CN102239400B - 免鞘液的流式细胞计量术的方法和仪器 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种方法和一种被用于执行流式细胞计量术方法的仪器，该流式细胞计量术方法优选地旨在用于但是不限于白血细胞的计数和区分。更加具体地，本发明涉及具有低操作成本的、简化的血液学仪器领域。根据本发明，该方法特征在于阻抗测量技术被用于识别具有没有通过预定光学测量区域的轨迹的颗粒从而选择性地处理所述颗粒，由此消除为了朝向测量区域引导颗粒而是用鞘流。
Description
技术领域
本发明涉及用于在液体介质中悬浮的颗粒的计数和表征的自动仪器领域，并且更加具体地涉及用于计数和表征在血样中包含的各种类型的细胞的血液学设备领域。
它特别地涉及但是并不限于用于计数和分类白细胞的方法。
本发明还涉及一种采用所述方法的仪器。
背景技术
正常的白细胞被分类成五种类型：单核细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞。在这五种亚群中白细胞的总数和它们的相对分布使得建立或者朝向病理学引导从业者成为可能。
现有技术和所提出的发明因此涉及用于计数在血样中包含的白细胞的数目和用于在五种亚群中确定它们的相对分布的仪器。
W.H. Coulter等人的已知文献US 2，656，508描述了一种用于利用阻抗测量的、在悬浮液中的颗粒的绝对计数的方法。根据这种方法，利用阻抗测量技术确定每单位体积的颗粒数目，阻抗测量技术由测量当血细胞通过微孔时微孔的阻抗的变化组成。这项简单的并且稳健的技术并不要求复杂的流体仪器并且能够自由使用，因为保护该技术的专利US2，656，508日期是自1953的。因此它常规性地被所有的、用于白细胞数目的绝对计数的自动仪器的制造商（Beckman Coulter、Abbott、Bayer、C2 Diagnostics、Sysmex、 ABX等）使用。
已知的是，在这项阻抗测量技术中，由于细胞通过而产生的脉冲的形状依赖于微孔的几何形状并且依赖于细胞在后者中的轨迹。例如，Von Behrens等人的论文（VonBehrens， J. of Histochemistry and Cytochemistry， 1976， Vol. 24， No.1， p.247）描述了作为所述孔口中的细胞或者颗粒的轨迹的函数的电阻脉冲的形状和在具有矩形或者圆形截面的孔口中产生的电场线的几何形状。现有技术中的大多数仪器试图通过优化或者孔口的几何形状，如例如由T. Zhao等人在文献US2008/0093216中描述地，或者电极的布置和结构，如例如分别地在Newton等人的文献US 4，420，720和North等人的US2001/0052763中描述地，而减小电阻脉冲的形状对于轨迹的这个依赖性。
然而，阻抗测量技术自身并不提供白细胞的五种亚群的可靠的区分。有利地通过组合阻抗测量与光学流式细胞技术执行根据它们的五种亚群的、白细胞的这种区分。V.L.Chupps等人的已知文献US 5，812，419描述了一种像阻抗测量那样组合吸收的光学测量、分光光度技术、在不同角度下的衍射和荧光的血细胞的自动分析方法。根据这种方法，在不同的分析细胞中执行通过阻抗测量和光学流式细胞计量术的测量，并且数据融合算法使得能够获得所期细胞计数和表征。Chupps等人描述的方法清楚地示出阻抗测量和光学流式细胞计量术的组合使用的益处，但是不同的分析细胞的使用使得该系统是非常复杂的。而且，利用不同的方法分析的血样的、可能的非均一性是测量不确定性的显著来源。
在文献US 6，228，652 中，C.M. Rodriguez等人描述了用于同时地在相同的细胞上执行阻抗测量和光学测量、因此实现仪器的简化并且减轻在多个换能器之间的关联测量的问题的细胞计量术细胞。根据US 6，228，652的仪器因此使得对于每一个细胞测量它的、作为它在正向电压下的电阻率的函数的体积、它的作为在测量电频率下的它的导电性的函数的射频不透性及其衍射和荧光的光学特性成为可能。
在用于血液学的自动仪器的研发中，仪器的简化是一项相当大的工业挑战，因为它在小型卫生保健设施方面和在新兴国家中开辟了相当大的市场。例如，D. Lefevre等人的文献FR 2 653 885描述了一种用于光学和电气细胞计量术的仪器，其中用于电阻率测量的电极是用于转移细胞流的仪器的构件。
在包含细胞的流和照明装置的相对定位方面，光学流式细胞计量术施加了重要的约束。事实上，对于光学测量质量而言重要的是使得细胞通过被称为光学测量区带的区带中的光束，在该区带中，照明能够被视为具有足够均匀的强度。通过其中照明不适当的区带中的光束的细胞能够引起不正确的测量和在确定细胞类型时的错误，因此困难在于迫使输送细胞的流以如此方式循环，使得它完全地处于具有均匀强度的光学测量区带内侧。
通常在现有技术仪器中采用的方案包括使用还被称为鞘流型流的一股或者多股鞘流，鞘流与输送细胞的中央液流同心地循环。这些鞘流抽取中央液流，并且因此非常准确地约束它所包含的颗粒。因此，FR 2 653 885例如采用双重鞘流技术，根据该技术，中央液流被两股同心鞘流约束。鞘流和输送血细胞的中央液流的产生要求多个流体进口以及微型喷嘴。这导致围绕测量区带的流体构件的组件是特别地稠密的，从而使得传感器的组装是困难的和高花费的。而且，为了使得利用鞘流定位颗粒是有效的，鞘流的流率应该比包含样本的流的流率大得多。这意味着所采用的、相当大量的试剂（通常为稀释剂）无任何化学用处而是仅仅被用于引导将被测量的样本流。在试剂的消耗和废物产生方面的效果是明显的。
而且，在这种类型的溶液中使用的稀释程度与血红蛋白的测量要求的稀释程度不相符合，血红蛋白通常是在白细胞稀释的情况下测量的并且因此使得另外的稀释以及另外的、昂贵的流体元件是有必要的。
本发明的意图在于提出一种流式细胞计量术方法，包括阻抗测量和光学测量，该方法并不要求鞘流，因此允许测量细胞和相关联的流体元件的、显著的简化。
本发明的另一个意图在于提出一种采用该方法的仪器，与现有技术仪器相比，对于制造和对于维护这两者而言，该仪器都是更加简单的和更加经济的，从而被如此配备的自动仪器能够在保持等效的测量质量同时由较小的实验室使用。
发明内容
利用一种用于颗粒表征的流式细胞计量术方法实现了这个目的，该方法包括以下步骤：
-通过孔隙流动池（aperture flow-cell）转移包含颗粒的流体，所述孔隙流动池至少部分地对于至少一个感兴趣的波长基本上是透明的并且至少部分地对于电基本上是绝缘的，
-测量由在流体中包含的所述颗粒通过孔隙流动池而产生的电阻抗变化，
-测量所述颗粒的至少一种光学性质，所述颗粒与通过孔隙流动池的至少一个光束互相作用，
-通过使用对电阻抗变化和光学性质的所述测量表征所述颗粒，
其特征在于该方法进一步包括以下步骤：
-至少根据对电阻抗变化的所述测量的分析推导有关在孔隙流动池中的颗粒的轨迹的信息，
-利用有关轨迹的所述信息来调整所述颗粒表征。
根据特别有利的特征，
-根据本发明的方法是并不如在现有技术方法中那样要求使用鞘流或者鞘式流的一种流式细胞计量术方法。利用执行从对于颗粒的测量获得的数据的选择性处理的可能性而取代了利用鞘流的、颗粒的物理限制的原理，利用有关它们的轨迹的信息调整或者确定所述处理；
-仅仅包含颗粒的流体通过孔隙流动池；
-与现有技术仪器相比，孔隙流动池能够被显著地简化。它能够被缩减成池壁中的简单的孔隙或者孔口，通过该孔隙或者孔口传送包含颗粒的流体并且在其中执行测量。
有利地，
-对电阻抗变化的测量能够包括在直流电中执行的电阻率的测量；
-对电阻抗变化的测量还能够包括在至少一个非零频率下执行的至少一个复数阻抗测量；
-所测量的该至少一种光学性质能够是以下光学性质之一：吸光度、在至少一个角度下的弹性散射、在至少一个角度下的非弹性散射、弹性反向散射、非弹性反向散射、自身荧光、在由被联结到颗粒的至少一个标记引起的至少一个波长下的荧光、在由被联结到在颗粒中包含的至少一个要素的至少一个标记引起的至少一个波长下的荧光、光的偏振；
-颗粒表征能够包括颗粒的分类；
-颗粒表征还能够包括颗粒的计数；
-对电阻抗变化的分析能够包括在所测量的电阻抗变化和在电阻抗变化的至少一个模型和至少一个在前限定的数字值中的、至少一个比较要素之间的比较，所述比较的结果确定颗粒的轨迹是否已经穿过孔隙流动池的、在前限定的区带；
-能够从被用于所述颗粒的分类的数据移除与其轨迹没有穿过孔隙流动池的、在前限定的区带的颗粒有关的数据。因此，在根据本发明的方法中关于它们的轨迹分类颗粒是可能的，例如仅仅为了从满足特定条件的那些区分数据；
-颗粒的所测量的光学性质还能够被与在光学性质的至少一个模型和至少一个在前限定的数字值中的至少一个比较要素相比较。在此情形中，如果电阻抗变化和光学性质与它们的模型或者分别的在前限定的数字值的比较的结果并不满足至少一个在前限定的准则，则能够从被用于所述颗粒的分类的数据移除与颗粒有关的数据；
-颗粒分类的操作能够包括将根据在它们通过孔隙流动池期间执行的对所述测量的分析获得的一组数值或者坐标归属于颗粒的步骤，所述坐标在在前限定的表示空间中限定它们的位置，和将所述表示空间分划成截然不同的区域的步骤，所述区域将具有基本类似的特性的颗粒分组在一起；
-所述颗粒能够包括血细胞。这些血细胞能够是白细胞。
根据本发明的另一个方面，提出了一种用于颗粒表征的流式细胞计量术仪器，包括：
-孔隙流动池，所述孔隙流动池至少部分地对于至少一个感兴趣的波长基本上是透明地并且至少部分地对于电基本上是绝缘的，
-用于通过所述孔隙流动池转移包含颗粒的流体的装置，
-用于测量由在流体中包含的所述颗粒通过孔隙流动池而产生的电阻抗变化的装置，
-用于测量颗粒的至少一种光学性质的装置，所述颗粒与通过孔隙流动池的至少一个光束互相作用，
-用于对电阻抗的变化和光学性质的所述测量的分析的装置，
其特征在于，该仪器包括：
-用于至少根据对电阻抗变化的所述测量的分析推导有关在孔隙流动池中的颗粒的轨迹的信息的装置，和
-用于利用有关轨迹的所述信息来调整所述颗粒表征的装置。
根据本发明的仪器能够进一步包括用于在它们通过孔隙流动池转移之前制备感兴趣的颗粒的装置。感兴趣的颗粒是我们希望对其进行分析和分类并且可能有必要特别地在血细胞的情形中利用溶解或者稀释方法将其从存在于样本中的其它颗粒分离的颗粒。
有利地，
-孔隙流动池的几何形状能够被以如此方式调整，使得在颗粒通过期间所测量的电阻抗变化基本上依赖于它们在所述孔隙流动池中的轨迹。能够例如利用具有基本矩形截面的孔隙流动池获得这个结果，该矩形截面的纵向边缘终止于具有低的曲率半径的角部中。应该指出，这里我们正在寻求一种与在现有技术仪器中的实践相反的结果，其中，实际上，预期最小化对于颗粒轨迹的这种依赖性；
-孔隙流动池能够包括具有基本上以下形式之一的内部截面：圆形、矩形；
-孔隙流动池能够由以下材料中的至少一种构成：蓝宝石、红宝石、玻璃、塑料；
-用于测量由颗粒通过而产生的电阻抗变化的装置能够包括分别地在孔隙流动池的孔口的任一侧上布置的至少两个电极，所述电极与包含颗粒的流体电接触；
-用于测量由颗粒通过而产生的电阻抗变化的装置还能够包括被布置在孔隙流动池的孔口中的至少一个电极，所述电极与包含颗粒的流体电接触。根据本发明的仪器能够因此包括例如沿着孔隙流动池的壁分布的电极。电极中的至少一个还能够是用于转移包含颗粒的流体的装置的构成元件；
-用于测量颗粒的光学性质的装置能够包括至少一个光源，和至少一个光电子探测装置；
-用于测量颗粒的光学性质的装置还能够包括聚焦来自光源的光于孔隙流动池中的至少一个光学装置；
-用于测量颗粒的光学性质的装置还能够包括收集源自孔隙流动池的光的至少一个光学装置；
-用于测量颗粒的光学性质的装置能够进一步包括用于将来自将被表征的颗粒的光进行光谱过滤的至少一个装置；
-测量颗粒的光学性质的所述光学装置中的至少一个能够被集成于孔隙流动池中。例如通过使用用塑料模制的孔隙流动池，所述集成是可能的，孔隙流动池的外壁将构成用于聚焦和可选地用于收集光的透镜。例如光电子探测器的光学元件例如还能够被直接地胶合在孔隙流动池上。
根据一个具体实施例，用于光电子探测的装置能够被以如此方式布置，使得测量具有一定角度定向的、来自将被表征的颗粒的光束，该角度定向不同于源自光源的光束的轴线的角度定向。这种配置使得例如在非零角度下进行散射测量成为可能。
根据另一个具体实施例，用于测量颗粒的光学性质的装置能够包括具有已知偏振状态的光源，并且用于光电子探测的装置包括用于光的偏振分析的装置。
根据本发明的又一个方面，提出了一种用于血液分析的设备，该设备包括根据本发明的至少一个仪器，将被分析的颗粒是血细胞，并且特别地是白细胞。
附图说明
在阅读绝不是限制性的、应用和实施例的详细说明和以下附图时，本发明的其它优点和特征将变得明显：
-图1示出根据本发明的仪器的概略图表；
-图2示意在流式细胞计量术中颗粒在光束中的定位的影响。图2a代表当颗粒流未在光束中定中时的情形，而在图2b中，颗粒流在光束中定中。为绝不是限制性的吸光度测量的情形示意了该效果；
-图3a和3b示意利用柱形孔口的表面的光束偏转，和由此产生的、可靠的光学测量的区带的定界；
-图4a给出在于绝缘材料中制成的微观开口中、当通过所述开口施加电压时出现的等势线的形式的一个实例。图4b示意根据各种轨迹当颗粒通过这个开口时获得的电阻脉冲的形状。这些示意摘自Wiley-Liss Inc.在1990年出版的、还在US2008/0093216中引用的、V. Kachel的Flow cytometry and Sorting（流式细胞计量术和分类）；
-图5a示出在柱形形状的孔隙流动池内侧的颗粒轨迹的实例，以及如在图3中限定的、可靠光学测量区带的定界。图5b示出将对于沿着图5a所示轨迹行进的颗粒获得的电阻脉冲的形状；
-图6示出按照根据本发明的方法的优选实施例的数据采集和处理的流程图；
-图7示出根据在图6中的流程图的数据采集和处理的时序图；
-图8示出从吸光度的测量产生的、分别地相应于电阻脉冲和光学脉冲的所测量的信号的实例。这些信号分别地代表如在图5中所示的轨迹T1和T4；
-图9示出利用根据本发明的仪器获得的颗粒（在此情形中为白细胞）的分类的图表的实例。图9a示出当探测到的所有的颗粒均得以表示时的情形。图9b仅仅示出根据本发明的方法分类的颗粒；
-图10示出根据本发明的仪器的、优选的但是绝不是限制性的实施例；
-图11示出采用利用鞘流在光学测量区带中对颗粒进行限制的现有技术的仪器的概略图表。
具体实施方式
将参考附图描述在用于在血样中包含的各种类型的细胞并且特别地白细胞的计数和表征的设备中采用根据本发明的方法的仪器的一个优选的、但是绝不是限制性的实施例。例如能够使用这个设备来确定白细胞的总数和它们的、在它们的五个亚群中的相对分布，该五个亚群是：单核细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞。
在本说明的其余部分中，假设颗粒是白血细胞或者白细胞，但是这绝不是旨在加以限制。
参考图1，采用根据本发明的方法的仪器包括孔隙流动池2，包含颗粒4的流体3通过孔隙流动池2。这个孔隙流动池包括孔口1，在颗粒和测量装置之间的相互作用主要在此处发生。在保持在本发明的范围内时，通过孔隙流动池2转移流体3能够利用各种技术进行，其中我们可以特别地提及重力流动、抽吸和在压力下注射。
优选地，孔隙流动池2和孔口1具有基本圆形截面，并且孔口1具有约为80μm的直径。当然，这些规格绝不是限制性的，并且根据本发明的仪器还能够同样包括带有不同尺寸的、具有基本矩形截面或者多边形的孔隙流动池2。
为了允许阻抗测量和光学测量，孔隙流动池2应该至少部分地由对于电基本绝缘的至少一种材料和至少部分地由对于感兴趣的光波长基本透过的至少一种材料构成。根据一个优选实施例，它是由蓝宝石制成的。在保持在本发明的范围内时，采用由某种其它材料例如红宝石、玻璃、聚合物或者塑料制成的或者甚至利用几种材料的组合制成的孔隙流动池2当然是可能的。
根据一个优选实施例，电极5被布置于孔隙流动池2的任一侧上。它们与流体电接触，从而使得能够在孔隙流动池中并且特别地通过孔口建立纵向电场。这些电极5被连接到在颗粒4通过孔隙流动池2的孔口1期间测量阻抗变化，即由于这些颗粒通过而产生的脉冲的时间形状和幅度的仪器6。在根据本发明的仪器中采用的阻抗测量优选地但是并不限于利用直流电执行的电阻率的测量。
根据优选实施例，根据本发明的仪器包括用于光学测量的至少一个仪器，其一般原理是对在颗粒例如白细胞和光束之间的相互作用结果的测量。所述测量还被称为对颗粒的光学性质的测量。
参考图1，用于光学测量的这种仪器能够特别地包括光源8，和至少一个探测装置13。它还能够包括用于聚焦9光束7于孔隙流动池2中的至少一个光学装置，和用于收集11来自孔隙流动池2的光的至少一个光学装置。
光源8能够例如是激光器、激光二极管或者发光二极管。
用于聚焦9和用于收集11的光学装置能够特别地包括球面、非球面或者柱面透镜，或者带有折射率梯度（index of gradient）和/或反射表面（反射镜）的、形式自由的光学仪器。它们还能够包括至少一个光导，光导例如朝向探测装置13的敏感表面引导源自测量区带的光束。
探测装置13能够包括至少一个光电探测器例如光电二极管、雪崩光电二极管或者光电倍增管。
有利地，用于聚焦9和用于收集11的光学装置中的至少一个能够至少部分地被与孔隙流动池2集成，例如通过结合或者通过调整后者的外部形状从而构成透镜的表面。直接地在孔隙流动池2上固定探测装置13，可选地不采用收集装置11也是可能的。
按照根据本发明的仪器的一个优选的但是绝不是限制性的实施例，采用吸光度的测量，其中当白细胞穿过光束7时，在探测器13上测量光强度的变化。从而这是将在本说明的其余部分中研究的这种光学性质的测量。然而，在保持在本发明的范围内时，本领域技术人员将能够容易地在采用对颗粒的其它光学性质的测量的仪器中使用根据本发明的方法。
有利地，根据这个实施例，
-光源8能够是发射蓝光的发光二极管；
-用于聚焦9的光学仪器能够由允许光束7在孔隙流动池2上定中的可调节平面平行板和消色差双合透镜和在优选实施例中是基本柱形的、用于在孔隙流动池2中聚焦光束7的柱面透镜构成；
-用于收集11的光学仪器能够由在包括例如光电二极管的探测装置13上对光与颗粒4相互作用的区带成像的两个平凸透镜构成。
为了获得可靠的结果，有必要使得在颗粒和光之间的相互作用在此处发生的光学测量区带，具有例如约100µm x 30µm的有限的尺寸，并且使得入射光的强度分布在那里是基本均匀的。困难在于约束输送将被循环的颗粒的流从而它完全地在所述光学测量区带内侧经过。在图2中对于在具有基本相同的吸光度的颗粒上测量吸光度的非限制性情形示意了这个问题。当颗粒4的所有的流3均穿过光学测量区带7时，吸光度峰值20全部具有在21b和22b之间的、基本相同的幅度。如果输送颗粒的流3达到或者甚至超过光学测量区带7的界限，如在图2a中所示，则颗粒4不再接收相等的光量并且光学测量是有错误的。该错误的特征在于，峰值20的幅度在21a和22a之间的、显著的可变性，这种可变性则进而在颗粒分类的不确定性中得以反映。
图3示意利用柱形孔口例如孔隙流动池2的孔口1的表面偏转光束7。在图3a中，光束大于孔口1的直径。由于在孔口1的内侧表面上的入射角，这个光束7的特定部分30被反射或者至少被强烈地折射并且结果孔口1的周边区带33未被足够均匀地照亮。在图3b中，光束小于孔口1的直径。类似地，超过限制射线31定位的、孔口1的周边区带33未被正确地照亮。在两种情形中，仅仅通过所谓的可靠光学测量区带32的颗粒将在适当的状况中得到测量。通过区带33的那些颗粒能够给出有错误的结果。在保持在本发明的范围内时，本领域技术人员当然能够容易地将这种推理扩展至孔隙1和孔隙流动池2的其它几何形状。
如在图11中所示通常在现有技术的仪器中采用的方案，包括利用一股或者多股同心鞘流71将输送颗粒4的流3限定72于测量池73的中心，特别地由于喷射器70的使用，该方案具有已经在复杂度、制造成本和操作成本方面述及的所有的缺陷。
相反，在根据本发明的方法中采用的方案包括识别其在孔隙流动池中的轨迹并不通过预定区带例如可靠光学测量区带32的颗粒，从而当分析数据时它们能够被不同地处理。能够特别地通过分析从阻抗测量获得的脉冲的形状执行这个识别。换言之，特别地根据电阻抗的变化分析推导的、有关颗粒4在孔隙流动池2的孔口1中的轨迹的信息得以利用以影响颗粒的表征操作，即用于修改所述测量得以使用的方式。
参考图4，当颗粒例如白细胞穿过在其中施加电场的开口时，在可以是根据本发明的仪器的孔隙流动池2的孔口1的所述开口两端的电阻率的时间变化采取脉冲41的形式，该脉冲的形状在很大程度上依赖于颗粒的轨迹40。特别地，在图4的实例中能够看到，当颗粒的轨迹远离孔隙流动池2的中心移动时，所述脉冲41变得更宽并且最终具有平稳状态并且然后回弹。这个效果是由于电场的形状引起的，该电场的、围绕并且在开口1中的等势线42在图4a中示意。
在现有技术仪器中被视为必须被最小化的误差源的这个效果在本发明中被有利地加以利用。它使得基于电阻脉冲的形状的分析表征颗粒在孔隙流动池中的轨迹成为可能，并且所述形状能够被视为这些轨迹的标识（signature）。
甚至能够有利地设计在池2的任一侧上的电极5的布置和表面以及所述池2的几何形状从而脉冲41的形状强烈地依赖于颗粒的轨迹，这与在现有技术仪器中采用的概念背道而驰。然而，具有终止于带有低的曲率半径的角部中的柱形形状的孔口1，如在一个优选实施例中采用地，已经显示出所要求的特征。
在图5中示出代表颗粒在孔隙流动池中的轨迹的标识的一个实例。在该实例中，光学测量区带具有对应于孔隙流动池2的孔口1的内部的柱体的形式，该内部也能够是近似柱形形状的。可靠光学测量区带32在总光学测量区带中由外切的（circumscribed）柱体代表，并且通过所述可靠光学测量区带32的颗粒的最佳轨迹Tl的标识是近似高斯（Gaussian）51。这个标识具有当轨迹远离孔口的中心移动时（轨迹T2、T3、T4）变得更宽的平稳状态。因此在可靠光学测量区带32的限制下关联脉冲形状或者限制标识并且关于数学准则确定轨迹是有效的（标识51）还是无效的（标识52）是可能的。例如在图5中所示电阻脉冲的形状的变化当然是一个非限制性实例，因为根据孔隙流动池的几何形状并且根据颗粒的类型，它们的行为能够是不同的。
根据该优选实施例，为了确定轨迹的有效性而应用的数学准则是通过比较所测量的脉冲与用于所述脉冲的至少一个高度的、脉冲宽度的至少一个极限数值而给出的。
根据采用电阻率测量和光学吸光度测量的一个优选的但是非限制性的实施例，通过孔隙流动池的颗粒因此产生两个脉冲，或者电信号：源自阻抗测量传感器的电阻脉冲和源自光学吸光度传感器的脉冲。
光学脉冲根据通常的技术而被以模拟方式调节、放大和滤波以便被传输到模拟/数字转换器。
电阻脉冲是利用传统的技术获得的，但是在应用传感器时特别地小心以便最大化信噪比并且获得用于表征和分类的充分信息，例如带宽选择。
从阻抗测量和光学吸光度传感器获得的这些信号得到调节并且被传输到模拟/数字转换器，模拟/数字转换器被连接到能够特别地包括微处理器和/或FPGA和/或DSP的数字处理系统。光学和电阻脉冲的采样率适于每一种类型的信号从而获得对于数字处理而言有必要的信息量。
光学脉冲的处理能够被限制为提取有关幅度和宽度的信息。
利用基于将被分析的信号的时间和频率特性的传统的信号处理技术例如利用有限或者无限脉冲响应的数字滤波、最优滤波、快速傅里叶变换等对源自电阻式传感器的采样信号进行成形。
我们能够因此产生从电阻脉冲和相关联的光学脉冲形成的对并且存储它们的特性，例如幅度、脉冲宽度等。
然后能够利用分类算法处理排除背景噪声并且被归一化的电阻和光学脉冲，该分类算法以称为有效和无效的至少两个范畴分类测量。
有利地，该分类算法包括测量在与由最佳电阻脉冲形状代表的最佳轨迹相关联的标识和颗粒的有效轨迹即所测量的电阻脉冲的标识之间的差异。如果这个差异太大，则与这些颗粒有关的数据被视为是无效的。图8示出有效和无效电阻（Res）和光学（Opt）脉冲对的测量结果的实例。它们分别地对应于与遵循在图5中的轨迹例如Tl和T4的颗粒有关的测量。在图7中的时序图示意测量的获取和分类（Val）的时间序列。
执行实际的结果分析的表征算法有利地包括在具有基本统一的特性的范畴中的至少一个颗粒分类操作，和可选地所述颗粒的至少一个计数操作。根据一个有利的但是绝非限制该方法的实施例，该分类仅仅使用与其脉冲或者标识已经被分类成有效的颗粒有关的数据，如在图6中的流程图中所示意地。相反，能够对所有给出电阻脉冲（无论有效还是无效的）的测量执行计数。在保持在本发明的范围内时，当然能够设想在颗粒分类之后任何其它的数据利用方式。
有效颗粒的或者根据优选实施例在次级范畴中的白细胞分类能够有利地通过将源自在它们通过孔隙流动池2期间执行的电阻和光学测量的分析的一组数值或者坐标归属于所述颗粒而得以执行，所述坐标在在前限定的表示空间中限定它们的位置。然后将这个表示空间分划成将具有基本类似的特性的颗粒分组在一起的、单独的区域使得识别每一个次级范畴的群体成为可能，以例如测量它们的相对尺寸。图9示出作为分别地从电阻测量（Res）和光学吸光度测量（ALL）的分析获得的数据的函数的颗粒（在此情形中为白细胞）的表示的实例。每一个点均代表一对测量。图9a示出所有有效的和无效的测量。图9b仅仅示出有效的测量，这使得揭示相应于不同的颗粒范畴的、分离的点组成为可能。
根据本发明的有利的特征，能够容易地应用该方法和仪器来制造特别简单的血液学设备。根据本发明的仪器能够容易地被安装在包含将被分析的溶液的简单器皿60及其相关联的孔口61上。孔隙流动池2能够相对于器皿被安装在任何位置中。所述孔隙流动池还能够被安装在连续管线中并且能够由基本透明的并且是电绝缘体的、任何类型的材料制成。能够例如利用通过孔隙流动池2抽吸实现将被分析的溶液的转移。图10示出包括在孔口的轴线中的单一光学测量的非限制性应用实例。还能够围绕孔口的轴线放置几个光电二极管以允许在各种角度和各种波长下测量。
有利地，这个实施例还使得易于通过包含将被分析的溶液的半透明器皿组合利用分光光度技术的传统的血红蛋白测量。
根据具体的实施例，根据本发明的仪器能够包括在沿着孔隙流动池2在一个或者多个层中分布的多个电极，如例如在文献US 4，420，720中描述地。根据本发明的仪器还能够包括覆盖孔隙流动池2的全部或者部分内侧表面的、具有可变或者不可变电阻率的电极，如例如在US2001/0052763中描述地。在包括多于两个电极的、根据本发明的仪器的情形中，在不同的电极对之间使用几个阻抗测量是可能的。
根据具体的实施例，在保持在本发明的范围内时，以一个或者多个离散的频率以及在一个或者多个连续的电频带中使用复数阻抗测量是可能的。
根据具体的实施例，在保持在本发明的范围内时，使用至少一种光学性质的至少一个测量是可能的，例如，举例来说：
-自身荧光的测量、被联结到白细胞膜的标记引起的荧光的测量，或者被联结到白细胞的细胞内包含物的一个或者多个元件的标记引起的荧光的测量，其中在围绕孔隙流动池布置的至少一个探测器13上在荧光波长下测量发光强度，通过光谱过滤器，所述探测器例如被从处于激发波长7的光隔离；
-处于至少一个角度的弹性散射、处于至少一个角度的非弹性散射、反向散射的测量，为此测量，特别地能够以不同于光束7的轴线的定向围绕孔隙流动池布置一个或者多个探测器13，从而测量以不同的角度散射的光，光可能具有在光学频率中的移位；
-偏振的测量，其中探测装置13被设计成分析已经与颗粒相互作用的光的偏振，光源8具有已知的例如线性偏振。
根据具体的实施例，在根据本发明的仪器中，例如通过以不同的定向或者根据围绕孔隙流动池2的不同的轴线如在图1中所示地布置用于光学测量的几个仪器，或者通过引入用于分裂源自孔隙流动池的光束10的装置，同时地使用几种光学性质的测量是可能的。
根据具体的实施例，为确定轨迹的有效性而应用的数学准则能够由以下给出：
-至少一次与幅度阀值，或者最小脉冲高度的比较，
-在所测量的脉冲和至少一个脉冲模型之间在数学意义上的距离的至少一次计算，例如利用归一化关联函数计算所述距离，
-对于对所测量的脉冲的至少一次变换例如傅里叶变换的应用结果执行的至少一次分析，
-或者在保持在本发明的范围内时这些方法或者任何其它适当的数学方法的任何组合。
根据具体的实施例，在保持在本发明的范围内时，限定光学脉冲的一个或者多个模型以比较所测量的光学脉冲与所述模型或者多个模型并且在分类算法中包括这个比较也是可能的。另外，限定光学和电阻脉冲的一个或者多个配对模型并且基于这些模型执行比较和分类操作是可能的。这能够使得处理其它情形的、例如由于颗粒并不属于预期范畴，或者几个颗粒被同时地测量的事实而引起的测量误差成为可能。
根据具体的实施例，能够在基于与微系统（MEM）或者光学微系统（MOEM）领域有关的技术制成的仪器中采用该方法和相关联仪器，从而例如在单一构件中集成所有的流体、电气和光学功能。
根据其它具体的实施例，能够为除了生物学细胞之外的颗粒例如在工业粉末制造领域中的陶瓷颗粒，或者在颜料制造领域中的色素的测量采用该方法和相关联仪器。
当然，本发明不限于刚刚已经描述的实例，并且能够在不超过本发明的范围的情况下对于这些实例作出多个调节。
Claims (22)
1.一种用于颗粒表征的、不带鞘流的流式细胞计量术方法，包括以下步骤：
-通过孔隙流动池(2)转移包含颗粒(4)的流体(3)，所述孔隙流动池至少部分地对于至少一个感兴趣的波长是透明的并且至少部分地对于电是绝缘的，
-测量由在流体(3)中包含的所述颗粒(4)通过孔隙流动池(2)而产生的电阻抗变化，
-测量所述颗粒(4)的至少一种光学性质，所述颗粒与通过孔隙流动池的至少一个光束(7)互相作用，
-通过使用对电阻抗变化和光学性质的所述测量表征所述颗粒(4)，
其特征在于所述方法进一步包括以下步骤：
-至少根据对电阻抗变化的所述测量的脉冲(41)形状的分析推导有关在孔隙流动池(2)中的颗粒(4)的轨迹的信息，
-在颗粒表征期间至少为了利用对光学性质的所述测量而使用有关轨迹的所述信息，其中使用有关轨迹的所述信息包括拒绝与轨迹在预定义的可靠光学测量区带(32)之外的颗粒(4)对应的测量，所述预定义的可靠光学测量区带与所述脉冲(41)形状的限制标识相关联。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于仅仅包含颗粒(4)的流体(3)通过孔隙流动池(2)。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于对电阻抗变化的测量包括利用直流电执行的电阻率的测量和/或在至少一个非零频率下执行的至少一个复数阻抗测量。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于，所测量的所述至少一种光学性质是以下光学性质之一：吸光度、在至少一个角度下的弹性散射、在至少一个角度下的非弹性散射、弹性反向散射、非弹性反向散射、自身荧光、在由被联结到颗粒的至少一个标记引起的至少一个波长下的荧光、在由被联结到在颗粒中包含的至少一个要素的至少一个标记引起的至少一个波长下的荧光、光的偏振。
5.根据权利要求1的方法，其特征在于所述颗粒表征包括颗粒(4)的分类。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于所述颗粒表征包括颗粒(4)的计数。
7.根据权利要求5的方法，其特征在于对电阻抗变化的分析包括在所测量的电阻抗变化和在电阻抗变化的至少一个模型和至少一个在前限定的数字值中的、至少一个比较要素之间的比较，所述比较的结果确定颗粒(4)的轨迹是否已经穿过孔隙流动池(2)的、在前限定的区带。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于从被用于所述颗粒(4)的分类的数据移除与其轨迹没有穿过孔隙流动池(2)的、在前限定的区带的颗粒(4)有关的数据。
9.根据权利要求7的方法，其特征在于
-颗粒(4)的所测量的光学性质被与在光学性质的至少一个模型和至少一个在前限定的数字值中的至少一个比较要素相比较，
-如果电阻抗变化和光学性质与它们的分别的模型或者在前限定的数字值的比较的结果并不满足至少一个在前限定的准则，则能够从被用于所述颗粒(4)的分类的数据移除与颗粒(4)有关的数据。
10.根据权利要求5的方法，其特征在于颗粒(4)的分类操作包括以下步骤：
-将根据在它们通过孔隙流动池(2)期间执行的对所述测量的分析获得的一组数值或者坐标归属于颗粒，所述坐标在在前限定的表示空间中限定它们的位置，
-将所述表示空间分划成截然不同的区域，所述区域将具有类似的特性的颗粒分组在一起。
11.根据前面权利要求中任何一项的方法，其特征在于颗粒(4)包括血细胞。
12.一种用于颗粒表征的、不带鞘流的流式细胞计量术仪器，包括：
-孔隙流动池(2)，所述孔隙流动池至少部分地对于至少一个感兴趣的波长是透明的并且至少部分地对于电是绝缘的，
-用于通过所述孔隙流动池转移包含颗粒(4)的流体的装置，
-用于测量由在流体(3)中包含的所述颗粒(4)通过孔隙流动池(2)而产生的电阻抗变化的装置，
-用于测量所述颗粒(4)的至少一种光学性质的装置，所述颗粒与通过孔隙流动池的至少一个光束(7)互相作用，
-用于对电阻抗的变化和光学性质的所述测量的分析的装置，
其特征在于，所述仪器包括：
-用于至少根据对电阻抗变化的所述测量的脉冲(41)形状的分析推导有关在孔隙流动池(2)中的颗粒的轨迹的信息的装置，和
-用于在颗粒表征期间至少为了利用光学性质的所述测量而使用有关轨迹的所述信息的装置，其中使用有关轨迹的所述信息包括拒绝与轨迹在预定义的可靠光学测量区带(32)之外的颗粒(4)对应的测量，所述预定义的可靠光学测量区带与所述脉冲(41)形状的限制标识相关联。
13.根据权利要求12的仪器，其特征在于孔隙流动池(2)的几何形状被以如此方式调整，使得在所述颗粒(4)通过期间所测量的电阻抗变化依赖于它们在所述孔隙流动池(2)中的轨迹。
14.根据权利要求12的仪器，其特征在于孔隙流动池(2)包括具有以下形式之一的内部截面：圆形、矩形。
15.根据权利要求12的仪器，其特征在于孔隙流动池(2)由以下材料中的至少一种构成：蓝宝石、红宝石、玻璃、塑料。
16.根据权利要求12到15中任一项的仪器，其特征在于用于测量由颗粒(4)通过而产生的电阻抗变化的装置包括分别地在孔隙流动池(2)的孔口(1)的任一侧上布置的至少两个电极(5)，所述电极与包含颗粒(4)的流体(3)电接触。
17.根据权利要求16的仪器，其特征在于用于测量由颗粒(4)通过而产生的电阻抗变化的装置还包括被布置在孔隙流动池(2)的孔口(1)中的至少一个电极，所述电极与包含颗粒(4)的流体(3)电接触。
18.根据权利要求17的仪器，其特征在于用于测量颗粒的光学性质的装置包括：
-至少一个光源(8)，和
-至少一个光电子探测装置(13)。
19.根据权利要求18的仪器，其特征在于用于测量颗粒的光学性质的装置包括聚焦(9)从光源(8)发射的光(7)于孔隙流动池(2)中的至少一个光学装置。
20.根据权利要求18的仪器，其特征在于用于测量颗粒的光学性质的装置包括收集(11)从孔隙流动池(2)发射的光(10)的至少一个光学装置。
21.根据权利要求18的仪器，其特征在于用于测量颗粒的光学性质的装置为多个，其中至少一个被与孔隙流动池(2)集成。
22.一种用于血液分析的设备，其特征在于所述设备包括至少一个根据权利要求12到21中任一项的仪器，将被分析的颗粒(4)包括血细胞。
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