JP2022526926A - イミダゾロニルキノリン化合物およびそれらの治療への使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＡＴＭ阻害剤８－（１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１－（３－フルオロ－５－メトキシ－ピリジン－４－イル）－７－メトキシ－３－メチル－１，３－ジヒドロイミダゾ［４，５ｃ］キノリン－２－オンのアトロプ異性体、固体形態、塩形態、および重水素化誘導体、ならびにそれらの医薬組成物に、関する。安定なアトロプ異性体は、相互転換をせず、以下の式によって表される：

Description

発明の分野
本発明は、ＡＴＭ阻害剤８－（１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１－（３－フルオロ－５－メトキシピリジン－４－イル）－７－メトキシ－３－メチル－１，３－ジヒドロイミダゾ［４，５ｃ］キノリン－２－オンのアトロプ異性体および重水素化誘導体、ならびにそれらの薬学的に許容し得る塩および固体形態を、提供する。これらの化合物は、ＴＭキナーゼによるシグナル伝達の阻害、制御、および／または調節において、有用である。本発明は、本発明の前記アトロプ異性体、固体形態、薬学的に許容し得る塩、および重水素化誘導体を含む組成物、ならびにＡＴＭキナーゼに関する様々な障害、とりわけがんの処置において、これらの組成物を使用する方法も、提供する。

発明の背景
セリン／トレオニンタンパク質キナーゼＡＴＭ（血管拡張性失調症突然変異キナーゼ）は、触媒ドメインを伴うキナーゼのＰＩＫＫファミリーに属し、それは、ホスホ－イノシチド－３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ、ＰＩ３Ｋ）に相同性を有する。これらのキナーゼは、細胞成長、細胞増殖、遊走、分化、生存、および細胞接着などの、様々な鍵となる細胞の機能に関わる。とりわけ、これらのキナーゼは、細胞周期停止およびＤＮＡ修復プログラム（ＤＤＲ：ＤＮＡ損傷応答）を活性化することによって、ＤＮＡ損傷に応答する。ＡＴＭは、ＡＴＭ遺伝子の生成物であり、相同性の遺伝子組換えおよび非相同性のエンドツーエンドの連結（ＮＨＥＪ）によって、ＤＮＡ二本鎖への損傷（ＤＳＢ：二本鎖切断）における修復において、鍵となる役割を果たす。このタイプの二本鎖の損傷は、とりわけ細胞障害性である。

ヒトの腫瘍の主な特色の１つは、ほとんどのがんにおいてまだ公知でないＤＮＡ修復機構の特定の欠陥を伴う、それらのゲノム不安定性である。この不安定性は、化学治療のための治療開始点を表し、それは、しばらくの間優先して実践された。加えて、下層の遺伝因子が、ＤＮＡ二本鎖の損傷への応答を調節する遺伝子の機能関連突然変異の喪失である、いくつかの症候群がある。これは、血管拡張性失調症を含み、それは、不完全なＡＴＭ遺伝子によって引き起こされる。すべてのこれらの症候群の一般的な特色は、それらが、極度の放射線感受性を引き起こすことである（Lavin & Shiloh (1997) Annu. Rev. Immunol. 15: 177; Rotman & Shiloh (1998) Hum. Mol. Genet. 7: 1555，その全体は、本明細書に参照によって組み込まれる）。従って、ＡＴＭ欠損細胞は、ＤＮＡ二重螺旋への損傷を引き起こす剤および他の手段に、感受性であり、ＡＴＭを、がん処置における化学－、および放射線－感受性のための魅力的な標的とさせる。

要約すると、ＡＴＭ（血管拡張性失調症突然変異キナーゼ）は、ＤＮＡ二本鎖切断修復の鍵の制御因子であり、それは、広く使用される放射－および化学治療によって誘導される。ＡＴＭは、広範囲にわたるシグナルを、ｐ５３を含む下流のエフェクターの多数にリレーする。修復されてない二本鎖切断は、チェックポイント応答の活性化、細胞周期停止、および最終的に腫瘍細胞死につながる。よって、ＡＴＭは、誘導された二本鎖切断の修復を阻害するために魅力的な介入位置になった。

化合物ワートマニンは、まず最初にこの文脈において調査されるものの１つで、なかでも、ＡＴＭの阻害に起因することができる放射線増感作用を示した。しかしながら、それは、ｉｎ ｖｉｖｏ毒性に起因して、治療の使用のために好適でなかった。ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２の化学物質構造から出発して、ＫｕＤＯＳ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓは、ＡＴＭ阻害剤：Ｋｕ－５５９３３（２－モルホリノ－６－（チアントレン－１－イル）－４Ｈ－ピラン－４－オン）を同定した。この化合物によって、電離放射線およびＤＮＡ二本鎖損傷化学療法剤に対する感受性は、達成された（Hickson, I., et al. (2004), Cancer Res 64, 9152-9159、その全体が、本明細書に参照によって組み込まれる）。しかしながら、Ｋｕ－５５９３３は、おそらくその高い親油性に起因して、ｉｎ ｖｉｖｏの使用に関して不適当であるとわかった。Ｋｕ－６００１９（２－（（２Ｓ，６Ｒ）－２，６－ジメチルモルホリノ）－Ｎ－（５－（６－モルホリノ－４－オキソ－４Ｈ－ピラン－２－イル）－９Ｈ－チオキサンテン－２－イル）－アセトアミド）およびＫｕ－５５９４０３（２－－（４－メチルピペラジン－１－イル）Ｎ－アセトアミド［５－チオキサンテン－（６－モルホリノ－４－オキソピラン－２－イル）２－イル］）が、続いて開発され、そして、Ｋｕ－５５９４０３は、進行固形腫瘍の処置のための臨床試験に入るのに十分な見込みがあり歓迎された。

放射線治療との組み合わせに関わる臨床試験を含む、臨床開発に現在あるという点で上記の考えを支持するＡＴＭ阻害剤、例えばＡＺＤ０１５６、ＡＺＤ１３９０、およびＭ３５４１が、さらにある。

多くの進展が、ＡＴＭ阻害剤の分野においてなされてきた一方で、ＡＴＭキナーゼの高い阻害力のみでなく、他のキナーゼをしのぐ有利な選択性、有利な生物学的利用率、および／または減少されたオフターゲット効果も有する化合物を提供するための必要性が、残っている。

ＡＴＭキナーゼによるシグナル伝達を効果的に阻害し、規制しおよび／または、調節する小分子の提供は、所望され、本発明の１つの目的である。選択的である、すなわち他のキナーゼに対して全くないまたは有意により低い活性を有するＡＴＭ阻害剤を提供することが、さらにその上所望される。望ましくない副作用を引き起こす公知の標的に関して、有利な特性を示すＡＴＭｉ阻害剤を提供することが、さらにその上所望される。１つの目的は、それゆえ、オフターゲット効果よび／または関連する毒性を減少させる化合物を、提供することである。さらにその上、良好な生物学的利用率を伴うＡＴＭ阻害剤を提供することが、本発明の目的である。好都合に低い吸湿性および／または他の物理的特性などの、有利な固体形態特性を伴うＡＴＭ阻害剤を提供することが、さらなるまたは代替の本発明の目的である。

概説された上記およびさらなる目的としての少なくとも１つの目的は、ＡＴＭ阻害剤８－（１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１－（３－フルオロ－５－メトキシピリジン－４－イル）－７－メトキシ－３－メチル－１，３－ジヒドロイミダゾ［４，５ｃ］キノリン－２－オン（化合物Ｙ）のアトロプ異性体および重水素化誘導体固体形態、ならびにそれらの薬学的に許容し得る塩および組成物によって解決された。

本発明の一側面は、２つの化合物を提供し、それは化合物Ｙのアトロプ異性体であり、以下の式によって表される：

および、それらの薬学的に許容し得る塩。

本発明の別の側面は、化合物１の固体形態を提供する：

別の側面は化合物１、とりわけ化合物１のフマラート、化合物１のエジシラート、および化合物１のナプシラートの特定のとりわけ有利な薬学的に許容し得る塩に関し、それは、以後「化合物１－ａ」としてまとめて称されてもよい。
本発明の別の側面は、重水素化合物３、４、および５を提供し、それは、以下の式によって表される：

またはそれらのアトロプ異性体または薬学的に許容し得る塩。

図１は、化合物１の注釈がついた１Ｈ ＮＭＲスペクトルを描く。 図２は、化合物１の注釈がついた１３ＣＮＭＲスペクトルを描く。 図３は、化合物１の注釈がついた１９ＦＮＭＲスペクトルを描く。 図４は、メタノールの化合物１のＵＶ－Ｖｉｓスペクトルを描く。 図５は、化合物１および２のＨＰＬＣクロマトグラムを描く。 図６は、化合物１の調製のフローチャートを描く。 図７は、化合物－１－ジベンゾイル－Ｄ－タートラート（Ａ）の結晶構造、およびそのＸＲＰＤ（Ｂ）を描く。 図７は、化合物－１－ジベンゾイル－Ｄ－タートラート（Ａ）の結晶構造、およびそのＸＲＰＤ（Ｂ）を描く。 図８は、化合物－２－ジベンゾイル－Ｌ－タートラートの結晶構造を描く。 図９は、化合物１およびその特定の塩のＦａＳＳＩＦ中のｎｏｎ－ｓｉｎｋ溶解挙動のチャートを描く。 図１０は、化合物１のフマラートの固体形態のＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンを描く。 図１１は、化合物１のナプシラートの固体形態のＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンを描く。 図１２は、化合物１のエジシラートの固体形態のＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンを描く。 図１３は、化合物１の固体形態Ａ２のＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンを描く。 図１４は、化合物１の固体形態Ａ１のＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンを描く。 図１５は、化合物１の固体形態Ａ３のＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンを描く。 図１６は、化合物１の固体形態ＮＦ９のＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンを描く。 図１７は、化合物１の水和物の固体形態Ｈ１のＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンを描く。 図１８は、化合物１の水和物の固体形態Ｈ２のＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンを描く。 図１９は、化合物１の固体形態ＮＦ１９のＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンを描く。 図２０は、照射（ＩＲ）および経口の化合物１の随伴投与によって誘導される強い腫瘍成長阻害を示す（６×５日、２Ｇｙ；ＦａＤｕ ＳＣＣＨＮ腫瘍モデル）。 図２１は、ＨＢＣｘ－１０患者由来三重陰性乳がん異種移植モデルにおける、化合物１および比較するオラパリブと組み合わせたＡＴＭ阻害剤の抗腫瘍活性のｉｎ ｖｉｖｏ評価の結果を示す。 図２２は、化合物１の形態Ａ２のＤＳＣ加熱曲線を示す。 図２３は、化合物１の形態Ａ２のＴＧＡ加熱曲線を示す。 図２４は、化合物１の形態Ａ２のＤＶＳ水取り込み等温曲線（２５℃）を示す。 図２５は、化合物１の形態Ａ１のＤＳＣ加熱曲線を示す。 図２６は、化合物１の形態Ａ１のＴＧＡ加熱曲線を描く。 図２７は、化合物１の形態Ａ３のＤＶＳ水取り込み等温曲線（２５℃）を示す。 図２８は、化合物１（水和物）の形態Ｈ２のＤＳＣ加熱曲線を描く。 図２９は、化合物１（水和物）の形態Ｈ２のＴＧＡ加熱曲線を示す。 図３０は、化合物１（水和物）の形態Ｈ２のＤＶＳ水取り込み等温曲線（２５℃）を示す。 図３１は、化合物１のフマラート（形態ＮＦ６）のＤＳＣ加熱曲線を描く。 図３２は、化合物１のフマラート（形態ＮＦ６）のＴＧＡ加熱曲線を示す。 図３３は、化合物１のフマラート（形態ＮＦ６）のＤＶＳ水取り込み等温曲線（２５℃）を示す。 図３４は、化合物１つのナプシラート（ＮＦ７）のＤＳＣ加熱曲線を描く。 図３５は、化合物１のナプシラート（ＮＦ７）のＴＧＡ加熱曲線を示す。 図３６は、化合物１のナプシラート（ＮＦ７）のＤＶＳ水取り込み等温曲線（２５℃）を描く。 図３７は、化合物１のエジシラート（ＮＦ８）のＤＳＣ加熱曲線を描く。 図３８は、化合物１のエジシラート（ＮＦ８）のＴＧＡ加熱曲線を示す。 図３９は、化合物１のエジシラート（ＮＦ８）のＤＶＳ水取り込み等温曲線（２５℃）を描く。 図４０は、固体形態Ｓ１における化合物１のメタノラートのＸＲＰＤを示す。 図４１は、固体形態Ｓ２における化合物１の混合水和物／メタノラートのＸＲＰＤを描く。 図４２は、固体形態Ｓ３における化合物１のＴＨＦ溶媒和物のＸＲＰＤを示す。 図４３は、固体形態ＮＦ１１における化合物１のジオキサン溶媒和物のＸＲＰＤを描く。 図４４は、固体形態ＮＦ１５における化合物１のクロロホルム溶媒和物のＸＲＰＤを示す。 図４５は、固体形態ＮＦ１６における化合物１の酢酸溶媒和物のＸＲＰＤを描く。 図４６は、固体形態ＮＦ１８における化合物１の酢酸溶媒和物のＸＲＰＤを示す。 図４７は、固体形態ＮＦ２９における化合物１の１，４－ジオキサン溶媒和物のＸＲＰＤを描く。 図４８は、固体形態ＮＦ３２における化合物１のジクロロメタン溶媒和物のＸＲＰＤを示す。 図４９は、固体形態ＮＦ３３における化合物１のＮＭＰ（Ｎメチル－２－ピロリドン）溶媒和物のＸＲＰＤを描く。 図５０は、固体形態ＮＦ３５における化合物１のアセトニトリル溶媒和物のＸＲＰＤを示す。 図５１は、固体形態ＮＦ３６における化合物１の１，４－ジオキサン溶媒和物のＸＲＰＤを描く。 図５２は、固体形態ＮＦ３７における化合物１のジメチルアセトアミド溶媒和物のＸＲＰＤを示す。

発明の詳細な説明
国際特許出願ＷＯ２０１６／１５５８４４は、その全体が、本明細書によって参照により組み込まれ、ＡＴＭキナーゼによってシグナル伝達を効果的に阻害し、規制し、および／または調節するイミダゾロニルキノリン化合物を記載する。
かかる化合物は、化合物Ｙを含む：

化合物Ｙは、ＷＯ２０１６／１５５８４４中の例４に明示され、（酵素および細胞のアッセイにおいて）ＰＩ３Ｋａｌｐｈａ、ＰＩ３Ｋｂｅｔａ、ＰＩ３Ｋｄｅｌｔａ、ＰＩ３Ｋｇａｍｍａ、およびｍＴＯＲにわたるＡＴＭキナーゼの選択的阻害を立証する様々なアッセイおよび治療のモデルにおいて活性である。
化合物の定義のためにここで使用される用語は、一般に化学物質化合物およびとりわけ有機化合物のためのＩＵＰＡＣ組織のルールに基づく。

驚くべきことに、化合物Ｙが２つのアトロプ異性体の形で存在し、それは、単離されることができ、そして有益に安定であり、そして、前記アトロプ異性体が、驚くべきおよびきわめて所望される特徴を呈することが、ここで、分かってきた。

一側面に従って、本発明は、以下の２つの化合物を提供し、それらは化合物Ｙのアトロプ異性体である：
・８－（１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１－（Ｓａ）－（３－フルオロ－５－メトキシ－ピリジン－４－イル）－７－メトキシ－３－メチル－１，３－ジヒドロ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オン（化合物１）および

・８－（１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１－（Ｒａ）－（３－フルオロ－５－メトキシ－ピリジン－４－イル）－７－メトキシ－３－メチル－１，３－ジヒドロ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オン（化合物２）、ならびにそれらの薬学的に許容し得る塩。

化合物１および２は、以下の式によって表される：

ここで、化合物１および２の太いおよび破線の部分は、三環系の環がある平面からの、ピリジン環の部分的な回転を意味する。

本明細書に使用されるとき用語「アトロプ異性体」が、キラル軸を構築する単結合周辺の制限された回転に起因して生じる立体異性体を指すことが、当業者によって認識されるだろう。前記単結合周辺の回転障壁が、単一のアトロプ異性体の単離ができるようにするために十分に高くなければならないことが、さらに認識されるだろう。前記回転障壁は、それにより前記単結合周辺で前記回転を制限する同じ分子の他の残基との立体相互作用から、例えば、結果として起こることができる。立体化学のおよび電子の因子は、効果を示し始めて、相互に補強してもまたは反対に作用してもよい。

不斉炭素原子を含有するキラル化合物の利用は、原則として、薬物発見において十分確立されている。とりわけ、２つのキラル化合物のラセミ混合物が、ラセミ混合物と比較して、通常１つのより活性なおよび１つのより活性でないエナンチオマーから成ることが当該技術分野において公知である。よって、２つの鏡像異性体のうちの１つのみの利用は、化合物の全体的な効力を改善するために有利であることができる。

しかしながら、アトロプ異性体は、単結合周辺の回転障害だけに起因して生じる立体異性体であり、その利用は、一般に望ましくないとみられる。これらの異性体の安定性は、前記単結合周辺での回転に対する障壁を構築する立体歪または他の因子から結果として起こるエネルギー差に依存するので、とりわけ、アトロプ異性体は、薬物発見における障害と一般にみなされる。不斉炭素原子から結果として起こるキラル化合物と対照的に、アトロプ異性体状態は、容易に予測されることができない。とりわけ、容易にアトロプ異性体の安定性を予測することは、一般に可能ではない。とりわけ、前記エネルギー障壁の高さは、２つの対応するアトロプ異性体の相互転換の時間を決定する。対応する他のアトロプ異性体への生物活性アトロプ異性体の相互転換は、このように、その生物活性を減少させることができて、オフターゲットまたは他の不必要な効果を導入することができる。それゆえ、十分に高いエネルギー障壁を所有する安定なアトロプ異性体だけが、薬物発見において好適でもよい。

驚くべきことに、アトロプ異性体化合物１および化合物２が、それぞれの他のアトロプ異性体に、１０年より長い広範囲の期間の後さえ、（＞１０年の回転の半減期はコンピュータシュミレーションによって決定された）そして、室温を超える温度でさえ、大きく相互転換をしないことが分かった。

アトロプ異性体の逆転温度は、溶液中で１００℃を超えることとして評価された。このきわめて良好な安定性は、実験的に確認されてきた。それは、それらのアトロプ異性体を、容易に医薬適用、製造、製剤化のために好適とし、十分な保存期間を提供する。

化合物１の絶対構造は、（２Ｓ，３Ｓ）－ジベンゾイル－Ｄ－酒石酸塩に基づいて、ならびに固体形態Ａ２のＸ線回折から決定されており、それは、更に詳細に以下で記載されるだろう。化合物１の構造は、分光法（ＮＭＲ、ＭＳ、ＩＲ、およびＵＶ）、Ｘ線回折、元素分析、および旋光分析からの結果によって証明された。化合物１の１Ｈ－１３Ｃ－および１９Ｆ－ＮＭＲスペクトルは、図１～３において示され、ＵＶ－Ｖｉｓ－スペクトルは、図４において示される。化合物１の固体形態Ａ２のＸＲＰＤは、図１３に図示される。化合物－１－ジベンゾイル－Ｄ－タートラートの結晶構造およびＸＲＰＤは、図７ＡおよびＢにおいて示され、化合物－２－ジベンゾイル－Ｌ－タートラートの結晶構造は、図８に図示される。

化合物１および２は、ＡＴＭキナーゼのきわめて強力な阻害剤である。
表１により図示されたとおり、化合物１は、化合物１および２の混合物である化合物Ｙと比較して、すべてのアッセイにおいてＡＴＭ阻害の明らかに優れた値を有している：

さらに、前記化合物は、ｍＴＯＲ（＞３０，０００ｎｍ）、ＤＮＡ－ＰＫ、および、最も注目すべきことに、ＡＴＲを含む、関連したキナーゼにわたってさえ選択的である。驚くべきことに、化合物１および２の両方とも、化合物Ｙと比較してより強力でないＡＴＲキナーゼの阻害剤であり、すなわち選択性の観点からより有利である。

化合物２が、ＡＴＭ阻害が関する限り、化合物Ｙと異ならない一方で（ｓ．表１）、上記の表２から明白なとおり、それは、ＡＴＲおよびＤＮＡ－ＰＫの両方にわたってきわめて化合物Ｙより良好な選択性を有する。

本発明の化合物は、それゆえ、ＤＮＡ二本鎖の損傷を特異的に標的とする、特定のＤＮＡ修復機構、とりわけ相同性の遺伝子組換えに選択的に取り組むために、とりわけ有利に使用されることができる。

選択的ＡＴＭ阻害剤化合物１および２のさらなる利点は、毒性の軽減、とりわけオフターゲット効果に関して、および、このように、より高い化合物投薬量の忍容性である。それゆえ、本発明に従う化合物は、がん治療において、新しい可能性を開き、例えば、化合物１および２、最も好ましくは、化合物１は、標的とされた組み合わせ治療で使用されてもよく、例えば、強力なおよび選択的なＡＴＭ阻害剤および強力なおよび選択的な他の阻害剤（例えばＡＴＲ阻害剤）を含む。

概して、化合物１が、もっとも有利な、全体的な特性の組み合わせを有すると、わかった。驚くべきことに、それは、最良のＡＴＭを阻害する特性だけでなく、最良のミクロソームのクリアランス値および最も低いホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）２Ａ１ならびにＰＤＥ４Ａ１ＡおよびＰＤＥ４Ｄ２の阻害をも有する。ホスホジエステラーゼ阻害自体は、様々な薬理効果と関連し、そして、ＰＤＥ阻害剤は、ほんの少し例を挙げれば、うつ病、多発性硬化症、および慢性閉塞性肺疾患を含む多様な状況の処置のための医薬として利用可能であり、その全ては、この場合、オフターゲット効果を構成する。ＰＤＥ４阻害は、悪心を誘導する危険と関連し、したがって、回避されるべきことも公知である。それゆえ、高いＩＣ_５０値、すなわちこれらのオフターゲットの弱い阻害が、望ましい。以下の表３から明白な通りに、化合物１は、化合物Ｙのそれより約５倍高い因子であるＰＤＥ４阻害に関するＩＣ_５０値を有する。

表４は、約８０％の好都合に高い生物学的利用率およびＣＹＰおよびｈＥＲＧ（心臓イオンチャネル）に関して好ましい特性を含む、化合物１のさらなる有利なパラメータを図示し、後者は、心臓Ｋｖ１１．１ｈＥＲＧイオンチャネルとの安全性関連の相互作用が予想されないことを指し示す。

驚くべきことに、化合物１および２の両方が、化合物Ｙと比較して、生物学的緩衝液において有意に改善された溶解性を示すことが（下の表５を参照）、さらに分かった。化合物１の予測された遅いヒト血漿クリアランスおよび高い生物学的利用率は、適切な低い用量要件に寄与する。

化合物１または２に関して描かれる構造は、１以上の同位体濃縮原子の存在下でだけ異なる化合物を含むことを意味する。例えば、Ｈ、Ｃ、Ｎは、これらの原子のより重い同位体をそれぞれの場合においても含む。これは、とりわけＨに、ここで、重水素またはトリチウムが、有利に用いられることができるが、および本発明の範囲内でもある、１３Ｃまたは１４Ｃが豊富な炭素による炭素の置換に、適用される。特定の好ましい実施例において、同位体濃縮原子は、使用されず、その代わりに、原子は、同位体分布に関して、それらの天然に存在する形態において、使用される。

本発明に従う化合物または塩に対する言及は、溶媒和した形態、すなわちそれらの溶媒和物、それは遊離形態または塩の両方の媒和物を意味するが、それらも包含するとみなされるだろう。溶媒和物は、それらの相互の引力によって形成する化合物上の不活性溶媒分子の付加生成物を意味すると、とられる。溶媒和物は、例えば、モノ－または二水和物、または、アルコラートである。溶媒和物の例示的態様は、以下でさらに詳細に開示される。

上に提示されるとおり、本発明は、２つの安定なアトロプ異性体、化合物１および２を提供する。これらの２つのアトロプ異性体の調製は、後で詳しく述べるように、分離および精製技法に典型的に基づく。当業者は、これが、完全に純粋な生成物を産生しなくてもよいと、認識する。しかしながら、本発明は、化合物２が実質的にない化合物１および化合物１が実質的にない化合物２を提供する。本文脈における「実質的にない」は、実質的に純粋な化合物１が、化合物２またはその塩の多くても２０重量％、好ましくは、多くても１５重量％、より好ましくは、多くても１０重量％、例えば、多くても５重量％、多くても２．５重量％、多くても１重量％、多くても０．５％、または化合物２またはそれらの塩の多くても０．１重量％を含有してもよく、１００％に対する残りが、化合物１で構成されることを、好ましくは意味するだろう。

一の実施例において、実質的に純粋な化合物１は、９９重量％の化合物１および１重量％の化合物２からなってもよい。逆もまた同じく、化合物２に対しても同様であり、すなわち化合物１が実質的にない化合物２は、純粋な化合物２が、化合物１のために開示される好ましい範囲が、（逆もまた同じく）類似によって等しく適用できるとともに、化合物１またはその塩の多くても２０重量％を含有してもよいことを、好ましくは意味するだろう。また、化合物１またはその塩、それぞれ化合物２またはその塩に対する言及は、たとえ具体的に言及されなくとも、さもなければ明示的に記載されないとしても、さらに以下の本明細書に開示されたものなどのすべての溶媒和物および固体形態を含むだろう。

他の態様において、本発明は、不純物が実質的にない化合物１または２を提供する。本明細書に使用されるとき、用語「実質的に、不純物がない」は、該化合物が、異物のいかなる有意な量も、含有しないだろうことを意味する。かかる異物は、残留する化合物１またはその塩、残留する化合物２またはその塩、残留溶媒、または結果として化合物１または２の調製、および／または単離から生じてもよい他のいかなる不純物を、含んでもよい。ある態様において、化合物１は、わずか３０重量％の異物、化合物１によって構成される１００重量％に対する残りを、好ましくはわずか２５重量％、わずか２０重量％、わずか１５重量％、わずか１０重量％、わずか７．５重量％、わずか５重量％、わずか１重量％、わずか０．５重量％またはわずか０．１重量％含有してもよい。

同じ例示的態様は、類似によって、化合物２に有効である。また、前のとおり、化合物１またはその塩、それぞれ化合物２またはその塩に対する言及は、さもなければ明示的に記載されないとしても、さらに以下の本明細書に開示されたものなどのすべての溶媒和物および固体形態を含むだろう。

別の態様に従い、それぞれ化合物１または２は、ＨＰＬＣクロマトグラムの全面積と比較して、全有機不純物のわずか約５．０面積パーセントＨＰＬＣおよび、特定の態様において、全有機不純物のわずか約３．０面積パーセントＨＰＬＣおよび、特定の態様において、全有機不純物のわずか１．５面積パーセントＨＰＬＣを含有する。他の態様において、化合物１または２は、ＨＰＬＣクロマトグラムの全面積と比較して、いずれかの単一不純物のわずか約１．０面積パーセントＨＰＬＣ；いずれかの単一不純物のわずか約０．６面積パーセントＨＰＬＣ、および、特定の態様において、いずれかの単一不純物のわずか約０．５面積パーセントＨＰＬＣを含有する。実例として、ＨＰＬＣクロマトグラムのために、それぞれのアトロプ異性体の純度の分析のための例３．３において記載される方法は、使用されてもよい。あらためて、化合物１またはその塩、それぞれ化合物２またはその塩に対する言及は、特に明示的に記載されないとしても、さらに以下の本明細書に開示されたものなどのすべての溶媒和物および固体形態を含むだろう。

別の態様に従い、本発明は、化合物１またはその薬学的に許容し得る塩の有効量を含む医薬組成物を、提供する。代替態様において、医薬組成物は、化合物２またはそれらの薬学的に許容し得る塩の有効な量を含む。別の態様に従い、本発明は、本明細書に記載されるかかる組成物を調製する方法を提供する（例えば、化合物１または２どちらかの有効量を含むことができる組成物）。化合物１または２に対する言及は、それぞれの他のアトロプ異性体のいかなる量も、それぞれの他のアトロプ異性体が「実質的にない」、「不純物が実質的にない」、または不純物の全量のそれぞれの定義と調和してそれに達することができるように、すなわち別に存在するよりもむしろ、前述の化合物の量に加算されるように、本文脈において読みとられるだろう。同様が、それぞれの塩に対しても、適用される。前に掲示されるように、化合物１または２またはそれらの塩に対する言及は、特に明示的に記載されないとしても、さらに以下の本明細書に開示されたものなどのすべての溶媒和物および固体形態を含むだろう。例示的態様において、化合物１は、その遊離、すなわち非塩形態において医薬組成物中に含有される。

依然として他の態様は、本明細書に記載のとおり、化合物または組成物それぞれの医薬組成物またはその薬学的に許容し得る塩を使用して、がんを処置する方法を、提供する。別の態様によれば、本発明は、がんを処置するための薬物の製造における、本発明に従う化合物、その薬学的に許容し得る塩、または（医薬）組成物の使用を提供する。別の態様において、本発明は、本明細書に記載のとおり、薬物として使用するための、とりわけがんの処置のための、化合物または医薬組成物を提供する。あらためて、化合物またはその塩に対する言及は、特に明示的に記載されないとしても、さらに以下の本明細書に開示されたものなどの、それらの化合物または塩の、すべての溶媒和物または固体形態を含むだろう。

遊離形態および塩
本発明に従う化合物は、すなわち上の式で示すように、それらの遊離形態において使用されることができる。実例として、化合物１の遊離形態が、とりわけ有益であり、そして、その例示的な固体形態が、好ましい固体形態を含むことがわかり、以下により詳細に記載されるだろう。

他方で、本発明は、それらの薬学的に許容し得る塩の形でこれらの化合物の使用を包含し、それは、当該技術分野において公知の手順によって、様々な有機のおよび無機の酸から導かれることができる。本発明に従う化合物の好適な薬学的に許容し得る塩は、従来の方法によって調製されることができる。本発明に従う化合物は、例えばＴＨＦまたはアセトンなどの好適な溶媒中での、化合物および同等物または過剰な量の酸の反応により、つづく、このようにして形成された飽和溶液の冷却結晶化によって、酸を使用して、関連する酸付加塩に転換されることができる。あるいは、抗溶剤結晶化または蒸発結晶化が、用いられてもよい。

本発明に従う化合物の好適な薬学的に許容し得る塩の例、とりわけ化合物１は、ＨＣｌ塩、硫酸塩、トシル酸塩、ベシル酸塩、乳酸塩、とりわけＬ－乳酸塩を含む。
化合物１の好ましい塩は、フマラート塩、ナプシラート塩およびエジシラート塩を含み、それらは、以下の化合物１ａとしてまとめて称されてもよい。

化合物１のナプシラートは、ナフタレンスルホニック酸およびＴＨＦまたはアセトンのどちらかを溶媒として使用して、化合物１から、調製されることができる。良好な結晶化度が、得られた。化合物１：ナプシラートの好ましい比率は、約１：１である。

化合物１のエジシラートは、アセトンから冷却結晶化をして、エタンジスルホニック酸を使用して、得られることができる。化合物１：ナプシラートの好ましい比率は、約１：１である。良好な結晶化度が、得られた。

化合物１のフマラートは、抗溶剤としてｎ－ペンタンを、および酸としてフマル酸を使用して、ＴＨＦ中で抗溶媒蒸気拡散によって、得られることができる。化合物１：フマラートの比率は、約１：０．９であると示された。結果として生じる塩は、きわめて好ましい全体的な物理的特性および良好な結晶化度を有する。フマラート塩は、部分的には、望ましい吸湿性特性の非存在に起因する塩の間の、好ましい態様である。
本発明に従う化合物１のフマラート、ナプシラート、およびエジシラートの塩を調製する好適な方法の詳細な例は、例５において開示される。

化合物１のこれらの塩が、親化合物１より速い最初の溶解速度を示すことが、分かった。化合物１およびその特定の塩のＦａＳＳＩＦ緩衝液溶液（ｐＨ６．５）中のｎｏｎ－ｓｉｎｋ溶解挙動は、図９において例示的に描かれる。

有利な溶解挙動を伴う塩は、化合物１のエジシラート、化合物１のフマラート、および化合物１のナプシラートである。親化合物１は、様々な結晶および溶媒和物の形態の混合物の形で使用された。酸および化合物１からのアニオン性部分が、イオンによって結合され、化合物１－ａを形成することが、当業者によって認識される。化合物１－ａが、様々な物理的形態において存在することができることが、企図される。例えば、化合物１－ａは、溶液、懸濁液中で、または、固体形態において、あることができる。ある態様において、化合物１－ａは、固体形態にある。化合物１－ａが、固体形態にある場合に、前記化合物は、アモルファス、結晶、またはそれらの混合物でもよい。本明細書に使用されるとき、用語「多形体」は、化合物またはその塩が結晶することができる種々の結晶構造を、指す。

いくつかの態様において、化合物１－ａは、アモルファス化合物１－ａが実質的にない結晶固体である。本明細書に使用されるとき、用語「実質的に、アモルファス化合物１－ａがない」は、塩が、著しい量のアモルファス化合物１－ａを含有しないことを意味する。ある態様において、少なくとも約９０重量％の結晶性化合物１－ａが、存在し、または、少なくとも約９５重量％の結晶性化合物１－ａが、存在する。依然として本発明の他の態様において、少なくとも約９９重量％の結晶性化合物１－ａが、存在する。これらのパーセンテージは、化合物１－ａの絶対重量（１００重量％）と関連する。

例示の態様において、本発明は、実質的に図１０において描かれるものに合致する粉末Ｘ線回折パターンによって特徴づけられ、および／または、以下についてそれらから選択される、その粉末Ｘ線回折パターンにおける１以上のピークによって特徴づけられる、化合物１のフマラートの固体形態を提供する。

化合物１のフマラート塩は、無水である。その固体形態は、フマラート－ＮＦ６として称されてもよい。フマラート－ＮＦ６のＤＳＣ加熱曲線、ＴＧＡ加熱曲線、およびＤＶＳ水取り込み等温曲線（２５℃）は、図３１、３２、および３３において描かれる。ｎｏｎ－ｓｉｎｋ溶解測定からの結果は、下の表において提供される（ｐＨ６．５でのＦａＳＳＩＦにおけるｎｏｎ－ｓｉｎｋ溶解データ、実験的部分において記載される方法）：

本明細書に使用されるとき、用語「約」は、２－シータ値に関して使用される場合に、明示された値±０．３度２－シータ（°２θ）を指す。ある態様において、「約」は、±０．２度２－シータまたは±０．１度２－θ、もっとも好ましくは±０．２度２－シータを指す。

本明細書に記載のいずれかの固体形態の多形体は、それぞれ、ＸＲＤまたはＸＲＰＤピークの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上（°２θ）によって、特徴づけられてもよい。本明細書に記載のいずれかの固体形態の多形体は、それぞれ、少なくとも６ＸＲＤピーク（°２θ、好ましくは±０．２°２θ）によって、好ましくは特徴づけられる。固体形態の多形体の特徴づけのための好ましいピークは、それぞれ、それぞれのピークリストにおいて、太字の印字および星印で指し示される。

さらなる例示の態様において、本発明は、実質的に図１１において描かれるものに合致する粉末Ｘ線回折パターンによって特徴づけられ、および／または、以下についてそれらから選択される、その粉末Ｘ線回折パターンにおける１以上のピークによって特徴づけられる、化合物１のナプシラートの固体形態を提供する。

化合物１のナプシラート塩の熱および水吸着特性は、図３４、３５、および３６において図示される。ナプシラート塩に関して得られた固体形態は、ナプシラートＮＦ７として称されてもよい。さらにその上、溶解挙動は、以下の実験的ｎｏｎ－ｓｉｎｋ溶解データによって表される（ＦａＳＳＩＦ、ｐＨ６．５）：

さらなる例示の態様において、本発明は、実質的に図１２において描かれるものに合致する粉末Ｘ線回折パターンによって特徴づけられ、および／または、以下についてそれらから選択される、その粉末Ｘ線回折パターンにおける１以上のピークによって特徴づけられる、化合物１のエジシラートの固体形態を提供する。

化合物１のエジシラート塩の耐熱性および溶解データは、図３７、３８、および３９によって図示される。エジシラート塩の固体形態は、ＮＦ８として称されてもよい。それは、無水形態／塩である。ｎｏｎ－ｓｉｎｋ溶解データ（ＦａＳＳＩＦ、ｐＨ ６．５）は、下の表において提供される：

化合物１および２に関して上で掲示されたことと調和して、本発明は、化合物１－ａ、または実質的に化合物２またはその塩がない化合物１の他の塩を提供する。さらなる態様において、化合物１－ａまたは化合物１の別の塩は、実質的に不純物がなく提供される。別の態様によれば、化合物１－ａまたは化合物１の他のいかなる塩も、ＨＰＬＣクロマトグラムの全面積と比較して、全有機不純物のわずか５．０面積パーセントＨＰＬＣを、含有する。「実質的に化合物２またはその塩がない」、「不純物がない」、および全有機不純物の面積パーセントに関連して、化合物１のために上で開示される例示のおよび好ましい範囲は、ここで等しく適用できる。類似によって、同様が、本発明に従ういかなる化合物、および、とりわけアトロプ異性体の化合物のいかなる塩のいずれにも適用される。

別の態様に従い、本発明は、化合物１－ａの有効量を含む医薬組成物を、提供する。別の態様に従い、本発明は、本明細書に記載されるかかる組成物を調製する方法を提供する（例えば、化合物１－ａの有効量を含むことができる組成物）。依然として他の態様は、それぞれ本発明に従う化合物１－ａのその組成物を用いて、がんを処置する方法を提供する。別の態様に従い、本発明は、がんを処置するための薬物の製造において、本明細書に記載の組成物の使用を提供する。化合物１－ａは、化合物１に関して開示される同一量の（医薬）組成物中に、存在してもよい。組成物中の他のアトロプ異性体またはそれらの塩の存在に関して、それぞれ、化合物１のために上に掲示された考慮点は、類似によって等しく適用される。
固体形態および溶媒和物
別の側面に従い、本発明は、化合物１または２の、とりわけ化合物１の固体形態を提供する。

本発明に従う化合物が、様々な物理的形態において存在することができるとが、当業者によって認識されるだろう。例えば、それらは、溶液、懸濁液、または、固体形態であることができる。

特定の好ましい態様において、化合物１は、固体形態にある。それらが、固体の医薬組成物の提供を許すので、固体形態は、本明細書において一般に好ましい。化合物１が、固体形態にある場合に、前記化合物は、アモルファス、結晶、またはそれらの混合物でもよい。例示の化合物１の固体形態は、さらに詳細に下で記載される。

一態様に従い、本発明は、アモルファス固体として化合物１を提供する。
アモルファス固体は、当業者に周知であり、凍結乾燥、噴霧乾燥または衝突沈殿などの方法によって、典型的に調製される。
他の態様において、化合物１は、結晶質固体である。本明細書に使用されるとき、用語「多形体」は、化合物が結晶することができる種々の結晶構造を指す。

いくつかの態様において、化合物１は、アモルファス化合物１が実質的にない結晶固体である。本明細書に使用されるとき、用語「実質的に、アモルファス化合物１がない」は、化合物が、著しい量のアモルファス化合物１を含有しないことを意味する。ある態様において、少なくとも約９０重量％の結晶性化合物１が、存在し、または、少なくとも約９５重量％の結晶性化合物１が、存在する。依然として本発明の他の態様において、少なくとも約９９重量％の結晶性化合物１が、存在する。これらのパーセンテージは、化合物１の絶対重量（１００重量％）と関連する。必要な変更を加えて、同様が、塩、無水形態、溶媒和物、および他の形態のために本明細書に記載されたものを含む、本明細書に開示された、それぞれすべての化合物の多形体のいかなる結晶形態における許容されるアモルファス含有量にも、適用される。

一側面に従い、本発明は、化合物１の固体形態を提供し、それは、無水化合物１、好ましくは結晶性無水化合物１の固体形態である。無水化合物１の５つの異なる多形性形態は、本明細書に記載されている。無水形態および溶媒和物に関わるこの部分において記載される具体的な固体形態の文脈において、化合物１に対する言及は、化合物自体、すなわちその遊離（非塩）形態に対する言及として、理解されるだろう。

化合物１の第１の無水結晶形態が、以下において「形態Ａ２」として称され、そして、実質的に図１３において描かれるものに合致する粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）パターンによって特徴づけられる多形体であり、そして、高度に有利であるとわかった。

一態様に従い、形態Ａ２は、約７．３、約９．６、約１１．１、約１２．０、約１２．７、および約１６．２度２－シータでのものから選択される、その粉末Ｘ線回折パターンの１以上のピークによって、特徴づけられる。いくつかの態様において、形態Ａ２は、約７．３、約９．６、約１２．７、約１６．２、約２２．６、および約２５．１度２－シータのものから選択される、その粉末Ｘ線回折パターンの２以上のピークによって、特徴づけられる。ある態様において、形態Ａ２は、約７．３、約９．６、約１２．７、約１６．２、約２２．６、および約２５．１度２－シータのものから選択される、その粉末Ｘ線回折パターンの３以上のピークによって、特徴づけられる。ある態様において、形態Ａ２は、約７．３、約９．６、約１２．７、約１６．２、約２２．６、および約２５．１度２－シータのものから選択される、その粉末Ｘ線回折パターンのピークの４、５、または実質的に全てによって、特徴づけられる。特定の態様において、形態Ａ２は、約７．３、９．６、１１．１、１２．０、１２．７、１４．７、１６．２、１７．３、１８．９、２１．０、２２．６、および２５．１度２－シータのものから選択される、そのＸ線粉末回折パターンのピークの６以上、または実質的に全てによって、特徴づけられる。

例示の態様において、形態Ａ２は、以下についてのものから選択される、そのＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンのピークの１以上、好ましくは６、および実質的に全てまでによって特徴づけられてもよい：

上記の多形性形態が、例えば、そのそれぞれのＸ線回折（ＸＲＤ）パターンのピークのいずれかを参照することによって特徴づけられることができることは、いうまでもない。前に掲示されるように、太字の印字および星印は、多形体の特徴づけのために好ましくてもよいピークを明示する。

形態Ａ２は、上の表のＸＲＰＤピーク（°２θ）の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上によって、特徴づけられてもよい。本明細書に記載されるいかなる多形体も、少なくとも６のＸＲＤまたはＸＲＰＤピーク（°２θ、好ましくは±０．２）によって、好ましくは特徴づけられる。

形態Ａ２は、単斜晶系およびＰ２_１空間群を有する点で、任意に特徴づけられてもよい。形態Ａ２は、以下の表において掲示されるように、その単位格子の以下のパラメータの１以上によってさらに特徴づけられてもよい：

化合物１の形態Ａ２は、（図２２）のＤＳＣ加熱曲線、ＴＧＡ加熱曲線（図２３）、およびＤＶＳ水取り込み等温曲線（２５℃での）（図２４）によって図示されるように、その熱および水取り込み挙動からさらに明白なように、好ましい全体的な特性を、有する。形態Ａ２は、例えば、１００％の相対湿度までさえ、きわめて少ない水（＜２％）を吸着して、このように、形態Ａ３より優れている。

形態Ａ２の別の利点は、種々の期間においてにおいて溶解される形態Ａ２の化合物１の量を表す、以下の表において図示されるように、その好ましい溶解挙動である（ｐＨ６．５でのＦａＳＳＩＦのｎｏｎ－ｓｉｎｋ溶解データ、実験的部分において記載された方法）：

形態Ａ２は、一例をあげると、アルコールからの冷却結晶化によって、化合物１から得られることができる。好適な方法および反応条件は、例７において詳細に記載されている。
実例として、好ましい特性を有する形態Ａ２の結晶は、以下を含む制御された結晶化プロセスによって、再現性よく調製されることができる：
ａ）好適な溶媒、例えばアルコール中で、化合物１、例えば化合物１の水和物の形態Ｈ２などの、化合物１の水和物の分散体を調製すること、
ｂ）分散体を加熱して、溶液、好ましくは透明な溶液を得ること、
ｃ）前記溶液を制御冷却すること；
ｄ）形態Ａ２の種結晶を加えること、
ｅ）種結晶を伴う溶液を、実例として約０．１℃／ｍｉｎの速度で、制御冷却すること。

好適なアルコールおよび温度などの結晶化条件は、例７．１～７．３に由来することができ、それは、特定の態様を越えて適用できる。本発明は、形態Ａ２の無水、結晶性化合物１にさらに関係し、それは、上のプロセスまたは例７．１～７．４に記載されるプロセスのいずれかに実質的に合致して、入手できる。

化合物１のさらなる無水結晶形態が、以下において「形態Ａ１」として称され、そして、実質的に図１４において描かれるものに合致する粉末Ｘ線回折パターンによって特徴づけられる多形体である。その調製のための好適な方法は、例７において記載されている。

形態Ａ１は、以下についてのものから選択される、そのＸ線粉末回折パターンのピークの１以上、好ましくは６、および実質的に全てまでによって特徴づけられてもよい：

化合物１の形態Ａ１の熱による特性は、図２５および２６にて図示したとおり、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）および熱重量分析（ＴＧＡ）によって評価された。

化合物１の第３の無水結晶形態が、以下において「形態Ａ３」として称され、そして、実質的に図１５において描かれるものに合致する粉末Ｘ線回折パターンによって特徴づけられる多形体である。その調製のための好適な方法は、例７において記載されている。

形態Ａ３は、以下についてのものから選択される、そのＸ線粉末回折パターンのピークの１以上、好ましくは６、および実質的に全てまでによって特徴づけられてもよい：

図２７から明白なとおり、化合物１の形態Ａ３は、約７０％の相対湿度まで、きわめて少ない水吸着を示す。形態Ａ３は、下の表７において掲示されるとおり、結晶系および単位格子パラメータによって、任意にさらに特徴づけられてもよい。形態Ａ３における化合物１のｐＨ６．５でのＦａＳＳＩＦ中のｎｏｎ－ｓｉｎｋ溶解データは、下の表において与えられる：

化合物１の第４の無水結晶形態が、以下において「形態ＮＦ９」として称され、そして、実質的に図１６において描かれるものに合致する粉末Ｘ線回折パターンによって特徴づけられる多形体である。その調製のための好適な方法は、例７において記載されている。

形態ＮＦ９は、以下についてのものから選択される、そのＸ線粉末回折パターンのピークの１以上、好ましくは６、および実質的に全てまでによって特徴づけられてもよい：

さらなる態様において、本発明は、化合物１の水和物、好ましくは化合物１の水和物の固体形態、好ましくは結晶性の化合物１の水和物を提供する。それぞれ化合物１の水和物の多形形態の２つの異なる水和物が、本明細書に記載されている。上記のとおり、これらの具体的な固体形態の文脈で、化合物１に対する言及は、化合物自体、すなわちその遊離（非塩）形態に対する言及として、理解されるだろう。

化合物１の水和物の第１の結晶形態が、以下において「形態Ｈ１」として称され、そして、実質的に図１７において描かれるものに合致する粉末Ｘ線回折パターンによって特徴づけられる多形体である。その調製のための好適な方法は、例７において記載されている。

形態Ｈ１は、以下についてのものから選択される、そのＸ線粉末回折パターンのピークの１以上、好ましくは６、および実質的に全てまでによって特徴づけられてもよい：

化合物１の水和物の第２の結晶形態が、以下において「形態Ｈ２」として称され、そして、実質的に図１８において描かれるものに合致する粉末Ｘ線回折パターンによって特徴づけられる多形体である。その調製のための好適な方法は、例７において記載されている。

形態Ｈ２は、以下についてのものから選択される、そのＸ線粉末回折パターンのピークの１以上、好ましくは６、および実質的に全てまでによって特徴づけられてもよい：

結晶形態Ｈ２の化合物１の水和物は、三斜晶系およびＰ１空間群を有する点において、任意に特徴づけられてもよい。形態Ｈ２は、下の表７において掲示されるとおり、その単位格子の以下のパラメータの１以上によって特徴づけられてもよい：

形態Ｈ２の熱および水吸着特性は、図２８、２９、および３０によって図示される。化合物１の形態Ｈ２に関するＦａＳＳＩＦ（ｐｈ ６．５）中のｎｏｎ－ｓｉｎｋ溶解データは、以下のとおり、決定された：

無水の化合物１の第５の結晶形態が、以下において「形態ＮＦ１９」として称され、そして、実質的に図１９において描かれるものに合致する粉末Ｘ線回折パターンによって特徴づけられる多形体である。その調製のための好適な方法は、例７において記載されている。

形態ＮＦ１９は、以下についてのものから選択される、そのＸ線粉末回折パターンのピークの１以上、好ましくは６、および実質的に全てまでによって特徴づけられてもよい：

または別の方法では、固体形態Ａ１、Ａ３、Ｈ１、およびＨ２は、表７の下に掲示されているとおり、ａ、ｂ、ｃ、a、b、g、およびＶから選択される特定の結晶系、空間群、および／または単位格子パラメータを有することによって、特徴づけられてもよい。

本発明は、以下の溶媒和物の形態にも関係し、それが、それぞれの溶媒から結晶化によって容易に作成されることができるが、上記の形態と比較して、重要な特性に関してかなりより有利でないとわかってきた：化合物１のメタノラート（Ｓ１として称される固体形態）、化合物１の混合の水和物／メタノラート（Ｓ２として称される固体形態）、化合物１のＴＨＦ溶媒和物（Ｓ３として称される固体形態）、無数の固体形態における化合物１の１，４－ジオキサン溶媒和物の形態（ＮＦ１１として称される固体形態［室温での、１，４－ジオキサン中～２６ｍｇ／２００μＬでの無水形態のスラリー変換実験からの］、ＮＦ２９［１，４－ジオキサン中での冷却結晶化実験５０～５℃からの］、ＮＦ３６［室温での１，４－ジオキサン中～５２ｍｇ／１５０μＬでの無水形態のスラリー変換実験から］、化合物１のクロロホルム溶媒和物（ＮＦ１５として称される固体形態）、様々な固体形態の化合物１の酢酸溶媒和物の形態（ＮＦ１６として称される固体形態［室温での酢酸中蒸発結晶化実験からの］、ＮＦ１８［酢酸中５０℃での蒸発結晶化実験からの）、化合物１のジクロロメタン（ＤＣＭ）溶媒和物（ＮＦ３２として称される固体形態）、化合物１のＮＭＰ（Ｎメチル－２‐ピロリドン）溶媒和物（ＮＦ３３として称される固体形態）、化合物１のアセトニトリル溶媒和物（ＮＦ３５として指される固体形態）、化合物１のジメチルアセトアミド（ＤＭＡＡ）溶媒和物（ＮＦ３７として称される固体形態）。これらの溶媒和物の固体形態のＸＲＰＤは、図４０～５２において示され、対応するピークが以下の表にリストされる：

別の態様に従い、本発明は、形態Ａ２、それは好ましい固体形態であるが、それにおける化合物１の有効量を含む医薬組成物を提供する。別の態様に従い、本発明は、本明細書に記載のかかる医薬組成物を調製する方法を提供する（例えば、形態Ａ２における化合物１の有効量を含む医薬組成物）。依然として、別の態様は、本明細書に記載された形態Ａ２における化合物１の有効量を含有する医薬組成物を使用する、がんを処置する方法を、提供する。別の態様に従い、本発明は、がんを処置するための薬物の製造における形態Ａ２における化合物１の使用を提供する。さらなる態様において、本発明は、薬物としての使用のための、好ましくはがんの処置のための、形態Ａ２を提供する。上で掲示されたことと調和して、化合物１に関して開示された例示的態様、範囲、純度等々が、形態Ａ２のために等しく有効である。

別の態様に従い、本発明は、上記のとおり、無水の化合物１または化合物１の水和物の固体形態のいずれか１つにおいて、化合物１の有効量を含む医薬組成物を、提供する。別の態様に従い、本発明は、本明細書に記載のかかる医薬組成物を調製する方法を提供する（例えば、それらの固体形態の１つにおける化合物１の有効量を含む医薬組成物）。依然として、別の態様は、本明細書に記載された固体形態の１つにおける化合物１の有効量を含有する医薬組成物を使用する、がんを処置する方法を、提供する。別の態様に従い、本発明は、がんを処置するための薬物の製造における、本明細書に記載の固体形態における化合物１の使用を提供する。さらなる態様において、本発明は、薬物としての使用のための、好ましくはがんの処置のための、本明細書に記載された化合物１の固体形態を提供する。上で掲示されたことと調和して、化合物１に関して開示された例示的態様、範囲、純度等々が、固体形態のために等しく有効である。

本発明は、本明細書に記載のとおり、無水の化合物１または化合物１の水和物の固体形態に関し、それは、例７において記載された方法に従い得られるかまたは得ることができる。

重水素化の態様
さらなる側面に従い、本発明は、化合物Ｙの重水素化誘導体を提供する。一態様に従い、本発明は、以下を提供する：
・８－（１，３－ジメチルピラゾール－４－イル）－１－［３－フルオロ－５－（トリジュウテリオメトキシ）－４－ピリジル］－７－メトキシ－３－（トリジュウテリオ－メチル）イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オン（化合物３）および、

・１－［３－フルオロ－５－（トリジュウテリオメトキシ）－４－ピリジル］ －７－メトキシ－３－メチル－８－［３－メチル－（トリジュウテリオ－メチル）ピラゾール－４－イル］イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オン （化合物４）、

・８－（１，３－ジメチルピラゾール－４－イル）－１－［３－フルオロ－５－（トリジュウテリオメトキシ）－４－ピリジル］－７－メトキシ－３－メチル－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オン（化合物５）、ならびにそれらの塩。
化合物３、４、および５は、以下の式によって表される：

他の態様において、本発明は、アトロプ異性体３－ａ、３－ｂ、４－ａ、４－ｂ、５－ａ、および５－ｂを提供する：

またはそれらの塩。

化合物１および２に関して上で掲示されたことと調和して、本発明は、それらのいかなる塩も含む、それぞれの他のアトロプ異性体が実質的にない、化合物４－ａ、５－ａ、６－ａ、４－ｂ、５－ｂ、６－ｂも、提供する。さらなる態様において、これらの化合物は、実質的に不純物がなく提供される。別の態様に従い、これらの化合物は、ＨＰＬＣクロマトグラムの全面積と比較して、全有機不純物のわずか５．０面積パーセントＨＰＬＣを、含有する。「実質的に化合物２またはその塩がない」、「不純物がない」、および全有機不純物の面積パーセントに関連して、化合物１のために上で開示される例示のおよび好ましい範囲は、それぞれの化合物の対応する他のアトロプ異性体に関して、ここで等しく適用できる。

別の態様に従い、本発明は、少なくとも１つの化合物３、４、または５、それらのアトロプ異性体または薬学的に許容し得る塩の有効量を含む医薬組成物を、提供する。別の態様に従い、本発明は、本明細書に記載された、かかる医薬組成物を調製する方法を、提供する。依然として、別の態様は、本明細書に記載された医薬組成物を使用する、がんを処置する方法を提供する。別の態様に従い、本発明は、がんを処置するための薬物の製造において、本明細書に記載の組成物の使用を提供する。化合物１に関する上記の例示のおよび好ましい態様は、これらの化合物に等しく適用できる。

調製
本発明に従う化合物１および２は、化合物Ｙから出発して調製されることができ、その化合物は、以前に記載されていた。ＷＯ２０１６／１５５８８４中に開示されたとおり、８－（１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）１－（３－フルオロ－５－メトキシピリジン－４－イル）７－メトキシ－３－メチル－１，３－ジヒドロイミダゾキノリン－［４，５ｃ］２－オン（化合物Ｙ）は、以下の反応系列に従い調製されることができる：

これらのステップａ～ｅのそれぞれに関する例示の反応条件は、出発化合物を得る方法であるとして、例１において与えられる。他の好適な反応条件は、当業者に容易で明白である。
化合物１および２は、化合物Ｙからの分離の好適な方法によって、次いで得られることができ、それの例示的態様は、例１、２、および３において提供される。

アトロプ異性体は、超臨界流体クロマトグラフィ（ＳＦＣ）を含むキラルクロマトグラフィーを使用して、化合物Ｙから出発して、分離されてもよい。好適な方法の例は、詳細に例１および３において記載されている。

それぞれの望ましくないアトロプ異性体は、ラセミ化、例えば熱ラセミ化に、付されることができ、１例として下に略図で例示するとおり、新しい出発材料として、化合物Ｙを産生する。

代替態様において、化合物１および２は、光学活性酸、例えばジベンゾイル酒石酸を使用して、結晶化によって化合物Ｙから出発して、調製されることができる。光学活性酸を伴う化合物Ｙの反応は、一対のアトロプ異性体塩を与える。化合物１および２のこれらの塩は、種々の物理化学的特性（例として溶解性、相分布）を呈し、そしてこれらの違いの利点をとることによって、分離されることができる。

下のスキームにより図示されるとおり、一態様において、化合物Ｙは、光学活性酸と反応し、母溶液中で２つの塩の混合物を産生し、化合物２の塩（Ｌ－塩Ｂ）が最初沈殿し、ろ過によって取り除かれ、化合物１の対応する塩（Ｌ－塩Ａ）が、さらなる母溶液の濃縮及び沈殿のあとのみに回収されることを伴う。

化合物１の塩は、次いでまずその遊離形態に転換され、単離され、そして次いで該酸の対応する他の光学活性形態と反応して、化合物１の対応する塩を与え、それは、これに続くステップにおいて、高い光学純度を伴う遊離塩基に転換される。一方、化合物２は、ラセミ化に付されてもよく、新鮮な出発材料として化合物Ｙを与える。

好適な調製スキームの詳細な例は、例２および図６において提供される。本発明に従う重水素化合物３、４、および５は、例６において詳細に記載されているとおり、調製されることができ、およびアトロプ異性体、塩、溶媒和物、および固体形態は、実質的に化合物１および２のものとして調製されることができる。

使用
以下において、「本発明に従う化合物」に対するいかなる一般的な言及も、化合物１または２、またはその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、または固体形態を含む、本発明の化合物のすべての態様に適用されることを意味するだろうし、そして、化合物１または２、またはその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、またはそれらの固体形態として読みとられることができる。同じく、本発明に従う重水素化合物に対するいかなる言及も、化合物３、４、または５だけでなく、前述のいかなるアトロプ異性体、塩、または固体形態も含むだろう。

本発明は、それらのアトロプ異性体、薬学的に許容し得る固体形態、溶媒和物、および塩、ならびにＡＴＭキナーゼのシグナリングカスケードの阻害、制御、および／または調節のための、重水素ＡＴＭ阻害剤、そのアトロプ異性体、および薬学的に許容し得る塩も包含し、このように調査および／または診断のための新規なツールを提示する。本発明は、それゆえさらにその上、本発明に従う化合物の使用に、関し、ＡＴＭキナーゼの阻害のためにそれらの重水素化形態を含む。用語「阻害」は、後者が、認識、結合、およびブロッキングが可能となるように、標的分子と相互作用することができるという点で、本発明に従う特定の化合物の作用に基づく活性におけるいかなる低下にも、関する。化合物は、高親和性によって、ＡＴＭキナーゼと区別される。化合物は、さらにその上高度に選択的であり、このように、実質的に独占的に、および直接、ＡＴＭキナーゼの認識を可能にする。調査および／または診断における使用に関して、実例としてアッセイにおける使用に関して、重水素化合物、すなわち化合物３、４、あるいは５、または、それらのアトロプ異性体、または塩または固体形態は、有用であると考えられる。

本発明は、ＡＴＭキナーゼの活性によって引き起こされ、媒介され、および／または伝播される疾患の処置において、重水素化合物を含む、本発明に従う化合物の使用を一般に包含する。
本発明は、それゆえ、薬物としての使用のための、重水素化合物を含む、本発明に従う化合物に、広く関する。

本発明は、それゆえ、ＡＴＭキナーゼの活性によって引き起こされ、媒介され、および／または伝播されるいずれかの疾患の処置における使用のための、重水素化合物を含む、本発明に従う化合物にも関する。本発明は、対応して、ＡＴＭキナーゼの活性によって引き起こされ、媒介され、および／または伝播されるいずれかの疾患の処置のための薬物の調製のための本発明に従う、重水素化合物を含む、化合物使用にも関する。換言すれば、本発明は、ＡＴＭキナーゼの阻害によって影響を受ける疾患の処置における使用のための、水素化合物を含む、本発明に従う化合物も開示する。

加えて、本発明に従う化合物または重水素化合物は、動物および／または細胞培養モデルにおける、または、本出願に記載の臨床疾患における、キナーゼ－依存シグナリング経路を試験するための試薬として、使用されることもできる。本明細書に述べられるとおり、これらのシグナリング経路は、様々な疾患に関連がある。

本発明は、がんおよび／または腫瘍の処置における使用のための；および、がんおよび／または腫瘍の処置のための薬物調製におけるそれらの使用への、それらの薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、固体および重水素化形態を含む、本発明に従う化合物にも関する。

本発明は、がんまたは腫瘍の処置のための方法を、さらにその上教示し、発明に従う少なくとも１つの化合物、またはそれらの薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、重水素化または固体形態の有効量が、処置される対象に投与される。本発明の意味における好ましい対象は、ヒトまたは動物（とりわけ好ましくはヒト）である。

がん／腫瘍は、とりわけ、扁平上皮、膀胱、胃、腎臓、頭部、頸部、食道、子宮頸部、甲状腺、腸、肝臓、脳、前立腺、尿生殖路、リンパ系、喉頭、肺、皮膚、血液および免疫系のがん／腫瘍の群から選択されてもよく、および／または、がんは、単球性白血病、肺腺がん、小細胞肺がん、非小細胞性肺がん、膵がん、結腸直腸がん、胃がん、乳がん、卵巣がん、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫の群から選択されてもよい。がん細胞の感作が、上記と同じがんおよび腫瘍の細胞を包含することが、理解されるべきである。
本発明は、本発明に従う化合物および／またはそれらの薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、重水素化または固体形態を含む薬物にも、関する。

本発明はさらにその上、任意に少なくとも１つの薬学的に許容し得る賦形剤と共に、本発明に従う化合物、および／またはそれらの薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、重水素化または固体形態の治療有効量を含む医薬組成物に、関する。

「薬物」および「医薬組成物」は、好ましくはがんおよび／または腫瘍の結果として、少なくとも一時的に、罹患生物の全体的な状況または個々の部分の状況の病原性変更を呈する患者の処置において、用いられることができるいかなる組成物も意味すると、とられるべきである。本発明に従う化合物のそれぞれの医薬組成物の、細胞または生物の中への送達は、応答が、誘導される結果として、ＡＴＭキナーゼを医薬組成物中に存在する化合物と接触させることを可能にする、いかなるやり方における発明に従っても、実行されることができる。

本発明の医薬組成物は、経口的に、経皮的に、経粘膜的に、経尿道的に、経膣的に、経直腸的に、経肺的に、経腸的に、および／または非経口的に投与されることができる。選択されるタイプの投与は、適応症（とりわけ投与された、個体具体的なパラメータ等々である用量）、次第である。そして、投与の様々なタイプは特定地域向けの治療を促進してもよい。そして、それは副作用を最小にして、活性化合物用量を短縮する。注射は、皮内でも、皮下でも、筋肉内でも、または静脈内でもよい。投与は、例えば、いわゆるワクチン接種ガンを用いて、または、シリンジによって、実行されることができる。エアロゾルとして物質を提供することも可能であり、それは、生物、好ましくはヒト患者によって吸入される。

好ましい態様において、本発明に従う化合物（それらの形態のいずれかにおいて）は、経口的に投与される。経口投与は、患者コンプライアンスに関して好ましい。それゆえ、医薬組成物は、好ましくは経口の固体の医薬組成物である。

良好な安定性および高い生物学的利用率に起因して、それらが、経口の固体投与形態への製剤化に、容易に役に立つことが、本発明に従う化合物、とりわけ化合物１および２およびそれらの固体形態、とりわけ化合物１およびその固体形態それぞれの利点である。

組成物
本発明に従うそれぞれ組成物、医薬組成物は、好適な投薬量における、そして、それ自体公知のやり方における、所望される投与のタイプに対応する従来の固体のまたは液体の賦形剤を使用して、調製されてもよい。よって、当業者に公知の薬学的に許容し得る賦形剤は、本発明に従う医薬組成物の部分を基本的に形成することができ、ここで、単一用量を調製するために活性化合物と組み合わせられる賦形剤の量が、用量および投与のタイプに応じて変化する。かかる薬学的に許容し得る賦形剤は、充填剤、安定剤、錯化剤、酸化防止剤、溶媒、結合剤、滑沢剤、塩、緩衝液、防腐剤、調節装置などを含む。このタイプの賦形剤の例は、水、植物油、ベンジルアルコール、アルキレングリコール、ポリエチレングリコール、コリフォール、グリセロールトリアセテート、ゼラチン、炭水化物、例えば、ラクトースまたはデンプンなど、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ステアリン酸マグネシウム、タルク、およびワセリンである。

上記のとおり、本発明の医薬組成物は、経口投与のために好ましい。医薬組成物は、一般にタブレット、フィルムタブレット、糖衣剤、トローチ剤、カプセル、ピル、粉末、顆粒、シロップ、ジュース、ドロップ、溶液、分散体、懸濁液、坐剤、乳剤、植込錠、クリーム、ゲル、軟膏、ペースト、ローション剤、血清、オイル、スプレー、エアロゾル、接着剤、硬膏剤、または絆創膏の形であることができる。経口投与の形態は、好ましくはタブレット、フィルムタブレット、糖衣剤、トローチ剤、カプセル、ピル、粉末、顆粒、シロップ、ジュース、ドロップ、溶液、分散体、または懸濁液である。

さらにその上、非経口医薬組成物、例えば、坐剤、懸濁液、乳剤、植込錠、または溶液などは、好ましくはオイル状であるか、水性溶液でもよいと考えられる。局所適用のために、本発明に従う化合物は、皮膚に適用されることができる組成物、例えば、クリーム、ゲル、軟膏、ペースト、粉末、または乳剤を与えるために、または皮膚に適用されることができる液状製剤、例えば、溶液、懸濁液、ローション剤、血清、オイル、スプレー、またはエアロゾルを与えるために、少なくとも１つの薬学的に許容し得る賦形剤、例えば、微結晶性セルロースなど、および任意にさらなる助剤、例えば、モイスチャライザーと、従来の方法で製剤化されてもよい。医薬組成物は、注射溶液の形であることもできる。注射溶液の調製のために、水性媒体、例えば、蒸留水または生理的塩溶液などは、使用されることができる。

医薬組成物は、固体の組成物の形、例えば凍結乾燥された状態で提供されてもよく、および、溶解剤、例えば、蒸留水または緩衝液などの添加をとおした注射による投与のために、次いで調製されてもよい。当業者は、凍結乾燥物の調製の基本原理に精通している。

少なくとも１つの薬学的に許容し得る賦形剤を含有する医薬組成物における、本発明に従う化合物の量は、０．１～１００重量パーセントであることができる。医薬組成物が化合物の有効量、任意に１以上の薬学的に許容し得る賦形剤と共に含むことが重要である。単純な医薬組成物は、堅いゼラチンカプセル中の、粉末などの固体形態における、本発明に従う化合物でもよい。用語「有効量」または「有効な用量」は、交換可能に本明細書に使用され、細胞、組織、臓器、または哺乳動物における疾患または病理学的変化、好ましくはがんおよび／または腫瘍に対して、治療的に関連のある効果を有する、本発明に従う化合物の量を、示す。

本発明に従う化合物の「治療有効量」は、必要な投薬量および期間で、ＡＴＭｉ調節又は依存状況、好ましくはがんを伴う患者に投与される場合に、意図された治療効果、例として、患者におけるがんのそれぞれの状況の１以上の出現の緩和、改善、緩和、または除去、または患者を処置する間のいずれかの他の臨床結果を有するだろう、有効な量を指す。治療的に有効は、１つの用量の投与によって必ずしも発生するというわけではなく、そして、一連の用量の投与の後のみ発生してもよい。よって、治療有効量は、１以上の投与において投与されてもよい。かかる治療有効量は、個体においての所望された応答を引き出すために、単独でまたは組み合わせて、疾患状態、年齢、性、および個体の重量、および本発明に従う化合物の能力などの因子に従い、変化してもよい。治療有効量は、本発明に従う化合物のいかなる有毒または有害作用も、治療的に有益な効果によって、上回られるものでもある。

本発明の態様において、本発明に従う化合物（または塩、溶媒和物、重水素化、または固体の）は、投与単位当たり５ｍｇ～１ｇ、例えば投与単位当たり１０と７５０ｍｇの間、投与単位当たり２０と５００ｍｇの間など、単位当たり２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、または３５０ｍｇなどの用量で、投与される。化合物１のための生物学的有効用量は、２５～３５０ｍｇｑｄの範囲であるべきであると推計された。

本発明の化合物は、それらの驚くほど強いおよび／または選択的な、二本鎖ＤＮＡの修復を介して細胞のプロセスを規制するＡＴＭキナーゼの阻害により、有利に低い用量において投与されることができ、その一方で、それらは、より強力でないかより選択的でない阻害剤と比較して、同程度であるかさらに優れた生物学的有効性を、達成する。減少された用量は、減少された医学的な副作用と、典型的に関連する。加えて、高度に選択的な阻害は、一般に望ましくない副作用の減少によっても、反映される。

状況または患者を「処置すること」または「処置」は、臨床結果を含む、有益であるか所望された結果を得るために、ステップを取ることを指す。本発明の目的を達成するために、有益であるか所望された臨床結果は、処置されるべき疾患の１以上の症状、最も好ましくはがんの緩和、改善；疾患の範囲の減少；疾患進行の遅延または減速；疾患状態の改善、緩和、または安定化；または、他の有益な結果を含むが、これに限定されない。「処置すること」または「処置」の言及は、予防ならびに状況の確立された症状の緩和を含むと、認識される。状態、障害または状況を「処置すること」または「処置」は、それゆえ以下を含む：（１）状態、障害、または状況に悩まされるかその素因があるが、状態、障害、または状況の臨床または不顕性症状をまだ経験してないか呈していない対象において進展する状態、障害、または状況の臨床症状の出現を防御するかまたは遅延させること、（２）状態、障害、または状況を抑制すること、すなわち、疾患の進展またはそれらの再発（維持処置の場合）またはそれらの少なくとも１つの臨床または不顕性症状を抑えるか、減少させるか、または遅延させること、または（３）疾患を軽減するかまたは減弱化すること、すなわち、状態、障害、または状況またはその臨床または不顕性症状の少なくとも１つの退行を引き起こすこと。ある態様において、「処置すること」は、（１）および（２）を含む。

「腫瘍」はそれと診断されるか、またはそれを有すると疑われる対象に適用され、がんは、悪性であるか潜在的に悪性の新生物またはいかなるサイズの組織塊を指し、１次腫瘍および２次新生物を含む。固形腫瘍は、通常嚢胞または液体領域を含有しない組織の、異常成長または塊である。固形腫瘍の種々のタイプは、それらを形成する細胞のタイプに関して命名される。固形腫瘍の例は、肉腫、癌腫、およびリンパ腫である。白血病（血液のがん）は、固形腫瘍を一般に形成しない。

患者に対して化合物を「投与すること」または「投与」（およびこの句の文法上の同等物）は、直接投与を指し、それは、医療専門家による患者に対する投与でもよいか、または自己投与、および／または間接的な投与でもよく、それは、薬物を処方する行為でもよい。例として、患者に薬物を自己投与するように指示するかまたは薬物の処方を患者に提供する医師は、本発明の文脈において、患者に薬物を投与するとして、みなされる。

上記の全て、およびさらなる賦形剤、または薬物または医薬製剤の他の構成要素は、当業者になじみがあり、ルーチン実験において本発明に従う教示のための特別な製剤を経てもよい。

組み合わせ治療
本発明に従う化合物を含む薬物および医薬組成物、およびキナーゼ媒介障害の処置のためのこれらの化合物の使用は、とりわけ、がんの処置のためのきわめて有望なアプローチである。本発明に従う化合物は、単独治療として、しかし、好ましく上で概説のとおりように、他の治療、例えば、化学－または放射線治療と組み合わせて投与されてもよい。上で掲示のとおり、化合物への言及は、それらのいかなる塩、溶媒和物、重水素化または固体の形態も含む。

ＤＮＡ修復プロセスにおけるＡＴＭの鍵となる関与、およびＡＴＭキナーゼ不足が、哺乳動物細胞をより放射線感受性になるのを許すという証拠は、照射治療および／または化学治療によって、がん、例えば、固形腫瘍の処置の一部としてのＡＴＭ特異的阻害剤の治療の使用を可能にし、化学治療は、好ましくはＤＮＡ二本鎖の損傷の誘導に、照準を定められる。前に説明のとおり、ＡＴＭは、治療誘導ＤＳＢの修復を阻害するために、魅力的な介入である。ゆえに、本発明に従う化合物は、それらの形態のいずれにおいても、放射線治療および／またはＤＮＡ損傷化学治療と組み合わせることにおいて、きわめて有利である。

従って、本発明は、本発明に従う化合物および放射線治療（ＲＴ）の組み合わせに関する。従って、本発明は、放射線治療と組み合わせた、がんおよび／または腫瘍の処置における使用のための、本発明の化合物、またはそれらの薬学的に許容し得る塩または固体形態に関する。異なって表現すると、本発明は、放射線治療と組み合わせた、がんおよび／または腫瘍を処置するための薬物の調製のための、本発明に従う化合物、またはそれらの薬学的に許容し得る塩または固体形態の使用、およびこのように、放射線治療と組み合わせた、本発明に従う化合物、またはそれらの薬学的に許容し得る塩または固体形態を投与することに関わる、がんを処置する方法に、関する。本発明は、それぞれ電離放射線、放射線治療（ＲＴ）に対してがん細胞の感度を高めることにおいて使用するための、本発明に従う化合物、またはそれらの薬学的に許容し得る塩または固体形態に、さらに関する。

化合物１は、臨床的に関連のある放射線スケジュールと組み合わせて（すなわち放射線治療）、ｉｎ ｖｉｖｏで著しい用量依存的抗腫瘍応答につながることが、示されてきた。例８および図２０は、達成された結果の詳細を提供する。

好適な投与レジメは、一例をあげると、１週にわたり５画分（画分日当たりに３Ｇｙ与えられる）において与えられる１５グレイ（Ｇｙ）のＲＴの投与（すなわち、５日連続オン、続いて２日間なし）、および、同日に、本発明に従う化合物の経口的投与に関わってもよく、そして、それは少なくとも一回繰り返されてもよい。

好ましくは臨床的に使用される工業上の照射方法は、光子照射（古典的、電磁Ｘ線／ガンマ放射線）、プロトン照射、重－イオン照射（イオン化炭素）、および中性子照射を含むが、それらに限定されない。本発明の意味におけるこれらの放射線治療および他の好適な照射治療は、例えばHerrmann et al. (2006) Klinische Strahlenbiologie [Clinical Radiation Biology], Elsevier Munich, 4th Edition, 67-68; Bhide & Nutting (2010) BMC Medicine 8: 25; Choi & Hung (2010) Current Urology Reports 11(3): 172などから、当業者に、公知であり、その全体が、ここに参照によって本明細書に組み込まれる。最も頻繁な適用として、光子照射は、ＩＭＲＴ（強度－調節放射線治療）方法によって、および、照射計画における画像化方法（三次元原体照射）および可能な最も精密な焦点化法のための性能によって、技術的に洗練された。

さらなる側面に従い、本発明は、以下の本発明に従う化合物およびＤＮＡ－損傷剤の組み合わせに関する；すなわち、ＤＮＡ－損傷剤と組み合わされる、がんおよび／または腫瘍の処置における使用のための、本発明の化合物、ＤＮＡ－損傷剤と組み合わされるがんを処置するための薬物の調製のための、本発明に従う化合物の使用、ならびに、本発明に従う化合物およびＤＮＡ－損傷剤の投与に関わる、がんを処置する方法。一般に本明細書に前に説明されるように、化合物は、薬学的に許容し得る塩、固体形態、および溶媒和物を、とりわけ組成物および処置に関して、含むだろう。
ＤＮＡ－損傷剤および本発明に従う化合物の投与は、同時でもよいか、または連続していてもよい。

本明細書に使用されるとき、ＤＮＡ－損傷剤は、下記の例示的態様とともに、細胞、とりわけ好ましくはがん細胞中のＤＮＡ損傷を誘導することができる剤である。

前に説明のとおり、ＡＴＭキナーゼは、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）修復の鍵となる制御因子であり、それは、広く使用されているがん治療法、イオン化放射線（Ｉｒ）およびＤＮＡ－損傷剤などによって誘導される。ＤＳＢ事象のうえに、ＡＴＭは、ｐ５３を含む下流のエフェクターの多数にシグナルを送る。修復されてないＤＳＢは、チェックポイント応答の活性化、細胞周期停止、および最終的に腫瘍細胞死につながる。
本発明の一態様において、本発明は、本発明に従う治療的に有効な化合物、およびＤＮＡ損傷剤を含む、医薬組成物を、提供する。
組み合わせ（治療）における使用のために好適なＤＮＡ－損傷剤は、医薬組成物またはキットを含み、好ましく以下を含む群から選択される：

・アルキル化剤、アルトレタミン、ベンダムスチン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブチル、クロロメチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、イホスファミド、インプロスルファントシラート、ロムスチン、メルファラン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ニムスチン、ラニムスチン、テモゾロマイド、チオテパ、トレオスルファン、メクロレタミン、カルボコン、アパジクオン、ホテムスチン、グルホスフアミド、パリフォスファミド、ピポブロマン、トロホスファミド、ウラムスチンなど：

・白金化合物、カルボプラチン、シスプラチン、エプタプラチン、ミリプラチン水和物、オキサリプラチン、ロバプラチン、ネダプラチン、ピコプラチン、サトラプラチンなど；

・トポイソメラーゼ阻害剤、イリノテカン、ＳＮ３８、トポテカン、カンプトセシン、ルビテカン、ベロテカン、エトポシド、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アクラルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アムルビシン、ピラルビシン、バルルビシン、ゾルビシン、アムサクリンなど；
・ポリ－（ＡＤＰリボース）－ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤、オラパリブ、ニラパリブ、ベリパリブなど；

・ＡＴＲ（血管拡張性失調症およびＲａｄ３に関連した）阻害剤、Ｍ６６２０（ＶＸ－９７０：３－［３－（４－メチルアミノメチル－フェニル）－イソキサゾール－５－イル］－５－［４－（プロパン－２－スルホニル）－フェニル］－ピラジン－２－イルアミン）、Ｍ４３４４（ＶＸ－８０３：２－アミノ－６－フルオロ－ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボン酸［５’－フルオロ－４－（４－オキセタン－３－イル－ピペラジン－１－カルボニル）－３，４，５，６－テトラヒドロ－２Ｈ－［１，４’］ビピリジニル－３’－イル］－アミド）など；ＡＺＤ－６７３８（４－［４－［１－［［Ｓ（Ｒ）］－ｓ－メチルスルホンイミドイル］シクロプロピル］－６－［（３Ｒ）－３－メチル－４－モルホリニル］－２－ピリミジニル］－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン）および２－［（３Ｒ）－３－メチルモルホリン－４－イル］－４－（１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－５－イル）－８－（１Ｈ－ピラゾール－５－イル）－１，７－ナフチリジン；

・ＤＮＡ修飾剤、アムルビシン、ビサントレン、デシタビン、ミトキサントロン、プロカルバジン、トラベクテジン、クロファラビン、アムサクリン、ブロスタリシン、ピキサントロン、ラロムスチンなど；

・抗癌抗生物質、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、レバミゾール、ミルテフォシン、マイトマイシンＣ、ロミデプシン、ストレプトゾシン、バルルビシン、ジノスタチン、ゾルビシン、ダウノルビシン、プリカマイシン、アクラルビシン、ペプロマイシン、ピラルビシンなど；
・アルファ放射体、アルファラジン（２２３Ｒａ二塩化物、Ｘｏｆｇｉｏ）、２１１Ａｔ、２１３Ｂｉ、２２５Ａｃ、２２７Ｔｈ；

特別な好ましさは、エトポシド、イリノテカン、ラゾキサン、ソブゾキサン、トポテカン、カンプトセシン、ドキソルビシン、アムサクリン、ＰＡＲＰ阻害剤、およびＡＴＲ阻害剤に与えられる。

例示的なＰＡＲＰ阻害剤オラパリブと組み合わされた化合物１の有効性は、免疫不全雌マウスにおいて開発された、ＨＢＣｘ－１０患者誘導三重陰性乳がん異種移植モデルにおいて立証され、その結果は、図２１において示される。この実験のより詳細は、例９において記載されている。

本発明は、キットとして実践されることもでき、それは、本発明に従う化合物を含有する。キットは、（ａ）本発明に従う化合物、および／またはそれらの生理的塩、溶媒和物、または固体形態の有効量、および（ｂ）さらなる活性化合物の有効量の、別々のパックから成る。さらなる活性化合物は、好ましくはＤＮＡ－損傷剤である。

キットは、好適な容器、例えばボックスまたはカートン、個別の瓶、バッグ、またはアンプルなどを含有してもよい。キットは、例えば、別々のアンプルまたはバイアルを含有してもよく、各々が、本発明に従う化合物、および／またはそれらの薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、または固体形態の有効量、またはさらなる活性化合物、溶解されたか凍結乾燥された形態のＤＮＡ損傷剤などの有効量を、含有する。本発明のキットは、書面での取扱説明書または使用者に向けた書面での取扱説明書を含有する物品を含有してもよく、それは、本発明の化合物の取扱いを、説明する。

要約すると、本発明に従う化合物が、個別におよび／または他の処置手段、例えば、外科的介入、免疫治療、放射線治療、および／または化学治療などと組み合わせて、使用されることができることが、注意されるべきである。後者は、単剤治療および／またはオンターゲット／オフターゲット組み合わせ治療として、いかなる所望の（ｎＭＥ:新しい分子実体、ＮＣＥ：新しい化学実体、およびＮＢＥ：新しい生物学的実体を含む化学的または生物学的）活性化合物を伴う標的治療にも、関する。
記載において引用されるすべての文書が、ここに参照としてその全体が、本発明の開示に組み込まれることが、意図される。

本発明が、特定の化合物、医薬組成物、本明細書に記載の使用および方法医制限されないことは、かかるものは変化することができるので、言うまでもない。ここで使用される専門用語が、独占的に特別な態様の記載の目的に役立ち、そして、本発明の保護の範囲を制限することが意図されないことは、さらにその上言うまでもない。ここで添付の特許請求の範囲を含む明細書で使用されるとおり、単数における語形式、例えば、「ａ」または「ｔｈｅ」などは、文脈が別途、具体的に指し示さない限り、複数形における同等物を含む。例えば、「化合物」への言及は、単一化合物または複数の化合物を含み、それは、順番に同一でもよいか種々でもよく、または、「方法」への言及は、当業者に公知である同等のステップおよび方法を含む。特定の特色を「含む」としての構成要件への言及は、その構成要件が、それらの特色を含むが、他の特色が、その構成要件を実行不可能にさせない限り、それらの存在を除外しない意味として解釈されるだろう。

実験
本発明に従う化合物は、様々なパラメータおよび実験結果によって立証されるとおり、有利な特性を呈する。本発明に従う化合物の分析および特徴づけのために使用される実験的方法は、すべてのそれらの形態で、下で提供される。

アッセイ
キナーゼ活性の測定は、当業者にとって周知の技法である。基質、例えばヒストン（Alessi et al. (1996) FEBS Lett. 399(3): 333）または塩基性ミエリンタンパク質を使用するキナーゼ活性の決定のための一般的な試験システムは、論文（Campos-Gonzalez & Glenney (1992) JBC 267: 14535）中に記載されている。様々なアッセイシステムは、キナーゼ阻害剤の同定のために利用可能である。シンチレーション近接アッセイ（Sorg et al. (2002) J Biomolecular Screening 7: 11）およびフラシュプレートアッセイにおいて、基質としてのタンパク質またはペプチドの放射性リン酸化は、ＡＴＰを使用して、測定される。阻害性化合物の存在下で、減少した放射性シグナルまたは全くないことは、検出可能である。さらにその上、均一な時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＨＴＲ－ＦＲＥＴ）、および蛍光分極（ＦＰ）技術は、アッセイ方法として有用である（Sills et al. (2002) J Biomolecular Screening 191）。他の非放射性ＥＬＩＳＡ方法は、特異的なホスホ－抗体（ｐｈｏｓｐｈｏ－ＡＢ）を使用する。ホスホ－ＡＢは、リン酸化された基質のみを結合する。この結合は、第２のペルオキシダーゼ接合された抗ヒツジ抗体を使用するケミルミネッセンスによって、検出されることができる。
本発明の目的ために、関連のある化合物のオンターゲット特性は、以下のアッセイを使用して、評価された：

ＡＴＭキナーゼアッセイ－ＡＴＭ阻害（ＩＣ_５０ＡＴＭ）の決定：
ＩＣ_５０値は、生化学ＡＴＭキナーゼアッセイの助けを借りて、決定された。
アッセイは、２つのステップから成る：
酵素反応および検出ステップ。
最初に、ＡＴＭ（突然変異した血管拡張性失調症）タンパク質および試験物質は、基質タンパク質ｐ５３およびＡＴＰの添加により、種々の濃度でインキュベートされる。ＡＴＭは、アミノ酸Ｓ１５を含む、いくつかの位置で、ｐ５３のリン酸化を媒介する。リン酸化されたｐ５３の量は、特異的抗体およびＴＲ－ＦＲＥＴ技法の助けを借りて、決定される。酵素のＡＴＭアッセイは、ＴＲ－ＦＲＥＴ（ＨＴＲＦ（商標）、Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）ベースの３８４－ウェルアッセイとして、実行される。第１ステップにおいて、精製されたヒト組み換えＡＴＭ（ヒトＡＴＭ、完全長、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｎＭ＿００００５１、哺乳動物細胞株において発現）は、陰性または中性の対照としての試験物質なしで、様々な濃度のＡＴＭ阻害剤によって、１５分間、アッセイ緩衝液中で、インキュベートされる。アッセイ緩衝液は、２５ｍｍのＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０と、１０ｍｍのＭｇ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_２と、１ｍｍのＭｎＣｌ_２と、０.１％ＢＳＡと、０.０１％Ｂｒｉｊ（登録商標）３５と、５ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）とを備える。試験物質溶液は、ＥＣＨＯ５５５（Ｌａｂｃｙｔｅ）を使用するマイクロプレートの中に、分配された。第２ステップにおいて、精製されたヒト組み換えｃ－ｍｙｃ－標識化ｐ５３（ヒトｐ５３、完全長、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＢＣ００３５９６、Ｓｆ２１昆虫細胞において発現）およびＡＴＰが、加えられ、および、反応混合物は、２２℃で３０～３５分間、インキュベートされる。薬理学的に関連のあるアッセイ容量は、５μｌである。反応混合物のインキュベーションの間のアッセイの最終的な濃度は、０．３～０．４ｎＭ ＡＴＭ、５０～７５ｎｍ ｐ５３および１０μＭ ＡＴＰである。酵素反応は、ＥＤＴＡの添加によって止められる。ＡＴＰの存在下でのＡＴＭ媒介反応の結果としてのリン酸化されたｐ５３の形成は、ＦＲＥＴを可能にする特異的抗体［ドナーとしてのフルオロホレンユーロピウム（Ｅｕ）およびアクセプターとしてのｄ２により標識化された］を経て、検出される。抗体含有停止液の２μｌ（１２．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、１２．５ｍＭＥＤＴＡ、３０ｍＭ塩化ナトリウム、３００ｍＭフッ化カリウム、０．１００６％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．００５％Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、０．２１ｎＭ抗－ホスホ－ｐ５３（ｓｅｒ１５）－Ｅｕ抗体、および１５ｎＭ抗－ｃｍｙｃ－ｄ２抗体）が、反応混合物に、加えられる。通常２時間（１．５と１５時間の間）のシグナル発生のためのインキュベーションの後、プレートは、ＴＲＦモード（およびレーザー励起を伴う）を使用するプレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ，ＰｅｒＫｉｎＥｌｍｅｒ）で、分析される。３４０ｎＭの波長でのドナーユーロピウムの励起の後、６６５ｎＭでのアクセプターｄ２、６１５ ｎＭでのドナーＥｕの両方の、放射された蛍光光が、測定される。リン酸化されたｐ５３の量は、放射される光の量の係数、すなわち６６５ｎｍおよび６１５ｎｍでの相対的な蛍光単位（ＲＦＵ）と、直接比例する。測定データは、Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒソフトウェアによって、処理された。ＩＣ_５０の決定は、とりわけ、非線形回帰分析法によって用量／作用曲線をデータポイントに合わせることによって、実行される。
ＩＣ_５０＝半減－最大阻害濃度
ＡＴＰ＝アデノシン三リン酸
ＴＲ－ＦＲＥＴ＝時間分解蛍光共鳴エネルギー移動
ＨＴＲＦ（登録商標）＝均一な時間分解蛍光
ＨＥＰＥＳ＝２－（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル）エタンスルホン酸
Ｍｇ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_２＝酢酸マグネシウム
ＭｎＣｌ_２＝塩化マンガン（ＩＩ）
ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン
ＥＤＴＡ＝エチレンジアミンテトラアセタート
ＴＲＦ＝時間分解蛍光
略語は、特に明記しない限り、全体に適用される。
１０００μＭのＡＴＰ濃度でのＩＣ_５０値を決定するためのアッセイは、前記ＡＴＰ濃度のみにおいて、上のアッセイと異なる。

細胞のｐＣＨＫ２アッセイ：
アミノ酸トレオニン６８でのタンパク質キナーゼＣＨＫ２（チェックポイントキナーゼ２）のリン酸化を阻害する物質の同定のために、免疫蛍光法ベースの「ハイコンテント」分析アッセイは、ＨＣＴ１１６細胞において、使用された。

ヒト結腸癌腫細胞株ＨＣＴ１１６におけるＣＨＫ２（ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｔｈｒ６８）のブレオマイシン－誘導リン酸化の阻害剤の同定のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞ベースの免疫蛍光法アッセイ：
ＨＣＴ１１６細胞は、培養培地（ＤＭＥＭ高グルコース、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０％ＦＣＳ）の３８４－ウェルプレート中に定義された細胞密度において播かれ、３７℃で終夜および１０％のＣＯ_２でインキュベートされる。以下の日に、試験物質が、１０μＭブレオマイシンと組み合わせて、定義された濃度範囲（１ｎＭから３０ｎＭまで）において添加され、溶媒ＤＭＳＯの濃度は、０．５％で一定に保たれる。３７℃で４時間および１０％のＣＯ_２でインキュベートの後、細胞は、固定され（５分、ＰＢＳ中４％ホルムアルデヒド）、透過化処理され（１０分、ＰＢＳ中の０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）、および、非特異的結合部位をブロックした後（１０％ヤギ血清、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）、特異的抗ｐＣＨＫ２抗体とともに、終夜４℃でインキュベートされる（細胞シグナル伝達＃２６６１）。ｐＣＨＫ２（Ｔｈｒ６８）は、Ａｌｅｘａ４８８標識化第２抗ウサギＩｇＧ抗体を使用して、決定される。プロピジウムヨーダイドによるＤＮＡの平行染色は、細胞数の決定を可能にする。ｐＣＨＫ２シグナルは、高含有量撮影装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＩＭＸ Ｕｌｔｒａ）および自動画像解析を使用して、機器に属するＭｅｔａＸｐｒｅｓｓソフトウェアを使用して、検出される。定義されたバックグラウンドの上のｐＣＨＫ２シグナルを有する細胞核の数が、決定される。
ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ修飾Ｅａｇｌｅ培地；ＦＣＳ：ウシ胎仔血清、ＰＢＳ：ホスファート緩衝食塩水（略語は、一貫して、特記しない限りあてはまる）
さらにその上、他のキナーゼの効果、とりわけ阻害、および、よって本発明に従う化合物の選択性は、以下のアッセイの助けを借りて決定されることができる：

ＡＴＲ／ＡＴＲＩＰキナーゼアッセイ
ＩＣ_５０値は、ＡＴＲ／ＡＴＲＩＰ酵素のアッセイによって決定された。アッセイは、２つのステップを含む：酵素反応および検出ステップ。第１に、ＡＴＲ／ＡＴＲＩＰタンパク質の混合物（血管拡張性失調症およびＲａｄ３－関連タンパク質／ＡＴＲ相互作用タンパク質）、種々の濃度での問題の化合物、基質タンパク質としてのｐ５３、およびアデノシン三リン酸が、アッセイ緩衝液においてインキュベートされる。ＡＴＲは、Ｓｅｒ１５および他の残基でｐ５３をリン酸化する。リン酸化されたｐ５３の量は、次いで、特異的抗体およびＴＲ－ＦＲＥＴアッセイ技術を使用して、検出される。

詳細には：ＡＴＲ／ＡＴＲＩＰ酵素アッセイは、ＴＲ－ＦＲＥＴ－（ＨＴＲＦ（商標），Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）ベースの３８４－ウェルアッセイとして遂行される。第１ステップにおいて、精製されたヒト組み換えＡＴＲ／ＡＴＲＩＰ（ヒトＡＴＲ、完全長、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＮＭ＿００１１８４．３、およびヒトＡＴＲＩＰ、完全長、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＦ４５１３２３．１、哺乳類の細胞株において同時発現される）は、種々の濃度の試験化合物とともにまたは試験化合物とともにではなく（陰性対照として）、１５分間２２℃で、アッセイ緩衝液中で、インキュベートされる。アッセイ緩衝液は、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ８．０、１０ｍＭ Ｍｇ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_２、１ｍＭ ＭｎＣｌ_２、０．１％ＢＳＡ、０．０１％Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、および５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含有する。Ｅｃｈｏ５５５（Ｌａｂｃｙｔｅ）は、化合物溶液の分配のために使用される。次いで、第２ステップで、精製されたヒト組み換えｃｍｙｃタグ付けされたｐ５３（ヒトｐ５３、全長、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＢＣ００３５９６（Ｓｆ２１昆虫細胞において表現される））およびＡＴＰは加えられる、そして、反応混合物は、２２℃で、２５～３５分間、典型的に２５分インキュベートされる。薬理学的に関連のあるアッセイ容量は５μｌである。反応混合物のインキュベーションの間のアッセイの最終的な濃度は０．３～０．５ｎＭ、典型的に０．３ｎＭ、ＡＴＲ／ＡＴＲＩＰ、５０ｎｍ ｐ５３および０．５μＭ ＡＴＰである）。酵素反応は、ＥＤＴＡの添加によって止められる。ＡＴＰの存在下でのＡＴＲ媒介反応の結果としてのリン酸化されたｐ５３の発生は、ＦＲＥＴを可能にする特異的抗体［ドナーとしてのフルオロホアユーロピウム（Ｅｕ）およびアクセプターとしてのｄ２により標識化された］を使用して、検出される。この目的のために、抗体含有停止液の２μｌ（１２．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、１２５ｍＭ ＥＤＴＡ、３０ｍＭ塩化ナトリウム、３００ｍＭフッ化カリウム、０．００６％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．００５％Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、０．２１ｎＭ抗－ホスホ－ｐ５３（ｓｅｒ１５）－Ｅｕ抗体、１５ｎＭ抗－ｃｍｙｃ－ｄ２抗体）が、反応混合物に、加えられる。２時間のシグナル発生に続いて、プレートは、レーザー励起を伴うＴＲＦモードを使用して、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）マイクロプレートリーダーで、分析される。３４０ｎｍでのドナーユーロピウムの励起において、６６５ｎｍでのアクセプターｄ２のならびに６１５ｎｍでのドナーＥｕからの放射された蛍光光が、測定される。リン酸化されたｐ５３の量は、放射される光の量の比率、すなわち６６５ｎｍおよび６１５ｎｍでの相対的な蛍光単位（ＲＦＵ）の比率と、直接比例する。データは、Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒソフトウェアを使用して、処理される。とりわけ、ＩＣ_５０値は、非線形回帰分析法を使用して、データポイントに用量反応曲線を合わせることによって、通常の方法で決定される。
略語に関しては、上記リストを参照。

ｐＣＨＫ１細胞のアッセイ
Ｃｈｋ１キナーゼは、ＡＴＲの下流に作用して、ＤＮＡ損傷チェックポイント対照での鍵となる役割を有する。Ｃｈｋ１の活性化は、Ｓｅｒ３１７およびＳｅｒ３４５（ＡＴＲによるリン酸化／活性化のための優先的な標的とみなされる）のリン酸化に関わり、ブロックされたＤＮＡ複製および遺伝子毒性ストレスの特定の形態に応答して、出現する。セリン３４５のリン酸化は、チェックポイント活性化の後に、核にＣｈｋ１を限局するのに役立つ。

このアッセイは、免疫細胞化学的手順およびハイコンテント画像化を使用して、ＨＴ２９結腸腺癌細胞におけるＣｈｋ１（セリン３４５）のリン酸化の減少、続く化合物とヒドロキシ尿素（ｄＮＴＰ枯渇により、フォーク遅延を推進する）との処置を、測定する。

アッセイのために、ＨＴ２９細胞は、培養培地中で培養され（Ｇｒｅｉｎｅｒ３８４ウェルプレート、ｂｌａｃｋ， μｃｌｅａｒ ＃７８１０９０中へ、ＤＭＥＭ高グルコース（フェノールレッドなし）、２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１ｍＭ Ｐｙｒｕｖａｔｅ、１０％ ＦＣＳ）（２５００細胞／ウェル／３０μｌ）、および、３７℃で少なくとも２０時間、１０％ＣＯ_２および９０％ｒＨで、インキュベートされる。希釈された試験化合物（最終１ｎＭ～３０μＭ）およびヒドロキシ尿素（最終３ｍＭ）が、同時に加えられ、そして、細胞は、３７℃で４時間、インキュベートされる。１００％ＭｅＯＨ（－２０℃冷却）による固定／透過化処理、および０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００による透過化処理の後、完全な免疫細胞化学的手順が、特異的抗ｐＣｈｋ１抗体（細胞シグナル伝達、＃２３４８ＢＦ）および蛍光標識二次抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ウサギＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１１０７０）および細胞計数のための平行核染色を使用して、遂行される。
核局在化ｐＣｈｋ１シグナルは、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｕｌｔｒａハイコンテントリーダー上で検出され、％陽性細胞（核）として報告される。

ＤＮＡ－ＰＫアッセイ
キナーゼアッセイは、３８４－ウェルアッセイベースのＨＴＲＦ（登録商標）として遂行された。第１ステップにおいて、ＤＮＡ－ＰＫタンパク質複合体は、２２℃で１５分間、試験化合物の有無にかかわらず、インキュベートされた。ＳＴＫ－基質１－ビオチン（Ｃｉｓｂｉｏ）、Ｍｇ－ＡＴＰ、ＤＮＡ、およびスタウロスポリンの添加の後、反応混合物が、２２℃で、６０～８０分間（ＤＮＡ－ＰＫタンパク質複合体の活性に応じて）、インキュベートされた。

Ｅｃｈｏ５５５（Ｌａｂｃｙｔｅ）は、化合物溶液の分配のために使用された。アッセイ緩衝液は、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、８０ｍＭ ＫＣｌ、０．４５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．５ｍＭ ＥＧＴＡから成り、および、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．１７％ＢＳＡ、および０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有した。薬理学的に関連のある容量は、５μｌであった。反応混合物のインキュベーションの間のアッセイにおける最終濃度は、５０～１００ｎｇ／ウェルＤＮＡ－ＰＫタンパク質複合体（ＤＮＡ－ＰＫタンパク質複合体の活性に応じて）、１μＭ ＳＴＫ－基質１－ビオチン、１０μＭ Ｍｇ－ＡＴＰ、仔ウシ胸腺からの８０ｎｇ／ウェルＤＮＡ、および１μＭスタウロスポリンであった。酵素反応は、ＥＤＴＡの添加によって止められた。ＤＮＡ－ＰＫ媒介反応の結果としてのリン酸化されたＳＴＫ－基質１－ビオチンの発生は、ドナーとしての、ユーロピウム（Ｅｕ）によって標識された特異的抗ホスホＳＴＫ－抗体（Ｃｉｓｂｉｏ）、および、ＦＲＥＴを許すアクセプターとしての、ＸＬ６６５（Ｃｉｓｂｉｏ）によって標識されたストレプトアビジンを介して、検出された。この目的のために、抗体およびストレプトアビジン含有停止液（１２．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、１２５ｍＭ ＥＤＴＡ、３０ｍＭ塩化ナトリウム、３００ｍＭフッ化カリウム、０．００６％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．００５％Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、０．１７９ｎＭ抗－ホスホ－ＳＴＫ抗体、１６０ｎＭストレプトアビジン－ＸＬ６６５）の４μｌが、反応混合物に加えられた。１時間の信号発生の後、プレートは、ＲｕｂｙｓｔａｒまたはＰｈｅｒａｓｔａｒマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）上で、分析された。リン酸化された基質の量は、６２０ ｎｍ（基準波長ユーロピウム）での単位に対する放射波長６６５ ｎｍ（ＸＬ６６５のホスホペプチド感受性波長／放射）での蛍光単位（励起波長３３７ ｎｍ）の比率に、直接比例した。ＩＣ_５０－値は、Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）ソフトウェアを使用して、算出された（Molecular Cancer Therapeutics 2003、1257-1264；DNA-dependent protein kinase inhibitors as drug candidates for the treatment of cancer; A. Kashishian, H. Douangpanya, D. Clark, S. T. Schlachter, C. Todd Eary, J. G. Schiro, H. Huang, L. E. Burgess, E. A. Kesicki, and J. Halbrook.）。

ｐＤＮＡ－ＰＫ細胞のアッセイ
ＨＣＴ１１６細胞は、３７℃でおよび１０％ＣＯ_２で、１０％ウシ胎仔血清および２ｍＭグルタミンとともに、ＭＥＭアルファ培地中で、培養される。細胞は、トリプシン／ＥＤＴＡを使用して培養容器の底から、分離され、遠心管中で遠心分離され、新鮮な培地に取り込まれ、そして、細胞密度が、決定された。１００，０００の細胞は、２４－ウェル細胞培養プレートのウェル当たり培養培地１ｍｌ中に播種されて、終夜培養された。次の日に、新鮮な培養培地中の１０μＭブレオマイシン（ＤＮＡインターカレーターおよびＤＮＡ二本鎖ブレーカーインデューサー）および試験物質は、細胞に加えられ、さらに６時間培養された。細胞溶解が、次いで遂行され、そして、細胞可溶化物は、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＷＨ０００５５９１Ｍ２：全ＤＮＡ－ＰＫ、Ａｂｃａｍ ａｂ１８１９２またはＥｐｉｔｏｍｉｃｓ ＥＭ０９９１２：ホスホ－セリン２０５６ ＤＮＡ－ＰＫ）上に配置され、それは、ブロックされ、ＤＮＡ－ＰＫ特異的抗体でコートされて、４℃で終夜インキュベートされた。続いて、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートは、検出抗体（Ａｂｃａｍ ａｂ７９４４４：全ＤＮＡ－ＰＫ）およびストレプトアビジン－ＨＲＰ接合体で処置された。酵素反応の進展は、化学発光試薬を使用して実行され、ケミルミネッセンスは、ＭｉｔｈｒａｓＬＢ９４０を使用して測定された。ホスホ－ＤＮＡ－ＰＫ特異的抗体によるシグナルは、総タンパク質ＤＮＡ－ＰＫｃに対する抗体によるシグナルに、標準化された。ＩＣ_５０値またはパーセンテージは、ブレオマイシン処置ビヒクル対照群（対照の１００％）のシグナルレベルを参照することによって、決定された。ＤＭＳＯ対照は、ブランクとして使用された。
ＭＥＭ：最小必須培地；
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド

ＰＤＥ２Ａ１アッセイ
商業的に入手可能なアッセイが、使用され（Ｃｅｒｅｐ、カタログｒｅｆ．４０７１、ＳＯＰｎ°１Ｃ１０５４）、それは、Ｓｆ９細胞において発現したヒト組み換え酵素を使用して、ｃＡＭＰからの５’ＡＭＰの形成を測定することにより定量化されたヒトホスホジエステラーゼ－２Ａ１の活性に対する化合物の効果を評価するために、設計されている。

試験化合物、参照化合物または水（対照）が、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、８ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および１．７ｍＭ ＥＧＴＡ／ＮａＯＨ、、１．８μＭ ｃＡＭＰ、および１μＣｉ［３Ｈ］ｃＡＭＰを含有する緩衝液に、加えられる。
その後で、反応は、酵素（約２．５Ｕ）の添加によって始まる、そして、混合物は、２０分間ベースの対照測定のための２２℃でインキュベートされる。
ベースの対象測定のため、酵素は、反応混合物から除かれる。
インキュベーションに続いて、ＳＰＡビーズが、加えられる。
振盪下２２℃での３０分後に、［３Ｈ］５’ＡＭＰの量が、シンチレーションカウンター（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ、Ｐａｃｋａｒｄ）で、定量される。
結果は、対照酵素活性のパーセント阻害として表現される。

標準阻害性参照化合物は、ＥＨＮＡ（エリスロ－９－（２－ヒドロキシ－３－ノニル）アデニン）であり、それは、各実験において、いくつかの濃度で試験され、そのＩＣ_５０値が算出される阻害曲線を得る。

参照文献：
Maurice D.H., Ke H., Ahmad F., Wang Y., Chung J. and Manganiello V. C. (2014), Advances in targeting cyclic nucleotide phosphodiesterases, Nat. Rev. Drug Discov., Vol. 13 Issue 4: p. 290.

ＰＤＥ４Ｄ２アッセイ
Ｃｅｒｅｐの商業的に入手可能なアッセイが、使用された（カタログｒｅｆ．４０７７；ＳＯＰｎ°１Ｃ１０４５）。アッセイは、Ｓｆ９細胞において発現したヒト組み換え酵素を使用して、ｃＡＭＰからの５’ＡＭＰの形成を測定することにより定量された、ホスホジエステラーゼ－４Ｄ２の活性に対する試験化合物の効果を評価するために、設計されている。

試験化合物、参照化合物または水（対照）は、４０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および８ｍＭ ＭｇＣｌ２、４５０ｎＭ ｃＡＭＰ、および０．０１２５μＣｉ［３Ｈ］ｃＡＭＰを含有する緩衝液に、加えられる。
その後で、反応は、酵素（約１．５Ｕ）の添加によって始まる、そして、混合物は、２０分間ベースの対照測定のための２２℃でインキュベートされる。
ベースの対照測定のために、酵素は、反応混合物から除かれる。
インキュベーションに続いて、ＳＰＡ（シンチレーション近接アッセイ）ビーズが、加えられる。
振盪下２２℃での３０分後に、［３Ｈ］５’ＡＭＰの量が、シンチレーションカウンター（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ、Ｐａｃｋａｒｄ）で、定量される。
結果は、対照酵素活性のパーセント阻害として表現される。
標準阻害性参照化合物は、Ｒｏ ２０－１７２４であり、それは、各実験においていくつかの濃度で試験され、そのＩＣ_５０値が算出される阻害曲線を、得る。
上記の参照文献。

ＰＤＥ４２Ａ１アッセイ
商業的に入手可能なアッセイが、使用され（カタログｒｅｆ．４０７４、ＳＯＰ ｎ°１Ｃ１０５６）、それは、Ｓｆ９細胞において発現したヒト組み換え酵素を使用して、ｃＡＭＰからの５’ＡＭＰの形成を測定することにより定量化されたヒトホスホジエステラーゼ－４Ａ１Ａの活性に対する化合物の効果を評価するために、設計されている。

試験化合物、参照化合物または水（対照）は、４０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および８ｍＭ ＭｇＣｌ２、４５０ ｎＭ ｃＡＭＰ、および０．２５μＣｉ［３Ｈ］ｃＡＭＰを含有する緩衝液に、加えられる。
その後で、反応は、酵素（約１０Ｕ）の添加によって始まり、そして、混合物は、２２℃で２０分間インキュベートされる。
ベースの対照測定のために、酵素は、反応混合物から除かれる。
インキュベーションに続いて、ＳＰＡビーズが、加えられる。
振盪下２２℃での３０分後に、［３Ｈ］５’ＡＭＰの量が、シンチレーションカウンター（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ、Ｐａｃｋａｒｄ）で、定量される。
結果は、対照酵素活性のパーセント阻害として表現される。
標準阻害性参照化合物は、Ｒｏ２０－１７２４であり、それは、各実験においていくつかの濃度で試験され、そのＩＣ_５０値が算出される阻害曲線を、得る。
上記の参照文献。
重要であると考えられる追加のパラメータは、以下の通りに決定される：

試験方法ミクロソームの安定性（固有のクリアランス）
ミクロソームの安定性アッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏクリアランス（Ｃｌｉｎｔ）を測定するために、使用される。アッセイは、代謝されるべきその固有の傾向に起因する化合物の消失の速度を測定することに関わる（「固有の」は、消失が透過性、結合等々などの他の特性に影響を受けず、ｉｎ ｖｉｖｏクリアランスを定量する場合に、役割を果たすことを、意味する）。ミクロソームの安定性（固有のクリアランス、Ｃｌｉｎｔ）および、よって、代謝安定性は、μｌ／ｍｉｎ／ｍｇタンパク質として、一般に与えられる。１ｍｇのミクロソームが、１分における化合物のクリアが可能であることが、溶液の容量として視覚化されることができる。

計測
Ｔｅｃａｎ Ｇｅｎｅｓｉｓワークステーション（ＲＳＰ１５０／８）が、ミクロソームのインキュベーションを遂行するために、使用された。
分析は、ＡＢＳｃｉｅｘ ＡＰＩ３０００質量分析計に連結されたＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステムを使用して、実行された。
データ分析は、Ａｓｓａｙ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ｓｙｍｙｘ）を使用して、遂行された。
ＵＰＬＣ条件：
カラム:Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８、２．１ｘ５０ｍｍ、１．７μｍ（Ｗａｔｅｒｓ）
移動相：Ａ＝水中の０．１％ギ酸；Ｂ＝アセトニトリル

流速：０．７５０ｍｌ／分；検出：ＥＳＩ、ＭＲＭ；注入：１０μＬ；カラム温度５０℃
化学物質
・リン酸カリウム緩衝液：１ｍＭ ＭｇＣＩ２を含有する０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．４

・ＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスファート）：１．８ｍｌリン酸カリウム緩衝液中の２２．５ｍｇ ＮＡＤＰＨ－Ｎａ４
・アセトニトリル：５０容量％アセトニトリル（１容量アセトニトリル、１容量水）
・ＤＭＳＯ：水中の２０容量％ＤＭＳＯ
・リン酸塩緩衝液中の２０ｍｇ／ｍｌヒトまたはマウス肝ミクロソーム（タンパク質）／ｍｌのストック溶液
・１００％ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ化合物のストック溶液

ミクロソームインキュベーション
試験化合物の希釈は、１００％ＤＭＳＯ中のそれぞれの化合物の１０ｍＭストック溶液から出発して、２ステップにおいて、なされた。第１の４μｌストック溶液は、２０容量％ＤＭＳＯの１９６μｌに、加えられた。第２ステップにおいて、第１の希釈の１０μΙは、１５９０μｌリン酸カリウム緩衝液に加えられ、最終的な化合物希釈物の１．２５μΜの最終的な濃度を達成した。よって、アッセイにおける有機溶媒の量は、最小限（＜１％）に保たれた。

アッセイにおいて使用されたヒトまたはマウス肝ミクロソーム（タンパク質）溶液は、７５０μｌストック溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）および２２５０μｌリン酸カリウム緩衝液を混合することによって、５ｍｇ／ｍｌの最終的な濃度へと、調製された。

インキュベーションは、９６ディープウェルインキュベーションプレート上で、実行された。最終的な化合物希釈物のウェル当たり１６０μｌが、インキュベーションプレートに移動された。各化合物希釈物の４つの試料が、アッセイされた。２０μｌ／ウェル肝ミクロソーム溶液が、各ウェルに加えられ、そして、試料は、次いで３７℃で５分間および８００ｒｐｍ撹拌で、プレインキュベートされた。２つの参照化合物（ベラパミルおよびデキストロメトルファン）は、システム性能を確保するためおよび比較のために、あらゆる実験において、および各種類（ヒトまたはマウスミクロソーム）のために、並行して、使用された。
別々のストッププレートに、１６０μｌアセトニトリルが、ウェル当たり加えられた。

プレインキュベーションの後、すなわち時間ｔ_１＝０分で、インキュベートされた化合物溶液の１８μｌ試料が、移動され、そして、ストッププレート上のウェル（アセトニトリルを含有する）当たり加えられ、反応を阻止した（０分の対照試料、化合物当たり４つの試料）。同時に、インキュベートされた参照化合物溶液の１８μｌ試料は、移動されて、そして、時間ｔ_１＝０分でのストッププレート上のウェル（アセトニトリルを含有する）当たり加えられ、そして、３０分後（ｔ_４）、化合物の溶解性および化学安定性が、チェックされた。

反応を始めるために、２６のμｌ ＮＡＤＰＨ溶液（補因子）が、プレインキュベートされた化合物希釈物、または、３０分の対照試料として使用されるべき化合物希釈物、（ここで２６μｌリン酸塩緩衝液が、代わりに加えられた）を含むそれらのウェルを除く参照溶液を含むすべてのウェルに、加えられた。インキュベーションは、次いで３７℃および８００ｒｐｍ撹拌で、継続された。

最終的なアッセイ溶液において（すなわち、化合物、ミクロソーム（タンパク質）、およびＮＡＤＰＨそれぞれのリン酸塩緩衝液を含む各ウェルにおいて）、最終的なタンパク質濃度は、０．５ｍｇ／ｍｌ、および化合物濃度は、１ｍｇ／ｍｌであった。

インキュベーション時間のｔ_２＝５分、ｔ_３＝１０分、およびｔ_４＝２０分の後（すなわち、反応の開始後）、インキュベートされた化合物溶液の２０μｌ試料（化合物当たり４つの試料）および参照化合物溶液は、移動され、ストッププレート上のアセトニトリルのウェル当たりに、加えられた。

インキュベーション時間のｔ_４＝３０分の後、インキュベートされた化合物溶液の２０μｌ試料（化合物当たり４つの試料）および３０分の対照試料（ＮＡＤＰＨの代わりに緩衝液を含有する）の２０μｌ試料、ならびにインキュベートされた参照化合物溶液の２０μｌ試料が、移動されて、ストッププレート上のアセトニトリルのウェル当たりに、加えられた。

クエンチされた試料は、４℃で１時間、４０００ｇで、遠心分離された。上清の８０μｌは、分析のため、９６ウェルプレートに、ＬＣＭ／ＭＳによって移動された。

データ分析
各化合物のミクロソーム／代謝安定性は、経時的にＬＣＭ／ＭＳピーク面積における変化の測定によって、決定された。データは、対数線形モデルに従い、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ／Ｍｅｎｔｅｎに沿って、適合された。Ｃｌｉｎｔ値は、ミクロソームの量（０．５ｍｇ／ｍｌ）で割った時間プロット当たりの線形対数変換濃度の傾き（ｋ）から、算出される：Ｃｌｉｎｔ（μｌ／ｍｉｎ／ｍｇタンパク質）＝ｋ＊１０００／タンパク質濃度。ｓｓａｙ Ｅｘｐｌｏｒｅｒソフトウェアは、低下の傾きｋを自動的に算出するために、使用された。

Ｋｖ１１．１（ｈＥＲＧ）イオンチャネル活性（パッチクランプアッセイ）
検出のための方法およびＫｖ１１．１（ｈＥＲＧ）チャンネルを妨げる試験物質の特徴づけ：Ｋｖ１１．１（ｈＥＲＧ、ヒト遅延整流性カリウムイオンチャンネル遺伝子）は、心室心筋細胞において、細胞の再分極のための中心の役割を果たすカリウムチャンネルである。

パッチ－クランプ測定は、ｈＥＲＧ遺伝子による安定なやり方においてトランスフェクトされたヒト胎生期腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）上の全細胞コンフィギュレーションにおいて、室温で、実行された。

全細胞コンフィギュレーションは、自動化されたパッチクランプデバイス（ＰａｔｃｈｌｉｎｅｒＴＭ、Ｎａｎｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｍｕｎｉｃｈ）を使用して、実行された。これは、自動化された全細胞測定が、８つの細胞までが、同時に可能である、ガラスチップベースの、システムである。ガラスチップは、細胞が、減圧の適用によってＧｉｇａｓｅａｌへ移動されて、全細胞コンフィギュレーションにされる、定義されたサイズの穴を、有する。緩衝液、細胞懸濁液、および試験物質は、テフロンコートされたピペットを使用して、チップのマイクロチャンネルに、加えられた。

細胞は、－８０ｍＶの保持電位に締着された。Ｋｖ１１．１チャンネルの物質に促進された阻害の測定のために、以下の電圧プロトコルが、１０秒の間隔で適用された：５１ｍｓ／－８０ｍＶ、５００ｍｓ／＋４０ｍＶ、５００ｍｓ／－４０ｍＶ、２００ｍｓ／－８０ｍＶ。漏れ電流は、Ｐ４の方法によって差し引かれる。細胞は、細胞外緩衝液（ＥＣ）中で再懸濁されて、チップに適用された。細胞が収集されたあと、シールは、シールエンハンサー緩衝液の添加によって、改善された。全細胞コンフィギュレーションに達するとすぐに、シールエンハンサー緩衝液は、洗い落とされて、細胞外緩衝液と、置き換えられた。１．５分間のＥＣにおいて測定が開始された。ＤＭＳＯ（ビヒクル対照、ＤＭＳＯの０．１％）が、次いで適用され、そして、対照電流が、３分間記録された。試験物質が、続いて二回同じ濃度において加えられ、そして、カリウム電流は３．５分間それぞれの場合において測定されていた。

１０μＭの開始濃度の試験物質の測定結果が、（－）５０％効果（閾値）よりより小さかった場合（例えば（－）６０％効果）、試験物質は、用量／作用関係を決定するために、濃度を増大させることにおいて、累積的に加えられ、各濃度は、５分間測定された。

使用された参照物質は、Ｋｖ１１．１（ｈＥＲＧ）イオンチャンネル遮断剤キニジンであった。試験物質およびキニジンの効果は、関連するビヒクル対照に標準化された。Ｋｖ１１．１（ｈＥＲＧ）チャンネル活性に対する効果は、－４０ｍＶでのカリウム電流から評価された。算出のために、電流は、それぞれの最終的なトレースのために評価された。Ｋｖ１１．１（ｈＥＲＧ）チャンネルの、試験物質によって誘発された阻害は、ビヒクル対照（ＤＭＳＯの０．１％）に標準化された。
測定の間、試験物質のアリコートは、濃度決定のために選ばれた。試料は、すぐＨＰＬＣで測定され、そして、最終的な濃度は、較正曲線から決定された。

１０μＭの開始濃度での試験物質の測定結果が、（－）５０％効果（閾値）より大きいか等しい場合（例えば、（－）３０％効果、すなわち１０μＭの３０％阻害）、Ｋ_ｉは、以下の式に従って算出される：Ｋ_ｉ＝１．０Ｅ－５×（１００＋％効果）／（－％効果）、［Ｍ］。
１０μＭの試験物質濃度での（－）３０％効果の測定結果は、２３μＭのＫ_ｉを与える。

シトクロムＰ‐４５０酵素（ＣＹＰ）
ヒト生物において、薬物物質は、それらの排泄を促進するために、水溶性化合物に酵素システムによって転換される。これらの酵素システムは、ミクロソームのシトクロムＰ‐４５０酵素、略してＣＹＰを含む。アッセイは、化合物が、定義されたＣＹＰアイソフォームのための強い阻害剤でもよいかどうか特定するために、設計されている。これは、組み換えＣＹＰアイソフォーム、およびバキュロウイルスに感染された昆虫細胞における過剰発現によって得られた、それらのレダクターゼの使用に関わる。ＣＹＰ反応は、ＮＡＤＰＨ再生条件の下でのＣＹＰ基質とともに試験される発光ＣＹＰアイソフォームの阻害を通して、遂行される。発光Ｐ４５０－ＧｌｏＴＭ基質は、カブトムシのルシフェリン（（４ｓ）－４，５－ジヒドロ－２－（６－ヒドロキシベンゾチアゾリル）－４－チアゾールカルボン酸またはＤ－ルシフェリン）、カブトムシからのホタルルシフェラーゼの基質の誘導体である。発光Ｐ４５０－ＧｌｏＴＭ基質は、直接ルシフェラーゼと反応せず、それぞれのＣＹＰアイソフォームによって、ルシフェリン検出試薬（ＬＤＲ）との反応で発光するルシフェリン生成物に、転換される。これは、光度を通して迅速に定量される酵素活性を、許す。阻害の範囲は、ＩＣ_５０値を決定することによって、測定される（Crespi et al., Methods Enzymol. 357:276-284, 2002）。以下の商業的に入手可能なスクリーニングシステム／アッセイが、使用される：Ｐ４５０－Ｇｌｏ（商標）ＣＹＰ１Ａ２スクリーニングシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｖ９７７０）；Ｐ４５０－Ｇｌｏ（商標）ＣＹＰ２Ｃ８アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｖ８７８２）；Ｐ４５０－Ｇｌｏ（商標）ＣＹＰ２Ｃ９スクリーニングシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｖ９７９０）；Ｐ４５０－Ｇｌｏ（商標）ＣＹＰ２Ｃ１９スクリーニングシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｖ９８８０）；Ｐ４５０－Ｇｌｏ（商標）ＣＹＰ２Ｄ６スクリーニングシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｖ９８８０）；Ｐ４５０－Ｇｌｏ（商標）ＧＹＰ３Ａ４スクリーニングシステム（（Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ－ＰＰＸＥ）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｖ９９１０）。
バイオアベイラビリティ

ヒトにおける予測されたバイオアビアビリティは、前臨床の種類における測定されたバイオアビアビリティに由来する：マウス、ラット、およびイヌ（ビーグル）は、ヒトにおける予測された薬理学的に有効な用量のために算出される（コンピューターでのＧａｓｔｒｏＰｌｕｓシミュレーション）。

粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）方法：
Ｘ線粉末回折図（ＸＲＰＤ）、図７Ｂおよび１０から１９（および、その他）に描写されるものなどは、以下の方法論を使用して得られた：試料は、組合せの９６－ウェルプレート（Ｘ線アモルファス箔を底として含む）、または、Ｘ線アモルファスフィルムの間において、調製された。測定は、Ｓｔｏｅ ＳｔａｄｉＰ ６１１回折計上の、Ｃｕ－Ｋ_α１放射線によって、透過ジオメトリーにおいて遂行された。スキャンは、それぞれ、同時に０～３６°２θ（０．０３°２θのステップ幅、１ステップにつき３０秒）であるか、または１～６５°２θ（０．０１５°２θのステップ幅、１ステップにつき１５秒）をカバーしていた。

単結晶Ｘ線回折：
単結晶Ｘ線構造データは、ＣｕＫα放射線を使用するＣＣＤ検出器を備える、ＡｇｉｌｅｎｔからのＳｕｐｅｒＮｏｖａ回折計を使用して、得られた。測定は、それぞれ、２００Ｋ（形態Ｈ２）で、または、２９８Ｋ（形態Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｈ１）で、遂行された。単結晶データは、結晶系および単位格子パラメータの決定のために、使用された。

示差走査熱量測定（ＤＳＣ）：
ＤＳＣスキャンは、窒素不活性気体雰囲気（５０ｍｌ／分）を使用して、オートサンプラーを伴うＭｅｔｔｌｅｒ－Ｔｏｌｅｄｏ熱流示差走査熱量計上で、取得された。概要スキャンは２５～３００℃、５℃／ｍｉｎで蓋の開いたＡｌ４０μＬパンにおいて、実行された。

熱重量分析（ＴＧＡ）：
ＴＧＡスキャンは、窒素不活性気体雰囲気（５０ｍｌ／分）を使用して、オートサンプラーを伴うＭｅｔｔｌｅｒ－Ｔｏｌｅｄｏ Ｔｈｅｒｍｏｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ Ａｎａｌｙｓｅｒ上で、取得された。概要スキャンは、２５～３００℃、５℃／ｍｉｎで蓋のないＡｌ１００μＬパンにおいて、実行された。実験は、同じ温度プロファイルを使用して、蓋のない空のＡｌ１００μＬパンからのブランクランによって、ベースライン修正された。

動的な蒸気収着（ＤＶＳ）：
ＤＣＳ水蒸気収着等温曲線は、微量天秤およびインキュベーターを伴うＤＶＳ機器（ＤＶＳ－Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ， Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ＳＭＳ）により、取得された。粉末試料は、使い捨て可能なＡｌパンに正確に計量され、ＤＶＳ機器の試料位置上に配置された。２００ｍＬ／分の窒素全体のフォロー速度（乾燥したおよび湿った流れを組み合わせた）が、加湿のために使用された。水蒸気収着等温曲線は、２５℃で、４０％ＲＨ（相対湿度）から０％ＲＨまでの最初の脱着セグメント１（１０％ＲＨステップを伴う）、０％ＲＨから９８％ＲＨまでの吸着セグメント（それぞれ１０％ＲＨステップおよび最終的な８％ＲＨステップを伴う）、および９８％ＲＨから０％ＲＨまでの最後の脱着セグメント２（それぞれ最初の８％ＲＨステップおよび１０％ＲＨステップを伴う）を使用して、取得された。すべてのＲｈステップのために、１０分間の最小Ｒｈステップ時間、および３６０分間の最大Ｒｈステップ時間（タイムアウト）を伴い、平衡条件ｄｍ／ｄｔ≦０．０００５重量％／分が、使用された。

固体形態のｎｏｎ－ｓｉｎｋ溶解プロファイル：
固体形態のためのｎｏｎ－ｓｉｎｋ溶解プロファイルは、ＡＰＩの溶解量の決定のための時間分解試料採取を伴う、ＦａＳＳＩＦ培地（ｐＨ６．５）中の過剰な固体成分を伴う振とう－フラスコ方法を使用して、取得された。約１０～２０ｍｇの固体試料が、ガラスバイアルに計量された。それぞれの培地（３７℃に予熱された）の７ｍｌが、加えられ、そして、懸濁液は、３７℃で４５０ rpmで振とうされた。５分、１０分、１５分、３０分、６０分、１２０分、２４時間、および４８時間後、１ｍｌの懸濁液が、回収され、０．２μｍシリンジフィルターで、濾過された。透明な濾過物は、溶解された化合物量／形態（ＡＰＩとして称されてもよい）の量を測定するために、好適な希釈の後で、ＨＰＬＣによって分析された。

ＦａＳＳＩＦ：３ｍＭのタウロコール酸ナトリウム；０．７５ｍＭレシチン；１０５．９ｍＭ塩化ナトリウム；２８．４ｍＭモノ塩基性ナトリウムホスファートおよび８．７ｍＭ水酸化ナトリウム、ｐＨ６．５
ｐｈ依存性溶解性および小型化ｎｏｎ－ｓｉｎｋ溶解のためのＨＰＬＣ方法：
溶解された化合物／形態のレベルは、以下の条件によって、ＨＰＬＣによって分析された：
・カラムＣｈｒｏｍｏｌｉｔｈ ＲＰ－１８ｅ １００～３ｍｍ
・溶媒Ａ：水／ギ酸（９９９：１；ｖ／ｖ）
・溶媒Ｂ：アセトニトリル／ギ酸（９９９：１；ｖ／ｖ）
注入容量：５μＬ
カラム温度：３７℃
ＨＰＬＣ－勾配：

例

以下の例は、上で記載された発明を例示する；しかしながら、それらは、どんな形であれ、発明の範囲を限定することを、意図しない。例は、とりわけ、それらが、具体的に例示された特色または特色の組み合わせに制限されないような方法において、解釈されなければならないが、しかし、その代わりに、例示された特色は、発明の目的が達成される限り、自由に補正されることができるかまたは組み合わせられることができる。本発明の化合物、組み合わせ、および組成物の有益な効果は、このように関連する技術の当業者に公知の他の分析方法および実験的セットアップによって、決定されることもできる。同じく、調整方法に対する改変は、とりわけ反応条件において、当業者にきわめて明白である。

例１：化合物１および２の調製
化合物Ｙを、ＷＯ２０１６／１５５８４４において開示された手順に従い調製し、つづいて化合物Ｙから化合物１および２を分離する：

ａ．６－ブロモ－Ｎ－（３－フルオロ－５－メトキシ－４－ピリジル）－７－メトキシ－３－ニトロ－キノリン－４－アミンの合成
乾燥した窒素雰囲気の下で、Ｎ、Ｎ－ジメチルホルムアミド（５ｍｌ）中に溶解した３－フルオロ－５－メトキシピリジン－４－アミン（４４７ mg、３．０２ｍｍｏｌ）の溶液を、提供した。次いで、水素化ナトリウム（５０４ｍｇ、１２．６ｍｍｏｌ、６０％）を溶液に加え、そして、５分間室温で、撹拌し続けた。次いで６－ブロモ－４－クロロ－７－メトキシ－３－ニトロ－キノリン（８００ｍｇ、２．５２ｍｍｏｌ）を、反応混合物に加え、続いて１５分間、室温で、撹拌し、次いで氷水（１００ｍｌ）の添加をとおして反応をクエンチした。沈殿物を、ろ過して取り除き、氷水によって洗浄し、そして乾燥して、黄色の固体として１．００ｇ（９４％）の６－ブロモ－Ｎ－（３－フルオロ－５－メトキシ－４－ピリジル）－７－メトキシ－３－ニトロ－キノリン－４－アミンを、与えた。

ｂ．６－ブロモ－Ｎ４－（３－フルオロ－５－メトキシ－４－ピリジル）－７－メトキシ－キノリン－3,4－ジアミンの合成
メタノール（１００ｍｌ）中に溶解した６－ブロモ－Ｎ－（３－フルオロ－５－メトキシ－４－ピリジル）－７－メトキシ－３－ニトロ－キノリン－４－アミン（９９０ mg、２．２０ｍｍｏｌ）を、保護窒素雰囲気の下で提供した。次いで、Raney－Ｎｉ（１００ mg、１．１７ｍｍｏｌ）を溶液に加え、そして、反応混合物を、常圧で３０分間水素雰囲気の下で撹拌した。窒素を導入した後に、懸濁液を濾過し、そして、濾過物を減圧下で乾燥させた。濾過物を、減圧下で乾燥物へとエバポレートした。残渣を、酢酸エチル／石油エーテルの混合物から、結晶化し、そして、黄色の固体として０．８６ｇ（９９％）の６－ブロモ－Ｎ４－（３－フルオロ－５－メトキシ－４－ピリジル）－７－メトキシ－キノリン－3,4－ジアミンを産生した。

ｃ．８－ブロモ－１－（３－フルオロ－５－メトキシ－４－ピリジル）－７－メトキシ－３Ｈ－イミダゾ［4,5－ｃ］キノリン－２－オンの合成
テトロヒドロフラン（２０ｍｌ）中に溶解した６－ブロモ－Ｎ４－（３－フルオロ－５－メトキシ－４－ピリジル）－７－メトキシ－キノリン－3,4－ジアミン（０．８５ｇ、２．２０ｍｍｏｌ）の溶液を、提供した。次いで、１，１’－カルボニルジイミダゾール（１．８４ｇ、１１．３ｍｍｏｌ）およびＨｕｅｎｉｇ－塩基（１．４６ｇ、１１．３ｍｍｏｌ）を、加えた。反応混合物を、４０℃まで加熱し、１６時間撹拌した。次いで、反応を、氷水（２００ｍｌ）の添加によって、クエンチした。沈殿物を、ろ過して取り除き、氷水によって洗浄し、乾燥して、淡黄色固体として０．８７ｇ（９４％）の８－ブロモ－１－（３－フルオロ－５－メトキシ－４－ピリジル）－７－メトキシ－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オンを与えた。
ｄ．８－ブロモ－１－（３－フルオロ－５－メトキシ－４－ピリジル）－７－メトキシ－３－メチル－イミダゾ［4,5－ｃ］キノリン－２－オンの合成

乾燥した保護窒素気体雰囲気中で、Ｎ、Ｎ－ジメチルホルムアミド（５ｍｌ）中に溶解した８－ブロモ－１－（３－フルオロ－５－メトキシ－４－ピリジル）－７－メトキシ－３Ｈ－イミダゾ［4,5－ｃ］キノリン－２－オン（０．８６ｇ、１．９４ｍｍｏｌ）を、提供した。次いで、水素化ナトリウム（３８８ｍｇ、９．７１ｍｍｏｌ、６０％）およびメチルヨーダイド（２．７６ｇ、１９．４ｍｍｏｌ）を、加えた。反応混合物を、室温で１０分間、撹拌した。次いで、反応を、氷水（１００ｍｌ）の添加によって、クエンチした。結果として生じた沈殿物を、濾過し、減圧下で乾燥して、淡黄色固体として０．７０ｇ（８０％）の８－ブロモ－１－（３－フルオロ－５－メトキシ－４－ピリジル）－７－メトキシ－３－メチル－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オンを、与えた。

ｅ．１－（３－フルオロ－５－メトキシ－４－ピリジル）－７－メトキシ－３－メチル－８－（1,3－ジメチルピラゾール－４－イル）イミダゾ［4,5－ｃ］キノリン－２－オンの合成

密閉した装置中アルゴン不活性気体雰囲気の下で、１,４－ジオキサン（１５ｍｌ）および水（５ｍｌ）中の、８－ブロモ－１－（３－フルオロ－５－メトキシ－４－ピリジル）－７－メトキシ－３－メチル－イミダゾ［4,5－ｃ］キノリン－２－オン（１５０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）、１－３－ジメチル－４－（テトラメチルの－１，３，２－ジオキソボロラン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール（８８．４ mg、０．４０ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（７６．６ mg、０．０７ｍｍｏｌ）、および炭酸カリウム（９１．６ mg、０．６６ｍｍｏｌ）を、提供した。反応混合物を、２時間撹拌しながら、８０℃まで加熱した。これを、続いて室温まで冷却し、反応混合物を減圧下で乾燥物に圧縮した。残渣を、シリカ（エチル・アセタート／メタノール＝９７：３、容量部）を使用して、クロマトグラフィーで精製した。溶出液を、乾燥物に圧縮し、そして、結果として生じる原料生成物を、手段または分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（水／アセトニトリル）によって精製した。生成物画分を圧縮した後に、１－（３－フルオロ－５－メトキシ－４－ピリジル）－７－メトキシ－３－メチル－８－（１，３－ジメチルピラゾール－４－イル）イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オン（７０ｍｇ、４７％）を、無色の固体として得た。

ｆ．８－（１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１－（Ｒａ）－（３－フルオロ－５－メトキシ－ピリジン－４－イル）－７－メトキシ－３－メチル－１，３－ジヒドロ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オンおよび８－（１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１－（Ｓａ）－（３－フルオロ－５－メトキシ－ピリジン－４－イル）－７－メトキシ－３－メチル－１，３－ジヒドロ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オンの分離

上で得た１－（３－フルオロ－５－メトキシ－４－ピリジル）－７－メトキシ－３－メチル－８－（１，３－メチルピラゾール－４－イル）イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オン（５０．０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を、ＳＦＣを使用して、キラルＨＰＬＣを介して分離して、化合物１および２を、与えた。物質を、キラル・カラムＬｕｘ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ－２に適用し、溶媒としてＣＯ_２／２－プロパノール＋０．５％のジエチルアミン（７５：２５）によって、５ｍｌ／分のフローで、および２４０ｎｍの波長での検出を使用して、分離した。減圧で生成物画分を圧縮して、８－（１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１－（Ｒａ）－（３－フルオロ－５－メトキシ－ピリジン－４－イル）－７－メトキシ－３－メチル－１，３－ジヒドロイミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オン（２５．０ｍｇ、５０％）および８－（１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１－（Ｓａ）－（３－フルオロ－５－メトキシ－ピリジン－４－イル）－７－メトキシ－３－メチル－１，３－ジヒドロ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オン）（２２．１ｍｇ、４４％）を、両方とも無色の固体として産生した。

実例として以下に示すとおり、出発化合物は、容易に入手できる：

例２：アトロプ異性体の単離および化合物１の精製
化合物１および２は、スキーム１において、および、図６において示すとおり、そして、以下に詳細に議論するとおり、化合物Ｙから、単離することができる。当業者は、下記のプロセスが、化合物３からの３－ａおよび３－ｂ、化合物４からの４－ａおよび４－ｂならびに化合物５からの５－ａおよび５－ｂのために、等しく適用できることを、認識するだろう。

ステップ１：
１．２００Ｌの反応器のなかに、アセトン（１０８Ｌ、２０ｖｏｌ）、精製水（８．１３Ｌ、１．５ｖｏｌ）、および化合物Ｙ（５．４２ｋｇ、１．０等量）を、２０～２５℃で加えた。
２．ジベンゾイル－Ｌ－酒石酸（４．３３ｋｇ、１．０当量）によって充填した。
３．５２～５５℃まで加熱し、透明な溶液を与えて、５２～５５℃で０．５時間撹拌した。
４．２０～２５℃まで冷却した。
５．濾過し、そして、濾過ケークを、アセトン（５．４Ｌ、１ｖｏｌ）で、洗浄した。
６．ケークを収集し、そして、乾燥させて、Ｌ－塩Ｂ（化合物２のＬ－塩）（９５．９％キラル純度の淡黄色固体）を、与えた。
７．母溶液を濃縮して、Ｌ－塩Ａ（化合物１のＬ－塩）を、得た。
８．Ｌ－塩ＡおよびＤＣＭ（３８Ｌ、７ｖｏｌ．）を１００Ｌ反応器に、加え、飽和ＮａＨＣＯ_３溶液によりｐＨ８～９まで調整した。

９．ジクロロメタン（ＤＣＭ）層を収集し、ＤＣＭ（１６．３Ｌ、３ｖｏｌ．）とともに飽和ＮａＨＣＯ_３で抽出し、ＤＣＭ層を合わせて、Ｈ_２Ｏ（１０．８Ｌ、２ｖｏｌ）でＤＣＭ層を、洗浄した。
１０．ＤＣＭ層を、濃縮した。
次いで、アセトン（５．４Ｌ、１ｖｏｌ）を、２０～２５℃で、加えた。
１１．２０～２５℃で１時間、撹拌した。
１２．濾過し、ケークを収集し、そして、乾燥して、化合物１（３．５０ｋｇ、７３．２％のキラル純度を有する白色固体、Ｙ：６４．６％）を与えた。

ステップ２：
１．Ｌ－塩ＢおよびＤＣＭ（１６．２Ｌ、３ｖｏｌ．）を５０Ｌフラスコに、加え、飽和ＮａＨＣＯ_３溶液によりｐＨ８～９まで調整した。
２．ＤＣＭ層を収集し、ＤＣＭ（５．４Ｌ，１ｖｏｌ）で水性層を抽出し、ＤＣＭ層を合わせて、Ｈ_２Ｏ（５．４Ｌ、１ｖｏｌ）でＤＣＭ層を洗浄した。
３．二回減圧下４０～５０℃で、ＤＣＭを２‐エトキシエタノール（１．８Ｌ、０．３ｖｏｌ）と交換した。
４．５．４Ｌ（１ｖｏｌ）まで、２‐エトキシエタノールで容量を、調整した。
５．１２８～１３０℃まで加熱し、スラリーを与えて、１２８－１３０の℃で４４時間、撹拌した。
６．ＩＰＣ（比率４９．５：５０．５）。
７．１５～２０℃に冷却した。
８．濾過し、そして、メチル－３級ブチル－エーテル（２．７Ｌ、０．５ｖｏｌ）で、ケークを洗浄した。
９．ケークを収集し、乾燥させて、化合物Ｙを与えた（１．６０ｋｇ、オフホワイトの固体、全収率：２９．５％）。

ステップ３：
１．２０～２５℃で、アセトン（７０Ｌ，２０ｖｏｌ）を１００Ｌ反応器に、加え、撹拌し、そして、化合物１（３．５ｋｇ、１．０当量）を加え、水（５．３のＬ，１．５ｖｏｌ．）を、充填した。

２．３５～４０℃でジベンゾイル－Ｄ－酒石酸（２．８Ｋｇ，１．０当量）で充填し、５２～５５℃まで加熱して、透明な溶液を与え、５２～５５℃で０．５時間、撹拌した。
３．オイルバスで２０～２５℃まで冷却し、２０～２５℃で１７時間、撹拌した。
４．濾過し、ケークをアセトン（３．５Ｌ、１ｖｏｌ）で、洗浄した。
５．ケークを収集して、Ｄ－塩Ａ（化合物１のＤ－塩）を与えた（９８．７％のキラル純度を伴う薄黄色固体）。
６．母溶液を、濃縮し、次いで、飽和ＮａＨＯ３溶液（１５．５Ｌ、３．５ｖｏｌ）およびＨ_２Ｏ（１５．５Ｌ、３．５ｖｏｌ）を、加えた。
７．２０～２５℃で０．５時間、撹拌した。
８．濾過し、Ｈ_２Ｏ（３．５Ｌ，１ｖｏｌ）で、ケークを、洗浄した。
９．フィルターケークを収集し、乾燥させて、化合物Ｙを与えた（１．５３ｋｇ、５０．３：４９．７の比率を伴う白色固体、Ｙ：４３．７％）。

ステップ４：
１．Ｄ－塩Ａ（化合物１のＤ－塩）およびアセトン（１７．５Ｌ，５ｖｏｌ．）を、５０Ｌ反応器に、加え、そして、５２～５５℃に暖めて、スラリー溶液を与え、そして、５２～５５℃で０．５時間、撹拌した。
２．２０～２５℃まで冷却し、２０～２５℃で１７時間、撹拌した。
３．濾過し、ケークをアセトン（３．５Ｌ、１ｖｏｌ）で、洗浄した。
４．フィルターケークを収集し、乾燥させて、Ｄ－塩Ａを与えた（３．２３ｋｇ、９９．２％のキラル純度を伴う淡黄色固体）。
５．Ｄ－塩Ａを、５０Ｌ反応器に、加え、そして、飽和ＮａＨＣＯ_３溶液（１６Ｌ、５ｖｏｌ）およびＨ_２Ｏ（１６Ｌ、５ｖｏｌ）を、加えた。
６．２０～２５℃で０．５時間、撹拌した。
７．濾過し、Ｈ_２Ｏ（１６Ｌ，５ｖｏｌ．）で、ケークを、洗浄した。
８．ケークを収集し、乾燥させて、化合物１を与えた（１６３８ｇ、９９．１％のキラル純度およびＨＰＬＣの９９．９％を伴う白色固体、全収率：３０．２％）。

例３：クロマトグラフィーの分離、精製、および分析
３．１ 化合物１および２は、キラル固定相上のクロマトグラフィーを使用して、化合物Ｙから、単離することができる（例として、Chiral Liquid Chromatography; W. J. Lough, Ed. Chapman and Hall, New York, (1989); Okamoto, ”Optical resolution of dihydropyridine enantiomers by high-performance liquid chromatography using phenylcarbamates of polysaccharides as a chiral stationary phase”, J. of Chromatogr. 513:375-378, (1990)参照）。化合物１および２は、例として、以下を含有する移動相を伴う定組成溶離を使用して、キラル固定相、例えば、Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＩＣカラム（５ｍｍ、１５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．）上のクロマトグラフィーによって、単離されることができる：Ｈ_２Ｏ／ＡＣＮ５０／５０ｖ／ｖ（ＡＣＮ：アセトニトリル；ｖ：容量）。当業者は、同じ手順が、化合物３－ａおよび３－ｂ、４－ａおよび４－ｂ、ならびに５－ａおよび５－ｂのために適用されることができることを、認識するだろう。

このように得られたクロマトグラムを、図５に図示する（上記したとおり、カラムおよび溶出は、フロー１．００ｍｌ／分；ＵＶ＠２６０ｎｍ；ＴｃおよびＴＳ：２５±５℃（Ｓｃｏｎｃ０．２０ｍｇ／ｍｌ）；注入された容量１０ｍｌ）。

３．２ 上記のＳＦＣ条件に代わるものとして、分取超臨界流体クロマトグラフィを、使用してもよく、実例として、以下に関わる：
Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＳ－Ｈ（２０ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ）カラム；
定組成溶離（０．１％ｖ／ｖＮＨ３を伴う、２０：８０エタノール：ＣＯ_２）、ＢＰＲ（逆圧ｒｅｇ．）：大気圧より上の約１００バール；４０℃のカラム温度、５０ｍｌ／分の流速、２５００μｌ（１２５ｍｇ）の注入容量、および２６５ｎｍの検出器波長。

３．３ それぞれのアトロプ異性体の純度の分析のために、再び、実例として以下のセットアップを使用して、ＳＦＣを適用してもよい：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＳ－Ｈ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ）カラム；定組成溶離（０．１％ｖ／ｖＮＨ３を伴う、２０：８０ エタノール：ＣＯ_２）、ＢＰＲ（逆圧ｒｅｇ．）：大気圧より上の約１２５バール；４０℃のカラム温度、４ｍｌ／分の流速、１μｌの注入容量、および２６０ ｎｍの検出器波長。

例４化合物１および２の安定性
回転障害の量子力学算出
ＬａＰｌａｎｔｅらは、薬物様分子の軸回転に対するエネルギー障壁を推計するための量子力学的ワークフローを、記載している（ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ、２０１１、６（３）、５０５－５１３）。同様のアプローチを、適用した：

すべての入力分子の３Ｄ構造は、ＣＯＲＩＮＡ（Corinaversion 3.6, Molecular Networks, Germany）を使用して発生させ、Ｍａｃｒｏｍｏｄｅｌ（version 11.1, Schroedinger, LLC, New York, NY）によって、続いて最小化した。これらの入力構造に基づいて、１５°の捻れ角増加を伴うＢ３ＬＹＰ／６－３１Ｇ＊＊方法を用いるプログラムＪａｇｕａｒ（ｖersion 9.1 release 14, Schroedinger, LLC, New York, NY）を使用して、リラックス二面角スキャンから、回転エネルギー障壁を、算出した。構造を、同じ理論のレベルを使用して、ねじれスキャンの前に、最適化した。極小化ステップの最大数を、５００にセットしたことを除いて、デフォルトパラメータを使用し、そして、人工的結合破壊を回避するために、ｓｔｏｐ＿ｒｘｎフラグを導入した。すべての算出のために、代表的な分子フラグメントを、使用した。分子力学最小化構造から得られた二面角を、二面角スキャンのための、例として本発明の化合物１のための、または「ＬａＰｌａｎｔｅ参照化合物１」のための初期値を定めるために使用し、値を、それぞれ４７．３２°および３５．８°にセットした。各ねじれについて、軸結合ＱＭエネルギーに関して、値を、２４ステップにおいて、算出した。ねじれプロファイルを、算出エネルギーにねじれ角値をプロットして、得た。

両方の異性体間の相互転換を許す、各化合物のための最も低いエネルギー障壁を、決定した。参照化合物１～６に関して、実験的に決定された相互転換速度、および推論したエネルギー障壁は、公知である。コンピューターによる、参照化合物１～６のためのエネルギー障壁は、９．８６５～３１．３１６ｋｃａｌ／モルである。これらの値は、実験的に判断した相互転換速度に、適合した。本発明の化合物１の、および本発明の化合物２のための算出は、数年（＞１０年）の範囲の予測された回転半減期を伴う高度に安定なアトロプ異性体に変換する、２９．２０５ｋｃａｌ／モルの高い予測された回転障壁を現した。
どちらの鏡像異性アトロプ異性体のラセミ化の発生のための要求される温度は、＞１００℃である。
当業者は、これらの値が、化合物３－ａおよび３－ｂ、４－ａおよび４－ｂ、ならびに５－ａおよび５－ｂのためにも例示的であると、認識するだろう。

例５：化合物１の薬学的に許容し得る塩
化合物１の塩（化合物１－ａ）は、薬学的に許容することができ、以下に示し詳細に議論するとおり、調製した。
フマラート－塩（形態ＮＦ６）の調製：
８－（１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１－（Ｓａ）－（３－フルオロ－５－メトキシ－ピリジン－４－イル）－７－メトキシ－３－メチル－１，３－ジヒドロイミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オンの約２０ｍｇを、磁気攪拌子を備える、密閉したキャップを伴う４ｍｌのガラスバイアル中で、および、磁気撹拌機を使用することによって、５０℃で、１ｍｌ ＴＨＦ（ｐ．ａ．グレード）中に溶解した。５０℃で、約５．７ｍｇフマル酸（～１．１当量）を、熱溶液に加え、０．１Ｋ／分の冷却速度で、５℃まで冷却した。混合物を、５℃で数時間の最終的な平衡化ステップの前に、反復して５０℃まで加熱し（約３０分以内に）、そして、撹拌下で、５℃まで、冷却した（０．１Ｋ／分で）。冷却溶液中の塩形成の収率を増加させるために、混合物を、密閉したバイアル構成において、ゆっくりしたｎ－ペンタンの抗溶媒蒸気拡散に、さらに暴露した。最終的に得られた固体成分を、遠心分離によって分離し、窒素パージの下で穏やかに乾燥させた。

ナプシラート－塩（形態ＮＦ７）の調製－変形例１：
８－（１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１－（Ｓａ）－（３－フルオロ－５－メトキシ－ピリジン－４－イル）－７－メトキシ－３－メチル－１，３－ジヒドロイミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オンの約１０ｍｇを、磁気攪拌子を備える、密閉したキャップを伴う４ｍｌのガラスバイアル中で、および、磁気撹拌機を使用することによって、５０℃で、～２５０μｌアセトン（ｐ．ａ．グレード）中に溶解した。５０℃で、約５．６ｍｇナフタレン－２－スルホン酸（～１．２当量）を、熱溶液に加え、０．１Ｋ／分の冷却速度で、５℃まで冷却した。

混合物を、５℃で数時間の最終的な平衡化ステップの前に、反復して５０℃まで加熱し（約３０分以内に）、そして、撹拌下で、５℃まで、冷却した（０．１Ｋ／分で）。最終的に得られた固体成分を、遠心分離によって分離し、窒素パージの下で穏やかに乾燥させた。

ナプシラート－塩（形態ＮＦ７）の調製－変形例２：
８－（１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１－（Ｓａ）－（３－フルオロ－５－メトキシ－ピリジン－４－イル）－７－メトキシ－３－メチル－１，３－ジヒドロイミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オンの約１１．５ｍｇを、磁気攪拌子を備える、密閉したキャップを伴う４ｍｌのガラスバイアル中で、および磁気撹拌機を使用することによって、５０℃で、～２５０μｌ ＴＨＦ（ｐ．ａ．グレード）中に溶解した。５０℃で、約６．６ｍｇナフタレン－２－スルホン酸（～１．２当量）を、熱溶液に加え、０．１Ｋ／分の冷却速度で、５℃まで冷却した。

混合物を、５℃で数時間の最終的な平衡化ステップの前に、反復して５０℃まで加熱し（約３０分以内に）、そして、撹拌下で、５℃まで、冷却した（０．１Ｋ／分で）。最終的に得られた固体成分を、遠心分離によって分離し、窒素パージの下で穏やかに乾燥させた。

エジシラート－塩（形態ＮＦ８）の調製：
８－（１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１－（Ｓａ）－（３－フルオロ－５－メトキシ－ピリジン－４－イル）－７－メトキシ－３－メチル－１，３－ジヒドロイミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オンの約１２．６ｍｇを、磁気攪拌子を備える、密閉したキャップを伴う４ｍｌのガラスバイアル中で、および、磁気撹拌機を使用することによって、５０℃で、～２５０μｌアセトン（ｐ．ａ．グレード）中に溶解した。５０℃で、約６．１ｍｇエタンジスルホン酸（～１．２当量）を、熱溶液に加え、０．１Ｋ／分の冷却速度で、５℃まで冷却した。混合物を、５℃で数時間の最終的な平衡化ステップの前に、反復して５０℃まで加熱し（約３０分以内に）、そして、撹拌下で、５℃まで、冷却した（０．１Ｋ／分で）。最終的に得られた固体成分を、遠心分離によって分離し、窒素パージの下で穏やかに乾燥させた。

例６：
化合物３、４、および５の調製
８－（１，３－ジメチルピラゾール－４－イル）－１－［３－フルオロ－５－（トリジュウテリオメトキシ）－４－ピリジル］－７－メトキシ－３－メチル－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オンの合成

ステップａ：
シールドチューブに、以下を配置した：１－（３，５－ジフルオロピリジン－４－イル）－８－（１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－７－メトキシ－３－メチル－１Ｈ，２Ｈ，３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オン（９０．０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、９５％）、炭酸カリウム（８５．３ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）、ＣＤ_３ＯＤ（０．３０ｍｌ、６．７４ｍｍｏｌ）、Ｎ、Ｎ－ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）。混合物を、１００℃で１時間撹拌した。１０ｍｌの水は加えられた、そして、結果として生じる溶液は酢酸エチル（１０ｍｌ）で３回抽出され、および組み合わせた有機の層は、無水硫酸ナトリウムで乾燥され、濾過され、そして、濾過物は減圧下で乾燥するまで濃縮された。粗残渣を、分取ＨＰＬＣ（島津（ＨＰＬＣ－１０）：カラム：Ａｔｌａｎｔｉｓ ＰｒｅｐＴ３ ＯＢＤカラム、１９＊２５０ｍｍ、１０μｍ；移動相：水（１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＨ_４ＨＣＯ_３）およびアセトニトリル（３４％アセトニトリルで１０分間保つ）；検出器：ＵＶ２５４ｎｍ）によって精製し、白色固体として８－（１，３－ジメチルピラゾール－４－イル）－１－［３－フルオロ－５－（トリジュウテリオメトキシ）－４－ピリジル］－７－メトキシ－３－メチル－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オンの３５ｍｇ（３８％）を産生した。融点２６０～２６２℃．ＨＰＬＣ／ＭＳ（純度）９７％。Ｒｔ１．９８分（方法Ａ）。［Ｍ＋Ｈ］＋４５２。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）ｐｐｍ＝８．９２（ｓ、１Ｈ）、８．７０（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．８３（ｓ、１Ｈ）、７．５４（ｓ、１Ｈ）、７．００（ｓ、１Ｈ）、３．９４（ｓ、３Ｈ）、３．７８（ｓ、３Ｈ）、３．６０（ｓ、３Ｈ）、１．７５（ｓ、３Ｈ）。

８－（１，３－ジメチルピラゾール－４－イル）－１－［３－フルオロ－５－（トリジュウテリオメトキシ）－４－ピリジル］－７－メトキシ－３－（トリジュウテリオメチル）イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オンの合成

ステップｂ：
丸底フラスコの中に、Ｎ、Ｎ－ジメチルホルムアミド（５０ｍｌ）中の８－ブロモ－１－（３，５－ジフルオロピリジン－４－イル）－７－メトキシ－１Ｈ，２Ｈ，３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オンを、配置した（３．００ｇ、６．９６ｍｍｏｌ、９４％）。水素化ナトリウム（１．３９ｇ、３４．８ｍｍｏｌ、６０％）を、０℃で５分以内に加え、続いて、ＣＤ３Ｉの添加を行った（３．１８ｇ、２０．９ｍｍｏｌ、９５％）。結果として生じた溶液を、室温で１５分間、撹拌した。混合物に、５００ｍｌの氷水を加え、そして、固体を、ろ過によって収集した。これは、黄色の固体として８－ブロモ－１－（３，５－ジフルオロ－４－ピリジル）－７－メトキシ－３－トリジュウテリオメチル）イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オンの２．９５ｇ（９９％）に、結果としてなった。ＨＰＬＣ／ＭＳ（純度）９９％。
Ｒｔ０．９３分（方法Ｂ）。［Ｍ＋Ｈ］＋４２４、４２６。
ステップｃ：

アルゴンの不活性雰囲気によってパージし、維持したシールドチューブの中に、８－ブロモ－１－（３，５－ジフルオロ－４－ピリジル）－７－メトキシ－３－トリジュウテリオメチル）イミダゾ－［４，５－ｃ］キノリン－２－オン（１．８０ｇ、４．２０ｍｍｏｌ、９９％）、１，３－ジメチル－４－（テトラメチルの－１，３，２－ジオキソボロラン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール（１．９７ｇ、８．４３ｍｍｏｌ、９５％）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（５４０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ、９０％）、炭酸カリウム（１．２２ｇ、８．３９ｍｍｏｌ、９５％）、ジオキサン（５０ｍｌ）、および水（１０ｍｌ））を、配置した。混合物を、８０℃で２時間撹拌し、減圧下で、乾燥するまで濃縮した。残渣を、カラムクロマトグラフィ（メタノール／エチル・アセタート、１３：８７）によって、精製し、黄色の固体として、１－（３，５－ジフルオロ－４－ピリジル）－８－（１，３－ジメチルピラゾール－４－イル）－７－メトキシ－３－（トリジュウテリオメチル）イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オンの１．３５ｇ（７１％）が、結果として生じた。ＨＰＬＣ／ＭＳ（純度）９７％。Ｒｔ０．９１分（方法Ｃ）。［Ｍ＋Ｈ］＋４４０。

ステップｄ：
アルゴンの不活性雰囲気によってパージし、維持したシールドチューブの中に、１－（３，５－ジフルオロ－４－ピリジル）－８－（１，３－ジメチルピラゾール－４－イル）－７－メトキシ－３－（トリジュウテリオメチル）イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オン（１．３５ｇ、２．９６ｍｍｏｌ）（Ｎ、Ｎ－ジメチルホルムアミド（３０ｍｌ）、炭酸カリウム（８１８ｍｇ、５．９２ｍｍｏｌ）、およびＣＤ_３ＯＤ（２．７６ｍｌ、２．２４ｇ、６２．２ｍｍｏｌ））を、配置した。混合物は２時間１００℃で撹拌した。１００ｍｌの水を加え、そして、結果として生じる混合物を、２００ｍｌの酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層を、１００ｍｌのブラインによって、二回洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥するまで濃縮し、粗生成物を、メタノール／アセトニトリル（１：２５）から結晶化して、オフホワイトの固体として８－（１，３－ジメチルピラゾール－４－イル）－１－［３－フルオロ－５－（トリジュウテリオメトキシ）－４－ピリジル］－７－メトキシ－３－（トリジュウテリオメチル）イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オンの１．５０ｇ（６６％）を産生した。融点２６６－２７１℃．ＨＰＬＣ／ＭＳ（純度）９７％。Ｒｔ２．００分（方法Ｃ）。［Ｍ＋Ｈ］＋４５５。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）ｐｐｍ＝８．８７（ｓ、１Ｈ）、８．６５（ｄ、 ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．７８（ｓ、１Ｈ）、７．４９（ｓ、１Ｈ）、６．９５（ｓ、１Ｈ）、３．８９（ｓ、３Ｈ）、３．２８（ｓ、３Ｈ）、１．７１（ｓ、３Ｈ）。

１－［３－フルオロ－５－（トリジュウテリオメトキシ）－４－ピリジル］ －７－メトキシ－３－メチル－８－［３－メチル－（トリジュウテリオメチル）ピラゾール－４－イル］イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オンの合成

ステップｅ：
丸底フラスコの中に、Ｎ、Ｎ－ジメチルホルムアミド（３０ｍｌ）中の１－（３，５－ジフルオロピリジン－４－イル）－７－メトキシ－３－メチル－８－（３－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１Ｈ，２Ｈ，３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オン（８９０ｍｇ、１．８９ｍｍｏｌ、９０％）を、配置した。水素化ナトリウム（３７７ｍｇ、９．４３ｍｍｏｌ、６０％）を５に０℃で、つづいて、ＣＤ３Ｉ（１．４４ｇ、９．４４ｍｍｏｌ、９５％）を加えた。結果として生じた混合物を、室温で８時間、撹拌した。氷水の２００ｍｌを加え、そして、溶液を、酢酸エチルの２００ｍｌで、４回抽出した。合わせた有機層を、１００ｍｌのブラインによって、二回洗浄した。有機相を、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥するまで濃縮し、ジクロロメタン／メタノール（１９：１）を伴うカラムクロマトグラフィによって精製して、黄色の固体として１－（３，５－ジフルオロ－４－ピリジル）－７－メトキシ－３－メチル－８－［３－メチル－１－（トリジュウテリオメチル）ピラゾール－４－イル］イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オンの４００ｍｇ（４７％）を、産生した。ＨＰＬＣ／ＭＳ（純度）９８％。Ｒｔ０．６８分（方法Ｄ）。［Ｍ＋Ｈ］＋４４０。

ステップｆ：
アルゴンの不活性雰囲気によってパージし、維持したシールドチューブの中に、１－（３，５－ジフルオロ－４－ピリジル）－７－メトキシ－３－メチル－８－［３－メチル－１－（トリジュウテリオメチル）ピラゾール－４－イル］イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オン（３８０ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ、９８％）、Ｎメチル－２‐ピロリドン（２０ｍｌ）、炭酸カリウム（３６８ｍｇ、２．５３ｍｍｏｌ、９５％）、およびＣＤ_３ＯＤ（２．４５ｍｌ、５３．９ｍｍｏｌ、９８％））を、配置した。混合物を４時間１００℃で撹拌した。１００ｍｌの水を加え、そして、結果として生じる溶液を、５回１００ｍｌの酢酸エチルによって抽出した。合わせた有機層を、１００ｍｌのブラインによって２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥するまで濃縮し、ジクロロメタン／メタノール（１０：１）を伴うカラムクロマトグラフィによって精製して、橙色固体として１－［３－フルオロ－５－（トリジュウテリオメトキシ）－４－ピリジル］－７－メトキシ－３－メチル－８－［３－メチル－１－（トリジュウテリオメチル）ピラゾール－４－イル］イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オンの３００ｍｇ（７４％）を、産生した。ＨＰＬＣ／ＭＳ（純度）９５％。Ｒｔ０．６５分（方法Ｄ）［Ｍ＋Ｈ］＋４５５。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）ｐｐｍ＝８．８７（ｓ、１Ｈ）、８．６５（ｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．７８（ｓ、１Ｈ）、７．４９（ｓ、１Ｈ）、６．９５（ｓ、１Ｈ）、３．８９（ｓ、３Ｈ）、３．５５（ｓ、３Ｈ）１．７１（ｓ、３Ｈ）。
ＨＰＬＣ方法Ａ：カラムＳｈｉｍ－ｐａｃｋ ＸＲ－ＯＤＳ、３．０＊５０ｍｍ、２．２μｍ；移動相Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ、移動相Ｂ：セトニトリル／０．０５％ＴＦＡ；流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；勾配：２．２分で５％Ｂ～１００％Ｂ、１．０分保持；２５４ｎｍ。

ＨＰＬＣ方法Ｂ：
カラムＳｈｉｍ－ｐａｃｋ ＸＲ－ＯＤＳ、３．０＊５０ｍｍ、２．２μｍ；移動相Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ、移動相 Ｂ：アセトニトリル／０．０５％ＴＦＡ；流速：１．２ｍＬ／分；勾配：２．０分で５％Ｂ～１００％Ｂ、０．７分保持；２５４ｎｍ。

ＨＰＬＣ方法Ｃ：
カラムＰｏｒｏｓｈｅｌｌ ＨＰＨ－Ｃ１８、３．０＊５０ ｍｍ、２．７μｍ；移動相Ａ：水／５ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３、移動相Ｂ：アセトニトリル：流速：１．３ｍＬ／ｍｉｎ；勾配：２．１分で１０％Ｂ～９５％Ｂ、０．６分保持；２５４ｎｍ。

ＨＰＬＣ方法Ｄ：
カラムＡｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃ１８、３．０＊５０ｍｍ、２．７μｍ；移動相Ａ：水／０．０５％ＴＦＡ、移動相Ｂ：アセトニトリル／０．０５％ＴＦＡ；流速：１．５ｍｌ／分；勾配：１．２分で５％Ｂ～１００％Ｂ、０．５分保持；２５４ｎｍ。

例７：化合物１の固体形態および溶媒和物
Ａ．固体形態Ａ２の調製
化合物１の固体形態Ａ２を、アルコールから種々の冷却結晶化プロセスによって調製した：
７．１ 化合物１を、撹拌下５０℃で、１－プロパノール中に約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で、溶解した。結果として生じる透明な溶液は－２０°の少なくとも１時間の最終的なホールド期間とともに、－２０℃に０．１の℃／ｍｉｎ．の冷却速度で冷却した。固液分離は減圧吸引の上のろ過によって遂行された、そして、濾過された固体試料は動的な窒素パージの下で終夜乾燥した。

７．２ 化合物１を、撹拌下５０℃で、イソ－ブチルアルコール中に約４０ｍｇ／ｍＬの濃度で、溶解した。結果として生じた透明な溶液を、－２０℃での少なくとも１時間の最終的なホールド期間とともに、－２０℃に０．１℃／分の冷却速度で冷却した。固液分離を、減圧吸引でろ過によって遂行し、そして、濾過した固体試料を、動的な窒素パージの下で、終夜乾燥した。

７．３ 化合物１の水和物の形態Ｈ２（その調製は、下に記載されている）を、２－ＰｒＯＨ中に、１２％（ｍ／ｍ；化合物１の乾燥塊と比較して）の濃度レベルで、分散した。結果として生じた分散体を、撹拌下で８０℃まで加熱し、透明な溶液を得た。８０から７０℃への最初の冷却ランプを、―７０℃のこれに続くホールド時間とともに、０．５℃／分の速度で流した。７０℃で、無水形態Ａ２の種結晶（すり砕いた粒子＜５０μｍ；反応器の量に比較して約４．５％）を、加えた。種結晶を、１００ mg種量当たり約１ｍｌの２－ＰｒＯＨ中に、プレ分散した。１０分のホールド時間を、７０°Ｃで播種の後に適用した。７０°Ｃから５°Ｃへの冷却ランプを、0.1°Ｃ／ｍｉｎで流し、続いて、最終的な終了温度（５°Ｃ）で、３時間、ホールドした。固液分離を、減圧吸引でろ過によって遂行し、そして、濾過した固体試料を、動的な窒素パージの下で、７０℃で終夜乾燥した。
代替の方法において、形態Ａ２を、スラリー変換によって種々の多形形態から、以下の通りに調製した：

７．４ 固体成分、とりわけ化合物１の種々の多形形態、最も好ましくは水和物の形態Ｈ２（調製は、下に記載されている）を、約５．２ｖｏｌ－当量の酢酸エチル中に分散させ、そして、２１時間ＲＴで、撹拌した。
沈殿物を、吸引によってろ過して取り除き、６０℃で少なくとも７２時間、減圧下で乾燥した。

Ｂ．固体形態Ａ１の調製
化合物１の固体形態Ａ１を、以下の２つの方法によって調製した：
７．５ ８－（１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１－（３－フルオロ－５－メトキシ－ピリジン－４－イル）－７－メトキシ－３－メチル－１，３－ジヒドロイミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オン（ラセミ混合物）の約５０ｍｇを、５ｍｌ／分の流速で、Ｌｕｘ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ－２カラム、およびＣＯ_２／２－プロパノール＋０．５％のＤＥＡ（７５：２５）の混合溶媒を使用して、ＳＦＣキラル分離に、付した。得られた画分を、ジクロロメタンでゆすぎ、３０℃バス温度で濃縮して、固体を得た。

７．６ １００μＬジクロロメタン（ＤＣＭ）中に溶解した８－（１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１－（Ｓａ）－（３－フルオロ－５－メトキシ－ピリジン－４－イル）－７－メトキシ－３－メチル－１，３－ジヒドロイミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オンの約１０ｍｇを、ＲＴ（ＲＴ：室温、２０～２５℃）で蒸発エバポレートし、粉末を、得た。

Ｃ．固体形態Ａ３の調製
７．７ Ａ３以外の代替の多形形態を表している、最も好ましくは形態Ａ２を表している、８－（１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１－（Ｓａ）－（３－フルオロ－５－メトキシ－ピリジン－４－イル）－７－メトキシ－３－メチル－１，３－ジヒドロイミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オン固形材料の約１２ｍｇを、約４０μＬ ＴＨＦに分散し、そして、ＲＴ（２０～２５℃）で約４週間、撹拌した。得られた固体を、遠心分離によって分離し、周囲条件で穏やかに乾燥して、粉末を得た。

Ｄ．固体形態ＮＦ９の調製：
化合物１の固体形態ＮＦ９を、以下の２つの方法によって調製した：
７．８ ２０００Ｌジクロロメタン中に溶解した８－（１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１－（Ｓａ）－（３－フルオロ－５－メトキシ－ピリジン－４－イル）－７－メトキシ－３－メチル－１，３－ジヒドロイミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オンの約１００ｍｇを、ＲＴ（約２０～２５℃）で急速にフラッシュエバポレートし、粉末を、得た。

７．９ ５０℃で１０００μＬアセトン中に溶解した、８－（１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１－（Ｓａ）－（３－フルオロ－５－メトキシ－ピリジン－４－イル）－７－メトキシ－３－メチル－１，３－ジヒドロイミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オンの約２０ｍｇを、１当量の安息香酸に加えた。溶液を、ＲＴ（約２０～２５℃）まで冷却した。溶液を、ｎ－ペンタンのレザーバーを使用したＲＴ（約２０～２５℃）での蒸気拡散結晶化、気相拡散を経たゆっくりした溶液の中への拡散に付した。数日後に、固体を結晶化し、それを、遠心分離によって分離し、窒素パージの下で穏やかに乾燥させて、粉末を得た。

Ｅ．固体水和物形態Ｈ１の調製
化合物１の水和物の固体形態Ｈを、以下の２つの方法によって得た：
７．１０ Ｈ１以外の代替の多形形態、最も好ましくは形態Ａ２を表している、８－（１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１－（Ｓａ）－（３－フルオロ－５－メトキシ－ピリジン－４－イル）－７－メトキシ－３－メチル－１，３－ジヒドロイミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オン固形形態の約１２～１３ｍｇを、約２００μＬメタノールに分散し、そして、ＲＴ（２０～２５℃）で約５週間、撹拌した。得られた固体を、遠心分離によって分離し、周囲条件で穏やかに乾燥して、粉末を得た。

７．１１ ７５０μＬ １－プロパノール中に溶解した８－（１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１－（Ｓａ）－（３－フルオロ－５－メトキシ－ピリジン－４－イル）－７－メトキシ－３－メチル－１，３－ジヒドロイミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オンの約１２ｍｇを、ＲＴ（約２０～２５℃）でエバポレートし、粉末を、得た。

Ｆ．固体水和物形態Ｈ２の調製
７．１２ Ｈ２以外の代替の多形形態を表している、最も好ましくは形態Ａ２を表している、８－（１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１－（Ｓａ）－（３－フルオロ－５－メトキシ－ピリジン－４－イル）－７－メトキシ－３－メチル－１，３－ジヒドロイミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オン固形形態の約１９ｇを、約８０ｍＬ ＤＩ水に分散し、そして、ＲＴ（２０～２５℃）で約４日間、撹拌した。得られた固体を、減圧ろ過によって分離し、５０℃で窒素パージの下で乾燥して、粉末を得た。

７．１３ ２５０μＬ ＴＨＦ中に溶解した８－（１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１－（Ｓａ）－（３－フルオロ－５－メトキシ－ピリジン－４－イル）－７－メトキシ－３－メチル－１，３－ジヒドロイミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オンの約１３～１４ｍｇを、荒い攪拌下で、１５００μＬ ＤＩ水のレザーバーに、ＲＴ（約２０～２５℃）で急速に注いだ。得られた沈殿物を、遠心分離によって分離し、周囲条件で穏やかに乾燥して、粉末を得た。

Ｇ．固体形態ＮＦ１９の調製
７．１４ １５００μＬ１－プロパノール中に溶解した８－（１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１－（Ｓａ）－（３－フルオロ－５－メトキシ－ピリジン－４－イル）－７－メトキシ－３－メチル－１，３－ジヒドロイミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オンの約４８ｍｇを、５０℃でエバポレートし、粉末を、得た。

例８：放射線治療との組み合わせ
図２０に示すとおり、ｉｎ ｖｉｖｏ薬理学試験において（ＦａＤｕ ＳＳＣＨＮ腫瘍モデル）、随伴する化合物１と６週間の分割照射（６×５日、１分画につき２Ｇｙ）の組み合わせ処置は、標的エンゲージメントのレベルに沿って、用量依存的やり方におけるＩＲ（照射）の有効性を強く増強した。詳細には：

ヒト扁平上皮細胞頭頸部モデルＦａＤｕの異種移植片を担持するＮＭＲＩ ｎｕ／ｎｕマウスにおける照射（ＩＲ）と組み合わせて、ＡＴＭ阻害剤化合物１の抗腫瘍有効性を、評価した。

対照群の１つを、ビヒクルだけで処置した。他の対照群を、５日間オン／２日間オフスケジュールにおいて、そして、６週間の期間にわたって、２Ｇｙの３０画分のＩＲだけで処置した。２つの群を、各ＩＲ画分の３０分前に、ＩＲ（ＩＲのみの対照においてのように）を、１０ｍｇ／ｋｇまたは２５ｍｇ／ｋｇの経口用量の化合物１と組み合わせて、処置した。

例９：ＰＡＲＰ阻害との組み合わせ
オラパリブと組み合わされた化合物１の有効性は、免疫不全雌マウスにおいて開発された、ＨＢＣｘ－１０患者由来三重陰性乳がん異種移植モデルにおいて立証され、その結果を、図２１において示す。

皮下に成長した６２．５と１９６．０ｍｍ^３の間のＨＢＣｘ－１０腫瘍（Ｐ２０．１．４／０）を伴う７０匹のマウスを、それらの平均値および中央値の腫瘍容量が、それぞれ１３１．１６および１２６．００ｍｍ^３に到達する場合に、処置に割り当てた。
試験は、各１０匹のマウスの様々な群を含む：
－群１において、１０ｍｌ／ｋｇ経口ビヒクル メトセルと組み合わせて、ビヒクル オラパリブを、１０ｍｌ／ｋｇ経口１日１回×２８で、投与した。
（３日間オン／４日間オフ）×４；
－群２において、オラパリブを、５０ｍｇ／ｋｇ経口１日１回×４９で投薬した；
－群３において、比較のＡＴＭ阻害剤ＡＴＭｉｘ単独を経口で与えた（３日間オン／４日間オフ）×５；
－群４において、ＡＴＭｉｘ経口（３日間オン／４日間オフ）×７と組み合わせて、オラパリブを、５０ｍｇ／ｋｇ経口１日１回×４９で投薬した；

－群５において、化合物１の１００ｍｇ／ｋｇ経口（３日間オン／４日間オフ）×７でと組み合わせて、オラパリブを、５０ｍｇ／ｋｇ経口１日１回×４９で、投薬した。腫瘍を、処置期間の間は、隔週に、そして、追跡調査期間の間は、週１回、測定した。
ｐ．ｏ． 経口的に－ｄ 日－quaque die １日１回

Claims (15)

1. 以下の式化合物１またはそれらの薬学的に許容し得る塩によって表される、化合物。
   

   
2. 以下の式化合物２またはそれらの薬学的に許容し得る塩によって表される、化合物。
   

   
3. 化合物１のフマラート、化合物１のナプシラート、および化合物１のエジシラートから選択される、請求項１に記載の化合物１の薬学的に許容し得る塩。
4. 化合物１の固体の無水形態。
5. 約７．３、約９．６、約１１．１、約１２．０、約１２．７、および約１６．２度２－シータ±０．２度２－シータでのものから選択される、粉末Ｘ線回折パターンにおける１以上のピークによって特徴づけられる、請求項４に記載の化合物１の固体の無水形態。
6. 単位細胞の単斜結晶系およびＰ２_１空間群および／または以下のパラメータの単位格子を有することにおいて特徴づけられる、請求項４または５に記載の化合物１の固体の無水形態：
   

   
7. 以下から選択される化合物：
   

   

   
   および、それらのアトロプ異性体および薬学的に許容し得る塩。
8. 以下から選択される、請求項７に記載の化合物：
   

   

   
   および、それらの薬学的に許容し得る塩。
9. 請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物、それらの薬学的に許容し得る塩、または固体の無水形態、および薬学的に許容し得る賦形剤を含む、医薬組成物。
10. 患者に、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物、それらの薬学的に許容し得る塩、または固体形態、または請求項９に記載の医薬組成物を投与することを含む、患者における、がんおよび／または腫瘍を処置するための、方法。
11. 放射線治療と組み合わせて、化合物、それらの薬学的に許容し得る塩、固体の無水形態、または医薬組成物を投与することを含む、請求項１０に記載の方法。
12. ＤＮＡ－損傷剤と組み合わせて、化合物、それらの薬学的に許容し得る塩、固体の無水形態、または医薬組成物を投与することを含む、請求項１０に記載の方法。
13. 腫瘍が、扁平上皮、膀胱、胃、腎臓、頭部、頸部、食道、子宮頸部、甲状腺、腸、骨、肝臓、脳、前立腺、尿生殖路、リンパ系、喉頭、肺、皮膚、血液、および免疫系の疾患の群から選択され、および／またはここで、がんが、単球性白血病、肺腺がん、小細胞肺癌腫、膵がん、神経膠芽細胞腫、腸管の癌腫、乳がん、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫の群から選択される、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 請求項１０～１３のいずれか一項に記載のがんおよび／または腫瘍の処置のための、薬物の製造における、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物、それらの薬学的に許容し得る塩、または固体の無水形態の使用。
15. 任意に放射線治療および／またはＤＮＡ－損傷剤と組み合わせた、がんおよび／または腫瘍の処置のための、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物、それらの薬学的に許容し得る塩、または固体形態。
    
    

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