JP6752878B2 - 神経芽細胞腫及び/または軟部組織肉腫の処置における使用のためのchk1/2阻害剤 - Google Patents
神経芽細胞腫及び/または軟部組織肉腫の処置における使用のためのchk1/2阻害剤 Download PDFInfo
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Description
ルートA
調製1
5−イソチオシアナトピラジン−2−カルボニトリル
調製2
(tert−ブチル3−(2−アセチル−3−メトキシフェノキシ)プロピルカルバメート
実施例1
5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルギ酸塩
ルートB
調製3
1−[2−メトキシ−6−(4−メトキシベンジルオキシ)フェニル]エタノン
調製4
1−(2−メトキシ−6−(4−メトキシベンジルオキシ)フェニル)−3,3−ビス(メチルチオ)プロプ−2−エン−1−オン
調製5
5−ブロモ−N−(5−(2−メトキシ−6−(4−メトキシベンジルオキシ)フェニル)−1H−ピラゾール−3−イル)ピラジン−2−アミン
調製6
2−(3−(5−ブロモピラジン−2−イルアミノ)−1H−ピラゾール−5−イル)−3−メトキシフェノール
調製7
tert−ブチル3−(2−(3−(5−ブロモピラジン−2−イルアミノ)−1H−ピラゾール−5−イル)−3−メトキシフェノキシ)プロピルカルバメート
調製8
tert−ブチル3−(2−(3−(5−シアノピラジン−2−イルアミノ)−1H−ピラゾール−5−イル)−3−メトキシフェノキシ)プロピルカルバメート
ルートC
調製9
(E)−5−(3−(2−メトキシ−6−(4−メトキシベンジルオキシ)フェニル)−1−(メチルチオ)−3−オキソプロプ−1−エニルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリル
調製10
5−(5−(2−メトキシ−6−(4−メトキシベンジルオキシ)フェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリル
調製11
5−(5−(2−ヒドロキシ−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリル
調製12
tert−ブチル3−(2−(3−(5−シアノピラジン−2−イルアミノ)−1H−ピラゾール−5−イル)−3−メトキシフェノキシ)プロピルカルバメート
実施例2
5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリル二塩酸塩
実施例3
5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリル
実施例4
5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルメタンスルホン酸塩
ルートD
調製13
1−[2−メトキシ−6−(4−メトキシベンジルオキシ)フェニル]エタノン
調製14
1−(2−メトキシ−6−(4−メトキシベンジルオキシ)フェニル)−3,3−ビス(メチルチオ)プロプ−2−エン−1−オン
調製15
(E)−5−(3−(2−メトキシ−6−(4−メトキシベンジルオキシ)フェニル)−1−(メチルチオ)−3−オキソプロプ−1−エニルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリル
調製16
5−(5−(2−メトキシ−6−(4−メトキシベンジルオキシ)フェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリル
調製17
5−(5−(2−ヒドロキシ−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリル二塩酸塩
調製18
tert−ブチル3−(2−(3−(5−シアノピラジン−2−イルアミノ)−1H−ピラゾール−5−イル)−3−メトキシフェノキシ)プロピルカルバメート
実施例5
5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩
代替の調製、実施例5
5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩
CHK1生化学活性に対する化合物の効果は、TR−FRETアッセイを用いて決定することができる。このアッセイでは、テルビウム標識抗体を使用して、キナーゼ、フルオレセイン標識基質、及びATPの反応から形成されたリン酸化生成物を検出する。抗体は、リン酸化基質に結合し、アクセプターシグナル(フルオレセイン)対ドナーシグナル(テルビウム)の比として計算されるTR−FRET値の増加をもたらす。
CHK2生化学アッセイ
CHK1の阻害剤は、タンパク質のキナーゼ活性が、DNA損傷応答が活性化された細胞における基質をリン酸化するのを防止する。CHK1の容易に検出可能な基質は、CHK1自体の自己リン酸化部位であり、セリン296である。以下の免疫ブロットアッセイは、CHK1上のセリン296のリン酸化量及び間接的にCHK1タンパク質キナーゼの活性レベルを測定するのに使用できる。HeLa細胞(ATCCから購入)を、10%(v/v)熱不活性化FBS(Gibco(商標))、1×MEM非必須アミノ酸(Gibco(商標))、1×ピルビン酸ナトリウム(Gibco(商標))を補充した、MEM w/Earle’s塩類(Invitrogen)w/L−グルタミン(Gibco(商標))中で培養し、1×105細胞を24ウェル細胞培養プレートの1ウェルあたり600μLのMEM培養培地(上記)にプレーティングした。細胞を37℃、5%CO2、及び湿度95%〜100%で24時間インキュベートする。培養培地中のドキソルビシン(Sigma)の4μMストックの16μLを各適切なウェルに添加して100nMのドキソルビシンの最終濃度を作製する。CHK1阻害剤化合物を添加する前に、プレートをインキュベーターにさらに24時間戻す。化合物を100%DMSO中で、10mMで可溶化し、次いで40%(v/v)DMSO中で2mMに希釈し、次いで培地+4%(v/v)DMSOで100μMに希釈する。続いて化合物(1:3)の連続希釈を100μM〜0.005μMの範囲にわたって調製する。化合物ストックの66μLをプレート中の適切なウェルに添加して、0.4%(v/v)の最終DMSO濃度及び最終化合物の濃度範囲1μM〜0.0005μMを生成する。プレートをインキュベーターにさらに2時間戻し、次いで細胞溶解及び処理のために取り出した。培地をプレートから取り出し、各ウェルを0.5mlの氷冷DPBS(Gibco(商標))で1回洗浄し、全ての液体を除去し、プレートを手順の残りの間氷上に置く。各ウェルに、ホスファターゼ阻害剤(Sigma)及びプロテアーゼ阻害剤(Roche Diagnostics)を含むCell Extraction Buffer(Invitrogen)からなる氷冷溶解緩衝液75μLを添加する。10分後、各ウェルをこすり取り、溶解物を氷上の1.5mLのポリプロピレン製微量遠心管に移す。各溶解物を、水/氷浴中に懸濁させながら、プレートのキュフォンソニケーター(Misonix)で45秒間超音波処理する。各サンプル50μLを、4×Laemmliサンプル緩衝液(240mM Tris−HCl、pH6.8、40%グリセロール、0.05%ブロモフェノールブルー、8%w/v SDS及び20%(v/v)β−メルカプトエタノール)25μLを含む0.5mLポリプロピレン製微量遠心管に移し、95℃で5分間加熱し、−80℃で凍結保存する。残りの溶解物をタンパク質濃度の測定に使用する(BCA(商標)タンパク質アッセイキット、Thermo Scientific)。試料緩衝液中の各細胞溶解物5 μgをE−96ウェルゲル(Invitrogen)に適用し、メーカーの使用説明書に従って電気泳動に付す。当技術分野で十分に理解されている手順(Towbin et al.,1979)に従って、タンパク質をゲルからImmobilon−P膜(Millipore)に電気泳動転写する。膜を10mM Tris/HCl pH8.0、150mM NaCl及び0.05%(v/v)Tween 20(TBST)で短時間すすいで、TBST/5%(v/v)再構成カーネーション(登録商標)インスタントミルク中に25℃で1時間浸漬した。膜をTBSTで5分間4回洗浄し、次いでウサギ抗ホスホCHK1(セリン296)(Cell Signaling)の適切な希釈液を含むTBST/5%(w/v)BSA中に4℃で24時間浸漬する。膜を25℃で5分間TBSTで4回洗浄し、次いでHRP(Amersham)にコンジュゲートしたロバ抗ウサギIgGの適切な希釈物を含むTBST/5%ミルク中に25℃で2時間浸して、自己リン酸化CHK1タンパク質を検出する。膜を25℃で5分間TBSTで再び4回洗浄する。膜上に固定された抗原−抗体−レポーターコンジュゲートを、化学発光イメージャ(Fujifilm)を使用してメーカーが推奨するように、Super Signal Western Femto HRP−検出試薬(Pierce)で検出する。ホスホ−CHK1(ser296)バンド強度は、「Total Lab」ソフトウェア(非線形動力学)を用いて計算する。ドキソルビシン誘発CHK1自己リン酸化の阻害パーセントは、以下の式を用いて計算される:阻害%=(試料ホスホCHK1バンド強度−ドキソルビシンなし陰性対照ホスホCHK1バンド強度)/(ドキソルビシン陽性対照ホスホCHK1バンド強度−ドキソルビシンなし陰性対照ホスホCHK1バンド強度)×100。実施例2の化合物は、このアッセイにおいて、<0.0005μMのEC50を有することが測定される。このことは、本発明の化合物がCHK1の強力な阻害剤であることを実証する。
CHK1の阻害剤は、トポイソメラーゼII阻害剤、ドキソルビシンで処置したp53マイナス腫瘍細胞におけるG2M DNA損傷チェックポイントを無効にする。G2Mチェックポイント抑止の測定は、セリン10上のヒストンH3のリン酸化であり、これは、細胞がG2Mチェックポイントを横切って有糸分裂に入る後に起こる。以下の高含量イメージングアッセイを使用して、細胞中のヒストンH3のリン酸化を測定することができる。HeLa細胞(ATCCから購入)を、10%(v/v)FBSを補充したMEM培地(Gibco(商標))中で培養し、ポリD−リシンでコートしたクリアボトムブラックプレート(BD Biocoatカタログ番号3504640)(ウェルあたり100μL)中に2000細胞/ウェルでプレーティングする。次いで、プレートを細胞培養インキュベーター内で18〜24時間インキュベートする(37℃、5%CO2及び95%相対湿度)。最初のインキュベーションの後、625nMのドキソルビシンを含むGibco(商標)MEM培地10%FBSの20μLをプレートの適切なウェルに加え、最終濃度125nMとする。プレートをインキュベーターに24時間戻し、G2Mチェックポイントで細胞を停止させるのに十分である。翌日、細胞を実施例2の化合物で処理する。実施例2の化合物を100%DMSO中、10mMで可溶化し、次いで4%(v/v)DMSO−MEM中50μMから開始する10倍ストックに希釈する。その後、化合物(1:2)の連続希釈液を50μM〜0.39μM範囲にわたって調製する。化合物ストックの13μLをプレート中の適切なウェルに添加して、0.4%の最終DMSO濃度及び5μM〜0.039μMの間の最終化合物濃度範囲を生成する。プレートをインキュベーターにさらに7時間戻し、次いで固定のために取り出した。液体を注意深く各ウェルから除去し、100μLのPREFER(商標)固定剤(Anatech LTD.カタログ番号414)を添加する。プレートを室温で20分間保持し、固定剤を除去し、次いで細胞をDPBS(Gibco(商標)カタログ番号14040)中の0.1%(v/v)Triton(登録商標)X100 Pierceカタログ番号28314)を100μL/ウェルで10分間添加することによって透過性にする。溶液を除去し、プレートを1ウェルあたり100μLのDPBSで2回洗浄し、続いて50μg/mLのRNAase(Sigmaカタログ番号R−6513)を含む100μLのDPBSを室温で1時間にわたって加える。RNAase溶液を除去し、ウサギ抗pHH3(ser10)(UBIカタログ番号06−570)+1%(w/v)BSA(Gibco(商標)カタログ番号15260)の1:500希釈物を含む50μLのRNAase溶液を各ウェルに添加することによってセリン10(pHH3)上でリン酸化されたヒストンH3の存在について細胞を染色した。プレートを密封し、4℃で一晩保温する。一次抗体は、各プレートを1ウェルあたり100μLのDPBSで2回洗浄することによって除去され、DPBS+1%(w/v)BSA中のAlexa dye 488(Invitrogenカタログ番号A11008)に結合したヤギ抗ウサギIgGの1:750希釈液50μLで置き換える。プレートは、光から保護するためにアルミホイルで覆われた室温で1時間保持される。プレートを再度100μLのDPBSで2回洗浄し、100μLの15nMのPI(元の溶液からPBSでの1:100希釈液、Molecular Probesカタログ番号P3566)で置き換える。プレートは黒いシールでシールされ、プレートを光から保護する。プレートを30分間インキュベートして核を染色する。プレートを、488nm励起(TTP LABTECH LTC)を用いて、ACUMEN EXPLORER(商標)レーザー走査蛍光マイクロプレートサイトメーターでスキャンして、2N及び4Nを含むpHH3及びDNA含有量を測定する。pHH3陽性細胞は、Alexa488からの519nmにおける平均強度によって同定される。PI/DNAからの655〜705nmでの全強度を用いて、細胞周期(2N細胞、4N細胞)における個々の細胞及び亜集団を同定する。各集団の最終的な読み出しは、pHH3の%、2Nの%及び4Nの%の最終アッセイ出力を生じる全細胞の%に対して正規化することによって決定される。次いで100nMの阻害剤対照化合物の最大濃度で細胞を処理して各化合物の最終%活性を測定することにより100%活性を測定する。0%活性は、化合物処理なしに基づく。相対EC50は、100%の対照最大に対するpHH3の%を決定する、ACTIVITY BASE(商標)、Excel適合、4つのパラメータのロジスティック適合を用いた曲線適合化、式205を用いることにより決定される。実施例2の化合物は、このアッセイにおいて、0.0105μMのEC50を有することが測定される。これは、本発明の化合物がG2M DNA損傷チェックポイントを無効にすることを実証する。
CHK1の阻害剤は、S期のチェックポイントの無効化を介してゲムシタビン(または他の細胞傷害剤)の抗増殖活性を増強し、DNA損傷を持続的かつ増加させることができる。DNA損傷後の腫瘍細胞増殖の継続能力は、細胞がDNAを複製する能力を決定することによって分析することができる。このアッセイは、細胞がDNA損傷を修復する機会を得た後に、そのDNAを複製する細胞の能力を評価する。このアッセイでは、細胞をゲムシタビンで処理し、次に実施例2の化合物で処理する。回復期の後、S期中に放射性チミジンをDNAに組み込む能力について細胞をアッセイする。ECtfsパラメータは、CHK1阻害の非存在下でこのアッセイで測定したゲムシタビンのGI90濃度の半分を減少させるのに必要なCHK1阻害剤の濃度の尺度である。HT−29細胞(ATCCから入手)をRPMI1640+(Gibco(商標))10%(v/v)の熱不活性化FBS中で増殖させる。これらの細胞を、Corning Costar 96ウェル組織培養プレート上に1.3×103/ウェルでプレーティングする。細胞をプレーティングした後、37℃に戻す前に、組織培養プレートを室温で45分間保持する。ゲムシタビンを添加する前にプレートを24時間インキュベートする。ゲムシタビンを添加する前に、培地を全てのウェルから取り出し、1ウェルあたり150μlの新しいRPMI培地と交換する。10mMのゲムシタビンストックをPBS中で調製する。ゲムシタビン希釈液をRPMI培地中4倍濃度で調製し、1ウェルあたり50μLでウェルに添加した。使用されるゲムシタビンの最高最終濃度は80μMであり、希釈は4倍段階で進行する。2時間後、ゲムシタビン含有培地をウェルから取り出し、150μl/ウェルの新鮮RPMI培地で置き換える。実施例2の化合物(DMSO中10mM)を最初にDMSO中で2000倍の最終濃度に希釈し、次いでRPMI培地で1:500に希釈してウェルに添加するための4倍ストックを生成する。添加容量は50μLである。化合物の希釈は、5000nMで開始して、2倍段階で進行する。実施例2の化合物を添加して24時間後、阻害剤を含む培地を吸引除去し、1ウェルあたり200μLの新鮮RPMI培地と交換する。実施例2の化合物を除去して72時間後、トリチウム化チミジン標識を開始する。3H−チミジン(NET027X001、PerkinElmer、比活性20Ci/mmol)を、完全RPMIで1:20に希釈して、0.05mCi/mLの濃度を得る。この溶液の20μLを各ウェルに加え、1μCi/ウェルの3H−チミジンを生成する。細胞を22時間標識する。3H−チミジンを含む培地をウェルから完全に除去する。次いで、プレートを−20℃で数時間凍結する。組み込まれた3H−チミジンを含むDNAを採取するために、プレートを数分間解凍し、次いで1ウェルあたり120μLの0.1N NaOHを各ウェルに添加する。次いで、各プレートを37℃で、ローテーター上でゆっくりと混合しながら10分間インキュベートする。DNAをFiltermate 196 Harvester(PerkinElmer)で採取し、96ウェルUnifilter GF/Cプレート(PerkinElmer番号6005174)上に収集する。細胞が標識された組織培養プレートのウェルを水で洗浄する(5×)。Unifilterプレート膜を、1ウェルあたりさらに4.5mLで洗浄する(3×1.0mL及び最後に1.5mL洗浄)。UnifiをBackseal接着シート(PerkinElmer)で密封し、MicroScint−20(Perkin Elmer)の50μL/ウェルを加える。次いで、各プレートをトップシール透明接着シート(PerkinElmer)で密封する。1ウェルあたり1分でTopcountシンチレーションカウンター(PerkinElmer)でプレートを計数する。3H−チミジンカウント/分(cpm)を分析及びプロットのためにPrism(GraphPad)にエクスポートする。ゲムシタビン用量応答は、実施例2の化合物の各濃度について決定される。これを行うために、ゲムシタビンの非存在下での実施例{2の化合物の濃度の平均cpmとして100%の取り込みを設定し、cpm=0(1分あたりのカウントなし)として取り込まない(100%阻害)と設定してcpmを標準化する。Prismでデータをプロットするために、ゲムシタビン濃度をlog値に変換し、用量応答曲線を非線形回帰によって適合させる。上部と下部のどちらの適合も制限されない。ECtfs値は0.3nMである。さらに、3nMの実施例2の化合物は、HT29結腸癌細胞においてゲムシタビンのEC50を37nMから5nMまで7倍減少させる。実施例2の化合物の作用はまた、ゲムシタビンについての52から組み合わせに対する73への増殖阻害の割合を増加させる。単独で、3nMの[1]実施例2の化合物はHT29細胞の増殖にほとんど影響を与えない。
Calu−6細胞(ATCC)を増殖培地(10%(v/v)熱不活性化FBS(Gibco(商標))、1×MEM非必須アミノ酸(Gibco(商標))、1×ピルビン酸ナトリウム(Gibco(商標))を補充したL−グルタミン(Gibco(商標))とのEarle’s塩とのMEM(Invitrogen))で培養し、増殖させる。細胞を採取し、リン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、増殖培地(血清を含まない)中の1×106個の細胞を同量のBD Matrigel(商標)マトリックス(BD Bioscience、Franklin、NJ)と混合し、予め照射した(4.5Gy)ヌードマウス(Harlan、Indianapolis、INからの胸腺欠損ヌード)の側腹部に皮下注射する。移植後の15日目(腫瘍サイズ=150〜200mm3)に、毎日150mg/kgの用量で腹腔内経路により動物に生理食塩水(Hospira、Lake Forest、IL)で新鮮に配合されたゲムシタビンを動物に投与する。6時間後、動物に、メタンスルホン酸/20%カプチソール(CYDEX、Overland Park、KS)のモル比で配合された実施例2の化合物を、15mg/kgの用量を下方に変化させる静脈内経路によって投与する。CHK1阻害剤投与の2時間後に動物を屠殺し、腫瘍を採取し、ホスファターゼ阻害剤(Sigma)及びプロテアーゼ阻害剤(Roche Diagnostics)を含む氷冷Cell Extraction buffer(Invitrogen カタログ番号FNN0011)で直ちに処理する。腫瘍を、15秒間高に設定した電動式組織ホモジナイザー(Powergen 700)を用いて、氷冷した15mLのポリプロピレン円錐管中1.5〜2.0mLの溶解緩衝液中で処理する。試料を氷上に保ったまま、25ゲージの針を備えた1mLのシリンジを通して4回、溶解物を吸引する。次に、0.35mLの腫瘍溶解物を、0.15mLの4×Laemmli試料緩衝液(240mM Tris−HCl、pH6.8,40%グリセロール、0.05%ブロモフェノールブルー、8%w/v SDS及び20%(v/v)ベータメルカプトエタノール)を含む1.5mLのポリプロピレン微量遠心管に移す。次いで、サンプルを混合し、95℃で5分間加熱し、Misonix3000プレートホーンソニケーターで高出力を用いて1分間超音波処理する。次いで、サンプルを氷上で保存するか、またはウェスタンブロットによる標的阻害評価のために−80℃で保存する。残りの溶解物をタンパク質濃度の測定に使用する(BCA(商標)protein assay kit,Thermo Scientific)。[1]試料緩衝液中の各腫瘍溶解物5μgをE−Page96ウェルゲル(Invitrogen)に適用し、メーカーの使用説明書に従って電気泳動に付す。当技術分野で十分に理解されている手順(Towbin et al.、1979)に従って、タンパク質をニトロセルロースプロトランBA83膜(Whatman)に移す。次に膜を処理して、セリン296上で自己リン酸化されたCHK1タンパク質を測定する。膜を水、次いで10mM Tris/HCl pH8.0、150mM NaCl及び0.05%(v/v)Tween 20(TBST)で短時間すすぎ、TBST/5%(w/v)再構成Carnation(登録商標)インスタントミルク中に25℃で1時間浸漬する。次いで膜をTBSTで5分間4回洗浄する。膜を、ウサギ抗ホスホCHK1(セリン296)(Cell Signaling)の適切な希釈液中のTBST/5%(w/v)BSA中に、4℃で16時間浸漬する。次に、膜を25℃で5分間TBSTで4回洗浄し、次いでHRP(Amersham)にコンジュゲートしたロバ抗ウサギIgGの適切な希釈物を含むTBST/5%ミルク中に25℃で2時間浸漬して、ホスホ−CHK1(ser296)を検出する。膜を25℃で5分間TBSTで4回洗浄する。メンブレン上に固定された抗原−抗体−レポーターコンジュゲートを、Super Signal Western Femto HRP−検出試薬(Pierce)で、製造元の推奨にする方法で検出される。
Phospho−CHK1(ser296)バンド強度は、「Total Lab」ソフトウェア(非線形動力学)を用いて計算される。ゲムシタビン誘発CHK1自己リン酸化の阻害パーセントを、以下の式を用いて計算する:阻害%=(試料ホスホCHK1バンド強度−平均ゲムシタビン(最大)陽性対照ホスホCHK1バンド強度)/(平均陰性対照(最小)ホスホCHK1バンド強度−平均ゲムシタビン(最大)陽性対照ホスホCHK1バンド強度)×100。
腫瘍死をもたらすCHK1阻害剤の能力は、Calu−6肺及びHT−29結腸腫瘍異種移植の有効性モデルを用いてインビボで決定することができる。Calu−6肺癌細胞(ATCC)を、増殖培地(10%(v/v)熱不活性化FBS(Gibco(商標))、1×MEM非必須アミノ酸(Gibco(商標))及び1×ピルビン酸ナトリウム(Gibco(商標))を補充した、L−グルタミン(Gibco(商標)を含むMEM w/Earle’s塩(Invitrogen))で培養し、及びHT−29結腸癌細胞(ATCC)を増殖培地(10%FBS(Gibco(商標))を補充したMcCoy’s5A培地(Gibco(商標)))で培養して、増殖させる。細胞を採取し、リン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、増殖培地(血清を含まない)中の5×106細胞(HT−29)または1×106細胞(Calu−6)を、同量のBD Matrigel(商標)マトリクス(BD Bioscience、Franklin,NJ)と混合し、次いでヌードマウス(Charles River Labs、Wilmington、MAからのCD−1nu/nu)の側腹部に皮下注射した。移植後約16日(150〜200mm3)に、ゲムシタビンを毎日生理食塩水で新鮮に配合し、60mg/kg用量の腹腔内経路により動物に投与する。24時間後、静脈内経路によりメタンスルホン酸/20%Captisol(CYDEX、Overland Park、KS)のモル比で配合された実施例2の化合物を動物に投与する。休止1日後、投与を3サイクル以上繰り返す(CHK1阻害剤オフセット+24時間で、Q3Dx4)。各投与群は9匹の動物からなる。腫瘍応答は、治療過程中に週に2回行われる腫瘍体積測定によって決定される。腫瘍成長阻害(TGI)は、ビヒクル処置対照群の平均腫瘍サイズから、化合物処置群の平均腫瘍サイズの減少率として計算される。実施例2の化合物は、単独で、及びゲムシタビンと組み合わせて、HT−29及びCalu−6腫瘍異種移植片モデルの両方において優れた用量依存性抗腫瘍活性を示し、ゲムシタビン単独よりも腫瘍増殖阻害が最大で6倍増加する。
腫瘍死をもたらすCHK1阻害剤の能力は、Calu−6肺異種移植の有効性モデルを用いてインビボで決定することができる。Calu−6肺癌細胞(ATCC)を上記のように培養する。細胞を採取し、リン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、増殖培地(血清を含まない)中の1×106個の細胞(Calu−6)を同量のBD Matrigel(商標)マトリックス(BD Bioscience、Franklin、NJ)と混合し、次いでヌードマウスCharles River Labs、Wilmington、MAからのCD−1nu/nu)の側腹部に皮下注射する。移植(150〜200mm3)後約16日目に、実施例2の化合物を15mg/kg(皮下(SC)、1日2回(BID×5日、休止2日)×3サイクルで投与する。腫瘍応答は、治療過程中に週に2回行われる腫瘍体積測定によって決定される。5日間のBIDスケジュール(15mg/kg)で投与した実施例2の化合物は、先に記載したゲムシタビンと実施例2の化合物との組み合わせスケジュールに優れた増殖阻害を提供する。完全な腫瘍退縮は迅速かつ耐久性がある。
CHK1阻害剤の有効性の1つの尺度は、制御されていない複製起点活性化のために培養中の癌細胞の増殖を阻害する能力である。(Conti et al.Cell Cycle 6:2760−2767,2007)。広範な種類の腫瘍に由来する細胞株におけるCHK1阻害剤の抗増殖活性の決定は、どの腫瘍型がCHK1阻害剤による化学療法に対して臨床的に応答性であり得るかを示す。以下に記載される細胞増殖アッセイは、ドイツのOncotest、GmbHで実施される。30種の固形腫瘍細胞は、それぞれ1〜6種の異なる細胞株(Oncotest、GmbH)によって示される13種の異なる腫瘍組織型に由来する。それらは、膀胱、脳、結腸、胃、肝臓、肺、乳房、卵巣、膵臓、腎臓及び子宮体の癌、ならびに黒色腫及び胸膜中皮腫から確立される。全ての細胞株は、患者由来の腫瘍異種移植片からのOncotestで確立されている(Roth et al.1999).ドナー異種移植片の起源は、Fiebig et al。(Fieberg et al.1992及び1999)に記載される。細胞株は、毎週1〜2回定期的に継代培養され、20継代まで培養液中に維持される。全ての細胞を、10%(v/v)ウシ胎児血清(PAA、Colbe、Germany)及び0.1mg/mLのゲンタマイシン(PAA、Colbe、Germany)を補充したRPMI 1640培地(PAA、Colbe、Germany)で、5%CO2の加湿雰囲気中、37℃で増殖させる。これらの細胞株に対する化合物の細胞傷害活性を評価するために、改変PIアッセイを使用する。簡潔に述べると、接着細胞をトリプシン処理により指数期培養から回収し、カウントし、96ウェル平底マイクロタイタープレートで、細胞株に応じた細胞密度(4.000〜20.000細胞/ウェル)でプレーティングする。細胞を付着させて指数関数的増殖を再開させるための24時間の回復期間の後、10μLの、培養培地(6対照ウェル/プレート)または実施例2の化合物を含む培養培地を添加する。実施例2の化合物のストック溶液をDMSO中に1mMの濃度で調製する。その後の希釈は、以下のように完全RPMI 1640細胞培養培地で行う:DMSO原液を最初に1:22(4.5%(v/v)DMSO含有)に希釈する。この溶液を用いて、細胞培養培地中で連続希釈(半対数または2倍)を行う。最終希釈段階(1:15)のために、それぞれの最終化合物溶液10μL/ウェルを、140μL/ウェル培養培地に直接添加する。最終DMSO濃度は≦0.3%(v/v)である。実施例2の化合物は、10点濃度曲線において3回適用して、処理を4日間続けた。4日間の処理の後、培地を除去し、7μg/mLPI水溶液200μLで置き換える。生存細胞の数を測定するために、細胞は凍結により透過性にされ、化合物による処理後にウェルに付着したままである全ての細胞が死滅する。最後に、PI蛍光をCytofluor 4000マイクロプレートリーダー(励起λ=530nm、発光λ=620nm)を用いて測定し、生存可能な全細胞数を決定する。増殖阻害は、試験/対照×100(%T/C)値として表される。T/C値に基づいて、非線形回帰(log[阻害剤濃度]対応答(%T/C))を用いて相対IC50値を決定する。実施例2の化合物は、これらの腫瘍細胞株の大部分の増殖を、20nM未満のEC50で阻害する。
細胞溶解物は、最終濃度5及び50nMで24時間、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩(実施例5)で処理した、胚性及び肺胞性横紋筋肉腫(それぞれRD及びSJCRH30)、骨肉腫(Saos−2)及びユーイング肉腫(RD−ES)細胞株から得ることができる。
以下のプロトコールは、有効薬学的成分に応答して腫瘍体積の減少を測定するために使用することができる。ヒトNBM癌細胞SH−SY5Y(ATCC、番号CRL−2226)を培養し、採取し、HBSS及びMatrigel(登録商標)の1:1溶液200μL中の5×106個の細胞をメスのCD−1 nu/nuマウス(20−24g、Charles River Laboratories)の右後部側腹部に皮下注射する。培養中のヒトNBM癌細胞KELLY(Sigma−番号92110411)を増殖させ、採取し、HBSSとMatrigel(登録商標)の1:1溶液200μL中の5×106細胞を、メスCB−17 SCIDマウス(20−24g、Charles River Laboratories)の右後部側腹部に皮下注射する。培養中のヒトNBM癌細胞IMR−32(ATCC、番号CCL−127)を増殖させ、採取し、HBSSとMatrigel(登録商標)の1:1溶液200μL中の5×106細胞をメスCB−17 SCIDマウス(20−24g、Charles River Laboratories)の右後部側腹部に皮下注射する。
組み合わせ療法は、腫瘍増殖を効果的にブロックし、単一の薬剤に応答してしばしば発症する獲得した腫瘍耐性を克服することができる癌治療の方法である。インビボSJCRH−30 RMSモデルにおいて、肉腫標準治療、ドキソルビシンと組み合わせて、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩(実施例5)を試験することができる。(表3を参照されたい。)この組み合わせ有効性試験は、上記のように胸腺欠損ヌードマウスで行うことができる。この試験で使用したビヒクルは、滅菌水中の20%Captisol(登録商標)であり、3日間連続して皮下投与し、その後4日間の投与休暇を行い、最低4週間繰り返した。ドキソルビシン(滅菌水中5%デキストロース)は、1週間に1回静脈内投与され、他方5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩(実施例5)は、滅菌水中20%Captisol(登録商標)中で投与され、3日間連続して皮下投与され、その後、4日間の投与休暇が行われる。治療期間は4週間続く。
本発明は、以下の態様を含む。
[1]
癌の治療方法であって、それを必要とする患者に、有効量の5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルである化合物、またはその薬学的に許容される塩、または前記その薬学的に許容される塩の溶媒和物を投与することを含み、前記癌は、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群より選択される、方法。
[2]
前記癌は、神経芽細胞腫である、[1]に記載の方法。
[3]
前記癌は、横紋筋肉腫である、[1]に記載の方法。
[4]
前記横紋筋肉腫は、胞巣状横紋筋肉腫または胎児性横紋筋肉腫である、[3]に記載の方法。
[5]
前記癌は、骨肉腫である、[1]に記載の方法。
[6]
前記癌は、ユーイング肉腫である、[1]に記載の方法。
[7]
前記癌は、線維形成性小円形細胞腫瘍である、[1]に記載の方法。
[8]
前記癌は、平滑筋肉腫である、[1]に記載の方法。
[9]
前記化合物は、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩である、[1]〜[8]のいずれか1項に記載の方法。
[10]
前記化合物は、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルである、[1]〜[8]のいずれか1項に記載の方法。
[11]
前記塩は、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルギ酸塩である、[1]〜[8]のいずれか1項に記載の方法。
[12]
前記塩は、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリル二塩酸塩である、[1]〜[8]のいずれか1項に記載の方法。
[13]
前記塩は、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルメタンスルホン酸塩である、[1]〜[8]のいずれか1項に記載の方法。
[14]
前記塩は、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩である、[1]〜[8]のいずれか1項に記載の方法。
[15]
前記塩は、2θ±0.02°=12.64°、21.25°、及び26.15°にピークを有するX線粉末回折パターンを特徴とする結晶形態の、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩である、[1]〜[8]のいずれか1項に記載の方法。
[16]
前記化合物、その塩、またはその溶媒和物を、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤のうちの1つ以上と共に投与する、[1]〜[15]のいずれか1項に記載の方法。
[17]
前記方法は、電離放射線を投与することをさらに含む、[1]〜[16]のいずれか1項に記載の方法。
[18]
前記方法は、1つ以上の化学療法剤を投与することをさらに含む、[1]〜[17]のいずれか1項に記載の方法。
[19]
前記方法は、5−フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、メトトレキサート、ペメトレキセド、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン、ビンクリスチン、イホスファミド、イリノテカン、シクロホスファミド、及びタキソールからなる群から選択される1つ以上の化学療法剤を投与することをさらに含む、[1]〜[17]のいずれか1項に記載の方法。
[20]
神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群から選択される癌の治療のための、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩、または前記その薬学的に許容される塩の溶媒和物の使用。
[21]
前記癌は、神経芽細胞腫である、[20]に記載の使用。
[22]
前記癌は、横紋筋肉腫である、[20]に記載の使用。
[23]
前記横紋筋肉腫は、胞巣状横紋筋肉腫または胎児性横紋筋肉腫である、[22]に記載の使用。
[24]
前記癌は、骨肉腫である、[20]に記載の使用。
[25]
前記癌は、ユーイング肉腫である、[20]に記載の使用。
[26]
前記癌は、線維形成性小円形細胞腫瘍である、[20]に記載の使用。
[27]
前記癌は、平滑筋肉腫である、[20]に記載の使用。
[28]
前記化合物は、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩である、[20]〜[27]のいずれか1項に記載の使用。
[29]
前記化合物は、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルである、[20]〜[27]のいずれか1項に記載の使用。
[30]
前記塩は、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルギ酸塩である、[20]〜[27]のいずれか1項に記載の使用。
[31]
前記塩は、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリル二塩酸塩である、[20]〜[27]のいずれか1項に記載の使用。
[32]
前記塩は、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルメタンスルホン酸塩である、[20]〜[27]のいずれか1項に記載の使用。
[33]
前記塩は、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩である、[20]〜[27]のいずれか1項に記載の使用。
[34]
前記塩は、2θ±0.02°=12.64°、21.25°、及び26.15°にピークを有するX線粉末回折パターンを特徴とする結晶形態の、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルである、[20]〜[27]のいずれか1項に記載の使用。
[35]
電離放射線と組み合わせた、[20]〜[34]のいずれか1項に記載の使用。
[36]
1つ以上の化学療法剤と組み合わせた、[20]〜[35]のいずれか1項に記載の使用。
[37]
5−フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、メトトレキサート、ペメトレキセド、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン、ビンクリスチン、イホスファミド、イリノテカン、シクロホスファミド、及びタキソールからなる群から選択される1つ以上の化学療法剤と組み合わせた、[20]〜[35]のいずれか1項に記載の使用。
[38]
神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群から選択される、癌の治療における使用のための、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルである化合物、またはその薬学的に許容される塩、または前記その薬学的に許容される塩の溶媒和物。
[39]
前記化合物は、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルである、[38]に記載の使用のための化合物、またはその薬学的に許容される塩、またはその薬学的溶媒和物。
[40]
前記化合物は、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルである、[38]に記載の使用のための化合物。
[41]
前記化合物は、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルギ酸塩である、[38]に記載の使用のための化合物。
[42]
前記化合物は、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリル二塩酸塩である、[38]に記載の使用のための化合物。
[43]
前記化合物は、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルメタンスルホン酸塩である、[38]に記載の使用のための化合物。
[44]
前記化合物は、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩である、[38]に記載の使用のための化合物。
[45]
前記化合物は、2θ±0.02°=12.64°、21.25°、及び26.15°にピークを有するX線粉末回折パターンを有する結晶形態の、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩である、[38]に記載の使用のための化合物。
[46]
前記癌は、神経芽細胞腫である、[38]〜[45]のいずれか1項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
[47]
前記癌は、横紋筋肉腫である、[38]〜[45]のいずれか1項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
[48]
前記癌は、胞巣状横紋筋肉腫または胎児性横紋筋肉腫から選択される、[38]〜[45]のいずれか1項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
[49]
前記癌は、骨肉腫である、[38]〜[45]のいずれか1項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
[50]
前記癌は、ユーイング肉腫である、[38]〜[45]のいずれか1項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
[51]
前記癌は、線維形成性小円形細胞腫瘍である、[38]〜[45]のいずれか1項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
[52]
前記癌は、平滑筋肉腫である、[38]〜[45]のいずれか1項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
[53]
前記使用は、電離放射線と同時に、別々に、または順次組み合わせられる、[38]〜[52]のいずれか1項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
[54]
前記使用は、1つ以上の化学療法剤と同時に、別々に、または順次組み合わせられる、[38]〜[53]のいずれか1項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
[55]
前記使用は、5−フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、メトトレキサート、ペメトレキセド、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン、ビンクリスチン、イホスファミド、イリノテカン、シクロホスファミド、及びタキソールからなる群から選択される、1つ以上の化学療法剤と同時に、別々に、または順次組み合わせられる、[38]〜[53]のいずれか1項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
Claims (21)
- 神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群から選択される癌の治療のための、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩、または前記その薬学的に許容される塩の溶媒和物を含む薬学的組成物。
- 前記癌は、神経芽細胞腫である、請求項1に記載の薬学的組成物。
- 前記癌は、横紋筋肉腫である、請求項1に記載の薬学的組成物。
- 前記横紋筋肉腫は、胞巣状横紋筋肉腫または胎児性横紋筋肉腫である、請求項3に記載の薬学的組成物。
- 前記癌は、骨肉腫である、請求項1に記載の薬学的組成物。
- 前記癌は、ユーイング肉腫である、請求項1に記載の薬学的組成物。
- 前記癌は、線維形成性小円形細胞腫瘍である、請求項1に記載の薬学的組成物。
- 前記癌は、平滑筋肉腫である、請求項1に記載の薬学的組成物。
- 前記化合物は、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
- 前記化合物は、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
- 前記塩は、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルギ酸塩である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
- 前記塩は、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリル二塩酸塩である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
- 前記塩は、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルメタンスルホン酸塩である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
- 前記塩は、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
- 前記塩は、2θ±0.02°=12.64°、21.25°、及び26.15°にピークを有するX線粉末回折パターンを特徴とする結晶形態の、5−(5−(2−(3−アミノプロポキシ)−6−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イルアミノ)ピラジン−2−カルボニトリルである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
- 電離放射線と組み合わせた、請求項1〜15のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
- 1つ以上の化学療法剤と組み合わせた、請求項1〜16のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
- 5−フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、メトトレキサート、ペメトレキセド、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン、ビンクリスチン、イホスファミド、イリノテカン、シクロホスファミド、及びタキソールからなる群から選択される1つ以上の化学療法剤と組み合わせた、請求項1〜17のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
- 前記癌の治療において、電離放射線と同時に、別々に、または順次組み合わせられる、請求項1〜18のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
- 前記癌の治療において、1つ以上の化学療法剤と同時に、別々に、または順次組み合わせられる、請求項1〜19のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
- 前記癌の治療において、5−フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、メトトレキサート、ペメトレキセド、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン、ビンクリスチン、イホスファミド、イリノテカン、シクロホスファミド、及びタキソールからなる群から選択される、1つ以上の化学療法剤と同時に、別々に、または順次組み合わせられる、請求項1〜19のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
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