CN103180311A - 可用于抑制chk1的化合物 - Google Patents

可用于抑制chk1的化合物 Download PDF

Info

Publication number
CN103180311A
CN103180311A CN2011800537798A CN201180053779A CN103180311A CN 103180311 A CN103180311 A CN 103180311A CN 2011800537798 A CN2011800537798 A CN 2011800537798A CN 201180053779 A CN201180053779 A CN 201180053779A CN 103180311 A CN103180311 A CN 103180311A
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
cancer
salt
methyl
pyridin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2011800537798A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103180311B (zh
Inventor
S.约瑟夫
S.萨马达
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eli Lilly and Co
Original Assignee
Eli Lilly and Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eli Lilly and Co filed Critical Eli Lilly and Co
Publication of CN103180311A publication Critical patent/CN103180311A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103180311B publication Critical patent/CN103180311B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/4965—Non-condensed pyrazines
    • A61K31/497—Non-condensed pyrazines containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C309/00—Sulfonic acids; Halides, esters, or anhydrides thereof
    • C07C309/01—Sulfonic acids
    • C07C309/02—Sulfonic acids having sulfo groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C309/03—Sulfonic acids having sulfo groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C07C309/04—Sulfonic acids having sulfo groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton containing only one sulfo group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C53/00—Saturated compounds having only one carboxyl group bound to an acyclic carbon atom or hydrogen
    • C07C53/08—Acetic acid
    • C07C53/10—Salts thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C55/00—Saturated compounds having more than one carboxyl group bound to acyclic carbon atoms
    • C07C55/02—Dicarboxylic acids
    • C07C55/06—Oxalic acid
    • C07C55/07—Salts thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C55/00—Saturated compounds having more than one carboxyl group bound to acyclic carbon atoms
    • C07C55/02—Dicarboxylic acids
    • C07C55/10—Succinic acid

Abstract

本发明提供抑制CHK1并可用于治疗癌症的氨基吡唑化合物或其可药用盐。

Description

可用于抑制CHK1的化合物
本发明涉及抑制Chk1并可用于治疗以脱氧核糖核酸(DNA)复制、染色体分离和/或细胞分裂中的缺陷为特征的癌症的氨基吡唑化合物或其可药用盐。
Chk1是在DNA损伤检验点信号转导通路中位于Atm和/或Atr下游的蛋白激酶。在哺乳动物细胞中，Chk1响应造成DNA损伤的因素(agents)（包括电离辐射（IR）、紫外（UV）光和羟基脲）磷酸化。活化哺乳动物细胞中的Chk1的这种磷酸化依赖于Atr。Chk1在Atr依赖性DNA损伤检验点中发挥作用，以致停滞在S期和G2M。Chk1使Cdc25A（正常地使细胞周期蛋白E/Cdk2脱磷酸化的双特异性磷酸酶）磷酸化和失活，以致通过S-期的进程停止。Chk1还使Cdc25C（使细胞周期蛋白B/Cdc2（也称作Cdk1）脱磷酸化的双特异性磷酸酶）磷酸化和失活，以致细胞周期进程停滞在G2与有丝分裂的边界（Furnari等, Science, 277:1495-7, 1997）。在这两种情况下，Cdk活性的调节都诱导细胞周期停滞以阻碍细胞在DNA损伤或未复制的DNA存在下进入有丝分裂。
已经报道了Chk1的各种抑制剂。此外，WO 2005/121121公开了声称是葡萄糖代谢的调节剂的某些氨基吡唑化合物。
但是，仍然需要作为细胞周期检验点的有力抑制剂的Chk1抑制剂，其可有效充当DNA损伤剂的增效剂。本发明提供作为Chk1的有力抑制剂的化合物，其有益于癌症治疗。该化合物在组织培养物中和在体内有力地消除用DNA损伤剂治疗诱导的Chk1介导的细胞周期停滞。另外，本发明的化合物提供Chk2的抑制，这可能有益于癌症治疗。此外，本发明的化合物通过依赖于Chk1抑制的机制抑制癌细胞的细胞增殖。这样的新型化合物可解决对癌症的安全有效治疗的需求。
本发明提供化合物(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺或其可药用盐。优选实施方案是(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺、(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺甲磺酸盐、(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺乙酸盐、(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺半草酸盐和(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺半琥珀酸盐。
作为具体实施方案，本发明提供化合物(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺。
本发明提供(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺的甲磺酸盐、乙酸盐、半草酸盐和半琥珀酸盐。
另一实施方案是(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺的水合物。
本发明提供结晶形式的(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺水合物。
本发明还提供以具有位于5.17的在2θ ± 0.2的峰以及一个或多个选自15.73、17.71和20.12的峰的X-射线粉末衍射图为特征的结晶形式的(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺水合物。
本发明提供包含(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺或其可药用盐和可药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
本发明提供包含(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺或其可药用盐以及可药用载体、稀释剂或赋形剂和任选其它治疗成分的药物组合物。
本发明提供治疗癌症的方法，包括向需要其的患者施用有效量的(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺或其可药用盐。此外，本发明还提供治疗癌症的方法，包括向需要其的患者施用有效量的(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺或其可药用盐和电离辐射。此外，本发明提供治疗癌症的方法，包括向需要其的患者施用有效量的(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺或其可药用盐和一种或多种化疗剂。
本发明提供(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺或其可药用盐用于制备癌症治疗药物的用途。此外，本发明还提供(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺或其可药用盐用于制备癌症治疗药物的用途，其中所述治疗包含与电离辐射联合治疗。此外，本发明提供(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺或其可药用盐用于制备通过联合疗法治疗癌症的药物的用途，其中所述联合疗法治疗包括向相同患者施用所述药物和施用一种或多种化疗剂。
本发明提供用于治疗的(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺或其可药用盐。此外，本发明还提供用于治疗的(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺或其可药用盐和电离辐射。此外，本发明提供用于治疗的(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺或其可药用盐和一种或多种化疗剂。
本发明提供用于治疗癌症的(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺或其可药用盐。此外，本发明还提供用于治疗癌症的(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺或其可药用盐和电离辐射。此外，本发明提供用于治疗癌症的(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺或其可药用盐和一种或多种化疗剂。
本发明提供(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺或其可药用盐用于制备癌症治疗药物的用途，其中所述药物与电离辐射同时、分开或相继给药。
本发明提供(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺或其可药用盐用于制备癌症治疗药物的用途，其中所述药物还包含一种或多种化疗剂或与一种或多种化疗剂同时、分开或相继给药。
本发明提供在癌症治疗中与电离辐射同时、分开或相继联合使用的(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺或其可药用盐。
本发明提供在癌症治疗中与一种或多种化疗剂同时、分开或相继联合使用的(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺或其可药用盐。
此外，本发明提供如本文所述的方法和用途的优选实施方案，其中所述一种或多种化疗剂选自5-氟尿嘧啶、羟基脲、吉西他滨、甲氨喋呤、培美曲塞(pemetrexed)、阿霉素、依托泊苷、顺铂和紫杉醇。另外，本发明提供如本文所述的方法和用途的更优选实施方案，其中两种化疗剂选自5-氟尿嘧啶、羟基脲、吉西他滨、甲氨喋呤、培美曲塞、阿霉素、依托泊苷、顺铂和紫杉醇。本发明还提供如本文所述的方法和用途的更优选实施方案，其中化疗剂选自5-氟尿嘧啶、羟基脲、吉西他滨、甲氨喋呤、培美曲塞、阿霉素、依托泊苷、顺铂和紫杉醇。本文所述的方法和用途的优选实施方案是选自膀胱癌、结肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、间皮瘤、肾癌和子宫癌的癌症。
如上文和发明说明书通篇所用，除非另行指明，下列术语应被理解为具有下列含义：
“可药用盐(pharmaceutically acceptable salt)”或“可药用盐(pharmaceutically acceptable salts)”是指本发明的化合物的相对无毒、无机和有机的盐。
本发明的化合物能够例如与许多无机和有机酸反应形成可药用盐。这样的可药用盐及其常用制备方法是本领域中熟知的。参见例如P. Stahl等，Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, (VCHA/Wiley-VCH, 2002)；S.M. Berge等, “Pharmaceutical Salts”, Journal of Pharmaceutical Sciences, 第66卷, No. 1, 1977年1月。
本发明的化合物优选使用一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂配制成药物组合物并通过各种途径给药。这样的组合物优选用于口服、皮下或静脉给药。这样的药物组合物及其制备方法是本领域中熟知的。参见例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro等编著, 第21版, Mack Publishing Co., 2005)。
术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”、“治疗(treating)”等意在包括减慢或逆转病症的进程。这些术语还包括缓和、改善、减弱、消除或减轻病症或病况的一个或多个症状，即使没有实际消除该病症或病况和即使该病症或病况的进程本身没有减慢或逆转。
“治疗有效量”或“有效量”是指引发研究人员、兽医、医师或其他临床医师追求的组织、系统、动物、哺乳动物或人的生物或医疗响应和对组织、系统、动物、哺乳动物或人的所需治疗作用的本发明的化合物或其可药用盐或含有本发明的化合物或其可药用盐的药物组合物的量。
医师会在相关情况（包括要治疗的病症、所选给药途径、施用的本发明的实际化合物、个别患者的年龄、体重和响应和患者症状严重程度）下决定实际施用的本发明的化合物的量。每日剂量通常落在大约0.1至大约10 mg/kg体重的范围内。在一些情况下，低于上述范围下限的剂量水平可能绰绰有余，而在另一些情况中可能仍然使用更大剂量。
可以通过本领域中已知的各种程序以及下列“制品和实施例”中描述的那些程序制备本发明的化合物。所述各途径的具体合成步骤可以以不同方式结合以制备本发明的化合物。
试剂和原材料通常是本领域普通技术人员易得的，或者可以通过有机和杂环化学的标准技术、与合成已知结构类似化合物相似的技术和下列“制品和实施例”中描述的程序（包括任何新颖程序）制造。提供下列制品和实施例以更详细示例本发明并代表该化合物的典型合成。本发明的化合物名称通常由带有Autonom插件的ISIS Draw 2.5 SP2提供。
本文所用的下列术语具有所示含义：“BCA”是指二喹啉甲酸；“BSA”是指牛血清白蛋白；“DMSO”是指二甲亚砜；“DPBS”是指二元磷酸盐缓冲盐水；“DTT”是指二硫苏糖醇；“EtOAc”是指乙酸乙酯；“FBS”是指胎牛血清；“HEPES”是指N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸；“MEM”是指最低必需培养基；“MeOH”是指甲醇；“PBS”是指磷酸盐缓冲盐水；“PI”是指碘化丙啶；“RNAase”是指核糖核酸酶A；“RPMI”是指Roswell Park Memorial Institue；“TBST”是指tris-缓冲盐水吐温-20；“THF”是指四氢呋喃；“TR-FRET”是指时间分辨荧光能量转移；“Tris”是指三(羟甲基)氨基甲烷；“Triton-X”是指4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇聚乙二醇叔辛基苯基醚；和“吐温-20”是指Polysorbate 20。
制品1
(R)-3-(6-氯吡嗪-2-基)氧基哌啶-1-甲酸叔丁酯
Figure 333248DEST_PATH_IMAGE001
将氢化钠（225.6克，5.64摩尔）分散到THF（3升）中并将温度降至0 - 5℃。在使温度保持在0 - 5℃之间的同时经1小时加入(R)-3-羟基-1-叔丁氧基羰基哌啶（891.6克，4.43摩尔）在THF（3升）中的溶液。将该反应搅拌1小时。在保持相同温度的情况下经1.5小时逐滴加入2,6-二氯吡嗪（600克，4.03摩尔）在THF（3升）中的溶液。将该反应在25 - 30℃下搅拌2小时，然后倒在冰上。该混合物用水稀释并用乙酸乙酯萃取。萃取物经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残留油用5%二氯甲烷/己烷碎化(triturate)以产生白色固体形式的产物。过滤收集固体并干燥产生1538克粗材料。粗产物用5%二氯甲烷/己烷再碎化以便以定量收率产生白色固体。
Figure 250389DEST_PATH_IMAGE002
制品2
2-甲氧基-6-甲基-烟酸甲酯
Figure 967809DEST_PATH_IMAGE003
在氮气下在室温下向2-氯-6-甲基-烟酸甲酯（10.4克，56.52毫摩尔）在MeOH中的搅拌溶液中加入钠（2.58克，113.04毫摩尔）在甲醇（80.0毫升）（在氮气气氛下将钠金属溶解在甲醇中）中的溶液。将反应混合物回流过夜。将该反应冷却至室温并用乙酸将pH调节至pH = 7。该反应混合物用乙酸乙酯（100毫升）和水（30毫升）稀释。分离有机层并用乙酸乙酯（2 × 75毫升）萃取水层。合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤并浓缩产生粗产物。
Figure 363018DEST_PATH_IMAGE004
制品3
5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基胺
Figure 364341DEST_PATH_IMAGE005
在- 78℃下将 n-BuLi（1.2 M, 96.0毫升，115.6毫摩尔）添加到乙腈（6.08毫升，115.4毫摩尔）在THF（300毫升）中的溶液中并使其在- 78℃下搅拌30分钟。加入在THF（200毫升）中的2-甲氧基-6-甲基-烟酸甲酯（20克，105.1毫摩尔）并在- 78℃下搅拌另外30分钟。该反应混合物在-78℃下用水（500毫升）猝灭并用EtOAc（2 × 250毫升）洗涤。分离并蒸发水层。这与甲苯共蒸馏两次以获得3-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-3-氧代丙腈。
Figure 186804DEST_PATH_IMAGE006
将3-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-3-氧代丙腈（21克，110.4毫摩尔）在乙醇（200毫升）中的溶液置于密封管中。加入水合肼（32.1毫升，662.4毫摩尔）和乙酸（21.0毫升）并将反应在100℃下加热2小时。蒸发掉溶剂，反应混合物用EtOAc（500毫升）和饱和碳酸氢钠溶液（100毫升）稀释。分离有机层并用EtOAc（2 × 250毫升）萃取水层。合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤并浓缩产生粗产物，其不经进一步纯化即送往下一步骤。
Figure 453837DEST_PATH_IMAGE007
制品4
5-氨基-3-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-吡唑-1-甲酸叔丁酯
在0℃下将5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基胺（16.0克，78.3毫摩尔）在THF（200毫升）中的溶液缓慢添加到NaH（60%在矿物油中，3.4克，85.0毫摩尔）在THF（200毫升）中的搅拌悬浮液中。在0℃下15分钟后，将二碳酸二叔丁酯（19.8毫升，86毫摩尔）缓慢添加到反应混合物中并在0℃下搅拌30分钟。该反应混合物用冰水（大约250毫升）猝灭并将产物萃取到乙酸乙酯（2 × 500毫升）中。合并的有机部分用水和饱和NaCl溶液（200毫升）洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩以提供粗材料。这种材料用己烷碎化两次以获得18.5克（78%）标题化合物。
Figure 259299DEST_PATH_IMAGE009
制品5
(R)-3-{6-[2-叔丁氧基羰基-5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基氨基]-吡嗪-2-基氧基}-哌啶-1-甲酸叔丁酯
通过侧臂圆底烧瓶将5-氨基-3-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-吡唑-1-甲酸叔丁酯（50.0克，164.5毫摩尔）、(R)-3-(6-氯吡嗪-2-基)氧基哌啶-1-甲酸叔丁酯（56.6克，180.9毫摩尔）、4,5-双-二苯基磷烷基(phosphanyl)-9,9-二甲基-9H-呫吨（14.2克，24.6毫摩尔）和Cs2CO3 (85.5克，263毫摩尔）在1,4-二氧杂环己烷（1.4升）中的混合物等分成两份，两者都用氩气吹扫2小时。加入Pd(OAc)2（5.4克，24.6毫摩尔）（每容器一半）并继续吹扫1小时。然后将该反应在90-95℃下加热1小时。将反应混合物冷却至室温，合并并用乙酸乙酯（1升）稀释。该混合物随后经硅藻土过滤，用乙酸乙酯洗涤并浓缩滤液。粗产物在硅胶上用15% EtOAc/己烷作为洗脱剂纯化以提供55克（57%收率）白色粉末。将55克纯化产物与15克类似制备和提纯的材料（由20克5-氨基-3-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-吡唑-1-甲酸叔丁酯获得）合并。将合并的70克材料溶解在THF和甲醇的4:1混合物（1.4升）中并用QuadraSil™ AP (140 g)处理2小时。该反应混合物经硅藻土过滤并用乙酸乙酯（4 × 100毫升）洗涤。该滤液再与QuadraSil™ AP (140 g)一起搅拌2小时并如上过滤。蒸发溶剂以产生白色固体状的标题化合物。
Figure 193943DEST_PATH_IMAGE011
实施例1
(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺
Figure 930955DEST_PATH_IMAGE012
在0℃下经5分钟的时间向(R)-3-{6-[2-叔丁氧基羰基-5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基氨基]-吡嗪-2-基氧基}-哌啶-1-甲酸叔丁酯 (13.0克，22.3毫摩尔）在二氯甲烷（150毫升）中的搅拌溶液中加入三氟乙酸（12.4毫升，167毫摩尔）在二氯甲烷（20毫升）中的溶液。使该反应温热至室温并搅拌3小时。该反应用二氯甲烷（1000毫升）稀释，接着添加饱和碳酸氢钠溶液（250毫升），然后搅拌4小时。分离有机部分并经无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发。所得材料从异丙醇中结晶以获得所需产物。
Figure 392023DEST_PATH_IMAGE013
实施例2
(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺甲磺酸盐
Figure 821867DEST_PATH_IMAGE014
在0℃下将甲磺酸（0.247克，2.57毫摩尔）添加到(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺 (0.982克，2.57毫摩尔）在二氯甲烷（25毫升）中的搅拌溶液中。使该反应温热至室温并搅拌45分钟。蒸发溶剂，所得盐相继用乙醚（10毫升）和戊烷（10毫升）洗涤以获得所需产物。
Figure 250444DEST_PATH_IMAGE015
实施例3
(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺乙酸盐
Figure 525567DEST_PATH_IMAGE016
在0℃下向(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺 (0.100克，0.26毫摩尔）在二氯甲烷（10毫升）中的溶液中加入溶解在二氯甲烷（1毫升）中的乙酸（0.015毫升，0.26毫摩尔）。将反应混合物在室温下搅拌60分钟，然后蒸发溶剂以获得残留物。该残留物用二乙醚（20毫升），接着正戊烷（20毫升）碎化。将该材料在高真空下干燥4小时以获得所需产物。
Figure 169038DEST_PATH_IMAGE017
实施例4
(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺半草酸盐
Figure 441887DEST_PATH_IMAGE018
在0℃下向(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺 (0.100克，0.26毫摩尔）在二氯甲烷（10毫升）中的溶液中加入溶解在MeOH（0.1毫升）中的草酸（0.012毫克，0.13毫摩尔）。将反应混合物在室温下搅拌60分钟，然后蒸发溶剂以获得残留物。该残留物用二乙醚（20毫升），接着正戊烷（20毫升）碎化。将该材料在高真空下干燥4小时以获得标题化合物。
实施例5
(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺半琥珀酸盐
Figure 436574DEST_PATH_IMAGE020
在室温下向(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺 (0.1克，0.26毫摩尔）在二氯甲烷（10毫升）中的溶液中加入溶解在乙醇（1毫升，在50℃下溶解）中的琥珀酸（0.015克，0.13毫摩尔）。将反应混合物在室温下搅拌2小时。蒸发溶剂，所得残留物用二乙醚（20毫升），接着正戊烷（20毫升）碎化。将该材料在高真空下干燥8小时以获得标题化合物。
Figure 934552DEST_PATH_IMAGE021
实施例6
(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺水合物
将(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺（52.1毫克；ES/MS m/z 382.2 [M+H]+）悬浮在5:95水-乙醇混合物（10毫升）中并在环境温度下制浆48小时。通过真空过滤回收白色结晶固体。
在配有CuKa源（λ=1.54056 Å）和Vantec检测器并在35 kV和50 mA下运行的Bruker D4 Endeavor X-射线粉末衍射仪上获得结晶固体的X-射线粉末衍射（XRD）图。在4°至40° 2θ之间以0.009° 2θ的步长扫描样品。将干粉装在石英样品支架上并使用载玻片获得光滑表面。在该情况下，2θ的± 0.2的峰位置变化性考虑到不阻碍所示晶型的明确识别的电位变化。可基于特征峰（以° 2θ为单位），通常为更突出峰的任何独特组合进行晶型的鉴定。基于在8.85和26.77 ° 2θ的NIST 675标准峰调节在环境温度和相对湿度下收集的晶型衍射图。
因此，该化合物的样品晶型以具有如下表1中所述的衍射峰（2θ值）的使用CuKa辐射的XRD图为特征。具体而言，该图含有在5.17的峰以及选自15.73、17.71和20.12的一个或多个峰，衍射角公差为0.2度。
表1: 实施例6的X-射线粉末衍射峰
Figure 706199DEST_PATH_IMAGE022
Chk1生化检测
可以使用CHK1/底物肽过滤结合检测法测定化合物对Chk1生化活性的作用。在这种检测法中，使用基于Cdc25的氨基酸序列残基206-225的合成肽作为重组Chk1蛋白激酶的磷酸基受体底物。使用γ-33P-ATP作为磷酸基供体底物，Chk1将放射性γ-33磷酸基转移给合成肽。通过将肽底物捕获在阳离子交换纸滤板上并闪烁计数发射的β粒子，测量该反应。
在96-孔V底聚苯乙烯板中进行激酶反应（40微升反应体积）。通过添加Chk1酶，引发反应。最终反应条件为67 mM HEPES钠盐pH 7.4, 0.007% (v/v) TRITON™ X-100, 2.7 mM DTT, 2.7 mM MgCl2, 12 μM肽底物, 60 μM ATP二钠盐, 0.75 μCi γ-33P-ATP, 0.75 nM活性Chk1酶, 4% (v/v) DMSO和该化合物的连续稀释(1:3连续稀释, 在20 μM开始, 10个点)。
在添加Chk1酶后，该反应在室温下孵育90分钟，然后通过添加140微升磷酸终止。将该反应混合物转移到磷酸纤维素阳离子交换纸不透明滤板的相应孔中以静置30分钟。该滤板在真空歧管中用200微升0.5%磷酸 (v/v)洗涤五次。在向该板的各孔添加40微升Microscint™-20之前，将该滤板干燥过夜。在室温下静置4小时后，使用MicroBeta Trilux微板闪烁计数器(Perkin Elmer)测量该板中的放射性。
为了测定IC50，由在各板上运行的对照组，使用闪烁计数比计算在各浓度下的抑制百分比。该十点化合物浓度数据随后使用ActivityBase 4.0拟合至四参数逻辑方程。由所得曲线计算绝对IC50值。在基本如上运行的这种检测中测试本发明的化合物。例如，测试实施例1的化合物，并发现具有<0.001 μM (n = 6)的IC50。此外，测试实施例2的化合物并发现具有<0.001 µM (n = 3)的IC50。这些结果表明，在本发明范围内的化合物是Chk1的有力抑制剂。
Chk2生化检测
可以使用CHK2/底物肽过滤结合检测法测定化合物对Chk2生化活性的作用。在这种检测法中，使用基于Cdc25C的氨基酸序列残基206-225的合成肽作为重组Chk2蛋白激酶的磷酸基受体底物。使用γ-33P-ATP作为磷酸基供体底物，Chk2将放射性γ-33磷酸基转移给合成肽。通过将肽底物捕获在阳离子交换滤纸板上并闪烁计数发射的β粒子，测量该反应。
在96-孔V底聚苯乙烯板中进行激酶反应（40微升反应体积）。通过添加Chk2酶，引发反应。最终反应条件为67 mM HEPES钠盐pH 7.4, 0.007% (v/v) TRITON™ X-100, 2.7 mM DTT, 2.7 mM MgCl2, 12 μM肽底物, 60 μM ATP二钠盐, 0.75 μCi γ-33P-ATP, 1.4 nM活性Chk2酶, 4% (v/v) DMSO和该化合物的连续稀释(1:3连续稀释, 在20 μM开始, 10个点)。
在添加Chk2酶后，该反应在室温下孵育90分钟，然后通过添加140微升磷酸终止。将该反应混合物转移到磷酸纤维素阳离子交换纸不透明滤板的相应孔中以静置30分钟。该滤板在真空歧管中用200微升0.5%磷酸(v/v)洗涤五次。在向该板的各孔添加40微升Microscint™-20之前，将该滤板干燥过夜。在室温下静置4小时后，使用MicroBeta Trilux微板闪烁计数器(Perkin Elmer)测量该板中的放射性。
为了测定IC50，由在各板上运行的对照组，使用TR-FRET比计算在各浓度下的抑制百分比。该十点化合物浓度数据随后使用ActivityBase 4.0拟合至四参数逻辑方程。由所得曲线计算绝对IC50值。在基本如上运行的这种检测中测试本发明的化合物。例如，测试实施例1的化合物。并发现具有0.011 μM (SE = 0.002, n = 6)的IC50。此外，测试实施例2的化合物并发现具有0.012 µM (SE = 0.008, n = 3)的IC50。这些结果表明，在本发明范围内的化合物是Chk2的有力抑制剂。
Chk1自磷酸化细胞基检测法
Chk1的抑制剂防止蛋白质的激酶活性将已激活DNA损伤响应的细胞中的底物磷酸化。易检测的Chk1底物是Chk1本身上的自磷酸化位点，丝氨酸296。可以使用下列免疫印迹检验法测量Chk1上的丝氨酸296的磷酸化量和间接测量Chk1蛋白激酶的活性水平。HeLa细胞在含L-谷氨酰胺的补充了10%(v/v)热灭活胎牛血清、1x MEM非必需氨基酸、1x丙酮酸钠和1 × 105个细胞（在接种在600微升MEM培养基/24孔细胞培养板的孔中）的MEM w/厄尔平衡盐溶液(Earle’s Balanced Salt Solution)中培养。细胞在37℃, 5% CO2和95%-100%湿度下孵育24小时。16微升4 μM阿霉素在培养基中的储液添加到各适当孔中以得出100 nM阿霉素的最终浓度。在添加Chk1抑制剂化合物之前，将板送回孵育器另外24小时。将化合物以10 mM溶解在100% DMSO中，然后在40% (v/v) DMSO中稀释至2 mM，然后用培养基 + 4% (v/v) DMSO稀释至100 μM。随后，在100 μM至0.005 μM范围内制备该化合物的连续稀释物（1:3）。将66微升化合物储液添加到该板中的适当孔中以产生0.4% (v/v)的最终DMSO浓度和1 μM至0.0005 μM的最终化合物浓度范围。将板送回孵育器另外2小时，然后取出用于细胞溶解和加工。然后从该板中除去培养基，各孔用0.5毫升冰冷的Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水(DPBS)洗涤一次，除去所有液体并在剩余程序过程中将该板置于冰上。向各孔中加入75微升冰冷的裂解缓冲液，其由含有磷酸酶抑制剂混合物(Sigma, cat# P0044 + P5725)和蛋白酶抑制剂混合物片剂(Roche Diagnostics, cat# 11836153001)的细胞提取缓冲液构成。在10分钟后，刮擦各孔并将裂解液转移到在冰上的1.5毫升聚丙烯微离心管中。各裂解液用板cuphorn声波仪(Misonix)声处理45秒，其同时悬浮在水/冰浴中。将50微升各样品转移到含有25微升4x Laemmli样品缓冲液的0.5毫升聚丙烯微离心管中，在95℃下加热5分钟，并在-80℃下冷冻储存。剩余裂解液用于测定蛋白质浓度（BCA蛋白质检测试剂盒, Thermo Scientific）。将5微克在样品缓冲液中的各细胞裂解液施加到E-Page 96孔凝胶上并施以电泳。根据本领域中公知的程序（Towbin等, PNAS (1979) 76(9), 4350-4）将蛋白质从该凝胶电转移至Immobilon-P膜PVDF (0.45 μm)。该膜用10 mM Tris/HCl pH 8.0, 150 mM NaCl和0.05% (v/v)吐温20 (TBST)简短冲洗并在25℃下在TBST/5% (v/v)重构Carnation®速溶乳中浸泡1小时。该膜用TBST洗涤5分钟4次，然后在4℃下在含有适当稀释的兔-抗-磷酸基-Chk1（丝氨酸296）的TBST/5% (w/v)牛血清白蛋白中浸泡24小时。该膜在25℃下用TBST洗涤5分钟4次，然后在25℃下在含有适当稀释的缀合到辣根过氧化物酶上的驴抗-兔IgG(GE Healthcare, cat# NA9340)的TBST/5%乳中浸泡2小时以检测自磷酸化Chk1蛋白质。该膜再在25℃下用 TBST洗涤5分钟4次。使用FUJI LAS-4000成像系统用Super Signal Western Femto HRP-检测试剂检测固定在膜上的抗原-抗体-报道分子缀合物。使用“Total Lab”软件(Nonlinear Dynamics)计算磷酸基-Chk1(ser296)谱带强度。使用下列公式计算阿霉素诱导的Chk1自磷酸化的抑制百分比：%抑制 = (样品-磷酸基-Chk1谱带强度 – 无阿霉素阴性对照 -磷酸基-Chk1谱带强度) /(阿霉素阳性对照 -磷酸基-Chk1谱带强度- 无阿霉素阴性对照-磷酸基-Chk1谱带强度) × 100。在基本如上运行的这种检测中测试本发明的化合物。在这种检测中测试实施例1的化合物并发现具有<0.001 μM (n = 1)的EC50。在这种检测中测试实施例3的化合物并发现具有<0.001 µM (n = 1)的EC50。这些结果表明，在本发明范围内的化合物是Chk1的有力抑制剂。
阿霉素诱导的G2M检测点消除，基于HeLa细胞的Acumen检测
Chk1的抑制剂会使用拓扑异构酶II抑制剂阿霉素处理过的p53-负型肿瘤细胞中的G2M DNA损伤检测点失效。G2M检测点消除的测量是在细胞横穿G2M检测点和进入有丝分裂后发生的在丝氨酸10上的组蛋白H3的磷酸化。下列高含量成像检测法可用于测量细胞中的组蛋白H3的磷酸化。HeLa细胞在补充了10% (v/v) FBS的MEM培养基中培养并以2000个细胞/孔接种在聚D-赖氨酸涂布的透明底黑色板中，每孔100微升体积。然后将板在细胞培养基孵育器中孵育18-24小时（37℃, 5% CO2和95%相对湿度）。在初始培养后，将20微升MEM培养基 + 含有625 nM阿霉素的10% FBS添加到该板的适当孔中以产生125 nM的最终浓度。将板送回孵育器24小时，足以使细胞停滞在G2M检测点。第二天用化合物处理细胞。将化合物以10 mM溶解在100% DMSO中，然后在MEM + 4% (v/v) DMSO中以50 μM开始稀释成10×储液。随后，在50 μM至0.39 μM范围内制备该化合物的连续稀释物(1:2)。将13微升化合物储液添加到板中的适当孔中以产生0.4%的最终DMSO浓度和5 μM至0.039 μM之间的最终化合物浓度范围。将板送回孵育器另外7小时，然后取出固定。从各孔中小心除去液体并加入100微升PREFER™固定剂。板在室温下保持20分钟，除去固定剂，然后通过添加100微升/孔在DPBS中的0.1% (v/v) Triton® X 100，将细胞渗透10分钟。除去溶液并将板用100微升DPBS/孔洗涤两次，接着在室温下添加含有50微克/毫升核糖核酸酶A（RNAase，来自牛胰）的100微升DPBS 1小时。除去RNAase溶液并通过在各孔中加入含有1:500 兔-抗-pHH3 (ser10)稀释液 + 1% (w/v) BSA的50微升RNAase溶液，将细胞染色以观察在丝氨酸10上磷酸化的组蛋白H3(pHH3)的存在。 将板密封并在4℃下保持过夜。通过将各板用100微升/孔DPBS洗涤两次并替换成50微升Alexa Fluor® 488山羊抗兔IgG (H+L) (2 mg/mL)在DPBS + 1% (w/v) BSA中的1:750稀释液，除去初始抗体。板用铝箔覆盖以避光的情况下在室温下保持1小时。板再用100微升/孔DPBS洗涤两次并替换成100微升15 nM碘化丙啶（由初始溶液用PBS 1:100稀释）。板用黑色封条密封以将板遮光。将板孵育30分钟以将细胞核染色。用ACUMEN EXPLORER™激光扫描荧光微板细胞仪使用488纳米激发（TTP LABTECH LTC）扫描所述板以测量pHH3和DNA含量，包括2N和4N。通过来自Alexa 488的在519纳米的平均强度鉴定pHH3阳性细胞。使用来自碘化丙啶/DNA的在655-705纳米的总强度鉴定各细胞和细胞周期中的亚群（2N细胞，4N细胞）。通过归一化至总细胞的%，测定各群的最终读数，以产生%pHH3、%2N和%4N的最终检测输出。随后通过用100 nM的抑制剂对照化合物最大浓度处理细胞以测定100%活性，从而测定各化合物的最终%活性。0%活性基于无化合物处理。使用ACTIVITY BASE™，excel拟合（使用四参数逻辑拟合方程205的曲线拟合）测定相对EC50以测定相对于在100%的对照最大值（control max）的%pHH3。在基本如上运行的这种检测中测试本发明的化合物。测试实施例1的化合物并发现具有0.029 μM (n = 1)的EC50。测试实施例2和实施例3的化合物并发现分别具有0.033 µM (n = 1)和0.019 µM (n = 1)的EC50结果。这些结果表明，在本发明范围内的化合物会使G2M DNA损伤检测点失效。
ECtfs (两倍致敏)检测
Chk1的抑制剂可通过S期内检测点的消除增强吉西他滨（或其它细胞毒素）的抗增殖活性，以产生持久和增加的DNA损伤。可以通过测定细胞的复制其DNA的能力来分析在DNA损伤后的继续肿瘤细胞增殖的能力。这一检测评估细胞在细胞具有修复DNA损伤的机会后复制其DNA的能力。在这种检测中，用吉西他滨的连续稀释物处理细胞，然后在22小时后，用实施例3的化合物处理。在另外44小时后，通过MTS (3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓)染料还原检测评估相对细胞数。ECtfs参数是将在这种检测中在不存在Chk1抑制的情况下测得的吉西他滨的GI90浓度减半所必需的Chk1抑制剂浓度的量度。在RPMI 1640 + 10% (v/v)热灭活FBS中使HT-29细胞（获自ATCC）生长。细胞在96孔组织培养板上以2.5 × 103/孔接种在100微升体积中并培养24小时。在McCoy’s 5A培养基(修饰的) (1x)中以6x浓度制备吉西他滨稀释液并以20微升/孔添加到孔中。如下建立吉西他滨稀释液：吉西他滨的最高最终浓度为1.0 μM，并通过三倍步骤稀释至0.5 nM。
通过在DMSO中稀释至4000x最终浓度，然后以666倍稀释到McCoy’s培养基中以生成6x储液，制备Chk1抑制剂。Chk1抑制剂稀释通过2.5倍步骤从25 nM开始进行至0.3 nM。在添加吉西他滨后22小时，Chk1抑制剂以24微升体积添加到含有120微升培养基 + 吉西他滨的孔中。各吉西他滨稀释液接收单Chk1抑制剂稀释液。对照孔接收单独的DMSO、吉西他滨或Chk1抑制剂。在添加Chk1抑制剂后44小时，将30微升CellTiter 96® AQueous检测试剂添加到各孔中并在室温下保持1小时45分钟。在SpectraMax 250 (分子器件)分光光度计上在490纳米读取吸光度。用GraphPad Prism 4.0分析来自SpectraMax分光光度计的数据。首先，在来自各板的数据矩阵中从所有其它值中扣除平均的无细胞对照吸光度。接着，得出复制的数据点的平均值。针对各Chk1抑制剂浓度将数据归一化，将0%细胞数设为校正的A490 = 0，100%细胞数设为0 nM 吉西他滨平均值。然后转换这些结果。将吉西他滨浓度换算成log浓度并将归一化的细胞数值换算成抑制百分比（抑制百分比 = 100- 归一化数值）。将转换的数据绘图，并进行非线性回归以评估吉西他滨在各Chk1抑制剂浓度下的IC50值。使斜率改变并且不限制对剂量响应曲线的顶部或底部，计算非线性回归。如下计算ECtfs值：测定在各Chk1抑制剂浓度下吉西他滨的GI50值，绘图并通过内插法测定将单独的吉西他滨的GI50降低两倍所必需的Chk1抑制剂浓度。
在基本如上运行的这种检测中测试在本发明范围内的化合物。例如，测试实施例3的化合物并发现具有1.0 nM (SE = 0.1, n = 3)的ECtfs值。此外，25 nM的该化合物将吉西他滨在HT-29结肠癌细胞中的EC50降低7-倍，从22 nM至3 nM。单独地，25 nM的实施例3的化合物对HT-29细胞的增殖具有很少的作用。这些结果表明，在本发明范围内的化合物有效增强吉西他滨在低浓度下的抗增殖活性。
用各种浓度的实施例3处理获得的吉西他滨IC50值
Figure 594520DEST_PATH_IMAGE023
Chk1体内靶抑制检测
Calu-6细胞在生长培养基（MEM + 厄尔平衡盐溶液，含L-谷氨酰胺，补充了10% (v/v)热灭活FBS、1x MEM非必需氨基酸、1x丙酮酸钠）中培养并扩增。获取细胞并用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，并将在生长培养基（无血清）中的1 × 106细胞与等体积的BD MatrigelTM基质混合，然后皮下注射到预辐照（4.5 Gy）的裸鼠（无胸腺的裸鼠）侧腹中。在移植（肿瘤尺寸 = 150-200 mm3）后第15天，将每天在盐水中新鲜配制的吉西他滨通过腹腔途径以150 mg/kg剂量施用于动物。6小时后，使动物口服在通过添加稀NaOH调节至pH 6.8的0.2% 吐温-80/0.5%甲基纤维素中配制的Chk1化合物。在Chk1抑制剂给药后2小时处死动物，获取肿瘤并立即在含有磷酸酶抑制剂混合物(Sigma, cat# P0044 + P5725)和蛋白酶抑制剂混合物片剂(Roche Diagnostics, cat# 11836153001)的冰冷细胞提取缓冲液中处理。在冰冷的15毫升聚丙烯锥形管中使用设定为高的机动组织匀浆器在1.5-2.0毫升裂解缓冲液中处理肿瘤15秒。在样品保持在冰上时，通过带有25 G针的1毫升注射器吸取裂解液四次。将0.35毫升肿瘤裂解液转移到含有0.15毫升4x Laemmli样品缓冲液的1.5毫升聚丙烯微离心管中。然后混合样品并在95℃下加热5分钟并在Misonix 3000板喇叭声波仪上使用高功率声处理1分钟。然后将样品储存在冰上或储存在-80℃以通过蛋白质印迹法评估靶抑制。将5微克在样品缓冲液中的各肿瘤裂解液施加到E-Page 96孔凝胶上并施以电泳。根据本领域中公知的程序（Towbin等, PNAS (1979) 76(9), 4350-4）将蛋白质转移至硝基纤维素BA83 Protran膜(Whatman, Cat# 10402405)。随后处理该膜以测量丝氨酸296上的Chk1蛋白质自磷酸化。该膜用水、然后10 mM Tris/HCl pH 8.0, 150 mM NaCl和0.05% (v/v) 吐温20 ( TBST)简短冲洗并在25℃下在TBST/5% (w/v)重构Carnation速溶乳中浸泡1小时。该膜随后用TBST洗涤5分钟4次。将该膜在4℃下在适当稀释的兔-磷酸基-Chk1抗-磷酸基-Chk1（丝氨酸296）中的TBST/5% (w/v)BSA中浸泡16小时。然后将该膜在25℃下用TBST洗涤5分钟4次，然后在25℃下在含有适当稀释的缀合到辣根过氧化物酶上的驴抗-兔IgG的TBST/5%乳中浸泡2小时以检测磷酸基-Chk1(ser 296)。该膜再在25℃下用 TBST洗涤5分钟4次。用Super Signal Western Femto HRP-检测试剂检测固定在膜上的抗原-抗体-报道分子缀合物。
使用FUJI LAS-4000成像系统检测和捕获信号。使用“Total Lab”软件(Nonlinear Dynamics)计算磷酸基-Chk1(ser296)谱带强度。使用下列公式计算吉西他滨诱导的Chk1自磷酸化的抑制百分比：%抑制 = (样品 -磷酸基-Chk1谱带强度 – 平均吉西他滨(最大)阳性对照 -磷酸基-Chk1谱带强度) / (平均阴性对照 (最小) -磷酸基-Chk1谱带强度 – 平均吉西他滨(最大)阳性对照 -磷酸基-Chk1谱带强度) × 100。
在基本如上运行的这种检测中测试在本发明范围内的化合物。例如，测试实施例3的化合物并发现具有1.3 mg/kg (n = 1)的对Chk1自磷酸化的靶调节有效剂量50（TMED50）。这一结果表明，在本发明范围内的化合物在体内有力抑制Chk1蛋白激酶的活化。
人肿瘤异种移植模型
可以使用Calu-6肺和HT-29结肠肿瘤异种移植效力模型体内测定Chk1抑制剂的增强通过DNA损伤剂杀灭肿瘤的能力。Calu-6肺癌细胞在生长培养基（MEM + 厄尔平衡盐溶液，含L-谷氨酰胺，补充了10% (v/v)热灭活FBS、1x MEM非必需氨基酸、1x丙酮酸钠）中培养，HT-29结肠癌细胞（ATCC）在生长培养基（补充了10% FBS的McCoy’s 5A培养基）中培养并扩增。
获取细胞并用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，将在生长培养基（无血清）中的5 × 106细胞(HT-29)或1 × 106细胞(Calu-6)与等体积的BD MatrigelTM基质混合，然后皮下注射到裸鼠（CD-1 nu/nu）的侧腹中。
Chk1 抑制剂的皮下给药
在移植（150-200 mm3）后大约第16天，每天在盐水中新鲜配制吉西他滨并通过腹腔途径以60 mg/kg剂量施用于动物。24小时后，皮下BID向动物施用在0.2% 吐温-80/0.5%甲基纤维素中的实施例3的化合物。在休息2天后，重复给药另外三个周期（Q4Dx4实施例3的化合物，再补充(offset)24小时）。以化合物处理组的平均肿瘤尺寸从媒介物处理对照组的平均肿瘤尺寸的减小百分比来计算肿瘤生长抑制（TGI）。在基本如上运行的这种检测中测试在本发明范围内的化合物。例如，发现与吉西他滨联合给药的实施例3的化合物在HT-29和Calu-6肿瘤异种移植模型中都表现出优异的剂量依赖性抗肿瘤活性，与单独使用吉西他滨相比肿瘤生长抑制提高最多6倍。这一结果表明，皮下给药的在本发明范围内的化合物显著提高吉西他滨在人肿瘤异种移植模型中的抗肿瘤活性。
HT29 皮下
ns = 无统计学意义。
Calu 6 皮下
ns = 无统计学意义。
Chk1 抑制剂的口服给药
在移植（150-200 mm3）后大约第16天，每天在盐水中新鲜配制吉西他滨并通过腹腔途径以40 mg/kg剂量施用于动物。24小时后，通过口服途径BID向动物施用在0.2% 吐温-80/0.5%甲基纤维素中的Chk1化合物。在休息3天后，重复给药另外三个周期（Q5Dx4实施例3的化合物，再补充24小时）。如上一段中所述计算肿瘤生长抑制（TGI）。在基本如上运行的这种检测中测试在本发明范围内的化合物。例如，实施例3的化合物与吉西他滨联合给药并发现在HT-29和Calu-6肿瘤异种移植模型中都表现出优异的剂量依赖性抗肿瘤活性，与单独使用吉西他滨相比肿瘤生长抑制提高最多2.9倍。这一结果表明，口服给药的在本发明范围内的化合物显著提高吉西他滨在人肿瘤异种移植模型中的抗肿瘤活性。
Calu6口服
Figure 959008DEST_PATH_IMAGE026
ns = 无统计学意义。
HT29口服
Figure 396943DEST_PATH_IMAGE027
ns = 无统计学意义

Claims (19)

1. 化合物(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺或其可药用盐。
2. 根据权利要求1的化合物，其是(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺。
3. 根据权利要求1的化合物，其是(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺甲磺酸盐。
4. 根据权利要求1的化合物，其是(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺乙酸盐。
5. 根据权利要求1的化合物，其是(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺半草酸盐。
6. 根据权利要求1的化合物，其是(R)-[5-(2-甲氧基-6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-[6-(哌啶-3-基氧基)-吡嗪-2-基]-胺半琥珀酸盐。
7. 包含根据权利要求1-6任一项的化合物或盐和可药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
8. 治疗癌症的方法, 包括向需要其的患者施用有效量的根据权利要求1-6任一项的化合物或盐。
9. 治疗癌症的方法, 包括向需要其的患者施用有效量的根据权利要求1-6任一项的化合物或盐和电离辐射。
10. 治疗癌症的方法, 包括向需要其的患者施用有效量的根据权利要求1-6任一项的化合物或盐和一种或多种化疗剂。
11. 根据权利要求10的方法，其中所述一种或多种化疗剂选自5-氟尿嘧啶、羟基脲、吉西他滨、甲氨喋呤、培美曲塞、阿霉素、依托泊苷、顺铂和紫杉醇。
12. 根据权利要求8-11任一项的方法，其中所述癌症选自膀胱癌、结肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、间皮瘤、肾癌和子宫癌。
13. 用于治疗的根据权利要求1-6任一项的化合物或盐。
14. 用于治疗癌症的根据权利要求1-6任一项的化合物或盐。
15. 根据权利要求1-6任一项的化合物或盐，其与电离辐射同时、分开或相继联合用于治疗癌症。
16. 根据权利要求1-6任一项的化合物或盐，其与一种或多种化疗剂同时、分开或相继联合用于治疗癌症。
17. 根据权利要求16使用的化合物或盐，其中所述一种或多种化疗剂选自5-氟尿嘧啶、羟基脲、吉西他滨、甲氨喋呤、培美曲塞、阿霉素、依托泊苷、顺铂和紫杉醇。
18. 根据权利要求14-17任一项使用的化合物或盐，其中所述癌症选自膀胱癌、结肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、间皮瘤、肾癌和子宫癌。
19. 包含根据权利要求1-6任一项的化合物或盐以及可药用载体、稀释剂或赋形剂和任选其它治疗成分的药物组合物。
CN201180053779.8A 2010-11-08 2011-11-01 可用于抑制chk1的化合物 Active CN103180311B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US41113710P 2010-11-08 2010-11-08
US61/411,137 2010-11-08
PCT/US2011/058692 WO2012064548A1 (en) 2010-11-08 2011-11-01 Compounds useful for inhibiting chk1

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103180311A true CN103180311A (zh) 2013-06-26
CN103180311B CN103180311B (zh) 2014-08-20

Family

ID=45044707

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180053779.8A Active CN103180311B (zh) 2010-11-08 2011-11-01 可用于抑制chk1的化合物

Country Status (22)

Country Link
US (1) US9067920B2 (zh)
EP (1) EP2638033B1 (zh)
JP (1) JP5792316B2 (zh)
KR (1) KR101533166B1 (zh)
CN (1) CN103180311B (zh)
AR (1) AR083575A1 (zh)
AU (1) AU2011326230B2 (zh)
BR (1) BR112013010009B1 (zh)
CA (1) CA2816944C (zh)
DK (1) DK2638033T3 (zh)
EA (1) EA022096B1 (zh)
ES (1) ES2541414T3 (zh)
HR (1) HRP20150530T1 (zh)
JO (1) JO3145B1 (zh)
ME (1) ME02119B (zh)
MX (1) MX2013005181A (zh)
PL (1) PL2638033T3 (zh)
PT (1) PT2638033E (zh)
RS (1) RS54012B1 (zh)
SI (1) SI2638033T1 (zh)
TW (1) TWI501956B (zh)
WO (1) WO2012064548A1 (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201402277D0 (en) 2014-02-10 2014-03-26 Sentinel Oncology Ltd Pharmaceutical compounds
EP3411036B1 (en) 2016-02-04 2021-12-29 Pharmaengine, Inc. 3,5-disubstituted pyrazoles useful as checkpoint kinase 1 (chk1) inhibitors, and their preparations and applications
EP3461480A1 (en) 2017-09-27 2019-04-03 Onxeo Combination of a dna damage response cell cycle checkpoint inhibitors and belinostat for treating cancer
US11564920B2 (en) 2020-11-30 2023-01-31 Sumitomo Pharma Co., Ltd. 5-heteroaryl-1H-pyrazol-3-amine derivative
CN116546974A (zh) * 2020-11-30 2023-08-04 住友制药株式会社 5-杂芳基-1h-吡唑-3-胺衍生物
TW202333680A (zh) * 2021-12-24 2023-09-01 日商住友製藥股份有限公司 具有二環性骨架之1h-吡唑-3-胺衍生物
WO2023229032A1 (ja) * 2022-05-27 2023-11-30 住友ファーマ株式会社 免疫チェックポイント阻害剤に対して治療抵抗性を示すがんの治療薬

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005009435A1 (en) * 2003-07-25 2005-02-03 Pfizer Inc. Aminopyrazole compounds and use as chk1 inhibitors
WO2006117560A1 (en) * 2005-05-05 2006-11-09 Astrazeneca Ab Pyrazolyl-amino- substituted pyrimidines and their use in the treatment of cancer
WO2008117050A1 (en) * 2007-03-27 2008-10-02 Astrazeneca Ab Pyrazolyl-amino-substituted pyrazines and their use for the treatment of cancer

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2305671A1 (en) * 2004-01-05 2011-04-06 AstraZeneca AB Thiophene and thiazole derivatives as CHK1 inhibitors
DK1756084T3 (da) * 2004-06-04 2009-03-23 Arena Pharm Inc Substituerede aryl- og heteroarylderivater som modulatorer af metabolisme og forebyggelse og behandling af forstyrrelser beslægtet dermed
US20090233896A1 (en) * 2005-06-09 2009-09-17 Arrington Kenneth L Inhibitors of checkpoint kinases
PA8850801A1 (es) * 2008-12-17 2010-07-27 Lilly Co Eli Compuestos útiles para inhibir chk1

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005009435A1 (en) * 2003-07-25 2005-02-03 Pfizer Inc. Aminopyrazole compounds and use as chk1 inhibitors
WO2006117560A1 (en) * 2005-05-05 2006-11-09 Astrazeneca Ab Pyrazolyl-amino- substituted pyrimidines and their use in the treatment of cancer
WO2008117050A1 (en) * 2007-03-27 2008-10-02 Astrazeneca Ab Pyrazolyl-amino-substituted pyrazines and their use for the treatment of cancer

Also Published As

Publication number Publication date
CN103180311B (zh) 2014-08-20
RS54012B1 (en) 2015-10-30
US20130190262A1 (en) 2013-07-25
US9067920B2 (en) 2015-06-30
WO2012064548A1 (en) 2012-05-18
AR083575A1 (es) 2013-03-06
BR112013010009A2 (pt) 2020-09-29
JP2013541586A (ja) 2013-11-14
SI2638033T1 (sl) 2015-05-29
KR101533166B1 (ko) 2015-07-01
PT2638033E (pt) 2015-06-01
MX2013005181A (es) 2013-10-17
HRP20150530T1 (hr) 2015-06-19
EA022096B1 (ru) 2015-10-30
JP5792316B2 (ja) 2015-10-07
TWI501956B (zh) 2015-10-01
CA2816944C (en) 2015-12-22
ME02119B (me) 2015-10-20
ES2541414T3 (es) 2015-07-20
PL2638033T3 (pl) 2015-09-30
KR20130099146A (ko) 2013-09-05
TW201305138A (zh) 2013-02-01
EP2638033B1 (en) 2015-04-08
DK2638033T3 (en) 2015-04-27
AU2011326230A1 (en) 2013-05-09
EP2638033A1 (en) 2013-09-18
AU2011326230B2 (en) 2015-02-19
EA201390499A1 (ru) 2013-08-30
JO3145B1 (ar) 2017-09-20
BR112013010009B1 (pt) 2021-10-19
CA2816944A1 (en) 2012-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103180311B (zh) 可用于抑制chk1的化合物
Roskoski Jr Cyclin-dependent protein serine/threonine kinase inhibitors as anticancer drugs
JP6612751B2 (ja) Ｂｔｋの阻害剤としてのピリジン、ピリミジン及びピラジンならびにその使用
JP2022515705A (ja) サイクリン依存性キナーゼ７（ｃｄｋ７）の非共有結合性阻害剤を用いてバイオマーカーにより特定された患者におけるがんを処置する方法
US8084621B2 (en) 3-Pyrrolo[b]cyclohexylene-2-dihydroindolinone derivatives and uses thereof
AU2013366513A1 (en) Novel benzimidazole derivatives as kinase inhibitors
US7432292B2 (en) Sulfhydantoins as phosphate isosteres
Xu et al. Design, synthesis, and biological evaluation of 2-oxo-3, 4-dihydropyrimido [4, 5-d] pyrimidinyl derivatives as new irreversible epidermal growth factor receptor inhibitors with improved pharmacokinetic properties
Song et al. Synthesis of selective PAK4 inhibitors for lung metastasis of lung cancer and melanoma cells
Ran et al. Development of novel hydrazidoarylaminopyrimidine-based BTK/FLT3 dual inhibitors with potent in vivo anti-hematological malignancies effects
US20190015410A1 (en) Heterocyclic pdk1 inhibitors for use to treat cancer
Wang et al. Design and synthesis of dual BRD4/Src inhibitors for treatment of triple-negative breast cancer
US20240043374A1 (en) N-benzyl-alpha-aminoamides as anaphase-promoting complex/cyclosome (apc/c) inhibitors
WO2019238088A1 (zh) 吡啶并吡啶酮衍生物的盐型及晶型
WO2024040241A1 (en) Pharmaceutical formulations, processes for preparation, and methods of use
Lakkaniga Targeting Aurora Kinase B for cancer therapy: Molecular dynamics studies and discovery of selective first-in-class inhibitors
Yoon et al. Design, synthesis of new 3H-imidazo [4, 5-b] pyridine derivatives and evaluation of their inhibitory properties as mixed lineage kinase 3 inhibitors
Aziz et al. CHAPTER EIGHT: NOVEL THIAZOLIDINES OF POTENTIAL ANTI-PROLIFERATION PROPERTIES AGAINST ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA VIA ERK PATHWAY
Bandi et al. Synthesis and Biological Evaluation of Fused [1, 2, 3] Triazolo [4ʹ, 5ʹ: 4, 5] pyrido [2, 3-d] pyrimidine Linked 1, 2, 3-Triazolesas Potent EGFR Targeting Anticancer Agents
Bestgen Selective modulation of the Protein Kinase CK2

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant