CN115721649A

CN115721649A - 抑制突变型egfr的化合物及其应用

Info

Publication number: CN115721649A
Application number: CN202111021427.6A
Authority: CN
Inventors: 李洪林; 赵振江; 刁妍妍; 陈卓
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2021-09-01
Filing date: 2021-09-01
Publication date: 2023-03-03

Abstract

本发明涉及碟啶酮系列及其或其药学上可接受的盐、前药作为EGFR非经典突变抑制剂的应用。具体而言，本发明涉及式I所示系列化合物、含有式I系列化合物的药物组合物在制备治疗含有EGFR 20insX突变、EGFR G719X突变、ERBB2突变的疾病的药物中的用途：

Description

抑制突变型EGFR的化合物及其应用

技术领域

本发明涉及药物化学领域；具体地说，本发明涉及蝶啶酮衍生物作为突变型表皮生长因子受体酪氨酸激酶(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase,EGFR)，特别是非经典突变EGFR的抑制剂的应用。

背景技术

随着EGFR一、二和三代抑制剂上市，给EGFR经典型敏感突变和T790M耐药突变非小细胞肺癌患者带来福音，但是并非所有EGFR突变患者都能获益。其中EGFR 20外显子插入突变(EGFR 20ins)的NSCLC对大部分EGFR抑制剂靶向治疗效果差或无效，这些突变常常归为非经典突变。这些非经典突变主要包括18-21外显子的插入突变和点突变，ERBB2的点突变和插入突变。

因此，研究开发靶向非经典突变EGFR抑制剂的药物具有重大的临床意义和应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供非经典突变EGFR的抑制剂以及包含上述抑制剂的药物组合物。

在第一方面，本发明提供式I所示化合物或其药学上可接受的盐在制备抑制突变型EGFR的药物或治疗或预防突变型EGFR介导的疾病的药物中的用途：

B选自下组：任选取代的(C₃-C₈)环烷基、(C₃-C₈)杂环基、(C₆-C₁₀)芳基或(C₅-C₁₀)芳杂环基；

R²选自：氢、卤素、任选取代的C₁-C₆烷氧基、羟基、任选取代的酰氧基、任选取代的氨基、任选取代的酰氨基、任选取代的C₁-C₆烷基、CN、磺酸基、氨基磺酰基、氨基甲酰基、羧基、任选取代的烷氧甲酰基、任选取代的苯基、任选取代的N-烷基哌嗪基、任选取代的吗啉基、任选取代的哌啶基、任选取代的吡咯基、任选取代的吡咯烷基、任选取代的吡啶基；

R³选自：氢、任选取代的C₁-C₁₀烷基、C₂-C₆链烯基、C₂-C₆炔基、任选取代的C₃-C₈环烷基、任选取代的C₁-C₁₀烷氧基、任选取代的芳基、任选取代的苄基、任选取代的杂环基、任选取代的芳杂环基、-O-(CH)_z-O-C₁-C₃烷基；z为1-3的整数，优选1；

R⁴选自：氢、任选取代的C₁-C₆烷基、硝基、氨基、卤素、任选取代的C₁-C₆烷氧基、任选取代的酰氧基、任选取代的酰氨基、任选取代的酰基；

m独立为0-7，优选1-7，更优选1-3的整数；

n独立为0-7，优选1-7，更优选1-3的整数。

在具体的实施方式中，B选自：

R⁴选自：

在具体的实施方式中，R²选自：氢、卤素、任选取代的C₁-C₆烷氧基、任选取代的吡咯烷基、-NR_aR_b、氨基甲酰基、任选取代的酰氨基、-(CH₂)_o-任选取代的N-烷基哌嗪基、任选取代的吗啉基、任选取代的哌啶基、o为0-2的整数，R_a和R_b各自独立选自任选取代的C₁-C₃烷基；

R³选自：氢、任选取代的C₁-C₆烷基、任选取代的C₆-C₁₀芳基、任选取代的C₃-C₈环烷基；

B选自苯环或含氮五元环；

R⁴选自：任选取代的酰氨基、任选取代的酰基。

在具体的实施方式中，本发明提供选自下组的化合物或其药学上可接受的盐在制备抑制突变型EGFR的药物或治疗或预防突变型EGFR介导的疾病的药物中的用途：

在具体的实施方式中，B是任选取代的苯基；

R²选自：氢、任选取代的C₁-C₆烷基、任选取代的C₁-C₆烷氧基、任选取代的N-C₁-C₃烷基哌嗪基、任选取代的吗啉基、-NR_aR_b；R_a和R_b各自独立选自C₁-C₃烷基或氨基取代的C₁-C₃烷基；

R³选自：氢、任选取代的C₁-C₆烷基、任选取代的芳基(优选任选取代的苯基；更优选卤素或C₁-C₆烷氧基取代的苯基)；

R⁴选自：氢、任选取代的酰氨基；

m独立为1-3的整数；

n独立为1-3的整数。

在具体的实施方式中，所述突变型EGFR包括至少一种以下突变：EGFR 18-21外显子点突变和插入突变，ERBB2的点突变和插入突变。

在具体的实施方式中，所述突变型EGFR含有：

18外显子G719X、E709X、K716A、K728A点突变与密码子709处缺失突变；

19号外显子插入突变I744-K745insKIPVAI、K745-E746insIPVAIK、K745-E746insVPVAIK、K745-E746insTPVAIK和点突变D761Y；

20号外显子插入突变与点突变包括：A763-Y764insFQEA、A763-Y764insFHEA、V769-D770insASV、V769-D770insDNP、D770-N771insNPG、D770-N771insNPH、D770-N771insSVD、D770-N771insASVDN、D770-N771insG、N771-P772insSVDNP、N771-H773dupNPH、P772-H773insPNP、P772-H773insPR、H773-V774insH、A763-Y764insFQEA、H773-V774insPH、H773-V774insNPH、N771-P772insH、H771-P772insN、H773-V774insAH、D770delinsGY、V774-C775insHV等以及20号外显子点突变S768I；

21号外显子点突变L861Q；

ERBB2的点突变V777L、D769Y、R896C、P1170A和插入突变V777-G778insCG、P780-Y781insGSP等。

在优选的实施方式中，所述突变型EGFR含有至少一种以下的突变：G719X(X表示A、S、C、D)、D761Y、A763-Y764insFQEA、A763-Y764insFHEA、V769-D770insASV、D770-N771insSVD、D770-N771insASVDN、D770-N771insG、N771-P772insSVDNP、N771-H773dupNPH、P772-H773insPNP、P772-H773insPR、H773-V774insH、A763-Y764insFQEA、H773-V774insPH、H773-V774insNPH、N771-P772insH、H771-P772insN、H773-V774insAH、D770delinsGY、V774-C775insHV、L861Q、V777-G778insCG、V777L、D769Y等。

在优选的实施方式中，所述突变型EGFR含有至少一种以下突变：A763_Y764insFHEA、A763-Y764insFQEA、d747-749/A750P D761Y、D770-N771insNPG、D770-N771insNPG/T790M、D770GY、G719C、G719D、G719S、L861Q以及ERBB的V777-G778insCG、V777L、D769Y等。

在具体的实施方式中，所述疾病为癌症。

在具体的实施方式中，所述癌症为非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、神经胶质细胞瘤、头颈部鳞癌、宫颈癌、食管癌、肝癌、肾癌、结肠癌、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、胃癌或多发性骨髓癌。

在另一方面，本发明提供抑制突变型EGFR或治疗或预防突变型EGFR介导的疾病的方法，所述方法包括将式I所示化合物或其药学上可接受的盐给予有此需要的对象的步骤。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1a-f为化合物85对包含不同EGFR突变的稳定细胞系增殖抑制检测实验GI50数据，其中化合物85显示为R202，化合物TAK788显示为R-203。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现一批蝶啶酮衍生物，这些衍生物能够靶向非经典突变EGFR，从而能够作为新一代的EGFR抑制剂。在此基础上完成了本发明。

术语定义

本文中涉及到的一些基团定义如下：

本文中，“烷基”指碳链长度为1-10个碳原子的饱和的支链或直链或环烷基，优选的烷基包括长1-5个、1-2个、1-6个、1-4个、3-8个碳原子不等的烷基。烷基的例子包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、庚基等。烷基可以被1个或多个取代基取代，例如被卤素或卤代烷基取代。例如，烷基可以是被1-4个氟原子取代的烷基，或者烷基可以是被氟代烷基取代的烷基。

本文中，“羟基”指碳链长度为1-10个碳原子的支链或直链醇，通常含有1-10个碳原子，优选含有1-6个碳原子，可以是直链或支链。酯羟基的例子包括但不限于1-羟基正丁基、1-羟基异丁基等等。

本文中，“酰氨基”指结构式为“-R’-NH-C(O)-R”的基团，其中，R’可选自氢或烷基，R可选自烷基、链烯基、炔基、被NR_cR_d取代的烷基、被NR_cR_d取代的链烯基和NR_cR_d取代的炔基、被卤素取代的烷基、被氰基取代的链烯基，其中，R_c和R_d可选自烷基和链烯基。

本文中，“芳基”指含有6到14个碳原子的单环、双环或三环芳族基团，包括苯基、萘基、菲基、蒽基、茚基、茀基、四氢化萘基、二氢化茚基等。芳基可任选地被1-5个(例如，1、2、3、4或5个)选自以下的取代基取代：卤素、C_1-4醛基、C_1-6烷基、氰基、硝基、氨基、酰胺基、羟基、羟甲基、卤素取代的烷基(例如三氟甲基)、卤素取代的烷氧基(例如三氟甲氧基)、羧基、C_1-4烷氧基、乙氧甲酰基、N(CH₃)和C_1-4酰基等、杂环基或杂芳基等。

本文中，“杂环基”包括但不限于含有1-3个选自O、S或N的杂原子的5元或6元杂环基团，包括但不限于呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡咯烷基、吡唑基、咪唑基、三唑基、噁唑基、吡喃基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哌啶基、吗啉基等。

本文中，“芳杂环基”是指含有5-14个环原子，并且有6个、10个或14个电子在环体系上共用。而且所含环原子是碳原子和从氧、氮、硫中任选的1-3个杂原子。有用的芳杂环基包括哌嗪基、吗啉基、哌啶基、吡咯烷基、噻吩基、呋喃基、吡喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、包括但不限制于嘧啶基等。芳杂环基可任选地被1-5个(例如，1、2、3、4或5个)选自以下的取代基取代：卤素、C_1-4醛基、C_1-6直链或支链烷基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、卤素取代的烷基(例如三氟甲基)、卤素取代的烷氧基(例如三氟甲氧基)、羧基、C_1-4烷氧基、乙氧甲酰基、N(CH₃)和C_1-4酰基。

本文中，“烷氧基”指被烷基取代的氧基。优选的烷氧基是长1-6个碳原子的烷氧基，更优选为长1-3个碳原子的烷氧基。烷氧基的例子包括但不限于：甲氧基、乙氧基、丙氧基等。烷氧基可以被1个或多个取代基取代，例如被卤素或卤代烷基取代。例如，烷氧基可以是被1-4个氟原子取代的烷基，或者烷基可以是被氟代烷基取代的烷基。

本文中，“卤素”指氟、氯、溴或碘。

本文中，“任选取代的”指其所修饰的取代基可任选地被1-5个(例如，1、2、3、4或5个)选自以下的取代基取代：卤素、C_1-4醛基、C_1-6直链或支链烷基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、卤素取代的烷基(例如三氟甲基)、卤素取代的烷氧基(例如三氟甲氧基)、羧基、C_1-4烷氧基、乙氧甲酰基、N(CH₃)和C_1-4酰基。

EGFR非经典突变

EGFR抑制剂为EGFR经典型敏感突变和T790M耐药突变的非小细胞肺癌患者带来福音。然而，并非所有EGFR突变患者都能从已经上市的EGFR抑制剂中获益。经研究发现，存在EGFR 20外显子插入突变(EGFR 20ins)的NSCLC对大部分EGFR抑制剂的靶向治疗效果差或无效。这些突变常常归为非经典突变。在本发明中，所述非经典突变主要包括18-21外显子的插入突变和点突变，ERBB2的点突变和插入突变。

18号外显子非经典突变主要表现G719X、E709X、K716A、K728A点突变，密码子709处缺失突变。G719X突变为EGFR中的G719X(X表示A丙氨酸，S丝氨酸，C半胱氨酸等)突变是指点突变，G719X突变约占总EGFR突变的3.10％[Cancer Sci.2016,107(9),:1179-1186]。

G719S突变致癌性较敏感突变弱，体外实验发现Gefitinib能以增加剂量的方式抑制G719S的自身磷酸化。与敏感突变L858R相比，Gefitinib需要以更高的浓度抑制G719S突变。E709X点突变为18号外显子的另一非经典突变，E709X突变约占总EGFR突变的0.30％。在体外实验中，与一代或三代TKIs相比，E709X点突变患者对Afatinib具有高度敏感性。

DelE709-T710insD是密码子709处最常见的缺失突变，约占总EGFR突变的0.30％。

19号外显子非经典突变表现为插入突变和点突变。19号外显子插入突变约占EGFR突变的0.60％，包括：I744-K745insKIPVAI、K745-E746insIPVAIK、K745-E746insVPVAIK、K745-E746insTPVAIK。体外试验均显示19号外显子插入突变对Afatinib敏感。

19号外显子点突变主要表现为D761Y，有研究认为它的出现可能与EGFR-TKi耐药相关，但耐药程度弱于20号外显子点突变T790M。目前缺乏临床试验数据。

20外显子翻译的氨基酸位点为762-823。起始于N-末端的谷氨酸Glu762为重要的催化位点。其中包括由E762-M766氨基酸构成的C-螺旋以及由A767-V774氨基酸构成的环。20号外显子非经典突变主要表现为插入突变与点突变。包括：A763-Y764insFQEA、V769-D770insASV、V769-D770insDNP、D770-N771insNPG、D770-N771insNPH、D770-N771insSVD、D770-N771insASVDN、D770-N771insG、N771-P772insSVDNP、N771-H773dupNPH、P772-H773insPNP、P772-H773insPR、H773-V774insH、A763-Y764insFQEA、H773-V774insPH、H773-V774insNPH、N771-P772insH、H771-P772insN、H773-V774insAH、D770delinsGY、V774-C775insHV等。以上突变约占总EGFR突变的5.80％。除A763-Y764insFQEA外，EGFR20号外显子插入突变对一、二代TKIs靶向治疗不敏感。在众多的突变形式中，最为特殊的是763_764insFQEA。763_764insFQEA是目前发现ex20ins突变里的敏感突变。

至今发现有超过60种独特的EGFR ex20ins形式，在其研究中最常见的EGFRex20ins依次为D770_N771>ASVDN、N771_P772>SVDNP和N771_H773dupNPH，约占ex20ins突变的50％。

在最新体外实验中发现，Poziotinib有效抑制了具有EGFR20号外显子插入突变的Ba/F3细胞系的生长。Poziotinib较Osimertinib、Afatinib强。但副作用明显，表现为皮疹和腹泻，缺乏临床试验数据。

20号外显子点突变主要为：S768I，约占总EGFR突变的1.0％。在体外实验中，S768I突变对Afatinib较Osimertinib更敏感。

EGFR ex20ins突变并不像经典突变那样对一二代EGFR-TKIs敏感，而是EGFR突变中最常见的非敏感突变。因而ex20ins突变的人群的治疗是目前临床医生在临床管理中面临的一大难题。

21号外显子非经典突变主要表现为点突变L861Q，约占总EGFR突变的0.90％。L861Q突变是由21号外显子第2828位点的T被A取代所致，具有类似于L858R突变的致癌活性。体外研究发现L861Q突变对于Osimertinib敏感，但目前缺少临床试验数据。

本发明的化合物及药物组合物

本发明的化合物是式I所示化合物或其药学上可接受的盐，

式中取代基的定义如上文所述。

本发明所述化合物的制备方法可参考公开于CN108721298A中所描述的方法。

本发明的化合物可以抑制突变型EGFR，特别是EGFR 18-21外显子点突变和插入突变，ERBB2的点突变和插入突变。因此，在本发明的化合物的基础上，本发明还提供一种药物组合物，该组合物含有治疗有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明化合物的药学上可接受的盐的例子包括但不限于无机和有机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐和草酸盐；以及与碱例如钠羟基、三(羟基甲基)胺基甲烷(TRIS，胺丁三醇)和N-甲基葡糖胺形成的无机和有机碱盐。

本发明的药物组合物可被配制成适合各种给药途径的制剂形式，包括但不限于被配制成用于肠外，皮下，静脉，肌肉，腹腔内，透皮，口腔，鞘内，颅内，鼻腔或外用途径给药的形式，用于治疗肿瘤和其他疾病。给药量是有效地改善或消除一个或多个病症的药量。对于特定疾病的治疗，有效量是足以改善或以某些方式减轻与疾病有关的症状的药量。这样的药量可作为单一剂量施用，或者可依据有效的治疗方案给药。给药量也许可治愈疾病，但是给药通常是为了改善疾病的症状。一般需要反复给药来实现所需的症状改善。药的剂量将根据病人的年龄，健康与体重，并行治疗的种类，治疗的频率，以及所需治疗效益来决定。

本发明的药物制剂可以给予任何哺乳动物，只要他们能获得本发明化合物的治疗效果。在这些哺乳动物中最为重要的是人类。

基于本发明的教导，本领域技术人员知晓本发明的化合物可用于治疗癌症。在具体的实施方式中，所述癌症为非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、神经胶质细胞瘤、头颈部鳞癌、宫颈癌、食管癌、肝癌、肾癌、结肠癌、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、胃癌、多发性骨髓癌。

本发明的药物制剂可用已知的方式制造。例如，由传统的混合，制粒，制锭，溶解，或冷冻干燥过程制造。制造口服制剂时，可结合固体辅料和活性化合物，选择性研磨混合物。如果需要或必要时加入适量助剂后，加工颗粒混合物，获得片剂或锭剂芯。

合适的辅料特别是填料，例如糖类如乳糖或蔗糖，甘露醇或山梨醇；纤维素制剂或钙磷酸盐，例如磷酸三钙或磷酸氢钙；以及粘结剂，例如淀粉糊，包括玉米淀粉，小麦淀粉，大米淀粉，马铃薯淀粉，明胶，黄芪胶，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，或聚乙烯吡咯烷酮。如果需要，可增加崩解剂，比如上面提到的淀粉，以及羧甲基淀粉，交联聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，或褐藻酸或其盐，如海藻酸钠。辅助剂特别是流动调节剂和润滑剂，例如，硅石，滑石，硬脂酸盐类，如镁硬脂酸钙，硬脂酸或聚乙二醇。如果需要，可以給锭剂核芯提供可以抵抗胃液的合适包衣。为此，可以应用浓缩糖类溶液。这个溶液可以含有阿拉伯树胶，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇和/或二氧化钛，漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。为了制备耐胃液的包衣，可使用适当的纤维素溶液，例如醋酸纤维素邻苯二甲酸或羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸。可向药片或锭剂核芯的包衣加入染料或色素。例如，用于识别或为了表征活性成分剂量的组合。

本发明的优点：

1.本发明提供的化合物是一种结构全新的能够抑制突变型EGFR，特别是非经典突变型EGFR的化合物；

2.本发明提供的化合物对非经典突变型EGFR具有优异的抑制活性；

3.本发明提供的化合物为开发能抑制EGFR突变，特别是非经典突变型EGFR的药物奠定了基础，具备极大的产业化和商品化前景以及市场价值，经济效益显著。

以下结合具体实施案例对本发明的技术方案进一步描述，但以下实施案例不构成对本发明的限制，所有依据本发明的原理和技术手段采用的各种施用方法，均属于本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

对以下化合物进行激酶谱评价(委托测试：Reaction Biology Corporation，OneGreat Valley Parkway,Suite 2Malvern,PA 19355,USA.)

实验方法：

将激酶反应的底物置于新鲜配置的反应缓冲液中，并加入激酶反应所需要的辅因子，其中缓冲液配比为：20mM HEPES(pH 7.5)、10mM MgCl₂,、1mM EGTA、0.02％Brij35、0.02mg/mL BSA,0.1mM Na₃VO₄,2mM DTT、1％DMSO；之后加入待测激酶，轻轻震荡。将待测化合物溶于DMSO中，制备成所需要的浓度，并使用自动进样器Echo550将待测化合物加入到上述含激酶/底物的缓冲液中。向反应体系中加入³³P标记的ATP(³³P-ATP，终浓度为0.01μCi/μL)，以启动激酶反应，并在室温下反应2h。将反应点在P81离子交换纸上(Whatman#3698-915)，用0.75％的磷酸彻底清洗过滤，最后测量残留在滤纸上的放射性磷酸化底物。激酶活性数据表示为测试样品中剩余激酶活性的百分比，测定10个浓度梯度，使用Prism4(GraphPad软件)进行曲线拟合并计算获得IC₅₀值。

IC₅₀值(nM)：

未测。

实施例2、细胞系增殖抑制检测实验

Mobocertinib(TAK-788，武田制药)日前美国FDA已授予突破性疗法认定(BTD)药物资格，用于治疗在含铂化疗后疾病进展的具有EGFR外显子20插入突变的转移性非小细胞肺癌患者。为了更客观评价化合物85活性，本实验采用TAK-788作为阳性对照。

1.化合物I对包含不同EGFR突变的稳定细胞系增殖抑制检测实验。

2.项目内容

通过CTG Assay检测化合物1，TAK788对不同突变类型Ba/F3 EGFR细胞系增殖的抑制作用。

3.主要试剂和耗材

3.1化合物：化合物85和TAK788，为粉末。

化合物85

TAK788

3.2细胞列表:

3.3 RPMI-1640(Gibco#C11875500CP；Lot#8120069)

3.4 FBS(Gibco#10099-141C；Lot#2145068CP)

3.5 CellTiter-Glo

Luminescent Cell Viability Assay(Promega,Cat.No.:G7573；Lot#0000319784)

3.7细胞培养及检测板：96Well Assay Plate(White Plate,Clear Bottom withLid Tissue Culture Treated Polystyrene 1/Pack,Costar 3610)

3.8 T25细胞培养瓶(BIOFIL#TCF012050)

3.9化合物配置板(Costar#3357)

4.主要实验仪器

Synergy H1多功能酶标仪(Biotek,REF:8040534；SN:500431)

5.实验原理

B a/F3是一种依赖于白介素-3的小鼠pro-B细胞系，是一种研究激酶及其激酶抑制剂的常用系统，因为重组表达一些蛋白激酶可以使Ba/F3细胞不再依赖IL-3而生长，根据其这样的特性，检测化合物对表达不同靶点激酶的B a/F3细胞增殖的抑制，可以从细胞水平反映化合物对不同激酶靶点的抑制作用，用于激酶抑制剂的筛选。

本实验采用CellTiter-Glo

Luminescent Cell Viability Assay检测细胞增殖，其具体原理如下：

三磷酸腺苷(Adenosine Tri-Phosphate,ATP)是自然界中各种生命活动中共用的能量载体，是能量储存和转移的最小单位。CellTiter-Glo^TM活细胞检测试剂盒采用萤光素酶作为检测物，而萤光素酶需要ATP的参与才能产生光信号。向细胞中加入CellTiter-Glo^TM试剂后，测量发光值。光信号和体系中ATP量成正比，而ATP又和活细胞数正相关。因此通过使用CellTiter-Glo试剂盒检测ATP含量，可以反映出细胞的活力进而反映细胞的增殖水平。

6.实验流程

6.1细胞复苏及培养

液氮内取出细胞，37摄氏度水浴快速融化细胞，并将冻存管以1000rpm的速度离心，并弃去冻存液上清，将细胞重悬于RPMI1640+10％FBS培养基中，放置37摄氏度细胞培养箱中培养，细胞培养密度始终保持2*10e5到2*10e6/ml之间。

6.2化合物配制

1)在化合物配制板中用DMSO对化合物进行连续梯度稀释，稀释起始浓度为1或10mM,梯度稀释倍数为3。

2)准备一个新的化合物配制板，每孔加入198ul RPMI160+10％FBS培养基，从前一个梯度稀释好的化合物配制板中一一对应的转移2ul/孔的化合物至该板，并充分混匀备用，使该板内最高起始化合物浓度为1或10uM，并依梯度而下(该板为10*化合物浓度稀释板)。

6.3检测过程

1)取对数生长的细胞，离心弃培养上清，将离心下来的细胞重悬于新鲜RPMI1640培养基中，细胞密度为2*10e4/ml

2)将重悬的细胞接种到白壁透明底的96孔细胞培养板中，100ul/孔细胞悬液，接种两块培养板，放置37度细胞培养箱培养过夜

3)第二天取其中一块接种细胞的96孔板，加入100ul/孔cell titer glo检测试剂放置60分钟，读取数值，定义为G0数据

4)取另一块平行板，从之前梯度稀释好的10*化合物浓度稀释板中取11.1ul/孔化合物至该板，使得细胞检测板中化合物终浓度从0.5或1uM开始，3倍稀释9个浓度梯度，并另外设置DMSO对照孔，继续在37度细胞培养箱培养72小时

5)将化合物处理过72小时的96孔板从培养箱中取出，加入100ul/孔cell titerglo检测试剂放置60分钟，读取数值，定义为G3数据

6)根据以下公式计算每个孔对应的细胞增殖率

％Proliferation＝(待测化合物孔G3–G0平均值)/(DMSO对照孔G3平均值–G0平均值)*100

7)根据每个梯度浓度孔对应的增殖率和其浓度，利用Prism Graphpad5.0软件拟合细胞增殖的梯度曲线，并且计算化合物的GI50(GI50定义为细胞增殖率为50％时对应的化合物浓度，软件中拟合公式如下：

Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))

7.实验结果：

化合物85对包含不同EGFR突变的稳定细胞系增殖抑制检测实验GI50

图1a-f显示了化合物85对包含不同EGFR突变的稳定细胞系增殖抑制检测实验GI50数据，其中化合物85显示为R202，化合物TAK788显示为R-203。

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