KR20130099146A - Ｃｈｋ１ 억제에 유용한 화합물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Chk1을 억제하며 암의 치료에 유용한 아미노피라졸 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

Description

ＣＨＫ１ 억제에 유용한 화합물{COMPOUNDS USEFUL FOR INHIBITING CHK1}
본 발명은 Chk1을 억제하며 데옥시리보핵산 (DNA) 복제, 염색체 분리, 및/또는 세포 분열의 결함을 특징으로 하는 암을 치료하는 데에 유용한 아미노피라졸 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
Chk1은 DNA 손상 체크포인트 신호 전달 경로에서 Atm 및/또는 Atr의 하류에 위치하는 단백질 키나제이다. 포유동물 세포에서, Chk1은 이온화 방사선 (IR), 자외선 (UV) 광, 및 히드록시우레아를 포함하여 DNA 손상을 야기하는 요인에 반응하여 인산화된다. 포유동물 세포에서 Chk1을 활성화하는 이와 같은 인산화는 Atr에 의존성이다. Chk1은 S 단계 및 G2M에서의 정지로 이어지는 Atr 의존성 DNA 손상 체크포인트에서 역할을 한다. Chk1은 보통은 시클린 E/Cdk2를 탈인산화하는 이중-특이성 포스파타제인 Cdc25A를 인산화하여 불활성화함으로써, S-단계의 진행을 중지시킨다. Chk1은 또한 시클린 B/Cdc2 (Cdk1으로도 알려져 있음)를 탈인산화하는 이중 특이성 포스파타제인 Cdc25C를 인산화하여 불활성화함으로써, 세포 주기 진행을 G2와 유사분열의 경계에서 중지시킨다 (문헌[Furnari et al., Science , 277: 1495-7, 1997]). 양 경우에서, Cdk 활성의 조절은 DNA 손상 또는 복제되지 않은 DNA의 존재시 세포가 유사분열에 진입하는 것을 방지하는 세포 주기의 중지를 유도한다.
Chk1의 다양한 억제제들이 보고되어 있다. 한편, WO 2005/121121호는 글루코스 대사의 조절자인 것으로 주장되는 소정의 아미노피라졸 화합물에 대해 개시하고 있다.
그러나, DNA 손상 요인의 증강제로서 효과적으로 작용할 수 있는 세포 주기 체크포인트의 강력한 억제제인 Chk1 억제제에 대한 요구가 여전히 존재한다.
본 발명은 암의 치료에 유익할 수 있는 Chk1의 강력한 억제제인 화합물을 제공한다. 본 화합물은 조직 배양 및 생체 내에서 DNA 손상 요인을 사용한 처리에 의해 유도되는 Chk1 매개 세포 주기 중지를 강력하게 폐기한다. 또한, 본 발명의 화합물은 암의 치료에 유익할 수 있는 Chk2의 억제를 제공한다. 또한, 본 발명의 화합물은 Chk1 억제에 의존성인 기작에 의해 암 세포의 세포 증식을 억제한다.
그와 같은 신규 화합물은 안전하고 효과적인 암의 치료에 대한 요구를 해소할 수 있다.
본 발명은 (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물을 제공한다. 바람직한 실시양태는 (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민, (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 메탄 술폰산염, (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 아세트산염, (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 헤미옥살레이트염, 및 (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 헤미숙시네이트염이다.
구체적인 실시양태로서, 본 발명은 (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민인 화합물을 제공한다.
본 발명은 (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민의 메탄 술폰산염, 아세트산염, 헤미옥살레이트염, 및 헤미숙시네이트염을 제공한다.
또 다른 실시양태는 (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민의 수화물이다.
본 발명은 결정질 형태의 (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 수화물을 제공한다.
본 발명은 또한 15.73, 17.71 및 20.12로 이루어진 군에서 선택되는 피크들 중 하나 이상과 함께 5.17의 2θ±0.2에서의 피크를 가지는 X-선 분말 회절 패턴을 특징으로 하는, 결정질 형태의 (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 수화물을 제공한다.
본 발명은 (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제, 및 임의로 다른 치료 성분과 함께 (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 유효량의 (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 또는 그의 제약상 허용되는 염을 암 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 유효량의 (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 이온화 방사선을 암 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법도 제공한다. 또한, 본 발명은 유효량의 (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 1종 이상의 화학치료제를 암 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 또는 그의 제약상 허용되는 염의, 암 치료용 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 치료가 이온화 방사선과의 조합 요법을 포함하는, (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 또는 그의 제약상 허용되는 염의, 암 치료용 약제의 제조를 위한 용도도 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 조합 요법 치료가 동일 환자에 대한 상기 약제의 투여 및 1종 이상 화학치료제의 투여를 포함하는, (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 또는 그의 제약상 허용되는 염의, 조합 요법에 의한 암 치료용 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 요법에서 사용하기 위한, (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 또한, 본 발명은 요법에서 사용하기 위한, (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 이온화 방사선도 제공한다. 또한, 본 발명은 요법에서 사용하기 위한, (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 1종 이상의 화학치료제를 제공한다.
본 발명은 암의 치료에서 사용하기 위한 (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 또한, 본 발명은 암의 치료에서 사용하기 위한 (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 이온화 방사선도 제공한다. 또한, 본 발명은 암의 치료에서 사용하기 위한 (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 1종 이상의 화학치료제를 제공한다.
본 발명은 약제가 이온화 방사선과 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여되는 것인, (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 또는 그의 제약상 허용되는 염의, 암 치료용 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 약제가 1종 이상의 화학치료제도 포함하거나, 또는 1종 이상의 화학치료제와 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여되는 것인, (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 또는 그의 제약상 허용되는 염의, 암 치료용 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 암의 치료에서 이온화 방사선과 동시, 별도 또는 순차 조합으로써 사용하기 위한, (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
본 발명은 암의 치료에서 1종 이상의 화학치료제와 동시, 별도 또는 순차 조합으로써 사용하기 위한, (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
또한, 본 발명은 1종 이상의 화학치료제가 5-플루오로우라실, 히드록시우레아, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 독소루비신, 에토포시드, 시스플라틴 및 탁솔로 이루어진 군에서 선택되는, 본원에서 기술되는 바와 같은 방법 및 용도들의 바람직한 실시양태를 제공한다. 또한, 본 발명은 5-플루오로우라실, 히드록시우레아, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 독소루비신, 에토포시드, 시스플라틴 및 탁솔로 이루어진 군에서 2종의 화학치료제가 선택되는, 본원에서 기술되는 바와 같은 방법 및 용도들의 더욱 바람직한 실시양태를 제공한다. 또한, 본 발명은 화학치료제가 5-플루오로우라실, 히드록시우레아, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 독소루비신, 에토포시드, 시스플라틴 및 탁솔로 이루어진 군에서 선택되는, 본원에서 기술되는 바와 같은 방법 및 용도들의 더욱 더 바람직한 실시양태를 제공한다. 본원에서 기술되는 방법 및 용도들의 바람직한 실시양태는 방광암, 결장암, 위암, 간암, 폐암, 유암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 중피종, 신장암 및 자궁암으로 이루어진 군에서 선택되는 암이다.
상기 및 본 발명의 상세한 설명 전체에 걸쳐 사용될 때, 다르게 표시되지 않는 한, 하기의 용어들은 하기의 의미를 가지는 것으로 이해되어야 한다:
"제약상 허용되는 염" 또는 "제약상 허용되는 염들"은 본 발명 화합물의 비교적 비-독성인 무기 및 유기 염을 지칭한다.
본 발명의 화합물은 예를 들면 수많은 무기 및 유기 산과 반응하여 제약상 허용되는 염을 형성할 수 있다. 그와 같은 제약상 허용되는 염 및 일반적인 그의 제조 방법론에 대해서는 업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 문헌 [P. Stahl, et al ., Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, (VCHA/Wiiey-VCH, 2002)]; [S.M. Berge, et al ., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, January 1977]을 참조하라.
본 발명의 화합물은 바람직하게는 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 사용하여 제약 조성물로 제제화된 후, 다양한 경로에 의해 투여된다. 바람직하게는, 그와 같은 조성물은 경구, 피하, 또는 정맥내 투여용이다. 그와 같은 제약 조성물 및 그의 제조 방법에 대해서는 업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, et al ., eds., 21st ed., Mack Publishing Co., 2005)]을 참조하라.
"치료", "치료하다", "치료하는" 등의 용어는 장애의 진행을 느리게 하거나 역행시키는 것을 포함하여 의미한다. 이들 용어는, 해당 장애 또는 상태가 실제로 제거되지는 않는다 할지라도, 그리고 장애 또는 상태의 진행 자체가 느려지거나 역행되지는 않는다 할지라도, 장애 또는 상태의 1종 이상 증상을 경감하거나, 개선하거나, 약화시키거나, 제거하거나, 또는 감소시키는 것 역시 포함한다.
"치료 유효량" 또는 "유효량"은 연구자, 수의사, 진료의, 또는 기타 임상의에 의해 탐구되는 조직, 시스템, 동물, 포유동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응, 또는 그에 대한 원하는 치료 효과를 도출하게 되는, 본 발명 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 본 발명 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 함유하는 제약 조성물의 양을 의미한다.
실제로 투여되는 본 발명 화합물의 양은 치료될 상태, 선택된 투여 경로, 투여되는 실제 본 발명 화합물, 개별 환자의 연령, 체중 및 반응, 그리고 환자 증상의 중증도를 포함한 관련 상황하에서 의사에 의해 결정될 것이다. 일 당 투약량은 보통 약 0.1 내지 약 10 mg/kg체중의 범위 내에 속한다. 일부 경우에는, 상기언급된 범위의 하위 한계 미만인 투약량 수준이 더 적정할 수 있는 반면, 다른 경우에는, 더 큰 투여량이 사용될 수도 있다.
본 발명의 화합물은 업계에 알려져 있는 다양한 절차는 물론, 하기의 제조예 및 실시예에서 기술되는 것들에 의해 제조될 수 있다. 기술되는 각 경로에 있어서의 구체적인 합성 단계들은 본 발명의 화합물을 제조하기 위하여 상이한 방식으로 조합될 수 있다.
반응물 및 개시 재료들은 일반적으로 업계 일반의 숙련자에게 쉽게 가용한 것들이다. 그 밖의 것들은 유기 및 헤테로시클릭 화학의 표준 기술들, 공지의 구조적으로 유사한 화합물의 합성과 유사한 기술들, 그리고 소정의 신규 절차를 포함하여 하기하는 제조예 및 실시예에서 기술되는 절차들에 의해 제조될 수 있다. 하기의 제조예 및 실시예는 본 발명을 더 상세하게 예시하고 화합물의 통상적인 합성을 나타내기 위하여 제공된다. 본 발명 화합물의 명칭은 일반적으로 오토놈 애드-인(Autonom add-in)을 사용하여 ISIS Draw 2.5 SP2에 의해 제공된다.
본원에서 사용될 때, 하기의 용어들은 표시된 의미를 가지는 바: "BCA"는 비신코닌산을 지칭하고; "BSA"는 소 혈청 알부민을 지칭하고; "DMSO"는 디메틸술폭시드를 지칭하고; "DPBS"는 이염기성 포스페이트-버퍼링된 식염수를 지칭하고; "DTT"는 디티오트레이톨을 지칭하고; "EtOAc"는 에틸 아세테이트를 지칭하고; "FBS"는 소 태아 혈청을 지칭하고; "HEPES"는 N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산을 지칭하고; "MEM"은 최소 필수 배지를 지칭하고; "MeOH"는 메탄올을 지칭하고; "PBS"는 포스페이트-버퍼링된 식염수를 지칭하고; "PI"는 요오드화 프로피듐을 지칭하고; "RNAase"는 리보뉴클레아제 A를 지칭하고; "RPMI"는 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institue)를 지칭하고; "TBST"는 트리스-버퍼링된 식염수 트윈(Tween)-20을 지칭하고; "THF"는 테트라히드로퓨란을 지칭하고; "TR-FRET"는 시간 분해 형광 에너지 전달(time resolved fluorescent energy transfer)을 지칭하고; "트리스(Tris)"는 트리스(히드록시메틸) 아미노메탄을 지칭하고; "트리톤(Triton)-X"는 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐-폴리에틸렌 글리콜 t-옥틸페톡시폴리에톡시에탄올 폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르를 지칭하고; "트윈-20"은 폴리소르베이트 20을 지칭한다.
제조 1
tert-부틸 (R)-3-(6-클로로피라진-2-일)옥시피페리딘-1-카르복실레이트
Figure pct00001
수소화 나트륨 (225.6 g, 5.64 mol)을 THF (3 L)에 분산시키고, 온도를 0-5 ℃로 낮춘다. 0-5 ℃ 사이로 온도를 유지하면서, THF (3 L) 중 (R)-3-히드록시-1-boc 피페리딘 (891.6 g, 4.43 mol)의 용액을 1시간에 걸쳐 첨가한다. 반응액을 1시간 동안 교반한다. 동일한 온도를 유지하면서, THF (3 L) 중 용액으로서의 2,6-디클로로피라진 (600 g, 4.03 mol)을 1.5시간에 걸쳐 적가한다. 반응액을 25-30 ℃에서 2시간 동안 교반한 다음, 얼음 위에 붓는다. 혼합물을 물로 희석한 후, 에틸 아세테이트로 추출한다. 추출물을 무수 나트륨 술페이트상에서 건조한 후, 여과하여, 농축한다. 잔류 오일을 헥산 중 5 % 디클로로메탄으로 연화처리함으로써, 백색의 고체로서 생성물을 산출한다. 여과에 의해 고체를 수집하여, 건조함으로써, 1538 g의 조 물질을 생성시킨다. 헥산 중 5 % 디클로로메탄을 사용하여 조 생성물을 재연화처리함으로써, 정량 수율로 백색의 고체를 생성시킨다. ES/MS m/z 314.1 [M+H]+.
제조 2
2-메톡시-6-메틸-니코틴산 메틸 에스테르
Figure pct00002
MeOH 중 2-클로로-6-메틸-니코틴산 메틸 에스테르 (10.4 g, 56.52 mmol)의 교반 용액에 질소하에 실온에서 메탄올 (80.0 mL) 중 나트륨 (2.58 g, 113.04 mmol)의 용액 (나트륨 금속을 질소 분위기하에서 메탄올에 용해시킴)을 첨가한다. 반응 혼합물을 밤새 환류시킨다. 반응액을 실온으로 냉각하고, 아세트산을 사용하여 pH를 pH=7로 조정한다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (100 mL) 및 물 (30 mL)로 희석한다. 유기 층을 분리하고, 에틸 아세테이트 (2×75 mL)를 사용하여 수성 층을 추출한다. 합쳐진 유기 추출물을 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하여, 농축함으로써, 조 생성물을 생성시킨다. 수율: 7.25 g (71 %).
Figure pct00003
제조 3
5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일아민
Figure pct00004
n-BuLi (1.2 M, 96.0 mL, 115.6 mmol)을 -78 ℃에서 THF (300 mL) 중 아세토니트릴 (6.08 mL, 115.4 mmol)의 용액에 첨가하고, -78 ℃에서 30분 동안 교반시킨다. THF (200 mL) 중 2-메톡시-6-메틸-니코틴산 메틸 에스테르 (20 g, 105.1 mmol)를 첨가하고, -78 ℃에서 다시 30분 동안 교반한다. -78 ℃에서 물 (500 mL)을 사용하여 반응 혼합물을 급랭한 후, EtOAc (2×250 mL)로 세척한다. 수성 층을 분리한 후, 증발시킨다. 이것을 톨루엔과 함께 2회 공동-증류함으로써, 3-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-3-옥소-프로피오니트릴을 수득한다. 수율 = 21.4 g (조물질). ES/MS m/z 191.1 [M+H]+.
에탄올 (200 mL) 중 3-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-3-옥소-프로피오니트릴 (21 g, 110.4 mmol)의 용액을 밀봉된 튜브 내에 위치시킨다. 히드라진 수화물 (32.1 mL, 662.4 mmol) 및 아세트산 (21.0 mL)을 첨가하고, 반응액을 100 ℃로 2시간 동안 가열한다. 용매를 증발 제거하고, 반응 혼합물을 EtOAc (500 mL) 및 포화 나트륨 비카르보네이트 용액 (100 mL)로 희석한다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc (2×250 mL)로 추출한다. 합쳐진 유기 추출물을 Na2SO4 상에서 건조한 후, 여과하여, 농축함으로써, 어떠한 추가적인 정제도 없이 다음 단계로 전달되는 조 생성물을 생성시킨다. 수율 = 16.5 g (73 %).
Figure pct00005
제조 4
5-아미노-3-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-피라졸-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르
Figure pct00006
THF (200 mL) 중 5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일아민 (16.0 g, 78.3 mmol)의 용액을 0 ℃에서 THF (200 mL) 중 NaH (무기 오일 중 60 %, 3.4 g, 85.0 mmol)의 교반 현탁액에 천천히 첨가한다. 0 ℃에서 15분 후, 디-tert-부틸디카르보네이트 (19.8 mL, 86 mmol)를 천천히 반응 혼합물에 첨가하고, 0 ℃에서 30분 동안 교반한다. 빙수 (대략 250 mL)를 사용하여 반응 혼합물을 급랭하고, 에틸 아세테이트 (2×500 mL)로 생성물을 추출한다. 합쳐진 유기 부분을 물 및 포화 NaCl 용액 (200 mL)으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조한 후, 여과하여, 진공하에서 농축함으로써, 조 물질을 산출한다. 이와 같은 물질을 헥산으로 2회 연화처리함으로써, 18.5 g (78 %)의 표제 화합물을 수득한다.
Figure pct00007
제조 5
(R)-3-{6-[2-tert-부톡시카르보닐-5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일아미노]-피라진-2-일옥시}-피페리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르
Figure pct00008
1,4-디옥산 (1.4 L) 중 5-아미노-3-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-피라졸-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르 (50.0 g, 164.5 mmol), tert-부틸 (R)-3-(6-클로로피라진-2-일)옥시피페리딘-1-카르복실레이트 (56.6 g, 180.9 mmol), 4,5-비스-디페닐포스파닐-9,9-디메틸-9H-크산텐 (14.2 g, 24.6 mmol) 및 Cs2CO3 (85.5 g, 263 mmol)의 혼합물을 동일하게 둘로 나누어 나란히 원형저 플라스크에 넣고, 모두를 아르곤으로 2시간 동안 퍼징한다. Pd(OAc)2 (5.4 g, 24.6 mmol)를 첨가하고 (각 용기에 절반씩), 1시간 동안 퍼징을 계속한다. 다음에, 반응액을 90-95 ℃로 1시간 동안 가열한다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각한 후, 합쳐, 에틸 아세테이트 (1 L)로 희석한다. 다음에, 혼합물을 규조토를 통하여 여과하고, 에틸 아세테이트로 세척한 후, 여과액을 농축한다. 실리카 겔 상에서 용리액으로서 15 % EtOAc/헥산을 사용하여 조 생성물을 정제함으로써, 55 g (57 % 수율)의 백색 분말을 제공한다. 55 g의 정제된 생성물을 15 g의 유사하게 제조 및 정제된 물질 (20 g의 5-아미노-3-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-피라졸-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르로부터 수득)과 합친다. 합쳐진 70 g의 물질을 THF와 메탄올의 4:1 혼합물 (1.4 L)에 용해시키고, 콰드라실(QuadraSil)™ AP (140 g)로 2시간 동안 처리한다. 반응 혼합물을 규조토를 통하여 여과하고, 에틸 아세테이트 (4×100 mL)로 세척한다. 여과액을 다시 콰드라실™ AP (140 g)과 함께 2시간 동안 교반한 후, 상기와 같이 여과한다. 용매를 증발시켜 백색의 고체로서 표제 화합물을 생성시킨다. 수율 = 70 g (47 %). ES/MS m/z 582.5 [M+H]+.
실시예 1
(R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민
Figure pct00009
디클로로메탄 (150 mL) 중 (R)-3-{6-[2-tert-부톡시카르보닐-5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일아미노]-피라진-2-일옥시}-피페리딘-1-카르복실산 tert-부틸 에스테르 (13.0 g, 22.3 mmol)의 교반 용액에, 0 ℃에서 5분의 기간에 걸쳐 디클로로메탄 (20 mL) 중 트리플루오로아세트산 (12.4 mL, 167 mmol)의 용액을 첨가한다. 반응액을 실온으로 가온시키고, 3시간 동안 교반한다. 반응액을 디클로로메탄 (1000 mL)으로 희석한 후, 이어서 포화 나트륨 비카르보네이트 용액 (250 mL)을 첨가한 다음, 4시간 동안 교반한다. 유기 부분을 분리하고, 무수 나트륨 술페이트 상에서 건조한 후, 여과하고, 증발시킨다. 생성 물질을 이소프로판올로부터 결정화하여, 원하는 생성물을 수득한다. 수율 = 7.2 g (85 %).
Figure pct00010
실시예 2
(R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 메탄 술폰산염
Figure pct00011
메탄 술폰산 (0.247 g, 2.57 mmol)을 0 ℃에서 디클로로메탄 (25 mL) 중 (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 (0.982 g, 2.57 mmol)의 교반 용액에 첨가한다. 반응액을 실온으로 가온시키고, 45분 동안 교반한다. 용매를 증발시키고, 생성되는 염을 에테르 (10 mL) 및 펜탄 (10 mL)으로 순차적으로 세척하여 원하는 생성물을 수득한다. 수율 = 1.139 g (92.6 %).
Figure pct00012
실시예 3
(R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 아세트산염
Figure pct00013
0 ℃에서, 디클로로메탄 (10 mL) 중 (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 (0.100 g, 0.26 mmol)의 용액에, 디클로로메탄 (1 mL)에 용해된 아세트산 (0.015 mL, 0.26 mmol)을 첨가한다. 반응 혼합물을 실온에서 60분 동안 교반한 다음, 용매를 증발시켜 잔류물을 수득한다. 잔류물을 디에틸 에테르 (20 mL)로 연화처리한 후, 이어서 n-펜탄 (20 mL)으로 연화처리한다. 고진공하에서 4시간 동안 물질을 건조함으로써, 원하는 생성물을 수득한다. 수율 = 0.060 g (51.8 %).
Figure pct00014
실시예 4
(R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 헤미옥살레이트염
Figure pct00015
디클로로메탄 (10 mL) 중 (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 (0.100 g, 0.26 mmol)의 용액에 0 ℃에서 MeOH (0.1 mL)에 용해된 옥살산 (0.012 mg, 0.13 mmol)을 첨가한다. 반응 혼합물을 실온에서 60분 동안 교반한 다음, 용매를 증발시켜 잔류물을 수득한다. 잔류물을 디에틸 에테르 (20 mL)로 연화처리한 후, 이어서 n-펜탄 (20 mL)으로 연화처리한다. 고진공하에서 4시간 동안 물질을 건조함으로써, 표제 화합물을 수득한다. 수율 = 0.095 g (77 %).
Figure pct00016
Figure pct00017
실시예 5
(R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 헤미숙시네이트염
Figure pct00018
디클로로메탄 (10 mL) 중 (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 (0.1 g, 0.26 mmol)의 용액에 실온에서 에탄올 (1 mL, 50 ℃에서 용해)에 용해된 숙신산 (0.015 g, 0.13 mmol)을 첨가한다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한다. 용매를 증발시키고, 수득된 잔류물을 디에틸 에테르 (20 mL)로 연화처리한 후, 이어서 n-펜탄 (20 mL)으로 연화처리한다. 고진공하에서 8시간 동안 물질을 건조함으로써, 표제 화합물을 수득한다. 수율 = 0.102 g (78 %).
Figure pct00019
실시예 6
(R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 수화물
5:95 물-에탄올 혼합물 (10 mL)에 (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 (52.1 mg; ES/MS m/z 382.2 [M+H]+)을 현탁시키고, 주변 온도에서 48시간 동안 슬러리화한다. 진공 여과에 의해 백색 결정질의 고체를 회수한다.
CuKa 공급원 (λ=1.54060 Å) 및 반텍(Vantec) 검출기가 장착되어 있으며 35 kV 및 50 mA로 가동되는 브루커(Bruker) D4 엔데보(Endeavor) X-선 분말 회절측정기에서 결정질 고체의 X-선 분말 회절 (XRD) 패턴을 수득한다. 2θ에서 0.009°의 단계 크기로 2θ에서 4 내지 40° 사이로 샘플을 스캐닝한다. 건조 분말을 석영 샘플 용기에 충진하고, 유리 슬라이드를 사용하여 평활 표면을 수득한다. 본 발명의 경우에는, 2θ 중 ±0.2의 피크 위치 가변성이 표시된 결정 형태의 명확한 식별을 저해하지 않도록 잠재적 변이를 고려한다. 결정 형태의 확인은 통상적으로 더 현저한 피크인 특징적인 피크 (°2θ의 단위로)의 임의의 고유 조합을 기준으로 이루어질 수 있다. 주변의 온도 및 상대 습도에서 수집된 결정 형태 회절 패턴은 8.85 및 26.77 도 2-세타에서 NIST 675 표준 피크를 기준으로 조정되었다.
따라서, 화합물의 샘플 결정질 형태는 CuKa 방사선을 사용한 XRD 패턴이 하기 표 1에 기술되어 있는 바와 같은 회절 피크들 (2-세타 값)을 가지는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 패턴은 0.2 도의 회절 각도에 대한 허용치로 15.73, 17.71 및 20.12로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상 피크와의 조합으로써 5.17에서의 피크를 포함한다.
<표 1>
Figure pct00020
Chk1 생화학 검정
Chk1 생화학 활성에 대한 화합물의 효과는 CHK1/기질 펩티드 필터 결합 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 이 검정에서는, Cdc25의 아미노산 서열 잔기 206-225를 바탕으로 하는 합성 펩티드가 재조합 Chk1 단백질 키나제의 포스포-수용체 기질로 사용된다. Chk1은 γ-33P-ATP를 포스포-공여체 기질로 사용하여 방사성인 γ-33포스페이트 기를 합성 펩티드로 전달한다. 반응은 양이온 교환 종이 필터 플레이트 상에서의 펩티드 기질의 포획 및 방출되는 베타 입자의 섬광 계수에 의해 측정된다.
키나제 반응 (40 μL 반응 부피)은 96-웰 V-저면 폴리스티렌 플레이트에서 수행된다. 반응은 Chk1 효소의 첨가에 의해 개시된다. 최종 반응 조건은 67 mM HEPES 나트륨염 pH 7.4, 0.007 % (v/v) 트리톤™ X-100, 2.7 mM DTT, 2.7 mM MgCl2, 12 μM 펩티드 기질, 60 μM ATP 디나트륨염, 0.75 μCi γ-33P-ATP, 0.75 nM 활성 Chk1 효소, 4 % (v/v) DMSO 및 화합물의 연속 희석물 (1:3 연속 희석, 20 μM에서 시작, 10 단계)이다.
Chk1 효소 첨가 후, 반응액을 실온에서 90분 동안 인큐베이팅한 다음, 140 μL의 인산을 첨가함으로써 종료한다. 반응 혼합물을 포스포셀룰로스 양이온 교환 종이 불투명 필터 플레이트의 상응하는 웰로 옮겨 30분 동안 정치한다. 진공 다기관(manifold)에서 0.5 % 인산 (v/v) 200 μL의 5회 세척에 의해 필터 플레이트를 세척한다. 필터 플레이트를 밤새 건조한 후, 플레이트의 각 웰에 40 μL의 아미크로신트(Microscint)™-20을 첨가한다. 실온에서 4시간 동안 정치한 후, 마이크로베타 트리룩스(MicroBeta Trilux) 마이크로플레이트 섬광 계수기 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 사)를 사용하여 플레이트 중 방사능을 측정한다.
IC50 측정을 위하여, 각 플레이트에서 대조 전개로부터의 섬광 계수 비를 사용하여 각 농도에 대한 %억제를 계산한다. 이후, 액티비티베이스(ActivityBase) 4.0을 사용하여 10-단계 화합물 농도 데이터를 4-파라미터 논리 방정식에 피팅한다. 생성되는 곡선으로부터 절대 IC50 값을 계산한다. 실질적으로 상기와 같이 전개되는 이와 같은 검정에서 본 발명의 화합물을 시험한다. 예를 들면, 실시예 1의 화합물을 시험한 바, <0.001 μM (n=6)의 IC50을 가지는 것으로 나타났다. 또한, 실시예 2의 화합물을 시험한 바, <0.001 μM (n=3)의 IC50을 가지는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 본 발명의 영역에 속하는 화합물이 Chk1의 강력한 억제제임을 표시한다.
Chk2 생화학 검정
Chk2 생화학 활성에 대한 화합물의 효과는 CHK2/기질 펩티드 필터 결합 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 이 검정에서는, Cdc25C의 아미노산 서열 잔기 206-225를 바탕으로 하는 합성 펩티드가 재조합 Chk2 단백질 키나제의 포스포-수용체 기질로 사용된다. Chk2는 γ-33P-ATP를 포스포-공여체 기질로 사용하여 방사성인 γ-33포스페이트 기를 합성 펩티드로 전달한다. 반응은 양이온 교환 종이 필터 플레이트 상에서의 펩티드 기질의 포획 및 방출되는 베타 입자의 섬광 계수에 의해 측정된다.
키나제 반응 (40 μL 반응 부피)은 96-웰 V-저면 폴리스티렌 플레이트에서 수행된다. 반응은 Chk2 효소의 첨가에 의해 개시된다. 최종 반응 조건은 67 mM HEPES 나트륨염 pH 7.4, 0.007 % (v/v) 트리톤™ X-100, 2.7 mM DTT, 2.7 mM MgCl2, 12 μM 펩티드 기질, 60 μM ATP 디나트륨염, 0.75 μCi γ-33P-ATP, 1.4 nM 활성 Chk2 효소, 4 % (v/v) DMSO 및 화합물의 연속 희석물 (1:3 연속 희석, 20 μM에서 시작, 10 단계)이다.
Chk2 효소 첨가 후, 반응액을 실온에서 90분 동안 인큐베이팅한 다음, 140 μL의 인산을 첨가함으로써 종료한다. 반응 혼합물을 포스포셀룰로스 양이온 교환 종이 불투명 필터 플레이트의 상응하는 웰로 옮겨 30분 동안 정치한다. 진공 다기관에서 0.5 % 인산 (v/v) 200 μL의 5회 세척에 의해 필터 플레이트를 세척한다. 필터 플레이트를 밤새 건조한 후, 플레이트의 각 웰에 40 μL의 아미크로신트™-20을 첨가한다. 실온에서 4시간 동안 정치한 후, 마이크로베타 트리룩스 마이크로플레이트 섬광 계수기 (퍼킨 엘머 사)를 사용하여 플레이트 중 방사능을 측정한다.
IC50 측정을 위하여, 각 플레이트에서 대조 전개로부터의 TR-FRET 비를 사용하여 각 농도에 대한 %억제를 계산한다. 이후, 액티비티베이스 4.0을 사용하여 10-단계 화합물 농도 데이터를 4-파라미터 논리 방정식에 피팅한다. 생성되는 곡선으로부터 절대 IC50 값을 계산한다. 실질적으로 상기와 같이 전개되는 이와 같은 검정에서 본 발명의 화합물을 시험한다. 예를 들면, 실시예 1의 화합물을 시험한 바, 0.011 μM (SE=0.002, n=6)의 IC50을 가지는 것으로 나타났다. 또한, 실시예 2의 화합물을 시험한 바, 0.012 μM (SE=0.008, n=3)의 IC50을 가지는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 본 발명의 영역에 속하는 화합물이 Chk2의 강력한 억제제임을 표시한다.
Chk1 자가인산화 세포 기반 검정
Chk1의 억제제는 DNA 손상 반응이 활성화된 세포에서 단백질의 키나제 활성이 기질을 인산화하는 것을 방해하게 된다. Chk1의 용이하게 검출가능한 기질은 Chk1 자체의 자가인산화 부위인 세린 296이다. Chk1 상 세린 296 인산화의 양, 및 간접적으로 Chk1 단백질 키나제의 활성 수준을 측정하는 데에는 하기의 면역블럿 검정이 사용될 수 있다. 10 % (v/v) 열 불활성화 소 태아 혈청, 1× MEM 비-필수 아미노산, 1× 나트륨 피루베이트, 및 24 웰 세포 배양 플레이트의 웰 당 MEM 배양 배지 600 μL에 도말된 1×105개의 세포가 보충되어 있으며, L-글루타민을 포함하는 MEM w/얼 균형 염 용액(Earle's Balanced Salt Solution)에서 HeLa 세포를 배양한다. 세포를 37 ℃, 5 % CO2 및 95 %-100 % 습도에서 24시간 동안 인큐베이팅한다. 배양 배지 중 독소루비신 4 μM 모액 16 μL를 적절한 각 웰에 첨가함으로써, 독소루비신 100 nM의 최종 농도를 조성한다. Chk1 억제제 화합물 추가 전에, 플레이트를 추가 24시간 동안 인큐베이터로 복귀시킨다. 화합물은 100 % DMSO에 10 mM로 용해시킨 다음, 40 % (v/v) DMSO 중에 2 mM로 희석하고, 다음에 배양 배지 더하기 4 % (v/v) DMSO를 사용하여 100 μM로 희석한다. 이후, 100 μM 내지 0.005 μM 범위에 걸친 화합물의 연속 희석물 (1:3)을 제조한다. 66 μL의 화합물 모액을 플레이트의 적절한 웰에 첨가함으로써, 0.4 % (v/v)의 최종 DMSO 농도 및 1 μM 내지 0.0005 μM 사이 범위의 최종 화합물 농도를 산출한다. 플레이트를 추가 2시간 동안 인큐베이터로 복귀시킨 다음, 세포 용해 및 처리를 위하여 꺼낸다. 다음에, 플레이트로부터 배지를 제거하고, 각 웰을 0.5 mL의 빙냉 둘베코 포스페이트-버퍼링 식염수 (DPBS)로 1회 세척한 후, 모든 액체를 제거하고, 나머지 절차를 위하여 플레이트를 얼음상에 위치시킨다. 각 웰에, 포스파타제 억제제 칵테일 (시그마(Sigma) 사, cat# P0044 + P5725) 및 프로테아제 억제제 칵테일 정제 (로체 디아그노스틱스(Roche Diagnostics) 사, cat# 11836153001)를 함유하는 세포 추출 버퍼로 구성되는 빙냉 용해 버퍼 75 μL를 첨가한다. 10분 후, 각 웰을 벗겨내고, 용해물을 얼음상 1.5 mL 폴리프로필렌 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다. 물/얼음 배스에서 현탁하면서, 플레이트 큐폰(cuphorn) 초음파처리장치 (미소닉스(Misonix) 사)를 사용하여 각 용해물을 45초 동안 초음파처리한다. 50 μL의 각 샘플을 25 μL의 4× 램리(Laemmli) 샘플 버퍼를 포함하는 0.5 mL 폴리프로필렌 마이크로원심분리 튜브로 옮기고, 95 ℃로 5분 동안 가열한 후, -80 ℃에서 냉동 저장한다. 나머지 용해물은 단백질 농도의 측정에 사용한다 (BCA 단백질 검정 키트, 서모 사이언티픽(Thermo Scientific) 사). 5 ㎍의 샘플 버퍼 중 각 세포 용해물을 E-Page 96 웰 겔에 적용하여, 전기영동에 적용한다. 업계에 잘 알려져 있는 절차에 따라 (문헌 [Towbin et al ., PNAS (1979) 76(9), 4350-4]), 단백질을 겔로부터 이모빌론(Immobilon)-P 막 PVDF (0.45 ㎛)로 전기이동시킨다. 10 mM 트리스/HCl pH 8.0, 150 mM NaCl 및 0.05% (v/v) 트윈 20 (TBST)를 사용하여 막을 간단하게 세정한 후, 25 ℃에서 1시간 동안 TBST/5 % (v/v) 재구성 카네이션(Carnation)® 인스턴트 우유에 침지시킨다. TBST를 사용하여 5분 동안 4회 막을 세척한 다음, 토끼 항-포스포-Chk1 (세린 296)의 적절한 희석물을 포함하는 TBST/5 % (w/v) 소 혈청 알부민 중에서 4 ℃로 24시간 동안 침지한다. 막을 25 ℃에서 TBST로 5분 동안 4× 세척한 다음, 25 ℃에서 2시간 동안 양고추냉이 퍼옥시다제 (GE 헬스케어(Healthcare) 사, cat# NA9340)에 접합된 당나귀 항-토끼 IgG의 적절한 희석물을 함유하는 TBST/5 % 우유에 침지시킴으로써, 자가인산화된 Chk1 단백질을 검출한다. 막을 다시 25 ℃에서 5분 동안 TBST로 4× 세척한다. 후지 LAS-4000 화상화 시스템에서 수퍼 시그날 웨스턴 펨토(Super Signal Western Femto) HRP-검출 시약을 사용하여 막에 고정된 항원-항체-리포터 접합체를 검출한다. "토탈 랩(Total Lab)" 소프트웨어 (논리니어 다이나믹스(Nonlinear Dynamics) 사)를 사용하여 포스포-Chk1 (ser296) 밴드 강도를 계산한다. 하기의 수학식을 사용하여 독소루비신 유도 Chk1 자가인산화의 %억제를 계산한다: %억제 = (샘플 -포스포-Chk1 밴드 강도 - 무독소루비신 음성 대조 -포스포-Chk1 밴드 강도) / (독소루비신 양성 대조 -포스포-Chk1 밴드 강도 - 무독소루비신 음성 대조 -포스포-Chk1 밴드 강도) × 100. 실질적으로 상기와 같이 전개되는 이와 같은 검정에서 본 발명의 화합물을 시험한다. 이와 같은 검정에서 실시예 1의 화합물을 시험한 바, <0.001 μM (n=1)의 EC50을 가지는 것으로 나타났다. 이와 같은 검정에서 실시예 3의 화합물을 시험한 바, <0.001 μM (n=1)의 EC50을 가지는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 본 발명의 영역에 속하는 화합물이 Chk1의 강력한 억제제임을 표시한다.
독소루비신-유도 G2M 체크포인트 폐기 HeLa 세포-기반 아큐멘 검정
Chk1의 억제제는 토포이소머라제 II 억제제인 독소루비신으로 처리된 p53-음성(minus) 종양 세포에서 G2M DNA 손상 체크포인트를 무력화하게 된다. G2M 체크포인트 폐기의 척도는 세포가 G2M 체크포인트를 지나 유사분열에 진입한 후 이루어지는 히스톤 H3의 세린 10상에서의 인산화이다. 세포에서의 히스톤 H3의 인산화를 측정하는 데에는 하기의 고함량 화상화 검정(high content imaging assay)이 사용될 수 있다. 10 % (v/v) FBS가 보충되고 폴리 D-리신 코팅된 투명저 블랙 플레이트에 웰 당 2000개 세포로 도말되며, 웰 당 100 μL 부피인 MEM 배지에서 HeLa 세포를 배양한다. 다음에, 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에서 18-24시간 동안 인큐베이팅한다 (37 ℃, 5 % CO2 및 95 % 상대 습도). 개시 인큐베이션 후, 625 nM의 독소루비신을 함유하는 20 μL의 MEM 배지 더하기 10 % FBS를 플레이트의 적절한 웰에 첨가함으로써, 125 nM의 최종 농도를 산출한다. 플레이트를 G2M 체크포인트에서 세포를 중지시키기에 충분한 24시간 동안 인큐베이터로 복귀시킨다. 다음날, 세포를 화합물로 처리한다. 화합물은 100 % DMSO에 10 mM로 용해시킨 다음, MEM 더하기 4 % (v/v) DMSO 중에서 50 μM로 시작하여 10× 모액까지 희석한다. 이후, 50 μM 내지 0.39 μM 범위에 걸쳐 화합물의 연속 희석물 (1:2)을 제조한다. 13 μL의 화합물 모액을 플레이트의 적절한 웰에 첨가함으로써, 0.4 %의 최종 DMSO 농도 및 5 μM 내지 0.039 μM 사이 범위의 최종 화합물 농도를 산출한다. 추가 7시간 동안 플레이트를 인큐베이터로 복귀시킨 다음, 고정을 위하여 제거한다. 각 웰로부터 조심스럽게 액체를 제거한 후, 100 μL의 프레퍼(PREFER)™ 고정제(fixative)를 첨가한다. 플레이트를 실온에서 20분 동안 유지하고, 고정제를 제거한 다음, 10분 동안 100 μL/웰의 DPBS 중 0.1 % (v/v) 트리톤® X100을 첨가함으로써 세포를 투과화한다. 용액을 제거하고, 플레이트를 웰 당 100 μL의 DPBS로 2회 세척한 후, 이어서 실온에서 1시간 동안 50 ㎍/mL의 리보뉴클레아제 A (RNAase, 소 췌장 유래)를 함유하는 DPBS 100 μL를 첨가한다. RNAase 용액을 제거하고, 토끼 항-pHH3 (ser10) 더하기 1 % (w/v) BSA의 1:500 희석물을 함유하는 RNAase 용액 50 μL를 각 웰에 첨가함으로써, 세린 10상에서 인산화된 히스톤 H3 (pHH3)의 존재에 대하여 세포를 염색한다. 플레이트를 밀봉하고, 4 ℃에서 밤새 유지한다. 웰 당 100 μL의 DPBS를 사용하여 각 플레이트를 2회 세척함으로써 일차 항체를 제거하고, DPBS 더하기 1 % (w/v) BSA 중 알렉사 플루어(Alexa Fluor)® 488 염소 항-토끼 IgG (H+L) (2 mg/mL)의 1:750 희석물 50 μL로 대체한다. 광으로부터 보호하기 위하여 알루미늄 호일로 덮은 채로 플레이트를 실온에서 1시간 동안 유지한다. 플레이트를 다시 웰 당 100 μL의 DPBS로 2회 세척한 후, 100 μL의 15 nM 요오드화 프로피듐 (원래의 용액으로부터 PBS와의 1:100 희석물)으로 대체한다. 흑색 밀봉으로 플레이트를 밀봉하여, 광으로부터 플레이트를 보호한다. 플레이트를 30분 동안 인큐베이팅하여 핵을 염색한다. 아큐멘 익스플로러(ACUMEN EXPLORER)™ 레이저-스캐닝 형광 마이크로플레이트 세포측정기에서 488 nm 여기 (TTP 랩테크(LABTECH) LTC)를 사용하여 플레이트를 스캐닝함으로써, 2N, 및 4N을 포함한 pHH3 및 DNA 함량을 측정한다. 알렉사 488로부터의 519 nm에서의 평균 강도에 의해 pHH3 양성 세포를 식별한다. 세포 주기에서 개별 세포 및 하위군집 (2N 세포, 4N 세포)을 식별하는 데에는 요오드화 프로피듐/DNA로부터의 655-705 nm에서의 총 강도가 사용된다. 각 군집의 최종 해독치는 %pHH3, %2N, 및 %4N의 최종 검정 결과를 산출하는 총 세포의 %로 표준화함으로써 확인된다. 다음에, 100 % 활성은 각 화합물의 최종 %활성을 확인하기 위하여 100 nM의 억제제 대조 화합물 최대 농도를 사용하여 세포를 처리함으로써 확인된다. 0 % 활성은 화합물 처리가 없는 것을 기준으로 한다. 반응성 EC50은 100 %에서의 대조 최대치 대비 %pHH3를 확인하기 위하여 4 파라미터 로지스틱 피트 방정식 205를 사용하는 액티비티 베이스(ACTIVITY BASE)™ 엑셀 피트 곡선 피팅을 사용하여 확인된다. 실질적으로 상기와 같이 전개되는 이와 같은 검정에서 본 발명의 화합물을 시험한다. 실시예 1의 화합물을 시험한 바, 0.029 μM (n=1)의 EC50을 가지는 것으로 나타났다. 실시예 2 및 실시예 3의 화합물을 시험한 바, 각각 0.033 μM (n=1) 및 0.019 μM (n=1)의 EC50 결과를 가지는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 본 발명의 영역에 속하는 화합물이 G2M DNA 손상 체크포인트를 무력화하게 됨을 표시한다.
EC tfs (2-배 민감화 ) 검정
Chk1의 억제제는 지속적이고 증가된 DNA 손상을 초래하는 S 단계-내 체크포인트의 폐기를 통하여 젬시타빈 (또는 기타 세포독성제)의 항-증식 활성을 증강시킬 수 있다. DNA 손상 후 계속되는 종양 세포 증식 능력은 해당 DNA를 복제하는 세포의 능력을 확인함으로써 분석될 수 있다. 이와 같은 검정은 세포가 DNA 손상을 복구할 기회를 가진 후 그의 DNA를 복제하는 세포의 능력을 평가한다. 이와 같은 검정에서는, 일련의 젬시타빈 희석물을 사용하여 세포를 처리한 다음, 22시간 후 실시예 3의 화합물을 사용하여 처리한다. 추가 44시간 후, MTS (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-술포페닐)-2H-테트라졸륨) 염료 환원 검정에 의해 상대적인 세포 수를 평가한다. ECtfs 파라미터는 Chk1 억제의 부재하에 이와 같은 검정에서 측정된 젬시타빈의 GI90 농도를 절반 감소시키는 데에 필요한 Chk1 억제제의 농도의 측정치이다. RPMI 1640 더하기 10 % (v/v) 열 불활성화 FBS에서 HT-29 세포 (ATCC로부터 입수)를 성장시킨다. 96-웰 조직 배양 플레이트상 100 μL의 부피에 웰 당 2.5×103개로 세포를 도말하고, 24시간 동안 인큐베이팅한다. 맥코이(McCoy's) 5A 배지 (변형) (1×)에서 6× 농도로 젬시타빈 희석물을 제조하고, 웰 당 20 μL로 웰에 첨가한다. 젬시타빈 희석은 젬시타빈의 최고 최종 농도가 1.0 μM이 되고 0.5 nM까지 3-배 단계에 의해 희석이 이루어지도록 설정하였다.
4000× 최종 농도까지의 DMSO 중 희석에 의해 Chk1 억제제를 제조한 다음, 맥코이 배지에 666-배 희석함으로써 6× 모액을 생성시킨다. 25 nM에서 시작하여 아래로 0.3 nM까지 2.5-배 단계로 Chk1 억제제 희석을 진행한다. 젬시타빈 첨가 22시간 후, 120 μL의 배지 더하기 젬시타빈을 포함하는 웰에 24 μL의 부피로 Chk1 억제제를 첨가한다. 각 젬시타빈 희석물은 하나의 Chk1 억제제 희석물을 수용한다. 대조 웰은 DMSO, 젬시타빈, 또는 Chk1 억제제 단독을 수용한다. Chk1 억제제의 첨가 44시간 후, 30 μL의 셀타이터(CellTiter) 96® AQueous 검정 시약을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 45분 동안 유지한다. 스펙트라맥스(SpectraMax) 250 (몰큘라 디바이시즈(Molecular Devices) 사) 분광광도측정기에서 490 nm로 흡광도를 해독한다. 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 4.0을 사용하여 스펙트라맥스 분광광도측정기로부터의 데이터를 분석한다. 먼저, 각 플레이트로부터의 데이터 행렬 중 모든 다른 값으로부터 무세포 대조 흡광도의 평균을 차감한다. 다음에, 2반복 데이터 값을 평균한다. 0 % 세포 수를 보정된 A490=0으로 설정하고 100 % 세포 수를 0 nM 젬시타빈 평균 값으로 설정하여, 각 Chk1 억제제 농도에 대해 데이터를 표준화한다. 다음에, 이러한 결과를 변형한다. 젬시타빈 농도는 log 농도로 전환하고, 표준화된 세포 수 값은 %억제 (%억제 = 100 - 표준화된 값)으로 전환한다. 변형된 데이터를 플로팅하고, 비-선형 회귀를 전개하여, 각 Chk1 억제제 농도에서의 젬시타빈에 대한 IC50 값을 추정한다. 기울기 변화를 허용하고 투여량-반응 곡선의 상부 또는 하부에 대한 제한 없이 비선형 회귀를 계산한다. ECtfs 값은 하기와 같이 계산한다: 각 Chk1 억제제 농도에 있어서의 젬시타빈에 대한 GI50 값을 측정하여 플로팅하고, 보간법에 의해 젬시타빈 단독 GI50을 2-배 감소시키는 데에 필요한 Chk1 억제제의 농도를 측정한다.
실질적으로 상기와 같이 전개되는 이와 같은 검정에서 본 발명의 영역에 속하는 화합물을 시험한다. 예를 들면, 실시예 3의 화합물을 시험한 바, 1.0 nM (SE=0.1, n=3)의 ECtfs 값을 가지는 것으로 나타났다. 또한, HT-29 결장 암종 세포에서는, 25 nM의 화합물이 젬시타빈의 EC50을 22 nM로부터 3 nM로 7-배 감소시킨다. 25 nM의 실시예 3 화합물 단독으로는 HT-29 세포의 증식에 대하여 거의 효과를 가지지 않는다. 이러한 결과는 본 발명의 영역에 속하는 화합물이 저농도에서 젬시타빈의 항-증식 활성을 효과적으로 증강시킨다는 것을 표시한다.
Figure pct00021
Chk1 생체내 표적 억제 검정
성장 배지 (10 % (v/v) 열 불활성화 FBS, 1× MEM 비-필수 아미노산, 1× 나트륨 피루베이트가 보충되어 있으며 L-글루타민을 포함하는 얼 균형 염 용액을 포함하는 MEM)에서 Calu-6 세포를 배양하여, 증식시킨다. 세포를 수확하여, 포스페이트 버퍼링된 식염수로 2회 세척하고, 성장 배지 (혈청 없음) 중 1×106개의 세포를 동일 부피의 BD 마트리겔(Matrigel)™ 매트릭스와 혼합한 다음, 사전-조사된 (4.5 Gy) 누드 마우스 (무흉선 누드)의 옆구리에 피하로 주사한다. 이식 후 15일차에 (종양 크기 = 150-200 mm3), 매일 식염수 중에 새로 배합되는 젬시타빈을 150 mg/kg의 투여량으로 복막내 경로에 의해 동물에 투여한다. 6시간 후, 묽은 NaOH의 첨가에 의해 pH가 6.8로 조정된 0.2 % 트윈-80/0.5 % 메틸셀룰로스 중에 배합된 Chk1 화합물을 동물에 경구 투여한다. Chk1 억제제 투여 2시간 후 동물을 희생시켜, 종양을 수확하고, 포스파타제 억제제 칵테일 (시그마 사, cat# P0044 + P5725) 및 프로테아제 억제제 칵테일 정제 (로체 디아그노스틱스 사, cat# 11836153001)를 함유하는 빙냉 세포 추출 버퍼에서 즉시 처리한다. 빙냉된 15 mL 폴리프로필렌 원추형 튜브에서, 고속으로 설정된 동력화 조직 균질화기를 사용하여 15초 동안, 1.5-2.0 mL의 용해 버퍼 중에서 종양을 처리한다. 샘플을 얼음 상에서 유지하면서, 25 게이지 바늘이 구비된 1 mL 주사기를 통하여 용해물을 4회 추출한다. 0.35 mL의 종양 용해물을 0.15 mL의 4× 램리 샘플 버퍼를 포함하는 1.5 mL 폴리프로필렌 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다. 다음에, 샘플을 혼합하고, 95 ℃로 5분 동안 가열한 후, 미소닉스 3000 플레이트 혼 초음파처리장치에서 고전력을 사용하여 1분 동안 초음파처리한다. 다음에, 웨스턴 블럿에 의한 표적 억제 평가를 위하여, 샘플을 얼음상에서 저장하거나, 또는 -80 ℃에서 저장한다. 5 ㎍의 샘플 버퍼 중 각 종양 용해물을 E-Page 96 웰 겔에 적용하여, 전기영동에 적용한다. 업계에 잘 알려져 있는 절차에 따라 (문헌 [Towbin et al ., PNAS (1979) 76(9), 4350-4]), 니트로셀루로스 BA83 프로트란(Protran) 막 (와트만(Whatman) 사, Cat# 10402405)로 단백질을 옮긴다. 다음에, 세린 296에서 자가인산화된 Chk1 단백질을 측정하기 위하여, 막을 처리한다. 물, 다음에는 10 mM 트리스/HCl pH 8.0, 150 mM NaCl 및 0.05 % (v/v) 트윈 20 (TBST)를 사용하여 간단하게 막을 세정한 후, 25 ℃에서 1시간 동안 TBST/5 % (w/v) 재구성 카네이션 인스탄트 우유 중에 침지시킨다. 다음에, 막을 TBST로 5분 동안 4회 세척한다. 4 ℃에서 16시간 동안 토끼 -포스포-Chk1 항-포스포-Chk1 (세린 296)이 적절하게 희석된 TBST/5 % (w/v) BSA 중에 막을 침지한다. 다음에, 막을 25 ℃에서 TBST로 5분 동안 4회 세척한 다음, 포스포-Chk1 (ser296)을 검출하기 위하여, 25 ℃에서 2시간 동안 양고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 당나귀 항-토끼 IgG의 적절한 희석물을 함유하는 TBST/5 % 우유 중에 침지한다. 막을 다시 25 ℃에서 TBST로 5분 동안 4회 세척한다. 수퍼 시그날 웨스턴 펨토 HRP-검출 시약을 사용하여, 막에 고정된 항원-항체-리포터 접합체를 검출한다.
신호를 검출하고, 후지 LAS-4000 화상화 시스템을 사용하여 촬영한다. "토탈 랩" 소프트웨어 (논리니어 다이나믹스 사)를 사용하여 포스포-Chk1 (ser296) 밴드 강도를 계산한다. 하기의 수학식을 사용하여 젬시타빈 유도 Chk1 자가인산화의 %억제를 계산한다: %억제 = (샘플 -포스포-Chk1 밴드 강도 - 평균 젬시타빈 (Max) 양성 대조 -포스포-Chk1 밴드 강도) / (평균 음성 대조 (Min) -포스포-Chk1 밴드 강도 - 평균 젬시타빈 (Max) 양성 대조 -포스포-Chk1 밴드 강도) × 100.
실질적으로 상기와 같이 전개되는 이와 같은 검정에서 본 발명의 영역에 속하는 화합물을 시험한다. 예를 들면, 실시예 3의 화합물을 시험한 바, 1.3 mg/kg (n=1)의 Chk1 자가인산화에 대한 표적 조절 유효 투여량(Target Modulatory Effective Dose) 50 (TMED50)을 가지는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 본 발명의 영역에 속하는 화합물이 생체 내에서 Chk1 단백질 키나제의 활성을 강력하게 억제한다는 것을 표시한다.
인간 종양 이종이식 모델
DNA 손상제에 의한 종양 사멸을 증강시키는 Chk1 억제제의 능력은 Calu-6 폐 및 HT-29 결장 종양 이종이식 효능 모델을 사용하여 생체 내에서 확인될 수 있다. Calu-6 폐암 세포를 성장 배지 (10 % (v/v) 열 불활성화 FBS, 1× MEM 비-필수 아미노산, 1× 나트륨 피루베이트가 보충되어 있으며 L-글루타민을 포함하는 얼 균형 염 용액을 포함하는 MEM) 중에서 배양하고, HT-29 결장암 세포 (ATCC)를 성장 배지 (10 % FBS가 보충된 맥코이 5A 배지) 중에서 배양함으로써, 증식시킨다.
세포를 수확하여, 포스페이트 버퍼링된 식염수로 2회 세척하고, 성장 배지 (혈청 없음) 중 5×106개의 세포 (HT-29) 또는 1×106개의 세포 (Calu-6)를 동일 부피의 BD 마트리겔™ 매트릭스와 혼합한 다음, 누드 마우스 (CD-1 nu/nu)의 옆구리에 피하로 주사한다.
Chk1 억제제의 피하 투여
이식 후 약 16일차에 (150-200 mm3), 젬시타빈을 매일 새로 식염수 중에 배합하여, 60 mg/kg의 투여량으로 복막내 경로에 의해 동물에 투여한다. 24시간 후, 0.2 % 트윈-80/0.5 % 메틸셀룰로스 중 실시예 3의 화합물을 하루 2회 피하로 동물에 투여한다. 2일 동안 쉰 후, 3회의 추가 주기 동안 투여를 반복한다 (실시예 3의 화합물 개시 + 24시간으로 Q4D×4). 비히클-처리된 대조 군의 평균 종양 크기로부터의 화합물 처리 군의 평균 종양 크기의 %감소로서 종양 성장 억제 (TGI)를 계산한다. 실질적으로 상기와 같이 전개되는 이와 같은 검정에서 본 발명의 영역에 속하는 화합물을 시험한다. 예를 들면, 젬시타빈과의 조합으로써 투여된 실시예 3의 화합물은 HT-29 및 Calu-6 종양 이종이식 모델 모두에서 젬시타빈 단독 대비 종양 성장 억제 6-배 증가까지의 뛰어난 투여량 의존성 항-종양 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이와 같은 결과는 피하로 투여된 본 발명의 영역에 속하는 화합물이 인간 종양 이종이식 모델에서 젬시타빈의 항-종양 활성을 상당히 증가시킨다는 것을 표시한다.
Figure pct00022
Figure pct00023
Chk1 억제제의 경구 투여
이식 후 약 16일차에 (150-200 mm3), 젬시타빈을 매일 새로 식염수 중에 배합하여, 40 mg/kg의 투여량으로 복막내 경로에 의해 동물에 투여한다. 24시간 후, 0.2 % 트윈-80/0.5 % 메틸셀룰로스 중 Chk1 화합물을 하루 2회 경구 경로로 동물에 투여한다. 3일 동안 쉰 후, 3회의 추가 주기 동안 투여를 반복한다 (실시예 3의 화합물 개시 + 24시간으로 Q5D×4). 종양 성장 억제 (TGI)는 전기한 단락에 기술되어 있는 바와 같이 계산한다. 실질적으로 상기와 같이 전개되는 이와 같은 검정에서 본 발명의 영역에 속하는 화합물을 시험한다. 예를 들면, 젬시타빈과의 조합으로써 실시예 3의 화합물을 투여한 바, HT-29 및 Calu-6 종양 이종이식 모델 모두에서 젬시타빈 단독 대비 종양 성장 억제 2.9-배 증가까지의 뛰어난 투여량 의존성 항-종양 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이와 같은 결과는 경구로 투여된 본 발명의 영역에 속하는 화합물이 인간 종양 이종이식 모델에서 젬시타빈의 항-종양 활성을 상당히 증가시킨다는 것을 표시한다.
Figure pct00024
Figure pct00025

Claims (19)

  1. (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물.
  2. 제1항에 있어서, (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민인 화합물.
  3. 제1항에 있어서, (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 메탄 술폰산염인 화합물.
  4. 제1항에 있어서, (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 아세트산염인 화합물.
  5. 제1항에 있어서, (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 헤미옥살레이트염인 화합물.
  6. 제1항에 있어서, (R)-[5-(2-메톡시-6-메틸-피리딘-3-일)-2H-피라졸-3-일]-[6-(피페리딘-3-일옥시)-피라진-2-일]-아민 헤미숙시네이트염인 화합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 염, 및 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  8. 유효량의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 염을 암 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법.
  9. 유효량의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 염 및 이온화 방사선을 암 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법.
  10. 유효량의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 염 및 1종 이상의 화학치료제를 암 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법.
  11. 제10항에 있어서, 1종 이상의 화학치료제가 5-플루오로우라실, 히드록시우레아, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 독소루비신, 에토포시드, 시스플라틴 및 탁솔로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 방광암, 결장암, 위암, 간암, 폐암, 유암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 중피종, 신장암 및 자궁암으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  13. 요법에서 사용하기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 염.
  14. 암의 치료에서 사용하기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 염.
  15. 암의 치료에서 이온화 방사선과 동시, 별도 또는 순차 조합으로써 사용하기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 염.
  16. 암의 치료에서 1종 이상의 화학치료제와 동시, 별도 또는 순차 조합으로써 사용하기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 염.
  17. 제16항에 있어서, 1종 이상의 화학치료제가 5-플루오로우라실, 히드록시우레아, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 독소루비신, 에토포시드, 시스플라틴 및 탁솔로 이루어진 군에서 선택되는 것인 화합물 또는 염.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 방광암, 결장암, 위암, 간암, 폐암, 유암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 중피종, 신장암 및 자궁암으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 화합물 또는 염.
  19. 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제, 및 임의로 다른 치료 성분과 함께, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 염을 포함하는 제약 조성물.
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