en comparación con métodos de ELISA (en la escala de mg/ml). Muestras de suero de control saludable no causaron desplazamiento por movilidad del ADL marcado con F1 , y 4.3% de los pacientes tratados con ADL se encontró que tenían ADA mediante este ensayo. Aunque muestras de suero de control saludable causaron desplazamiento por movilidad del TNF- marcado con F1 , lo cual puede haberse debido a la presencia del receptor libre soluble de TNF-a, el promedio de ADL en pacientes tratados con ADL fue mucho más alto (10.8 vs. 0.76 mg/ml). La detección temprana de ADA y el monitoreo del nivel de fármaco ADL mientras el paciente está recibiendo tratamiento con ADL permitir al médico optimizar la dosificación de ADL o cambiar por otro fármaco anti-TNF- cuando sea adecuado, y, de esta manera, optimizar el manejo general de la enfermedad del paciente.

Tabla 7 Niveles en suero de paciente de ADA y ADL medidos por el ensayo de desplazamiento por movilidad ¦ Usando este ensayo de desplazamiento por movilidad analizamos muestras de suero de 100 sujetos saludables, y 1 14 pacientes de IBD tratados con ADL, para niveles de ADA y ADL. Todas las 100 muestras de sujetos saludables tuvieron niveles de ADA debajo del límite de detección (sin desplazamiento de F1 -ADL libre), mientras que 4 de las 42 muestras de pacientes con 0-4 pg/mL de ADL tuvieron una concentración de ADA promedio de 0.012 a >20 pg/ml. Los niveles de ADL promedio en 100 muestras de sujetos saludables fueron de 0.76+1 .0 mg/ml (escala de 0 a 9.4 mg/ml). Los niveles de ADL promedio en 1 14 muestras de suero de pacientes tratados con ADL fueron de 10.8+17.8 mg/ml (intervalo 0-139 mg/ml). Cuatro de cuatro muestras positivas para ADA tuvieron niveles indetectables de ADL. Para la detección de ADA, los 1 14 pacientes de IBD tratados con ADL fueron divididos en dos categorías, 0-4 µg/ml de ADL y >4 pg/ml de ADL. Los pacientes con más de 4 pg/ml de ADL serán probados con una cantidad más grande de ADL-F1 para evaluar la competencia de ADL circulante con ADL-F1 .

Las muestras de suero de control saludable no causan desplazamiento por movilidad del ADL marcado por Fl. En un estudio preliminar, 9.52% de pacientes con 0.4 µg/ml de ADL se encontró que tenían ADA en este ensayo.

Ejemplo 7 Determinación de los niveles de concentración de REMICADE™ v anticuerpos antifármaco humanos Este ejemplo describe un método para determinar los niveles de fármacos anti-TNFa, por ejemplo, REMICADE™ (infliximab), en una muestra de suero así como para determinar los niveles de un anticuerpo anti-fármaco humano, por ejemplo, un anticuerpo anti-quimérico humano (HACA) contra REMICADE™ (infliximab).

Etapa 1 : Determinación del nivel de concentración de REMICADE™ (infliximab) en una muestra En una modalidad ejemplar, TNFa se marca como un fluoróforo (por ejemplo, Alexa6 7), en donde el fluoróforo puede ser detectado mediante, ya sea cualquiera o ambos de, los espectros visibles y fluorescente. El TNFa marcado es incubado con un suero humano en una reacción en fase líquida para permitir que el fármaco anti-TNFa presente en el suero se una. El TNFa marcado también puede ser incubado con cantidades conocidas del fármaco anti-TNFa en una reacción en fase líquida para crear una curva estándar. Después de la incubación, las muestras se cargan directamente en una columna de exclusión de tamaño. La unión del fármaco anti-TNFa al TNFa marcado se traduce en un desplazamiento a la izquierda del pico en comparación con TNFa marcado solo. La concentración del fármaco anti-TNFa presente en la muestra de suero puede ser luego comparada con la curva estándar y controles.

Análisis SE-HPLC de los niveles de REMICADE™ (infliximab) en suero de paciente. TNFa Humano recombinante se marcó con un fluoróforo, Alexa Fluor® 488, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. TNFa Marcado se incubó con diferentes cantidades de REMICADE™ o suero de pacientes durante 1 hora a temperatura ambiente. Muestras de 100 µ? de volumen fueron analizadas mediante cromatografía de exclusión de tamaño en un sistema de HPLC. Detección de marcadores de fluorescencia se usó para monitorear el TNFa marcado libre y el inmunocomplejo TNFa marcado unido con base en sus tiempos de retención. Los niveles de REMICADE™ en suero fueron calculados a partir de la curva estándar.

Las siguientes ecuaciones son relevantes para este ensayo: Ecuación I: TNFa-marcado + REMICADE™ ? (TNFa-marcado«REMICADE™)comPiejo Ecuación II: [REMICADE™]s¡n TNFa-marcado-preSente=[(TNFa- marcado»REMICADE™)compieio] Ecuación III: [REMICADE™] = [(TNFa-marcado»REMICADE™)compiejo]/[TNF -marcado] x [TNFa-marcado] En la Etapa 1 , una cantidad conocida del TNFa marcado se pone en contacto con una muestra de suero que contiene REMICADE™. El TNFa marcado y el REMICADE™ forman un complejo, (TNFa-marcado»REMICADE™)compiejo, véase Ecuación I. Ya que casi todo el REMICADE™ formará un complejo con el TNFa marcado, la concentración de REMICADE™ presente antes de la introducción del TNFa marcado es igual a la concentración medida de TNFa-marcado»REMICADE™compiejo, véase Ecuación II. El nivel de concentración de REMICADE™ se calcula al multiplicar la relación de [(TNFa-marcado»REMICADE™)compiejo]/[TNFa-marcado] por [TNFa-marcado], véase Ecuación III. La relación, [(TNFa-marcado«REMICADE™)compiejo]/[TNFa-marcado], se obtiene al integrar el área bajo la curva para el pico de (TNFa-marcado»REMICADE™)compiej0) a partir de una gráfica de intensidad de señal como una función de tiempo de elución a partir de HPLC de exclusión de tamaño, y dividiendo este número entre la integración resultante del área bajo la curva para el pico de TNFa marcado a partir de la gráfica. El [TNFa marcado] se conoce a priori.

Etapa 2: Determinación del nivel de anticuerpo anti-quimérico humano, HACA En una modalidad ejemplar, un fármaco anti-TNFa, por ejemplo, REMICADE™, se marca con un fluoróforo, por ejemplo, Alexa647, en donde el fluoróforo puede ser detectado mediante, cualquiera o ambos de, los espectros visible y fluorescente. El fármaco anti-TNFa marcado se incuba con suero humano en una reacción en fase líquida para permitir que cualquier HACA presente en el suero se una. El fármaco anti-TNFa marcado también puede ser incubado con cantidades conocidas de anticuerpo anti-lgG o suero de paciente positivo agrupado en una reacción en fase líquida para crear una curva estándar. Después de la incubación, las muestras se cargan directamente en una columna de exclusión de tamaño. La unión de los autoanticuerpos al fármaco anti-TNFa marcado se traduce en un desplazamiento a la izquierda del pico en comparación con fármaco marcado solo. La concentración de HACA presente en la muestra de suero puede ser luego comparada con la curva estándar y controles.

Análisis SE-HPLC de los niveles de HACA en suero de paciente.

REMICADE™ Purificado se marcó con un fluoróforo. REMICADE™ Marcado se incubó con diferentes diluciones de suero positivo HACA agrupado o suero de paciente diluido durante una hora a temperatura ambiente. Muestras de 100 de volumen fueron analizadas mediante cromatografía de exclusión de tamaño en un sistema de HPLC. Se usó detección en marcador de fluorescencia para monitorear el REMICADE™ marcado libre y el inmunocomplejo de REMICADE™ marcado unido con base en sus tiempos de retención. La relación de REMICADE™ marcado unido y libre se usó para determinar el nivel de HACA como se describe abajo.

Procedimiento de ensayo de desplazamiento por movilidad para medir HACA en suero. El principio de este ensayo se basa en el desplazamiento por movilidad del complejo de un anticuerpo anti-fármaco, por ejemplo, HACA, con REMICADE™ marcado con Alexa647 con relación a REMICADE™ marcado con Alexa647 libre, en cromatografía de líquidos de alto rendimiento-exclusión de tamaño (SE-HPLC) debido al incremento en el peso molecular del complejo. La cromatografía se lleva a cabo en un sistema para HPLC Agilent-1200, usando una columna Bio-Sep 300x7.8 mm SEC-3000 (Phenomenex) con un intervalo de fraccionado de peso molecular de 5,000-700,000 y una fase móvil de 1 X PBS, pH 7.3 a una velocidad de flujo de 0.5 - 1.0 ml_/m¡n con detección de marcador de fluorescencia, por ejemplo, detección UV a 650 nm. Enfrente del sistema para HPLC Agilent-1200 con una columna Bio-Sep 300x7.8 mm SEC-3000 está una pre-columna analítica que es una BioSep 75x7.8 mm SEC-3000. Un volumen de muestra de 100 µ? se carga en la columna para cada análisis. El complejo de HACA y complejo de REMICADE™ marcado se forma al incubar suero de un paciente tratado con REMICADE™ y REMICADE™ marcado en el regulador de pH de elución de 1 X PBS, pH 7.3, a temperatura ambiente durante 1 hora antes del análisis SE-HPLC.

Las siguientes ecuaciones son relevantes para este ensayo: Ecuación IV: REMICADE™ + REMICADE™-marcado + HACA ? (REMICADE™«HACA)compiej0 + (REMICADE™-marcado»HACA)compieio.

Ecuación V: [REMICADE™]/[REMICADE™.HACAcomptejo] [REMICADE™-marcado]/[REMICADE™-marcado»HACAcompiej0] Ecuación VI: [HACA] = [REMICADE™«HACA]cotlip,ejo + [REMICADE™-marcado«HACA]compiejo Ecuación VII: [REMICADE™.HACAcomplejo] = [REMICADE™] x [REMICADE™-marcado»HACAcompiejo]/[ REMICADE™-marcado] Ecuación VIII: [REMICADE™-marcado.HACAcompiejo] = [REMICADE™-marcado] x [REMICADE™-marcado»HACAcompiej0]/[REMICADE™-marcado] Ecuación IX: [REMICADE™]cantidad efectiva = [REMICADE™]-[HACA] Determinación de los niveles de concentración de anticuerpos contra fármaco anti-TNFa humano, por ejemplo, HACA. Una concentración conocida de REMICADE™ marcado se añade a una muestra de suero. HACA Forma un complejo ya sea con REMICADE™ o REMICADE™ marcado, véase Ecuación IV. El [REMICADE™] se determina en la etapa 1 anterior. Al integrar el área bajo la curva para el REMICADE™-marcado»HACACOmpiejo y dividir este número entre la integración resultante para el área bajo la curva para el REMICADE™ marcado libre, se obtiene la relación de [REMICADE™-marcado»HACAcompie¡o] a [REMICADE™-marcado]. La relación de [REMICADE™] a [R E M I C AD E™ · H AC Acompiejo] es igual a la relación de [REMICADE™-marcado] a [REMIADE™-marcado«HACA)compiejo], véase ecuación V. Ya que HACA se equilibra y forma un complejo tanto con REMICADE™ como con REMICADE™ marcado, la cantidad total de HACA es igual a la suma de la cantidad de REMICADE™»HACAcompiejo y la cantidad de REMICADE™-marcado«HACAcompiej0, véase Ecuación VI. Debido a que la relación de [REMICADE™] a [REMICADE™-marcado»HACAcompie¡0] es igual a la relación de [REMICADE™-marcado] a [REMICADE™-marcado»HACAcompiejo], tanto el [REMICADE™-HACA]compiej0 como el [REMICADE™-marcado-HACAcompiejo] se determinan al multiplicar la relación del [REMICADE™-marcado»HACAcompiejo)]/[REMICADE™-marcado] por, respectivamente, la cantidad de concentración de REMICADE™, determinada en la Etapa 1 , y la cantidad de concentración de REMICADE™ marcado, conocida a priori, véase Ecuaciones VII y VIII. Por lo tanto, la cantidad total de HACA es igual a la suma de (1 ) el [REMICADE™], de la etapa 1 , multiplicada por [REMICADE™-marcado»HACA)compiein]/[REMICADE™-marcado], y (2) el [REMICADE™-marcado], conocido a priori, multiplicado por [REMICADE™-marcado»HACA)CQmpiejo]/[REMICADE™-marcado].

Determinación de los niveles de concentración efectivos de REMICADE™. Debido a que HACA forma complejo con REMICADE™, la cantidad efectiva de REMICADE™ disponible en una muestra de suero es la cantidad de REMICADE™ medida a partir de la Etapa 1 , menos la cantidad de HACA, medida de la Etapa 2, véase Ecuación IX.

Cálculo ejemplar. En paciente JAG en V1 0, el [REMICADE™] se determinó como 7.5 g/ml, véase figura 6C. Este resultado se obtuvo al seguir la Etapa 1 y usando las Ecuaciones l-lll. 7.5 µg/m\ Es igual a 30 ng/4 µ?_. Ya que 4 µ?_ de muestra se usó en la medición de la Etapa 2, un total de 30.0 ng de REMICADE™ estuvo presente en la muestra analizada. La relación de [REMICADE™-marcado»HACA]compiejo/[REMICADE™-marcado] para el paciente JAG en V10 fue 0.25, véase figura 16B. El [REMICADE™-marcado] introducido en la muestra fue 37.5 ng/100 µ?_. Ya que 100 µ?_ del REMICADE™ marcado se usaron en la medición en la Etapa 2, un total de 37.5 ng de REMICADE™ marcado estuvo presente en la muestra analizada. Usando la Ecuación VII, la cantidad total de REMICADE™»HACAcompiej0 fue 30 ng multiplicada por 0.25, que es igual a 7.5 ng de REMICADE™-marcado«HACAcompiejo. Usando la Ecuación VIII, la cantidad total de REMICADE™-marcado»HACAcompiejo fue 37.5 ng multiplicada por 0.25, que es igual a 9.4 ng de REMICADE™-marcado«HACAcompiejo. Usando la Ecuación VI, la cantidad total de HACA es igual a la suma de 9.4 ng y 7.5 ng, que es igual a 16.9 ng de HACA. Los 1 6.9 ng de HACA estuvieron presentes en 4 µL· de muestra. El [HACA] fue 16.9 ngA^L, que es igual a 4.23 µ9 ?t??. Usando la Ecuación IX, la cantidad efectiva de REMICADE™ es igual a 7.5 pg/ml de REMICADE™, determinada a partir de la Etapa 1 , menos 4.23 g/ml de HACA, determinada a partir de la Etapa 2. En este cálculo ejemplar, el [REMICADE™] efectivo fue igual a 3.27 µ9/???.

Ejemplo 8 Determinación de los niveles de concentración de HUMIRA™ y anticuerpos antifármaco humanos Este ejemplo describe un método para determinar los niveles de HUMIRA™ en una muestra de suero así como para determinar los niveles de anticuerpos antihumano humanos (HAHA).

Etapa 1 : Determinación del nivel de concentración de HUMIRA™ en una muestra En una modalidad ejemplar, TNFa se marca con un fluoróforo (por ejemplo, Alexa647), en donde el fluoróforo puede detectarse mediante, cualquiera o ambos, de, los espectros visible y fluorescente. El TNFa marcado se incuba con suero humano en una reacción en fase líquida para permitir que el fármaco anti- TNFa presente en el suero se una. El TNFa marcado también puede ser incubado con cantidades conocidas del fármaco anti- TNFa en una reacción en fase líquida para crear una curva estándar. Después de la incubación, las muestras se cargan directamente en una columna de exclusión de tamaño. La unión del fármaco anti- TNFa al TNFa marcado se traduce en un desplazamiento a la izquierda del pico en comparación con TNFa marcado solo. La concentración del fármaco anti- TNFa presente en la muestra de suero puede ser luego comparada con la curva estándar y controles.

Análisis SE-HPLC de los niveles de HUMIR™ en suero de paciente.

TNFa Recombinante humano se marcó con un fluoróforo, Alexa Fluor® 488, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. TNFa Marcado se incubó con diferentes cantidades de HUMIRA™ o suero de paciente durante 1 hora a temperatura ambiente. Muestras de 100 µ? de volumen se analizaron mediante cromatografía de exclusión de tamaño en un sistema de HPLC. Se usó detección de marcador de fluorescencia para monitorear el TNFa marcado libre y el inmunocomplejo de TNFa marcado unido con base en sus tiempos de retención. Los niveles de HUMIRA™ en suero fueron calculados a partir de la curva estándar.

Las siguientes ecuaciones son relevantes para este ensayo: Ecuación X: TNFa-marcado + HUMIRA™ ? (TNFa-marcado»HUMIRA™)compieio Ecuación XI: [HUMIRA™] = [(TNFa-marcado.HUMIRA)compiejo] Ecuación XII: [HUMIRA™] = [TNFa-marcado»HUMIRA™)compiejo]/[ TNFa-marcado] x [TNFa-marcado] En la Etapa 1 , una cantidad conocida del TNFa marcado se pone en contacto con una muestra de suero que contiene HUMIRA™. El TNFa marcado y el HUMIRA™ forman un complejo, (TNFa-marcado»HUMIRA™)compiejo, véase Ecuación X. Ya que casi todo el HUMIRA™ formará un complejo con el TNFa-marcado, el [HUMIRA™] presente antes de la introducción del TNFa marcado es igual al [(TNFa-marcado»HUMIRA™)compiejo] medido, véase Ecuación XI. El [HUMIRA™] se calcula al multiplicar la relación de [TNFa-marcado«HUMIRA™)compiejo]/[ TNFa-marcado] por [TNFa-marcado], véase Ecuación XII. Al integrar el área bajo la curva para el TNFa marcado y el área bajo la curva para el (TNFa-marcado»HUMIRA™)oompiej0 y dividir la integración resultante para (TNFa-marcado»HUMIRA™)compiejo entre la integración resultante para el TNFa marcado, se obtiene la relación de [(TNFa-marcado«HUMIRA™)oompiejo] a [TNFa-marcado]. El [TNFa-marcado] se conoce a priori.

Etapa 2: Determinación del nivel de anticuerpo anti-humano humano, por ejemplo, HAHA. En una modalidad ejemplar, un fármaco anti- TNFoc, por ejemplo, HUMIRA™, se marca con un fluoróforo, por ejemplo, Alexa647, en donde el fluoróforo puede ser detectado mediante, cualquiera o ambos de, los espectros visible y fluorescente. El fármaco anti-TNF marcado se incuba con suero humano en una reacción en fase líquida para permitir que cualquier HAHA presente en el suero se una. El fármaco anti-TNFa marcado también puede ser incubado con cantidades conocidas de un anticuerpo anti-lgG o suero de paciente positivo agrupado en una reacción en fase líquida para crear una curva estándar. Después de la incubación, las muestras se cargan directamente en una columna de exclusión de tamaño. La unión de los autoanticuerpos al fármaco anti-TNFa marcado se traduce en un desplazamiento a la izquierda del pico en comparación con fármaco marcado solo. La concentración de HAHA presente en la muestra de suero puede ser luego comparada con la curva estándar y controles.

Análisis SE-HPLC de los niveles de HAHA en suero de paciente.

HUMIRA™ Purificado se marcó con un fluoróforo. HUMIRA™ Marcado se incubó con diluciones diferentes de suero positivo para HAHA agrupado o suero de paciente diluido durante una hora a temperatura ambiente. Muestras de 100 pL de volumen se analizaron mediante cromatografía de exclusión de tamaño en un sistema de HPLC. Detección con marcador de fluorescencia se usó para monitorear el HUMIRA™ marcado libre y el inmunocomplejo de HUMIRA™ marcado unido con base en sus tiempos de retención. La relación de HUMIRA™ marcado y libre se usó para determinar el nivel de HAHA como se describe abajo.

Procedimiento de ensayo de desplazamiento por movilidad para medir HAHA en suero. El principio de este ensayo se basa en el desplazamiento por movilidad del anticuerpo, por ejemplo, HAHA, complejo de HUMIRA™ marcado con Alexa647 unido contra HUMIRA™ marcado con AlexaS 7 libre en cromatografía de líquidos de alto rendimiento-exclusión de tamaño (SE-HPLC) debido al incremento en el peso molecular del complejo. La cromatografía se lleva a cabo en un sistema para HPLC Aigelente-1200, usando una columna Bio-Sep 300x7.8 mm SEC-3000 (Phenomenex) con un intervalo de fraccionado de peso molecular de 5,000-700,000 y una fase móvil de 1 X PBS, pH 7.3, a una velocidad de flujo de 0.5-1 .0 mL/min con detección con marcador de fluorescencia, por ejemplo, detección UV a 650 nm. En frente del sistema para HPLC Agilent-1200 con una columna Bio-Sep 300x7.8 mm SEC-3000 está una pre-columna analítica que es una BioSep 75x7.8 mm SEC-3000. Un volumen de muestra de 100 µL· se carga sobre la columna para cada análisis. Un volumen de muestra de 100 µ? se carga sobre la columna para cada análisis. El complejo de HUMIRA™ marcado y unido a HAHA se forma al incubar suero de un paciente tratado con HUMIRA y HUMIRA™ marcado en el regulador de pH de elución 1 PBS, pH 7.3, a temperatura ambiente durante 1 hora antes del análisis SE-HPLC.

Ecuación XIII: HUMIRA™ + HUMIRA™-marcado+ HAHA ? (HUMIRA™.HAHA)oompleio + (HUMIRA™-marcado.HAHA)complejo Ecuación XIV: [HUMIRA™]/[HUMIRA™.HAHAcompiejo] = [HUMIRA™-m a rcado]/[ H U M I RA- marcado» HA HAcompiej0] Ecuación XV: [HAHA] = [HUMIRA™«HAHAcompleio] + [HUMIRA™-marcado»HAHA Ecuación XVI: [HUMIRA™»HAHAcompiejo] = [HUMIRA™] x [HUMIRA™-marcado»HAHAcompiejo]/[ HUMIRA™-marcado] Ecuación XVII: [HUMIRA™-marcado«HAHAcompie¡0] = [HUMIRA™-marcado] x [HUMIRA™-marcado.HAHAcompiejo]/[ HUMIRA™-marcado] Ecuación XVIII: [HUMIRA™]cant¡dad efec,¡Va = [HUMIRA™] - [HAHA] Cálculo para la Etapa 2: Una concentración conocida de HUMIRA™ marcado se añade a una muestra de suero. HAHA Forma un complejo ya sea con HUMIRA™ o HUMIRA™ marcado, véase Ecuación XIII. El [HUMIRA™] se determina en la etapa 1 como se describió arriba. Al integrar el área bajo la curva para el HUMIRA™-marcado»HAHAcompiejo y el área bajo la curva para el HUMIRA™ marcado y dividir la integración resultante para el HUMIRA™-marcado»HAHAcompiejo entre la integración resultante para el HUMIRA™-marcado, se obtiene la relación del [HUMIRA™-marcado»HAHAcompieio] a [HUMIRA™-marcado]. La relación del [HUMIRA™] al [HUMIRA™«HAHAcompiej0] es igual a la relación del [HUMIRA™-marcado] al [HUMIRA™-marcado«HAHAcompie¡o], véase Ecuación XIV. Debido a que HAHA se equilibra y forma un complejo tanto con HUMIRA como con HUMIRA™-marcado, la cantidad total de HAHA es igual a la suma de la cantidad de HUMIRA™»HAHAcompiejo, y el HUMIRA™-marcado«HAHAcompiejo, véase Ecuación XV. Ya que la relación de [HUMIRA™] a [HUMIRA™ «HAHAco^ejo] es igual a la relación de [HUMIRA-marcado] a [HUMIRA™-marcado»HAHAcompieio], la concentración tanto del [HUMIRA™-compiej0HAHA] como del [HUMIRA™-marcado»HAHAcompiej0] se determina al multiplicar la relación del [HUMIRA™-marcado»HAHAcomp,ejo]/[HUMIRA-marcado] por el [HUMIRA™], determinada en la Etapa 1 , y el [HUMIRA™-marcado], conocido a priori, respectivamente, véanse Ecuaciones XVI y XVII. Debido a que HAHA forma complejo con HUMIRA™, la cantidad efectiva de HUMIRA™ disponible en una muestra de suero es la cantidad de HUMIRA, medida a partir de la Etapa 1 , menos la cantidad de HAHA, medida a partir de la Etapa 2, véase Ecuación XVIII.

Cálculo ejemplar. En el paciente SL03246013, véase figura 25, el [HUMIRA™] se determinó que era 16.9 pg/ml, véase figura 25. Este resultado se obtuvo al seguir la Etapa 1 y usando las Ecuaciones X-XII. 16.9 µg/ml Es igual a 67.6 ng/4 µ?_. Ya que 4 µ?_ de muestra se usaron en la medición en la Etapa 2, un total de 67.6 ng de HUMIRA™ estuvo presente en la muestra analizada. La relación de [HUMIRA™-marcado»HAHAcomplejo/[HUMIRA™-marcado] para el paciente SL03246013 fue 0.055, véase figura 25. El [HUMIRA™-marcado] introducido en la muestra fue 37.5 ng/100 µ?_. Ya que 100 µ?_ del HUMIRA™ marcado se usaron en la medición en la Etapa 2, un total de 37.5 ng de HUMIRA™ marcado estuvo presente en la muestra analizada. Usando la Ecuación XVI, la cantidad total de HUMIRA™ ·????8Gp?? fue 67.6 ng multiplicada por 0.055, que es igual a 3.71 ng de HUMIRA™-marcado»HAHAcompiejo. Usando la Ecuación XVII, la cantidad total de HUMIRA™-marcado»HAHAcompiej0 fue 37.5 ng multiplicada por 0.055, que es igual a 2.06 ng de HUMIRA™ ·??????G????e??. Usando la Ecuación XV, la cantidad total de HAHA es igual a la suma de 3.71 ng y 2.06 ng, que es igual a 5.77 ng de HAHA. Los 5.77 ng de HAHA estuvieron presentes en 4 pL de muestra. El [HAHA] fue 5.77 ng/4 pL, que es igual a 1 .44 pg/ml. Usando la Ecuación XVIII, la cantidad efectiva de HUMIRA™ es igual a 16.99 pg/ml de HUMIRA™, determinada a partir de la Etapa 1 , menos 1 .44 pg/ml de HAHA, determinada a partir de la Etapa 2. En este cálculo ejemplar, el [HUMIRA™] efectivo fue igual a 15.46 pg/ml.

Ejemplo 9 Determinación de la cantidad de un complejo de HACA o HAHA va sea con REMICADE™, REMICADE™ marcado, HUMIRA o HUMIRA-marcado Este ejemplo describe un método para determinar la cantidad de un complejo de HACA o HAHA ya sea con REMICADE™, REMICADE™ marcado, HUMIRA o HUMIRA™ marcado con referencia a un estándar interno.

Mediante el uso de un control interno, por ejemplo, Biocitina-Alexa 488, artefactos de suero y variaciones de un experimento a otro experimento pueden identificarse y analizarse adecuadamente. La cantidad de control interno, por ejemplo, Biocitina-Alexa 488, es de aproximadamente 50 a alrededor de 200 pg por 100 µ?_ analizados.

HUMIRA™ marcado con fluoróforo (F1 ) se incubó con suero de paciente para formar el inmunocomplejo. Un péptido pequeño marcado con F1 , por ejemplo, Biocitina-Alexa 488, se incluyó como un control interno en cada reacción. En un caso, diferentes cantidades de IgG anti-humana se usaron para generar una curva estándar para determinar los niveles de HAHA en suero. En otro caso, suero de paciente positivo agrupado y titulado que había sido calibrado con HAHA purificado se usó para generar una curva estándar para determinar los niveles de HAHA en suero. En otro caso más, el método descrito en el ejemplo 7 se usó para generar una curva estándar para determinar los niveles de HAHA en suero. HUMIRA marcado libre se separó del complejo unido a anticuerpo con base en su peso molecular mediante cromatografía de exclusión de tamaño. La relación de HUMIRA marcado libre a un control interno de cada muestra se usó para extrapolar la concentración de HAHA a partir de la curva estándar. Se usó una metodología similar para medir los niveles de HUMIRA en muestras de suero de paciente con TNF- marcado.

La relación inicial del fármaco marcado, es decir, REMICADE™ marcado o HUMIRA marcado, al control interno es igual a 100. Como se ilustra en las figuras 23A-23H y 24A-24H, cuando la relación de fármaco marcado al control interno cae debajo de 95, se infiere que el fármaco marcado es acomplejado con un compuesto de unión a antifármaco, por ejemplo, HACA, HAHA. La relación del [fármaco marcado] a [control interno] se obtiene al integrar las áreas bajo la curva para el fármaco marcado y para el control interno y luego dividiendo la integración resultante para el fármaco marcado entre la integración resultante para el control interno.

Ejemplo 10 Determinación de la relación de fármacos anti-TNFa acomplejados a fármacos anti- TNFa no acomplejados La relación del fármaco anti-TNFa acomplejado a fármaco ati-TNFa no acomplejado se obtiene al integrar las áreas bajo la curva tanto para el fármaco anti-TNFa acomplejado como para el fármaco anti-TNFa no acomplejado y luego dividiendo la integración resultante para el fármaco anti-TNFa acomplejado entre la integración resultante para el fármaco anti-TNFa no acomplejado.

En una modalidad, el fármaco ant-TNFa no acomplejado es REMICADE™ que tiene niveles de entre aproximadamente 0 ng y 100 ng en una muestra. La cantidad de REMICADE™ marcado es de aproximadamente 37.5 ng.

Usando un control interno, por ejemplo, Biocitina-Alexa 488, artefactos y variaciones en suero de un experimento a otro experimento pueden identificarse al analizarse adecuadamente. La cantidad de control interno, por ejemplo, Biocitina-Alexa 488, es de aproximadamente 50 a alrededor de 200 pg por 100 µ? analizados.

La relación del fármaco anti-TNFa marcado, por ejemplo, REMICADE™ o HUMIRA™, al control interno marcado se obtiene al integrar las áreas bajo la curva tanto para el fármaco anti-TNFa marcado como para el control interno marcado y luego dividiendo la integración resultante para el fármaco anti-TNFa marcado entre la integración resultante para el control interno marcado.

La relación de [(anti-TNFa-marcado»autoanticuerpo)compiejo]/[control interno] se obtiene al integrar el área bajo la curva para el pico de (fármaco anti-TNFa- marcado»autoanticuerpo)8m iejo a partir de una gráfica de intensidad de señal como una función de tiempo de elución a partir de la HPLC de exclusión de tamaño, y dividiendo este número entre la integración resultante del área bajo la curva para el pico de control interno de la gráfica. En algunas modalidades, el fármaco anti-TNFa marcado es REMICADE™ marcado. En algunas otras modalidades, el fármaco anti-TNFa marcado es HU IRA™ marcado.

Ejemplo 11 Determinación de la relación de TNFa marcado libre y acomplejado Este ejemplo describe un método para determinar la cantidad de un complejo de TNFa marcado ya sea con REMICADE™ o HUMIRA™ con referencia a un estándar interno.

Usando un control interno, por ejemplo, Biocitina-Alexa 488, artefactos y variaciones en suero de un experimento a otro experimento pueden identificarse y analizarse adecuadamente. La cantidad de control interno, por ejemplo, Biocitina-Alexa 488, es de aproximadamente 1 a alrededor de 25 ng por 100 pL analizados.

En una modalidad, el TNFa marcado no acomplejado tiene niveles de entre aproximadamente 50 ng y 150 ng en una muestra. En ciertos casos, la cantidad de TNFa marcado es de aproximadamente 00.0 ng.

TNFa Marcado con fluoróforo (F1 ) se incubó con suero de paciente para formar el inmunocomplejo. Un péptido pequeño marcado con F1 , por ejemplo, Biocitina-Alexa 488, se incluyó como un control interno en cada reacción. Se creó una curva estándar al salpicar en concentraciones conocidas de fármaco anti-TNFa purificado y luego extrapolando a partir de la curva para determinar la concentración en unidades de pg/mL.

La relación inicial de TNFa marcado al control interno es igual a 100. Cuando la relación del TNFa marcado al control interno cae debajo de 95, se infiere que el TNFa marcado es acomplejado con un fármaco anti-TNFa, por ejemplo, Remicade™, Humira™. La relación del [TNFa marcado] a [control interno] se obtiene al integrar las áreas bajo la curva para el TNFa marcado y para el control interno y luego dividiendo la integración resultante para el TNFa marcado entre la integración resultante para el control interno.

Ejemplo 12 Optimización de la terapia con fármaco anti-TNFa al medir los niveles de fármaco anti-TNFa y/o anticuerpo anti-fármaco (ADA) Este ejemplo describe métodos para optimizar terapia con fármacos anti-TNFa, reducir toxicidad asociada con terapia con fármacos anti-TNFa y/o monitorear la eficacia del tratamiento terapéutico con un fármaco anti-TNFa al medir la cantidad (por ejemplo, nivel de concentración de fármaco anti-TNFa (por ejemplo, nivel de anticuerpo terapéutico anti-TNFa libre) y/o anticuerpo anti-fármaco (ADA) (por ejemplo, nivel de autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNFa) en una muestra de un sujeto que recibe terapia con fármaco anti-TNFa. En consecuencia, los métodos mostrados en el presente ejemplo proporcionan información útil para guiar decisiones de tratamiento, por ejemplo, al determinar cuándo o cómo ajustar o modificar (por ejemplo, incrementar o reducir) la dosis subsecuente de un fármaco anti-TNFa, al determinar cuándo o cómo combinar un fármaco anti-TNFa (por ejemplo, a una dosis incrementada, reducida o igual) con uno o más agentes inmunosupresores tales como metotrexato (MTX) o azatíoprina, y/o al determinar cuándo o cómo cambiar el curso de terapia actual (por ejemplo, cambiar a un fármaco anti-TNFa diferente).

Para efectos de ilustración únicamente, los siguientes escenarios proporcionan una demostración de cómo los métodos de la presente invención hacen posible adecuadamente que la terapia es optimizada y la toxicidad (por ejemplo, efectos secundarios) sea minimizada o reducida con base en el nivel de fármaco anti-TNFa (por ejemplo, nivel de anticuerpo terapéutico anti-TNFa libre) y/o ADA (por ejemplo, nivel de autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNFa) en una muestra de un sujeto que reciba terapia con fármacos anti-TNFa. Los niveles del fármaco anti-TNFa y ADA pueden medirse con los novedosos ensayos descritos en la presente.

Escenario #1 : Alto nivel de fármaco anti-TNFa con bajo nivel de anticuerpo anti-fármaco (ADA) Niveles de fármaco = 10-50 ng/10 µ?; niveles de ADA = 0.1 -2 ng/10 µ?. Muestras de pacientes que tenían este perfil incluyen muestras de pacientes BAB y JAA en la visita 10 ("V10"). Véase figura 16B.

Pacientes que recibían terapia con fármaco anti-TNFa y que tenían este perfil particular deben ser tratados con fármacos inmunosupresores tales como azatioprina (AZA) junto con el fármaco anti-TNFa (por ejemplo, infliximab).

Escenario #2: Nivel medio de fármaco anti-TNFa con nivel bajo de ADA Niveles de fármaco = 5-20 ng/10 µ?; niveles de ADA = 0.1 -2 ng/10 µ?.

Muestras de pacientes que tenían este perfil incluyen muestras de pacientes DGO, JAG y JJH en VI O. Véase figura 16B.

Pacientes que recibían terapia con fármacos anti-TNFa y que tenían este perfil particular deben ser tratados con fármacos inmunosupresores tales como azatiopn'na (AZA) junto con una dosis más alta del fármaco anti-TNFoc (por ejemplo, infliximab). Un experto en la técnica conocerá dosis más altas o más bajas adecuadas a las cuales se pueda ajusfar el actual curso de terapia de tal manera que se optimice la terapia con fármaco, por ejemplo, una dosis subsecuente que sea al menos aproximadamente 1 .5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ó 100 veces más alta o más baja que la dosis actual.

Escenario #3: Nivel medio de fármaco anti-TNF con nivel medio de ADA Niveles de fármaco = 5-20 ng/10 µ?; niveles de ADA = 0.5-10 ng/10 µ?. Muestras de pacientes que tenían este perfil incluyen muestras de paciente JMM en la visita 10 ("V10") y paciente J-L en la visita 14 ("V14"). Véase, figura 16B.

Pacientes que recibían terapia con fármaco anti-TNFa y que tenían este perfil particular deben ser tratados con un fármaco diferente. Como un ejemplo no limitativo, un paciente en terapia con infliximab (IFX) y que tenía niveles medios de IFX y ADA (es decir, HACA) debe ser cambiado a terapia con adalimumab (HUMIRA™).

Escenario #4: Bajo nivel de fármaco anti-TNFa con alto nivel de ADA Niveles de fármaco = 0-5 ng/10 µ?; niveles de ADA = 3.0-50 ng/10 µ?_. Muestras de pacientes que tenían este perfil incluyen muestras de todos los pacientes en V14 en la figura 16B.

Pacientes que recibían terapia con fármacos anti-TNFa y que tenían este perfil particular deben ser tratados con un fármaco diferente. Como un ejemplo no limitativo, un paciente en terapia con infliximab (IFX) y que tenía un bajo nivel de IFX con un alto nivel de ADA (es decir, HACA) debe ser cambiado a terapia con (HUMIRA™).

Ejemplo 13 Medición de anticuerpo anti-químérico humano (HACA) en muestras de suero de pacientes mediante ensayo de desplazamiento por movilidad de HPLC Este ejemplo describe un procedimiento de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) destinado a cuantificar el nivel de anticuerpos contra Remicade en muestras de suero de pacientes.

El principio del ensayo de movilidad HPLC se basa en el desplazamiento en tiempo de retención del complejo inmune antígeno-anticuerpo contra el antígeno libre en cromatografía de HPLC de exclusión de tamaño. Estándares, controles y muestras de pacientes son disociadas con ácido durante 1 hora, antes de la adición del Remicade marcado fluorescente y un control interno marcado fluorescente, para reducir el efecto de Remicade circulante. Todas las reacciones son luego neutralizadas e incubadas durante 1 hora para permitir la formación de complejos inmunes. Antes de ser inyectadas sobre una columna de exclusión de tamaño, todas las reacciones son filtradas y cargadas en el sistema de HPLC con una temperatura de almacenamiento de 4°C. HACA Unido a Remicade se separa del Remicade libre mediante cromatografía de exclusión de tamaño.

La cantidad de HACA se determina por la relación del área del pico de Remicade marcado libre sobre el área del pico de control interno marcado.

La sangre puede ser recolectada mediante punción a partir de pacientes. Los siguientes materiales adicionales pueden ser empleados: agua para HPLC Chromasolv; tubos de microtitulación de 1 .2 mL; placa de muestra de 96 pocilios Nunc; 10XPBS pH 7.4; Remicade-AlexaFluor 488/Biocitina-AlexaFluor 488; sistemas de filtro estéril de 1 L; placas de filtro de 96 pocilios Multiscreen HTS, GV; columna de guarda BioSep-S-3000, 75 x 7.8 mm; columna analítica BioSep-SEC-S 3000, 300 x 7.8 mm; 0.05% de azida de sodio/agua para HPLC; capilar de residuo de detector; viales para HPLC; insertos de muestra HPLC; múltiple de vacío para HTS de varias pantallas; sistema de HPLC Agilent 1200.

Se prepara una fase móvil para HPLC (1 X de solución de PBS pH 7.310.1 ). Se combinan 200 mL de 10X PBS pH 7.4 con 1750 mi de agua para HPLC en un cilindro graduado. El pH del resultado se determina y se ajusta con HCI 1 N. El volumen total se incrementa a 2000 mL con agua para HPLC. El resultado se filtra a través de una membrana de 0.22 µ?. Una columna de guarda BioSep-SEC-S 3000 y columna analítica BioSep-SEC-S 3000 para un sistema de HPLC son usadas. Los detectores UV se establecen para registrar a 280 nm y 210 nm.

Estándares, controles de muestras de pacientes son preparados. Estándares, controles y muestras de suero de pacientes son diluidos. Muestras de suero, estándares y controles se preparan en hielo en una placa de 96 pocilios Nunc con pocilios de 0.5 mL. La muestra de suero debe ser añadida primero, seguida por ácido cítrico 0.5 M pH 3.0, y finalmente agua para HPLC. Los estándares, controles y muestras son incubados durante una hora a temperatura ambiente en agitador de placa para permitir la disociación completa de las muestras. La placa se cubre con hoja durante incubación. Se añade Remicade-AlexaFluor 488/Biocitina-AlexaFluor488. Se preparan volúmenes especificados de Remicade-AlexaFluor488/Biocitina-AlexaFluor488 en agua para HPLC. Se añaden 6 pL de agua para HPLC a pocilios adecuados. Se añade Remicade-AlexaFluor488/Biocitina-AlexaFluor488 a los pocilios adecuados.

Otros ácidos orgánicos pueden ser adecuados para usarse con este ensayo incluyendo, pero no limitados a, ácido ascórbico o ácido acético.

Neutralizar muestras. Volumen especificado de 10X PBS pH 7.4 se añade a pocilios adecuados. Las muestras se mezclan al pipetear hacia arriba y abajo seis veces. Estándares, controles y muestras se incuban durante una hora a temperatura ambiente en un agitador de placa para permitir la formación completa de inmunocomplejos. La placa se cubre con hoja durante la incubación. La muestra incubada se transfiere a un refrigerador a 4°C si no es que se transfiere inmediatamente a frascos para HPLC.

Estándar de columna se prepara en una nueva placa de muestra con 15 \i de estándar de columna y 285 µ? de fase móvil añadidos a un mismo pocilio dado. Estándares, controles y muestras se diluyen hasta 2% de suero. El volumen especificado de cada estándar, control y muestra se transfiere en los pocilios adecuados de una nueva placa de muestra. A la misma placa de muestra se le añade el estándar de columna en el que fue preparada. Volumen especificado de 10X PBS pH 7.4 se añade a pocilios adecuados. Un volumen especificado de agua para HPLC se añade a los pocilios adecuados. Las muestras se mezclan al pipetear hacia arriba y abajo 6 veces. Las muestras se filtran a través de una placa de filtro Multiscreen de 0.2 µ??. La placa de recolección se añade bajo placa de filtro. Se transfieren 295 µ? de muestra a la posición respectiva en la placa de filtro. La placa de filtro fijada se añade con muestra y la placa de recolección al distribuidor de vacío. La muestra se filtra al interior de la placa de recolección. Estándares, controles y muestras se transfieren a frascos para HPLC.

Se usa una pipeta para transferir 250 µ? de estándares, controles y muestras a viales de inserto de HPLC marcados. Estándares, controles y muestras se cargan en una HPLC. Los parámetros de HPLC pueden incluir los siguientes: volumen de inyección: 100 pL. Velocidad de flujo: 1 .0 mL/min de regulador de pH de elución A; tiempo de paro: 20 minutos; post tiempo: apagado; presión mínima: 0 bares; presión máxima: 400 bares; termostato: apagado; los parámetros DAD son 210 nm y 280 nm con 4 nm y la referencia apagada; ancho de pico (tiempo de respuesta): >0.1 min (2s); ranura: 4 nm; parámetros de FLD excitación: 494 nm, emisión: 519 nm; una inyección por vial; 100 µ? de volumen de inyección para cada muestra.

Ejemplo 14 Ensayo de disociación con ácido de HACA Como se ilustra en la figura 26, una etapa de disociación con ácido permite el adecuado equilibrio de las especies acomplejadas antes de medir los niveles de concentración de las especies constituyentes. Altos niveles de fármaco pueden interferir con la detección de anticuerpos anti-fármaco tales como HACA. Como se representa en la figura 26, la etapa de disociación con ácido permite el equilibrio de los complejos ya sea del fármaco marcado "A" o fármaco no marcado "C" con el anticuerpo anti-fármaco HACA, "B". Después de la introducción del ácido para disociar el complejo de BC, altos niveles de A pueden ser añadidos. Posteriormente, la muestra puede ser diluida y la concentración de "AB" se puede medir. La concentración de "BC" después de la etapa de disociación con ácido puede calcularse con base en las cantidades conocidas o medidas de "A" y "B".

Las figuras 27 y 28 ilustran el porcentaje de infliximab marcado libre como una función de porcentaje en suero de paciente logarítmico con y sin la etapa de disociación con ácido, respectivamente.

Los siguientes materiales pueden ser empleados en este ensayo: Remicade-Alexa488/Biocitina-Alexa488; suero humano normal; control positivo HACA (HPLC); estándar de columna: 10X PBS, 1 XPBS pH 7.3; placa de filtro Multiscreen; placa de muestra; HCI 1 N; ácido cítrico 0.5 M. Se preparan títulos de HPLC en NHS. Diluciones en serie de dos veces se preparan al transferir 35 µ? de una muestra en 35 µ? de NHS. Las siguientes soluciones pueden prepararse para usarse con este ejemplo: Solución 1 : 90 µ? de HPC 25%/NHS 75%; Solución 2: 90 µ? de 12.5% de HPC/87.5% de NHS; Solución 3: 90 µ? de 6.25% de HPC/93.75% de NHS.

Las muestras pueden mantenerse en hielo antes, durante y después del análisis descrito en la presente.

Se preparan las siguientes soluciones: Solución 4: una solución reguladora de pH; Solución 5: una solución estándar de columna; Solución 6: 2% de NHS; Solución 7: 2% de NHS + 37.5 de Remicade-Alexa-488/Biocit¡na-Alexa488.

A estas soluciones se les añade muestras de suero, ácido cítrico, agua para HPLC en una placa de muestra de 96 pocilios. Muestras de suero se añaden a pocilios respectivos. Acido cítrico 0.5M pH 3.0 se añade a pocilios respectivos.

Agua para HPLC se añade a pocilios respectivos.

Se prepara una serie de muestras incluyendo las siguientes: Solución 8: regulador de pH Solución 9: ^ 5 µL de estándar de columna y 285 µ? 1 X PBS pH 7.3; Solución 10: 2% de NHS; Solución 1 1 : 2% de NHS + 37.5 Remicade-Alexa-488/Biocitina-Alexa488; Solución 12: 2% de HPC + 0% de NHS + 37.5 Remicade-Alexa-488/Biocitina-Alexa488; Solución 13: 1 % de HPC + 1 % de NHS + 37.5 Remicade-Alexa-488/Biocitina-Alexa488; Solución 14: 0.5% de HPC + 1 .5% de NHS + 37.5 Remicade-Alexa-488/Biocitina-Alexa488; Solución 15: 0.25% de HPC + 1.75% de NHS + 37.5 Remicade-Alexa-488/Biocitina-Alexa488; Solución 16: 0.125% de HPC + 1 .875% de NHS + 37.5 Remicade-Alexa-488/Biocitina-Alexa488; Solución 17: 0.063% de HPC + 1.937% de NHS + 37.5 Remicade-Alexa-488/Biocitina-Alexa488; Solución 18: 0.031% de HPC + 1 .969% de NHS + 37.5 Remicade-Alexa- 488/Biocit¡na-Alexa488; Solución 19: 0.016% de HPC + 1.984% de NHS + 37.5 Remicade-Alexa-488/Bioc¡t¡na-Alexa488; Solución 20: 2% de HPC + 0% de NHS + 37.5 Remicade-Alexa-488/Biocitina-Alexa488; Solución 21 : control alto; Solución 22: control medio; Solución 23: control bajo; Solución 24: 2% de NHS; Solución 25: 2% de NHS + 37.5 de Remicade-Alexa-488/Biocitina- Alexa488.

Todas las muestras tuvieron 5.5 µ?_ de ácido cítrico 0.5M pH 3 y 10.9 µ?_ de agua para HPLC añadidos a éstas.

Se preparan 450 µ?_ de 0.074 mg/mL de Remicade-Alexa488/Biocitina-Alexa488. Se añaden 6 pL de agua para HPLC a tres pocilios separados. Se añaden 6 pL de 0.074 mg/mL de Remicade-AlexcaFluor488/Biocitina-AlexaFluor488 a los pocilios restantes.

Las muestras se neutralizan. Se añaden 27.6 pL de 10XPBS pH 7.3 a todos los pocilios excepto uno de los pocilios. Las muestras se mezclan por pipeteo hacia arriba y hacia abajo 6X. Las muestras se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad en agitador de placa. Se añaden 15 µ?_ de estándar de columna al pocilio al cual no se le añaden los 27.6 µ?_ de 10XPBS pH 7.3. Se añaden al pocilio 285 µ?_ de 1 XPBS pH 7.3 al cual no se le añaden 27.6 µ?_ de 10XPBS pH 7.3. Las muestras se diluyen hasta 2% de suero.

Se transfieren 18.4 µ?_ de cada muestra a pocilios correspondientes de una nueva placa de muestra. Usando la misma placa en la que se hizo el estándar, se añaden 22.6 µ?_ de 10X PBS a todos los pocilios excepto el pocilio al cual no se le añaden los 27.6 pL de 10XPBS pH 7.3. Se añaden 254 µ?_ de agua para HPLC a todos los pocilios excepto el pocilio al cual no se le añaden los 27.6 µ?_ de 10XPBS pH 7.3. Las muestras se mezclan por pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Se transfieren 295 pL de estándares, controles y muestras a una placa de filtración de 96 pocilios. Usando una pipeta, 250 µ? de estándares, controles y muestras se transfieren a frascos para inserto de HPLC.

Ejemplo 15 Caso de Paciente 1 de paciente que recayó con terapia con anti-TNFot Pruebas iniciales indicaron que ningún HACA en suero estaba presente y niveles de IFX de rápida depuración. La vida media para IFX se calculó como de 46.9 horas. Se incrementaron la dosis y frecuencia de IFX. El paciente respondió. Véase figura 29 para una descripción de los niveles de IFX como una función de tiempo.

Tres meses más tarde, el paciente recayó, el paciente fue probado de nuevo y se encontró que tenía bajo HACA y ningún IFX detectable. Todas las citocinas probadas estuvieron dentro del intervalo normal.

El tratamiento sugerido es azatioprina y opcionalmente el cambio a una terapia con fármaco anti-TNF alternativa. Asimismo, se continúa el monitoreo del paciente para ver si se forman otros anticuerpos anti-fármaco (ADA).

Ejemplo 16 Caso de Paciente 2 de paciente que recavó con terapia con anti-TNFg Cuatro meses después de las pruebas iniciales, dos muestras, tomadas 8 días aparte, fueron probadas. Los niveles de HACA fueron altos y los niveles de IFX no fueron detectables. La recomendación es que el paciente debe ser cambiado a un terapéutico anti-TNF alternativo.

Ejemplo 17 Caso de Paciente 3 de paciente que recavó con terapia anti-TNFg La concentración de IFX se calculó con una curva estándar generada por reacción de diferentes concentraciones de IFX a TNF-a marcado. Una muestra de 1 1 días fue 3.8 ug/ml en diluciones de 1 :25 (al menos 3 vidas medias). Véase figura 30 para una descripción de los niveles séricos de infliximab como una función de tiempo. Véase figura 31 para una descripción de los niveles séricos de TNF-a como una función de tiempo. El tratamiento recomendado es combinar IFX con un fármaco inmunosupresor o, opcionalmente, cambiar por un fármaco anti-TNF alternativo.

Ejemplo 18 Caso de Paciente 4 de paciente que recavó con terapia anti-TNFg Se encontró que el paciente tenía alto HACA y ningún IFX detectable. Los niveles de TNF-a fueron elevados; todas las demás citocinas probadas estuvieron dentro del rango normal. El tratamiento sugerido es cambiar a un terapéutico anti-TNF alternativo.

La figura 32 muestra los perfiles de desplazamiento por movilidad de IFX marcado con F1 para el caso de Paciente 1 (A); Caso de Paciente 2 (B, C) y Caso de Paciente 4 (D).

Ejemplo 19 Caso de Paciente 5 de paciente que recavó con terapia anti-TNFg Se encontró que el paciente tenía bajo HACA y ningún nivel de IFX detectable. Los niveles de TNF-oc fueron muy altos; todos los demás niveles de citocinas probados estuvieron dentro del rango normal. La terapia sugerida es incrementar la dosis o frecuencia de dosificación de IFX o cambiar por un fármaco anti-TNF alternativo junto con la adición de un fármaco inmunosupresor. También una terapia sugerida es continuar monitoreando al paciente para ver si se incrementan los niveles de HACA/ADA.

Ejemplo 20 Caso de Paciente 6 de paciente que recayó con terapia anti-TNFa Se encontró que el paciente tenía niveles de HACA medios y bajos niveles de IFX. Los niveles de IL-1 ß e IL-6 fueron muy altos. IFN-? estaba ligeramente elevada y TNF-oc estaba dentro del rango normal. El tratamiento sugerido es cambiar por un fármaco anti-TNFa diferente o por una terapia con un fármaco que se dirija a un mecanismo diferente (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal e inhibidor del receptor de IL-6 tal como Actemra (tocilizumab) junto con la adición de un fármaco inmunosupresor.

Ejemplo 21 Caso de Paciente 7 de paciente que recavó con terapia anti-TNFa Se encontró que el paciente tenía bajos niveles de HACA. Se detectaron bajos niveles de IFX. Los niveles de IFN-? fueron altos; todos los demás niveles de citocinas probados estuvieron dentro del rango normal. El tratamiento sugerido es incrementar la dosis de IFX o cambiar por una terapia con un fármaco que se dirija a un mecanismo diferente (por ejemplo, un anticuerpo anti-INFy tal como fontolizumab). Como alternativa, el tratamiento sugerido puede ser añadir un fármaco inmunosupresor.

La figura 33 muestra los perfiles de desplazamiento por movilidad de IFX marcado con F1 para Caso de Paciente 5 (A); Caso de Paciente 6 (B, C) y Caso de Paciente 7 (D, E).

Ejemplo 22 Niveles de citocinas en diferentes grupos séricos de pacientes Este ejemplo describe los niveles de citocinas, tales como, pero no limitadas a, IFN-?, ?1 -1 ß, IL-6 y TNFa, en muestras de control normal, UC tratada con infliximab, CD tratada con humira y suero positivo a HACA. Como se ilustra en la figura 34, suero de paciente positivo a HACA típicamente tuvo niveles más altos de todas las citocinas probadas (por ejemplo, IFN-?, ? 1 -1 ß, IL-6 y TNFa). Con base en la presencia de autoanticuerpos contra IFX (es decir, HACA) y altos niveles de citocinas, estos pacientes deben ser cambiados a un fármaco anti-TNF alternativo, opcionalmente en combinación con un fármaco inmunosupresor.

Ejemplo 23 Cuantificación de estándares de HACA mediante ensayo de disociación de ácido Este ejemplo describe la cuantificación de HACA en muestras estándares usando el ensayo de disociación de ácido descrito en el ejemplo 14 con una cantidad fija de Remicade™-AlexaFluor488 y cantidades variables de Remicade™ no marcado. En particular, concentraciones de HACA que variaban de 25 U/mL a 100 U/mL pueden determinarse en presencia de Remicade™ no marcado que varía en varios órdenes de magnitud. Los datos para la determinación de HACA en un estándar de baja concentración (25 U/mL), un estándar de media concentración (50 U/mL) y un estándar de alta concentración (100 U/mL), se presentan en las tablas 8, 9 y 10, respectivamente. La concentración de Remicade™ no marcada en cada muestra se determinó usando el ensamble de desplazamiento por movilidad descrito en el ejemplo 1. Después de la disociación de ácido y equilibrio, el complejo HACA/Remicade™-AlexaFluor488 resultante en una muestra dada se determinó por SE-HPLC y HACA total se calculó de acuerdo con los cálculos presentados en el ejemplo 7. Se presenta el porcentaje de recuperación de HACA en cada análisis (con base en la concentración conocida de HACA en el estándar).

Tabla 8 Cuantificación del estándar de HACA de baja concentración (25 U/mL) con concentración de Remicade variable Tabla 9 Cuantificación del estándar de HACA de concentración media (50 U/mU con concentración de Remicade variable Tabla 10 Cuantificación de estándar de HACA de alta concentración (100 U/mL) con concentración de Remicade Variable Ejemplo 24 Un nuevo paradigma para terapia con fármacos anti-TNF El paradigma existente para terapia con fármacos anti-TNF, con base en el nivel de fármaco y el nivel de HACA determinado en una muestra de paciente, se delinea en la siguiente tabla 1 1 : Tabla 11 Paradigma existente HACA FARMACO Acción BAJO BAJO Incrementar Dosis MEDIO BAJO Incrementar Dosis ALTO BAJO Cambiar Terapia BAJO MEDIO Continuar MEDIO MEDIO Indeterminado ALTO MEDIO Cambiar Terapia BAJO ALTO Continuar MEDIO ALTO Continuar ALTO ALTO Cambiar Terapia Este paradigma se confunde, sin embargo, por la alta variabilidad de los niveles de fármaco en pacientes indeterminados a HACA.

El paradigma terapéutico de la presente invención utiliza un índice de actividad/severidad de enfermedad derivado de un análisis a base de algoritmos de uno o más biomarcadores para seleccionar terapia, optimizar terapia, reducir toxicidad, monitorear la eficacia de tratamiento terapéutico o una combinación de los mismos, con un fármaco anti-TNF. En ciertos aspectos, las acciones a tomar basadas en este nuevo paradigma se delinean para varios escenarios ilustrativos en la siguiente tabla 12: Tabla 12 Paradigma de la presente invención HACA FARMACO Indice de Acción actividad de enfermedad BAJO BAJO BAJO Continuar BAJO BAJO MEDIO Aumentar Dosis BAJO BAJO ALTO Aumentar Dosis BAJO MEDIO BAJO Continuar BAJO MEDIO MEDIO Aumentar Dosis BAJO MEDIO ALTO Aumentar Dosis BAJO ALTO BAJO Continuar o reducir dosis para prevenir toxicidad BAJO ALTO MEDIO Continuar BAJO ALTO ALTO Cambiar Terapia MEDIO BAJO BAJO Continuar MEDIO BAJO MEDIO Aumentar Dosis MEDIO BAJO ALTO Aumentar Dosis o Cambiar Terapia MEDIO MEDIO BAJO Continuar MEDIO MEDIO ALTO Cambiar Terapia MEDIO ALTO BAJO Continuar o reducir dosis para prevenir toxicidad MEDIO ALTO MEDIO Continuar MEDIO ALTO ALTO Cambiar Terapia ALTO BAJO MEDIO Cambiar Terapia ALTO BAJO MEDIO Cambiar Terapia ALTO BAJO ALTO Cambiar Terapia ALTO MEDIO BAJO Cambiar Terapia ALTO MEDIO MEDIO Cambiar Terapia ALTO MEDIO ALTO Cambiar Terapia ALTO ALTO BAJO Cambiar Terapia ALTO ALTO MEDIO Cambiar Terapia ALTO ALTO ALTO Cambiar Terapia Cabe mencionar que las acciones terapéuticas para pacientes con niveles de HACA de escala media pueden seguirse con monitoreo de cambios en la actividad de enfermedad. En ciertos casos, los niveles de HACA altos pueden desencadenar un cambio en terapia a pesar de otros parámetros, debido a la naturaleza inmunologica de la condición.

Ejemplo 25 Detección de bajos niveles de Remicade en muestras de tejido Pacientes con artritis reumatoide (RA) han mostrado tener una respuesta a menos de 100 ng/mL de Remicade durante el curso de tratamiento. Un ensayo de desplazamiento por movilidad de HPLC de Remicade ha sido desarrollado como se describe en la presente que detecta la presencia de Remicade en suero de paciente evitando muchos de los aspectos con un formato de ELISA. En ciertos aspectos, el actual límite más bajo de cuantificación (LLOQ) para este ensayo inventivo es de aproximadamente 0.49 pg/mL, permitiendo el análisis de la mayoría de los pacientes. Nuestra investigación actual indica que al ajustar varios parámetros de detector de fluorescencia (desplazamiento de la longitud de onda de emisión a 525 nm e incremento de la ganancia P T a 16), el ensayo de desplazamiento por movilidad HPLC de Remicade puede detectar de manera cuantitativa tan poco como 50 ng/mL de Remicade en suero con alta reproducibilidad. De hecho, este nivel de sensibilidad hace posible el análisis de los niveles de Remicade en pequeñas muestras de tejido (<10 mg). La detección de Remicade dentro de tejidos incrementa nuestro conocimiento sobre la cantidad de Remicade que ha alcanzado el sitio de inflamación, produciendo más información sobre detalles farmacocinéticos y mecánicos del fármaco.

Métodos El aislamiento de proteína a partir de tejido de paciente se logra por extracción de células enteras. Se colocan 1 -10 mg cortes de tejido en un tubo y se congelan después en un ambiente criogénico. La muestra criogénica es luego homogeneizada usando el interruptor de tejidos mecánico Covaris CryoPrep. Después de la pulverización, la muestra se transfiere a un tubo que contiene alrededor de 300 pL de regulador de pH de extracción (50 mM de Tris, pH 8.0, 150 mM de NaCI, 1 % de NP-40, 0.25% de desoxicolato, 1 mM de EDTA) que contiene un coctel inhibidor de proteasa de mamífero (Sigma, St Louis, Mo). Las muestras son luego transferidas inmediatamente a la porción acústica del instrumento CryoPrep para su interrupción adicional por sonicación. Las muestras se incuban después durante 45 minutos en hielo para permitir disociación completa de los componentes celulares. Los extractos se centrifugan a 4°C durante 15 minutos a alta velocidad. Se hacen alícuotas de los sobrenadantes y se congelan a -80°C. Las concentraciones de proteína se cuantifican usando el ensayo de proteína Lowry (Bio-Rad). Una alícuota de 200 se descongela y luego se añaden 5.0 ng de TNF-a recombinante marcado fluorescentemente (TNF-Alexa488). Después de incubación a temperatura ambiente durante 1 hora, la solución está en equilibrio y varios complejos TNF-Alexa488/Remicade de peso molecular cada vez más alto se han formado. Después de la filtración, la muestra se inyecta en una columna de exclusión de tamaño para HPLC Phenomenex BioSep S-3000. Este ensayo en fase líquida y tiempo real resuelve complejos Remicade-TNF a partir de TNF libre con base en el tamaño de los complejos formados.

Aunque el actual límite inferior de cuantificación es adecuado para la mayoría de los pacientes, existe la necesidad por incrementar la sensibilidad para usar en pacientes de RA (véase arriba). En un aspecto, el ensayo se basa en la detección de 25 ng de TNF-Alexa488 en una inyección de 100 uL en la columna de exclusión de tamaño HPLC. El uso de fluorescencia como el método de detección proporciona flexibilidad para optimización de longitudes de onda de excitación y emisión así como la capacidad para incrementar la ganancia del tubo fotomultiplicador (PMT). Los ajustes actuales usados para validación del ensayo Remicade son: FLD ???=494, ??p,=519 PMTGain = 12 Estos ajustes fueron seleccionados con base en longitudes de onda publicadas para el grupo AlexaFluor 488 así como ajustes PMTGain normales para el Agilent 1200 series FLD. Incrementar la PMTGain incrementa la señal y el ruido, pero hasta cierto factor el incremento en la señal es más alto que el incremento en el ruido. La etapa de ganancia a ganancia es igual a un factor de 2. Los parámetros más importantes a optimizar son las longitudes de onda de excitación y emisión y aunque los máximos publicados son un punto de partida útil, comúnmente es necesario optimizarlos toda vez que la excitación depende de los propios compuestos así como de las características específicas del instrumento.

Cuando se detectan bajas cantidades de Remicade, un pico específico que refleja un complejo de TNF-Alexa488 y Remicade se origina a un tiempo de retención de 9.2 minutos. En un aspecto, es importante que la altura de este pico esté al menos 3 veces por arriba del fondo y que la concentración en suero calculada sobre multiplique las réplicas para tener un coeficiente de varianza menor que 20%. En ciertas modalidades, la señal a ruido de este pico de Remicade-TNF-Alexa488 específico a fondo de suero humano normal es entonces el punto de partida para incrementar la sensibilidad del ensayo.

Para incrementar la sensibilidad, la PMTGain así como las longitudes de onda de excitación y emisión fueron optimizadas con base en los resultados de gráficas de amplificación y gráficas de isoabsorbancia. Remicade fue titulado en presencia de diluciones de TNF-Alexa488 a diferentes niveles de PMTGain que variaban de 12-18, usando las longitudes de onda de excitación y emisión actuales de 494 y 519 nm, respectivamente.

La figura 35 muestra una cantidad estándar de TNF-Alexa488 así como el pico pequeño a Rt=9.2 minutos que reflejan un complejo Remicade-TNF (panel superior). Después de reducir la cantidad de TNF-Alexa488 a 2.5 ng, es claro que el fondo de 4% de suero humano normal empieza a interferir con la resolución del pico de TNF libre así como el pico a 9.2 minutos reflejando un complejo Remicade-TNF (panel medio). Incrementar la PMTGain a 18 (panel inferior) incrementa la señal y ruido igualmente (los datos son similares para todos los niveles de PMT).

Es claro a partir de los datos que la fluorescencia de fondo a partir de suero humano normal interfiere con la cuantificación de bajos niveles de Remicade usando los ajustes actuales. Para incrementar la sensibilidad del ensayo, modificaciones adicionales de los ajustes de FLD son necesarias para reducir la señal de fondo en suero. Para investigar esto, se llevaron a cabo experimentos a diferentes longitudes de onda de excitación y emisión con base en resultados de gráficas de isoabsorbancia. Las gráficas de isoabsorbancia se tomaron a partir de suero humano normal, TNF-Alexa488, fase móvil (1 X PBS/0.1 % de BSA) y agua.

La figura 36 muestra longitudes de onda de excitación graficadas en el eje Y y longitudes de onda de emisión graficadas en el eje X. Comparar las gráficas para suero humano normal (panel superior) y TNF-Alexa 488 (panel interior) muestra una superposición significativa en máximos tanto de excitación como de emisión (vértice de la región en forma de v en las gráficas). El desplazamiento de la longitud de onda de emisión a por lo menos 525 nm probablemente mantendrá la alta sensibilidad para TNF-Alexa488 mientras reduce el fondo de suero normal. La longitud de onda de emisión se estableció en 525 nm y luego los experimentos se repitieron mirando a TNF-Alexa488 así como el fondo de suero humano normal. TNF-Alexa488 se inyectó en presencia de 4% de NHS y la señal a ruido se evaluó.

La figura 37 muestra el análisis de suero humano normal (panel izquierdo) y 25 ng de TNF-Alexa 488 (panel derecho) por HPLC usando los ajustes indicados. El nivel de fondo de fluorescencia a partir de suero humano normal se reduce ampliamente.

Después de demostrar que el nivel de fluorescencia de fondo a partir de suero se había reducido, la señal a ruido del ensayo fue evaluada a diferentes niveles de PMTGain que variaban de 12-18. Los resultados del análisis, presentados en la siguiente tabla 13, establecen que una PMTGain de 16 proporciona beneficio significativo.

Tabla 13 La sensibilidad del ensayo fue luego sondeada al generar curvas estándares tales como la gráfica mostrada en la figura 38. Se ussaron 2.5 ng de TNF-Alexa488 por inyección y el Remicade se tituló en el intervalo de 50 ng/mL-5.86 µg mL para establecer el límite de detección. El pico en el tiempo de retención de 9.2 fue de nuevo monitoreado como un juicio de señal a ruido y la concentración más baja que repetidamente (n-20) dio origen a una altura de pico de 3:1 se usó para calcular la LOQ. Los resultados de este tipo de análisis se presentan en la siguiente tabla.

Tabla 14 Al desplazar la longitud de onda de emisión a 525 nm e incrementar PMTGain a 16, el ensayo de desplazamiento por movilidad de HPLC de Remicade puede ahora detectar cuantitativamente tan poco como 50 ng/mL de Remicade en suero con alta reproducibilidad. Una optimización adicional puede incrementar la sensibilidad a un mayor grado, pero el nuevo formato debe permitir el análisis de paciente de RA que muestran respuesta incluso a concentraciones en suero de Remicade muy bajas. La correlación de bajos niveles de Remicade con respuesta del paciente, resultado clínico y biomarcadores relacionados toman decisiones para un enfoque más personalizado para el tratamiento.

Ejemplo 26 Análisis de estudio clínico de ensayo de desplazamiento por movilidad contra ELISA Estudios iniciales se llevaron a cabo como arriba usando muestras de pacientes con CD activa (N=1 17) y pacientes de UC (N=10) tratados con infliximab durante varias semanas. Los datos del ensayo de desplazamiento por movilidad se compararon con los resultados de ELISA.

Como se muestra en la figura 39, ambos métodos se correlacionaron (coeficiente de correlación =0.812, p < 2.2 x 10'16 para datos recabados sobre los límites inferiores de cuantificación) para la determinación de infliximab en las muestras. 6% De muestras determinadas como negativas a infliximab por ELISA mostraron ser positivas a infliximab por el ensayo de desplazamiento por movilidad. Ninguna de las muestras determinada como negativa a infliximab por el ensayo de desplazamiento por movilidad se determinó como positiva a infliximab por ELISA. Según se determina por el ensayo de desplazamiento por movilidad, se encontró que cuatro muestras negativas a infliximab eran HACA-positivas. Los datos de ELISA y del ensayo de desplazamiento por movilidad también se correlacionaron para la determinación de HACA, como se muestra en la figura 40. 37 De las muestras determinadas como negativas a HACA por ELISA se encontró que eran positivas a HACA por el ensayo de desplazamiento por movilidad.

Los recuentos acumulativos por semana de las muestras positivas a HACA se tabularon con el tiempo como se muestra en la figura 41. Aunque los datos para el ensayo de desplazamiento por movilidad (figura 41 , trazo superior) y ELISA (figura 41 , trazo inferior) empiezan a converger después de 60 semanas, el ensayo de desplazamiento por movilidad dio como resultado un recuento más alto de especímenes positivos a HACA en puntos de tiempo más tempranos. La prueba exacta de Fisher se aplicó a los datos recabados en varios puntos de tiempo. Los valores p determinados por la prueba fueron 0.0381 , 0.0240 y 0.6791 después de 46 semanas, 50 semanas y 66 semanas, respectivamente. Tomados juntos, los estudios clínicos indican que el ensayo de desplazamiento por movilidad supera las limitaciones de variabilidad e interferencia en el ELISA. La tecnología también es aplicable a un amplio espectro de terapéuticos proteínicos para condiciones tales como artritis reumatoide y enfermedad intestinal inflamatoria. Dada la necesidad crítica por una detección precisa de niveles de fármaco y anticuerpos anti-fármaco en estrategias terapéuticas en desarrollo, el ensayo de desplazamiento por movilidad permite un mejor manejo de tratamiento de pacientes.

Ejemplo 27 Evaluación de un novedosos ensayo de desplazamiento por movilidad homogéneo para la medición de anticuerpos anti-quiméricos humanos (HACA) y niveles de infliximab (IFX) en suero de pacientes Antecedentes: La lista de bioterapéuticos a base de anticuerpos disponible para el tratamiento de enfermedades inflamatorias tales como enfermedad intestinal inflamatoria (IBD) y artritis reumatoide (RA) se incrementa sostenidamente. Sin embargo, ciertos pacientes generarán anticuerpos anti-fármaco (ADA) que pueden causar una gama de consecuencias, incluyendo alteración de la farmacocinética del fármaco, producción/pérdida de eficacia del fármaco y reacciones del fármaco adversas. El monitoreo de pacientes para niveles de fármacos de anticuerpos y ADA no sólo se requiere por la FDA durante el proceso de desarrollo del fármaco, sino que también es muy importante para un adecuado manejo del paciente durante el tratamiento con estos fármacos. Están disponibles diferentes métodos para la evaluación de los niveles de ADA y fármaco, los cuales incluyen ¡nmunoensayo en fase sólida, radioinmunoprecipitación (RIPA) y Resonancia de un Plasmón en Superficie (SPR). Sin embargo, se observan muchas desventajas en estos métodos, incluyendo epítopos enmascarados/alterados por inmovilización o marcado de antígenos, incapacidad para definir la especificidad de especie y detección de isotipo, falla en detectar anticuerpos de baja afinidad, necesidad de instrumentos dedicados o reactivo marcado radioactivamente, y baja tolerancia de fármaco en la muestra. Hemos desarrollado un ensayo de desplazamiento por movilidad homogénea en fase líquida y no radiomarcado para medir los niveles de HACA y fármaco en suero de pacientes tratados con IFX. Este método supera muchas de las limitaciones de los métodos actuales para medir niveles de HACA y fármaco.

Métodos: Para llevar a cabo el ensayo HACA de desplazamiento por movilidad, infliximab (IFX) marcado con AlexaFluor 488 (Alexa 488) que contenía un control de carga de Alexa 488 se incuba con suero positivo a HACA y se deja alcanzar equilibrio. Después del equilibrio, la mezcla de reacción se inyecta entonces en una columna de HPLC. Los complejos Alexa488-IFX libre e inmune son resueltos mediante HPLC de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) y la intensidad de la fluorescencia en cada pico resuelto se mide por un detector fluorescente (FLD). Los cambios en la relación del área pico de Alexa488 IFX libre al área pico de control interno Alexa488 indican la cantidad de complejos inmunes formada. Diferentes diluciones de suero positivo HACA se usan para generar una curva estándar, la cual se ajusta con un modelo logístico de 5 parámetros para compensar la asimetría. La cantidad de HACA en las muestras se calcula a partir de la curva estándar. Metodología y análisis similares se usan para medir el nivel de IFX en el suero, excepto que TNF-oc marcado con Alexca488 se utiliza para unir IFX e IFX purificado se usa como el estándar. Hemos llevado a cabo una validación de método completa en los ensayos tanto de HACA como de IFX, y comparado los resultados de prueba de muestras clínicas con aquellos obtenidos de métodos de ELISA.

Resultados: La validación del ensayo HACA de desplazamiento por movilidad reveló un nivel más bajo de cuantificación de 6.75 U/ml en muestras de suero, que es equivalente a 35.4 ng/ml, y este valor es más bajo que el requisito industrial (250-500 ng/ml). El intervalo lineal de cuantificación es 6.75-150 U/ml. La determinación de precisión intra-ensayos e inter-ensayos produjo un coeficiente de variación de menos de 15%, y la precisión del ensayo está dentro de 20%. La tolerancia a fármaco IFX en el ensayo es de hasta 100 µ?/?t?? en el suero de prueba. Niveles terapéuticos de azatioprina (AZA) y metotrexato (MTX), presencia de factor reumatoide (774 lU/ml), niveles normales de inmunoglobulinas, TNFs y receptores de TNF solubles no tienen interferencia significativa en el ensayo. Muestras de suero de 100 sujetos sanos naives a fármaco se probaron para establecer el punto límite de 6.75 U/ml (media + 1 .65 SD). Cien muestras de suero positivas a HACA analizadas por ELISA de puente también fueron evaluadas por el ensayo de desplazamiento por movilidad. Sobre todo, existe una fuerte correlación entre los dos métodos en los niveles de HACA (Rho de Spearman = 0.337, p = 0.0196). Sin embargo, el nuevo método fue capaz de identificar 23 muestras falsas positivas a partir del ELISA de puente. Resultados similares se obtuvieron a partir de la validación del ensayo IFX de desplazamiento por movilidad.

Conclusiones: Los resultados de este estudio demostraron la superioridad del ensayo de desplazamiento por movilidad en medir HACA e IFX en muestras de suero de pacientes. Este método también se puede aplicar para detectar otros biofarmacéuticos y ADA en muestras de suero de pacientes tales como aquellos tratados con adalimumab.

Aunque la anterior invención ha sido descrita en cierto detalle a manera de ilustración y ejemplo para efectos de claridad de entendimiento, un experto en la técnica apreciará que ciertos cambios y modificaciones pueden llevarse a la práctica dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Además, cada referencia provista en la presente se incorpora por referencia en su totalidad al mismo grado que si cada referencia estuviera incorporada individualmente por referencia.

Claims (28)

REIVINDICACIONES

1 . Un método para detectar la presencia o nivel de un autoanticuerpo contra un fármaco anti-TNFa en una muestra sin interferencia del fármaco anti-TNFa en la muestra, el método se caracteriza porque comprende: (a) poner en contacto la muestra con un ácido para disociar complejos preformados del autoanticuerpo y el fármaco anti-TNFa, en donde la muestra tiene o se sospecha que tiene un autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNFa; (b) poner en contacto la muestra con un fármaco anti-TNFa marcado después de la disociación de los complejos preformados; (c) neutralizar el ácido en la muestra para formar complejos marcados del fármaco anti-TNFa marcado y el autoanticuerpo; (d) someter los complejos marcados a cromatografía de exclusión de tamaño para separar los complejos marcados; y (e) detectar los complejos marcados, detectando de esta manera la presencia o nivel del autoanticuerpo sin interferencia del fármaco anti-TNFa en la muestra.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el fármaco anti-TNFa se selecciona del grupo que consiste en REMICADE™ (infliximab), ENBREL™ (etanercept), HUMIRA™, (adalimumab), CIMZIA® (certolizumab pegol), SIMPONI® (golimumab, CNTO 148) y combinaciones de los mismos.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNFa se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-quimérico humano (HACA), un anticuerpo anti-humanizado humano (HAHA), un anticuerpo anti-ratón humano (HAMA) y combinaciones de los mismos.

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el ácido comprende un ácido orgánico, un ácido inorgánico o mezclas de los mismos.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el ácido orgánico comprende ácido cítrico.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la muestra se pone en contacto con un ácido a una concentración de 0.1 M a 5M.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el ácido se neutraliza al añadir uno o más agentes neutralizantes a la muestra.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la etapa (b) comprende además poner en contacto un control interno marcado con la muestra.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la presencia o nivel del autoanticuerpo se detecta en presencia de un alto nivel del fármaco anti-TNFa

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el alto nivel del fármaco anti-TNFa de 10 a 100 pg/mL.

1 1 . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la cromatografía de exclusión de tamaño es cromatografía de líquidos de alto rendimiento-exclusión de tamaño (SE-HPLC).

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , caracterizado porque la muestra es suero.

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la muestra se obtiene de un sujeto que recibe terapia con el fármaco anti-TNFa.

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque los complejos son eluidos primero, seguidos por fármaco anti-TNFa marcado libre.

15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el fármaco anti-TNFa se marca con un fluoróforo o un colorante fluorescente.

16. Un método para optimizar terapia y/o reducir toxicidad para un fármaco anti-TNFa en un sujeto que reciba un curso de terapia con el fármaco anti-TNFa, el método comprende: (a) detectar la presencia o nivel de un autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNFa en una muestra del sujeto sin interferencia del fármaco anti-TNFa en la muestra, el método comprende: (i) poner en contacto la muestra con un ácido para disociar complejos preformados del autoanticuerpo y el fármaco anti-TNFa, en donde la muestra tiene o se sospecha que tiene un autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNFa; (ii) poner en contacto la muestra con un fármaco anti-TNFa marcado después de la disociación de los complejos preformados; (iii) neutralizar el ácido en la muestra para formar complejos marcados del fármaco anti-TNFa marcado y el autoanticuerpo; (iv) someter los complejos marcados a cromatografía de exclusión de tamaño para separar los complejos marcados; y (v) detectar los complejos marcados para detectar así la presencia o nivel del autoanticuerpo sin interferencia del fármaco anti-TNFa en la muestra; y (b) determinar una dosis subsecuente del curso de terapia para el sujeto o si un curso de terapia diferente debe ser administrado al sujeto con base en la presencia o nivel del autoanticuerpo, optimizando así terapia y/o reduciendo toxicidad para el fármaco anti-TNFa.

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el fármaco anti-TNFa se selecciona del grupo que consiste en REMICADE™ (¡nfliximab), ENBREL™ (etanercept), HUMIRA™ (adalimumab), CIMZIA® (certolizumab pegol), SIMPONI® (golimumab, CNTO 148) y combinaciones de los mismos.

18. El método de conformidad con la reivindicación 16 ó 17, caracterizado porque el autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNFa se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-quimérico humano (HACA), un anticuerpo anti-humanizado humano (HAHA), un anticuerpo anti-ratón humano (HAMA) y combinaciones de los mismos.

19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizado porque la dosis subsecuente del curso de terapia se incrementa, reduce o mantiene con base en la presencia o nivel del autoanticuerpo.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la dosis subsecuente del curso de terapia se reduce cuando se detecta un alto nivel del autoanticuerpo en la muestra.

21 . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizado porque el curso de terapia diferente comprende un fármaco anti-TNFa diferente.

22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizado porque el curso de terapia diferente comprende el curso de terapia actual junto con un agente inmunosupresor.

23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizado porque el curso de terapia diferente comprende cambiar a un curso de terapia que no sea un fármaco anti-TNFa.

24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado porque el curso de terapia diferente se administra cuando un alto nivel del autoanticuerpo se detecta en la muestra.

25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 24, caracterizado porque el ácido comprende un ácido orgánico, un ácido inorgánico o mezclas de los mismos.

26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 25, caracterizado porque la presencia o nivel del autoanticuerpo se detecta en presencia de un alto nivel del fármaco anti-TNFa.

27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 26, caracterizado porque la cromatografía de exclusión de tamaño es cromatografía de líquidos de alto rendimiento-exclusión de tamaño (SE-HPLC).

28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 27, caracterizado porque la muestra es suero.