BR112013010009B1 - Compostos úteis para inibição de chk1 - Google Patents
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Abstract
compostos úteis para inibição de chk1. a presente invenção refere-se a um composto de aminopirazol ou um sal farmaceuticamente aceitável, que inibe chk1 e é útil no tratamento de câncer.
Description
[0001] A presente invenção refere-se a um composto deaminopirazol, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, que inibe Chk1 e é útil para o tratamento de cânceres caracterizados por defeitos na replicação do ácido desoxirribonucleico (ADN), segregação cromossômica e / ou divisão celular.
[0002] Chk1 é uma proteína quinase que se encontra a jusante deAtm e / ou Atr na via de transdução de sinal do ponto de verificação de danos do ADN. Em células de mamíferos, Chk1 é fosforilada em resposta a agentes que causam dano ao ADN, incluindo radiação por ionização (IR), luz ultravioleta (UV) e hidroxiureia. Esta fosforilação que ativa Chk1 em células de mamíferos é dependente de Atr. Chk1 desempenha um papel no ponto de verificação de dano do ADN dependente de Atr. Chk1 fosforila e inativa Cdc25A, a fosfatase de especificidade dupla que normalmente desfosforila ciclina E/Cdk2, travando a progressão através da fase S. Chk1 também fosforila e inativa Cdc25C, a fosfatase de especificidade dupla que desfosforila ciclina B/Cdc2 (também conhecida como Cdk1) reprimindo a progressão do ciclo celular, na fronteira de G2 e mitose (Furnari et al., Science, 277:1495-7, 1997). Em ambos os casos, a regulação daatividade de Cdk induz uma paragem do ciclo celular para prevenir a entrada das células em mitose na presença de danos no ADN ou ADN não-replicado.
[0003] Vários inibidores de Chk1 foram relatados. Além disso, odocumento WO 2005/121121 descreve certos compostos de aminopirazol considerados moduladores do metabolismo da glicose.
[0004] No entanto, existe ainda uma necessidade de inibidores deChk1 que sejam potentes inibidores dos pontos de verificação do ciclo celular que podem atuar efetivamente como potenciadores de agentes que danificam o ADN. A presente invenção proporciona compostos que são inibidores potentes de Chk1, que podem ser benéficos para o tratamento do câncer. Os compostos potencialmente revogam uma paragem do ciclo celular mediada por Chk1 induzida por tratamento com agentes que danificam o ADN em cultura de tecidos e in vivo. Além disso, os compostos da presente invenção proporcionam a inibição de Chk2, o que pode ser benéfico para o tratamento de câncer. Além disso, os compostos da presente invenção inibem a proliferação celular de células cancerosas através de um mecanismo dependente da inibição de Chk1. Esses novos compostos suprir a necessidade de tratamentos seguros e eficazes de câncer.
[0005] A presente invenção proporciona um composto que é (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)- pirazin-2-il]-amina, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. Formas de realização preferidas são (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3- il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina, sal do ácido metano sulfônico de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3- il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina, sal hemioxalato de (R)-[5-(2- metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2- il-amina e sal hemissuccinato de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)- 2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina.
[0006] Como uma forma de realização particular, a presenteinvenção proporciona o composto que é (R)-[5-(2-metóxi-6-metil- piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina.
[0007] A presente invenção proporciona o ácido metano sulfônico,ácido acético, sais hemioxalato e hemissuccinato de (R)-[5-(2-metóxi- 6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il- amina.
[0008] Outra forma de realização é um hidrato de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]- amina.
[0009] A presente invenção proporciona hidrato de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2- il]-amina em forma cristalina.
[00010] A presente invenção também proporciona hidrato de (R)-[5- (2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)- pirazin-2-il]-amina em forma cristalina caracterizada por um padrão de difração de pó de raio-X com picos de 2θ ± 0,2 a 5,17, em combinação com um ou mais dos picos selecionados a partir do grupo que consiste em 15,73; 17,71 e 20,12.
[00011] A presente invenção proporciona uma composição farmacêutica que compreende (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H- pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e um veículo, diluente, ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00012] A presente invenção proporciona uma composição farmacêutica que compreende (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H- pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il-amina, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, juntamente com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável e opcionalmente outros ingredientes terapêuticos.
[00013] A presente invenção proporciona um método de tratamento de câncer, compreendendo a administração a um paciente em sua necessidade de uma quantidade eficaz de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil- piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina, ouum seu sal farmaceuticamente aceitável. Além disso, a presente invenção também fornece um método de tratamento de câncer, que compreende a administração a um paciente em sua necessidade de uma quantidade eficaz de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H- pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e radiação por ionização. Além disso, a presente invenção proporciona um método de tratamento de câncer, compreendendo a administração a um paciente em sua necessidade de uma quantidade eficaz de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H- pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina, ou um seu salfarmaceuticamente aceitável, e um ou mais agentes de quimioterapia.
[00014] A presente invenção proporciona a utilização de (R)-[5-(2- metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2- il]-amina, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para a fabricação de um medicamento para o tratamento do câncer. Além disso, a presente invenção também proporciona a utilização de (R)-[5- (2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)- pirazin-2-il]-amina, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer, em que o referido tratamento compreende a terapia de combinação com radiação por ionização. Além disso, a presente invenção proporciona a utilização de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para a fabricação de um medicamento para o tratamento do câncer por terapia de combinação, em que o referido tratamento de terapia de combinação compreende a administração do referido medicamento e administração de um ou mais agentes de quimioterapia ao mesmo paciente.
[00015] A presente invenção proporciona (R)-[5-(2-metóxi-6-metil- piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina, ouum seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilização em terapia. Além disso, a presente invenção proporciona também (R)-[5-(2-metóxi- 6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]- amina, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e radiação por ionização para utilização em terapia. Além disso, a presente invenção proporciona (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e um ou mais agentes de quimioterapia para utilização em terapia.
[00016] A presente invenção proporciona (R)-[5-(2-metóxi-6-metil- piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina, ouum seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilização no tratamento de câncer. Além disso, a presente invenção proporciona também (R)- [5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)- pirazin-2-il]-amina, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e radiação por ionização para utilização no tratamento de câncer. Além disso, a presente invenção proporciona (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin- 3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e um ou mais agentes de quimioterapia para o uso no tratamento do câncer.
[00017] A presente invenção proporciona a utilização de (R)-[5-(2- metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2- il]-amina, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer, em que o medicamento deve ser administrado simultaneamente, separadamente ou sequencialmente com a radiação por ionização.
[00018] A presente invenção proporciona a utilização de (R)-[5-(2- metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2- il]-amina, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer, em que o medicamento também compreende um ou mais agentes de quimioterapia ou deve ser administrado simultaneamente, separadamente ou sequencialmente com um ou mais agentes de quimioterapia.
[00019] A presente invenção proporciona (R)-[5-(2-metóxi-6-metil- piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina, ouum seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilização em combinação simultânea, separada ou sequencial com radiação de ionização para o tratamento de câncer.
[00020] A presente invenção proporciona (R)-[5-(2-metóxi-6-metil- piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina, ouum seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilização em combinação simultânea, separada ou sequencial com um ou mais agentes de quimioterapia no tratamento de câncer.
[00021] Além disso, a presente invenção proporciona formas de realização preferidas dos métodos e utilizações como aqui descritos, em que o um ou mais agentes de quimioterapia é selecionado a partir do grupo que consiste em 5-fluorouracila, hidroxiureia, gemcitabina, metotrexato, pemetrexed, doxorrubicina, etoposídeo, cisplatina, e taxol. Além disso, a presente invenção proporciona formas de realização preferidas dos métodos e utilizações como aqui descrito, em que dois agentes quimioterapêuticos são selecionados a partir do grupo que consiste em 5-fluorouracila, hidroxiureia, gemcitabina, metotrexato, pemetrexed, doxorrubicina, etoposídeo, cisplatina e taxol. Além disso, a presente invenção proporciona formas de realização ainda mais preferidas dos métodos e utilizações como aqui descrito, em que o agente de quimioterapia é selecionado a partir do grupo que consiste em 5-fluorouracila, hidroxiureia, gemcitabina, metotrexato, pemetrexed, doxorrubicina, etoposídeo, cisplatina, e taxol. Formas de realização preferidas dos métodos e utilizações aqui descritos são cânceres selecionados a partir do grupo que consiste em câncer de bexiga, câncer de cólon, câncer gástrico, câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer da mama, melanoma, câncer de ovário, câncer de pâncreas, mesotelioma, câncer renal e câncer de útero.
[00022] Tal como utilizado acima, e ao longo da descrição da invenção, os termos a seguir, a menos que indicado em contrário, devem ser entendidos como tendo os seguintes significados:
[00023] "Sal farmaceuticamente aceitável" ou "saisfarmaceuticamente aceitáveis" refere-se aos sais inorgânicos e orgânicos relativamente não-tóxicos de compostos da presente invenção.
[00024] Os compostos da presente invenção são capazes de reação, por exemplo, com um número de ácidos inorgânicos e orgânicos para formar sais farmaceuticamente aceitáveis. Tais sais farmaceuticamente aceitáveis e metodologia comum para seu preparo são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, P. Stahl, et al, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, (VCHA / Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge, et al. "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, Janeiro de 1977.
[00025] Os compostos da presente invenção são preferencialmente formulados como composições farmacêuticas utilizando um ou mais veículos, diluentes, ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis e administrados através de uma variedade de vias. De preferência, tais composições são para administração oral, subcutânea ou intravenosa. Tais composições farmacêuticas e processos para seu preparo são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, et al, eds., 21a ed, Mack Publishing Co., 2005).
[00026] Os termos "tratamento", "tratar", "tratando", e similares, devem incluir retardar ou reverter a progressão de uma doença. Estes termos também incluem aliviar, melhorar, atenuar, eliminar ou reduzir um ou mais sintomas de um distúrbio ou condição, mesmo se a doença ou condição não for efetivamente eliminada e mesmo se a progressão do distúrbio ou condição não é, em si, retardada ou revertida.
[00027] "Quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz" significa a quantidade do composto, ou seu sal farmaceuticamente aceitável, da presente invenção ou uma composição farmacêutica contendo um composto, ou seu sal farmaceuticamente aceitável, da presente invenção que irá provocar a resposta biológica ou médica ou efeito terapêutico desejado em um tecido, sistema, animal, mamífero ou ser humano que está sendo solicitado pelo pesquisador, veterinário, médico ou outro clínico.
[00028] A quantidade de composto da presente invenção efetivamente administrada será determinada por um médico sob as circunstâncias relevantes, incluindo a condição a ser tratada, a via de administração escolhida, o composto real da presente invenção administrado, a idade, peso e resposta do paciente individual, e a gravidade dos sintomas do paciente. As dosagens por dia normalmente caem dentro da faixa de cerca de 0,1 a cerca de 10 mg / kg de peso corporal. Em alguns casos, níveis de dosagem abaixo do limite inferior da faixa acima mencionada podem ser mais do que adequados, enquanto em outros casos doses ainda maiores podem ser empregadas.
[00029] Os compostos da presente invenção podem ser preparados por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, bem como os descritos em Preparos e Exemplos abaixo. As etapas sintéticas específicas para cada uma das vias descritas podem ser combinadas de diferentes formas para preparar os compostos da presente invenção.
[00030] Os reagentes e os materiais de partida são em geral prontamente disponíveis para alguém de habilidade comum na técnica. Outros podem ser preparados por técnicas padrão de química orgânica e heterocíclica, técnicas que são análogas às sínteses de compostos conhecidos estruturalmente semelhantes, e os procedimentos descritos em Preparos e Exemplos que se seguem, incluindo quaisquer novos procedimentos. Os seguintes Preparos e Exemplos são fornecidos para ilustrar a invenção em maiores detalhes e representam sínteses típicas dos compostos. Os nomes dos compostos da presente invenção são geralmente fornecidos por ISIS Draw 2.5 SP2 com Autonom incluído.
[00031] Como usado aqui, os termos a seguir têm os significadosindicados: "BCA" refere-se a ácido bicinconínico; "BSA" refere-se à albumina do soro bovino; "DMSO" refere-se a dimetilsulfóxido; "DPBS" refere-se a solução salina tamponada tamponada com fosfato dibásico; "DTT" refere-se a ditiotreitol; "EtOAc" refere-se a acetato de etila; "FBS" refere-se a soro bovino fetal; "HEPES" refere-se a ácido N- 2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfónico; "MEM" refere-se a meio essencial mínimo; “MeOH" refere-se a metanol; "PBS" refere-se a solução salina tamponada com fosfato; "PI" refere-se a iodeto de propídio; "RNAase" refere-se a ribonuclease A; "RPMI" refere-se a Roswell Park Memorial Institue; "TBST" refere-se a solução salina com Tween-20 tamponada com tris; "THF" refere-se a tetrahidrofurano; "TR-FRET" refere-se a tempo de transferência de energia fluorescente resolvida; "Tris" refere-se a tris(hidroximetil)aminometano; "Triton-X" refere-se a 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenil-polietileno glicol polietileno- glicol t-octilfenoxipolietoxietanol polietileno glicol terc-octilfenil éter e "Tween-20" refere-se o polissorbato 20.Preparo 1(R)-3-(6-cloropirazin-2-il)oxipiperidina-1-carboxilato de terc- butila
[00032] Hidreto de sódio (225,6 g; 5,64 mol) é disperso em THF (3 L) e a temperatura é reduzida a 0 - 5°C. Uma solução de (R)-3-hidróxi- 1-boc piperidina (891,6 g; 4,43 mol) em THF (3 L) é adicionada ao longo de 1 h enquanto se mantém a temperatura entre 0 - 5°C. A reação é agitada durante 1 h. 2,6-Dicloropirazina (600 g; 4,03 mol) como uma solução em THF (3 L) é adicionada gota a gota ao longo de 1,5 h mantendo a mesma temperatura. A reação é agitada durante 2 horas a 25 - 30°C, e em seguida vertida em gelo. A mistura é diluída com água e extraída com acetato de etila. Os extratos são secos sobre sulfato de sódio anidro, filtrados e concentrados. O óleo residual é triturado com diclorometano a 5% em hexano para dar o produto como um sólido branco. O sólido é recolhido por filtração e seco para dar 1,538 g de material bruto. O produto bruto é retriturado com diclorometano a 5% em hexanos para dar um sólido branco em rendimento quantitativo. ES/MS m/z 314,1 [M + H]+.Preparo 2Éster metílico do ácido 2-metóxi-6-metil-nicotínico
[00033] A uma solução agitada de éster metílico do ácido 2-cloro-6- metil-nicotínico de (10,4 g; 56,52 mmol) em MeOH sob nitrogênio, é adicionada uma solução de sódio (2,58 g; 113,04 mmol) em metanol (80,0 mL) (sódio metálico é dissolvido em metanol sob uma atmosfera de nitrogênio) à temperatura ambiente. A mistura da reação é submetida a refluxo durante a noite. A reação é arrefecida à temperatura ambiente e o pH é ajustado a pH = 7 com ácido acético. A mistura da reação é diluída com acetato de etila (100 mL) e água (30 mL). A camada orgânica é separada e a camada aquosa é extraída com acetato de etila (2 x 75 mL). Os extratos orgânicos combinados são secos sobre Na2SO4, filtrados e concentrados para dar o produto bruto. Rendimento: 7,25 g (71%). 1H RMN (400 MHz, CDCl3); δ 8,066 - 8,047 (d, J = 7,6 Hz, 1H); 6,782 - 6,764 (d, J = 7,2 Hz; 1H); 4,029 (s, 3H); 3,879 (s, 3H ); 2,483 (s, 3H); ES/MS m/z 182,2 [M + H]+.Preparo 35-(2-Metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-ilamina
[00034] n-BuLi (1,2 M; 96,0 mL; 115,6 mmol) é adicionado a uma solução de acetonitrila (6,08 mL; 115,4 mmol) em THF (300 mL) a - 78°C e deixada agitar durante 30 min a - 78°C. Éster metílico do ácido 2-metóxi-6-metil-nicotínico (20 g; 105,1 mmol) em THF (200 mL) é adicionado e agitado a - 78°C durante mais 30 min. A mistura da reação é arrefecida a -78°C com água (500 mL) e lavada com EtOAc (2 x 250 mL). A camada aquosa é separada e evaporada. Esta é co- destilada duas vezes com tolueno para se obter 3-(2-metóxi-6-metil- piridin-3-il)-3-oxo-propionitrila. Rendimento = 21,4 g (bruto). ES/MS m/z 191,1 [M + H]+.
[00035] Uma solução de 3-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-3-oxo- propionitrila (21 g; 110,4 mmol) em etanol (200 ml) é colocada em um tubo vedado. Hidrato de hidrazina (32,1 mL; 662,4 mmol) e ácido acético (21,0 mL) são adicionados e a reação aquecida a 100°C durante 2 h. O solvente é separado por evaporação e a mistura da reação é diluída com EtOAc (500 mL) e solução saturada de bicarbonato de sódio (100 mL). A camada orgânica é separada e a camada aquosa é extraída com EtOAc (2 x 250 mL). Os extratos orgânicos combinados são secos sobre Na2SO4, filtrados e concentrados para dar o produto bruto, o qual é levado para a etapa seguinte sem qualquer purificação adicional. Rendimento = 16,5 g(73%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,50 (bs, 1H); 7,90 (d; J = 7,6 Hz; 1H); 6,86 (d; J = 7,6 Hz; 1H); 5,88 (s, 1H); 4,64 (s, 2H); 3,91 (s, 3H); 2,38 (s, 3H).Preparo 4Éster terc-butílico do ácido 5-amino-3-(2-metóxi-6-metil- piridin-3-il)-pirazol-1-carboxílico
[00036] Uma solução de 5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol- 3-il-amina (16,0 g; 78,3 mmol) em THF (200 mL) é adicionada lentamente a uma suspensão agitada de NaH (60% em óleo mineral; 3,4 g; 85,0 mmol) em THF (200 mL) a 0°C. Após 15 min a 0°C, di-terc- butildicarbonato (19,8 mL; 86 mmol) é adicionado lentamente à mistura da reação e agitado a 0°C durante 30 min. A mistura da reação é arrefecida com água gelada (aproximadamente 250 mL) e o produto é extraído em acetato de etila (2 x 500 mL). As porções orgânicas combinadas são lavadas com água e solução saturada de NaCl (200 mL), secas sobre Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas sob vácuo para produzir material bruto. Este material é triturado com hexano duas vezes para se obter 18,5 g (78%) do composto do título. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,05 (d; J = 7,6 Hz; 1H); 6,90 (d; J = 7,2 Hz; 1H); 6,28 (s, 2H); 5,85 (s, 1H); 3,90 (s, 3H); 2,40 (s, 3H); 1,56 (s, 9H).Preparo 5Éster terc-butílico do ácido (R)-3-{6-[2-terc-butoxicarbonil-5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-ilamino]-pirazin-2-ilóxi}-piperidina-1-carboxílico
[00037] Uma mistura de éster terc-butílico do ácido 5-amino-3-(2- metóxi-6-metil-piridin-3-il)-pirazol-1-carboxílico (50,0 g; 164,5 mmol), (R)-3-(6-cloropirazin-2-il)oxipiperidina-1-carboxilato de terc-butila (56,6 g; 180,9 mmol), 4,5-bis-difenilfosfanil-9,9-dimetil-9H-xanteno (14,2 g; 24,6 mmol) e Cs2CO3 (85,5 g; 263 mmol) em 1,4-dioxano (1,4 L) é igualmente dividido em dois frascos de fundo redondo lado a lado e ambos são purgados com argônio durante 2 h. Pd(OAc)2 (5,4 g; 24,6 mmol) é adicionado (metade a cada vaso) e a purga continua durante 1 h. As reações são, em seguida, aquecidas a 90 - 95°C durante 1 h. As misturas da reação são arrefecidas à temperatura ambiente, combinadas e diluídas com acetato de etila (1 L). A mistura é então filtrada através de terra diatomácea, lavada com acetato de etila e o filtrado é concentrado. O produto bruto é purificado em sílica gel com EtOAc a 15% / hexano como eluente para proporcionar 55 g (57% de rendimento) de um pó branco. Esses 55 g do produto purificado são combinados com 15 g de material preparado de forma similar e purificado (obtido a partir de 20 g de éster terc-butílico do ácido 5- amino-3-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-pirazol-1-carboxílico). Os 70 g combinados de material são dissolvidos em uma mistura 4:1 de THF e metanol (1,4 L) e tratados com QuadraSil® AP (140 g) durante 2 h. A mistura da reação é filtrada através de terra diatomácea e lavada com acetato de etila (4 x 100 mL). O filtrado é novamente agitada com QuadraSil® AP (140 g) durante 2 horas e filtrado como anteriormente. O solvente é evaporado para dar o composto do título como um sólido branco. Rendimento = 70 g (47%). ES/MS m/z 582,5 [M + H]+.Exemplo 1(R)-[5-(2-Metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6- (piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina
[00038] A uma solução agitada de éster terc-butílico do ácido (R)-3- {6-[2-terc-butoxicarbonil-5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3- ilamino]-pirazin-2-ilóxi}-piperidina-1-carboxílico (13,0 g; 22,3 mmol) em diclorometano (150 mL), é adicionada uma solução de ácido trifluoroacético (12,4 mL; 167 mmol) em diclorometano (20 mL) ao longo de um período de 5 min a 0°C. A reação é deixada a aquecer até a temperatura ambiente e agitada durante 3 h. A reação é diluída com diclorometano (1000 mL), seguido pela adição de solução saturada de bicarbonato de sódio (250 mL) e em seguida agitada durante 4 h. A porção orgânica é separada e seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada e evaporada. O material resultante é cristalizado a partir de isopropanol para se obter o produto desejado. Rendimento = 7,2 g (85%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,40 (s, 1H); 9,71 (s, 1H); 8,02 (d, J = 7,6 Hz; 1H); 7,97 (s, 1H); 7,46 (s, 1H); 6,93 (d, J = 7,6 Hz; 1H); 6,91 (s, 1H); 4,94 - 4,86 (m, 1H); 3,97 (s, 3H); 3,20 - 3,13 (m, 1H); 2,83 - 2,75 (m, 1H); 2,57 (dd; J = 12,0; 8,4 Hz; 1H); 2,53 - 2,45 (m obscuro, 1H); 2,42 (s, 3H); 2,15 - 2,05 (m, 1H); 1,71 - 1,63 (m, 1H); 1,60 - 1,49 (m, 1H); 1,49 - 1,40 (m, 1H); ES/MS m/z 382,5 [M + H]+.Exemplo 2Sal do ácido metano sulfônico (R)-[5-(2-metóxi-6-metil- piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina
[00039] Ácido metano-sulfônico (0,247 g; 2,57 mmol) é adicionado a uma solução agitada de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol- 3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina (0,982 g; 2,57 mmol) em diclorometano (25 mL) a 0°C. A reação é deixada a aquecer até a temperatura ambiente e agitada durante 45 min. O solvente é evaporado, e o sal resultante é lavado com éter (10 ml) e pentano (10 mL) sequencialmente para se obter o produto desejado. Rendimento = 1,139 g (92,6%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6), δ 12,5 (bs, 1H); 9,81 (s, 1H); 8,73 (bs, 1H); 8,54 (bs, 1H); 8,07 (s, 1H); 7,96 (d; J = 7,6 Hz; 1H); 7,56 (s, 1H); 6,95 (d; J = 7,6 Hz; 1H); 6,81 (s, 1H); 5,31 - 5,24 (m, 1H); 3,97 (s, 3H); 3,48 - 3,39 (m, 1H); 3,39 - 3,30 (m, 1H); 3,18 - 3,10 (m, 1H); 3,10 - 3,01 (m, 1H); 2,43 (s, 3H); 2,32 (s, 3H); 2,03 - 1,85 (m, 3H); 1,73 - 1,65 (m, 1H); ES/MS m/z 382,4 [M + H]+.Exemplo 3Sal do ácido acético (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H- pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina
[00040] A uma solução de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H- pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina (0,100 g; 0,26 mmol) em diclorometano (10 mL), adiciona-se ácido acético (0,015 mL; 0,26 mmol) dissolvido em diclorometano (1 mL) a 0°C. A mistura da reação é agitada durante 60 minutos à temperatura ambiente e em seguida o solvente é evaporado para se obter um resíduo. O resíduo é triturado com dietil éter (20 mL), seguido de n-pentano (20 mL). O material é seco sob alto vácuo durante 4 h para se obter o produto desejado. Rendimento = 0,060 g (51,8%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,40 (bs, 1H); 9,70 (s, 1H); 8,02 (d; J = 7,6 Hz; 1H); 7,98 (s, 1H); 7,46 (s, 1H); 6,94 (d; J = 7,6 Hz; 1H); 6,90 (s, 1H); 4,97 - 4,38 (m, 1H); 3,98 (s, 3H); 3,20 - 3,13 (m, 1H); 2,83 - 2,74 (m , 1H); 2,66 - 2,56 (m, 1H); 2,42 (s, 3H); 2,14 - 2,03 (m, 1H); 1,89 (s, 3H); 1,74 - 1,62 (m, 1H); 1,61 - 1,51 (m, 1H); 1,50 - 1,40 (m, 1H); 1,30 - 1,20 (m, 1H); ES/MS m/z 382,5 [M + H]+.Exemplo 4Sal hemioxalato de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H- pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina
[00041] A uma solução de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H- pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina (0,100 g; 0,26 mmol) em diclorometano (10 mL), adiciona-se ácido oxálico (0,012 mg; 0,13 mmol) dissolvido em MeOH (0,1 mL) a 0°C. A mistura da reação é agitada durante 60 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, o solvente evaporado para se obter um resíduo. O resíduo é triturado com dietil éter (20 mL), seguido de n-pentano (20 mL). O material é seco sob alto vácuo durante 4 h para se obter o composto do título. Rendimento = 0,095 g (77%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,77 (s, 1H); 8,07 (s, 1H); 7,95 (d; J = 7,6 Hz; 1H); 7,55 (s, 1H); 6,95 (d; J = 7,6 Hz; 1H); 6,79 (s, 1H); 5,33 - 5,24 (m, 1H); 3,97 (s, 3H); 3,45 - 3,30 (m, 2H); 3,18 - 3,09 (m, 1H); 3,08 - 2,98 (m, 1H); 2,42 (s, 3H); 2,05 - 1,85 (m, 2H); 1,74 - 1,63 (m, 1H); 1,18 - 1,10 (m, 1H); ES/MS m/z 382,4 [M + H]+.Exemplo 5Sal hemissuccinato de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)- 2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina
[00042] A uma solução de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H- pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina (0,1 g; 0,26 mmol) em diclorometano (10 mL), adiciona-se ácido succínico (0,015 g; 0,13 mmol) dissolvido em etanol (1 mL, dissolvido a 50°C) à temperatura ambiente. A mistura da reação é agitada durante 2 h à temperatura ambiente. O solvente é evaporado e o resíduo obtido é triturado com dietil éter (20 mL), seguido de n-pentano (20 mL). O material é seco sob alto vácuo durante 8 horas para se obter o composto do título. Rendimento = 0,102 g (78%). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,4 (bs, 1H); 9,72 (s, 1H); 8,05 - 7,96 (m, 2H); 7,48 (s, 1H); 6,93 (d; J = 7,6Hz; 1H); 6,86 (s, 1H); 5,06 - 4,97 (m, 1H); 3,97 (s, 3H); 2,90 - 2,81 (m,1H); 2,74 - 2,62 (m, 1H); 2,42 (s, 3H); 2,30 (s, 2H); 2,09 - 2,01 (m, 1H);1,80 - 1,60 (m, 2H); 1,57 - 1,46 (m, 1H); 1,14 - 1,10 (m, 1H); 1,10 -1,00 (m, 1H); ES/MS m/z 382,4 [M + H]+.Exemplo 6 Hidrato de (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3- il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina
[00043] Suspender (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3- il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina (52,1 mg; ES/MS m/z 382,2 [M + H]+) em mistura de água-etanol a 5:95 (10 mL) e pasta fluida à temperatura ambiente durante 48 horas. Um sólido branco cristalino foi recuperado por filtração a vácuo.
[00044] Padrões de difração de pó de raio X (XRD) de sólidos cristalinos são obtidos em um difratômetro de pó de raio X Bruker D4 Endeavor, equipado com uma fonte de CuKa (À = 1,54060 Â) e um detector Vantec, operando a 35 kV e 50 mA. A amostra é varrida entre 4 e 40° em 2θ, com um tamanho de etapa de 0,009° em 2θ. O pó seco é embalado em um suporte de amostras de quartzo e uma superfície lisa é obtida utilizando uma lâmina de vidro. No presente caso, uma variabilidade de posição de pico de ± 0,2 em 2θ leva em conta as variações potenciais sem impedir a identificação inequívoca da forma de cristal indicada. A confirmação de uma forma de cristal pode ser feita com base em qualquer combinação única de picos distintivos (em unidades de ° 2θ), tipicamente os picos mais proeminentes. Ospadrões de difração de forma de cristal, coletados à temperatura ambiente e umidade relativa, foram ajustados com base em picos de padrão NIST 675 a 8,85 e 26,77 graus 2-teta.
[00045] Assim, uma forma cristalina de amostra do composto é caracterizada por um padrão de XRD, utilizando radiação CuKa como tendo picos de difração (valores de dois-teta) como descrito na Tabela 1 abaixo. Especificamente, o padrão contém um pico a 5,17 em combinação com um ou mais dos picos selecionados a partir do grupo que consiste em 15,73; 17,71 e 20,12, com uma tolerância para os ângulos de difração de 0,2 graus.Tabela 1: picos de difração de pó de raio-X do Exemplo 6
Ensaio Bioquímico da Chk1
[00046] O efeito dos compostos sobre a atividade bioquímica da Chk1 pode ser determinado utilizando um ensaio de ligação de filtro de peptídeo CHK1/substrato. Neste ensaio, um peptídeo sintético com base nos resíduos da sequência de aminoácidos 206-225 de Cdc25 é utilizado como um substrato aceitador de fosfato para proteína quinase recombinante Chk1. Usando Y-33P-ATP como substrato doador de fosfato, Chk1 transfere o grupo Y—33fosfato radioativo para o peptídeo sintético. A reação é medida através da captura do substrato peptídico em uma placa de filtro de papel de troca iônica e contagem de cintilação de partículas beta emitidas.
[00047] As reações de quinase (40 μL de volumes da reação) são realizadas em placas de poliestireno de fundo em V de 96 poços. As reações são iniciadas com a adição da enzima Chk1. As condições finais da reação são 67 mM HEPES sal de sódio de pH 7,4; 0,007% (v / v) de TRITON™ X-100; 2,7 mM de DTT; 2,7 mM de MgCl2, 12 μM de substrato peptídico, 60 μM ATP sal dissódico; 0,75 μCiY-33P-ATP; 0,75 nM da enzima Chk1 ativa, 4% (v / v) de DMSO e diluição em série do composto (diluição em série de 1:3, a partir de 20 μM, 10 pontos).
[00048] Seguindo a adição da enzima Chk1, as reações são incubadas à temperatura ambiente durante 90 min, e depois terminadas com a adição de 140 μL de ácido fosfórico. A mistura da reação é transferida para os poços correspondentes de uma placa de filtro opaca de papel de troca catiônica de fosfocelulose para assentar durante 30 min. A placa de filtro é lavada em um coletor de vácuo com cinco lavagens de 200 μL de ácido fosfórico a 0,5% (v / v). A placa de filtro é seca durante a noite antes da adição de 40 μL de Microscint® - 20 a cada poço da placa. Depois de assentar durante 4 h à temperatura ambiente, a radioatividade na placa é medida utilizando um contador de cintilação de microplaca MicroBeta Trilux (Perkin Elmer).
[00049] Para determinação do IC50, a percentagem de inibição para cada concentração é calculada utilizando a razão de contagem de cintilação a partir de controles executados em cada placa. Os dados de concentração de composto de 10 pontos são posteriormente ajustados a uma equação logística de quatro parâmetros, utilizando ActivityBase 4.0. Valores de IC50 absolutos são calculados a partir da curva resultante. Os compostos da invenção são testados neste ensaio executado substancialmente como descrito acima. Por exemplo, o composto do Exemplo 1 é testado e verifica-se que tem um IC50 de < 0,001 μM (n = 6). Além disso, o composto do Exemplo 2 é testado e verifica-se que tem um IC50 de < 0,001 μM (n = 3). Estes resultados indicam que os compostos dentro do âmbito da presente invenção são potentes inibidores de Chk1.Ensaio Bioquímico de Chk2
[00050] O efeito dos compostos sobre a atividade bioquímica de Chk2 pode ser determinada utilizando um ensaio de ligação de filtro de peptídeo CHK2/substrato. Neste ensaio, um peptídeo sintético com base nos resíduos da sequência de aminoácidos 206-225 de Cdc25C é utilizado como um substrato aceitador de fosfato para proteína quinase Chk2 recombinante. Usando Y-33P-ATP como o substrato doador de fosfato, Chk2 transfere o grupo Y— 33P radioativo para o peptídeo sintético. A reação é medida através da captura do substrato peptídico em uma placa de filtro de papel de troca catiônica e contagem de cintilação de partículas beta emitidas.
[00051] As reações de quinase (40 μL de volumes de reação) são realizadas em placas de poliestireno de fundo em V de 96 poços. As reações são iniciadas com a adição de enzima Chk2. As condições de reação finais são 67 mM de HEPES sal de sódio pH 7,4; 0,007% (v / v) de TRITON® X-100; 2,7 mM de DTT; 2,7 mM de MgCl2; 12 μM de substrato peptídico, 60 μM de ATP sal dissódico; 0,75 μCiY-33P-ATP; 1,4 nM de enzima Chk2 ativa; 4% (v / v) de DMSO e diluição em série do composto (diluição em série de 1:3, a partir de 20 μM, 10 pontos).
[00052] Após adição da enzima Chk2, as reações são incubadas à temperatura ambiente durante 90 min, e depois terminadas com a adição de 140 μL de ácido fosfórico. A mistura da reação é transferida para os poços correspondentes de uma placa de filtro opaca de papel de troca catiônica de fosfocelulose para assentar durante 30 min. A placa de filtro é lavada em um coletor de vácuo com cinco lavagens de 200 μL de ácido fosfórico a 0,5% (v / v). A placa de filtro é seca durante a noite antes da adição de 40 μL de Microscint®-20 a cada poço da placa. Depois de assentar durante 4 h à temperatura ambiente, a radioatividade na placa é medida utilizando um contador de cintilação de microplaca MicroBeta Trilux (Perkin Elmer).
[00053] Para a determinação do IC50, a percentagem de inibição para cada concentração é calculada utilizando a razão TR-FRET de controles executados em cada placa. Os dados de concentração de compostos de 10 pontos são posteriormente ajustados a uma equação logística de quatro parâmetros, utilizando ActivityBase 4.0. Valores de IC50 absolutos são calculados a partir da curva resultante. Os compostos da invenção são testados neste ensaio executado substancialmente como descrito acima. Por exemplo, o composto do Exemplo 1 é testado e verifica-se que tem um IC50 de 0,011 μM (SE = 0,002; n = 6). Além disso, o composto do Exemplo 2 é testado e verifica-se que tem um IC50 de 0,012 μM (SE = 0,008; n = 3). Estes resultados indicam que os compostos dentro do âmbito da presente invenção são potentes inibidores de Chk2.Ensaio à Base de Célula de Autofosforilação de Chk1
[00054] Um inibidor de Chk1 irá impedir a atividade da proteína quinase de substratos de fosforilação em células nas quais a resposta a dano de DNA foi ativada. Um substrato facilmente detectável para Chk1 é um sítio de autofosforilação na própria Chk1, serina 296. O ensaio de imunoblot a seguir pode ser usado para medir a quantidade de fosforilação da serina 296 em Chk1 e indiretamente o nível de atividade da proteína quinase Chk1. Células HeLa são cultivadas em solução salina equilibrada de Earle MEM w / com L-glutamina suplementada com 10% (v / v) de soro bovino fetal inativado por calor, 1 x MEM aminoácidos não-essenciais, 1x piruvato de sódio e 1 x 105 células plaqueadas em 600 μL de meio de cultura MEM por poço de uma placa de cultura de células de 24 poços. As células são incubadas durante 24 horas a 37°C, 5% de CO2 e 95% a 100% de umidade. Dezesseis μL de uma estoque a 4 μM de doxorubicina em meio de cultura são adicionados a cada poço apropriado para fazer uma concentração final de 100 nM de doxorrubicina. As placas são devolvidas à incubadora durante 24 horas adicionais antes da adição do composto inibidor de Chk1. Os compostos são solubilizados a 10 mM em DMSO a 100%, em seguida diluídos a 2 mM em DMSO a 40% (v / v) e em seguida diluídos a 100 μM com meio de cultura mais DMSO a 4% (v / v). Subsequentemente, diluições em série dos compostos (1:3) são preparadas ao longo de um intervalo de 100 μM a 0,005 μM. Sessenta e seis μL de estoque de composto são adicionados aos poços apropriados na placa para produzir uma concentração final de DMSO de 0,4% (v / v) e um intervalo de concentração de composto final entre 1 μM e 0,0005 μM. As placas são devolvidas à incubadora durante mais 2 h e, em seguida, removidas para lise das células e processamento. O meio é então removido da placa, cada poço lavado uma vez com 0,5 mL de Solução Salina Tamponada com Fosfato gelada da Dulbecco (DPBS), todo o líquido é retirado, e a placa é colocada em gelo para o restante do procedimento. A cada poço, são adicionados 75 μL de tampão de lise gelado, que consiste em Tampão de Extração Celular contendo coquetel inibidor de fosfatase (Sigma, cat# P0044 + P5725) ecomprimidos do coquetel inibidor de protease (Roche Diagnostics, cat# 11836153001). Depois de 10 min, cada poço é raspado e o lisado transferido para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml de polipropileno em gelo. Cada lisado é sonicado durante 45 segundos com um sonicador de copo de chifre de placa (Misonix) enquanto suspenso em um banho de água / gelo. Cinquenta μL de cada amostra são transferidos para um tubo de microcentrífuga de polipropileno de 0,5 ml contendo 25 μL de 4x Tampão de Amostra Laemmli, aquecidos a 95°C durante 5 min e armazenados congelados a -80°C. O lisado restante é usado para a determinação da concentração de proteína (kit de ensaio de proteínas BCA, Thermo Scientific). Cinco μg de cada lisado de células em tampão de amostra são aplicados a um gel de 96 poços E-Page e submetidos à eletroforese. As proteínas são eletrotransferidas do gel para membrana Immobilon-P PVDF (0,45 μm) de acordo com procedimentos bem conhecidos na técnica (Towbin et al., PNAS (1979) 76(9), 4350-4). A membrana é lavada brevemente com 10 mM de Tris / HCl pH 8,0, 150 mM de NaCl e 0,05% (v / v) de Tween 20 (TBST) e embebida durante uma hora a 25°C em TBST / 5% (v / v) de leite instantâneo Carnation® reconstituído. A membrana é lavada quatro vezes com TBST durante 5 minutos, em seguida embebida a 4°C durante 24 h em TBST / 5% (w / v) de albumina de soro bovino com uma diluição adequada de anti-fosfo-Chk1 (serina 296) de coelho. A membrana é lavada 4 x com TBST durante 5 minutos a 25°C e, em seguida, embebida a 25°C durante 2 h em TBST / leite a 5% contendo uma diluição adequada de IgG anticoelho de burro conjugado a peroxidase de rábano silvestre (GE Healthcare, cat # NA9340 ) para detectar a proteína Chk1 autofosforilada. Amembrana é lavada novamente 4 x com TBST durante 5 minutos a 25°C. Conjugados Antígeno-anticorpo-repórter imobilizados na membrana são detectados com o reagente de detecção de HRP Super Signal Western Femto utilizando um sistema de formação de imagens FUJI LAS-4000. Intensidades de banda Fosfo-Chk1 (ser296) são calculadas usando software "Total Lab" (Nonlinear Dynamics). A percentagem de inibição da autofosforilação de Chk1 induzida por doxorrubicina é calculada usando a seguinte fórmula: % de inibição = (amostra-intensidade de banda fosfo-Chk1 - nenhum controle negativo de doxorrubicina - intensidade de banda fosfo-Chk1) / (controlepositivo de doxorrubicina-intensidade de banda fosfo-Chk1-nenhum controle negativo de doxorrubicina-intensidade de banda fosfo-Chk1) x 100. Os compostos da invenção são testados neste ensaio executado substancialmente como descrito acima. O composto do Exemplo 1 é testado neste ensaio e verificou-se que tem um valor de EC50 de < 0,001 μM (n = 1). O composto do Exemplo 3 é testado neste ensaio e verificou-se que tem um valor de EC50 de <0,001 μM (n = 1). Estes resultados indicam que compostos dentro do âmbito da presente invenção são potentes inibidores da Chk1.Ensaio Acume à Base de Células HeLa de Anulação do Ponto de Verificação G2M Induzido por Doxorrubicina
[00055] Um inibidor de Chk1 irá desativar o ponto de verificação de danos no ADN G2M em células tumorais p53-minus tratadas com o inibidor da topoisomerase II, doxorrubicina. Uma medição da anulação do ponto de verificação G2M é a fosforilação da histona H3 em serina 10 que ocorre depois que as células atravessam o ponto de verificação G2M e entram em mitose. O ensaio de formação de imagens de alto conteúdo seguinte pode ser usado para medir a fosforilação da histona H3 em células. Células HeLa são cultivadas em Meios MEM suplementados com 10% (v / v) de FBS e plaqueadas a 2000 células por poço em placas pretas de fundo claro revestidas com poli D-lisina, 100 μL de volume por poço. As placas são então incubadas em um incubador de cultura de células durante 18-24 h (37°C, 5% de CO2 e 95% de umidade relativa). Após a incubação inicial, 20 μL de Meios MEM mais FBS a 10% contendo 625 nM de doxorrubicina sãoadicionados aos poços adequados da placa resultante em umaconcentração final de 125 nM. As placas são devolvidas à incubadora durante 24 horas, suficiente para prender as células no ponto de verificação G2M. No dia seguinte, as células são tratadas comcompostos. Os compostos são solubilizados a 10 mM em DMSO a 100% e depois diluídos a um estoque 10* a partir de 50 μM em MEM mais 4% (v / v) de DMSO. Subsequentemente, diluições em série dos compostos (1:2) são preparadas ao longo de um intervalo de 50 μM a 0,39 μM. Treze μL de estoque de composto são adicionados aos poços apropriados na placa para produzir uma concentração final de DMSO de 0,4% e um intervalo de concentração de composto final entre 5 μM e 0,039 μM. As placas são devolvidas à incubadora durante mais 7 h e, em seguida, removidas para fixação. O líquido é cuidadosamente removido de cada poço e 100 μL de fixador PREFER® são adicionados. As placas são mantidas à temperatura ambiente durante 20 min, o fixador removido e as células são então permeabilizados pela adição de 100 μL / poço de 0,1% (v / v) de Triton® X 100 em DPBS durante 10 minutos. A solução é removida e a placa lavada duas vezes com 100 μL de DPBS por poço, seguido pela adição de 100 μL de DPBS contendo 50 μg/mL de Ribonuclease A (RNAase, do pâncreas bovino) durante uma hora à temperatura ambiente. A solução de RNAase é removida e as células tingidas quanto à presença de histona H3 fosforilada em serina 10 (phh3), adicionando-se a cada poço 50 μL de solução de RNAase contendo uma diluição de 1:500 de anti-phh3 de coelho (ser10) mais 1% (w / v) de BSA. As placas são seladas e mantidas a 4 °C durante a noite. O anticorpo primário é removido por lavagem de cada placa duas vezes com 100 μL de DPBS por poço e substituído com 50 μL de uma diluição a 1:750 de IgG anticoelho de cabra Alexa Fluor® 488 (H + L) (2 mg / ml) em DPBS mais 1% (w / v) de BSA. As placas são mantidas durante uma hora à temperatura ambiente cobertas com folha de alumínio para proteger da luz. As placas são novamente lavadas duas vezes com 100 μL por poço de DPBS e substituídas com 100 μL de 15 nM de iodeto de propídio (diluição a 1:100 com PBS a partir da solução original). As placas são seladas com um selo preto para proteger as placas da luz. As placas são incubadas durante 30 minutos para tingir os núcleos. As placas são varridas com citômetros de microplacas de fluorescência de varredura a Laser ACUMEN EXPLORER®, usando excitação a 488 nm (TTP LABTECH LTC) para medir o conteúdo de pHH3 e ADN incluindo 2N e 4N. As células positivas phh3 são identificadas pela intensidade média a 519 nm de Alexa 488. A intensidade total a 655-705 nm a partir de iodeto de propídio / ADN é utilizada para identificar células individuais e subpopulações em ciclo celular (células 2N, 4N células). A leitura final para cada população é determinada através da normalização para o percentual do total de células com uma produção de ensaio final de %pHH3, %2N e %4N. 100% de atividade é então determinado por tratamento das células com a concentração máxima de um composto de controle inibidor a 100 nM para determinar o percentual de atividade final de cada composto. 0% de atividade baseia-se na ausência de tratamento com composto. O EC50 relativo é determinado usando ACTIVITY BASE®, ajuste excel, ajuste de curva utilizando um ajuste logístico de quatro parâmetros, equação 205, para determinar o percentual de pHH3 em relação ao controle máximo a 100%. Os compostos da invenção são testados neste ensaio executado substancialmente como descrito acima. O composto do Exemplo 1 é testado e verificou-se que tem um EC50 de 0,029 μM (n = 1). Os compostos do Exemplo 2 e Exemplo 3 são testados e verificou-se que têm resultados de EC50 de 0,033 μM (n = 1) e 0,019 μM (n = 1), respectivamente. Estes resultados indicam que os compostos dentro do âmbito da presente invenção irão desativar o ponto de verificação de danos do DNA G2M.Ensaio de ECtfs (Duas Vezes Sensibilização)
[00056] Um inibidor de Chk1 pode potenciar a atividade antiproliferativa de gemcitabina (ou outros agentes citotóxicos) através de anulação do ponto de verificação de fase intra-S, o que resulta em danos ao ADN prolongados e aumentados. A capacidade para a proliferação contínua de células tumorais após o dano ao DNA pode ser analisada através da determinação da capacidade das células de replicar o seu ADN. Este ensaio avalia a capacidade das células de replicar seu DNA, depois que as células tiveram uma oportunidade para reparar danos ao ADN. Neste ensaio, as células são tratadas com uma série de diluição de gemcitabina e em seguida, 22 h mais tarde, com o composto do Exemplo 3. Após um adicional de 44 h, o número relativo de células é avaliado por um ensaio de redução de corante de MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4- sulfofenil)-2H-tetrazólio). O parâmetro ECtfs é uma medida da concentração de um inibidor de Chk1 necessário para reduzir à metade a concentração de GI90 de gemcitabina, medida neste ensaio na ausência de inibição de Chk1. As células HT-29 (obtidas de ATCC) são cultivadas em RPMI 1640 mais 10% (v / v) de FBS inativado pelo calor. As células são plaqueadas a 2,5 x 103 por poço, em um volume de 100 μL em placas de cultura de tecidos de 96 poços e incubadas durante 24 h. Diluições de gemcitabina são preparadas a concentrações de 6x em meio 5A de McCoy (modificado) (1x) e adicionadas aos poços a 20 μL por poço. Diluições de Gemcitabina foram criadas com a maior concentração final de gemcitabina sendo 1,0 μM e diluições feitas por etapas de três vezes a 0,5 nM.
[00057] Inibidor de Chk1 é preparado por diluições em DMSO a uma concentração final de 4000x e, em seguida, diluído 666 vezes em meio de McCoy para gerar estoques a 6x. Diluições de inibidor de Chk1 continuam por etapas de 2,5 vezes a partir de 25 nM até 0,3 nM. Vinte e duas horas após a adição de gemcitabina, inibidor de Chk1 é adicionado em um volume de 24 μL a poços contendo 120 μL de meio mais gemcitabina. Cada diluição de gemcitabina recebe uma única diluição de inibidor de Chk1. Os poços de controle receberam apenas DMSO, gemcitabina ou inibidor de Chk1. Quarenta e quatro horas após a adição do inibidor de Chk1, 30 μL de reagente de ensaio AQueous CellTiter 96® são adicionados a cada poço e mantidos à temperatura ambiente durante 1 hora e 45 minutos. A absorbância é lida em um espectrofotômetro SpectraMax 250 (Molecular Devices) a 490 nm. Os dados do espectrofotômetro SpectraMax são analisados com GraphPad Prism 4.0. Em primeiro lugar, uma média de absorbância de controle sem células é subtraída de todos os outros valores na matriz de dados de cada placa. Em seguida, calcula-se uma média dos pontos de dados duplicados. Os dados são normalizados para cada concentração de inibidor de Chk1, com número de células a 0% definido como A490 = 0 corrigido, e o número de células a 100% definido como o valor médio de gemcitabina a 0 nM. Estes resultados são, então, transformados. Concentrações de gemcitabina são convertidas para concentrações log e valores do número de células normalizados são convertidos em percentual de inibição (inibição percentual = 100 - valor normalizado). Os dados transformados são colocados em gráfico, e uma regressão não-linear é executada para estimar um valor de IC50 de gemcitabina em cada concentração de inibidor de Chk1. A regressão não-linear é calculada permitindo a variação da curva, e sem restrições para a parte superior ou inferior das curvas dose-resposta. O valor de ECtfs é calculado como segue: valores de GI50 para gemcitabina para cada concentração de inibidor de Chk1 são determinados, colocados em gráfico e a concentração de inibidor de Chk1 necessária para diminuir apenas o GI50 da gemcitabina em duas vezes é determinada por interpolação.
[00058] Os compostos dentro do âmbito da invenção são testados neste ensaio executado substancialmente como descrito acima. Por exemplo, o composto do Exemplo 3 é testado e verificou-se que tem um valor de ECtfs de 1,0 nM (SE = 0,1; n = 3). Além disso, 25 nM do composto diminuem o EC50 de gemcitabina 7 vezes de 22 nM e 3 nM em células HT-29 de câncer de cólon. Sozinhos, 25 nM do composto do Exemplo 3 têm pouco efeito sobre a proliferação de células HT-29. Estes resultados indicam que os compostos dentro do âmbito da presente invenção efetivamente potenciam a atividade antiproliferativa de gemcitabina em baixas concentrações. Valores de IC50 de Gemcitabina obtidos com o tratamento de várias concentrações do Exemplo 3
Ensaio de Inibição de Alvo in vivo de Chk1
[00059] Células Calu-6 são cultivadas em meio de crescimento (MEM com Solução Salina Equilibrada de Earle com L-glutamina suplementada com 10% (v / v) de FBS inativado pelo calor, 1x aminoácidos não-essenciais MEM, 1x piruvato de sódio) e expandidas. As células são colhidas e lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato e 1 x 106 células em meio de crescimento (sem soro) são misturadas com um volume igual de matriz BD Matrigel®, então injetadas subcutaneamente no flanco decamundongos nus pré-irradiados (4,5 Gy) (nu atímico). No dia 15 após o implante (tamanho do tumor = 150 - 200 mm3), gemcitabinaformulada fresca em solução salina diariamente é administrada aos animais por via intraperitoneal na dose de 150 mg / kg. Seis horas depois, os animais são administrados oralmente com o composto Chk1 formulado em Tween-80 a 0,2% / metilcelulose a 0.5% pH ajustado a 6,8 por adição de NaOH diluído. Os animais são sacrificados 2 horas após a dose de inibidor de Chk1, tumores colhidos e processados imediatamente em tampão de Extração de Células gelado contendo coquetel inibidor de fosfatase (Sigma, cat # P0044 + P5725) e comprimidos do coquetel inibidor da protease(Roche Diagnostics, cat # 11836153001). Os tumores são processados em 1,5 - 2,0 mL de tampão de lise e um tubo cônico de polipropileno de 15 mL congelado usando um homogeneizador de tecido motorizado ajustado em modo intenso durante 15 seg. Com a amostra mantida em gelo, o lisado é puxado quatro vezes através de uma seringa de 1 mL com uma agulha de calibre 25. 0,35 mL de lisado de tumor é transferido para um tubo de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 ml contendo 0,15 mL de tampão de amostra de Laemmli 4x. A amostra é, em seguida, misturada e aquecida durante 5 min a 95 °C e sonicada durante 1 min, utilizando alta potência em um sonicador de chifre de placa Misonix 3000. As amostras são então armazenadas em gelo, ou armazenadas a -80 °C para a avaliação da inibição alvo por western blot. Cinco μg de cada lisado de tumor em tampão de amostra são aplicados a géis de 96 poços E-Page e submetidos à eletroforese. As proteínas são transferidas para membrana de nitrocelulose BA83 Protran (Whatman, Cat. # 10402405) de acordo com procedimentos bem conhecidos na técnica (Towbin et al., PNAS (1979) 76 (9), 4350-4). A membrana é então processada para medir a proteína Chk1 autofosforilada em serina 296. A membrana é lavada brevemente com água, depois 10 mM de Tris / HCl, pH 8,0, 150 mM de NaCl e 0,05% (v / v) de Tween 20 (TBST) e embebida durante uma hora a 25 °C em TBST / 5% (p / v ) de leite instantâneo Carnation reconstituído. A membrana é então lavada quatro vezes com TBST durante 5 min. A membrana é embebida a 4°C durante 16 h em TBST / 5% (p / v) de BSA em uma diluição apropriada de anti-fosfo-Chk1 de coelho-fosfo-Chk1 (serina 296). Em seguida, a membrana é lavada quatro vezes com TBST durante 5 min a 25°C e, em seguida, embebida a 25°C durante 2 h em TBST / 5% de leite contendo uma diluição apropriada de IgG anticoelho de burro conjugado com peroxidase de rábano silvestre para detectar fosfo- Chk1 ( Ser 296). A membrana é lavada novamente quatro vezes com TBST durante 5 min a 25°C. Conjugados antígeno-anticorpo-repórter imobilizados sobre a membrana são detectados com o reagente de detecção de HRP Super Signal Western Femto.
[00060] Os sinais são detectados e capturados usando o sistema de formação de imagens FUJI LAS-4000. Intensidades de banda fosfo- Chk1 (ser296) são calculados usando o software "Total Lab" (Nonlinear Dynamics). O percentual de inibição da autofosforilação de Chk1 induzida por gemcitabina é calculado utilizando a seguinte fórmula: % inibição = (amostra-intensidade de banda de Fosfo-Chk1 - intensidade de banda de fosfo-Chk1 de controle positivo de gemcitabina (Max) média) / (intensidade de banda de Fosfo-Chk1 (Min) de controle negativo média - intensidade de banda de fosfo-Chk1 de controle positivo de gemcitabina (Max) média) x 100.
[00061] Os compostos dentro do âmbito da invenção são testados neste ensaio executado substancialmente como descrito acima. Por exemplo, o composto do Exemplo 3 é testado e verifica-se que tem uma Dose Eficaz Modulatória Alvo 50 (TMED50) para autofosforilação de Chk1 de 1,3 mg / kg (n = 1). Este resultado indica que os compostos dentro do âmbito da presente invenção inibem potentemente a ativação da proteína quinase Chk1 in vivo.Modelos de Xenoenxerto Tumoral Humanos
[00062] A capacidade dos inibidores de Chk1 de potenciar a morte de tumores por agentes prejudiciais ao ADN pode ser determinada in vivo usando os modelos de eficácia de xenoenxerto tumoral do cólon HT-29 e pulmão Calu-6. Células de câncer pulmão Calu-6 são cultivadas em meio de crescimento (MEM com Solução Salina Equilibrada de Earle com L-glutamina suplementada com 10% (v / v) de FBS inativado pelo calor, 1x aminoácidos não-essenciais MEM, 1x piruvato de sódio) e células de câncer do cólon HT- 29 As (ATCC) são cultivadas em meios de crescimento, (meio 5A de McCoy suplementado com 10% de FBS) e expandidas.
[00063] As células são colhidas e lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato e 5 x 106 células (HT-29) ou 1 x io6 células (Calu-6) em meio de crescimento (sem soro) são misturadas com um volume igual de matriz BD Matrigel®, então injetadas subcutaneamente no flanco de camundongos nus CD-1 (nu / nu).Administração Subcutânea de Inibidor de Chk1
[00064] A cerca de 16 dias após o implante (150 - 200 mm3), gemcitabina é formulada fresca em solução salina diariamente e administrada aos animais por via intraperitoneal à dose de 60 mg / kg. Vinte e quatro horas mais tarde, os animais são administrados com o composto do Exemplo 3, em 0,2% de Tween-80 / 0,5% demetilcelulose subcutaneamente BID. Após dois dias de descanso, a dosagem é repetida por três ciclos adicionais (Q4Dx4 com o composto do Exemplo 3 deslocamento + 24 horas P.25, L.22). A inibição do crescimento tumoral (TGI) é calculada como o percentual de redução no tamanho médio do tumor de um grupo tratado com composto do tamanho médio do tumor do grupo de controle tratado com veículo. Os compostos dentro do âmbito da invenção são testados neste ensaio executado substancialmente como descrito acima. Por exemplo, verifica-se o composto do Exemplo 3 administrado em combinação com gemcitabina demonstra uma excelente atividade antitumoral dependente da dose em modelos de xenoenxerto tumoral HT-29 e Calu-6, com um aumento de até seis vezes na inibição do crescimento tumoral em relação à gemcitabina sozinha. Este resultado indica que os compostos dentro do âmbito da presente invenção administrados por via subcutânea aumentam significativamente a atividade antitumoral da gemcitabina em modelos de xenoenxerto tumoral humanos.HT29 Subcutânea
ns = não significante estatisticamenteCalu 6 Subcutânea
ns = não significante estatisticamenteAdministração Oral de Inibidor de Chk1
[00065] A cerca de 16 dias após o implante (150 - 200 mm3), gemcitabina é formulada fresca em solução salina diariamente e administrada aos animais por via intraperitoneal à dose de 40 mg / kg. Vinte e quatro horas mais tarde, os animais são administrados com composto Chk1, em 0,2% de Tween-80 / 0,5% de metilcelulose por via oral BID. Após três dias de descanso, a dosagem foi repetida por três ciclos adicionais (Q5Dx4, com o composto do Exemplo 3 deslocamento + 24 horas). A inibição do crescimento tumoral (TGI) é calculada como descrito no parágrafo anterior. Os compostos dentro do âmbito da invenção são testados neste ensaio executado substancialmente como descrito acima. Por exemplo, o composto do Exemplo 3 é administrado em combinação com gemcitabina e verifica- se que demonstra uma excelente atividade antitumoral dependente da dose em modelos de xenoenxerto tumoral HT-29 e Calu-6, com um aumento de até 2,9 vezes na inibição do crescimento tumoral em relação à gemcitabina sozinha. Este resultado indica que os compostos dentro do âmbito da presente invenção administrados por via oral aumentam significativamente a atividade antitumoral da gemcitabina em modelos de xenoenxerto tumoral humanos.Calu6 Oral
ns = não significante estatisticamenteHT29 Oral
ns = não significante estatisticamente
Claims (13)
1. Composto caracterizado pelo fato de que é (R)-[5-(2- metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2- il]-amina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é (R)-[5-(2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)- 2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina.
3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é sal do ácido metano sulfônico (R)-[5- (2-metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)- pirazin-2-il]-amina.
4. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é sal do ácido acético (R)-[5-(2-metóxi- 6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]- amina.
5. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é sal hemioxalato de (R)-[5-(2-metóxi-6- metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2-il]-amina.
6. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é sal hemissuccinato de (R)-[5-(2- metóxi-6-metil-piridin-3-il)-2H-pirazol-3-il]-[6-(piperidin-3-ilóxi)-pirazin-2- il]-amina.
7. Composição farmacêutica caracterizado pelo fato de que compreende o composto ou sal conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
8. Composto ou sal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 - 6, caracterizado pelo fato de ser para uso emterapia.
9. Composto ou sal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 - 6, caracterizado pelo fato de ser para uso notratamento de câncer.
10. Composto ou sal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para uso em combinação simultânea, separada ou sequencial com radiação por ionização no tratamento de câncer.
11. Composto ou sal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 - 6, caracterizado pelo fato de ser para uso emcombinação simultânea, separada ou sequencial com um ou mais agentes de quimioterapia no tratamento de câncer.
12. Composto ou sal para uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes de quimioterapia é selecionado a partir do grupo que consistindo em 5- fluorouracila, hidroxiureia, gemcitabina, metotrexato, pemetrexed, doxorrubicina, etoposídeo, cisplatina e taxol.
13. Composto ou sal para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de bexiga, câncer de cólon, câncer gástrico, câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer de mama, melanoma, câncer de ovário, câncer pancreático, mesotelioma, câncer renal e câncer uterino.
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