MX2011003142A

MX2011003142A - Anticuerpo anti-vasa de atun.

Info

Publication number: MX2011003142A
Application number: MX2011003142A
Authority: MX
Inventors: Goro Yoshizaki; Yutaka Takeuchi; Naoki Kabeya; Misako Miwa
Original assignee: Univ Tokyo Nat Univ Corp
Priority date: 2008-09-25
Filing date: 2009-09-25
Publication date: 2011-05-19
Also published as: US20110244485A1; EP2336311A4; EP2336311A1; KR20110055687A; WO2010035465A1; AU2009297872A1; JPWO2010035465A1

Abstract

Un objetivo de la presente invención es proveer un medio para distinguir entre una célula germinativa derivada de un donante (atún) y una célula germinativa derivada de un recipiente en un método para inducir la diferenciación de una célula germinativa del atún, en donde una célula germinativa primordial derivada del atún es trasplantada en un embrión nuevo del pez recipiente heterólogo; los presentes inventores compararon una secuencia de aminoácidos de Vasa del atún aleta azul con esos de otros peces (bonito negro, bonito oceánico, caballa, macarela azul, caballa redonda, y macarela), identificaron las regiones de la secuencia de aminoácidos específicas para el atún aleta azul, y, al usar las secuencias de aminoácidos específicas para el atún aleta azul como antígenos, produjeron exitosamente anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente las células germinativas primordiales, espermatogonios, oogonios u oocitos derivados del atún aleta azul, logrando así la presente invención.

Description

ANTICUERPO ANTI-VASA DE ATÚN CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-Vasa de atún que es capaz de detectar específicamente una célula germinativa derivada de un atún, y a un método para detectar una célula germinativa de un atún usando un anticuerpo-anti Vasa de atún. Al usar este método para detectar una célula germinativa de un atún, puede evaluarse una célula germinativa derivada de un atún, trasplantada en un pez recipiente heterólogo en cuanto a su incorporación dentro de la glándula genital, proliferación y/o maduración.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El análisis genético usando Drosophila ha revelado que los genes Oskar, Vasa, y Nanos tienen funciones de núcleo en el mecanismo de determinación de las células germinativas (véase por ejemplo, el Documento no de Patente 1 ). Durante la formación del óvulo, cada uno de estos genes se acumula en gránulos polares, y se determina el destino de las células germinativas de la blastómera que hospeda los factores de determinación materna. Los genes Vasa codifican una ARN helicasa dependiente de ATP, cuya función se cree está implicada en el control traduccional del ARNm a la proteína (véase, por ejemplo, el Documento no de Patente 2). Más aún, la estructura responsable de la función enzimática se conserva fuertemente en la evolución, y por lo tanto los genes homólogos Vasa han sido identificados en una variedad de especies animales multicelulares que varían de platelmintos (planadas) hasta humanos.

Con base en los hallazgos mencionados anteriormente, se reporta un método para obtener una célula germinativa como un método simple para seleccionar una célula que tiene la capacidad de diferenciarse como una célula germinativa, usando una expresión del gen marcador como indicador, sin realizar operaciones complicadas tales como la recombinación homóloga. En el método, un gen marcador es incorporado dentro de un vector de expresión recombinante de manera que se coloca bajo el control de una secuencia promotora de un gen homólogo Vasa derivado de mamíferos, y usando la expresión del gen marcador como indicador, se recupera una célula que tiene la capacidad de diferenciarse como una célula germinativa del mamífero no humano transgénico transfectado con el vector (véase, por ejemplo, el Documento de Patente 1).

Por otro lado, ya que las células germinativas primordiales son las células de origen de los ovarios y los espermatozoides, y se desarrollan en los individuos vía los procesos de maduración y fertilización, también se conoce un método para inducir la diferenciación de una célula germinativa primordial aislada de un pez dentro de un linaje de célula germinativa al trasplantar la célula germinativa primordial aislada dentro de un embrión nuevo de un pez recipiente heterólogo, particularmente al interior del mesentérico en la cavidad abdominal del pez recipiente heterólogo en una fase de desarrollo temprano (véase, por ejemplo, el Documento de Patente 2).

Lista de Referencias Documentos de Patente Documento de Patente 1 Patente Japonesa Abierta al público No. 2006-333762 Documento de Patente 2 Patente Japonesa Abierta al público No. 2003-235558 Documentos No de Patente Documento No de Patente 1 Rongo, C. et al., Development, 121 , 2737-2746, 1995.

Documento No de Patente 2 Liang, L. et al., Development, 120, 1201-1211 , 1994.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Problema a Ser Resuelto por la Invención Actualmente, el atún es cultivado principalmente en la manera en donde el pez inmaduro silvestre (típicamente, numerosas decenas a numerosos cientos de gramos) son capturados por pescadores y cultivados hasta tamaños grandes. En años recientes, las cantidades de fuentes de atún han disminuido y las capturas permitidas totales de peces adultos tienen numerosas condiciones. De manera que al depender de las fuentes naturales para el suministro de peces inmaduros, no puede asegurarse el suministro estable futuro de simiente. Además, se espera que se vuelva posible el suministro de simiente en cantidades estables con mejores eficiencias de cultivo al establecer una técnica para la producción de simiente artificial, tal como esa para el salmón y el pargo, que producirán la crianza al intercambiar generaciones con padres seleccionados que tienen rasgos excelentes. No obstante, se piensa que el atún excede numerosas decenas de kilogramos cuando alcanza la primera maduración, aunque la fisiología de la maduración del atún aún no es suficientemente clara. Ya que el atún se vuelve un pez grande, a diferencia de otras especies de peces, la producción de simiente se realiza en la manera en donde huevos fertilizados desovados naturalmente en depósitos o divisiones en un golfo son capturados con una red de malla fina. Para el pargo o similares, ya que éstos desovan en un acuario, puede fabricarse fácilmente un aparato para que fluya sobre la superficie del agua de mar y capture sus huevos con una red, aunque las operaciones en el mar son laboriosas.

Más aún, cuando se desea la crianza cruzada de individuos específicos para el propósito de crianza o similar, se realiza la extracción artificial del desove, en el cual se recolectan los huevos al apretar el abdomen, y también se recolectan los espermatozoides para realizar la fertilización artificial, esto no es fácil cuando los padres tienen grandes tamaños como el atún. Además, desde el punto de vista industrial, la rentabilidad puede aumentar al cambiar la programación de producción de simiente para el propósito de ajustar la programación del embarque, la duración del crecimiento del pez. Para este propósito, se requiere el control de la programación del desove al cambiar la estación a los padres al ajustar las temperaturas del agua y/o los ciclos de iluminación en el lugar en donde puede controlarse el medio ambiente; esto es laborioso y costoso si los padres tienen grandes tamaños como el atún.

La técnica de peces sustitutos pretende producir simiente fácilmente a bajo costo al hacer que una especie de pez fácil para la producción de simiente produzca gametos, o huevos desovados y esperma de una especie de que es difícil para dicha producción de simiente. Por ejemplo, aplicando la técnica de peces sustitutos de acuerdo con el Documento de Patente 2 mencionado anteriormente para el atún, usando un pez pequeño como un recipiente para madurar las células germinativas derivadas de un atún, lo que permitirá la producción de simiente y cultivos completos en un acuario pequeño, y esto se espera que conduzca a un ahorro en trabajo extensivo y a un ahorro en costos. El trasplante de células germinativas primordiales aisladas requiere detectar la proliferación de células germinativas primordiales del donante derivadas del atún incorporadas dentro de la gónada del recipiente, y la proporción de células germinativas derivadas del recipiente y las células germinativas derivadas del atún. Un objetivo de la presente invención es proveer un anticuerpo monoclonal capaz de detectar específicamente una célula germinativa del atún, y un método para detectar una célula germinativa derivada de un atún mediante el uso del mismo, en un método para inducir la diferenciación de una célula germinativa primordial dentro del linaje de la célula germinativa, en donde una célula germinativa primordial derivada de un atún es trasplantada dentro de un embrión nuevo del pez recipiente heterólogo, el anticuerpo es capaz de detectar específicamente una célula germinativa primordial, un espermatogonio, un oogonio o un oocito derivado del atún, que es el pez donante, sin unirse a una célula germinativa derivada del recipiente,, y permite distinguir entre la célula germinativa derivada del atún y la célula germinativa derivada del recipiente.

Medios para resolver el problema En los peces Salmonidae, los presentes inventores han tenido éxito en producir individuos de la trucha arco iris a partir del salmón japonés al realizar un trasplante de célula germinativa xenogénica. En este caso, ha sido posible analizar fácilmente la determinación en cuanto a si el trasplante fue exitoso o no mediante el uso de un linaje transgénico en el cual fueron visualizadas las células germinativas de la trucha arco iris con una proteína fluorescente verde. Además, los presentes inventores ya han desarrollado un método para determinar si un trasplante es exitoso o no sin usar un linaje transgénico para aplicar un trasplante de célula germinativa xenogénico a especies de peces silvestres en peligro y especies de peces cultivados. Mediante este método, las células germinativas de la trucha arco iris insertadas en la glándula genital de un huésped asistente han sido detectados exitosamente. Los presentes inventores buscan aplicaciones adicionales del trasplante de células germinativas xenogénicas a otros peces marinos. Para efectuar esto, ha sido necesaria una técnica para analizar si las células germinativas trasplantadas de un pez Percomorphi donante tal como el atún se incorporan en la glándula genital del huésped y si están injertadas o no.

Por lo tanto, los presentes inventores seleccionaron al gen Vasa de los genes conocidos que se expresan específicamente en las células germinativas primordiales, tales como los genes Nanos, Deadend, y Vasa, y determinaron las secuencias de nucleótidos de los genes Vasa del atún, caballa, macarela azul, bonito negro y corvina por primera vez. Entre estos genes, los presentes inventores se enfocaron además en el gen Vasa del atún, que es el más probable de volverse un pez donante Percomorphi, confirmaron que el gen Vasa del atún se expresa específicamente en las células germinativas primordiales del atún y en los espermatogonios/oogonios, identificaron las regiones que son únicas en el gen Vasa del atún para evitar una falsa detección del gen Vasa de la corvina altamente homologa al gen Vasa del atún, entonces encontraron que puede usarse como un marcador de identificación para un espermatogonio/oogonio derivado de las células germinativas del atún. Más aún, para analizar las células germinativas del atún trasplantadas en la glándula genital del huésped, es necesario establecer un método para distinguir entre los genes Vasa del atún y del huésped y detectar exclusivamente el gen del atún. No obstante, los genes Vasa del pez son altamente homólogos en la secuencia de nucleótidos, y fue muy difícil diseñar un juego de cebador de PCR que detecte específicamente la expresión del gen Vasa del atún. Por lo tanto, los inventores de la presente solicitud realizaron PCR jerarquizada, la cual puede amplificar el ADN con alta especificidad comenzando inclusive con una cantidad muy pequeña de ADN, y detectaron específicamente el gen Vasa del atún. Adicionalmente, los presentes inventores compararon la secuencia del gen Vasa del atún con otras secuencias del gen Vasa de Percomorphi, e identificaron una secuencia de enzima de restricción que está contenida únicamente en el gen Vasa del atún. La combinación de este PCR jerarquizado y tratamiento con la enzima de restricción estableció un método para detectar el gen Vasa del atún con una confiabilidad aumentada. En ese momento, los presentes inventores produjeron muchos fragmentos peptídicos candidatos que son específicos para la proteína Vasa del atún usando información de la secuencia de aminoácidos de la proteína Vasa del atún, y generaron muchos anticuerpos monoclonales usando dichos fragmentos peptídicos candidatos como inmunogenes, encontraron anticuerpos monoclonales que se unieron específicamente a las células germinativas derivadas exclusivamente del atún, logrando así la presente invención.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a: (1 ) un anticuerpo anti-Vasa de atún o un fragmento del mismo, en donde el anticuerpo se produce al usar un antígeno que comprende uno o más fragmentos peptídicos seleccionados del grupo de fragmentos peptídicos que consiste en las secuencias de aminoácidos mostradas en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 9 en el listado de secuencias, el anticuerpo se une específicamente a un producto de gen Vasa del atún, pero no se une a un producto del gen Vasa de otras especies de peces, (2) un anticuerpo anti-Vasa de atún o un fragmento del mismo, en donde el anticuerpo se produce al usar un antígeno que comprende uno o más fragmentos peptídicos seleccionados del grupo de fragmentos peptídicos que consisten de una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 9 en el listado de secuencias, el anticuerpo específicamente reconoce una célula germinativa derivada de un atún, pero no reconoce una célula somática derivada de un atún y una célula derivada de otras especies de peces, (3) el anticuerpo anti-Vasa de atún o un fragmento del mismo de acuerdo con (1) o (2) mencionados anteriormente, en donde el anticuerpo se produce al usar un antígeno que comprende un fragmento de péptido que consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 en el listado de secuencias, (4) el anticuerpo anti-Vasa de atún o un fragmento del mismo de acuerdo con (2) o (3) mencionados anteriormente, en donde la célula germinativa derivada de un atún es una célula germinativa primordial, un espermatogonio, un oogonio o un oocito, (5) el anticuerpo anti-Vasa de atún o un fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de (1) a (4) mencionados anteriormente, en donde el atún es un atún de aleta azul, y (6) el anticuerpo anti-Vasa de atún o un fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de (1) a (5) mencionados anteriormente, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

También, la presente invención se refiere a: (7) un hibridoma que tiene la capacidad de producir el anticuerpo monoclonal de acuerdo con (6) mencionado anteriormente, (8) el hibridoma de acuerdo con (7) mencionado anteriormente, en donde el hibridoma es vasa-C57Z 6H-7E (NITE BP-647) o vasa-C57Z 8A-11A (NITE BP-646), (9) un kit para detectar una célula germinativa derivada de un atún, en donde el kit comprende un anticuerpo anti-Vasa de atún marcado o un fragmento de anticuerpo anti-Vasa de atún marcado que resulta del marcado del anticuerpo anti-Vasa de atún o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de (1) a (6) mencionados anteriormente, (10) un método para detectar una célula germinativa derivada de un atún, en donde la célula germinativa es trasplantada en un pez recipiente heterólogo, el método comprende poner en contacto el anticuerpo anti-Vasa de atún o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de (1) a (6) mencionados anteriormente, con una célula muestra, y detectar una proteína Vasa del atún expresada en la célula.

Efectos Ventajosos de la Invención Para examinar si las células germinativas derivadas del pez donante trasplantadas por la técnica de pez sustituto proliferan y maduran en la gónada del pez recipiente heterólogo, es necesario usar, como un indicador, un rasgo que se expresa específicamente en las células germinativas y que se distingue entre el pez recipiente y el pez donante. Un gen específico de la célula germinativa, el gen Vasa, es específico para las células germinativas primordiales, espermatogonios, oogonios y/o oocitos, y su expresión no se encuentra en las células somáticas. De acuerdo con la presente invención, una célula germinativa derivada de un atún puede ser distinguida confiable y simplemente entre las secuencias del gen Vasa altamente conservadas en peces, al usar un anticuerpo monoclonal anti-Vasa de atún capaz de detectar específicamente las células germinativas del atún, sin realizar un análisis de secuencias, y, como resultado, puede realizarse de manera eficiente el cultivo y la crianza del atún.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra el resultado de una comparación de secuencias de aminoácidos de Vasa del atún aleta azul y otros peces (bonito negro, bonito oceánico, caballa, macarela azul, caballa redonda y macarela). En la figura, la línea negra indica nueve porciones de la secuencia de aminoácidos con bajas homologías en la comparación entre el atún aleta azul y los otros peces.

La Figura 2 muestra el resultado de un análisis de transferencia Western que confirmó la expresión de las proteínas que contenían cuatro secuencias de péptidos expresados en el sobrenadante de una muestra bacteriana lisada.

La Figura 3 muestra el SDS-PAGE de las fracciones eludidas de la proteína purificada de la proteína expresada.

La Figura 4 muestra la confirmación de las concentraciones de la proteína expresada después de la concentración.

Las Figuras 5A-5C muestran el resultado de la selección primaria después del procedimiento de fusión celular. El No. 6 (vasa-C57Z 6H-7E) y No. 8 (vasa C57Z 8A-1 1A) mostraron fuertes respuestas a BFvasa14 (figura 5A) y cuatro péptidos entrelazados a BSA mezclados (figura 5B), pero no mostraron reacción al antígeno de la proteína recombinante de la caballa (figura 5C).

La Figura 6 muestra resultado de la selección en el hibridoma vasa-C57Z 6H-7E y el hibridoma vasa-C57Z 8A-1 1A mediante ELISA usando cada uno de los péptidos entrelazados a BSA como un antígeno uno por uno. Ellos mostraron respuestas al péptido de la SEQ ID NO. 1.

Las Figuras 7A-7D muestran el resultado de la tinción inmunohistológica de las células germinativas derivadas del atún aleta azul y la macarela. El ovario (figura 7A) y los testículos (figura 7B) del atún aleta azul se tiñeron de color café con DAB, mostrando la unión a un anticuerpo monoclonal de la presente invención, mientras que el ovario (figura 7C) y los testículos (figura 7D) de la macarela no se tiñeron, no mostrando unión al anticuerpo monoclonal de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Un anticuerpo anti-Vasa de atún de la presente invención no está particularmente limitado, en tanto que sea un anticuerpo producido al usar un antígeno, que comprende uno o más fragmentos peptídicos seleccionados del grupo de fragmentos peptídicos que consiste de las secuencias de aminoácidos mostradas en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 9 en el listado de secuencias (en los siguiente, también referido como un fragmento peptidico de Vasa de atún), en donde el anticuerpo se une específicamente a un producto del gen Vasa del atún, pero no se une a un producto del gen Vasa de otras especies de peces, o en donde el anticuerpo reconoce específicamente una célula germinativa derivada de un atún, pero no reconoce una célula somática derivada de un atún y una célula derivada de otras especies de peces. "Atún", en cuanto a la presente invención, es un nombre genérico para el pez Percomorphi Scombroidei Scombridae Thunnus, que incluye específicamente el atún aleta azul, atún ojo grande, atún aleta azul del Sur, atún aleta amarilla, atún blanco, atún de aleta negra, atún de cola larga, y más preferiblemente el atún de aleta azul. La descripción anterior "reconoce específicamente una célula germinativa derivada de un atún, pero no reconoce una célula somática derivada de un atún y una célula derivada de otras especies de peces", en cuanto a la presente invención, significa que se une específicamente a un producto del gen Vasa expresado en las células germinativas del atún, por ejemplo las células germinativas primordiales, espermatogonios, oogonios, y/o oocitos, pero no se une específicamente a la sustancia presente en las células somáticas del atún, o las células germinativas, por ejemplo, las células germinativas primordiales, espermatogonios, oogonios, y/o oocitos de otros peces que no sean atún.

Ejemplos anticuerpos de la presente invención incluyen, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos de cadena simple, anticuerpos bifuncionales, que pueden reconocer dos epítopes al mismo tiempo, etc., pero se prefieren particularmente los anticuerpos monoclonales debido a su especificidad para los sitios de reconocimiento. Las clases de inmunoglobulinas de los anticuerpos no están particularmente limitadas, y pueden ser cualquiera de los isotipos IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, etc., pero se prefiere el IgG. Más aún, los anticuerpos de la presente invención pueden ser un anticuerpo completo o un fragmento de anticuerpo, en tanto que pueda reconocer específicamente un producto del gen Vasa del atún. Ejemplos específicos del fragmento de anticuerpo incluyen, los fragmentos de anticuerpos tales como los fragmentos Fab y F(ab')2, CDR, anticuerpos multifuncionales, anticuerpos de cadena simple (ScFv), etc. Por ejemplo, los fragmentos Fab pueden prepararse al tratar anticuerpos con papaína, y los fragmentos F(ab')2 con pepsina. Más aún, los anticuerpos de la presente invención no están particularmente limitados por su origen, sino que pueden ser de origen de ratón, de rata, de conejo o de pollo, pero se prefieren los anticuerpos monoclonales de origen de ratón debido a la facilidad de su producción.

Los antígenos usados para la producción de anticuerpos anti-Vasa de atún, particularmente anticuerpos monoclonales anti-Vasa de atún de la presente invención no se limitan particularmente en tanto que comprendan uno o más fragmentos peptídicos seleccionados del grupo de fragmentos peptídicos que consisten de las secuencias de aminoácidos mostradas en TSTITLTSRTSS (SEQ ID NO: 1), FWNTNGGEFG (SEQ ID NO: 2), CRMDQSEFNG (SEQ ID NO: 3), DNGMRENGYRG (SEQ ID NO: 4), GFSQGGDQGGRGGF (SEQ ID NO: 5), TRGEDKDPEKKDDSD (SEQ ID NO: 6), ADGQLARSLV (SEQ ID NO: 7), PATTGFNPPRKN (SEQ ID NO: 8) o RGSFQDNSVKSQPAVQTAADDD (SEQ ID NO: 9) en las secuencias de aminoácidos de una proteína Vasa del atún (SEQ ID NO: 10). Entre estos, se prefieren esos que comprenden el fragmento peptídico que consiste de la secuencia de aminoácidos de TSTITLTSRTSS (SEQ ID NO: 1). Más aún, los fragmentos peptídicos mencionados anteriormente pueden consistir de una secuencia de aminoácidos en la cual han sido eliminados, sustituidos o añadidos uno o más aminoácidos, en una secuencia de aminoácidos mostradas en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 9. Además, para aumentar la antigenicidad, puede unirse una proteína portadora tal como KLH (Hemocianina Keyhole-Limpet), BSA (Albúmina de Suero Bovino), OVA (Ovalbúmina). Por ejemplo, al introducir cisteína al extremo N- o C- de un fragmento peptídico que consiste de una secuencia de aminoácidos mostradas en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 9, activándola por maleímida vía el grupo SH en la cisteína, y acoplando una proteína portadora a ella, puede producirse un péptido entrelazado y usarse para la sensibilización inmunológica. Más aún, para criar anticuerpos de manera eficiente contra los fragmentos peptídicos mencionados anteriormente, un adyuvante, tal como el adyuvante completo de Freund (FCA) y el adyuvante incompleto de Freund (FIA) puede usarse con la sensibilización inmunológica, según se requiera. Ejemplos de los métodos de producción de los fragmentos peptídicos mencionados anteriormente incluyen métodos de síntesis química tales como el método Fmoc (método Fluorenilmetil oxicarbonilo), el método tBoc (método t-butiloxi carbonilo), los métodos de síntesis basados en la información de la secuencia de aminoácidos usando diversos sintetizadores de péptidos disponibles en el comercio, métodos de producción al expresar una parte o todo el gen Vasa del atún usando fagos o células tales como E. coli, actinomices, lactobacílos, levaduras, células cultivadas.

Ejemplos de los métodos de preparación de un anticuerpo anti-Vasa de atún de la presente invención incluyen los métodos de administración de los fragmentos peptídicos mencionados anteriormente como antígenos a un animal (preferiblemente diferente de humano), por ejemplo, usando un protocolo convencional, y los ejemplos específicos incluyen los métodos de administración de los fragmentos peptídicos mencionados anteriormente como antígenos a un mamífero tal como una rata, un ratón, un conejo, etc., para inmunizarlo. Típicamente, los antígenos pueden ser administrados intravenosamente, subcutáneamente o intraperitonealmente. Los intervalos de inmunización no están particularmente limitados, pero preferiblemente es de varios días a varias semanas, más preferiblemente de 1 a 4 semanas. El número de inmunizaciones es preferiblemente 1 a 10 veces, y más preferiblemente 1 a 5 veces. Las células productoras de anticuerpos se recolectan 1 a 60 días, preferiblemente 1 a 14 días después del día de la última inmunización. Las células productoras de anticuerpos son preferiblemente células derivadas de las células esplénicas, células del nodo linfático, o células sanguíneas periféricas, y más preferiblemente células esplénicas o células del nodo linfático local.

Para preparar un anticuerpo monoclonal anti-Vasa de atún de la presente invención, puede usarse cualquier método, incluyendo el método del hibridoma (Nature 256, 495-497, 1975), el método del trioma, método del hibridoma de linfocitos B humanos (Inmunology today 4, 72, 1983) y el método de hirbidoma EBV (MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp, 77-96, Alan, R. Liss, Inc., 1985), en los cuales el anticuerpo se produce en un cultivo de una línea celular continua. La producción del hibridoma productor de anticuerpos monoclonales usando el método del hirbidoma mencionado anteriormente puede realizarse por fusión de las células productoras de anticuerpos mencionadas anteriormente y células de mieloma. Como las células de mieloma mencionadas anteriormente, pueden usarse líneas celulares disponibles normalmente tales como células derivadas de ratón o de rata. Las células productoras de anticuerpos y las células de mieloma mencionadas anteriormente son preferiblemente de la misma especie animal, y preferiblemente tienen las propiedades de no poder sobrevivir en el medio de selección HAT (que contiene hipoxantina, aminopterina, y timidina) cuando no están fusionadas, y de poder sobrevivir como hibridoma positivo únicamente cuando están fusionadas con las células productoras de anticuerpos. Ejemplos específicos incluyen líneas celulares de mieloma de ratón tales como P3-X63-Ag8-U, NSI/1-Ag4-1, NSO/1 , y líneas celulares de mieloma de ratón tales como YB2/0.

Los hibridomas de la presente invención no están particularmente limitados, en tanto que tengan la capacidad de producir un anticuerpo monoclonal anti-Vasa de atún de la presente invención, pero los ejemplos específicos incluyen vasa-C57Z 6H-7E y vasa-C57Z 8A- A descrito en los ejemplos siguientes. Los hibridomas vasa-C57Z 6H-7E y vasa-C57Z 8A-11 A mencionados anteriormente fueron depositados respectivamente en el "Patent Microorganisms Depositan/, National Institute of Technology and Evaluation (Depósito de Microorganismos de Patente, Instituto Nacional de Tecnología y Evaluación), 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba, Japón, bajo el número de acceso de NITE BP-647 y NITE BP-646 el 24 de Septiembre de 2008.

Un kit para detectar una célula germinativa derivada de un atún de la presente invención no está particularmente limitado, en tanto que comprenda un anticuerpo marcado o fragmento de anticuerpo marcado, en el cual se marca un anticuerpo anti-Vasa del atún de la invención o fragmento del mismo, o comprende un anticuerpo marcado (anticuerpo secundario marcado) o sustancia marcada que reconoce el anticuerpo anti-Vasa de atún de la presente invención. Una sustancia marcadora usada para generar un anticuerpo marcado o fragmento de anticuerpo marcado mencionado anteriormente no está particularmente limitado, en tanto que sea capaz de producir una señal que permite la detección de una célula germinativa derivada de un atún por sí mismo o reaccionar con otra sustancia. Ejemplos incluyen enzimas tales como peroxidasa, fosfatasa alcalina, ß-D-galactosidasa, glucosa oxidasa, catalasa o ureasa; sustancias presentes tales como isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina o isotiocianato de tetrametil rodamina; sustancias luminiscentes tales como luminol, dioxetano, sales de acridinio; sustancias radioactivas tales como 3H, 4C, 125l o 131l. Cuando la sustancia marcadora es una enzima, se prefiere incluir un sustrato según sea necesario, y un agente colorante, un agente fluorescente, un agente luminiscente, etc., en caso de ser necesario, para medir la actividad. Mediante el uso de un kit de detección que comprende un anticuerpo marcado de la presente invención, puede detectarse la presencia de una célula germinativa derivada de un atún, y puede investigarse la localización y densidad in vivo.

Un método para detectar una célula germinativa derivada de un atún trasplantada en un pez recipiente heterólogo de la presente invención no está particularmente limitado, en tanto que sea un método para detectar una célula germinativa derivada de un atún trasplantado en un pez recipiente heterólogo, en donde el método comprende poner en contacto el anticuerpo anti-Vasa del atún o un fragmento del mismo de la presente invención con una muestra, y detectar el anticuerpo unido a la proteína Vasa del atún expresada en células en la muestra. El método es también útil como un método para evaluar la proliferación y/o maduración de la célula germinativa derivada de un atún en el pez recipiente heterólogo. En un método de detección de la presente invención, un método para detectar el anticuerpo unido a una proteína Vasa del atún puede ser, por ejemplo, un ensayo inmunológico, tal como ELISA, RIA, transferencia Western, inmunoprecipitación, tinción inmunohistológica, técnica de placa, formación de manchas, prueba de hemoaglutinación, o método de Ouchterlony. Al usar un método de detección de la presente invención, por ejemplo, el trasplante de células germinativas primordiales aisladas de un atún en un embrión nuevo de un pez recipiente heterólogo, tal como una corvina, macarela, bonito negro, pargo, cuya producción de simiente es más simple y eficiente que la del atún, puede realizarse preferiblemente el trasplante en la cavidad abdominal de un pez recipiente heterólogo en una fase temprana del desarrollo, y de esta manera puede inducirse la diferenciación de las células germinativas primordiales antes mencionadas dentro del linaje de la célula germinativa. Como resultado, las células germinativas primordiales derivadas de un atún se inducen para ser diferenciadas en esperamtogonios, oogonios u oocitos en los individuos de peces recipientes heterólogos, y además para diferenciar los ovarios de los espermas, lo que permite la reproducción y crianza del atún.

La presente invención se describe más específicamente con los ejemplos siguientes. Estos ejemplos no pretenden limitar el alcance técnico de la presente invención.

EJEMPLO 1 Producción de anticuerpos monoclonales Preparación del antiqeno 1 ; preparación de los péptidos entrelazados a KLH Se realizó una comparación de la secuencia de aminoácidos de Vasa del atún de aleta azul (SEQ ID NO: 10) y esos de otros peces (bonito negro, bonito oceánico, caballa, macarela azul, caballa redonda y macarela) (Figura 1). Como resultado, se identificaron 9 regiones de secuencia de aminoácidos, TSTITLTSRTSS (SEQ ID NO: 1), FWNTNGGEFG (SEQ ID NO:2), CRMDQSEFNG (SEQ ID NO: 3), DNGMRENGYRG (SEQ ID NO: 4), GFSQGGDQGGRGGF (SEQ ID NO: 5), TRGEDKDPEKKDDSD (SEQ ID NO: 6), ADGQLARSLV (SEQ ID NO: 7), PATTGFNPPRKN (SEQ ID NO: 8) o RGSFQDNSVKSQPAVQTAADDD (SEQ ID NO: 9) como las regiones que son particularmente diferentes en secuencia entre el atún aleta azul y otros peces. Luego, el péptido de la SEQ ID NO: 3 y los péptidos de la SEQ ID NO: 1 , 2 y 4 con una cisteína añadida necesaria para el entrelazamiento del KLH en el extremo C fueron sintetizados por el método de síntesis de fase sólida Fmoc. Los productos resultantes fueron purificados por HPLC. Para el residuo de cisteína de cada uno de los péptidos purificados, se conjugó KLH activado por maleimida (Pierce) como un péptido portador siguiendo el protocolo. Estos fueron usados como antígenos para la inmunización en la producción de los anticuerpos monoclonales como se describe a continuación.

Preparación de antígeno 2; preparación de proteína recombinante BFvasa 4 1. Construcción del vector de expresión Para aumentar la inmunogenicidad, se seleccionó la secuencia cercana a la región peptídica que incluye las 4 secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente para la preparación de una proteína de antígeno. Se realizó RT-PCR usando el cebador delantero (5'-GCCGGGATCCAGCACTATTACACTAACCAGCCGC-3': SEQ ID NO: 12) y el cebador inverso (5'-GCCGAAGCTTGCTGAAACCTCCTCCTCTTCCTCT-3': SEQ ID NO: 13) con sitios de enzima de restricción añadidos de BamHI y Hindlll, y el gen Vasa del atún (SEQ ID NO: 1 1) como un molde. Se amplificó un fragmento de ADNc de 333 bp. Se usó polimerasa TaKaRa LATaq. El fragmento de ADNc fue insertado en los sitios BamHI-HindIII en pCoIdDNA (Takara bio Co., Ltd), un reactor de expresión del choque frío, ligado con ligasa T4DNA (Promega), y se construyó un vector de expresión en E. coli. Un huésped de E. coli para la expresión, células competentes BL21 (DE3) (Invitrogen life technologies) fueron transformadas con el vector de expresión construido. Con E. coli de una sola colonia obtenida, se inoculó el medio LB líquido que contenía 100 g/mL de ampicilina. El cultivo fue sacudido por 16 horas a 37 °C. Subsiguientemente, el medio líquido LB fue inoculado con 1/100 del volumen total del cultivo bacteriano saturado, y el cultivo fue sacudido por 2 horas a 37 °C. Este cultivo se dejó a 15 °C por 30 minutos, y luego se añadió IPTG a la concentración final de 1mM. El cultivo fue sacudido por 24 horas a 15 °C. 2. Construcción del vector de expresión y expresión de la proteína Después de sacudir por 24 horas, 1.5 ml_ del cultivo bacteriano mencionado anteriormente fue centrifugado a 13,000 rpm, 4 °C por 5 minutos para cosechar células bacterianas. Las células fueron lisadas con B-PER (Reactivo de Extracción de Proteína Bacteriana; PIERCE Thermo Scientific) y centrifugadas a 13,000 rpm, 4 °C por 15 minutos. El sobrenadante y el precipitado fueron recuperados. El sobrenadante y el precipitado recuperados fueron disueltos en 10 pL de amortiguador de muestra (1 ml_ de Tris-HCI 0.5M (pH 6.8), 2 ml_ de SDS al 10%, 0.6 mL de ß-mercaptoetanol, 1 ml_ de glicerol, 5.4 mL de D.W., 100 µ?/mL de BPB al 1%). Se realizó el SDS-PAGE con gel de poliacrilamida al 15% a 250V, 20mA. Después del término de la electroforesis, se realizó una transferencia Western usando la membrana de nitrocelulosa Hybond-ECL (GE health care bioscience Co„ Ltd) a 80V, 250 mA. Debido a que se añadió etiqueta de histidina (6 His tag) a la proteína expresada, los estados de la expresión fueron confirmados por el desarrollo del color con el sustrato NBT/BCIP usando un conjugado de Ni-NTA AP (QIAGEN) como un anticuerpo contra la proteína de interés. Como resultado, se encontró que el sobrenadante de las muestras de lisado contuvieron la proteína de interés, expresando en un estado soluble (véase la Figura 2). 3. Purificación y concentración de la proteína Para obtener la proteína expresada para purificar, 6L de medio líquido LB que contenía 100 pg/mL de ampicilina fue inoculado con 60 mL de cultivo bacteriano saturado. El cultivo fue agitado en una incubadora a 37 °C por 2 horas. Este cultivo se dejó a 15 °C por 30 minutos, y luego se añadió IPTG a la concentración final de 1 mM. El cultivo fue sacudido a 15 °C por 24 horas. Se cosecharon las células bacterianas por centrifugación a 4,000 rpm, 4 °C por 20 minutos, se lisaron usando un kit de amortiguador TALON xTractor (Clontech) y se centrifugaron a 13,000 rpm, 4 °C por 20 minutos para obtener una fracción soluble. La solución de esta fracción fue mezclada con resina de afinidad de metal TALON (Metal Affinity Resins; Clontech), perlas de resina acopladas con iones cobalto, para adsorber la proteína de interés. Estas perlas fueron cargadas en una columna. La proteína adherida de manera no específica a las perlas fue removida al aplicar 2 mL de amortiguador (NaH2PO4 50 mM, NaCI 300 mM, imidazol 60 mM, pH 7.0) 6 veces, y la proteína de interés fue eluida al aplicar 1mL de amortiguador de elución (NaH2PO4 50 mM, NaCI 300 mM, imidazol 150 mM, pH 7.0) 6 veces (véase la Figura 3). La solución de la proteína después de la purificación fue sometida a ultrafiltracion usando un Amicon Ultra-15 Ultracel-3K (MILLIPORE) para concentrar a 1 mg/1.5 ml_. Esta proteína purificada fue designada como la proteína recombinante BFvasa14, y se usó 1 mg para la producción del anticuerpo monoclonal (véase la Figura 4).

Inmunización de ratón La solución de una mezcla de cuatro péptidos entrelazados a KLH fue preparada como 1 mL de solución de antígeno al mezclar 250 pL de cada uno de los cuatro péptidos entrelazados a KLH preparados como se mencionó anteriormente. También se usaron 300 pL de la solución de proteína recombinante BFVasa14 como una solución de antígeno. La solución de la mezcla de cuatro péptidos entrelazados a KLH mencionada anteriormente fue emulsificada al añadir 1 mL de adyuvante completo de Freund (Pierce). La solución de la mezcla de cuatro péptidos entrelazados a KLH emulsificada fue dividida en alícuotas iguales y se administró subcutáneamente a 4 animales de ratón C57BL6 (comprados a Japan SLC) de 9 semanas de edad en su espalda para cebar. Por separado, 300 pL de solución de proteína recombinante BFVasa14 fueron emulsificados al añadir 300 pL de adyuvante completo de Freund (Pierce). La solución de proteína recombinante de BFvasa14 emulsificada fue dividida en alícuotas iguales y administrada subcutáneamente a 2 animales de ratón C57BL6 de 9 semanas de edad en su espalda.

Fusión Celular Células del nodulo linfático fueron removidas asépticamente de los 6 ratones mencionados anteriormente 14 días después del cebado mencionado anteriormente. Las células del nodulo linfático fueron mezcladas y fusionadas con células de mieloma de ratón P3-X63-Ag8-U almacenadas en la Universidad de Tokio de Ciencia y Tecnología Marina (Tokyo University of Marine Science and Technology) en la presencia de polietilenglicol al 50%. Las células mezcladas fueron diluidas en placas de microvaloración que contenían medio HAT. Después de 8 días de cultivo, se detectó la presencia o ausencia de anticuerpo en antisuero y medio acondicionado mediante el inmunoensayo enlazado a enzima (ELISA). Como inmunogenes para la selección, se usó la proteína recombinante BFvasa14 antes mencionada y los cuatro péptidos mezclados entrelazados a BSA. Los péptidos fueron entrelazados con BSA en lugar de KLH para remover los anticuerpos que se unieron sólo al KLH. Las placas fueron preparadas al diluir los antígenos para la selección antes mencionada con PBS a 5 pg/mL cada uno. Como moldes, se prepararon placas de una manera similar a lo anterior al diluir un antígeno de proteína recombinante de caballa con PBS a 10 pg/mL (véase la Figura 5C). Al realizar ensayos para cada antígeno (959 pozos en total), se encontraron 14 cepas en total como las cepas que respondieron sólo a la proteína recombinante BFvasa14; las cepas que respondieron a la proteína recombinante BFvasa14 y a los péptidos entrelazados a BSA; y las cepas que responden a la proteína recombinante BFvasa14, péptidos entrelazados a BSA y al antígeno de la proteína recombinante de la caballa. Fueron seleccionadas dos cepas, No. 6 y No. 8, que no mostraron respuesta a la caballa, pero una respuesta fuerte a la proteína recombinante BFvasa14 y a los péptidos entrelazados a BSA (véase las Figuras 5A y 5B). El No. 6 fue designado como vasa-C57Z, y el No. 8 como vasa-C57Z 8A-1 1A. Los Cuadros 1 a 3 a continuación muestran los resultados de la selección primaria después del tratamiento de fusión celular que produjo la selección del hibridoma.

Como se muestra en las Figuras 5A-5C, el No. 6 (vasa-C57Z 6H-7E) demostró fuertes respuestas a BFvasa14 (0.638) y a los cuatro péptidos mezclados entrelazados a BSA (0.247); y el No. 8 (vasa-C57Z 8A-1 1A) al BFvasa14 (0.624) y a los cuatro péptidos mezclados entrelazados a BSA (0.410), mientras que no demostraron una respuesta al antígeno de la proteína recombinante de la caballa (0.062 y 0.063 respectivamente).

CUADRO 1 Placa de péptido recombinante BFvasa14 (5 gg/mL) 0.066 0.061 0.052 0.066 0.060 0.057 0.062 0.063 0.063 0.063 0.064 0.067 0.084 0.064 0.054 0.061 0.054 0.064 0.064 0.064 0.065 0.064 0.064 0.064 0.063 0.052 0.050 0.076 0.063 0.062 0.638 0.109 0.066 0.064 0.063 0.062 0.063 0.052 0.054 0.052 0.064 0.064 0.063 0.062 0.052 0.096 0.063 0.080 0.063 0.061 0.060 0.053 0.067 0.053 0.052 0.059 0.052 0.062 0.063 0.062 0.065 0.063 0.065 0.104 0.065 0.061 0.062 0.060 0.198 0.054 0.080 0.052 0.062 0.063 0.063 0.064 0.063 0.060 0.071 0.062 0.074 0.062 0.062 0.068 0.066 0.066 0.067 0.066 0.065 0.066 0.067 0.064 0.065 0.065 0.069 0.064 CUADRO 2 Placa de mezcla de cuatro péptidos entrelazados a BSA (5 gg/mL) CUADRO 3 Placa de caballa (10 ug/mL) Reexamen de la selección de células de fusión Las células fueron capturadas en microplacas de 48 pozos (Falcon) de pozos positivos de cepas originales y cultivadas. Las valoraciones de anticuerpos en los sobrenadantes fueron medidos de nuevo. Dos cepas que mostraron respuesta a los antígenos fueron sometidas a la clonación de dilución limitante en un medio de clonación.

Se realizó una selección mediante ELISA usando como un antígeno, cada uno de los péptidos entrelazados a BSA mencionados anteriormente para el hibridoma vasa-C57Z 6H-7E y el hibridoma vasa-C57Z 8A-11A, respectivamente. Ambos mostraron fuertes respuestas cuando se usó, como un antígeno, el péptido en el cual el fragmento peptídico que consiste de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 estaba entrelazado a BSA. Los resultados se muestran en la Figura 6.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención fueron tomados de medio acondicionado de los cultivos en los cuales el hibridoma vasa-C57Z 6H-7E y el hibridoma vasa-C57Z 8A-11A de la presente invención mencionados anteriormente fueron cultivados en medio RPMI-1640 que contenía suero bovino fetal al 10% etc., a 37 °C por 4 a 5 días. La subclase de los anticuerpos fue confirmada usando un Kit de Prueba de Isotipificación de Anticuerpos Monoclonales de Ratón (clave de producto: MMT1 , Serotec); el vasa-C57Z 6H-7E produce la cadena lgG2bi , y el vasa-C57Z 8A-11A produce la cadena igG3K.

EJEMPLO 2 Tinción inmunohistológica de las células germinativas derivadas del atún aleta azul v de la macarela La desparafinización de cada una de las secciones de tejido de atún aleta azul incorporadas en parafina (tejido de ovario de atún aleta azul y tejido de testículos de atún aleta azul (obtenidos de Nakatani Suisan), y tejido de ovario de macarela y tejido de testículos en macarela (derivados de mar abierto de Tateyama, Chiba)) fijos con líquido de fijación PFA/PBS al 4%, fue realizada con soluciones de xileno-etanol y tratamiento de hidratación. Las muestras de la sección resultantes fueron tratadas con agente de recuperación de antígeno por inmersión en la solución de recuperación de antígeno HistoVT One (Nakarai tesque) a 90 °C por 20 minutos, lavando con PBS/ Tween 20 al 0.1%, bloqueando a temperatura ambiente con BSA/PBS al 2% por 30 minutos. Como un anticuerpo primario, 0.1 ml_ de sobrenadante diluido del hibridoma vasa-C57Z 6H-7E (dilución de anticuerpo: 1 a 10 veces) fue añadido por goteo sobre las muestras de sección. Las muestras fueron incubadas a 4 °C durante la noche, se lavaron 3 veces con PBS/Tween 20 al 0.1% por 5 minutos, luego se bloquearon a temperatura ambiente por 30 minutos usando suero de caballo normal para el bloqueo (kit ImmPRESS, Vector). Como anticuerpo secundario, se añadió por goteo un anticuerpo IgG anti-ratón ImmPRESS REAGENT sobre las muestras de sección. Las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente por 1 hora, lavadas 3 veces con PBS/Tween 20 al 0.1% por 5 minutos, luego las muestras de sección fueron teñidas con reactivo DAB por 5 a 10 minutos.

Las muestras de sección teñidas mencionadas anteriormente fueron observadas bajo un BX50 (Olympus). Las Figuras 7A-7D muestran ejemplos de inmunotinciones de las células germinales en el tejido de ovario y el tejido de testículos del atún aleta azul, y el tejido de ovario y el tejido de testículos de la macarela con el anticuerpo (dilución de anticuerpo: 10 veces) producido mediante el hibridoma vasa-C57Z 6H-7E mencionado anteriormente. Se demostró que la proteína de antígeno expresada en el tejido de ovario y el tejido de testículos del atún aleta azul fue teñida de color café (véase la Figura 7A y la Figura 7B), mientras que las células germinativas de la macarela no se tiñeron (véase la Figura 7C y la Figura 7D). Por consiguiente, se demostró que, mediante un método de inmunotinción que usa el anticuerpo monoclonal de la presente invención, puede detectarse una proteína de antígeno expresada en células germinativas del atún aleta azul que se unen específicamente a un anticuerpo monoclonal de la presente invención.

Números de Acceso NITE BP-646 NITE BP-647 i

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un anticuerpo anti-Vasa de atún o un fragmento del mismo, en donde el anticuerpo se produce al usar un antígeno que comprende uno o más fragmentos peptídicos seleccionados del grupo de fragmentos peptídicos que consiste de las secuencias de aminoácidos mostradas en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 9 en el listado de secuencias, el anticuerpo se une específicamente a un producto del gen Vasa del atún, pero no se une a un producto del gen Vasa de otras especies de peces.

2.- Un anticuerpo anti-Vasa de atún o un fragmento del mismo, en donde el anticuerpo se produce al usar un antígeno que comprende uno o más fragmentos peptídicos seleccionados del grupo de fragmentos peptídicos que consiste de las secuencias de aminoácidos mostradas en cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 9 en el listado de secuencias, el anticuerpo reconoce específicamente una célula germinativa derivada de un atún, pero no reconoce una célula somática derivada de un atún y una célula derivada de otras especies de peces.

3.- El anticuerpo anti-Vasa de atún o un fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque el anticuerpo se produce al usar un antígeno que comprende un fragmento peptídico que consiste de la secuencia de aminoácidos mostrado en la SEQ ID NO: 1 en el listado de secuencias.

4. - El anticuerpo anti-Vasa de atún o un fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 2 o 3, caracterizado además porque la célula germinativa derivada de un atún es una célula germinativa primordial, un espermatogonio, un oogonio o un oocito.

5. - El anticuerpo anti-Vasa de atún o un fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque el atún es atún aleta azul.

6. - El anticuerpo anti-Vasa de atún o un fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

7. - Un hibridoma que tiene la capacidad de producir el anticuerpo monoclonal de la reivindicación 6.

8. - El hibridoma de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el hibridoma es vasa-C57Z 6H-7E (NITE BP- 647) o vasa-C57Z 8A-11 A (NITE BP-646).

9. - Un kit para detectar una célula germinativa derivada de un atún, caracterizado porque el kit comprende un anticuerpo anti-Vasa de atún marcado o un fragmento de anticuerpo anti-Vasa de atún marcado que resulta de marcar el anticuerpo anti-Vasa de atún o un fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

10. - Un método para la detección de una célula germinativa derivada de un atún, en donde la célula germinativa es trasplantada dentro de un pez recipiente heterologo, el método comprende poner en contacto el anticuerpo anti-Vasa de atún o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 con una célula de muestra, y detectar una proteína Vasa expresada en la célula.