MX2013005181A - Compuestos utiles para inhibir chk1. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un compuesto aminopirazol, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que inhibe Chk1 y es útil en el tratamiento de cáncer.

Description

COMPUESTOS ÚTILES PARA INHIBIR CHK1 La presente invención se refiere a un compuesto de aminopirazol, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, que inhibe Chk1 y es útil para tratar cánceres caracterizados por defectos en replicación de ácido · desoxirribonucleico (DNA), segregación de cromosomas, y/o división celular.

Chk1 es una proteína cinasa que depende corriente abajo de Atm y/o Atr en la trayectoria de transduccion de señal de punto de verificación de daño de DNA. En células de mamífero, el Chk1 es fosforilado en respuesta a agentes que causan daño al DNA que incluyen radiación ionizante (IR), luz ultravioleta (UV), e hidroxiurea. Esta fosforilación la cual activa Chk1 en células de mamífero es dependiente del Atr. El Chk1 juega un papel en el punto de verificación de daño al DNA dependiente del Atr que conduce a detención en fase S y en G2M. El Chk1 fosforila e inactiva Cdc25A, la especificidad dual de fosfatasa que normalmente desfosforila ciclina E/Cdk2, obstaculizando el progreso a través de la fase-S. El Chk1 también fosforila e inactiva Cdc25C, la especificidad dual de fosfatasa que desfosforila ciclina B/Cdc2 (también conocida como Cdk1) deteniendo el progreso del ciclo celular en el límite de G2 y mitosis (Furnari et al., Science, 277:1495-7, 1997). En ambos casos, la regulación de la actividad de Cdk induce a detención del ciclo celular para prevenir a las células de entrar en mitosis en la presencia de daño al DNA o DNA no replicado.

Se han reportado varios inhibidores de Chk1. Además, el documento WO 2005/121121 describe ciertos compuestos de aminopirazol clasificados por ser moduladores del metabolismo de glucosa.

Sin embargo, todavía existe una necesidad de inhibidores de Chk1 que sean inhibidores potentes de los puntos de verificación del ciclo celular que puedan actuar efectivamente como potenciadores de agentes que dañan el DNA. La presente invención proporciona compuestos que son inhibidores potentes de Chk1, lo cual puede ser benéfico para el tratamiento de cáncer. Los compuestos potencialmente anulan una detención del ciclo celular mediada por Chk1 inducida por tratamiento con agentes que dañan el DNA en cultivo de tejido e in vivo. Adicionalmente, los compuestos de la presente invención proporcionan inhibición de Chk2, lo cual puede ser benéfico para el tratamiento de cáncer. Además, los compuestos de la presente invención inhiben la proliferación celular de células de cáncer por un mecanismo dependiente de la inhibición de Chk1. Tales nuevos compuestos podrían atender la necesidad de tratamientos seguros y efectivos para el cáncer.

La presente invención proporciona un compuesto el cual es (R)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable. Modalidades preferidas son (f?)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-piraz¡n-2-il]-am¡na, sal de ácido meta nsulfón ico de (f?)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina, sal de ácido acético de (f?)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)- pirazin-2-¡l]-am¡na, sal de hemioxalato de (R)-[5-(2-metoxi-6-metil-p¡rid¡n-3-¡l)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperid¡n-3-iloxi)-p¡ra2¡n-2-il]-amina, y sal de hemisuccinato de (f?)-[5-(2-metoxi-6-met¡l-pir¡din-3-¡l)-2H-p¡razol-3-¡l]-[6-(piperid¡n-3-ilox¡)-piraz¡n-2-¡l]-amina.

Como una modalidad particular, la presente invención proporciona el compuesto el cual es (f?)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-p¡razin-2-il]-amina.

La presente invención proporciona la sales de ácido metansulfónico, ácido acético, hemioxalato y hemisuccinato de ( ?)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-am¡na.

Otra modalidad es un hidrato de (f?)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina.

La presente invención proporciona hidrato de (R)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-¡l]-amina en forma cristalina.

La presente invención también proporciona hidrato de (R)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina en forma cristalina caracterizado por un patrón de difracción en polvo de rayos-X que tiene picos a 2T ± 0.2 a 5.17 en combinación con uno o más de los picos seleccionados del grupo que consiste de 15.73, 17.71 y 20.12.

La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende (ft)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piper¡din-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende (R)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, junto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos.

La presente invención proporciona un método para tratar cáncer, que comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad efectiva de (f?)-[5-(2-metoxi-6-metil-pirid¡n-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable. Además, la presente invención también proporciona un método para tratar cáncer, que comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad efectiva de (R)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, y radiación ionizante. Además, la presente invención proporciona un método para tratar cáncer, que comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad efectiva de (f?)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, y uno o más agentes de quimioterapia.

La presente invención proporciona el uso de (R)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2- ¡l]-amina, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de cáncer. Además, la presente invención también proporciona el uso de (R)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de cáncer en donde el tratamiento comprende terapia de combinación con radiación ionizante. Además, la presente invención proporciona el uso de (f?)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-¡l]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de cáncer por terapia de combinación en donde dicho tratamiento de terapia de combinación comprende la administración del medicamento y administración de uno o más agentes de quimioterapia al mismo paciente.

La presente invención proporciona (R)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, para uso en terapia. Además, la presente invención también proporciona (R)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, y radiación ionizante para uso en terapia. Además, la presente invención proporciona (ft)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, y uno o más agentes de quimioterapia para uso en terapia.

La presente invención proporciona ( ?)-[5-(2-metoxi-6-metil- piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, para uso en el tratamiento de cáncer. Además, la presente invención también proporciona (f?)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, y radiación ionizante para uso en el tratamiento de cáncer. Además, la presente invención proporciona (R)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, y uno o más agentes de quimioterapia para uso en el tratamiento de cáncer.

La presente invención proporciona el uso de (^?)-[5-(2-metoxi-S-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de cáncer, en donde el medicamento es para ser administrado simultáneamente, separadamente, o secuencialmente con radiación ionizante.

La presente invención proporciona el uso de (f?)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilox¡)-pirazin-2-il]-amina, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de cáncer, en donde el medicamento también comprende uno o más agentes de quimioterapia o es para ser administrado simultáneamente, separadamente, o secuencialmente con uno o más agentes de quimioterapia.

La presente invención proporciona (f?)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, para uso en combinación simultánea, separada o secuencial con radiación ionizante en el tratamiento de cáncer.

La presente invención proporciona (R)-[5-(2-metox¡-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, para uso en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más agentes de quimioterapia en el tratamiento de cáncer.

Además, la presente invención proporciona modalidades preferidas de los métodos y usos como se describe en la presente, en los cuales uno o más agentes de quim ioterapia son seleccionados del grupo que consiste de 5-fluorouracilo, hidroxiurea, gemcitabina, metotrexato, pemetrexed, doxorubicina, etopósido, cisplatino, y taxol. Adicionalmente, la presente invención proporciona modalidades más preferidas de los métodos y usos como se describe en la presente, en los cuales dos agentes de quimioterapia son seleccionados del grupo que consiste de 5-fluorouracilo, hidroxiurea, gemcitabina, metotrexato, pemetrexed, doxorubicina, etopósido, cisplatino, y taxol. También, la presente invención proporciona modalidades aún más preferidas de los métodos y usos como se describe en la presente, en los cuales el agente de quimioterapia es seleccionado del grupo que consiste de 5-fluorouracilo, hidroxiurea, gemcitabina , metotrexato, pemetrexed , doxorubicina, etopósido, cisplatino, y taxol. Modalidades preferidas de los métodos y usos descritos en la presente son cánceres seleccionados del grupo que consiste de cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer gástrico, cáncer hepático, cáncer pulmonar, cáncer de mama, melanoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, mesotelioma, cáncer renal y cáncer uterino.

Como se usa anteriormente, y a través de la descripción de la invención, los siguientes términos, a menos que se indique de otro modo, deben ser entendidos por tener los siguientes significados: "Sal farmacéuticamente aceptable" o "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a las sales relativamente no tóxicas, inorgánicas y orgánicas de compuestos de la presente invención.

Los compuestos de la presente invención son capaces de reaccionar, por ejemplo, con un número de ácidos orgánicos e inorgánicos para formar sales farmacéuticamente aceptables. Tales sales farmacéuticamente aceptables y metodología común para prepararlas son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, P. Stahl, et al., Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, Enero 1977.

Los compuestos de la presente invención son preferiblemente formulados como composiciones farmacéuticas usando uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables y administrados por una variedad de rutas. Preferiblemente, tales composiciones son para administración oral, subcutánea o intravenosa. Tales composiciones farmacéuticas y procesos para prepararlas son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, et al., eds., 21st ed., Mack Publishing Co., 2005).

Los términos "tratamiento", "trata", "tratar" y similares, significan incluir reducir o invertir el progreso de un trastorno. Estos términos también incluyen aliviar, mejorar, atenuar, eliminar o reducir uno o más síntomas de un trastorno o condición, aún si el trastorno o condición no es actualmente eliminado y aún si el progreso del trastorno o condición el mismo no es reducido o invertido.

"Cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidad efectiva" significa la cantidad del compuesto, o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de la presente invención o composición farmacéutica que contiene un compuesto, o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de la presente invención que estimulará la respuesta biológica o médica de o efecto terapéutico deseado en un tejido, sistema, animal, mamífero, o humano que está siendo buscado por el investigador, veterinario, doctor médico u otro especialista.

La cantidad de compuesto de la presente invención actualmente administrada será determinada por un especialista bajo las circunstancias relevantes, que incluyen la condición a ser tratada, la ruta elegida de administración, el compuesto actual de la presente invención administrado, la edad, peso y respuesta del paciente individual, y la severidad de los síntomas del paciente. Las dosificaciones por día normalmente caen dentro del intervalo de aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 1 0 mg/kg de peso corporal. En algunos casos, los niveles de dosificación por debajo del límite inferior del intervalo mencionado anteriormente pueden ser más adecuados, mientras en otros casos dosis todavía más grandes pueden ser empleadas.

Los compuestos de la presente invención pueden ser empleados por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica, así como también aquellos descritos en las Preparaciones y Ejemplos siguientes. Las etapas sintéticas especificas para cada una de las rutas descritas se pueden combinar en diferentes formas para preparar los compuestos de la presente invención.

Los reactivos y materiales de partida son en general fácilmente disponibles para uno de habilidad en la técnica. Otros pueden ser elaborados por técnicas estándares de química orgánica y heterocíclica, técnicas las cuales son análogas a las síntesis de compuestos conocidos estructuralmente similares y los procedimientos descritos en las Preparaciones y Ejemplos los cuales siguen , incluyendo algunos procedimientos nuevos. Se proporcionan las Siguientes Preparaciones y Ejemplos para ilustrar la invención en más detalle y representan síntesis típicas de los compuestos. Los nombres de los compuestos de la presente invención son en general proporcionados por ISIS Draw 2.5 SP2 con complemento de Autonom .

Como se usa en la presente, los siguientes términos tienen los significados indicados: "BCA" se refiere a ácido bicincon ínico; "BSA" se refiere a albúmina de suero bovino; "DMSO" se refiere a dimetilsulfóxido; "DPBS" se refiere a salina amortiguada con fosfato dibásico; "DTT" se refiere a ditiotreitol; "EtOAc" se refiere a acetato de etilo; "FBS" se refiere a suero bovino fetal; "HEPES" se refiere a ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N'-2-etansulfónico; "MEM" se refiere a medio esencial mínimo; "MeOH" se refiere a metanol ; "PBS" se refiere a salina amortiguada de fosfato; "Pl" se refiere a yoduro de propidio; "RNAasa" se refiere a ribonucleasa A; "RPMI" se refiere a I nstituto Roswell Park Memorial; "TBST" se refiere a Tween-20 de salina amortiguada con tris; "THF" se refiere a tetrahidrofurano; "TR-FRET" se refiere a transferencia de energ ía fluorescente resuelta por tiempo; "Tris" se refiere a tris(hidroximetil)aminometano; "Triton-X" se refiere a fer-octilfenil éter de í-octilfenoxipolietoxietanol polietilen glicol de 4-(1 , 1 , 3,3-tetrametilbutil)fenil-poliet¡len glicol; y "Tween-20" se refiere a polisorbato 20.

Preparación 1 (í?)-3-(6-cloropirazin-2-il)oxipiperidin-1 -carboxilato Butilo Hidruro de sodio (225.6 g , 5.64 mol) se dispersó en THF (3 L) y la temperatura se redujo a 0-5 °C. Una solución de (R)-3-hidroxi-1 - boc piperidina (891.6 g, 4.43 mol) en THF (3 L) se agregó durante 1 h mientras se mantiene la temperatura entre 0-5 °C. La reacción se agitó por 1 h. 2,6-dicloropirazina (600 g, 4.03 mol) como una solución en THF (3 L) se agregó por goteo durante 1.5 h manteniendo la misma temperatura. La reacción se agitó por 2 h a 25-30 °C, y después se vertió en hielo. La mezcla se diluyó con agua y extrajo con acetato de etilo. Los extractos se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, filtraron, y concentraron. El aceite residual se trituró con 5% de diclorometano en hexano para dar el producto como un sólido blanco. El sólido se recolectó por filtración y secó para dar 1538 g de material crudo. El producto crudo se retrituró con 5% de diclorometano en hexanos para dar un sólido blanco en rendimiento cuantitativo. ES/MS m/z 314.1 [M+H]+.

Preparación 2 Ester metílico del ácido 2-Metoxi-6-metil-nicotínico A una solución agitada de éster metílico del ácido 2-cloro-6-metil-nicotínico (10.4 g, 56.52 mmol) en MeOH bajo nitrógeno se agregó una solución de sodio (2.58 g, 113.04 mmol) en metanol (80.0 mi) (se disolvió metal sódico en metanol bajo una atmósfera de nitrógeno) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se sometió a reflujo durante la noche. La reacción se enfrió a temperatura ambiente y el pH se ajustó a pH = 7 con ácido acético. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (100 mi) y agua (30 mi). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 * 75 mi). Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na2S04, filtraron, y concentraron para dar el producto crudo. Rendimiento: 7.25 g (71 %). 1 H NMR (400 MHz, CDCI3), d 8.066 - 8.047 (d, J = 7.6 Hz, 1 H) , 6.782 -6.764 (d , J = 7.2 Hz, 1 H) , 4.029 (s, 3H), 3.879 (s, 3H), 2.483 (s, 3H); ES/MS m/z 1 82.2 [M + H]\ Preparación 3 5-(2-Metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-ilamina n-BuLi ( 1 .2 M, 96.0 mi, 1 15.6 mmol) se agregó a una solución de acetonitrilo (6.08 mi, 1 1 5.4 mmol) en THF (300 mi) a -78 °C y se dejó agitar por 30 min a -78 °C. Ester metílico del ácido 2-Metox¡-6-metil-nicotínico (20 g , 1 05.1 mmol) en THF (200 mi) se agregó y agitó a -78 °C por otros 30 min. La mezcla de reacción se apagó a -78 °C con agua (500 mi) y lavó con EtOAc (2 ? 250 mi). La capa acuosa se separó y evaporó. Esto se co-destiló dos veces con tolueno para obtener 3-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-3-oxo-propionitrilo. Rendim iento = 21 .4 g (crudo). ES/MS m/z 1 91 .1 [ +H]+.

Una solución de 3-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-3-oxo-propionitrilo (21 g, 110.4 mmol) en etanol (200 mi) se colocó en un tubo sellado. Hidrato de hidrazina (32.1 mi, 662.4 mmol) y ácido acético (21.0 mi) se agregaron y la reacción se calentó a 100 °C por 2 h. El solvente se evaporó y la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (500 mi) y solución saturada de bicarbonato de sodio (100 mi). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo con EtOAc (2 ? 250 mi). Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na2S04, filtraron, y concentraron para dar el producto crudo el cual se tomó en la siguiente etapa sin alguna purificación adicional. Rendimiento = 16.5 g (73%). 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) d 11.50 (bs, 1H), 7.90 (d, J =7.6 Hz, 1H), 6.86 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.88 (s, 1H), 4.64 (s, 2H), 3.91 (s, 3H), 2.38 (S, 3H).

Preparación 4 Ester ter-butílico del ácido 5-Amino-3-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-pirazol-1 -carboxílico Una solución de 5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-ilamina (16.0 g, 78.3 mmol) en THF (200 mi) se agregó lentamente a una suspensión agitada de NaH (60% en aceite mineral, 3.4 g, 85.0 mmol) en THF (200 mi) a O °C. Después de 15 min a O °C, di-fer-butildicarbonato (19.8 mi, 86 mmol) se agregó lentamente a la mezcla de reacción y agitó a 0 °C por 30 min. La mezcla de reacción se apagó con agua helada (aproximadamente 250 mi) y el producto se extrajo en acetato de etilo (2 ? 500 mi). Las porciones orgánicas combinadas se lavaron con agua y solución saturada de NaCI (200 mi), secaron sobre Na2S04 anhidro, filtraron, y concentraron bajo vacío para proporcionar el material crudo. Este material se trituró con hexano dos veces para obtener 18.5 g (78%) del compuesto del título. 1H NMR (400 MHz, DMSO- de) d 8.05 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 6.28 (s, 2H), 5.85 (s, 1H), 3.90 (s, 3H), 2.40 (s, 3H), 1.56 (s, 9H).

Preparación 5 Ester ter-butílico del ácido (^)-3-{6-[2-fer-Butoxicarbonil-5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-ilamino]-pirazin-2-iloxi}-piperidin-1-carboxílico Una mezcla de éster ter-butílico del ácido 5-amino-3-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-pirazol-1-carboxílico (50.0 g, 164.5 mmol), (R)-3-(6-cloropirazin-2-il)oxipiperid¡n-1 -carboxilato de fer-butilo (56.6 g, 180.9 mmol), 4,5-bis-difenilfosfanil-9,9-dimetil-9H-xanteno (14.2 g, 24.6 mmol) y Cs2C03 (85.5 g, 263 mmol) en 1,4-dioxano (1.4 L) se dividió igualmente en dos matraces de fondo redondo lado por lado y ambos se purgaron con argón por 2 h. Se agregó Pd(OAc)2 (5.4 g, 24.6 mmol) (la mitad a cada recipiente) y se continuó purgando por 1 h. Las reacciones entonces se calentaron a 90-95 °C por 1 h. Las mezclas de reacción se enfriaron a temperatura ambiente, combinaron y diluyeron con acetato de etilo (1 L). La mezcla entonces se filtró a través de tierra diatomácea, se lavó con acetato de etilo y lo filtrado se concentró. El producto crudo se purificó en gel de sílice con 15% de EtOAc/hexano como eluyente para proporcionar 55 g (57% de rendimiento) de un polvo blanco. Los 55 g de producto purificado se combinaron con 15 g de material similarmente preparado y purificado (obtenido de 20 g de éster ter-butílico del ácido 5-amino-3-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-pirazol-1-carboxílico). Los 70 g combinados de material se disolvieron en una mezcla 4:1 de THF y metanol (1.4 L) y se trató con QuadraSM™ AP (140 g) por 2 h. La mezcla de reacción se filtró a través de tierra diatomácea y lavó con acetato de etilo (4 * 100 mi). Lo filtrado nuevamente se agitó con QuadraSil™ AP (140 g) por 2 h y filtró como anteriormente. El solvente se evaporó para dar el compuesto del título como un sólido blanco. Rendimiento = 70 g (47%). ES/MS m/z 582.5 [M + H] + .

Ejemplo 1 (R)-[5-(2-Metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina A una solución agitada de éster ter-butílico del ácido (R)-3-{6-[2-íer-butoxicarbonil-5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-ilamino]-pirazin-2-iloxi}-piperidin-1 -carboxítico (13.0 g, 22.3 mmol) en diclorometano (150 mi) se agregó una solución de ácido trifluoroacético (12.4 mi, 167 mmol) en diclorometano (20 mi) durante un periodo de 5 min a 0 °C. La reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y agitó por 3 h. La reacción se diluyó con diclorometano (1000 mi), seguido por adición de solución saturada de bicarbonato de sodio (250 mi) y después agitó por 4 h. La porción orgánica se separó y secó sobre sulfato de sodio anhidro, filtró, y evaporó. El material resultante se cristalizó de isopropanol para obtener el producto deseado. Rendimiento = 7.2 g (85%). 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) d 12.40 (s, 1H), 9.71 (s, 1H), 8.02 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.46 (s, 1H), 6.93 (d, J=7.6 Hz, 1H), 6.91 (s, 1H), 4.94-4.86 (m, 1H), 3.97 (s, 3H), 3.20-3.13 (m, 1H), 2.83-2.75 (m, 1H), 2.57 (dd, J=12.0, 8.4 Hz, 1H), 2.53-2.45 (m oscurecido, 1H), 2.42 (s, 3H), 2.15-2.05 (m, 1H), 1.71-1.63 (m, 1H), 1.60-1.49 (m, 1H), 1.49-1.40 (m,1H); ES/MS m/z 382.5 [M+H]+.

Ejemplo 2 Sal de ácido metansulfónico de (R)-[5-(2-Metoxi-6-metil- pir¡din-3-¡l)-2H-pirazol-3-il]-[6-(p¡per¡d¡n-3-iloxi)-p¡raz¡n-2-¡l]-am¡na Se agregó ácido metansulfónico (0.247 g, 2.57 mmol) a una solución agitada de (f?)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il}-amina (0.982 g, 2.57 mmol) en diclorometano (25 mi) a 0 °C. La reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y agitó por 45 min. El solvente se evaporó, y la sal resultante se lavó con éter (10 mi) y pentano (10 mi) secuencialmente para obtener el producto deseado. Rendimiento = 1.139 g (92.6%).1H NMR (400 MHz, DMSO- d6), d 12.5 (bs, 1H), 9.81 (s, 1H), 8.73 (bs, 1H), 8.54 (bs, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.96 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.56 (s, 1H), 6.95 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.81 (s, 1H), 5.31-5.24 (m, 1H), 3.97 (s, 3H), 3.48-3.39 (m, 1H), 3.39-3.30 (m, 1H), 3.18-3.10 (m, 1H), 3.10-3.01 (m 1H), 2.43 (s, 3H), 2.32 (s, 3H), 2.03-1.85 (m, 3H), 1.73 - 1.65 (m, 1H); ES/MS m/z 382.4 [M + H] + .

Ejemplo 3 Sal de ácido acético de (ft)-[5-(2-Metoxi-6-metil-pirid¡n-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina A una solución de (R)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-piraz¡n-2-il]-amina (0.100 g, 0.26 mmol) en diclorometano (10 mi) se agregó ácido acético (0.015 mi, 0.26 mmol) disuelto en diclorometano (1 mi) a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó por 60 min a temperatura ambiente y después el solvente se evaporó para obtener un residuo. El residuo se trituró con éter dietílico (20 mi) seguido por n-pentano (20 mi). El material se secó bajo alto vacío por 4 h para obtener el producto deseado. Rendimiento = 0.060 g (51.8 %).1H NMR (400 MHz, DIVISO- d6) d 12.40 (bs, 1H), 9.70 (s, 1H), 8.02 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.46 (s, 1H), 6.94 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.90 (s, 1H), 4.97 - 4.38 (m, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.20-3.13 (m, 1H), 2.83-2.74 (m, 1H), 2.56-2.56 (m, 1H), 2.42 (s, 3H), 2.14-2.03 (m, 1H), 1.89 (s, 3H), 1.74-1.62 (m, 1H), 1.61-1.51 (m, 1H), 1.50-1.40 (m, 1H), 1.30-1.20 (m, 1H); ES/MS m/z 382.5 [M + H]+.

Ejemplo 4 Sal de hemioxalato de (R)-[5-(2-Metoxi-6-metil-piridin-3-il)- 2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina A una solución de (R)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina (0.100 g, 0.26 mmol) en diclorometano (10 mi) se agregó ácido oxálico (0.012 mg, 0.13 mmol) disuelto en MeOH (0.1 mi) a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó por 60 min a temperatura ambiente y después el solvente evaporó para obtener un residuo. El residuo se trituró con éter dietílico (20 mi) seguido por n-pentano (20 mi). El material se secó bajo alto vacío por 4 h para obtener el compuesto del título. Rendimiento = 0.095 g (77%). 1H NMR (400 MHz, DMSO- de) d 9.77 (s, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.95 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.55 (s, 1H), 6.95 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.79 (s, 1H), 5.33-5.24 (m, 1H), 3.97 (s, 3H), 3.45-3.30 (m, 2H), 3.18-3.09 (m, 1H), 3.08-2.98 (m, 1H), 2.42 (s, 3H), 2.05 - 1.85 (m, 2H), 1.74 - 1.63 (m, 1H), 1.18 - 1.10 (m, 1H)¡ ES/MS m/z 382.4 [M + H]\ Ejemplo 5 Sal de hemisuccinato de (R)-[5-(2-Metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina A una solución de (f?)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina (0.1 g, 0.26 mmol) en diclorometano (10 mi) se agregó ácido succínico (0.015 g, 0.13 mmol) disuelto en etanol (1 mi, disuelto a 50 °C) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó por 2 h a temperatura ambiente. El solvente se evaporó y el residuo obtenido se trituró con éter dietílico (20 mi) seguido por n-pentano (20 mi). El material se secó bajo alto vacío por 8 h para obtener el compuesto del título. Rendimiento = 0.102 g (78%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-cf6) d 12.4 (bs, 1H), 9.72 (s, 1H), 8.05 - 7.96 (m, 2H), 7.48 (s, 1H), 6.93 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.86 (s, 1H), 5.06 - 4.97 (m, 1H), 3.97 (s, 3H), 2.90 - 2.81 (m, 1H), 2.74 - 2.62 (m, 1H), 2.42 (s, 3H), 2.30 (s, 2H), 2.09 - 2.01 (m, 1H), 1.80 - 1.60 (m, 2H), 1.57 - 1.46 (m, 1H), 1.14-1.10 (m, 1H), 1.10-1.00 (m, 1H); ES/MS m/z 382.4 [M + H]+.

Ejemplo 6 Hidrato de (f?)-[5-(2-Metoxi-6-met¡l-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina Se suspendió (R)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(píperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina (52.1 mg; ES/MS m/z 382.2 [M + H]+) en una mezcla 5:95 de agua-etanol (10 mi) y formó en suspensión a temperatura ambiente por 48 horas. Se recuperó un sólido cristalino blanco por filtración a vacío.

Patrones de difracción en polvo de rayos-X (XRD) de sólidos cristalinos se obtuvieron en un dífractrómetro en polvo de rayos-X Bruker D4 Endeavor, equipado con una fuente CuKa (? = 1.54060 A) y un detector Vantec, operando a 35 kV y 50 mA. La muestra se exploró entre 4 y 40° en 2T, con un tamaño de etapa de 0.009° en 2T. El polvo seco se envasó en un soporte de muestras de cuarzo y se obtuvo una superficie suave usando una laminilla de vidrio. En el presente caso, una variabilidad de posición máxima de ± 0.2 en 2T tomó en cuenta variaciones potenciales sin obstaculizar la identificación inequívoca de la forma de cristal indicada. La confirmación de una forma de cristal puede hacerse con base en cualquier combinación única de picos distinguidos (en unidades de °2T), típicamente los picos más prominentes. Los cristales forman patrones de difracción, recolectados a temperatura ambiente y humedad relativa, se ajustaron con base en picos estándares NIST 675 a 8.85 y 26.77 grados 2-teta.

De este modo, una muestra de forma cristalina del compuesto se caracteriza por un patrón de XRD usando radiación CuKa por tener picos de difracción (valores 2-teta) como se describe en la Tabla 1 abajo. Específicamente el patrón contiene un pico a 5.17 en combinación con uno o más de los picos seleccionados del grupo que consiste de 15.73, 17.71 y 20.12 con una tolerancia para los ángulos de difracción de 0.2 grados.

Tabla 1 : Picos de difracción en polvo de rayos-X del Ejem Ensayo Bioquímico de Chk1 El efecto de compuestos en la actividad bioqu ímica de Chk1 se puede determinar usando un ensayo de enlace de filtro peptídico de sustrato/CHK1 . En este ensayo, un péptido sintético con base en los residuos de la secuencia de aminoácido 206-225 de Cdc25, se usa como un sustrato fosfo-aceptor para la proteína cinasa Chk 1 recombinante. Usando ?-33?-??? como el sustrato fosfo-donador, el Chk 1 transfiere el grupo y-33fosfato radioactivo al péptido sintético. La reacción se mide capturando el sustrato peptídico en una placa de filtro de papel de intercambio catiónico y conteo de escintilación de partículas beta emitidas.

Las reacciones de cinasa (volúmenes de reacción de 40 µ?) se realizan en placas de poliestireno en forma de V de 96 cavidades. Las reacciones se inician con la adición de enzima Chk1 . Las condiciones de reacción final son 67 mM de sal sódica de HEPES pH 7.4, 0.007% (v/v) TRITON™ X-100, 2.7 mM de DTT, 2.7 mM de MgCI2, 12 µ? de sustrato peptídico, 60 µ? de sal disódica de ATP, 0.75 pCi de ?-33?-???, 0.75 nM de enzima Chk1 activa, 4% (v/v) de DMSO y dilución serial del compuesto (dilución serial 1 :3, partiendo a 20 µ ? , 1 0 puntos).

Después de la adición de enzima Chk1 , las reacciones se incubaron a temperatura ambiente por 90 min, y después terminó con la adición de 140 µ? de ácido fosfórico. La mezcla de reacción se transfirió a las cavidades correspondientes de una placa de filtro de papel opaca de intercambio catiónico de fosfocelulosa para reposar por 30 min. La placa de filtro se lavó en un colector de vacío con cinco lavados de 200 µ? de 0.5% de ácido fosfórico (v/v). La placa de filtro se secó durante la noche previo a la adición de 40 µ? de Microscint™-20 a cada cavidad de la placa. Después de reposar por 4 h a temperatura ambiente, la radioactividad en la placa se midió usando un contador de escintilación de microplaca MicroBeta Trilux (Perkin Elmer) .

Para determinación de IC50, el porcentaje de inhibición para cada concentración se calculó usando la relación de conteo de escintilación de controles corridos en cada placa. Los datos de concentración de compuesto de diez puntos se ajustaron subsecuentemente a una ecuación logística de cuatro parámetros usando ActivityBase 4.0. Los valores IC50 absolutos se calcularon de la curva resultante. Los compuestos de la invención son probados en esta corrida de ensayo sustancialmente como anteriormente. Por ejemplo, el compuesto del Ejemplo 1 se probó y encontró por tener un IC50 de <0.001 µ? (n = 6). Además, el compuesto del Ejemplo 2 se probó y encontró por tener un IC50 de <0.001 µ? (n = 3) . Estos resultados indican que los compuestos dentro del alcance de la presente invención son potentes inhibidores de Chk1 .

Ensayo Bioquímico de Chk2 El efecto de los compuestos en la actividad bioquímica de Chk2 se puede determinar usando un ensayo de enlace de filtro peptídico de sustrato CHK2. En este ensayo, un péptido sintético con base en los residuos de la secuencia de aminoácido 206-225 de Cdc25C, se usó como un sustrato fosfo-aceptor para la proteína cinasa Chk2 recombinante. Usando ?-33?-??? como el sustrato fosfo-donador, el Chk2 transfiere el grupo y-33fosfato radioactivo al péptido sintético. La reacción se midió capturando el sustrato peptídico en una placa de filtro de papel de intercambio catiónico y conteo de escintilacion de partículas beta emitidas.

Las reacciones de cinasa (volúmenes de reacción de 40 µ?) se realizaron en placas de poliestireno en forma de V de 96 cavidades. Las reacciones se iniciaron con la adición de la enzima Chk2. Las condiciones de reacción final son 67 mM de sal sódica de HEPES pH 7.4, 0.007% (v/v) TRITON™ X-100, 2.7 mM de DTT, 2.7 mM de MgCI2, 12 µ? de sustrato peptídico, 60 µ? de sal disódica de ATP, 0.75 pCi ?-33P-ATP, 1.4 nM de enzima Chk2 activa, 4% (v/v) de DMSO y dilución serial del compuesto (dilución serial 1:3, partiendo a 20 µ?, 10 puntos).

Después de la adición de la enzima Chk2, las reacciones se incubaron a temperatura ambiente por 90 min, y después terminaron con la adición de 140 µ? de ácido fosfórico. La mezcla de reacción se transfirió a las cavidades correspondientes de una placa de filtro de papel opaca de intercambio catiónico de fosfocelulosa a reposar por 30 min. La placa de filtro se lavó en un colector a vacío con cinco lavados de 200 µ? de 0.5% de ácido fosfórico (v/v). La placa de filtro se secó durante la noche previo a la adición de 40 µ? de Microscint™-20 a cada cavidad de la placa. Después de reposar por 4 h a temperatura ambiente, la radioactividad en la placa se midió usando un contador de escintilación de microplaca MicroBeta Trilux (Perkin Elmer).

Para determinación de IC50, el porcentaje de inhibición por cada concentración se calculó usando la relación TR-FRET de controles corridos en cada placa. Los datos de concentración de compuesto de diez puntos se ajustaron subsecuentemente a una ecuación logística de cuatro parámetros usando ActivityBase 4.0. Los valores IC50 absolutos se calcularon de la curva resultante. Compuestos de la invención son probados en esta corrida de ensayo sustancialmente como anteriormente. Por ejemplo, el compuesto del Ejemplo 1 se probó y encontró por tener un IC50 de 0.011 µ? (SE = 0.002, n = 6). Además, el compuesto del Ejemplo 2 se probó y encontró por tener un IC50 de 0.012 µ? (SE = 0.008, n = 3). Estos resultados indican que los compuestos dentro del alcance de la presente invención son potentes inhibidores de Chk2.

Ensayo a Base de Célula de Autofosforilación de Chk1 Un inhibidor de Chk1 prevendrá la actividad de cinasa de la proteína de sustratos fosforilantes en células en las cuales se ha activado la respuesta al daño de DNA. Un sustrato fácilmente detectable para Chk1 es un sitio de autofosforilación en Chk1 mismo, serina 296. Después, el ensayo de inmunomanchado puede ser usado para medir la cantidad de fosforilación de serina 296 en Chk1 e indirectamente el nivel de actividad de la proteína cinasa Chk1. Las células HeLa son cultivadas en solución de Sal Balanceada de Earle /p de E con L-glutamina suplementada con 10% (v/v) de suero bovino fetal inactivado por calor, aminoácidos no esenciales 1x MEM, piruvato de sodio 1x y 1 * 105 células plaqueadas en 600 µ? de medio de cultivo MEM por cavidad de una placa de cultivo de 24 cavidades. Las células se incubaron por 24 h a 37 °C, 5% de C02 y 95%-100% de humedad. Dieciséis µ? de una solución base de doxorubicina de 4 µ? en medio de cultivo se agregaron a cada cavidad apropiada para hacer una concentración final de 100 nM de doxorubicina. Las placas se regresaron a la incubadora por 24 horas adicionales previo a la adición del compuesto inhibidor de Chk1. Los compuestos son solubilizados en 10 mM en 100% de DMSO, después se diluyeron a 2 mM en 40% (v/v) de DMSO y después se diluyeron a 100 µ? con medio de cultivo más 4% (v/v) de DIVISO. Subsecuentemente, se prepararon diluciones seriales de los compuestos (1:3) sobre un intervalo de 100 µ? a 0.005 µ?. Sesenta y seis µ? de solución base del compuesto se agregaron a las cavidades apropiadas en la placa para producir una concentración final de DMSO de 0.4% (v/v) y un rango de concentración de compuesto final entre 1 µ? y 0.0005 µ?. Las placas se regresaron a la incubadora por unas 2h adicionales y después se removieron por lisis celular y procesamiento. El medio después se removió de la placa, cada cavidad se lavó una vez con 0.5 mi de Salina Amortiguada con Fosfato de Dulbecco (DPBS) enfriada en hielo, todo el líquido se removió, y la placa se colocó en hielo por el resto del procedimiento. A cada cavidad se agregó 75 µ? de amortiguador de lisis enfriada en hielo, que consiste de Amortiguador de Extracción Celular que contiene cóctel inhibidor de fosfatasa (Sigma, cat# P0044 + P5725) y tabletas de cóctel inhibidor de proteasa (Roche Diagnostics, cat# 11836153001). Después de 10 min cada cavidad se raspó y el lisado se transfirió en un tubo microcentrífugo de polipropileno de 1.5 mi en hielo. Cada lisado se sónico por 45 seg en un sonicador cuphor de placa (Misonix) mientras se suspende en un baño de agua/hielo. Cincuenta µ? de cada muestra se transfirieron en un tubo microcentrífugo de polipropileno de 0.5 mi que contiene 25 µ? de Amortiguador de Muestra Laemmli 4x, se calentó a 95 °C por 5 min y almacenó congelada a -80 °C. El lisado restante se usó para determinación de concentración de proteína (kit de ensayo de proteína BCA, Thermo Scientific). Cinco µg de cada lisado celular en la muestra de amortiguador se aplicó a un gel de 96 cavidades E-Page y sometió a electroforesis. Las proteínas son electrotransferidas del gel a una membrana PVDF Immobilon-P (0.45 µ?t?) de conformidad con procedimientos bien entendidos en la técnica (Towbin et al., PNAS (1979) 76(9), 4350-4). La membrana se enjuagó brevemente con 10 mM de Tris/HCI pH 8.0, 150 mM de NaCI y 0.05% (v/v) de Tween 20 (TBST) y remojó por una hora a 25 °C en TBST/5% (v/v) de leche instantánea reconstituida Carnation®. La membrana se lavó cuatro veces con TBST por 5 min, después se remojó a 4 °C por 24 h en TBST/5% (w/v) de albúmina de suero bovino con una dilución apropiada de anti-fosfo-Chkl de conejo (serina 296). La membrana se lavó 4* con TBST por 5 min a 25 °C y después remojó a 25 °C por 2 h en TBST/5% de leche que contiene una dilución apropiada de IgG anticonejo de mono a peroxidasa de rábano picante (GE Healthcare, cat# NA9340) para detectar la proteína Chk1 autofosforilada. La membrana se lavó nuevamente 4* con TBST por 5 min a 25 °C. Conjugados de antígeno-anticuerpo-reportero inmovilizados en la membrana se detectaron con el reactivo de detección HRP Super Signal Western Femto usando un sistema de imagen FUJI LAS-4000. Se calcularon las intensidades de banda Fosfo-Chk1 (ser296) usando software "Total Lab" (Nonlinear Dynamics). El porcentaje de inhibición de la autofosforilación de Chk1 inducida por doxorubicina se calculó usando la siguiente fórmula: % de inhibición = (muestra-intensidad de banda fosfo-Chkl-control negativo sin doxorubicina-intensidad de banda fosfo-Chk1 )/(control positivo de doxorubicina-intensidad de banda fosfo-Chkl-control negativo sin doxorubicina-intensidad de banda fosfo-Chkl) * 100. Los compuestos de la invención son probados en esta corrida de ensayo sustancialmente como anteriormente. El compuesto del Ejemplo 1 se probó en este ensayo y encontró por tener un EC50 de <0.001 µ? (n = 1). El compuesto del Ejemplo 3 se probó en este ensayo y encontró por tener un EC50 de <0.001 µ? (n = 1). Estos resultados indican que los compuestos dentro del alcance de la presente invención son potentes inhibidores de Chk1.

Ensayo de Agudeza con Base en Células Hela de Anulación de Punto de Verificación de G2M Inducido por Doxorubicina Un inhibidor de Chk1 inhabilitará el punto de verificación de daño al DNA por G2M en células de tumor menos-p53 tratadas con el inhibidor de toposiomerasa II, doxorubicina. Una medición de la anulación del punto de verificación G2M es la fosforilación de histona H3 en serina 10 que ocurre después que las células viajan al punto de verificación G2M y entran a la mitosis. El siguiente ensayo de imagen de alto contenido puede ser usado para medir la fosforilación de histona H3 en células. Las células HeLa se cultivaron en medio MEM suplementado con 10% (v/v) de FBS y colocaron en placas a 2000 células por cavidad en placas negras de fondo transparente revestidas con poli D-lisina, 100 µ? volúmenes por cavidad. Las placas son entonces incubadas en una incubadora de cultivo celular por 18-24 h (37 °C, 5% C02 y 95% de humedad relativa). Después de la incubación inicial, 20 µ? de medio MEM más 10% de FBS que contiene 625 nM de doxorubicina se agregaron a las cavidades apropiadas de las placas resultando en una concentración final de 125 nM. Las placas se regresaron a la incubadora por 24 h, suficiente para detener las células en el punto de verificación G2M. Al siguiente día las células son tratadas con los compuestos. Los compuestos son solubilizados de manera suficiente para detener las células en el punto de verificación G2M. Al siguiente día las células son tratadas con compuestos. Los compuestos son solubilizados a 10 mM en 100% de DMSO y después diluidos a solución base 10* partiendo a 50 µ? en MEM más 4% (v/v) de DMSO. Subsecuentemente, se prepararon diluciones seriales de los compuestos (1:2) sobre un intervalo 50 µ? a 0.39 µ?. Treinta µ? de solución base del compuesto se agregaron a las cavidades apropiadas en la placa para producir una concentración final de DMSO de 0.4% y un rango de concentración de compuesto final entre 5 µ? y 0.039 µ?. Las placas se regresaron a la incubadora por unas 7h adicionales y después se removieron por fijación. El líquido se removió cuidadosamente de cada cavidad y se agregaron 100 µ? de fijativo PREFER™. Las placas se retuvieron a temperatura ambiente por 20 min, el fijativo se removió y las células entonces se permeabilizaron por la adición de 100 µ?/cavidad de 0.1% (v/v) de Tritón® X 100 en DPBS por 10 min. La solución se removió y la placa se lavó dos veces con 100 µ? de DPBS por cavidad seguido por la adición de 100 µ? de DPBS que contiene 50 pg/ml de Ribonucleasa A (RNAasa, de páncreas bovino) por una hora a temperatura ambiente. La solución de RNAsa se removió y las células se tiñeron por la presencia de histona H3 fosforilada en serina 10 (pHH3) agregando a cada cavidad 50 µ? de solución de RNAsa que contiene una dilución 1:500 de anti-pHH3 de conejo (ser10) más 1% (p/v) BSA. Las placas se sellaron y mantuvieron a 4°C durante la noche. El anticuerpo primario se removió lavando cada placa dos veces con 1 00 µ? de DPBS por cavidad y se colocó en placa nuevamente con 50 µ? de una dilución 1 :750 de IgG anti-conejo de cabra de Alexa Fluor® 488 (H + L) (2 mg/ml) en DPBS más 1 % (p/v) de BSA. Las placas se mantuvieron por una hora a temperatura ambiente cubiertas con papel aluminio para protegerlas de la luz. Las placas se lavaron nuevamente dos veces con 100 µ? por cavidad de DPBS y colocaron nuevamente en placas con 1 00 pL de 15 nM de yoduro de propidio (dilución 1 : 100 con PBS de la solución original). Las placas son selladas con un sello negro para proteger las placas de la luz. Las placas se incubaron por 30 min para teñir los núcleos. Las placas son barridas con citómetros de microplaca fluorescente de barrido láser ACUMEN EXPLORER™ usando excitación de 488 nm (TTP LABTECH LTC) para medir el pHH3 y contenido de DNA que incluye 2N, y 4N . Las células pHH3 positivas se identificaron por intensidad media a 51 9 nm de Alexa 488. La intensidad total a 655-705 nm de yoduro de propidio/DNA se usó para identificar células individuales y subpoblaciones en ciclo celular (células 2N, células 4N) . La lectura final para cada población se determinó normalizando al % de células totales produciendo un rendimiento de ensayo final de % pHH3, % 2N , y % 4N. Después se determina el 100% de actividad tratando células con la concentración máxima de un compuesto de control inhibidor a 1 00 nM para determinar el % de actividad final de cada compuesto. El %0 de actividad se basa en tratamiento sin compuesto. El EC50 relativo se determinó usando ACTIVITY BASE , ajuste Excel, ajuste de curva, usando un ajuste logístico de cuatro parámetros, ecuación 205, para determinar el % de pHH3 relativo a máximo control a 100%. Los compuestos de la invención son probados en esta corrida de ensayo sustancialmente como anteriormente. El compuesto del Ejemplo 1 se probó y encontró por tener un EC5- de 0.029 µ? (n = 1). Los compuestos de Ejemplo 2 y Ejemplo 3 son probados y se encontró que tienen resultados EC50 de 0.033 µ? (n = 1) y 0.019 µ? (n = 1) respectivamente. Estos resultados indican que los compuestos dentro del alcance de la presente invención inhabilitarán el punto de verificación de daño al DNA G2M.

Ensayo ECtfs (Sensibilización doble) Un inhibidor de Chk1 puede potenciar la actividad anti-proliferativa de gemcitabina (u otros tóxicos) a través de la anulación del punto de verificación de fase intra-S, resultando en daño al DNA incrementado y sostenido. La capacidad de proliferación de célula de tumor continuada después del daño al DNA se puede analizar determinando la capacidad de las células para replicar su DNA. Este ensayo valora la capacidad de las células para replicar su DNA después que las células han tenido una oportunidad para reparar el daño al DNA. En este ensayo, las células son tratadas con una serie de diluciones de gemcitabina, y luego 22 horas después con el compuesto del Ejemplo 3. Después de 44 h adicionales, el número de células relativas se valora por un ensayo de reducción de tinte MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio). El parámetro de ECtfS es una medida de la concentración de un inhibidor de Chk1 necesario para reducir la mitad de la concentración GI90 de gemcitabina , medida en este ensayo en la ausencia de inhibición de Chk1 . Se hicieron crecer células HT-29 (obtenidas de ATCC), en RPMI 1 640 más 1 0% (v/v) de FBS inactivado por calor. Las células se plaquearon a 2.5 * 103 por cavidad, en un volumen de 100 µ? en placas de cultivo de tejido de 96 cavidades e incubaron por 24 h. Se prepararon diluciones de gemcitabina a concentraciones 6x en medio McCoy's 5A (modificado) (1 x) y se agregaron a cavidades a 20 µ? por cavidad. Las diluciones de gemcitabina se ajustaron con la concentración final más alta de gemcitabina siendo 1 .0 pm y se hicieron diluciones por etapas triples a 0.5 nM.

El inhibidor Chk1 se preparó por diluciones en DMSO a una concentración final 4000x, y después se diluyó 666 veces en medio McCoy's para generar soluciones base 6x. Las diluciones de inhibidor Chk1 procedieron por etapas de 2.5 veces partiendo de 25 nM bajando a 0.3 nM. Veintidós horas después de la adición de gemcitabina, se agregó el inhibidor de Chk1 en un volumen de 24 µ? a cavidades que contienen 120 µ? de medio más gemcitabina. Cada dilución de gemcitabina recibe una dilución única de inhibidor de Chk1 . Las cavidades de control recibieron DMSO, gemcitabina, o inhibidor Chk1 solo. Cuarenta horas después de la adición de inhibidor Chk1 , 30 µ? de reactivo de ensayo AQue0Us CelITiter 96® se agregaron a cada cavidad y se mantuvo a temperatura ambiente por 1 hora y 45 minutos. Se leyó la absorbancia en un espectrofotómetro SpectraMax 250 (Molecular Devices) a 490 nm . Los datos a partir del espectrofotómetro SpectraMax son analizados con GraphPad Prism 4.0. Primero, una absorbencia de control sin célula promedio se sustrajo de todos los otros valores en la matriz de datos a partir de cada placa. Después, se promediaron los puntos de datos duplicados. Los datos se normalizaron para cada concentración de inhibidor Chk1 , con 0% de número de célu las ajustado como A490 corregido = 0, y 1 00% de número de células ajustado como el valor medio de gemcitabina 0 nM. Estos resultados son después transformados. Las concentraciones de gemcitabina son convertidas a concentraciones log y los valores de números de células normalizadas se convirtieron a porcentaje de inhibición (porcentaje de inhibición = 1 00 - valor normalizado). Los datos transformados son trazados, y se corrió una regresión no lineal para estimar un valor IC50 para gemcitabina a cada concentración de inhibidor Chk1 . La regresión no lineal se calculó permitiendo variar la inclinación, y sin restricciones para la cima o fondo de las curvas de respuesta de dosis. El valor ECt(s se calculó como sigue: se determinaron los valores Gl50 para gemcitabina por cada concentración de inhibidor Chk1 , trazaron, y la concentración del inhibidor Chk1 necesaria para reducir la gemcitabina sola GI5o dos veces, se determinó por interpolación.

Los compuestos dentro del alcance de la invención son probados en esta corrida de ensayo sustancialmente como anteriormente. Por ejemplo, el compuesto del Ejemplo 3 se probó y encontró por tener un valor ECtfs de 1 .0 nM (SE = 0. 1 , n = 3). Además, 25 nM del compuesto reducen el EC50 de gemcitabina 7 veces de 22 nM a 3 nM en células de carcinoma de colon HT-29. Solo, 25 nM del compuesto del Ejemplo 3 tiene poco efecto en la proliferación de células HT-29. Estos resultados indican que los compuestos dentro del alcance de la presente invención efectivamente potencian la actividad anti-proliferativa de gemcitabina a bajas concentraciones.

Valores IC50 de gemcitabina obtenidos con tratamiento de varias concentraciones del Ejemplo 3 Ensayo de Inhibición Objetivo in vivo de Chk1 Se cultivaron células Calu-6 en medio de crecimiento (MEM con Solución de Sal Balanceada Earle's con L-glutamina suplementada con 10% (v/v) de FBS inactivado por calor, aminoácidos no esenciales MEM 1x, piruvato de sodio 1x) y expandieron. Las células se recolectaron y lavaron dos veces con salina amortiguada de fosfato y 1 x 106 células en medio de crecimiento (sin suero) son mezcladas con volumen igual de matriz BD Matrigel , después inyectadas subcutáneamente en el flanco de ratones sin pelo (sin pelo atímicos) pre-irradiados (4.5 Gy). 15 días después del implante (tamaño del tumor = 150-200 mm3), gemcitabina fresca formulada en salina diaria se administra a animales por ruta intraperitoneal a dosis de 150 mg/kg. Seis horas después los animales son oralmente administrados con el compuesto Chk1 formulado en 0.2% de Tween-80/0.5% de metilcelulosa ajustado de pH a 6.8 por adición de NaOH diluido. Los animales se sacrificaron 2h posterior a la dosis del inhibidor Chk1, los tumores se recolectaron e inmediatamente procesaron en amortiguador de Extracción de Células enfriadas en hielo que contienen cóctel inhibidor de fosfatasa (Sigma, cat# P0044 + P5725) y tabletas de cóctel inhibidor de proteasa (Roche Diagnostics, cat# 11836153001). Los tumores se procesaron en 1.5-2.0 mi de amortiguador de lisis en un tubo cónico de polipropileno de 15 mi enfriado usando un homogenizador de tejido motorizado ajustado a alto por 15 seg. Con la muestra mantenida en hielo, el Usado se retira cuatro veces a través de una jeringa de 1 mi con una aguja de calibre 25. 0.35 mi de lisado de tumor se transfirieron en un tubo microcentrífugo de polipropileno de 1.5 mi que contiene 0.15 mi de amortiguador de muestra Laemmli 4x. La muestra después se mezcló y calentó por 5 min a 95 °C y sónico por 1 min usando alta energía en un sonicador de cuerno de placa isonix 3000. Las muestras son después almacenadas en hielo, o almacenadas a -80 °C para valoración de inhibición objetivo por manchado western. Cinco pg de cada lisado de tumor en amortiguador de muestra se aplicaron a geles de 96 cavidades E-Page y sometieron a electroforesis. Las proteínas son transferidas a membrana Protran BA83 de nitrocelulosa (Whatman, Cat# 10402405) de conformidad con procedimientos bien entendidos en la técnica (Towbin et al., PNAS (1979) 76(9), 4350-4). La membrana después se procesó para medir la proteína Chk1 autofosforilada en serina 296. La membrana se enjuagó brevemente con agua, después 10 mM de Tris/HCI pH 8.0, 150 mM de NaCI y 0.05% (v/v) de Tween 20 ( TBST) y remojó por una hora a 25 °C en TBST/ 5% (p/v) de leche instantánea Carnation reconstituida. La membrana después se lavó cuatro veces con TBST por 5 min. La membrana se remojó a 4 °C por 16 h en TBST/5% (p/v) de BSA en una dilución apropiada de -fosfo-Chkl-anti-fosfo-Chkl de conejo (serina 296). Después la membrana se lavó cuatro veces con TBST por 5 min a 25 °C y después remojó a 25 °C por 2 h en TBST/ 5% de leche que contiene una dilución apropiada de IgG anti-conejo de mono conjugado a peroxidasa de rábano picante para detectar fosfo-Chkl (ser 296). La membrana se lavó nuevamente cuatro veces con TBST por 5 min a 25 °C. Los conjugados de antígeno-anticuerpo-reportero inmovilizados en la membrana son detectados con el reactivo de detección HRP Super Signal Western Femto.

Se detectaron señales y capturaron usando el sistema de imagen FUJI LAS-4000. Se calcularon las intensidades de banda Fosfo-Chkl (ser296) usando software "Total Lab" (Nonlinear Dynamics). El porcentaje de inhibición de la autofosforilación de Chk1 inducida por gemcitabina se calculó usando la siguiente fórmula: % de inhibición = (muestra -intensidad de banda fosfo-Chkl- control positivo de gemcitabina promedio (Max) - intensidad de banda fosfo-Chkl )/(control negativo promedio (Min) -intensidad de banda fosfor-Chkl- control positivo de gemcitabina promedio (Max) - intensidad de banda fosfo-Chkl) x 100.

Los compuestos dentro del alcance de la invención son probados en esta corrida de ensayo sustancialmente como anteriormente. Por ejemplo, el compuesto del Ejemplo 3 se probó y encontró por tener una Dosis Efectiva Moduladora Objetivo 50 (TMED50) para autofosforilación de Chk1 de 1.3 mg/kg (n = 1). Este resultado indica que compuestos dentro del alcance de la presente invención inhiben potencialmente la activación de la proteína cinasa Chk1 in vivo.

Modelos de Injerto Heterologo en Tumor Humano La capacidad de las Chk1 inhibidoras para potenciar la eliminación tumoral por agentes que dañan el DNA se puede determinar in vivo usando los modelos de eficacia de injerto heterologo en tumor de colon HT-29 y pulmón Calu-6. Las células de cáncer de pulmón Calu-6 se cultivaron en medio de crecimiento (MEM con Solución de Sal Balanceada Earle's con L-glutamina suplementada con 10% (v/v) de FBS inactivado por calor, aminoácidos no esenciales MEM 1x, piruvato de sodio 1x) y células de cáncer de colon HT-29 (ATCC), se cultivaron en medio de crecimiento, (medio McCoy's 5A suplementado con 10% de FBS) y expandieron.

Las células se recolectaron y lavaron dos veces con salina amortiguada de fosfato y las células 5 * 10e (HT-29) o 1 ? 106 células (Calu-6) en medio de crecimiento (sin suero) se mezclaron con volumen igual de matriz BD Matrigel™, después inyectaron subcutáneamente en el flanco de ratones sin pelo (CD-1 nu/nu).

Administración Subcutánea de Inhibidor Chk1 A aproximadamente 16 días después del implante (150-200 mm3), se formuló gemcitabina fresca en salina diaria y administró a animales por ruta intraperitoneal a dosis de 60 mg/kg. Veinticuatro horas después los animales son administrados con el compuesto del Ejemplo 3, en 0.2% de Tween-80/0.5% de metilcelulosa subcutáneamente BID. Después de dos días de detención, la dosificación se repitió por tres ciclos adicionales (Q4Dx4 con el compuesto del Ejemplo 3 compensado +24 horas). Se calculó la inhibición de crecimiento del tumor (TGI) como el porcentaje de reducción en un tamaño de tumor medio de un grupo tratado de compuesto a partir del tamaño de tumor medio del grupo de control tratado con vehículo. Los compuestos dentro del alcance de la invención son probados en esta corrida de ensayo sustancialmente como anteriormente. Por ejemplo, el compuesto del Ejemplo 3 dosificado en combinación con gemcitabina se encontró que demuestra excelente actividad anti-tumoral dependiente de la dosis en tanto los modelos de injerto heterólogo de tumor HT-29 como Calu-6, con hasta un incremento de seis veces en inhibición de crecimiento de tumor sobre gemcitabina sola. Estos resultados indican que compuestos dentro del alcance de la presente invención administrados subcutáneamente incrementan significativamente la actividad anti-tumoral de gemcitabina en modelos de injerto meteorólogo en tumor humano.

HT29 subcutáneas ns = no estad ísticamente sig nificativo Calu 6 subcutáneas ns = no estadísticamente significativo Administración Oral de Inhibidor Chk1 A aproximadamente el día 16 después del implante (150-200 mm3), se formuló gemcitablna fresca en salina diaria y administró a animales por ruta intraperitoneal a dosis de 40 mg/kg. Veinticuatro horas después los animales son administrados con el compuesto Chk1, en 0.2% de Tween-80/0.5% de metilcelulosa por ruta oral BID. Después de tres días de detención, la dosificación se repitió por tres ciclos adicionales (Q5Dx4 con el compuesto del Ejemplo 3 compensado +24 horas). La inhibición de crecimiento del tumor (TGI) se calculó como se describe en el párrafo previo. Los compuestos dentro del alcance de la invención son probados en esta corrida de ensayo sustancialmente como anteriormente. Por ejemplo, el compuesto del Ejemplo 3 es dosificado en combinación con gemcitabina y se encuentra demostrar excelente actividad anti-tumoral dependiente de la dosis en tanto los modelos de injerto heterólogo de tumor HT-29 como Calu-6, con hasta incremento de 2.9 veces en inhibición de crecimiento de tumor sobre gemcitabina sola. Este resultado indica que los compuestos dentro del alcance de la presente invención administrados oralmente incrementan significativamente la actividad-antitumoral de gemcitabina en modelos de injerto heterólogo de tumor humano.

Calu6 oral 29 Oral

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto caracterizado porque es (R)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

2. El compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado porque es ( ?)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina.

3. El compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado porque es sal de ácido metansulfónico de (R)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-p¡razol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina.

4. El compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado porque es sal de ácido acético de (R)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina.

5. El compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado porque es sal de hemioxalato de (f?)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina.

6. El compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado porque es sal de hemisuccinato de (R)-[5-(2-metoxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-iloxi)-pirazin-2-il]-amina.

7. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el compuesto o sal de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1-6, y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

8. Un método para tratar cáncer, caracterizado porque comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad efectiva del compuesto o sal de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1-6.

9. Un método para tratar cáncer, caracterizado porque comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad efectiva del compuesto o sal de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1-6 y radiación ionizante.

10. Un método para tratar cáncer, caracterizado porque comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad efectiva del compuesto o sal de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1-6 y uno o más agentes de quimioterapia.

11. El método de conformidad con la Reivindicación 10, caracterizado porque uno o más agentes de quimioterapia son seleccionados del grupo que consiste de 5-fluorouracilo, hidroxiurea, gemcitabina, metotrexato, pemetrexed, doxorubicina, etopósido, cisplatino, y taxol.

12. El método de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 8-11, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer gástrico, cáncer hepático, cáncer pulmonar, cáncer de mama, melanoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, mesotelioma, cáncer renal y cáncer uterino.

13. El compuesto o sal de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1-6, para uso en terapia.

14. El compuesto o sal de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1-6, para uso en el tratamiento de cáncer.

15. El compuesto o sal de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1-6, para uso en combinación simultánea, separada o secuencial con radiación ionizante en el tratamiento de cáncer.

16. El compuesto o sal de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1-6, para uso en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más agentes de quimioterapia en el tratamiento de cáncer.

17. El compuesto o sal para uso de conformidad con la Reivindicación 16, en donde uno o más agentes de quimioterapia son seleccionados del grupo que consiste de 5-fluorouracilo, hidroxiurea, gemcitabina, metotrexato, pemetrexed, doxorubicina, etopósido, cisplatino, y taxol.

18. El compuesto o sal para uso de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 14-17, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer gástrico, cáncer hepático, cáncer pulmonar, cáncer de mama, melanoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, mesotelioma, cáncer renal y cáncer uterino.

19. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el compuesto o sal de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1-6, junto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos.