MX2011005656A - Metodo y dispositivo para citometria de flujo sin fluido de vaina. - Google Patents

Metodo y dispositivo para citometria de flujo sin fluido de vaina.

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Abstract

La invención se refiere a un método y a un dispositivo usado para llevar a cabo un método de citometría de flujo, de manera preferente propuesto para, pero no limitado al conteo de diferenciación de células sanguíneas blancas. De manera más específica, la invención se refiere al campo de dispositivos simplificados de hematología con bajos costos de operación. De acuerdo a la invención, el método se caracteriza en que la técnica de medición de impedancia se usa para identificar partículas que tienen una trayectoria que no ha pasado a través de un área predeterminada de medición óptica para tratar las partículas de manera selectiva, eliminando de este modo el uso de fluidos de vaina a fin de guiar las partículas hacia el área de medición.

Description

METODO Y DISPOSITIVO PARA CITOMETRIA DE FLUJO SIN FLUIDO DE VAINA Campo de la Invención La presente invención está relacionada al campo de dispositivos automáticos para el conteo y caracterización de partículas suspendidas en un medio líquido, y de manera más particular, al campo de instrumentos de hematología para contar y caracterizar los varios tipos de células contenidas en una muestra sanguínea.
Se refiere en particular, pero no se limita a un método para contar y clasificar leucocitos.
La presente invención también se refiere a un dispositivo que emplea este método.
Antecedentes de la Invención Los leucocitos normales se clasifican en cinco tipos: monocitos, linfocitos, neutrófilos, eosinófilos y basófilos. El número total de leucocitos y su distribución relativa en estas cinco subpoblaciones hace posible establecer o guiar al practicante hacia una patología.
El estado de la técnica y la invención propuesta se refieren de esta manera a dispositivos para contar el número de leucocitos contenidos en una muestra sanguínea y para determinar su distribución relativa entre cinco subpoblaciones .
El documento conocido US 2,656,508 de .H. Coulter Ref.: 220033 et al., describe un método para el conteo absoluto de partículas en suspensión por medición de impedancia. De acuerdo con este método, el número de partículas por volumen unitario se determina por una técnica de medición de impedancia que consiste en medir el cambio en la impedancia de un micro-orificio cuando una célula sanguínea pasa a través del mismo. Esta técnica, que es simple y contundente, no requiere dispositivos hidráulicos complejos y está libre para usarse puesto que la patente US 2,656,508 que los protegió es de 1953. Por lo tanto, se usa regularmente por todos los fabricantes de dispositivos automáticos (Beckman Coulter, Abbott, Bayer, C2, Diagnostics, Sysmex, ABX, etc.) para el conteo absoluto del número de leucocitos.
Se sabe que en esta técnica de medición de impedancia, la forma de un impulso generado por el paso de una célula depende de la geometría del micro-orificio y de la trayectoria de la célula en este último. Por ejemplo, existe el artículo de Von Behrens et al. (Von Behrens, J. de Histochemistry y Cytochemistry, 1976, Vol. 24, No. 1, p.247), que describe la geometría de las líneas del campo eléctrico generado en un orificio de sección rectangular o circular, y la forma de los impulsos resistivos como una función de la trayectoria de la célula o partícula en ese orificio. La mayoría de los dispositivos de la técnica anterior intentan reducir al mínimo esta dependencia de la forma del impulso resistivo en la trayectoria al optimizar ya sea la geometría del orificio, como se describe por ejemplo por T. Zhao et al., en el documento US 2008/0093216, o el arreglo y estructura de los electrodos, como se describe por ejemplo en los documentos US 4,420,720 de Newton et al. y US 2001/0052763 de North et al., respectivamente .
Sin embargo, la técnica de medición de impedancia no proporciona, en sí misma, diferenciación confiable de las cinco subpoblaciones de leucocitos. Esta diferenciación de los leucocitos de acuerdo a sus cinco subpoblaciones se lleva a cabo de manera ventajosa al combinar la medición de impedancia con técnicas ópticas de citometría de flujo. El documento conocido US 5,812,419 de V.L. Chupps et al., describe un método de análisis automático de células sanguíneas que combina, así como la medición de impedancia, mediciones ópticas de absorción, espectrofotometría, diferenciación a diferentes ángulos y fluorescencia. De acuerdo con este método, las mediciones por medición de impedancia y citometría de flujo óptica se realizan en diferentes celdas de análisis, y los algoritmos fusionadores de datos permiten que se obtenga el conteo y caracterización deseada de las células . El método descrito por Chupps et al., muestra claramente el beneficio del uso combinado de medición de impedancia y citometría de flujo óptica, pero el uso de diferentes celdas de análisis hace muy complejo el sistema. Además, la posible no homogeneidad de las muestras sanguíneas analizadas por los diferentes métodos es una fuente apreciable de incertidumbre de medición.
El documento US 6,228,652 C.M. Rodríguez et al., describe una celda de citometría para realizar mediciones de impedancia y mediciones ópticas de manera simultánea en las mismas celdas logrando de esta manera la simplificación del dispositivo y la reducción de los problemas de correlacionar las mediciones entre múltiples transductores. El dispositivo de acuerdo a US 6,228,652 hace de esta manera posible medir, para cada celda, su volumen, que es una función de su resistividad con voltaje directo, su opacidad de radiofrecuencia que es una función de su conductividad a la frecuencia eléctrica de medición, y sus características ópticas de difracción y fluorescencia.
La simplificación de dispositivos es un reto industrial considerable en el desarrollo de dispositivos automáticos para hematología, puesto que abre mercados considerables en pequeñas instalaciones de cuidado de la salud y en los países emergentes. Por ejemplo, el documento FR 2 653 885 de D. Lefevre et al., describe un dispositivo para citometría óptica y eléctrica en el cüal los electrodos para medición de resistividad son partes constituyentes del dispositivo para la transferencia del flujo de células.
La citometría óptica de flujo impone restricciones importantes en términos de colocación relativa del flujo que contiene las células y el medio de eliminación. En realidad, es importante para la calidad de las mediciones ópticas que las células pasen a través del haz en una zona, llamada zona de medición óptica, en donde la eliminación se puede considerar como suficientemente uniforme en intensidad. Una célula que pasa a través del haz en una zona donde la eliminación es incorrecta puede dar lugar a una medición incorrecta y a un error en la determinación del tipo de célula. Por lo tanto, la dificultad consiste en forzar el flujo que transporta las células para circular de una manera tal que esté completamente dentro de la zona de medición de óptica de intensidad uniforme.
,La solución empleada en general en los dispositivos de la técnica anterior incluye el uso de uno o más flujos de vaina, también llamados corrientes de vaina, que circulan de manera concéntrica con estos flujos de vaina extraen la corriente central, y de esta manera confinan de manera muy exacta las partículas que contienen. De esta manera, la FR 2 653 885 emplea por ejemplo una técnica de doble vaina, de acuerdo a lo cual la corriente central se confina por dos flujos concéntricos de vaina. La generación del flujo de vaina y de la corriente central que transporta las células sanguíneas requiere múltiples entradas hidráulicas así como micro-boquillas. Esto conduce a montajes particularmente densos de componentes hidráulicos alrededor de la zona de medición, haciendo difícil y costoso el montaje de los censores. Además, para que sea efectiva la localización de las partículas por el flujo de vaina, la velocidad del flujo de vaina debe ser mucho mayor que la velocidad del flujo que contiene la muestra. Esto significa que un volumen considerable del reactivo empleado, en general un diluyente, no es de uso químico sino sólo se usa para guiar el flujo de la muestra que se va a medir. Son obvios los efectos en términos del consumo de reactivos y producción de residuos.
Breve Descripción de la Invención Además, el grado de dilución usada en soluciones de este tipo es incompatible con el grado de dilución requerida para la medición de hemoglobina, que en general se mide con la dilución de los leucocitos y por lo tanto hace necesaria la dilución adicional, así como elementos hidráulicos, costosos, adicionales.
El propósito de la presente invención es proponer un método de citometría de flujo que comprende mediciones de impedancia y mediciones ópticas, que no requiere un flujo de vaina, permitiendo de esta manera una simplificación considerable de la celda de medición y de los elementos hidráulicos asociados.
Otro propósito de la presente invención es proponer un dispositivo que emplee el método, que sea más simple y más económico tanto de fabricar como de mantener, que los dispositivos de la técnica anterior, de modo que se pueden usar dispositivos automáticos equipados de esta manera por laboratorios más pequeños en tanto que se conserva una calidad equivalente de medición.
Este objetivo se logra con un método de citometría de flujo para la caracterización de partículas que comprenden los pasos de : - transferir un fluido que contiene partículas a través de una celda de flujo de abertura, esta celda de flujo de abertura que es al menos en parte sustancialmente transparente a al menos una longitud de onda de interés, y al menos en parte sustancialmente aislante a electricidad, medición de la variación de la impedancia eléctrica generada por el paso de las partículas contenidas en el fluido a través de la celda de flujo de abertura, - medición de al menos una propiedad óptica de las partículas, que interactúan con al menos un haz de luz que pasa a través de la celda de flujo de abertura, - caracterización de las partículas al usar las mediciones de la variación de impedancia eléctrica y propiedades ópticas, caracterizado en que comprende además los pasos de: - deducir la información de la trayectoria de las partículas en la celda de flujo de abertura, al menos del análisis de la medición de la variación de impedancia eléctrica, aprovechamiento de la información de la trayectoria para acondicionar la caracterización de las partículas, De acuerdo a características particularmente ventajosas, - el método de acuerdo a la invención es un método de citómetría de flujo que no requiere el uso de un flujo de vaina o flujo de envainado como en los métodos de la técnica anterior. El principio del confinamiento físico de las partículas por los ruidos de funda se reemplaza por la posibilidad de llevar a cabo procesamiento selectivo de los datos obtenidos de las mediciones en las partículas, el procesamiento que se condiciona o determina por la información de su trayectoria; - sólo el fluido que contienen las partículas se hace pasar a través de la celda de flujo de abertura; la celda de flujo de abertura se puede simplificar considerablemente en comparación con los dispositivos de la técnica anterior. Se puede reducir a una abertura u orificio simple en la pared de una celda, a través de la cual el ruido que contienen las partículas se transporta y en la cual se llevan a cabo las mediciones.
De manera ventajosa, la medición de la variación de impedancia eléctrica puede comprender una medición de resistividad llevada a cabo en corriente directa; la medición de la variación de impedancia eléctrica también puede comprender al menos una medición de impedancia compleja llevada a cabo al menos a una frecuencia no cero; la por lo menos una propiedad óptica medida puede ser una de las siguientes propiedades ópticas: absorbancia, dispersión elástica en al menos un ángulo, dispersión inelástica en al menos un ángulo, retrodispersión elástica, retrodispersión inelástica, autofluorescencia, fluorescencia en al menos una longitud de onda provocada por al menos un marcador unido a las partículas, fluorescencia a al menos a una longitud de onda provocada por al menos un marcador unido a al menos un elemento contenido en las partículas, polarización de la luz; la caracterización de las partículas puede comprender una clasificación de las partículas; - la caracterización de las partículas también puede comprender un conteo de las partículas; el análisis de la variación y impedancia eléctrica puede comprender una variación entre la variación medida de sedancia eléctrica y al menos un elemento de comparación entre al menos un modelo de variación de impedancia eléctrica y al menos un valor numérico anteriormente definido, el resultado de la comparación que determina si la trayectoria de las partículas ha recorrido una zona anteriormente definida de la celda de flujo de abertura; - los datos que se relacionan a las partículas cuya trayectoria no pasa a través de una zona previamente definida de la celda de flujo de abertura, se pueden remover de los datos usados para la clasificación de las partículas. De esta manera, es posible en el método de acuerdo a la invención clasificar las partículas con relación a su trayectoria, por ejemplo, sólo para separar los datos de aquellos que cumplen con ciertas condiciones; la propiedad óptica medida de las partículas también se puede comparar con al menos un elemento de comparación entre al menos un modelo de propiedad óptica y al menos un valor numérico anteriormente definido. En este caso, si los resultados de las comparaciones de la variación de impedancia eléctrica y de la propiedad óptica con sus modelos o valores numéricos respectivos previamente definidos no satisfacen al menos un criterio anteriormente definido, los datos que se relacionan a las partículas se pueden remover de los datos usados para la clasificación de las partículas; - la operación de clasificación de las partículas puede comprender los pasos de atribución a las partículas de un conjunto de valores o coordenadas obtenidas del análisis de las mediciones llevadas a cabo durante su paso a través de la celda de flujo de abertura, las coordenadas que definen su posición en un espacio de presentación previamente definido, y los pasos de segmentación del espacio de representación en distintas regiones, estas regiones se agrupan conjuntamente partículas con características sustancialmente similares; - las partículas pueden comprender células sanguíneas. Estas células sanguíneas pueden ser leucocitos.
De acuerdo a otro aspecto de la invención, se propone un dispositivo de citometría de flujo para la caracterización de partículas, que comprende: - una celda de flujo de abertura al menos en parte sustancialmente transparente a al menos una longitud de onda de interés, y al menos en parte sustancialmente aislante a electricidad, - un medio para la transferencia de un fluido que contiene partículas a través de la celda de flujo de abertura, - un medio para la medición de la variación de impedancia eléctrica generada por el paso de las partículas contenidas en el fluido a través de la celda de flujo de abertura, un medio para la medición de al menos una propiedad eléctrica de las partículas, las partículas que interactúan con al menos un haz de luz que pasa a través de la celda de flujo de abertura, - un medio para el análisis de las mediciones de la variación de la impedancia eléctrica y de las propiedades ópticas, caracterizado en que comprende: un medio para deducir información de la trayectoria de las partículas en la celda de flujo de abertura, al menos del análisis de la medición del cambio en la impedancia eléctrica, y un medio para el aprovechamiento de la información de la trayectoria para acondicionar la caracterización de las partículas.
El dispositivo de acuerdo a la invención puede comprender además medios para la preparación de las partículas de interés antes de su transferencia a través de la celda de flujo de abertura. Las partículas de interés son las partículas que se desea analizar y clasificar, y que puede ser necesario separar de otras partículas presentes en la muestra, notablemente por los métodos de lisis o de dilución en el caso de células sanguíneas.
De manera ventajosa, - la geometría de la celda de flujo de abertura se puede adaptar de una manera tal que la variación medida de impedancia eléctrica durante el paso de las partículas depende sustancialmente de su trayectoria en la celda de flujo de abertura. Este resultado se puede obtener por ejemplo con una celda de flujo de abertura de sección sustancialmente rectangular cuyos bordes longitudinales terminan en esquinas con poco radio de curvatura. Se debe señalar que se está buscando un resultado opuesto a la práctica en los dispositivos de la técnica anterior, ya que más bien se espera reducir al mínimo esta dependencia de la trayectoria de las partículas; - la celda de flujo de abertura puede comprender una sección transversal interna sustancialmente de una de las siguientes formas: circular, rectangular; - la celda de flujo de abertura puede estar constituida de al menos uno de los siguientes materiales: zafiro, rubí, vidrio, plástico; - el medio para la medición de la variación de impedancia eléctrica generada por el paso de las partículas puede comprender al menos dos electrodos arreglados respectivamente en cualquier lado del orificio de la celda de flujo de abertura, los electrodos que están en contacto eléctrico con el fluido que contiene las partículas; - el medio para la medición de la variación de impedancia eléctrica generada por el paso de las partículas también puede comprender al menos un electrodo arreglado en el orificio de la celda de flujo de abertura, el electrodo que está en contacto eléctrico con el fluido que contiene las partículas. Un dispositivo de acuerdo a la invención puede comprender de esta manera por ejemplo electrodos distribuidos a lo largo de la pared de la celda de flujo de abertura. Al menos uno de los electrodos también puede ser un elemento constituyente del medio para la transferencia del fluido que contiene las partículas; - el medio para medición de la propiedad óptica de las partículas puede comprender al menos una fuente de luz, y al menos un medio de autodetección electrónica; - el medio para la medición de la propiedad óptica de las partículas también puede comprender al menos un medido óptico para enfocar la luz que viene de la fuente de luz en la celda de flujo de abertura; - el medio para la medición de la propiedad óptica de las partículas también puede comprender al menos un medio óptico para recolectar la luz que se origina de la celda de flujo de abertura; - el medio para la medición de la propiedad óptica de las partículas puede comprender además al menos un medio para la filtración espectral de la luz que viene de las partículas que se van a caracterizar; - al menos uno de los medios ópticos de medición de la propiedad óptica de las partículas se puede integrar en la celda de flujo de abertura. Esta integración por ejemplo es posible al usar una celda de flujo de abertura moldeada en plástico, cuyas paredes externas constituirán lentes par enfocar y opcionalmente para recolectar la luz. También se pueden pegar por ejemplo, directamente elementos ópticos tal como un autodetector electrónico, en la celda de flujo de abertura.
De acuerdo a una modalidad particular, el medio para la autodetección electrónica se puede arreglar de una manera tal para medir un haz de luz que viene de las partículas que se caracterizan que tiene una orientación angular diferente de aquella del eje del haz que se origina de la fuente de luz. Esta configuración hace posible, por ejemplo, mediciones de dispersión a ángulos no cero.
De acuerdo a otra modalidad particular, el medio para la medición de la propiedad óptica de las partículas puede comprender una fuente de luz que tiene un estado conocido de polarización, y un medio para la autodetección electrónica que comprende medios para el análisis de la polarización de la luz.
De acuerdo aún a otro aspecto de la invención, se propone un instrumento para análisis sanguíneo que comprende al menos un dispositivo de acuerdo a la invención, las partículas que se analizan que son células sanguíneas, y notablemente leucocitos.
Breve Descripción de las Figuras Otras ventajas y características de la invención llegarán a ser evidentes al leer la descripción detallada de las aplicaciones y modalidades, que de ninguna manera son limitantes, y las siguientes figuras anexas: La Figura 1 muestra un diagrama esquemático del dispositivo de acuerdo a la invención; La Figura 2a ilustra la influencia de la posición de las partículas en el haz de luz en la citometría de flujo. La Figura 2b representa un caso cuando el flujo de las partículas no se centra en el haz, en tanto que en la Figura 2b el flujo de las partículas se centra en el haz. El efecto se ilustra por el caso, que no es de ninguna manera limitante, de las mediciones de absorbancia,- Las Figuras 3a y 3b ilustran la deflexión de un haz de luz por la superficie de un orificio cilindrico, y la delimitación resultante de las zonas de mediciones ópticas confiable s ; La Figura 4a presenta un ejemplo de la forma de líneas equipotenciales que aparecen en una abertura microscópica hecha en un material aislante, cuando se aplica un voltaje a través de la abertura. La Figura 4b ilustra la forma de los impulsos resistivos obtenidos cuando las partículas pasan a través de esta abertura, de acuerdo a varias trayectorias. Estas ilustraciones se toman de V. Kachel, Flow cytometry y Sorting, Wiley-Liss Inc., 1990, también citado en US 2008/0093216; La Figura 5a muestra ejemplos de trayectorias de partículas dentro de una celda de flujo de abertura de forma cilindrica, así como la delimitación de la zona confiable de medición óptica como se define en las Figuras 3a-3b. La Figura 5b muestra la forma de los impulsos resistivos que se obtendrán para partículas que viajan a lo largo de las trayectorias mostradas en la Figura 5a; La Figura 6 muestra un diagrama de flujo de la adquisición de datos y el procesamiento de datos de acuerdo a una modalidad preferida del método de acuerdo a la invención; La Figura 7 muestra un diagrama de sincronización de la adquisición y procesamiento de datos de acuerdo con el diagrama de flujo de la Figura 6; La Figura 8 muestra ejemplos de señales medidas que corresponden respectivamente a impulsos resistivos a impulsos ópticos que resültan de mediciones de absorbancia.
Estas señales son respectivamente representativas, de las trayectorias TI y T4 como se muestra en la Figura 5 ; La Figura 9 muestra ejemplos de diagramas de clasificación de partículas, en este caso leucocitos, obtenidos con un dispositivo de acuerdo a la invención. La Figura 9a muestra un caso cuando todas las partículas detectadas se representan. La Figura 9b muestra sólo las partículas clasificadas de acuerdo con el método de la invención; La Figura 10 muestra una modalidad, que se prefiere pero de ninguna manera es limitante, de un dispositivo de acuerdo a la invención.
La Figura 11 se muestra un diagrama esquemático de un dispositivo de la técnica anterior que emplea el confinamiento de las partículas en la zona de medición óptica por medio de fluidos de vaina.
Descripción Detallada de la Invención Una modalidad que se prefiere, pero de ninguna manera es limitante, del dispositivo que emplea el método de acuerdo a la invención en un instrumento para contar y caracterizar los varios tipos de células contenidas en una muestra sanguínea, y en particular leucocitos, se describirá, con referencia a las figuras. Este instrumento se puede usar, por ejemplo, para determinar el número total de leucocitos y su distribución relativa en sus cinco subpoblaciones : monolitos, linfocitos, neutrófilos, eosinófilos y basófilos.
En el resto de la descripción, se asume que las partículas son células sanguíneas blancas o leucocitos, pero esto no se propone que sea de ningún modo limitante.
Con referencia a la Figura 1, el dispositivo que emplea el método de acuerdo a la invención comprende una celda 2 de flujo de abertura, a través de la cual se hace pasar un fluido 3 que contiene las partículas 4. Esta celda de flujo de abertura comprende un orificio 1, donde se presentan principalmente las interacciones entre las partículas y el medio de medición. La transferencia del fluido 3 a través de la celda 2 de flujo de abertura se puede hacer por varias técnicas en tanto que permanezcan dentro del alcance de la invención, entre las cuales se puede mencionar de forma notable el flujo por gravedad, aspiración, e inyección bajo presión.
De manera preferente, la celda 2 de flujo de abertura y el orificio 1 son sustancialmente de sección transversal circular, y el orificio 1 tiene un diámetro del orden de 80 µt?. Estas especificaciones por supuesto, no son de ningún modo limitantes, y un dispositivo de acuerdo a la invención también puede comprender sólo una celda 2 de flujo de abertura de sección sustancialmente rectangular, o poligonal, con un tamaño diferente.
Para permitir mediciones de impedancia y mediciones ópticas, la celda 2 de flujo de abertura debe constituir al menos en parte de al menos un material que sea sustancialmente aislante a electricidad, y al menos en parte de al menos un material que sea sustancialmente transparente a las longitudes de onda, ópticas, de interés. De acuerdo a una modalidad preferida, se hace de zafiro. Por supuesto, es posible, en tanto que permanezcan dentro del alcance de la invención, enfriar una celda 2 de flujo de abertura hecha de algún otro material, tal como rubí, un vidrio, un polímero o un plástico, o aún hecha con una combinación de varios materiales.
De acuerdo a una modalidad preferida, los electrodos 5 se arreglan en cualquier lado de la celda 2 de flujo de abertura. Están en contacto eléctrico con el fluido, para permitir que se establezca un campo eléctrico longitudinal en la celda de flujo de abertura y en particular a través del orificio 1. Estos electrodos 5 se conectan a un dispositivo 6 que mide las variaciones de impedancia durante el paso de las partículas 4 a través del orificio 1 de la celda 2 de flujo de abertura, es decir, la forma temporal y la amplitud de los impulsos debido al paso de estas partículas. La medición de la impedancia empleada en el dispositivo de acuerdo a la invención es, de manera preferente, pero no se limita a, una medición de la resistividad llevada a cabo con corriente directa.
De acuerdo a una modalidad preferida, el dispositivo de acuerdo a la invención comprende al menos un dispositivo para mediciones ópticas, el principio general de lo cual es la medición del resultado de una interacción entre una partícula tal como un leucocito y un haz de luz. Es medición también se llama medición de una propiedad óptica de la partícula.
Con referencia a la Figura 1, este dispositivo para medición óptica puede comprender de manera notable una fuente 8 de luz, y al menos un medio 13 de detección. También puede contener al menos un medio óptico para enfocar espacio 9 del haz 7 en la celda 2 de flujo de abertura, y al menos un medio óptico' para recolectar espacio 11 a la luz de la celda de flujo de abertura.
La fuente 8 de luz puede ser por ejemplo un láser, un diodo de láser, o un diodo emisor de luz.
El medio óptico para enfocar espacio 9 y para colectar en espacio 11 puede comprender notablemente lentes esféricos, asféricos o cilindricos, o componentes ópticos de libre forma, con gradientes de índices y/o superficies reflejantes (espejos) . También pueden comprender al menos una guía de luz, que por ejemplo guía los haces que se originan de la zona de medición hacia la superficie sensible del medio 13 de detección.
El medio 13 de detección puede comprender al menos un fotodetector tal como un fotodiodo, un fotodiodo de avalancha o un tubo fotomultiplicador .
De manera ventajosa, al menos uno de los medios ópticos para enfocar 9 y para recolectar 11 puede estar al menos en parte integrado con la celda 2 de flujo de abertura, por ejemplo al unir o al adaptar la forma externa de este último para constituir la superficie de un lente. También es posible fijar el medio 13 de detección directamente en la celda 2 de flujo de abertura, opcionalmente sin emplear el medio 11 de colección.
De acuerdo a una modalidad que se prefiere, pero no es de ningún modo limitante, el dispositivo de acuerdo a la invención, se emplea una medición de absorbancia, en la cual se mide una variación de la intensidad de luz en el detector 13 cuando un leucocito atraviesa el haz 7 de luz. Esto es la medición de la propiedad óptica que se desarrollará en el resto de la descripción. Sin embargo, una persona experta en la técnica será capaz fácilmente de usar el método de acuerdo a la invención en dispositivos que emplean la medición de otras propiedades eléctricas de la partícula, en tanto que permanezcan dentro del alcance de la invención .
De manera ventajosa, de acuerdo a esta modalidad, la fuente 8 de luz puede ser un diodo emisor de luz que emite en azul; - el dispositivo óptico de enfoque 9 puede estar constituido de una placa plano-paralela ajustable que permite que el haz 7 se centre en la celda 2 de flujo de abertura, y un doblete acromático y un lente cilindrico para enfocar el haz 7 en la celda 2 de flujo de abertura, que en la modalidad preferida es sustancialmente cilindrica; - el dispositivo óptico de recolección 11 puede estar constituido de dos lentes plano-convexos que forman imagen de la zona de interacción de la luz con las partículas 4 en el medio 13 de detección, que comprende por ejemplo un foto diodo.
Para obtener resultados confiables, es necesario que la zona de medición óptica, donde se presentan las interacciones entre las partículas y la luz, tenga dimensiones limitadas, por ejemplo en el orden de lOOpm x 30pm, y para que la distribución de intensidad de la luz incidente sea sustancialmente homogénea. La dificultad consiste de restringir el flujo que transporta las partículas que se van hacer circular de modo que pase completamente dentro de la zona de medición de óptica. Este problema se ilustra en las Figuras 2a-2b para el caso no limitativo de mediciones de absorbancia en partículas que tienen absorbancia sustancialmente idéntica. Cuando todo el flujo 3 de partículas 4 atraviesa la zona 7 de medición óptica, los picos 20 de absorbancia tienen todos sustancialmente la misma amplitud, entre 21b y 22b. Si el flujo 3 se transporta a las partículas alcanza o aún excede el límite de la zona 7 de medición óptica, como se muestra en la Figura 2a, las partículas 4 no reciben por más tiempo una cantidad igual de luz y es defectuosa la medición óptica. El error se caracteriza por variabilidad considerable, entre 21a y 22a, de la amplitud de los picos 20, que se refleja a su vez en incertidumbre incrementada en la clasificación de las partículas.
Las Figuras 3a-3b ilustra la deflexión de un haz 7 de luz por la superficie de un orificio cilindrico tal como el orificio 1 de la celda 2 de abertura. La Figura 3a, el haz es mayor que el diámetro del orificio 1. Debido al ángulo de incidencia de la superficie interior del orificio 1, ciertas porciones 30 de este haz 7 se reflejan o al menos se reflejan fuertemente y en consecuencia una zona periférica 33 del orificio 1 se ilumina de una manera suficientemente uniforme. En la Figura 3b, el haz es más pequeño que el diámetro del orificio 1. De manera similar, una zona periférica 33 del orificio 1 localizado más allá del rayo 31 limitante no se ilumina de manera correcta. En ambos casos, sólo las partículas que pasan a través de la llamada zona 32 confiable de medición óptica se medirán en condiciones apropiadas. Aquellas que pasan a través de la zona 33 pueden dar resultados fallidos. Este razonamiento por supuesto se puede extender fácilmente por una persona experta en la técnica a otras geometrías de orificio 1 y de celdas 2 de flujo de abertura en tanto que permanezcan dentro del alcance de la invención.
La solución adoptada en general en los dispositivos de la técnica anterior, como se muestra en la Figura 11, comprende el confinamiento 72 del flujo 3 que transporta las partículas 4 al centro de la celda 73 de medición, por medio de uno o más flujo 71 concéntricos de vaina, con todas las desventajas ya mencionadas en términos de complejidad, costos de producción y costos de operación, notablemente al uso de inyectores 70.
La solución adoptada en el método de acuerdo a la invención comprende, el contraste, la identificación de las partículas cuya trayectoria en la celda de flujo de abertura no pase a través de una zona predeterminada, por ejemplo, la zona 32 confiable de medición óptica, de modo que se puedan tratar de manera diferente cuando se analizan los datos. Esta identificación se puede llevar a cabo de manera notable al analizar la forma de los impulsos obtenidos de la medición de impedancia. En otras palabras, la información de la trayectoria de las partículas 4 del orificio 1 de la celda 2 del flujo de abertura deducida notablemente del análisis de los cambios de la impedancia eléctrica se aprovecha para tener influencia en la operación de la caracterización de las partículas, es decir, para modificar la manera en la cual se usan las mediciones.
Con referencia a las Figuras 4a-4b, cuando una partícula tal como un leucocito atraviesa una abertura en la cual se aplica un campo eléctrico, el cambio temporal en la resistividad a través de la abertura, que puede ser el orificio 1 de la celda 2 de flujo del dispositivo de acuerdo a la invención, toma la forma de un impulso 41, la forma de lo cual depende en su mayor parte de la trayectoria 40 de la partícula. En particular, se puede ver en el ejemplo de la Figura 4 que el impulso 41 llega a ser más amplio y finalmente tiene una meseta y luego rebota, conforme la trayectoria de la partícula se mueve alejándose del centro de la celda 2 de flujo de abertura. Este efecto es debido a la forma del campo eléctrico, cuyas líneas equipotenciales 42 alrededor y en la abertura 1 se ilustran en la Figura 4a.
Este efecto, que se considera en los dispositivos de la técnica anterior como una fuente de error que tiene que ser reducido al mínimo, se aprovecha de manera ventajosa en la presente invención. Hace posible caracterizar las trayectorias de las partículas en la celda de flujo de abertura en base al análisis de la forma de los impulsos resistivos, y de esta forma se puede considerar como una signatura de estas trayectorias.
El arreglo y la superficie de los electrodos 5 en cualquier lado de la celda 2 así como una geometría de la celda 2 aún se puede diseñar de manera ventajosa de modo que la forma del impulso 41 sea fuertemente dependiente de la trayectoria de las partículas, que nuevamente va a los conceptos empleados en los dispositivos de la técnica anterior. Sin embargo, un orificio 1 de forma cilindrica que termina en esquinas con un bajo radio de curvatura, como se emplea en una modalidad preferida, presenta ya las características requeridas.
Un ejemplo de signaturas representativas de trayectorias de partículas en una celda de flujo de abertura se muestra en las Figuras 5a-5b. En este ejemplo, la zona de medición óptica está en la forma de un cilindro que corresponde al interior del orificio 1 de la celda 2 de flujo de abertura, que también puede ser de forma aproximadamente cilindrica. La zona 32 confiable de medición óptica se representa por un cilindro circunscrito en la zona total de medición óptica, y la asignatura de las trayectorias óptimas TI de las partículas que pasan a través de esta zona 32 confiable de medición óptica es aproximadamente Gausiana 51. Esta signatura tiene una meseta que llega a ser más amplia conforme la trayectoria se aleja del centro del orificio (trayectorias T2 , T3 , T4). Por lo tanto, es posible asociar, al límite de la zona 32 confiable de medición óptica, una forma de pulso o una signatura limitante y determinar, con relación a un criterio matemático, si una trayectoria es válida (signatura 51) o inválida (signatura 52) . El cambio en la forma de los impulsos resistivos tal como se muestra en la Figura 5 por supuesto es un ejemplo no limitativo, puesto que su comportamiento puede digerir de acuerdo a la geometría de la celda de flujo de abertura y de acuerdo al tipo de partículas .
De acuerdo a una modalidad preferida, el criterio matemático aplicado para determinar la validez de una trayectoria resulta de la comparación de los impulsos medidos con al menos un valor límite del ancho de impulso para al menos una altura de este impulso.
De acuerdo a una modalidad preferida pero no limitante que emplea una medición de resistividad de una medición de absorbancia óptica, las partículas que pasan a través de la celda de flujo de abertura generan por lo tanto dos impulsos, o señales eléctricas: un impulso resistivo que se origina del censor de medición de impedancia y un impulso que se origina de un censor de absorbancia óptica.
Los impulsos ópticos se condicionan de manera analógica, se amplifican y se filtran de acuerdo a las técnicas usuales a fin de que se transmitan al convertidor de analógico/digital.
Los impulsos resistivos se obtienen por técnicas convencionales pero se toma cuidado particular en la aplicación del censor a fin de aumentar al máximo la relación de señal a ruido y de obtener suficiente información para la clasificación y caracterización, tal como la elección del ancho de banda.
Estas señales obtenidas de los censores de absorbancia óptica y de medición de impedancia se acondicionan y transmiten a un convertidor de analógico a digital, que está conectado a un sistema de procesamiento digital, que puede incluir de manera notable un microprocesador y/o un FPGA y/o un DSP. La velocidad de muestreo de los impulsos ópticos y resistivos se adapta a cada tipo de señal para obtener la cantidad de información necesaria para procesamiento digital.
El procesamiento de los impulsos ópticos se puede limitar a la extracción de la información de la amplitud y ancho .
La señal muestreada que se origina del censor resistivo se forma por técnicas convencionales de procesamiento de señales en base a las características de tiempo y frecuencia de la señal que se van analizar tal como la filtración digital con la respuesta de impulsos finitos o infinitos, filtración óptima, transformadas rápidas de fourier, etc.
De esta manera podemos crear un par, formado del impulso resistivo y el impulso óptico asociado, y almacenar sus características, por ejemplo, las amplitudes, anchos de impulso, etc.
Los impulsos resistivo y óptico, limpiados del ruido de fondo y normalizados, entonces se pueden procesar por el algoritmo de clasificación, que clasifica las mediciones en al menos dos categorías, llamadas válida e invalida .
De manera ventajosa, el algoritmo de clasificación comprende una medición de la diferencia entre una signatura asociada con una trayectoria óptima, representada por una forma de impulso resistivo óptimo, y la asignatura de las trayectorias efectivas de las particular, es decir, de los impulsos resistivos medidos. Si esta diferenciación es demasiado grande, los datos que se relacionan a estas partículas se consideran como inválidos. La Figura 8 muestra los ejemplos del resultado de la medición de pares de impulsos resistivo (Res) y óptico (Opt) válidos e inválidos . Corresponden respectivamente a mediciones que se refieren a partículas que siguen trayectorias tal como TI y T4 en las Figuras 5a-5b. El diagrama de sincronización en la Figura 7 ilustra la secuencia de tiempo de la adquisición y clasificación (Val) de las mediciones.
El algoritmo de caracterización, que realiza el análisis real de los resultados, comprende de manera ventajosa al menos una operación de clasificación de las partículas en categorías que tienen características sustancialmente uniformes, y opcionalmente al menos una operación del conteo de las partículas. De acuerdo a una modalidad que es ventajosa pero de ningún modo limitante del método, la clasificación usa sólo datos que se refieren a las partículas cuyos impulsos o signaturas se han clasificado como válidas, como se ilustra en el diagrama de flujo en la Figura 6. Por el contrario, la cuenta se puede realizar en todas las mediciones que dan lugar a un impulse resistivo, ya sea válido o inválido. Cualquier otra manera de aprovechamiento de los datos después de la clasificación de las partículas se puede contemplar, por supuesto, en tanto que permanezcan dentro del alcance de la invención.
La clasificación de partículas válidas, o de acuerdo a una modalidad preferida, de leucocitos en subcategorías , se puede llevar a cabo de manera ventajosa al atribuir a las partículas un conjunto de valores o coordenadas que se originen del análisis de las mediciones resistiva y óptica llevadas a cabo durante su paso a través de la celda 2 de flujo de abertura, estas coordenadas que definen su posición en un espacio de representación previamente definido. La segmentación de este espacio de representación en regiones separadas que agrupan conjuntamente partículas de características sustancialmente similares entonces hace posible identificar la población de cada una de las subcategorías , por ejemplo para medir su tamaño relativo. Las Figuras 9a-9b muestra un ejemplo de representación de las partículas, en este caso leucocitos, como una función de los datos obtenidos respectivamente del análisis de las mediciones resistivas (Res) y de las mediciones de absorbancia óptica (ALL) . Cada punto representa un par de mediciones. La Figura 9a muestra todas las mediciones, válidas e inválidas. La Figura 9b sólo muestra las mediciones válidas, que hace posible revelar grupos separados de puntos que corresponden a diferentes categorías de partículas.
De acuerdo a una característica ventajosa de la invención, el método y el dispositivo se puede aplicar fácilmente al producir un instrumento de hematología particularmente simple. El dispositivo de acuerdo a la invención se puede montar fácilmente en un recipiente simple 60 que contiene la solución que se va analizar, y su oficio 61 asociado. La celda 2 de flujo de abertura se puede montar en cualquier posición con relación al recipiente. Esta celda de flujo de abertura también se puede montar en una tubería continua y se puede producir de cualquier tipo de material que sea sustancialmente transparente y sea un aislante eléctrico. Por ejemplo, la transferencia de la solución que se va analizar se puede efectuar por aspiración a través de la celda 2 de flujo de abertura. La Figura 10 muestra un ejemplo no limitativo de aplicación, que comprende una medición óptica e individual en el eje del orificio. También se pueden colocar varios fotodiodos alrededor del eje del orificio para permitir mediciones a varios ángulos y varias longitudes de onda.
De manera ventajosa, esta modalidad también hace fácil combinar una medición convencional de hemoglobina por espectrofotometría a través del recipiente traslúcido que contiene la solución que se va analizar.
De acuerdo a modalidades particulares, el dispositivo de acuerdo a la invención puede comprender una pluralidad de electrodos distribuidos en una o más capas a lo largo de la celda 2 de flujo de abertura, como se describe por ejemplo en el documento US 4,420,720. El dispositivo de acuerdo a la invención también puede comprender electrodos de resistividad variable o no variable, que cubren toda o parte de la superficie interior de la celda 2 de flujo de abertura, como se describe por ejemplo en US 2001/0052763. En el caso de un dispositivo de acuerdo a la invención que comprenden más de dos electrodos, es posible usar varias mediciones de impedancia entre diferentes pares de electrodos.
De acuerdo a modalidades particulares es posible, en tanto que se permanezca dentro del alcance de la invención, usar mediciones complejas de impedancia en una o más frecuencias discretas, así como en una o más bandas continuas de frecuencia eléctrica.
De acuerdo a modalidades particulares, es posible usar, en tanto que se permanezca dentro del alcance de la invención, al menos una medición de al menos una propiedad óptica tal como por ejemplo: - una medición de autofluorescencia, una medición de fluorescencia provocada por un marcador unido a la membrana de leucocito, una medición de la fluorescencia provocada por un marcador unido a uno o más elementos de los contenidos intracelulares de los leucocitos, en los cuales se mide una intensidad luminosa a una longitud de onda de fluorescencia en al menos un detector 13 arreglado alrededor de la celda de flujo de abertura, el detector que se aisla por ejemplo de la luz a la longitud de onda 7 de excitación por un filtro espectral; - una medición de la dispersión elástica en al menos un ángulo, de la dispersión inelástica en al menos un ángulo, de retrodispersión, para lo cual de manera notable se pueden arreglar uno o más detectores 13 alrededor de la celda de flujo de abertura, a orientaciones diferentes de aquella del eje del haz 7, para medir la luz dispersada a diferentes ángulos, que pueden tener cambios en la frecuencia óptica; - una medición de polarización, en la cual el medio 13 de detección se diseña para analizar la polarización de la luz que ha interactuado con la partícula, la fuente 8 que tiene por ejemplo una polarización lineal, conocida .
De acuerdo a modalidades particulares, es posible, en un dispositivo de acuerdo a la invención, usar las mediciones de varias propiedades ópticas de forma simultánea, por ejemplo al arreglar varios dispositivos para la medición óptica como se muestra en la Figura 11 en diferentes orientaciones o de acuerdo a diferentes ejes alrededor de la celda 2 de flujo de abertura, o al introducir medios para dividir el haz 10 que se origina de la celda de flujo de abertura.
De acuerdo a modalidades particulares, el criterio matemático aplicado para determinar la validez de una trayectoria puede resultar de: - al menos una comparación con un umbral en la amplitud, o una altura mínima de impulso, - al menos un cálculo de distancia en el sentido matemático entre un impulso medido y al menos un modelo de impulso, la distancia que se calcula por ejemplo por medio de una función normalizada de correlación, - al menos un análisis llevado a cabo del resultado de la aplicación de al menos una transformación tal como una transformada de Fourier a los impulsos medidos, o cualquier combinación de estos métodos o cualquier otro modelo matemático apropiado, en tanto que se permanezca dentro del alcance de la invención.
De acuerdo a modalidades particulares también es posible, en tanto que se permanezca dentro del alcance de la invención, definir uno o más modelos de impulsos ópticos, para comparar los impulsos ópticos medidos con el modelo o modelos y para incluir esta comparación en el algoritmo de clasificación. Además, es posible definir uno o más modelos apareados de impulsos ópticos y resistivos y llevar a cabo operaciones de comparación y clasificación en base a estos modelos. Esto puede hacer posible procesar otros casos de errores de medición, debido por ejemplo a partículas que no corresponden a las categorías esperadas, o al hecho que se miden variar partículas al mismo tiempo.
De acuerdo a modalidades particulares, el método y el dispositivo asociados se pueden emplear en un dispositivo producido en base a tecnologías que se refieren al campo de microsistemas (MEM) , o de microsistemas ópticos (MOEM) , por ejemplo para integrar todas las funciones hidráulicas, eléctricas y ópticas en un componente medidor.
De acuerdo a otras modalidades particulares, el método el dispositivo asociado se puede emplear a la medición de partículas diferentes de las celdas biológicas, por ejemplo, partículas cerámicas dentro del contexto de la producción de polvos industriales, o pigmentos dentro del contexto de producción de pintura.
Por supuesto, la invención no se limita a los ejemplos que se han descrito, y se pueden hacer numerosos ajustes a estos ejemplos sin exceder el alcance de la invención .
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (22)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Método de citometría de flujo sin fluidos de vaina para caracterización de partículas, que comprende los pasos de: transferir un fluido que contiene partículas a través de una celda de flujo de abertura, la celda de flujo de abertura que es al menos en parte sustancialmente transparente a al menos una longitud de onda de interés, y al menos en parte sustancialmente aislante a electricidad, medir la variación de impedancia eléctrica generada por el paso de las partículas contenidas en fluido a través de la celda de flujo de abertura, medir al menos una propiedad óptica de las partículas, que interactúan con al menos un haz de luz que pasa a través de la celda de flujo de abertura, caracterizar las partículas al usar las mediciones de la variación de impedancia óptica y las propiedades ópticas, caracterizado porque además comprende los pasos de: reducir la información de la trayectoria de las partículas de la celda de flujo de abertura, al menos del análisis de la medición de la variación de impedancia eléctrica, usar la información de la trayectoria al menos para el aprovechamiento de las mediciones de propiedades ópticas durante la caracterización de las partículas.
2. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque sólo el fluido que contienen las partículas se hace pasar a través de la celda de flujo de abertura .
3. Método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la medición de la variación de impedancia eléctrica comprende una medición de resistividad llevada a cabo con corriente directa y/o al menos una medición de impedancia compleja llevada a cabo en al menos una frecuencia no cero.
4. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la por lo menos una propiedad óptica medida es una de las siguientes medidas ópticas: absorbancia, dispersión elástica a al menos un ángulo, dispersión inelástica a al menos un ángulo, retrodispersión elástica, retrodispersión inelástica, autofluorescencia, fluorescencia a al menos una longitud de onda provocada por al menos un marcador unido a las partículas, fluorescencia a al menos una longitud de onda provocada por al menos un marcador unido a al menos un elemento contenido en las partículas, polarización de luz.
5. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la caracterización de las partículas comprende una clasificación de las partículas.
6. Método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la caracterización de las partículas comprende un conteo de las partículas.
7. Método de conformidad con la reivindicación 5 ó 6, caracterizado porque el análisis de la variación de impedancia eléctrica comprende una comparación entre la variación medida de impedancia eléctrica y al menos un elemento de comparación entre al menos un modelo de variación de impedancia eléctrica y al menos un valor numérico previamente definido, el resultado de esta comparación que determina si la trayectoria de las partículas ha atravesado una zona previamente definida de la celda de flujo de abertura.
8. Método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque los datos que se relacionan a las partículas cuya trayectoria no pasa a través de una zona previamente definida de la celda de flujo de abertura se remueven de los datos usados para la clasificación de las partículas .
9. Método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la propiedad óptica medida de las partículas se compara con al menos un elemento de comparación entre al menos un modelo de propiedad óptica y al menos un valor numérico previamente definido, si el resultado de las comparaciones de la variación de impedancia óptica y de la propiedad óptica con sus modelos respectivos o valores numéricos previamente definidos no satisface al menos un criterio previamente definido, los datos que se refieren a las partículas se remueven de los datos usados para la clasificación de las partículas .
10. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, caracterizado porque la operación de clasificación de las partículas comprende los pasos de: atribuir a las partículas de un conjunto de valores o coordenadas obtenidas del análisis de las mediciones llevadas a cabo durante su paso a través de la celda de flujo de abertura, las coordenadas que definen . su posición en un espacio de representación previamente definido , segmentar el espacio de representación en distintas regiones, las regiones que agrupan conjuntamente partículas de características sustancialmente similares.
11. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las partículas comprenden células sanguíneas .
12. Dispositivo de citometría de flujo sin fluidos de vaina para caracterización de partículas, que comprende : una celda de flujo de abertura al menos en parte sustancialmente transparente a al menos una longitud de onda de interés, y al menos en parte sustancialmente aislante a electricidad, un medio para la transferencia de un fluido que contiene las partículas a través de la celda de flujo de abertura, un medio para la medición de la variación de impedancia eléctrica generada por el paso de las partículas contenidas en el fluido a través de la celda de flujo de abertura, un medio para la medición de al menos una propiedad óptica de las partículas, las partículas que interactúan con al menos un haz de luz que pasa a través de la celda de flujo de abertura, un medio para análisis de las mediciones de variación de la impedancia eléctrica y propiedades ópticas, caracterizado porque comprende: un medio para deducir la información de la trayectoria de las partículas en la serie de flujo de abertura, al menos del análisis de la medición de la variación de impedancia eléctrica, y un medio para usar esta información en la trayectoria al menos para el aprovechamiento de las mediciones de las propiedades ópticas durante la caracterización de las partículas.
13. Dispositivo de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la geometría de la celda de flujo de abertura se adapta de una manera tal que la variación medida de impedancia eléctrica durante el paso de las partículas depende sustancialmente de la trayectoria de la celda de flujo de abertura.
14. Dispositivo de conformidad con una de las reivindicaciones 12 ó 13, caracterizado porque la celda de flujo de abertura comprende una sección transversal interna sustancialmente de una de las siguientes formas: circular, rectangular .
15. Dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, caracterizado porque la celda de flujo de abertura está constituida de al menos uno de los siguientes materiales: zafiro, rubí, vidrio, plástico.
16. Dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, caracterizado porque el medio para la medición de la variación de impedancia eléctrica generada por el paso de las partículas comprende al menos dos electrodos arreglados respectivamente en cualquier lado del orificio de la celda de flujo de abertura, los electrodos que están en contacto eléctrico con el fluido que contiene las partículas.
17. Dispositivo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el medio para la medición de la variación de impedancia eléctrica generada por el paso de las partículas comprende al menos un electrodo arreglado del orificio de la celda de flujo de abertura, el electrodo que está en contacto eléctrico con el fluido que contiene las partículas.
18. Dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, caracterizado porque el medio para la medición de la propiedad eléctrica de las partículas comprende : al menos una fuente de luz, y al menos un medio autodetector electrónico.
19. Dispositivo de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el medio para la medición de la propiedad óptica de las partículas comprende al menos un medio óptico de enfoque de la luz emitida de la fuente de luz en la celda de flujo de abertura.
20. Dispositivo de conformidad con la reivindicación 18 ó 19, caracterizado porque el medio para la medición de la propiedad óptica en las partículas comprende al menos un medio óptico para recolección de la luz emitida de la celda de flujo de abertura.
21. Dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, caracterizado porque al menos uno de los medios para la medición de la propiedad óptica de las partículas se integra con la celda de flujo de abertura.
22. Instrumento para análisis sanguíneo, caracterizado porque comprende al menos un dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 21, las partículas que se analizarán, las cuales comprenden células sanguíneas, y notablemente leucocitos.
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