BRPI0921518B1

BRPI0921518B1 - Método e dispositivo de citometria de fluxo sem fluidos envolventes

Info

Publication number: BRPI0921518B1
Application number: BRPI0921518-2A
Authority: BR
Inventors: Henri Champseix; Oliver Magnin; Bernard Welmant
Original assignee: C2 Diagnostics
Priority date: 2008-12-02
Filing date: 2009-12-01
Publication date: 2019-06-04
Also published as: WO2010063936A1; BRPI0921518B8; US20110235030A1; BRPI0921518A2; EP2352984A1; CN102239400B; RU2011127235A; FR2939199B1; WO2010063936A9; EP2352984B1; MX2011005656A; CN102239400A; FR2939199A1; JP2012510627A; PL2352984T3; RU2511065C2; US9243992B2

Abstract

método e dispositivo de citometria de fluxo sem fluidos envolventes a presente invenção refere-se a um método e a um dispositivo que adotam o método da citometria de fluxo, os quais podem ser usados, de preferência, mas sem a isto se restringir, na contagem e classificação de leucócitos. mais especificamente, ela se refere ao campo dos instrumentos de hematologia simplificados com custos operacionais moderados. o método de acordo com a presente invenção é caracterizado por usar uma técnica de medição de impedância para identificar as partículas cuja trajetória incluiu uma área de medição óptica predeterminada a fim de processá-las seletivamente, evitando assim o uso de fluidos envolventes para manter as partículas dentro da referida área de medição.

Description

Campo técnico

A presente invenção refere-se ao campo dos dispositivos automáticos para a contagem e caracterização de partículas suspensas em um meio líquido e, mais especifícamente, ao campo dos instrumentos de hematologia para a contagem e caracterização dos diversos tipos de células presentes em uma 10 amostra sanguínea.

Em especial, ela se refere, sem a isto a restringir, a um método para a contagem e classificação de leucócitos.

A presente invenção também se refere a um 15 dispositivo que adota esse método.

Técnica anterior

Normalmente, os leucócitos são classificados em cinco tipos: monócitos, linfócitos, neutrófilos, eosinófilos e basófilos. O conhecimento do número total de leucócitos e de sua 20 distribuição em relação a essas cinco subpopulações possibilita determinar uma patologia ou ajuda o médico a determiná-la.

Sendo assim, a técnica anterior e a presente invenção se referem a dispositivos para contar o número de leucócitos presentes em uma amostra sanguínea e determinar sua 25 distribuição no que se refere às cinco subpopulações.

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O documento US 2.656.508, em nome de W.H.

Coulter e colaboradores, descreve um método para a contagem absoluta de partículas em suspensão por medição de impedância. De acordo com esse método, determina-se o número de partículas 5 por unidade de volume por meio de uma técnica de medição de impedância que consiste em medir a variação de impedância em um microcanal quando uma célula sanguínea a atravessa. Essa técnica, simples e eficiente, não requer dispositivos fluídicos complexos e pode ser usada livremente já que a patente US 10 2.656.508, que a protegia, data de 1953. Sendo assim, ela é usada com frequência por todos os fabricantes de dispositivos automáticos (Beckman Coulter, Abbott, Bayer, C2 Diagnostics, Sysmex, ABX etc.) para a contagem absoluta do número de leucócitos.

Sabe-se que, nessa técnica de medição da impedância, o formato de um pulso gerado pela passagem de uma célula depende geometria do microcanal e da trajetória da célula dentro dele. Há, por exemplo, o artigo de Von Behrens e colaboradores (Von Behrens, “J. of Histocliemistry and

Cytocinemistryf 1976, Vol. 24, n° 1, pág. 247), que descreve a geometria das linhas do campo elétrico gerado em um canal de seção retangular ou circular e o formato dos pulsos resistivos em função da trajetória da célula ou partícula dentro do referido canal. A maioria dos dispositivos da técnica anterior tenta 25 minimizar essa dependência do formato do pulso resistivo em relação à trajetória otimizando a geometria do canal, conforme

3/32 descrito, por exemplo, por T. Zhao e colaboradores no documento US 2008/0093216, ou a disposição e estrutura dos eletrodos, conforme descrito, por exemplo, nos documentos US 4.420.720, em nome de Newton e colaboradores, e US 2001/0052763, em 5 nome de North e colaboradores, respectivamente.

No entanto, a técnica de medição da impedância por si só não proporciona uma distinção confiável no que se refere às cinco subpopulações de leucócitos. De maneira vantajosa, essa distinção dos leucócitos de acordo com suas cinco subpopulações io é realizada combinando-se a medição da impedância com técnicas de citometria de fluxo óptica. O documento US 5.812.419, em nome de V.L. Chupps e colaboradores, descreve um método para a análise automática de células sanguíneas que combina, além da medição da impedância, medições ópticas de absorção, 15 espectrofotometria, difração a diferentes ângulos e fluorescência.

De acordo com esse método, as medidas por medição de impedância e citometria de fluxo óptica são tiradas em diferentes células de análise, e algoritmos de combinação de dados permitem obter a contagem de células e a caracterização desejada. 20 O método descrito por Chupps e colaboradores revela claramente a vantagem do uso combinado da medição de impedância e da citometria de fluxo óptica, mas o uso de diferentes células de análise toma o sistema bastante complexo. Além disso, a possível falta de homogeneidade nas amostras sanguíneas analisadas pelos 25 diferentes métodos é uma fonte considerável de incertezas quanto à medição.

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No documento US 6.228.652, C.M. Rodriguez e colaboradores descrevem uma câmara de citometria para tirar medidas ópticas e de impedância ao mesmo tempo das mesmas células, simplificando assim o dispositivo e diminuindo os 5 problemas na hora de correlacionar as medidas de vários transdutores. Sendo assim, o dispositivo de acordo com o documento US 6.228.652 possibilita medir, para cada célula, seu volume, em função de sua resistividade à corrente direta, sua opacidade de radiofrequência, em função de sua condutividade à 10 frequência elétrica de medição, e suas características ópticas de difração e fluorescência.

A simplificação de dispositivos é um desafio industrial importante ao desenvolvimento de dispositivos de hematologia automáticos, pois abre novos mercados em 15 pequenos postos de saúde e em países emergentes. Por exemplo, o documento FR 2.553.885, em nome de D. Lefevre e colaboradores, descreve um dispositivo de citometria óptica e elétrica em que os eletrodos para medir a resistividade são componentes integrantes do dispositivo para o transporte do fluxo 20 de células.

A citometria de fluxo óptica impõe barreiras consideráveis em termos de intoxicação relativa do fluxo que contém as células e dos meios de iluminação. Na verdade, é importante para a qualidade das medições ópticas que as células 25 atravessem o feixe dentro de uma área, chamada de área de medição óptica, onde a iluminação pode ser considerada

5/32 sufícientemente uniforme quanto à intensidade. A célula que atravessa o feixe em uma área onde a iluminação é incorreta pode originar uma medida incorreta e um erro na definição do tipo de célula. Portanto, a dificuldade está em fazer com que o fluxo que transporta as células a circule por inteiro dentro da área de medição óptica de intensidade uniforme.

A solução geralmente adotada pelos dispositivos da técnica anterior inclui o uso de um ou mais fluxos envolventes, também conhecidos como fluxos laterais, que circulam concentricamente em relação ao fluxo central, que transporta as células. Esses fluxos envolventes repelem o fluxo central e, portanto, confinam com bastante precisão as partículas que ele contém. Sendo assim, o documento FR 2.653.885, por exemplo, adota uma técnica de envolvimento duplo, na qual o fluxo central é limitado por dois fluxos envolventes concêntricos. A geração do fluxo envolvente e do fluxo central, que transporta as células sanguíneas, requer várias entradas fluídicas, bem como microbocais, o que leva a conjuntos particularmente densos de componentes fluídicos em tomo da área de medição, tomando o conjunto de sensores complexo e caro. Ademais, para que o confmamento das partículas pelo fluxo envolvente seja eficaz, sua vazão deve ser superior à vazão do fluxo que contém a amostra. Isso significa que um volume considerável do reagente utilizado, na maioria das vezes um diluente, não é de uso químico, mas, em vez disso, serve apenas para guiar o fluxo da amostra que será

6/32 medida. As consequências, em termos de consumo de reagentes e de produção de resíduos, são evidentes.

Além do mais, o grau de diluição usado em soluções desse tipo é incompatível com o grau de diluição necessário à medição das hemoglobinas, que costumam ser medidas com a diluição dos leucócitos, e, portanto, toma necessária uma nova diluição, bem como o uso de outros elementos fluídicos onerosos.

O objetivo da presente invenção é o de propor um método de citometria de fluxo compreendendo medições ópticas e de impedância que dispense o uso de fluxos envolventes, simplificando assim consideravelmente a câmara de medição e os elementos fluídicos relacionados.

Outro objetivo da presente invenção é o de propor um dispositivo que adote esse método de fabricação e manutenção mais simples e econômica que os dispositivos da técnica anterior a fim de que dispositivos automáticos assim equipados possam ser usados por laboratórios menores com a mesma qualidade de medição.

Revelação da invenção

Esses objetivos são atingidos por meio de um método de citometria de fluxo para a caracterização de partículas compreendendo as etapas de:

- transportar um fluido que contém partículas através de uma câmara de fluxo, a qual é, ao menos em parte, substancialmente transparente a ao menos um comprimento de i/yi onda de interesse e, ao menos em parte, substancialmente isolante elétrico,

- medir a variação de impedância elétrica gerada pela passagem das referidas partículas presentes no fluido pela câmara de fluxo,

- medir ao menos uma propriedade óptica das referidas partículas, que interagem com ao menos um feixe de luz que atravessa a câmara de fluxo,

- caracterizar as referidas partículas usando as 10 referidas medidas de variação de impedância elétrica e de propriedades ópticas, o método sendo caracterizado por compreender ainda as etapas de:

- deduzir informações sobre a trajetória das 15 partículas na câmara de fluxo analisando-se ao menos a referida medida de variação de impedância elétrica,

- utilizar as referidas informações sobre a trajetória para caracterizar as partículas.

De acordo com características particularmente 20 vantajosas,

- o método de acordo com a presente invenção é um método de citometria de fluxo que dispensa o uso de fluxos envolventes, como ocorre nos métodos da técnica anterior. O princípio do confinamento físico das partículas por meio de fluidos envolventes é substituído pela possibilidade processar seletivamente os dados obtidos pelas medidas das partículas,

8/32 processamento esse condicionado ou determinado pelas informações sobre a trajetória das partículas;

- apenas o fluido que contém as partículas atravessa a câmara de fluxo;

- a câmara de fluxo pode ser simplificada consideravelmente em comparação aos dispositivos da técnica anterior. Ela pode ser reduzida a uma simples passagem ou canal dentro de uma câmara, através do qual o fluido que contém as partículas é transportado e dentro do qual ocorrem as medições.

Para maior vantagem,

- a medição da variação de impedância elétrica pode compreender a medição da resistividade em corrente contínua;

- a medição da variação de impedância elétrica também pode compreender ao menos uma medição de impedância complexa realizada em ao menos uma freqüência diferente de zero;

- a ao menos uma propriedade óptica medida pode ser uma das propriedades ópticas a seguir: absorbância, espalhamento elástico em ao menos um ângulo, espalhamento inelástico em ao menos um ângulo, retroespalhamento elástico, retroespalhamento inelástico, autofluorescência, fluorescência em ao menos um comprimento de onda causada por ao menos um marcador ligado às partículas, fluorescência em ao menos um comprimento de onda causada por ao menos um marcador ligado

9/32 a ao menos um elemento presente nas partículas e polarização de luz;

- a caracterização das partículas pode compreender a classificação das partículas;

- a caracterização das partículas também pode compreender a contagem das partículas;

- a análise da variação de impedância elétrica pode compreender a comparação entre uma variação de impedância elétrica medida e ao menos um elemento de comparação dentre ao menos um modelo de variação de impedância elétrica e ao menos um valor numérico predefinido, o resultado da referida comparação determinando se a trajetória das partículas incluiu uma área predeterminada da câmara de fluxo;

- os dados referentes às partículas cuja trajetória não incluiu a área predeterminada da câmara de fluxo podem ser excluídos dos dados usados para a classificação das referidas partículas. Sendo assim, com o método de acordo com a presente invenção, é possível classificar as partículas com referência à sua trajetória, por exemplo, mantendo-se somente os dados que atendam certas condições;

- a propriedade óptica medida das partículas também pode ser comparada a ao menos um elemento de comparação dentre ao menos um modelo de propriedade óptica e ao menos um valor numérico predefinido. Nesse caso, se os resultados das comparações da variação de impedância elétrica e da propriedade óptica com seus respectivos modelos ou valores

10/32 numéricos predefinidos não satisfizerem ao menos um critério predefinido, os dados referentes às partículas podem ser excluídos dos dados usados para sua classificação;

a classificação das partículas pode compreender etapas de atribuição às partículas de um conjunto de valores ou coordenadas obtido pela análise das referidas medidas tiradas durante sua passagem pela câmara de fluxo, coordenadas essas que definem a posição das partículas em um espaço de representativo predefinido, e etapas de segmentação do referido espaço representativo em regiões distintas, as quais reúnem partículas com características substancialmente semelhantes;

- as partículas podem incluir células sanguíneas, que podem ser leucócitos.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, propomos um dispositivo de citometria de fluxo para a caracterização de partículas compreendendo:

- uma câmara de fluxo, ao menos em parte, substancialmente transparente a ao menos um comprimento de onda de interesse e, ao menos em parte, substancialmente isolante elétrico,

- meios para transportar um fluido que contém partículas através da referida câmara de fluxo,

- meios para medir a variação de impedância elétrica gerada pela passagem das referidas partículas presentes no fluido através da câmara de fluxo,

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- meios para medir ao menos uma propriedade óptica das partículas, que interagem com ao menos um feixe de luz que atravessa a câmara de fluxo,

- meios para analisar as referidas medidas de variação de impedância elétrica e propriedades ópticas, o dispositivo sendo caracterizado por compreender:

- meios para deduzir informações sobre a trajetória das partículas dentro da câmara de fluxo analisando-se ao menos a referida medida de variação de impedância elétrica e

- meios para usar as referidas informações sobre a trajetória a fim de caracterizar as partículas.

O dispositivo de acordo com a presente invenção pode compreender ainda meios para preparar as partículas de interesse antes de sua passagem pela câmara de fluxo. As partículas de interesse são as partículas que se deseja analisar e classificar e que pode ser necessário separar de outras partículas presentes na amostra, em especial, por meio de métodos de lise ou diluição no caso de células sanguíneas.

Para maior vantagem,

- a geometria da câmara de fluxo pode ser adaptada de modo que a variação de impedância elétrica medida durante a passagem das partículas dependa substancialmente de sua trajetória dentro da referida câmara de fluxo. Isso pode ser obtido, por exemplo, por meio de uma câmara de fluxo de seção substancialmente retangular cujas bordas longitudinais culminem

12/32 em eantos com raio de curvatura baixo. Vale frisar, contudo, que estamos à procura de um resultado oposto à prática dos dispositivos da técnica anterior e, portanto, esperamos minimizar essa dependência quanto à trajetória das partículas;

- a câmara de fluxo pode incluir uma secção transversal interna substancialmente de um dos formatos a seguir: circular ou retangular;

- a câmara de fluxo pode ser feita de ao menos um dos materiais a seguir: safira, rubi, vidro ou plástico;

- os meios para medir a variação de impedância elétrica gerada pela passagem das partículas podem incluir ao menos dois eletrodos dispostos, respectivamente, de cada lado do canal da câmara de fluxo, eletrodos esses fazendo contato elétrico com o fluido que contém as partículas;

- os meios para medir a variação de impedância elétrica gerada pela passagem das partículas também podem incluir ao menos um eletrodo disposto no canal da câmara de fluxo, o referido eletrodo fazendo contato elétrico com o fluido que contém as partículas. Sendo assim, um dispositivo de acordo com a presente invenção pode compreender, por exemplo, eletrodos distribuídos ao longo da parede da câmara de fluxo. Ao menos um dos eletrodos também pode ser um componente integrante dos meios para transportar o fluido que contém as partículas;

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- os meios para medir a propriedade óptica das partículas podem incluir ao menos uma fonte luminosa e ao menos um meio de detecção optoeletrônico;

- os meios para medir a propriedade óptica das partículas também podem incluir ao menos um meio óptico para focalizar a luz advinda da fonte luminosa na câmara de fluxo;

- os meios para medir a propriedade óptica das partículas também podem incluir ao menos um meio óptico para coletar a luz advinda da câmara de fluxo;

- os meios para medir a propriedade óptica das partículas podem incluir ainda ao menos um meio para a filtragem espectral da luz advinda das partículas que serão caracterizadas;

- ao menos um dos referidos meios ópticos para medir a propriedade óptica das partículas pode ser parte integrante da câmara de fluxo. A referida integração é possível, por exemplo, adotando-se uma câmara de fluxo feita de plástico cujas paredes externas consistam em lentes para focalizar e, com opção, coletar a luz. Elementos ópticos, como um detector optoeletrônico, por exemplo, também podem ser dispostos diretamente na câmara de fluxo.

De acordo com uma concretização específica, os meios de detecção optoeletrônicos podem ser dispostos a fim de medir um feixe de luz advindo das partículas que serão caracterizadas de orientação angular diferente do eixo do feixe oriundo da fonte luminosa. Essa configuração possibilita, por

14/32 exemplo, tirar medidas de espalhamento em ângulos diferentes de zero.

De acordo com outra concretização específica, os meios para medir a propriedade óptica das partículas podem 5 incluir uma fonte luminosa com um estado de polarização conhecido e meios de detecção optoeletrônicos que compreendam meios para analisar a polarização da luz.

De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, propomos um instrumento de análise sanguínea que 10 compreende ao menos um dispositivo de acordo com a presente invenção, as partículas que serão analisadas sendo células sanguíneas, em especial leucócitos.

Descrição das figuras e concretizações

Outras vantagens e características da presente invenção transparecerão pela leitura da descrição detalhada das aplicações e concretizações, meramente exemplificativas, com referência aos desenhos anexos, dentre os quais:

- a figura 1 ilustra um diagrama esquemático do dispositivo de acordo com a presente invenção;

- a figura 2 ilustra a influência do posicionamento das partículas no feixe de luz na citometria de fluxo.A figura 2a representa um caso em que o fluxo das partículas não está centralizado no feixe, ao passo que a Figura 2b representa o fluxo de partículas centralizado no feixe. As consequências são ilustradas no caso, meramente exemplificativo, de medidas de absorbância;

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- as figuras 3a e 3b ilustram a deflexão de um feixe de luz pela superfície de um canal cilíndrico e a delimitação consequente das áreas de medição óptica confiável;

- a figura 4a representa um exemplo na forma de linhas equipotenciais vista em uma abertura microscópica feita em um material isolante quando se aplica tensão elétrica através da referida abertura. A figura 4b ilustra o formato dos pulsos resistivos obtidos quando as partículas atravessam essa abertura de acordo com várias trajetórias. Essas ilustrações foram retiradas de V. Kachel, “Flow cytometry and Sorting”, Wiley-Liss Inc., 1990, também citado no documento US 2008/0093216;

- a figura 5a ilustra exemplos de trajetórias de partículas dentro de uma câmara de fluxo cilíndrica, bem como a delimitação da área de medição óptica confiável conforme definida na figura 3. A figura 5b ilustra o formato dos pulsos resistivos que seriam obtidos por partículas que se deslocassem ao longo das trajetórias apresentadas na figura 5a;

- a figura 6 ilustra um fluxograma da aquisição e processamento de dados de acordo com uma concretização preferida do método de acordo com a presente invenção;

- a figura 7 ilustra um diagrama de tempo da aquisição e processamento de dados de acordo com o fluxograma da figura 6;

- a figura 8 ilustra exemplos de sinais medidos que correspondem, respectivamente, a pulsos resistivos e pulsos ópticos decorrentes de medições de absorbância. Esses sinais

16/32 representam, respectivamente, as trajetórias TI e T4 ilustradas na figura 5;

- a figura 9 ilustra exemplos de diagramas de classificação de partículas, nesse caso leucócitos, obtidos por meio de um dispositivo de acordo com a presente invenção. A figura 9a ilustra o caso em que são representadas todas as partículas detectadas. A figura 9b ilustra apenas as partículas classificadas de acordo com o método da presente invenção;

- a figura 10 ilustra uma concretização preferida, mas não limitante, de um dispositivo de acordo com a presente invenção;

- a figura 11 ilustra um diagrama esquemático de um dispositivo da técnica anterior que adota o confinamento das partículas na área de medição óptica por meio de fluidos envolventes.

Com referência aos desenhos, descreveremos uma concretização preferida, mas não limitante, de um dispositivo que adota o método de acordo com a presente invenção em um instrumento para contar e caracterizar os vários tipos de células presentes em uma amostra sanguínea, em especial os leucócitos. Esse instrumento pode ser usado, por exemplo, para determinar o total de leucócitos e sua distribuição relativa em suas cinco subpopulações: monócitos linfócitos, neutrófilos, eosinófilos e basófilos.

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Doravante na presente descrição, admitir-se-á as partículas como glóbulos brancos, ou leucócitos, o que, contudo, não constitui uma limitação à presente invenção.

Com referência à figura 1, o dispositivo que adota o método de acordo com a presente invenção compreende uma câmara de fluxo 2, que é atravessada por um fluido 3 que contém partículas 4. Essa câmara de fluxo compreende um canal 1, onde ocorrem, em essência, as interações entre as partículas e os meios de medição. É possível transportar o fluido 3 pela câmara de fluxo 2 por meio de várias técnicas, sem divergir do âmbito da presente invenção, dentre as quais podemos citar, em especial, fluxo por gravidade, aspiração e injeção sob pressão.

De preferência, a câmara de fluxo 2 e o canal 1 têm uma seção substancialmente circular, e o canal 1 tem um diâmetro da ordem de 80 pm. Evidentemente, essas especificações não são de forma alguma limitantes, e um dispositivo de acordo com a presente invenção também pode muito bem compreender uma câmara de fluxo 2 de seção substancialmente retangular, ou poligonal, de tamanho diferente.

Para permitir medições ópticas e de impedância, a câmara de fluxo 2 deve ser feita, ao menos em parte, de ao menos um material substancialmente isolante elétrico e, ao menos em parte, de ao menos um material substancialmente transparente nos comprimentos de onda ópticos de interesse. De acordo com uma concretização preferida, ela é feita de safira. É claro que é possível, sem divergir do âmbito da presente invenção, construir

18/32 uma câmara de fluxo 2 feita de outros materiais, como rubi, vidro, polímeros ou plástico, ou mesmo de uma mistura de diversos materiais.

De acordo com uma concretização preferida, são dispostos eletrodos 5 de ambos os lados da câmara de fluxo 2. Eles fazem contato elétrico com o fluido para viabilizar a formação de um campo elétrico longitudinal na câmara de fluxo e, em especial, através do canal 1. Esses eletrodos 5 conectam-se a um dispositivo 6, que mede as variações de impedância durante a passagem das partículas 4 pelo canal 1 da câmara de fluxo 2, ou seja, o formato temporal e a amplitude dos pulsos em virtude da passagem dessas partículas. A medição de impedância adotada pelo dispositivo de acordo com a presente invenção é, de preferência, mas sem a isto se restringir, uma medição de resistividade feita com corrente contínua.

De acordo com uma concretização preferida, o dispositivo de acordo com a presente invenção compreende ao menos um dispositivo de medição óptica, cujo princípio geral é medir o resultado da interação entre uma partícula, como um leucócito, e um feixe de luz. A referida medição também é chamada de medição de uma propriedade óptica da partícula.

Com referência à figura 1, um dispositivo de medição óptica desse tipo pode incluir, em especial, uma fonte luminosa 8 e ao menos um meio de detecção 13. Ele também pode incluir ao menos um meio óptico 9 para focalizar o feixe 7

19/32 na câmara de fluxo 2 e ao menos um meio óptico 11 para coletar a luz advinda da câmara de fluxo 2.

A fonte luminosa 8 pode, por exemplo, ser um laser, um diodo de laser ou um diodo emissor de luz.

Os meios ópticos de focalização 9 e coleta 11 podem incluir, em especial, lentes esféricas, asféricas, cilíndricas ou de formato livre, com gradiente de índices e/ou superfícies refletoras (espelhos). Eles também podem incluir ao menos um guia de luz, que, por exemplo, guie os feixes advindos da área de ío medição à superfície sensível do meio de detecção 13.

O meio de detecção 13 pode incluir ao menos um fotodetector, como um fotodiodo, um fotodiodo de avalanche ou um tubo fotomultiplicador.

Para maior vantagem, ao menos um dos meios 15 ópticos para focalizar 9 e coletar 11 pode ser, ao menos em parte, integrado à câmara de fluxo 2, por exemplo, por colagem ou adaptando-se o formato externo desta para que constitua a superfície de uma lente. Também é possível fixar o meio de detecção 13 diretamente na câmara de fluxo 2, opcionalmente 20 sem a adoção do meio de coleta 11.

De acordo com uma concretização preferida, mas não limitante, do dispositivo de acordo com a presente invenção, realiza-se uma medição de absorbância, em que se mede a variação de intensidade da luz por meio do detector 13 25 quando um leucócito atravessa a feixe de luz 7. Sendo assim, desenvolveremos o restante da descrição com base na medição

20/32 dessa propriedade óptica. Todavia, os versados na técnica perceberão com clareza como usar o método de acordo com a presente invenção em dispositivos que adotem medições de outras propriedades ópticas das partículas, sem divergir do âmbito da presente invenção.

Para maior vantagem, de acordo com essa concretização,

- a fonte luminosa 8 pode ser um diodo emissor de luz no tom azul;

- o dispositivo óptico de focalização 9 pode consistir em uma chapa de plano paralelo ajustável, que possibilita centralizar o feixe 7 na câmara de fluxo 2, e um dubleto acromático e uma lente cilíndrica para focalizar o feixe 7 na câmara de fluxo 2, que, na concretização preferida, é substancialmente cilíndrica;

- o dispositivo óptico de coleta 11 pode consistir em duas lentes plano-convexas que geram a imagem da área de interação da luz com as partículas 4 no meio de detecção 13, que inclui, por exemplo, um fotodiodo.

Para obter resultados confiáveis, é necessário que a área de medição óptica, onde ocorrem as interações entre as partículas e a luz, tenha dimensões limitadas, por exemplo, da ordem de 100 pm x 30 pm, e que a distribuição de intensidade da luz incidente nela seja substancialmente homogênea. A dificuldade consiste em fazer com que o fluxo que transporta as partículas circule de modo a passar por inteiro dentro da referida

21/32 área de medição óptica. A figura 2 ilustra esse problema no caso não-limitante da medição de absorbância de partículas de absorbância substancialmente idêntica. Quando todo o fluxo 3 de partículas 4 atravessa a área de medição óptica 7, todos os picos de absorbância 20 têm substancialmente a mesma amplitude, entre 21b e 22b. Se o fluxo 3 que transporta as partículas atinge ou mesmo cruza o limite da área de medição óptica 7, como demonstra a figura 2a, as partículas 4 não mais receberão a mesma quantidade de luz e a medição óptica será falha. O erro se caracteriza por uma variabilidade considerável, entre 21a e 22a, da amplitude dos picos 20, o que, por sua vez, aumenta a incerteza na classificação das partículas.

A figura 3 ilustra a deflexão de um feixe de luz 7 pela superfície de um canal cilíndrico, como o canal 1 da câmara de fluxo 2. Na Figura 3a, o feixe é maior do que o diâmetro do canal 1. Devido ao ângulo de incidência na superfície interna do canal 1, certas frações 30 desse feixe 7 refletem ou ao menos se refratam intensamente, fazendo com que uma área periférica 33 do canal 1 não seja iluminada de maneira suficientemente uniforme. Na Figura 3b, o feixe é menor do que o diâmetro do canal 1. Da mesma forma, uma área periférica 33 distante do feixe de extremidade 31 não é iluminado corretamente. Em ambos os casos, apenas as partículas que atravessarem a assim chamada área de medição óptica confiável 32 serão medidas em condições adequadas. As que passarem pela área 33 trarão resultados imperfeitos. Certamente, os versados na

22/32 técnica podem estender esse raciocínio com facilidade a outras geometrias de canal 1 e câmaras de fluxo 2 sem divergir do âmbito da presente invenção.

A solução adotada com frequência nos dispositivos da técnica anterior, como demonstra a figura 11, envolve o confinamento 72 do fluxo 3 que transporta as partículas 4 no centro da câmara de fluxo 73 graças um ou mais fluxos envolventes concêntricos 71, com todas as desvantagens já mencionadas em termos de complexidade, custo de fabricação e ío custo de operação, em especial, em decorrência do uso de injetores 70.

Em contrapartida, a solução adotada no método de acordo com a presente invenção compreende identificar as partículas cuja trajetória na câmara de fluxo não inclui uma área 15 predeterminada, por exemplo, a área de medição óptica confiável 32, de modo que se possa tratá-las de maneira diferente ao analisar os dados. Em especial, é possível realizar essa identificação analisando-se o formato dos pulsos obtidos pela medição de impedância. Em outras palavras, as informações sobre 20 a trajetória das partículas 4 no canal 1 da câmara de fluxo 2 deduzidas, em especial, pela análise de variações na impedância elétrica são usadas para influir na caracterização das partículas, isto é, para modificar a forma como são usadas as medidas.

Com referência à figura 4, quando uma 25 partícula, como um leucócito, atravessa uma abertura a que se aplica um campo elétrico, a variação temporal da resistividade ao

23/32 longo da referida abertura, que pode ser o canal 1 da câmara de fluxo 2 do dispositivo de acordo com a presente invenção, assume a forma de um pulso 41, cujo formato depende em grande medida da trajetória 40 da partícula. Em especial, podemos observar no 5 exemplo da figura 4 que o referido pulso 41 se cresce, por fim, se estabiliza e, então, cresce novamente à medida que a trajetória da partícula se afasta do centro da câmara de fluxo 2. Esse efeito decorre do formato do campo elétrico, cujas linhas equipotenciais 42 em volta e dentro do canal 1 são ilustradas na figura 4a.

Esse efeito, que é considerado nos dispositivos da técnica anterior como fonte de erros que precisa ser minimizada, é aproveitado pela presente invenção. Ele possibilita caracterizar as trajetórias das partículas na câmara de fluxo com base na análise do formato dos pulsos resistivos, formato esse que pode ser considerado um traço característico dessas trajetórias.

A disposição e a superfície dos eletrodos 5 de ambos os lados da câmara 2, bem como a geometria da referida câmara 2, podem ainda ser projetadas de maneira vantajosa de modo que o formato do pulso 41 dependa em grande medida da 20 trajetória das partículas, o que vai contra as concepções adotadas pelos dispositivos da técnica anterior. No entanto, um canal 1 cilíndrico que culmina em cantos de raio de curvatura baixo, conforme ocorre em uma concretização preferida, já apresenta as características necessárias.

A figura 5 ilustra um exemplo de traços característicos que representam as trajetórias das partículas em

24/32 uma câmara de fluxo. Nele, a área de medição óptica tem um formato cilíndrico correspondente ao interior do canal 1 da câmara de fluxo 2, que também pode ter um formato amplamente cilíndrico. A área de medição óptica confiável 32 é representada 5 por um cilindro confinado dentro da área de medição óptica como um todo, e o traço característico da trajetória ideal TI de partículas que atravessam a referida área de medição óptica confiável 32 é de cerca de 51 gauss. Esse traço característico tem um maior patamar à medida que a trajetória se afasta do centro do 10 canal (trajetórias T2, T3, T4). Por conseguinte, é possível associar aos limites da área de medição óptica confiável 32 um formato de pulso ou traço característico limitante e determinar, com referência a um critério matemático, se determinada trajetória é válida (traço característico 51) ou inválida (traço característico 15 52). A mudança de formato dos pulsos resistivos, conforme ilustra a figura 5, é, na verdade, um exemplo não-limitante visto que seu comportamento pode variar de acordo com a geometria da câmara de fluxo e de acordo com o tipo de partícula.

De acordo com a concretização preferida, o 20 critério matemático usado para determinar a validade de uma trajetória resulta da comparação dos pulsos medidos a ao menos um valor-limite da largura de pulso para ao menos uma altura do referido pulso.

De acordo com uma concretização preferida, 25 mas não limitante, adotando-se a medição de resistividade e a medição de absorbância óptica, as partículas que atravessam a

25/32 câmara de fluxo geram, portanto, dois pulsos ou sinais elétricos: um pulso resistivo oriundo do sensor de medição de impedância e um pulso oriundo do sensor de absorbância óptica.

Os pulsos ópticos são condicionados analogicamente, amplificados e filtrados de acordo com técnicas típicas para serem transmitidos ao conversor analógico/digital.

Os pulsos resistivos são obtidos por técnicas convencionais, mas toma-se cuidado especial na instalação do sensor a fim de maximizar a razão sinal-ruído e obter informações suficientes para a caracterização e classificação, como a escolha da largura de banda.

Esses sinais obtidos pelos sensores de medição de impedância e absorbância óptica são condicionados e transmitidos a um conversor analógico/digital, que se conecta a um sistema de processamento digital, que pode incluir, em especial, um microprocessador, um FPGA e/ou um DSP. A taxa de amostragem dos pulsos ópticos e resistivos é adaptada a cada tipo de sinal a fim de obter a quantidade de informações necessária ao processamento digital.

O processamento dos pulsos ópticos pode se limitar à extração das informações referentes à amplitude e à largura.

O sinal de amostra oriundo do sensor resistivo ganha forma por meio de técnicas de processamento de sinais convencionais com base nas características de tempo e freqüência do sinal que será analisado, como filtragem digital com resposta

26/32 de pulso finita ou infinita, filtragem ideal, transformada rápida de Fourier etc.

Logo, podemos criar um par, formado pelo pulso resistivo e pelo pulso óptico relacionado, e armazenar suas 5 características, por exemplo, amplitudes, larguras de pulso etc.

Em seguida, os pulsos resistivos e ópticos, normalizados e com o ruído de fundo removido, podem ser processados pelo algoritmo de classificação, que classifica as medidas em ao menos duas categorias chamadas de válida e 10 inválida.

Para maior vantagem, o algoritmo de classificação compreende a medida da diferença entre um traço característico referente a uma trajetória ideal, representado por um formato de pulso resistivo ideal, e o traço característico de 15 trajetórias reais das partículas, isto é, dos pulsos resistivos medidos. Se essa diferença for muito grande, consideram-se os dados referentes a essas partículas como inválidos. A figura 8 ilustra exemplos do resultado da medição de dois pares de pulsos resistivos (Res) e ópticos (Opt), um válido e o outro inválido. Eles 20 correspondem, respectivamente, a medidas referentes a partículas que percorreram as trajetórias TI e T4 da figura 5. O diagrama de tempo da figura 7 ilustra a seqüência de tempo da aquisição e classificação (Vai) das medidas.

Para maior vantagem, o algoritmo de 25 caracterização, que faz a análise real dos resultados, compreende ao menos uma operação de classificação das partículas em

27/32 categorias com características substancialmente uniformes e, com opção, ao menos uma operação de contagem das referidas partículas. De acordo com uma concretização vantajosa, mas que não limita o método de maneira alguma, a classificação usa 5 apenas dados referentes às partículas cujos pulsos ou traços característicos tenham sido classificados como válidos, conforme ilustra o fluxograma da figura 6. Em contrapartida, a contagem pode ser realizada com todas as medidas que originaram um pulso resistivo, sejam elas válidas ou inválidas. Evidentemente, 10 contempla-se qualquer outra forma de aproveitamento dos dados para a classificação das partículas sem divergir do âmbito da presente invenção.

Para maior vantagem, a classificação das partículas válidas, ou, de acordo com uma concretização 15 preferida, dos leucócitos válidos, em subcategorias pode ser realizada atribuindo-se às referidas partículas um conjunto de valores ou coordenadas oriundos da análise das medidas resistivas e ópticas realizadas durante sua passagem através da câmara de fluxo 2, coordenadas essas que definem sua posição em um 20 espaço representativo predefinido. Então, a segmentação desse espaço representativo em regiões separadas que reúnem partículas de características substancialmente semelhantes possibilita identificar a população de cada uma das subcategorias, por exemplo, para medir seu tamanho relativo. A figura 9 ilustra um 25 exemplo de representação das partículas, nesse caso leucócitos, em função dos dados obtidos, respectivamente, pela análise das

28/32 medidas resistivas (Res) e das medidas de absorbância óptica (ALL). Cada ponto representa um par de medidas. A figura 9a ilustra todas as medidas, válidas e inválidas. Já a figura 9b só ilustra as medidas válidas, o que possibilita revelar grupos de 5 pontos separados correspondentes a diferentes categorias de partículas.

De acordo com uma característica vantajosa da presente invenção, o método e o dispositivo podem ser usados com facilidade para construir um instrumento de hematologia 10 particularmente simples. O dispositivo de acordo com a presente invenção pode ser montado com facilidade em um simples recipiente 60, que contém a solução que será analisada, e seu canal relacionado 61. A câmara de fluxo 2 pode ser disposta em qualquer lugar em relação ao recipiente. A referida câmara de 15 fluxo também pode ser montada em um duto contínuo e ser feita de qualquer tipo de material que seja substancialmente transparente e isolante elétrico. O transporte da solução que será analisada, por exemplo, pode ser realizado por aspiração através da câmara de fluxo 2. A figura 10 ilustra uma concretização 20 exemplificativa não-limitante que compreende apenas uma medição óptica no eixo do canal. No entanto, também é possível implementar vários fotodiodos em tomo do eixo do canal para permitir medições em vários ângulos e vários comprimentos de onda.

Para maior vantagem, essa concretização também facilita combinar uma medição de hemoglobina

29/32 convencional por espectrofotometria através do recipiente translúcido que contém a solução que será analisada.

De acordo com concretizações específicas, o dispositivo de acordo com a presente invenção pode compreender 5 vários eletrodos distribuídos em uma ou mais camadas ao longo da câmara de fluxo 2, conforme descreve o documento US 4.420.720, por exemplo. O dispositivo de acordo com a presente invenção pode incluir também eletrodos de resistividade variável ou invariável cobrindo toda ou parte da superfície interna da ío câmara de fluxo 2, conforme descreve o documento US 2001/0052763, por exemplo. No caso de um dispositivo de acordo com a presente invenção com mais de dois eletrodos, é possível usar várias medidas de impedância entre diferentes pares de eletrodos.

De acordo com concretizações específicas, é possível, sem divergir do âmbito da presente invenção, usar medidas de impedância complexas em uma ou mais frequências discretas, bem como em uma ou mais bandas de freqüência elétrica contínua.

De acordo com concretizações específicas, é possível usar, sem divergir do âmbito da presente invenção, ao menos uma medida de ao menos uma propriedade óptica como, por exemplo:

- uma medida de autofluorescência, uma medida 25 de fluorescência feita por um marcador ligado à membrana dos leucócitos ou uma medida de fluorescência feita por um marcador

30/32 ligado a um ou mais elementos do conteúdo intracelular dos leucócitos, em que uma intensidade luminosa é medida a um comprimento de onda de fluorescência em ao menos um detector 13 disposto em tomo da câmara de fluxo, detector esse, por 5 exemplo, sendo isolado da luz no comprimento de onda de estímulo 7 por meio de um filtro espectral;

- uma medida de espalhamento elástico em ao menos um ângulo, uma medida de espalhamento inelástico em ao menos um ângulo e uma medida de retroespalhamento, em que, em especial, um ou mais detectores 13 podem ser dispostos em tomo da câmara de fluxo a diferentes orientações em relação ao eixo do feixe 7 a fim de medir a luz espalhada em diferentes ângulos, o que pode proporcionar variações na frequência óptica;

- uma medida de polarização, em que os meios 15 de detecção 13 são projetados para analisar a polarização da luz que interagiu com a partícula, a fonte 8 tendo uma polarização conhecida, por exemplo linear.

De acordo com concretizações específicas, é possível, em um dispositivo de acordo com a presente invenção, 20 medir várias propriedades ópticas ao mesmo tempo, por exemplo, dispondo vários dispositivos de medição óptica, conforme ilustra a figura 1, em diferentes orientações ou de acordo com diferentes eixos em tomo da câmara de fluxo 2 ou introduzindo-se meios para dividir o feixe 10 advindo da câmara de fluxo.

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De acordo com concretizações específicas, o critério matemático usado para determinar a validade de uma trajetória pode decorrer de:

- ao menos uma comparação com um limite de 5 amplitude ou uma altura de pulso mínima,

- ao menos um cálculo de distância, no sentido matemático, entre um pulso medido e ao menos um modelo de pulso, distância essa calculada, por exemplo, por meio de uma função de correlação normalizada,

- ao menos uma análise feita ao resultado da aplicação de ao menos uma transformada, como a transformada de Fourier, aos pulsos medidos,

- ou qualquer combinação desses métodos, ou qualquer outro método matemático adequado, sem divergir do âmbito da presente invenção.

De acordo com concretizações específicas, também é possível, sem divergir do âmbito da presente invenção, definir um ou mais modelos de pulsos ópticos para comparar os pulsos ópticos medidos com os referidos um ou mais modelos e 20 incluir essa comparação no algoritmo de classificação. Ademais, é possível definir um ou mais modelos de pares de pulsos ópticos e resistivos e realizar operações de comparação e classificação com base neles. Isso possibilita corrigir outros casos de erros na medição devido, por exemplo, a partículas que não pertencem às 25 categorias esperadas ou ao fato de que várias partículas são medidas ao mesmo tempo.

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De acordo com concretizações específicas, o método e o dispositivo relacionado podem ser adotados por um dispositivo feito com base em tecnologias relacionadas ao campo dos microssistemas (MEMS), ou microssistemas ópticos 5 (MOEMS), por exemplo, a fim de integrar todas as funções, fluídica, elétrica e óptica, em um único componente.

De acordo com outras concretizações específicas, o método e o dispositivo relacionado podem ser usados para medir partículas diferentes de células biológicas, por 10 exemplo, partículas cerâmicas, no contexto da fabricação de pó industrial, ou pigmentos, no contexto da fabricação de tintas.

É evidente que a presente invenção não se limita aos exemplos que acabamos de descrever e que é possível fazer diversos ajustes neles sem, com isso, divergir do âmbito da 15 presente invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. - Método de citometria de fluxo sem fluidos envolventes para a caracterização de partículas compreendendo as etapas de:

- transportar de um fluido (3) que contém partículas (4) através de uma câmara de fluxo de abertura (2) livre de fluidos, de modo que apenas o fluido (3) contendo as partículas (4) atravesse a referida câmara de fluxo de abertura (2), sendo que a referida câmara de fluxo de abertura é transparente para ao menos um comprimento de onda de interesse e isolante à eletricidade,

- medir a variação de impedância elétrica gerada pela passagem das referidas partículas (4) presentes no fluido (3) através da câmara de fluxo (2),

- medir ao menos uma propriedade óptica das referidas partículas (4), que interagem com ao menos um feixe de luz (7) que atravessa a câmara de fluxo,

- caracterizar as referidas partículas (4) usando as referidas medidas de variação da impedância elétrica e propriedades ópticas, o método sendo caracterizado por compreender ainda as etapas de:

- deduzir informações sobre a trajetória das partículas (4) dentro da câmara de fluxo (2) analisando-se ao menos a referida medida de variação de impedância elétrica,

- usar as referidas informações sobre a trajetória ao menos para aproveitar as referidas medidas de propriedade óptica durante a caracterização das partículas.
2. - Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que apenas o fluido (3) que contém partículas (4) atravessa a câmara de fluxo (2).

Petição 870190027789, de 22/03/2019, pág. 8/13

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3. - Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de a medição da variação de impedância elétrica compreende uma medição de resistividade realizada com corrente contínua e/ou ao menos uma medição de impedância complexa realizada em ao menos uma frequência diferente de zero.
4. - Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a ao menos uma propriedade óptica medida é uma das propriedades ópticas a seguir: absorvência, espalhamento elástico em ao menos um ângulo, espalhamento inelástico em ao menos um ângulo, retroespalhamento elástico, retroespalhamento inelástico, autofluorescência, fluorescência em ao menos um comprimento de conta causada por ao menos um marcador ligado às partículas, fluorescência em ao menos um comprimento de onda causada por ao menos um marcador ligado a ao menos um elemento presente nas partículas e polarização de luz.
5. - Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a caracterização das partículas compreende a classificação das partículas (4).
6. - Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a caracterização das partículas compreende a contagem das partículas (4).
7. - Método, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de a análise da variação de impedância elétrica inclui a comparação entre a variação de impedância elétrica medida e ao menos um elemento de comparação dentre ao menos um modelo de variação de impedância elétrica e ao menos um valor numérico predefinido, o resultado da referida comparação determinando se a trajetória das partículas (4) incluiu uma área predefinida da câmara de fluxo (2).
8. - Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que os dados referentes às partículas (4) cuja

Petição 870190027789, de 22/03/2019, pág. 9/13

3/6 trajetória não incluiu a área predefinida da câmara de fluxo (2) são excluídos dos dados usados para a classificação das referidas partículas (4).
9. - Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que:

- a propriedade óptica medida das partículas (4) é comparada a ao menos um elemento de comparação dentre ao menos um modelo de propriedade óptica e ao menos um valor numérico predefinido,

- se os resultados das comparações da variação de impedância elétrica e da propriedade óptica com seus respectivos modelos ou valores numéricos predefinidos não satisfizerem ao menos um critério predefinido, os dados referentes às partículas (4) são excluídos dos dados usados para a classificação das referidas partículas (4).
10. - Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 9, caracterizado pelo fato de que a operação de classificação das partículas (4) compreende as etapas de:

- atribuir às partículas um conjunto de valores ou coordenadas obtido pela análise das medidas realizadas durante sua passagem pela câmara de fluxo (2), coordenadas essas que definem a posição das partículas em um espaço representativo predefinido,

- segmentar o referido espaço representativo em regiões distintas, regiões essas que reúnem partículas de características semelhantes.
11. - Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as partículas (4) consistem em células sanguíneas.
12. - Dispositivo de citometria de fluxo sem fluidos envolventes de acordo com o método definidos nas reivind para a caracterização de partículas compreendendo:

- uma câmara de fluxo de abertura (2) transparente a ao menos um comprimento de onda de interesse e isolante à eletricidade,

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- meios para transportar um fluido (3) que contém partículas (4) através da referida câmara de fluxo (2) livre de fluido envolvente, de modo que o fluido (3) contendo as partículas (4) é passado através da referida câmara (2),

- meios para medir a variação de impedância elétrica gerada pela passagem das referidas partículas (4) presentes no fluido (3) através da câmara de fluxo (2),

- meios para medir ao menos uma propriedade óptica das referidas partículas (4), que interagem com ao menos um feixe de luz (7) que atravessa a câmara de fluxo,

- meios para analisar as referidas medidas de variação de impedância elétrica e propriedades ópticas, o dispositivo sendo caracterizado por compreender:

- meios para deduzir informações sobre a trajetória das partículas dentro da câmara de fluxo (2) analisando-se ao menos a referida medida de variação de impedância elétrica e

- meios para usar as referidas informações sobre a trajetória ao menos para aproveitar as referidas medidas de propriedades ópticas durante a caracterização das partículas.
13. - Dispositivo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a geometria da câmara de fluxo (2) é adaptada de modo que a variação de impedância elétrica medida durante a passagem das referidas partículas (4) dependa de sua trajetória dentro da referida câmara de fluxo (2).
14. - Dispositivo, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que a câmara de fluxo (2) compreende uma seção transversal interna de um dos formatos a seguir: circular ou retangular.
15. - Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 12 a 14, caracterizado pelo fato de que a câmara de fluxo (2) é feita de ao menos um dos materiais a seguir: safira, rubi, vidro ou plástico.

Petição 870190027789, de 22/03/2019, pág. 11/13

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16. - Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 12 a 15, caracterizado pelo fato de que os meios para medir a variação de impedância elétrica gerada pela passagem das partículas (4) compreendem ao menos dois eletrodos (5) dispostos, respectivamente, de cada lado do canal (1) da câmara de fluxo (2), eletrodos esses que fazem contato elétrico com o fluido (3) que contém as partículas (4).
17. - Dispositivo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que os meios para medir a variação de impedância elétrica gerada pela passagem das partículas (4) compreendem ao menos um eletrodo disposto no canal (1) da câmara de fluxo (2), eletrodo esse que faz contato elétrico com o fluido (3) que contém as partículas (4).
18. - Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 12 a 17, caracterizado pelo fato de que os meios para medir a propriedade óptica das partículas compreendem:

- ao menos uma fonte luminosa (8) e

- ao menos um meio de detecção optoeletrônico (13).
19. - Dispositivo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que os meios para medir a propriedade óptica das partículas compreendem um meio óptico (9) para focalizar a luz (7) emitida pela fonte luminosa (8) na câmara de fluxo (2).
20. - Dispositivo, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que os meios para medir a propriedade óptica das partículas compreendem um meio óptico (11) para coletar a luz (10) advinda da câmara de fluxo (2).
21. - Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 18 a 20, caracterizado pelo fato de que os meios para medir a propriedade óptica das partículas constituem parte integrante da câmara de fluxo (2).
22. - Instrumento de análise sanguínea caracterizado por compreender ao menos um dispositivo de acordo com qualquer uma das

Petição 870190027789, de 22/03/2019, pág. 12/13

6/6 reivindicações de 12 a 21, as partículas (4) que serão analisadas consistindo em células sanguíneas, em especial leucócitos.