CN107849025A

CN107849025A - 用于治疗成神经细胞瘤和/或软组织肉瘤的chk1/2抑制剂

Info

Publication number: CN107849025A
Application number: CN201680043229.0A
Authority: CN
Inventors: L.F.斯坦卡托
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2015-07-23
Filing date: 2016-07-15
Publication date: 2018-03-27
Also published as: JP2019218361A; JP6752878B2; US11123326B2; US20220378745A1; EP3325468B1; WO2017015124A1; TW201714615A; US20180369202A1; EP3325468A1; JP2018528172A; TWI725041B

Abstract

本发明提供能够抑制CHK1并可用于治疗成神经细胞瘤和/或软组织肉瘤的5‑(5‑(2‑(3‑氨基丙氧基)‑6‑甲氧基苯基)‑1H‑吡唑‑3‑基氨基)吡嗪‑2‑甲腈及其可药用盐和溶剂化物。

Description

用于治疗成神经细胞瘤和/或软组织肉瘤的CHK1/2抑制剂

据估计20%至25%被诊断出软组织肉瘤的个体具有不良的总存活率和12个月的短中位生存期。关于成神经细胞瘤，高风险成神经细胞瘤患者的观察结果（outcome）仍然低，长期存活率小于50%。因此，需要治疗成神经细胞瘤和/或软组织肉瘤的新方法。

CHK1是对促进DNA损伤应答和在DNA合成过程中的复制叉许可（replication forklicensing）重要的多功能蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶。CHK1小分子抑制剂正被临床研究用于实体瘤和血红素恶性肿瘤。由于CHK1和CHK2在DNA损伤修复中的作用，CHK1/2抑制剂已在用于癌症治疗方面受到关注。US8314108例如公开了CHK1/2抑制剂5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈、5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲酸盐、5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈二盐酸盐、5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸盐和5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物。

但是，仍然需要可有效充当DNA损伤剂的增效剂的作为细胞周期检查点的强效抑制剂的CHK1抑制剂，其可有益于治疗成神经细胞瘤和/或软组织肉瘤。本发明涉及氨基吡唑化合物或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物，其是可有益于治疗成神经细胞瘤和/或软组织肉瘤的CHK1的强效抑制剂。该化合物或其可药用盐或盐的溶剂化物在组织培养中和在体内有力地消除由于用DNA损伤剂治疗引起的CHK1介导的细胞周期停滞，这可有益于治疗成神经细胞瘤和/或软组织肉瘤。此外，本发明的化合物或其可药用盐或盐的溶剂化物还提供CHK2的抑制，这可有益于治疗成神经细胞瘤和/或软组织肉瘤。另外，某些其它蛋白激酶，如CDK1的抑制的缺乏可通过将使用该化合物或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物治疗成神经细胞瘤和/或软组织肉瘤时的不良效应减至最低而提供治疗益处。

本发明还提供一种氨基吡唑化合物或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物，其是CHK1的拮抗剂并可解决更安全和有效治疗成神经细胞瘤和/或小儿和成人软组织肉瘤的需求。

本发明设想了涉及5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物的用于治疗成神经细胞瘤和/或软组织肉瘤的用途或方法。其它非限制性实施方案包括用于治疗成神经细胞瘤和/或软组织肉瘤或作为治疗成神经细胞瘤和/或软组织肉瘤的方法的5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲酸盐、5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈二盐酸盐、5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸盐和5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物。

作为一个特定实施方案，本发明提供用于治疗成神经细胞瘤和/或软组织肉瘤或作为治疗成神经细胞瘤和/或软组织肉瘤的方法的化合物5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈。

本发明提供用于治疗成神经细胞瘤和/或软组织肉瘤或作为治疗成神经细胞瘤和/或软组织肉瘤的方法的5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈的甲酸盐、二盐酸盐和甲磺酸盐。

本发明还提供用于治疗成神经细胞瘤和/或软组织肉瘤或作为治疗成神经细胞瘤和/或软组织肉瘤的方法的化合物5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物。

本发明提供用于治疗成神经细胞瘤和/或软组织肉瘤或作为治疗成神经细胞瘤和/或软组织肉瘤的方法的结晶形式的5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物，其特征在于具有在2θ ± 0.02° = 12.64°、21.25°和26.15°的峰的X-射线粉末衍射图。

本发明设想了涉及5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物的用于治疗成神经细胞瘤和/或非脂肪肉瘤的软组织肉瘤的用途或方法。其它非限制性实施方案包括用于治疗成神经细胞瘤和/或非脂肪肉瘤的软组织肉瘤或作为治疗成神经细胞瘤和/或非脂肪肉瘤的软组织肉瘤的方法的5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲酸盐、5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈二盐酸盐、5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸盐和5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物。

作为一个特定实施方案，本发明提供用于治疗成神经细胞瘤和/或非脂肪肉瘤的软组织肉瘤或作为治疗成神经细胞瘤和/或非脂肪肉瘤的软组织肉瘤的方法的化合物5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈。

本发明提供用于治疗成神经细胞瘤和/或非脂肪肉瘤的软组织肉瘤或作为治疗成神经细胞瘤和/或非脂肪肉瘤的软组织肉瘤的方法的5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈的甲酸盐、二盐酸盐和甲磺酸盐。

本发明还提供用于治疗成神经细胞瘤和/或非脂肪肉瘤的软组织肉瘤或作为治疗成神经细胞瘤和/或非脂肪肉瘤的软组织肉瘤的方法的化合物5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物。

本发明提供用于治疗癌症，包括成神经细胞瘤和/或非脂肪肉瘤的软组织肉瘤，或作为治疗癌症，包括成神经细胞瘤和/或非脂肪肉瘤的软组织肉瘤的方法的结晶形式的5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物，其特征在于具有在2θ ± 0.02° = 12.64°、21.25°和26.15°的峰的X-射线粉末衍射图。

本发明提供用于治疗成神经细胞瘤和/或软组织肉瘤或作为治疗成神经细胞瘤和/或软组织肉瘤的方法的包含5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物和一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。本发明提供用于治疗成神经细胞瘤和/或非脂肪肉瘤的软组织肉瘤或作为治疗成神经细胞瘤和/或非脂肪肉瘤的软组织肉瘤的方法的包含5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物和一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。本发明提供用于治疗癌症或作为治疗癌症的方法的包含5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物和一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物；其中所述癌症选自成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤和平滑肌肉瘤。

本发明提供一种治疗癌症的方法，其包括给予需要其的患者有效量的5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物；其中所述癌症选自成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤和平滑肌肉瘤。此外，本发明还提供一种治疗癌症的方法，其包括给予需要其的患者有效量的5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物和电离辐射；其中所述癌症选自成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤和平滑肌肉瘤。本发明提供一种治疗癌症的方法，其包括给予需要其的患者有效量的5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物和至少一种化疗剂；其中所述癌症选自成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤和平滑肌肉瘤。本发明提供一种治疗癌症的方法，其包括给予需要其的患者有效量的5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物、至少一种化疗剂和电离辐射；其中所述癌症选自成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤和平滑肌肉瘤。

本发明提供5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物用于制备用于治疗癌症的药物的用途；其中所述癌症选自成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤和平滑肌肉瘤。此外，本发明还提供5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物用于制备用于治疗癌症的药物的用途，其中所述治疗包括与电离辐射的组合疗法；其中所述癌症选自成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤和平滑肌肉瘤。本发明提供5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物用于制备通过组合疗法治疗癌症的药物的用途，其中所述组合疗法治疗包括向同一患者给予所述药物和给予一种或多种其它化疗剂；其中所述癌症选自成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤和平滑肌肉瘤。本发明提供5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物用于制备通过组合疗法治疗癌症的药物的用途，其中所述组合疗法治疗包括向同一患者给予所述药物和给予一种或多种其它化疗剂和电离辐射；其中所述癌症选自成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤和平滑肌肉瘤。

本发明提供用于疗法的5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物。本发明还提供用于癌症治疗的5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物。

此外，本发明还提供用于与电离辐射同时、分开或相继组合以治疗癌症的5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或盐的溶剂化物。此外，本发明还提供用于与一种或多种化疗剂同时、分开或相继组合以治疗癌症的5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或盐的溶剂化物。

本发明提供用于治疗癌症的5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物；其中所述癌症选自成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤和平滑肌肉瘤。此外，本发明还提供用于与电离辐射同时、分开或相继组合以治疗癌症的5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物；其中所述癌症选自成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤和平滑肌肉瘤。本发明提供用于与一种或多种化疗剂同时、分开或相继组合以治疗癌症的5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物；其中所述癌症选自成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤和平滑肌肉瘤。本发明提供用于与一种或多种化疗剂和电离辐射同时、分开或相继组合以治疗癌症的5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物；其中所述癌症选自成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤和平滑肌肉瘤。

本发明提供5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物用于制备用于治疗癌症的药物的用途，其中所述药物要与电离辐射同时、分开或相继给予；其中所述癌症选自成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤和平滑肌肉瘤。

本发明提供5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物用于制备用于治疗癌症的药物的用途，其中所述药物还包含至少一种化疗剂或要与至少一种化疗剂同时、分开或相继给予；其中所述癌症选自成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤和平滑肌肉瘤。

本发明提供用于与电离辐射同时、分开或相继组合以治疗癌症的5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物；其中所述癌症选自成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤和平滑肌肉瘤。

本发明提供用于与至少一种化疗剂同时、分开或相继组合以治疗癌症的5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物；其中所述癌症选自成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤和平滑肌肉瘤。

本发明提供用于与至少一种化疗剂和电离辐射同时、分开或相继组合以治疗癌症的5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物；其中所述癌症选自成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤和平滑肌肉瘤。

本发明提供包含5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物以及可药用载体和任选其它治疗成分的药物组合物；其中所述癌症选自成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤和平滑肌肉瘤。

5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物是CHK1/CHK2小分子抑制剂，其作为单一药剂，引起在S期过程中的双链DNA断裂，以造成复制灾难和最终有丝分裂灾难。此外，5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物介导的CHK1抑制消除用基因毒素（genotoxics）如阿霉素和吉西他滨治疗后的DNA损伤应答，以增强DNA损伤和对这些药剂的凋亡响应。

5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物的效力在成神经细胞瘤和人类小儿和成人肉瘤的小鼠模型中可体内测量。5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物（10 mg/kg）可使用用药3天中断4天的b.i.d.给药方案皮下给予携带人类横纹肌肉瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤（DSRCT）、骨肉瘤和尤因氏肉瘤的细胞源性异种移植物（CDX）或患者源性异种移植物（PDX）的裸小鼠。可以每周两次测量肿瘤体积和体重。可以通过免疫组织化学评估肿瘤特异性参数。

5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物在7/13小儿肿瘤模型中引起强单剂活性，从病情稳定到完全消退。需要注意的是，在四个给药周期后在DSRCT的PDX模型中观察到完全消退。在治疗停止后，在治疗后50天观察肿瘤生长，包括在DSRCT的PDX模型中用5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物再次给药时的肿瘤消退。在SJCRH-30 aRMS模型中，在治疗过程中观察到的完全消退在撤药后立即逆转，并且随后的再生长对用10 mg/kg的5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物进一步治疗耐药。但是，在这一相同模型中，5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物 + 阿霉素带来持久的完全消退，在治疗停止后超过2个月没有可检测到的肿瘤生长。

5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物在非脂肪肉瘤的平滑肌肉瘤的PDX模型中也有活性。独自和与化疗组合的5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物可显著阻止肉瘤的人类PDX和CDX模型的生长。

本发明涉及抑制CHK1并可用于治疗以脱氧核糖核酸（DNA）复制、染色体分离或细胞分裂中的缺陷为特征的癌症的氨基吡唑化合物或其可药用盐或可药用盐的溶剂化物。

化疗剂的非限制性实例包括5-氟尿嘧啶、羟基脲、吉西他滨、氨甲蝶呤、培美曲塞、阿霉素、放线菌素D、依托泊苷、长春新碱、异环磷酰胺、伊立替康、环磷酰胺、顺铂、紫杉醇及其组合。本文所述的方法和用途的实施方案包括选自膀胱癌、结肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、间皮瘤、肾癌和子宫癌的其它癌症。此外，本发明提供如本文所述的方法和用途的实施方案，其中横纹肌肉瘤是肺泡横纹肌肉瘤和/或胚胎性横纹肌肉瘤。

本发明的化合物或其可药用盐或盐的溶剂化物可以互变异构形式存在。当存在互变异构形式时，在本发明中考虑各形式及其混合物。

除非另行指明，本发明包括实施例3的化合物的可药用盐以及实施例3的化合物的游离碱的溶剂化物或其可药用盐。本文所用的术语“可药用盐”是指实施例3的化合物的盐。可药用盐及其制备方法的实例是本领域中常规的。参见例如Stahl等人，“Handbook ofPharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use”, VCHA/Wiley-VCH, (2002)；Gould, P.L., “Salt selection for basic drugs”, International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986)；和Bastin等人“Salt Selection andOptimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities”, Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000)。

除可药用盐外，在本发明中包括其它盐。它们可充当化合物提纯或其它可药用盐制备中的中间体或可用于鉴定、表征或提纯。

本文所用的术语“患者”是指人类或非人哺乳动物。更特别地，术语“患者”是指人类。

术语“治疗”是指涉及减慢、中断、阻止、控制、减轻或逆转症状、障碍、病况或疾病的进展或严重程度的过程。

本文所用的术语“有效量”是指在单剂量或多剂量给药于患者时在诊断或治疗的患者中提供所需效果的本文所述的本发明的化合物或其可药用盐或盐的溶剂化物（独自或与电离辐射或化疗剂组合）的量或剂量。主治诊断医师作为本领域技术人员可通过考虑许多因素（如哺乳动物物种；其体型、年龄和一般健康状况；如果需要，其它药剂的共同给药；所涉具体疾病；疾病的程度或严重程度；个体患者的响应；给予的特定化合物；给药模式；给予的制剂的生物利用度特征；所选给药方案；任何伴随药物治疗的使用；和其它相关情况）容易地确定有效量。不应被解释为以任何方式限制本发明，但20-150 mg/m²代表本文所述的化合物或其可药用盐或盐的溶剂化物的有效量。

本文所用的术语“组合疗法”是指本发明的化合物或其可药用盐或盐的溶剂化物和至少一种化疗剂的分开、同时或相继给予。此外，术语“组合疗法”是指本发明的化合物或其可药用盐或盐的溶剂化物和电离辐射的分开、同时或相继给予。术语“组合疗法”还是指本发明的化合物或其可药用盐或盐的溶剂化物、电离辐射和至少一种化疗剂的分开、同时或相继给予。

本领域普通技术人员会认识到，5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物也可被称作2-吡嗪甲腈，5-[[5-[2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基]-1H-吡唑-3-基]氨基]单甲磺酸盐一水合物。

化合物5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或盐的溶剂化物可配制成作为药物组合物的一部分给药。因此，包含化合物5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或盐的溶剂化物以及一种或多种可药用载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物是本发明的重要实施方案。药物组合物及其制备方法的实例是本领域中公知的。参见例如REMINGTON:THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, A. Gennaro等人, eds., 22^nd ed.,Pharmaceutical Press (2012)。

本发明的化合物或其可药用盐或盐的溶剂化物可通过使其可生物利用的任何途径给药。例如，该化合物或其可药用盐或盐的溶剂化物可以口服、皮下、肌肉内、静脉、透皮、局部、鼻内、直肠、含服等给药。或者，该化合物或其可药用盐或盐的溶剂化物可通过输注给药。静脉输注是优选给药途径。

本文所用的下列术语具有所示含义：“ATCC”是指美国典型菌种保藏中心（American Type Culture collection）；“ATM”是指毛细血管扩张性共济失调突变（Ataxiatelangiectasia mutated）；“ATP”是指三磷酸腺苷；“ATR”是指共济失调-和Rad相关激酶；“BCA”是指二喹啉甲酸；“b.i.d.”是指每日两次给药；“Boc或t-Boc”是指叔丁氧基羰基；“BSA”是指牛血清白蛋白；“CTG”是指Cell Titer Glow试剂；“DPBS”是指杜氏磷酸盐缓冲盐水；“DIAD”是指偶氮二甲酸二异丙酯；“DMF”是指二甲基甲酰胺；“DMSO”是指二甲亚砜；“DTT”是指二硫苏糖醇；“DSRCT”是指促纤维增生性小圆细胞肿瘤；“EDTA”是指乙二胺四乙酸；“ERK”是指细胞外信号调节激酶；“EtOH”是指乙醇；“EWS”是指尤因氏肉瘤；“FBS”是指胎牛血清；“G2M”是指细胞周期的G2和M期；“HBSS”是指Hank's平衡盐溶液；“HEPES”是指N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸；“hnRNP”是指核不均一核糖核蛋白；“HRP”是指辣根过氧化物酶；“LMS”是指平滑肌肉瘤；“MEM”是指最小必需培养基；“MeOH”是指甲醇(methanol)或甲醇(methyl alcohol)；“NBM”是指成神经细胞瘤；“OS”是指骨肉瘤；“PBS”是指磷酸盐缓冲盐水；“PBST”是指磷酸盐缓冲盐水Tween-20，“Ph”是指苯基；“pHH3”是指磷酸化组蛋白H3；“PI”是指碘化丙啶；“PKC”是指蛋白激酶C；“RMS”是指横纹肌肉瘤；“RNAase”是指核糖核酸酶A；“RPMI”是指Roswell Park Memorial Institute；“SDS”是指十二烷基硫酸钠；“ST”是指软组织；“TBST”是指tris-缓冲盐水Tween-20；“THF”是指四氢呋喃；“TR-FRET”是指时间分辨荧光能量转移；“Tris”是指三(羟甲基)氨基甲烷；“Triton™-X”是指4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇聚乙二醇叔辛基苯基醚；且“Tween-20”是指聚山梨醇酯20。

提供下列制备和实施例以更详细例示本发明并代表所述化合物或其可药用盐或盐的溶剂化物的典型合成。

途径A

制备1

5-异硫氰酸根合吡嗪-2-甲腈

在室温下将硫光气（1.86克，15毫摩尔）在THF（4毫升）中的溶液逐滴添加到5-氨基吡嗪-2-甲腈（1.20克，10毫摩尔）和吡啶（2毫升）在CH₂Cl₂（200毫升）和THF（25毫升）中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌3小时。浓缩混合物，粗产物用乙酸乙酯稀释，过滤并浓缩以产生标题化合物。

制备2

3-(2-乙酰基-3-甲氧基苯氧基)丙基氨基甲酸叔丁酯

在室温下将DIAD（2.82克，14.0毫摩尔）添加到3-羟基丙基氨基甲酸叔丁酯（2.45克，14.0毫摩尔）、1-(2-羟基-6-甲氧基苯基)乙酮（1.94克，11.7毫摩尔）和三苯基膦（3.66克，14.0毫摩尔）在THF（50毫升）中的搅拌溶液中。在搅拌18小时后，在减压下除去溶剂，并将粗产物色谱分离（己烷-乙酸乙酯: 0-60%梯度）以提供标题化合物（1.60克，42%）。

实施例1

5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲酸盐

在室温下将六甲基二硅氮烷锂在THF中的1M溶液（7.6毫升，7.6毫摩尔）缓慢添加到3-(2-乙酰基-3-甲氧基苯氧基)丙基氨基甲酸叔丁酯（1.08克，3.17毫摩尔）在干燥THF（25毫升）中的搅拌溶液中。在搅拌10分钟后，加入在THF（4毫升）中的5-异硫氰酸根合吡嗪-2-甲腈（0.510克，3.17毫摩尔）并继续搅拌30分钟。将反应混合物浓缩并再溶解在EtOH（50毫升）和乙酸（5毫升）中，接着加入水合肼（2毫升）。然后将所得反应混合物加热至120℃ 2分钟。然后将反应混合物冷却至室温，用水（100毫升）稀释并用乙酸乙酯（2 × 100毫升）萃取。有机部分经无水Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将粗产物再溶解在CH₂Cl₂（50毫升）中，用三氟乙酸（10毫升）处理并在室温下搅拌15分钟。除去溶剂，粗产物（1.20克）使用制备HPLC提纯以提供标题化合物（0.046克，3.5%）。LC-ES/MS m/z 366.1 [M+H]⁺。

途径B

制备3

1-[2-甲氧基-6-(4-甲氧基苄氧基)苯基]乙酮

在烧瓶中装载在THF中的1-(2-羟基-6-甲氧基苯基)乙酮（30克，180.5毫摩尔）、碳酸钾（49.9克，361毫摩尔）、碘化钠（2.68克，18.1毫摩尔）和4-甲氧基苄基氯（27.0毫升，198.6毫摩尔）并将混合物加热至回流过夜。将混合物冷却至室温，用水稀释并用乙酸乙酯萃取。合并的有机萃取物用盐水洗涤并经无水MgSO₄干燥，过滤并浓缩。粗产物通过用乙酸乙酯/己烷洗脱剂的硅胶色谱法提纯以产生白色固体状的标题产物（32.51克，57%）。

制备4

1-(2-甲氧基-6-(4-甲氧基苄氧基)苯基)-3,3-双(甲基硫基)丙-2-烯-1-酮

在500毫升圆底烧瓶中装载95% NaH（7.28克，288毫摩尔）并加入干燥DMSO（170毫升）。向所得不均匀混合物中逐滴加入在干燥DMSO（60毫升）中的1-[2-甲氧基-6-(4-甲氧基苄氧基)苯基]乙酮（41.2克，144毫摩尔）。将混合物在室温下搅拌10分钟，此时逐滴加入二硫化碳（8.69毫升，144毫摩尔），接着立即加入碘甲烷（18.0毫升，288毫摩尔）。在这两种试剂的添加过程中析出热和气体，以提示小心添加。将该均匀溶液在室温下搅拌18小时，然后缓慢倒入三倍体积的水中。滤出固体产物并在高真空下干燥以产生橙色固体形式的标题化合物。

制备5

5-溴-N-(5-(2-甲氧基-6-(4-甲氧基苄氧基)苯基)-1H-吡唑-3-基)吡嗪-2-胺

将5-溴吡嗪-2-胺（3.73克，21.4毫摩尔）溶解在THF（30毫升）中并将该混合物冷却至-78℃。缓慢加入正丁基锂在己烷中的溶液（10.32毫升，23.5毫摩尔）。将反应混合物在低温下搅拌15分钟，然后缓慢升温至室温并搅拌另外1小时。将该混合物再冷却至0℃并经套管加入1-(2-甲氧基-6-(4-甲氧基苄氧基)苯基)-3,3-双(甲基硫基)丙-2-烯-1-酮（8.39克，21.4毫摩尔）在THF（50毫升）中的溶液。该溶液变均匀并在室温下搅拌15分钟，之后加热至回流10小时。然后将该溶液冷却至室温并在减压下除去溶剂。将该固体残留物溶解在EtOH（150毫升）中并加入冰醋酸（1.3毫升，23.5毫摩尔）。加入水合肼（5.25毫升，107毫摩尔）并将该溶液回流另外8小时。将该混合物冷却至室温并在真空下浓缩。该产物通过硅胶色谱法（CH₂Cl₂ / MeOH）提纯以产生棕色固体形式的标题化合物（5.76克，74%）。

制备6

2-(3-(5-溴吡嗪-2-基氨基)-1H-吡唑-5-基)-3-甲氧基酚

将5-溴-N-(5-(2-甲氧基-6-(4-甲氧基苄氧基)苯基)-1H-吡唑-3-基)吡嗪-2-胺（3.1克，6.43毫摩尔）溶解在MeOH（100毫升）中。将HCl气体鼓泡通过反应混合物20分钟。将该混合物搅拌2小时并在减压下除去溶剂。将残留物再溶解在3:1氯仿 / 异丙醇（100毫升）中并与饱和NaHCO₃溶液（100毫升）合并。分离各层，水层用乙酸乙酯（3 × 50毫升）萃取。将合并的有机层浓缩并用MeOH研磨以产生棕色固体形式的标题化合物（1.5克，64%）。

制备7

3-(2-(3-(5-溴吡嗪-2-基氨基)-1H-吡唑-5-基)-3-甲氧基苯氧基)丙基氨基甲酸叔丁酯

在室温下将DIAD（1.73毫升，8.76毫摩尔）添加到3-羟丙基氨基甲酸叔丁酯（0.83毫升，4.83毫摩尔）、2-(3-(5-溴吡嗪-2-基氨基)-1H-吡唑-5-基)-3-甲氧基酚)（1.59克，4.38毫摩尔）和聚苯乙烯三苯膦（5.91克，8.76毫摩尔）在THF（50毫升）中的搅拌溶液中。在搅拌45分钟后，过滤该反应，并在减压下除去溶剂。将所得残留物色谱分离（MeOH/CH₂Cl₂）以提供黄色固体形式的标题化合物（1.27克，54%）。

制备8

3-(2-(3-(5-氰基吡嗪-2-基氨基)-1H-吡唑-5-基)-3-甲氧基苯氧基)丙基氨基甲酸叔丁酯

将3-(2-(3-(5-溴吡嗪-2-基氨基)-1H-吡唑-5-基)-3-甲氧基苯氧基)丙基氨基甲酸叔丁酯（0.378克，0.730毫摩尔）和氰化锌（0.10克，0.870毫摩尔）在DMF（10毫升）中的溶液用氮气流脱气1小时，然后加热至80℃。向该反应中加入Pd(Ph₃P)₄（0.080克，0.070毫摩尔）并将该混合物加热过夜。将该反应冷却至室温并在减压下浓缩。该残留物通过硅胶色谱法（CH₂Cl₂/MeOH）提纯以产生标题化合物（0.251克，73%）。

途径C

制备9

(E)-5-(3-(2-甲氧基-6-(4-甲氧基苄氧基)苯基)-1-(甲基硫基)-3-氧代丙-1-烯基氨基)吡嗪-2-甲腈

向配备空气搅拌棒和桨、温度计、水冷凝器和氮气鼓泡器的5升法兰颈烧瓶装载氢化钠（22.4克，560.1毫摩尔）和无水THF（3升）。在虑及任何发泡的同时，经1.5小时向充分搅拌的混合物中逐份加入2-氨基-5-氰基吡嗪（67.0克，557.8毫摩尔）。内部温度全程保持在22℃。将该混合物搅拌35分钟。然后在22℃下经1小时加入1-(2-甲氧基-6-(4-甲氧基-苄氧基)-苯基)-3,3-双-甲基硫基-丙烯酮（146.0克，373.9毫摩尔）。该黄色悬浮液在室温下搅拌45分钟，然后加热直至反应温和回流。在65℃下19小时后，将反应混合物冷却至15℃。然后将混合物分成两半，将每批淬灭到水（2升）中并用乙酸乙酯（2 × 1升）萃取。合并有机萃取物并用盐水洗涤，经无水Na₂SO₄干燥，过滤并在减压下在40℃下浓缩以产生黄色/橙色固体形式的标题化合物（196克，100%粗制），其不经进一步提纯即用于下一步骤。LC-ES/MS m/z463.2 [M+H]⁺。

制备10

5-(5-(2-甲氧基-6-(4-甲氧基苄氧基)苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈

向配备空气搅拌棒和桨、温度计、水冷凝器和氮气鼓泡器的10升法兰颈烧瓶装载(E)-5-(3-(2-甲氧基-6-(4-甲氧基苄氧基)苯基)-1-(甲基硫基)-3-氧代丙-1-烯基氨基)吡嗪-2-甲腈（196克，423.8毫摩尔）和纯EtOH（3升）。在氮气下向搅拌悬浮液中加入水合肼（41.0毫升，838.7毫摩尔）和冰醋酸（66.0毫升，1.15摩尔）。注意到小放热。将黄色悬浮液升温至65℃。然后停止加热并使反应混合物冷却至室温。使混合物在氮气气氛下静置过夜。通过过滤收集固体，用新鲜EtoH洗涤，并在真空中在45℃下干燥以产生亮黄色固体的标题化合物（140克，两个步骤87%收率）。该产物不经进一步提纯即用于下一步骤。LC-ES/MS m/z 429.2[M+H]⁺。

制备11

5-(5-(2-羟基-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈

向配备空气搅拌棒和桨、温度计、水冷凝器和通往苛性碱溶液气体洗涤器的出口的10升法兰颈烧瓶装载5-(5-(2-甲氧基-6-(4-甲氧基苄氧基)苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈（140克，326.76毫摩尔）和在1,4-二氧杂环己烷中的4 N HCl（2500毫升，10.0摩尔）溶液。将该混合物在60-65℃下充分搅拌1.5小时并使其冷却至50℃。在总共4小时后，加入更多在1,4-二氧杂环己烷中的4 N HCl（1000毫升）并继续加热至65℃。在此温度下1小时后，停止加热并使混合物在搅拌下冷却至室温过夜。混合物经大烧结漏斗过滤。收集的固体用新鲜1,4-二氧杂环己烷洗涤，然后短暂地抽干（pulled dry）。将散装滤饼送回10升烧瓶并用水（2升）和乙酸乙酯（3.5升）剧烈搅拌。然后通过添加浓氨水（440毫升）使该混合物呈碱性。将溶液过滤，然后转移到5升分液漏斗中。分离水层并再用乙酸乙酯（0.5升）萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。固体在真空中在45℃下干燥以产生101.3克。将粗产物悬浮在温的无水THF（2.2升）中并加载到用异己烷填充的二氧化硅垫（1千克）上。产物用乙酸乙酯洗脱。将合并的级分部分浓缩，通过过滤收集所得沉淀物并在真空中在40℃下干燥整夜以产生标题化合物（60.9 gm 60%）。LC-ES/MS m/z 309.2 [M+1]⁺。

制备12

向配备空气搅拌棒和桨、温度计、压力均衡滴液漏斗和氮气鼓泡器的5升法兰颈圆底烧瓶装载5-(5-(2-羟基-6-甲氧基-苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)-吡嗪-2-甲腈（47.0克，152毫摩尔）和无水THF（1.2升）。搅拌悬浮液在氮气下冷却至0℃。向配备大型磁搅拌棒、温度计和氮气鼓泡器的单独2升三颈圆底烧瓶装载三苯基膦（44.0克；168毫摩尔）和无水THF（600毫升）。搅拌溶液在氮气下冷却至0℃，加入偶氮二甲酸二异丙酯（34.2克；169毫摩尔）并形成乳状溶液。在3-4分钟后，加入N-(3-羟丙基)-氨基甲酸叔丁酯（30.3克，173毫摩尔）在无水THF（100毫升）中的溶液并将该混合物搅拌3-4分钟。这一混合物随后在0℃下经5分钟添加到原材料的搅拌悬浮液中。反应混合物迅速变成深色溶液并使其缓慢升温至室温。在6.5小时后，如上使用PPh₃（8克）、DIAD（6.2克）和氨基甲酸酯（5.4克）在无水THF（150毫升）中制备更多试剂。将混合物添加到反应混合物中，冷却至-5℃并使其升温至室温过夜。在真空中除去溶剂。将所得粘性溶液加载到二氧化硅垫上，产物用乙酸乙酯洗脱。浓缩的级分单独用MeOH研磨并通过过滤收集所得固体。合并的固体再用MeOH（400毫升）研磨，然后通过过滤分离并在真空中在50℃下干燥过夜以产生标题化合物（31.3克，44%）。LC-ES/MS m/z 466.2[M+1]⁺。

实施例2

5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈二盐酸盐

向配备空气搅拌棒和桨、温度计和附带鼓泡器的空气冷凝器的5升法兰颈圆底烧瓶装载3-(2-(3-(5-氰基吡嗪-2-基氨基)-1H-吡唑-5-基)-3-甲氧基苯氧基)丙基氨基甲酸叔丁酯（30.9克，66.3毫摩尔）和乙酸乙酯（3升）。将机械搅拌的黄色悬浮液冷却至刚低于10℃。然后在冰浴仍在原位下经气体入口管剧烈鼓入来自气阀瓶的氯化氢15分钟。在5小时后，混合物在外观上明显变稠。通过过滤收集固体，用乙酸乙酯洗涤，然后在真空中在60℃下干燥过夜以产生标题化合物（30.0克，100%）。

实施例3

5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈

将5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈二盐酸盐（3.0克，6.84毫摩尔）悬浮在CH₂Cl₂（200毫升）中。加入1 N NaOH（200毫升，200毫摩尔）。该混合物在氮气下在室温下磁搅拌5小时。通过过滤收集固体并用水充分洗涤。滤饼在真空中在50℃下干燥过夜以产生（2.26克，90%）黄色固体形式的游离碱。

实施例4

5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸盐

将5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈（1.0克，2.74毫摩尔）悬浮在MeOH（100毫升）中。在搅拌下将甲磺酸在MeOH中的1M溶液（2.74毫升，2.74毫摩尔）逐滴添加到混合物中。固体几乎完全溶解并声处理和搅拌15分钟，过滤并浓缩至50毫升。将该溶液在-15℃下冷却过夜，并通过过滤收集形成的固体。固体在真空炉中干燥过夜以产生（0.938克，74%）黄色固体。

途径D

制备13

1-[2-甲氧基-6-(4-甲氧基苄氧基)苯基]乙酮

将1-(2-羟基-6-甲氧基苯基)乙酮（1300克，7.82摩尔）和DMF（10.4升）添加到22升烧瓶中并搅拌以获得溶液。分份加入碳酸钾（2700克，19.54摩尔）并将该混合物搅拌至少30分钟。使用加料漏斗，在保持温度<30℃的同时将4-甲氧基苄基氯（14700克，9.39摩尔）经2.5小时逐滴添加到混合物中。将反应混合物升温至35℃并将该反应在此温度下保持12小时。通过HPLC监测反应转化率并在35℃下13小时后认为完全。过滤浆料且所得固体用DMF（1升）洗涤。滤液用乙酸乙酯和水萃取后处理，接着浓缩提供蜡质黄色固体。向该蜡质黄色固体中加入甲基叔丁基醚（2.6升）。将所得浆料搅拌。将现在自由流动的浆料过滤并用甲基叔丁基醚（1升）洗涤。将白色固体真空干燥以产生标题化合物（1539克，69%）。mp 105-107℃。

制备14

在氮气气氛下向叔丁醇锂（602.4克，7.52摩尔）在无水DMSO（11.0升）中的混合物中加入1-(2-甲氧基-6-(4-甲氧基苄氧基)苯基)乙酮（1000.0克，3.49摩尔）。将所得混合物搅拌30分钟并在保持内部温度低于30℃的同时经1至1.5小时缓慢加入CS₂（259毫升，4.296摩尔）。在环境温度下搅拌至少1小时后，在保持内部温度低于30℃的同时缓慢加入碘甲烷（1000克，7.045摩尔）。将所得混合物在环境温度下搅拌30分钟至1小时。通过HPLC证实反应完全。将所得反应混合物冷却，接着用水和乙酸乙酯萃取后处理。将所得有机部分浓缩以提供浆料，将其过滤并用乙酸乙酯（1升），接着甲基叔丁基醚（2 × 1升）洗涤。分离的固体在真空炉中在40℃下干燥以提供标题化合物（1057克，77%）。mp 93-94℃；ES/MS m/z 391.2[M+1]⁺。

制备15

(E)-5-(3-(2-甲氧基-6-(4-甲氧基苄氧基)苯基)-1-(甲基硫基)-3-氧代丙-1-烯基氨基)吡嗪-2-甲腈

向干燥的惰性22升烧瓶中加入氢化钠（159.2克，3.98摩尔）和THF（10.4升）。将混合物冷却至5-15℃。经30分钟分四份加入5-异氰基吡嗪-2-胺（382.2克，3.18摩尔）以控制氢气释放，在添加之间使发泡平息并将温度保持在10℃。在使温度提高至15℃的同时将混合物搅拌15-90分钟。向反应混合物中分份加入1-(2-甲氧基-6-(4-甲氧基苄氧基)苯基)-3,3-双(甲基硫基)丙-2-烯-1-酮（1036克，2.65摩尔）以控制发泡。将所得浆料搅拌15分钟。将混合物加热至在66℃下温和回流。通过HPLC监测反应转化率。将反应混合物淬灭到冷水（14.2升）中，接着用乙酸乙酯萃取后处理。将有机部分浓缩以形成浆料，将其过滤以提供标题化合物（957克，78%）。mp 128-135 ℃；ES/MS m/z 463.2 [M+1]⁺。

制备16

合并EtOH（11.28升）和乙酸（318毫升，5.545摩尔）。将反应排气到用氮气吹扫的漂白洗涤器中。将(E)-5-(3-(2-甲氧基-6-(4-甲氧基苄氧基)苯基)-1-(甲基硫基)-3-氧代丙-1-烯基氨基)吡嗪-2-甲腈（940克，1.931摩尔）和EtOH/乙酸溶液添加到22升反应烧瓶中。向所得棕色浆料中加入一水合肼（197克，3.935摩尔），以产生轻微放热。将所得黄色浆料缓慢加热至65-70℃并通过HPLC监测。反应持续时间小于1小时。将该稠浆经1-2小时缓慢冷却至小于30℃。将该浆料过滤并用冷EtOH洗涤。该材料在40℃下真空干燥以产生标题化合物（820克，99.1%）。mp 215-117℃；ES/MS m/z 429.2 [M+1]⁺。

制备17

5-(5-(2-羟基-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈二盐酸盐

下列所有操作排气到苛性碱洗涤器系统中以控制HCl析气。将5-(5-(2-甲氧基-6-(4-甲氧基苄氧基)苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈（1.24千克，2.89摩尔）和在二氧杂环己烷中的4 N HCl（26.06千克，99.28摩尔）装载到60升玻璃反应器中。将浆料缓慢加热至60-70℃。通过HPLC监测反应。在9小时后，测定反应完全。将棕色浆料冷却至20℃并保持过夜。过滤酸性反应混合物，滤饼用乙酸乙酯（7升）洗涤。将湿滤饼真空干燥至恒重以提供标题化合物（1010克，91.84%校正收率）。mp 225-228℃（游离碱）；ES/MS m/z 309.2 [M+1]⁺。

制备18

将5-(5-(2-羟基-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈（618克，1.62摩尔）在THF（6.18升，10体积）中制浆并用丙酮/冰浴冷却到-5至0℃。在-5至5℃下经30-40分钟经由加料漏斗加入三乙胺（330克，3.25摩尔）。将所得浆料在-5至5℃下搅拌60-90分钟。滤出不可溶三乙胺盐酸盐并将该酚（(5-(2-羟基-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈）的溶液收集在适当的反应容器中。滤饼用THF（1.24升）冲洗。将该酚的THF溶液保存在15至20℃下直至需要。在室温下将三苯基膦（1074克，4.05摩尔）溶解在THF（4.33升）中。清澈无色溶液用丙酮/冰浴冷却到-5至5℃。经由加料漏斗经40-60分钟逐滴加入偶氮二甲酸二异丙酯（795克，3.89摩尔），使温度保持在10℃以下。将所得白色稠浆冷却回-5至0℃。将3-羟丙基氨基甲酸叔丁酯（717克，4.05摩尔）溶解在最低限度的THF（800毫升）中。将3-羟丙基氨基甲酸叔丁酯/THF溶液在-5至5℃下经由加料漏斗经20-30分钟添加到试剂浆料中。制备好的试剂在冰浴中在-5至0℃下搅拌直至准备使用。

在15至20℃下将制备好的试剂浆料（20%）添加到底物溶液中。将其余试剂送回冰浴。底物溶液在环境温度下搅拌30分钟并取样进行HPLC。将大约20%的第二部分试剂添加到底物中，在环境温度下搅拌并如上所述取样。继续添加试剂，通过HPLC监测反应完成。将完成的反应浓缩并用温MeOH（4.33升，50-60℃）研磨，接着在冰浴中冷却。将所得黄色沉淀物过滤，用冷MeOH（2升）冲洗，并干燥至恒重以提供标题化合物（544克，72%）。mp 214-216℃；ES/MS m/z 466.2 [M+1]⁺。

实施例5

5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物

将3-(2-(3-(5-氰基吡嗪-2-基氨基)-1H-吡唑-5-基)-3-甲氧基苯氧基)丙基氨基甲酸叔丁酯（1430克，3.07摩尔）在30升反应器中用丙酮（21.5升）制浆。在温和料流中经加料漏斗加入甲磺酸（1484克，15.36摩尔）。将浆料升温至在大约52℃下回流1至3小时并通过HPLC分析监测反应完成。将完成的反应经4.5小时从回流冷却到15至20℃。过滤5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈二甲磺酸盐的黄色浆料，用丙酮（7升）冲洗并在真空炉中干燥。该二甲磺酸盐（1608克，2.88摩尔）在水（16升）中制浆。将氢氧化钠（50%水溶液，228克，2.85摩尔）缓慢倒入浆料中。将浆料加热至60℃并搅拌1小时。然后将其经4小时冷却至16℃并过滤。湿滤饼用丙酮（4升）冲洗并在真空炉中在40℃下干燥至恒重以提供标题化合物（833克，94%）。mp 222.6℃；ES/MS m/z 366.2 [M+1]⁺。

另一制备，实施例5

粗制5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物使用下列程序提纯。该技术级5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物（1221克，2.55摩尔）在1:1丙酮/水的溶剂混合物（14.7升）中制浆。通过将混合物升温至50-55℃溶解固体。溶液在50-55℃下经0.22μ筒式过滤器精过滤。将溶液缓慢冷却至大约42-45℃的接种温度并接种。经接下来的30-60分钟继续缓慢冷却以证实成核。稀浆经3小时从38℃冷却至15℃。设置真空蒸馏并在110-90 mm和20-30℃下除去丙酮。将混合物经14小时从30℃冷却至15℃，在15℃下保持2小时，然后过滤。重结晶物质用19:1水/丙酮（2升）、然后水（6升）冲洗并在真空炉中在40℃下干燥至恒重以提供标题化合物（1024克，83.9%）。mp 222.6℃；ES/MS m/z 366.2 [M+1]⁺。

可以在配有CuKα源（λ=1.54056 Å）的Bruker D8 Advance粉末衍射仪上获得X-射线粉末衍射（XRPD）图，在40 kV和40 mA下运行，使用位置敏感检测器。在以°2θ ± 0.02计4°至35°之间使用以2θ ± 0.02计0.026°的步长和0.3秒的步长时间，以0.6 mm发散狭缝和10.39 mm检测器狭缝扫描各样品。初级和次级索勒狭缝（Soller slit）各自在2°；防散射狭缝为6.17 mm；空气散射池（air scatter sink）在合适的位置。

表1: 实施例5的特征峰位置和相对强度:

可以在Mettler-Toledo DSC装置（型号DSC822e）上进行差示扫描量热（DSC）分析。样品在具有针孔的封闭铝盘中在50毫升/分钟的氮气吹扫下以10℃/分钟从25℃加热至350℃。可以在Mettler Toledo TGA装置（型号TGA/SDTA 851e）上进行热重分析（TGA）。样品在具有针孔的封闭铝盘中在50毫升/分钟的氮气吹扫下以10℃/分钟从25℃加热至350℃。来自DSC的热曲线显示从80-140℃的弱的、宽吸热，接着在222℃下的尖锐熔融吸热，起始（225℃，峰）。通过TGA从25-140℃看出4%的质量损失。

下列检测的结果展示本发明的化合物或其可药用盐或盐的溶剂化物可用作 CHK1抑制剂、CHK2抑制剂和用作抗癌剂的证据。本文所用的“IC₅₀”是指产生该试剂可能的最大抑制响应的50%的试剂浓度，且“EC₅₀”是指产生该试剂可能的最大响应的50%的试剂浓度。

CHK1生化检测

可以使用TR-FRET检测法测定化合物对CHK1生化活性的作用。在这种检测法中，使用铽标记的抗体检测由激酶、荧光素标记底物和ATP的反应形成的磷酸化产物。抗体结合到磷酸化底物上，以使作为受体信号（荧光素）与供体信号（铽）的比率计算出的TR-FRET值提高。

在96-孔半面积黑色聚苯乙烯板（Costa, cat# 3694）中进行激酶反应（25微升反应体积）。通过添加ATP引发反应。最终反应条件为50 mM HEPES pH 7.5、0.005% (v/v)Triton™ X-100、2 mM DTT、2 mM MgCl₂、104 nM荧光素-PKC底物（Invitrogen, cat#PV3506）、30 μM ATP、1.5 nM活性CHK1酶（Millipore, cat# 14-346）、4% (v/v) DMSO和实施例2的化合物的连续稀释液（1:3连续稀释，20 μM开始，10个点）。在添加ATP后，该反应在室温下孵育75分钟，然后通过添加含有10 mM EDTA和2.1 nM Tb-pSer抗体（Invitrogen,cat# PV3574）的25微升TR-FRET稀释缓冲液（Invitrogen #PV3574）终止。淬灭的反应在室温下孵育60分钟，然后使用来自PerkinElmer的Envision读板仪用Ex340nm、Em495nm和Em520nm波长过滤器测量TR-FRET。

对于IC₅₀测定，由在各板上运行的对照组，使用TR-FRET比计算各浓度的抑制百分比。该十点化合物浓度数据随后使用ActivityBase 4.0拟合至四参数逻辑方程。由所得曲线计算绝对IC₅₀值。在这一检测中测得实施例2的化合物具有<0.001 μM的IC₅₀。这证实本发明的化合物是CHK1的强效抑制剂。

CHK2生化检测

可以使用TR-FRET检测法测定化合物对CHK2生化活性的作用。在这种检测法中，使用铽标记的抗体检测由激酶、荧光素标记底物和ATP的反应形成的磷酸化产物。抗体结合到磷酸化底物上，以使作为受体信号（荧光素）与供体信号（铽）的比率计算出的TR-FRET值提高。

在96-孔半面积黑色聚苯乙烯板（Costa, cat# 3694）中进行激酶反应（25微升反应体积）。通过添加ATP引发反应。最终反应条件为50 mM HEPES pH 7.5、0.005% (v/v)Triton™ X-100、2 mM DTT、2 mM MgCl₂、104 nM荧光素-PKC底物（Invitrogen, cat#PV3506）、30 μM ATP、2.5 nM活性CHK2酶（Millipore, cat# 14-347）、4% (v/v) DMSO和实施例2的化合物的连续稀释液（1:3连续稀释液，20 μM开始，10个点）。在添加ATP后，反应在室温下孵育75分钟，然后通过添加含有10 mM EDTA和2.1 nM Tb-pSer抗体（Invitrogen,cat# PV3574）的25微升TR-FRET稀释缓冲液（Invitrogen #PV3574）终止。淬灭的反应在室温下孵育60分钟，然后使用来自PerkinElmer的Envision读板仪用Ex340nm、Em495nm和Em520nm波长过滤器测量TR-FRET。

对于IC₅₀测定，由在各板上运行的对照组，使用TR-FRET比计算各浓度的抑制百分比。该十点化合物浓度数据随后使用ActivityBase 4.0拟合至四参数逻辑方程。由所得曲线计算绝对IC₅₀值。在这一检测中测得实施例2的化合物具有0.0047 μM的IC₅₀。这证实本发明的化合物是CHK2的强效抑制剂。

基于细胞的CHK1自磷酸化检测法

CHK1的抑制剂防止蛋白质的激酶活性将已激活DNA损伤响应的细胞中的底物磷酸化。易检测的CHK1底物是CHK1自身上的自磷酸化位点，丝氨酸296。可以使用下列免疫印迹检测法测量CHK1上的丝氨酸296的磷酸化量和间接测量CHK1蛋白激酶的活性水平。HeLa细胞（购自ATCC）在补充了10% (v/v)热灭活FBS（Gibco™）、1× MEM非必需氨基酸（Gibco™）、1×丙酮酸钠（Gibco™）的MEM w/ Earle's盐（Invitrogen）w/ L-谷氨酰胺（Gibco™）中培养并且24孔细胞培养板的每孔在600微升MEM培养基（上述）中接种1 × 10⁵个细胞。细胞在37℃、5% CO₂和95%-100%湿度下孵育24小时。将16微升4 μM阿霉素（Sigma）在培养基中的储液添加到各适当孔中以得出100 nM阿霉素的最终浓度。在添加CHK1抑制剂化合物之前，将板送回孵育器另外24小时。将化合物以10 mM溶解在100% DMSO中，然后在40% (v/v) DMSO中稀释至2 mM，然后用培养基 + 4% (v/v) DMSO稀释至100 μM。随后在100 μM至0.005 μM范围内制备化合物的连续稀释液（1:3）。将66微升化合物储液添加到板中的适当孔中以产生0.4% (v/v)的最终DMSO浓度和1 μM至0.0005 μM的最终化合物浓度范围。将板送回孵育器另外2小时，然后取出用于细胞裂解和处理。然后从该板中除去培养基，各孔用0.5毫升冰冷的DPBS（Gibco™）洗涤一次，除去所有液体并在该程序的剩余过程中将该板置于冰上。向各孔中加入75微升冰冷的裂解缓冲液，其由含有磷酸酶抑制剂（Sigma）和蛋白酶抑制剂（Roche Diagnostics）的细胞提取缓冲液（Invitrogen）构成。在10分钟后，刮擦各孔并将裂解液转移到在冰上的1.5毫升聚丙烯微离心管中。各裂解液在悬浮在水/冰浴中的同时用板cuphorn声波仪（Misonix）声处理45秒。将50微升各样品转移到含有25微升4× Laemmli样品缓冲液（240 mM Tris-HCl，pH6.8，40%甘油，0.05%溴酚蓝、8% w/v SDS和20% (v/v) β-巯基乙醇（beta-mercaptol ethanol））的0.5毫升聚丙烯微离心管中，在95℃下加热5分钟，并在-80℃下冷冻储存。剩余裂解液用于测定蛋白质浓度（BCA™蛋白质检测试剂盒, ThermoScientific）。将5微克在样品缓冲液中的各细胞裂解液施加到E-Page 96孔凝胶（Invitrogen）上并根据制造商的说明施以电泳。根据本领域中公知的程序（Towbin等人,1979）将蛋白质从该凝胶电转移至Immobilon-P膜（Millipore）。该膜用10 mM Tris/HCl pH8.0, 150 mM NaCl和0.05% (v/v) Tween 20 (TBST)短暂冲洗并在25℃下在TBST/5% (v/v)重构Carnation®速溶乳中浸泡1小时。将膜经5分钟用TBST洗涤4次，然后在4℃下在含有适当稀释的兔抗-phosphoCHK1（丝氨酸296）（Cell Signaling）的TBST/5% (w/v) BSA中浸泡24小时。将膜在25℃下经5分钟用TBST洗涤4次，然后在25℃下在含有适当稀释的缀合到HRP上的驴抗-兔IgG（Amersham）的TBST/5%乳中浸泡2小时以检测自磷酸化CHK1蛋白质。将膜再在25℃下经5分钟用 TBST洗涤4次。使用化学发光成像仪（Fujifilm）用如制造商推荐的Super Signal Western Femto HRP-检测试剂（Pierce）检测固定在膜上的抗原-抗体-报道分子缀合物。使用“Total Lab”软件（Nonlinear Dynamics）计算phospho-CHK1（ser296）谱带强度。使用下列公式计算阿霉素诱发的CHK1自磷酸化的抑制百分比：%抑制 = (样品phosphoCHK1谱带强度-无阿霉素阴性对照phosphoCHK1谱带强度) /(阿霉素阳性对照phosphoCHK1谱带强度- 无阿霉素阴性对照phosphoCHK1谱带强度) × 100。在这一检测中测得实施例2的化合物具有<0.0005 μM的EC₅₀。这证实本发明的化合物是CHK1的强效抑制剂。

基于HeLa细胞的阿霉素诱发的G2M检查点失效（abrogation）Acumen检测

CHK1的抑制剂会使用拓扑异构酶II抑制剂阿霉素处理过的p53-minus肿瘤细胞中的G2M DNA损伤检查点失效。G2M检查点失效的量度是在细胞横穿G2M检查点和进入有丝分裂后发生的在丝氨酸10上的组蛋白H3的磷酸化。下列高含量成像检测法可用于测量细胞中的组蛋白H3的磷酸化。HeLa细胞（购自ATCC）在补充了10% (v/v) FBS的MEM培养基（Gibco™）中培养并以每孔2000个细胞接种在聚D-赖氨酸涂布的透明底黑色板（BD Biocoat Cat #3504640）中，每孔100微升体积。然后将板在细胞培养基孵育器中孵育18-24小时（37℃、5%CO₂和95%相对湿度）。在初次孵育后，将含有625 nM阿霉素的20微升Gibco™ MEM培养基10%FBS添加到该板的适当孔中以产生125 nM的最终浓度。将板送回孵育器24小时，足以使细胞停滞在G2M检查点。第二天用实施例2的化合物处理细胞。将实施例2的化合物以10 mM溶解在100% DMSO中，然后在4% (v/v) DMSO-MEM中以50 μM开始稀释成10X储液。随后在50 μM至0.39 μM范围内制备该化合物的连续稀释液（1:2）。将13微升化合物储液添加到板中的适当孔中以产生0.4%的最终DMSO浓度和5 μM至0.039 μM的最终化合物浓度范围。将板送回孵育器另外7小时，然后取出固定。从各孔中小心除去液体并加入100微升PREFER™固定剂（Anatech LTD. Cat #414）。板在室温下保持20分钟，除去固定剂，然后通过添加100微升/孔在DPBS（Gibco™ cat # 14040）中的0.1% (v/v) Triton® X 100（Pierce Cat#28314），将细胞渗透10分钟。除去溶液并将板用100微升DPBS/孔洗涤两次，接着在室温下添加含有50 μg/mL RNAase（Sigma Cat # R-6513）的100微升DPBS 1小时。除去RNAase溶液并通过向各孔中加入含有1:500兔抗-pHH3（ser10）稀释液（UBI Cat# 06-570）+ 1% (w/v)BSA（Gibco™ cat# 15260）的50微升RNAase溶液，将细胞染色以测定在丝氨酸10上磷酸化的组蛋白H3（pHH3）的存在。将板密封并在4℃下保持整夜。通过将各板用每孔100微升DPBS洗涤两次而除去一抗并替换成50微升结合到Alexa染料488上的羊抗兔IgG（Invitrogencat# A11008）在DPBS + 1% (w/v) BSA中的1:750稀释液。将板在铝箔覆盖以避光的情况下在室温下保持1小时。板再用每孔100微升DPBS洗涤两次并替换成100微升15 nM PI（由原始溶液用PBS 1:100稀释，Molecular Probes cat# P3566）。板用黑色封条密封以将板遮光。将板孵育30分钟以将细胞核染色。用ACUMEN EXPLORER™激光扫描荧光微板细胞仪使用488纳米激发（TTP LABTECH LTC）扫描板以测量pHH3和包括2N和4N的DNA含量。通过来自Alexa488的在519纳米的平均强度识别pHH3阳性细胞。使用来自PI/DNA的在655-705纳米的总强度识别各细胞和细胞周期中的亚群（2N细胞，4N细胞）。通过标准化至总细胞的%，测定各群的最终读数，以产生%pHH3、%2N和%4N的最终检测输出。然后通过用100 nM的抑制剂对照化合物最大浓度处理细胞以测定100%活性，从而测定各化合物的最终%活性。0%活性基于无化合物处理。使用ACTIVITY BASE™，excel拟合（使用四参数逻辑拟合方程205的曲线拟合）测定相对EC₅₀以测定相对于在100%的对照最大值（control max）的%pHH3。在这一检测中测得实施例2的化合物具有0.0105 μM的EC50。这证实本发明的化合物会使G2M DNA损伤检查点失效。

EC_tfs(两倍致敏)检测

CHK1的抑制剂可通过S期内检查点的失效增强吉西他滨（或其它细胞毒素）的抗增殖活性，从而产生持久和增强的DNA损伤。可以通过测定细胞复制其DNA的能力来分析在DNA损伤后的继续肿瘤细胞增殖的能力。这一检测评估细胞在细胞具有修复DNA损伤的机会后复制其DNA的能力。在这一检测中，用吉西他滨、然后用实施例2的化合物处理细胞。在恢复期后，检测细胞在S期过程中将放射性胸苷并到DNA中的能力。EC_tfs参数是将在这种检测中在不存在CHK1抑制的情况下测得的吉西他滨的GI90浓度减半所必需的CHK1抑制剂浓度的量度。在RPMI 1640 +（Gibco™）10% (v/v)热灭活FBS中生长HT-29细胞（获自ATCC）。这些细胞以每孔1.3 × 10³个接种在Corning Costar 96孔组织培养板上。在接种细胞后，将组织培养板在室温下保持45分钟，然后回到37℃。将板孵育24小时，之后添加吉西他滨。在添加吉西他滨前，从所有孔中除去培养基并换成每孔150微升新鲜RPMI培养基。在PBS中以10 mM制备吉西他滨储液。在RPMI培养基中以4×浓度制备吉西他滨稀释液并以每孔50微升添加到孔中。所用的吉西他滨的最高最终浓度为80 μM，并通过四倍步骤进行稀释。在2小时后，从孔中除去含吉西他滨的培养基并换成每孔150微升新鲜RPMI培养基。将实施例2的化合物（10 mM在DMSO中）首先在DMSO中稀释至2000×最终浓度，然后1:500稀释到RPMI培养基中以生成添加到孔中的4×储液。添加体积为50微升。化合物稀释通过两倍步骤进行，从5000 nM开始。在添加实施例2的化合物后24小时，通过抽吸除去含抑制剂的培养基并换成每孔200微升新鲜RPMI培养基。在除去实施例2的化合物后72小时，开始氚化胸苷标记。³H-胸苷（NET027X001，PerkinElmer，比活性20 Ci/mmol）在完全RPMI中稀释1:20以产生0.05 mCi/mL的浓度。将20微升这一溶液添加到各孔中，以得到1 μCi/孔的³H-胸苷。将细胞标记22小时。从孔中彻底除去含³H-胸苷的培养基。然后将板在-20℃下冷冻几小时。为了收取含有并入的³H-胸苷的DNA，将板解冻几分钟，然后将每孔120微升0.1 N NaOH添加到各孔中。然后在旋转器上缓慢混合下将各板在37℃下孵育10分钟。用Filtermate 196 Harvester（PerkinElmer）收获DNA并收集在96孔Unifilter GF/C板（PerkinElmer #6005174）上。已在其上标记细胞的组织培养板的孔用水洗涤（5×）。Unifilter板膜用每孔另外4.5毫升洗涤（3 × 1.0毫升和最后1.5毫升洗涤）。Unifi用Backseal粘合片（PerkinElmer）密封并加入50 μL/孔MicroScint-20（Perkin Elmer）。各板然后用Topseal透明粘合片（PerkinElmer）密封。板在Topcount闪烁计数器（PerkinElmer）上以每孔1分钟计数。将每分钟的³H-胸苷计数（cpm）输出到Prism（GraphPad）中以供分析和绘图。对实施例2的化合物的各浓度测定吉西他滨剂量响应。为此，将cpm标准化，将100%并入设定为在不存在吉西他滨的情况下在该实施例2的化合物浓度下的平均cpm，并将零并入（100%抑制）设定为cpm = 0（无每分钟计数）。为了将数据绘制在Prism中，将吉西他滨浓度换算成log值并通过非线性回归拟合剂量响应曲线。不限制顶部和底部拟合。EC_tfs值为0.3 nM。此外，在HT29结肠癌细胞中，3 nM的实施例2的化合物将吉西他滨的EC₅₀降至1/7，从37 nM至5 nM。实施例2的化合物的作用也提高增殖抑制百分比，从吉西他滨的52到该组合的73。单独的3 nM的实施例2的化合物对HT29细胞的增殖几乎没有影响。

CHK1体内靶抑制检测

Calu-6细胞（ATCC）在生长培养基（含Earle's盐（Invitrogen）的MEM，含L-谷氨酰胺(Gibco™)，补充了10% (v/v)热灭活FBS(Gibco™)、1x MEM非必需氨基酸(Gibco™)、1x丙酮酸钠(Gibco™)）中培养并扩增。获取细胞并用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，并将在生长培养基（无血清）中的1 × 10⁶细胞与等体积的BD Matrigel^TM基质（BD Bioscience,Franklin, NJ）混合，然后皮下注射到预辐照（4.5 Gy）的裸小鼠（无胸腺裸鼠，来自Harlan,Indianapolis, IN）的侧腹中。在移植（肿瘤尺寸 = 150-200 mm³）后第15天，将每天在盐水（Hospira, Lake Forest, IL）中新鲜配制的吉西他滨通过腹腔内途径以150 mg/kg剂量给予动物。6小时后，通过静脉途径给予动物实施例2的化合物（以摩尔比甲磺酸/20%Captisol（CYDEX, Overland Park, KS）配制），从15 mg/kg向下改变剂量。在CHK1抑制剂给药后2小时处死动物，收取肿瘤并立即在含有磷酸酶抑制剂（Sigma）和蛋白酶抑制剂（RocheDiagnostics）的冰冷细胞提取缓冲液（Invitrogen Cat #FNN0011）中处理。使用设定为高的机动组织匀浆器（Powergen 700）在冰冷的15毫升聚丙烯锥形管中的1.5-2.0毫升裂解缓冲液中处理肿瘤15秒。在样品保持在冰上时，通过带有25 gauge针的1毫升注射器提取裂解液四次。接着，将0.35毫升肿瘤裂解液转移到含有0.15毫升4x Laemmli样品缓冲液（240 mMTris-HCl，pH6.8，40%甘油，0.05%溴酚蓝、8% w/v SDS和20% (v/v) β-巯基乙醇（beta-mercaptol ethanol））的1.5毫升聚丙烯微离心管中。然后混合样品，在95℃下加热5分钟并在Misonix 3000 plate horn声波仪上使用高功率声处理1分钟。然后将样品储存在冰上或储存在-80℃下以通过蛋白质印迹法评估靶抑制。剩余裂解液用于测定蛋白质浓度（BCA™蛋白质检测试剂盒, Thermo Scientific）。将5微克在样品缓冲液中的各肿瘤裂解液施加到E-Page 96孔凝胶（Invitrogen）上并根据制造商的说明施以电泳。根据本领域中公知的程序 [Towbin等人, 1979]将蛋白质转移至Nitrocellulose Protran BA83膜（Whatman）。随后加工该膜以测量在丝氨酸296上自磷酸化的CHK1蛋白质。该膜用水、然后10 mM Tris/HCl pH 8.0、150 mM NaCl和0.05% (v/v) Tween 20 (TBST)短暂冲洗并在25℃下在TBST/5% (w/v)重构Carnation速溶乳中浸泡1小时。将膜随后用TBST经5分钟洗涤4次。将膜在4℃下在适当稀释的兔抗-phosphoCHK1（丝氨酸296）（Cell Signaling）中的TBST/5% (w/v)BSA中浸泡16小时。接着，该膜在25℃下用TBST经5分钟洗涤4次，然后在25℃下在含有适当稀释的缀合到HRP上的驴抗-兔IgG（Amersham）的TBST/5%乳中浸泡2小时以检测phospho-CHK1（ser 296）。该膜再在25℃下用 TBST经5分钟洗涤4次。用如制造商推荐的Super SignalWestern Femto HRP-检测试剂（Pierce）检测固定在膜上的抗原-抗体-报道分子缀合物。

使用FUJI LAS-4000成像系统检测和捕获信号。使用“Total Lab”软件(NonlinearDynamics)计算Phospho-CHK1（ser296）谱带强度。使用下列公式计算吉西他滨诱发的CHK1自磷酸化的抑制百分比：%抑制 = (样品phosphoCHK1谱带强度 – 平均吉西他滨(Max)阳性对照phosphoCHK1谱带强度) / (平均阴性对照 (Min) phosphoCHK1谱带强度 – 平均吉西他滨(Max)阳性对照phosphoCHK1谱带强度) × 100。

在这一检测中测得实施例2的化合物具有0.03 mg/kg的对CHK1自磷酸化的靶调节有效剂量50（TMED50）。

人肿瘤异种移植模型

可以使用Calu-6肺和HT-29结肠肿瘤异种移植效力模型体内测定CHK1抑制剂实现肿瘤杀灭的能力。Calu-6肺癌细胞（ATCC）在生长培养基（MEM w/ Earle's盐（Invitrogen），含L-谷氨酰胺（Gibco™），补充了10%(v/v)热灭活FBS（Gibco™）、1x MEM非必需氨基酸（Gibco™）、1x丙酮酸钠（Gibco™））中培养，HT-29结肠癌细胞（ATCC）在生长培养基（补充了10%FBS（Gibco™）的McCoy's 5A培养基（Gibco™））中培养并扩增。获取细胞并用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，将在生长培养基（无血清）中的5 × 10⁶个细胞（HT-29）或1 × 10⁶个细胞（Calu-6）与等体积的BD Matrigel^TM基质（BD Bioscience, Franklin, NJ）混合，然后皮下注射到裸小鼠（CD-1 nu/nu，来自Charles River Labs, Wilmington, MA）的侧腹中。在移植（150-200 mm³）后大约第16天，每天在盐水中新鲜配制吉西他滨并通过腹腔内途径以60mg/kg剂量给予动物。24小时后，通过静脉途径给予动物实施例2的化合物（以摩尔比甲磺酸/20% Captisol（CYDEX, Overland Park, KS）配制）。在休息1天后，重复给药另外三个周期（Q3Dx4，CHK1抑制剂终止(offset) + 24小时）。各剂量组由9只动物构成。通过在治疗过程中每周进行两次的肿瘤体积测量测定肿瘤响应。作为化合物处理组的平均肿瘤尺寸与媒介物处理对照组的平均肿瘤尺寸相比的减小百分比，计算肿瘤生长抑制（TGI）。独自和与吉西他滨组合的实施例2的化合物在HT-29和Calu-6肿瘤异种移植模型中都表现出优异的剂量依赖性抗肿瘤活性，与单独使用吉西他滨相比肿瘤生长抑制增至最高6倍。

单剂效力给药

可以使用Calu-6肺异种移植效力模型体内测定CHK1抑制剂实现肿瘤杀灭的能力。Calu-6肺癌细胞（ATCC）如上所述培养。获取细胞并用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，将在生长培养基（无血清）中的1 × 10⁶个细胞（Calu-6）与等体积的BD Matrigel^TM基质（BDBioscience, Franklin, NJ）混合，然后皮下注射到裸小鼠（CD-1 nu/nu，来自CharlesRiver Labs, Wilmington, MA）的侧腹中。在移植（150-200 mm³）后大约第16天，实施例2的化合物以15 mg/kg给药（皮下（SC）、每天两次（BID×5休息2天）× 3个周期）。通过在治疗过程中每周进行两次的肿瘤体积测量测定肿瘤响应。以5天BID方案（15 mg/kg）给药的实施例2的化合物提供优于之前描述的吉西他滨 + 实施例2的化合物组合方案的生长抑制。完全肿瘤消退是快速持久的。

单层增殖和细胞毒性检测

CHK1抑制剂的效力的一个量度是其抑制癌细胞在培养中由于不受控的复制起点活化而增殖的能力（Conti等人Cell Cycle 6: 2760-2767, 2007）。CHK1抑制剂在源自宽范围肿瘤类型的细胞系中的抗增殖活性的测定指示哪些肿瘤类型可能在临床上响应用CHK1抑制剂化疗。下面描述的细胞增殖检测在德国的Oncotest, GmbH进行。三十种实体瘤细胞系源自13种不同的肿瘤组织型，各自以1至6种不同的细胞系为代表（Oncotest, GmbH）。它们由膀胱癌、脑癌、结肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌和子宫体癌，以及由黑素瘤和胸膜间皮瘤建立。所有细胞系在Oncotest由患者源性肿瘤异种移植物建立（Roth等人1999）。Fiebig等人（Fieberg等人1992和1999）描述了供体异种移植物的来源。细胞系每周常规传代一次或两次并保持培养最多20代。所有细胞在补充了10% (v/v)胎牛血清（PAA, Cölbe, Germany）和0.1 mg/mL庆大霉素（PAA, Cölbe, Germany）的RPMI 1640培养基（PAA, Cölbe, Germany）中在含5% CO₂的增湿气氛中在37℃下生长。使用改良PI检测评估化合物对这些细胞系的细胞毒活性。简言之，通过胰蛋白酶消化从指数期培养中收取贴壁细胞，计数并以取决于细胞系的细胞密度（4.000 - 20.000个细胞/孔）接种在96孔平底微量滴定板中。在24小时恢复期以使细胞贴壁并恢复指数生长后，加入10微升培养基（6个对照孔/板）或含实施例2的化合物的培养基。在DMSO中以1 mM的浓度制备实施例2的化合物的储液。用完全RPMI 1640细胞培养基如下进行后续稀释：首先将DMSO储液稀释1:22（含有4.5% (v/v) DMSO）。使用这种溶液，在细胞培养基中进行连续稀释（半对数或2倍）。对于最后一个稀释步骤（1:15），将10微升/孔的各最终化合物溶液直接添加到140微升/孔的培养基中。最终DMSO浓度≤ 0.3% (v/v)。在十点浓度曲线中一式三份施加实施例2的化合物并继续处理4天。在处理4天后，除去培养基并换成200微升7 µg/mL的PI水溶液。为了测量活细胞数，通过冷冻透化细胞，以使在用化合物处理后仍附着在孔上的所有细胞死亡。最后，使用Cytofluor 4000酶标仪（microplate reader）（激发λ= 530 nm，发射λ= 620 nm）测量PI荧光以测定总活细胞数。生长抑制表示为测试/对照 ×100 (% T/C)值。基于T/C值，使用非线性回归（log[抑制剂浓度] vs 应答(% T/C)）测定相对IC₅₀值。实施例2的化合物以在20nM下的 EC₅₀抑制大多数这些肿瘤细胞系的生长。

小儿细胞系对5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物的体外应答

细胞裂解液获自用5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物（实施例5）以5和50 nM最终浓度处理24小时的胚胎性横纹肌肉瘤和肺泡横纹肌肉瘤（分别为RD和SJCRH30）、骨肉瘤（Saos-2）和尤因氏肉瘤（RD-ES）细胞系。

使用上述细胞裂解液进行蛋白印迹法。所述蛋白印迹的分析表明当用5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物（实施例5）处理细胞系时CHK1蛋白质水平不变并且phospho-CHK1（S345）水平随处理而提高。借助CHK1抑制可以观察到较高的DNA损伤水平。相应地，在用5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物（实施例5）处理后，作为DNA损伤信号的gammaH2AX的水平提高。已知在CHK1抑制后提高的phospho-ERK 1/2（T202/Y204）的水平在四种细胞系的三种中也提高，无应答的RD-ES细胞系是这四种中在体外最不敏感的。phospho-hnRNP-C水平（CHK1抑制的一种标志，其在RD-ES细胞系中也不受影响）的提高也支持这些数据。phospho-AKT水平在用5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物（实施例5）处理后看起来不变。

异种移植瘤模型

可以使用下列程序测量响应活性药物成分的肿瘤体积减小。在培养基中扩增人NBM癌细胞SH-SY5Y（ATCC，#CRL-2226），收取并将在200微升1:1 HBSS和Matrigel®溶液中的5×10⁶个细胞皮下注射到雌性CD-1 nu/nu小鼠（20-24克，Charles River Laboratories）的右后胁腹中。在培养基中扩增人NBM癌细胞KELLY（Sigma-#92110411），收取并将在200微升1:1HBSS和Matrigel®溶液中的5×10⁶个细胞皮下注射到雌性CB-17 SCID小鼠（20-24克，Charles River Laboratories）的右后胁腹中。在培养基中扩增人NBM癌细胞IMR-32（ATCC，#CCL-127），收取并将在200微升1:1 HBSS和Matrigel®溶液中的5×10⁶个细胞皮下注射到雌性CB-17 SCID小鼠（20-24克，Charles River Laboratories）的右后胁腹中。

在培养基中扩增人RMS癌细胞SJCRH-30（St. Jude Children's ResearchHospital），收取并将在200微升HBSS中的5×10⁶个细胞皮下注射到雌性无胸腺裸小鼠（20-22克，Harlan Laboratories）的右后胁腹中。在培养基中扩增人横纹肌肉瘤癌细胞RD（ATCC，#CCL-136），收取并将在200微升HBSS中的5×10⁶个细胞皮下注射到雌性无胸腺裸小鼠（20-22克，Harlan Laboratories）的右后胁腹中。

对于所有“CTG”模型（包含人RMS、DSRCT、EWS、OS和LMS患者源性异种移植物模型），雌性NCr裸自发突变小鼠（5-8周龄，Taconic）在胁腹区中单侧移植取自供体动物的肿瘤碎片，各自从特定传代批（passage lot）移植。

对于所有“ST”模型（包含RMS和LMS），患者源性异种移植物由人肿瘤活组织建立并在动物中连续传代有限次数以保持肿瘤异质性。在皮下模型中，无胸腺裸小鼠（Crl:NU(NCr)-Foxn1nu）或CB-17 SCID小鼠（CRL- CB17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl）在胁腹中单侧注射或移植取自宿主动物的肿瘤碎片，各自从特定传代批（passage lot）移植。对于所有研究，在移植后第7天开始每周两次测量肿瘤生长和体重。当肿瘤尺寸达到150-300立方毫米时，随机打乱动物并分组，每组4-7只动物。在适当的媒介物（例如媒介物可以是20%Captisol®/无菌水）中制备受试化合物并皮下给药连续三天，接着四天给药假期（dosingholiday）并重复最少四周。通过在治疗过程中每周进行两次的肿瘤体积测量测定肿瘤响应。

发现5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物（实施例5）具有如下表2中提供的%T/C或%消退值。这些结果表明5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物（实施例5）在包括骨肉瘤（CTG-0242）；尤因氏肉瘤（CTG-0994）；DSRCT（CTG-0926）；RMS（CTG-1213、CTG-1116、SJCRH-30和ST162）；和NBM（SH-SY5Y、KELLY、IMR-32）；LMS（CTG-1006、ST1547）的一系列人异种移植物模型中表现出显著抗肿瘤活性。

表2

¹T/C是指受治疗/对照值。

异种移植瘤模型: 组合研究

组合疗法是可有效阻止肿瘤生长并克服经常响应单剂形成的获得性肿瘤耐药性的一种癌症治疗方法。5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物（实施例5）可以在体内SJCRH-30 RMS模型中与肉瘤标准疗法（standard-of-care）阿霉素组合测试（见表3）。这种组合效力研究可以在如上所述的无胸腺裸小鼠中进行。此研究中所用的媒介物是20% Captisol®/无菌水并皮下给药连续三天，接着四天给药假期并重复最少四周。阿霉素（5%葡萄糖/无菌水）每周一次静脉给药，同时5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物（实施例5）在20% Captisol®/无菌水中皮下给药连续三天，接着四天给药假期。治疗期持续4周。

5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物（实施例5）作为单剂给药带来最初完全应答直至第38天，此时出现肿瘤再生长。用5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物（实施例5）+阿霉素治疗肿瘤带来完全应答并且没有肿瘤再生长（见表3；-87%消退，p<0.001）。5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物（实施例5）和阿霉素的组合看起来耐受，因为没有明显的体重损失。这些结果表明5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物（实施例5）和阿霉素的组合与任一药剂的单独给药相比更有效抑制肿瘤生长。

表3

¹T/C是指受治疗/对照值

²5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物（实施例5）。

表4

肿瘤亚型	肿瘤收集时的患者年龄(年)	用CHK1/2抑制剂治疗的结果¹
			DSRCT	20	1/1完全应答
尤因氏肉瘤	8-17	1/4病情稳定
			骨肉瘤	11-19	1/4病情稳定
肺泡横纹肌肉瘤	17-24	2/2完全应答；观察到获得性耐药
			胚胎性横纹肌肉瘤	2-7	1/3完全应答；1/3病情稳定
平滑肌肉瘤	48-64	1/5部分应答；1/5病情稳定
			脂肪肉瘤	36-74	7/7进行性疾病

¹5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物（实施例5）。

如表 4中所示，小儿肉瘤细胞系对5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物（实施例5）的体内治疗高度敏感。5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物（实施例5）在接近41%（7/17）的受试小儿肉瘤体内小鼠模型中作为单剂有效，结果从病情稳定到完全应答。体内评估的大多数成人肉瘤模型（10/12；83%）对5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物（实施例5）的单剂治疗敏感。5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物（实施例5）与阿霉素、异环磷酰胺或伊立替康的组合看起来克服SJCRH30异种移植物中的获得性耐药。

Claims

1.治疗癌症的方法，其包括给予需要其的患者有效量的化合物5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或其可药用盐的溶剂化物；其中所述癌症选自成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤和平滑肌肉瘤。

2.根据权利要求1的方法，其中所述癌症是成神经细胞瘤。

3.根据权利要求1的方法，其中所述癌症是横纹肌肉瘤。

4.根据权利要求3的方法，其中所述横纹肌肉瘤是肺泡横纹肌肉瘤或胚胎性横纹肌肉瘤。

5.根据权利要求1的方法，其中所述癌症是骨肉瘤。

6.根据权利要求1的方法，其中所述癌症是尤因氏肉瘤。

7.根据权利要求1的方法，其中所述癌症是促纤维增生性小圆细胞肿瘤。

8.根据权利要求1的方法，其中所述癌症是平滑肌肉瘤。

9.根据权利要求1-8任一项的方法，其中所述化合物是5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐。

10.根据权利要求1-8任一项的方法，其中所述化合物是5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈。

11.根据权利要求1-8任一项的方法，其中所述盐是5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲酸盐。

12.根据权利要求1-8任一项的方法，其中所述盐是5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈二盐酸盐。

13.根据权利要求1-8任一项的方法，其中所述盐是5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸盐。

14.根据权利要求1-8任一项的方法，其中所述盐是5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物。

15.根据权利要求1-8任一项的方法，其中所述盐是结晶形式的5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物，其特征在于具有在2θ ± 0.02° = 12.64°、21.25°和26.15°的峰的X-射线粉末衍射图。

16.根据权利要求1-15任一项的方法，其中所述化合物、其盐或其溶剂化物与一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂一起给药。

17.根据权利要求1-16任一项的方法，其中所述方法进一步包括给予电离辐射。

18.根据权利要求1-17任一项的方法，其中所述方法进一步包括给予一种或多种化疗剂。

19.根据权利要求1-17任一项的方法，其中所述方法进一步包括给予选自5-氟尿嘧啶、羟基脲、吉西他滨、氨甲蝶呤、培美曲塞、阿霉素、依托泊苷、顺铂、长春新碱、异环磷酰胺、伊立替康、环磷酰胺和紫杉醇的一种或多种化疗剂。

20.5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或其可药用盐的溶剂化物用于治疗癌症的用途，所述癌症选自成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤和平滑肌肉瘤。

21.根据权利要求20的用途，其中所述癌症是成神经细胞瘤。

22.根据权利要求20的用途，其中所述癌症是横纹肌肉瘤。

23.根据权利要求22的用途，其中所述横纹肌肉瘤是肺泡横纹肌肉瘤或胚胎性横纹肌肉瘤。

24.根据权利要求20的用途，其中所述癌症是骨肉瘤。

25.根据权利要求20的用途，其中所述癌症是尤因氏肉瘤。

26.根据权利要求20的用途，其中所述癌症是促纤维增生性小圆细胞肿瘤。

27.根据权利要求20的用途，其中所述癌症是平滑肌肉瘤。

28.根据权利要求20-27任一项的用途，其中所述化合物是5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐。

29.根据权利要求20-27任一项的用途，其中所述化合物是5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈。

30.根据权利要求20-27任一项的用途，其中所述盐是5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲酸盐。

31.根据权利要求20-27任一项的用途，其中所述盐是5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈二盐酸盐。

32.根据权利要求20-27任一项的用途，其中所述盐是5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸盐。

33.根据权利要求20-27任一项的用途，其中所述盐是5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物。

34.根据权利要求20-27任一项的用途，其中所述盐是结晶形式的5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈，其特征在于具有在2θ ± 0.02°= 12.64°、21.25°和26.15°的峰的X-射线粉末衍射图。

35.根据权利要求20-34任一项的用途，其与电离辐射组合。

36.根据权利要求20-35任一项的用途，其与一种或多种化疗剂组合。

37.根据权利要求20-35任一项的用途，其与选自5-氟尿嘧啶、羟基脲、吉西他滨、氨甲蝶呤、培美曲塞、阿霉素、依托泊苷、顺铂、长春新碱、异环磷酰胺、伊立替康、环磷酰胺和紫杉醇的一种或多种化疗剂组合。

38.化合物5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈或其可药用盐或其可药用盐的溶剂化物，用于治疗选自成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤和平滑肌肉瘤的癌症。

39.根据权利要求38使用的化合物或其可药用盐或其可药用溶剂化物，其中所述化合物是5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈。

40.根据权利要求38使用的化合物，其中所述化合物是5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈。

41.根据权利要求38使用的化合物，其中所述化合物是5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲酸盐。

42.根据权利要求38使用的化合物，其中所述化合物是5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈二盐酸盐。

43.根据权利要求38使用的化合物，其中所述化合物是5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸盐。

44.根据权利要求38使用的化合物，其中所述化合物是5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物。

45.根据权利要求38使用的化合物，其中所述化合物是结晶形式的5-(5-(2-(3-氨基丙氧基)-6-甲氧基苯基)-1H-吡唑-3-基氨基)吡嗪-2-甲腈甲磺酸一水合物，其X-射线粉末衍射图具有在2θ ± 0.02° = 12.64°、21.25°和26.15°的峰。

46.根据权利要求38-45任一项使用的化合物、其盐或其溶剂化物，其中所述癌症是成神经细胞瘤。

47.根据权利要求38-45任一项使用的化合物、其盐或其溶剂化物，其中所述癌症是横纹肌肉瘤。

48.根据权利要求38-45任一项使用的化合物、其盐或其溶剂化物，其中所述癌症选自肺泡横纹肌肉瘤或胚胎性横纹肌肉瘤。

49.根据权利要求38-45任一项使用的化合物、其盐或其溶剂化物，其中所述癌症是骨肉瘤。

50.根据权利要求38-45任一项使用的化合物、其盐或其溶剂化物，其中所述癌症是尤因氏肉瘤。

51.根据权利要求38-45任一项使用的化合物、其盐或其溶剂化物，其中所述癌症是促纤维增生性小圆细胞肿瘤。

52.根据权利要求38-45任一项使用的化合物、其盐或其溶剂化物，其中所述癌症是平滑肌肉瘤。

53.根据权利要求38-52任一项使用的化合物、其盐或其溶剂化物，其中所述用途与电离辐射同时、分开或相继组合。

54.根据权利要求38-53任一项使用的化合物、其盐或其溶剂化物，其中所述用途与一种或多种化疗剂同时、分开或相继组合。

55.根据权利要求38-53任一项使用的化合物、其盐或其溶剂化物，其中所述用途与选自5-氟尿嘧啶、羟基脲、吉西他滨、氨甲蝶呤、培美曲塞、阿霉素、依托泊苷、顺铂、长春新碱、异环磷酰胺、伊立替康、环磷酰胺和紫杉醇的一种或多种化疗剂同时、分开或相继组合。