MX2008010107A - Vehiculo de vacuna novedoso. - Google Patents

Vehiculo de vacuna novedoso.

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MX2008010107A
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sucpg
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MX2008010107A
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Shinobu Watarai
Kenji Kono
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Abstract

Un objeto es prepara un vehículo de vacuna novedoso que se puede usar en la producción de una vacuna capaz de inducir una respuesta inmune humoral o celular con buena eficiencia; otro objeto es proveer una vacuna capaz de inducir una respuesta inmune humoral o celular con buena eficiencia; se encuentra que el objeto se puede lograr usando un liposoma que comprende poliglicidol succinilado; por lo tanto, se describe un vehículo de vacuna que comprende un liposoma que comprende poliglicidol succinilado.

Description

VEHICULO DE VACUNA NOVEDOSO CAMPO TECNICO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a vehículos de vacuna novedosos que usan liposomas que tienen membrana lipídica fusogénica.
TECNICA ANTECEDENTE El sistema inmune de los animales tiene la función de diferenciar entre lo propio y lo no propio y eliminar lo no propio del cuerpo. La reacción inmunológica en un cuerpo vivo que es responsable de dicha discriminación entre lo propio y lo no propio lo realiza la inmunidad celular que utiliza moléculas de MHC de clase I o la inmunidad humoral que utiliza moléculas de MHC de clase II. Por ejemplo, si un cuerpo vivo es infectado con un virus o una bacteria como un patógeno infeccioso, intenta eliminar dichos patógenos infecciosos al usar la inmunidad celular o inmunidad humoral antes mencionadas. La vacunación se utiliza frecuentemente como un medio para prevenir estos patógenos infecciosos. En el caso de los humanos, así como animales domesticados y animales de compañía, se utiliza una gran variedad de vacunas. Esas vacunas se dividen aproximadamente en dos tipos, vacunas inactivadas (incluyendo vacuna de toxoide) y vacunas atenuadas. Las vacuna inactivadas son las vacunas en las un patógeno o toxoide se trata con formalina u otras sustancias químicas para volverse no infecciosos y después se administran en un estado inactivado o son aquellas vacunas en las que sólo se administra una porción de antígeno del patógeno; ejemplos de este tipo de vacunas que se pueden administrar a humanos incluyen vacunas triples (vacuna de DPT; vacuna de difteria, -pertusis-tétanos), vacuna de encefalitis japonesa, vacuna de la influenza, vacuna de toxoide tetánico, etc. La vacunas atenuadas, por otra parte, son aquellas vacunas que se administran en forma de patógenos que son débilmente virulentos pero tienen infectividad, como lo ilustran las cepas atenuadas que ocurren naturalmente o cepas artificialmente creadas de variantes atenuadas; ejemplos de ese tipo de vacunas que pueden ser administradas a humanos incluyen la vacuna BCG, vacuna de poliomielitis, vacuna del sarampión, vacuna de la rubéola, vacuna de paperas, vacuna de varicela (vacuna de viruela de los pollos), etc. Las vacunas inactivadas tienen la ventaja de que sea menos probable que causen infección mediada por patógenos y efectos colaterales como resultado de su administración pero, por otra parte, se caracterizan por su capacidad para adquirir sólo inmunidad humoral. Las vacunas atenuadas, por otra parte, usan patógenos vivos, de modo que tienen la ventaja de que su virulencia pudiera ser restaurada por alguna razón para desarrollar efectos colaterales. Lo que es más, excepto en el caso de algunas vacunas atenuadas (tales como vacuna de poliomielitis) que se han de administrar oralmente, las vacunas generalmente se administran por inyección intramuscular, por lo que tienen problemas adicionales en que los títulos de anticuerpos de anticuerpos IgG pueden incrementarse pero los de anticuerpos de otras clases (tales como IgA e IgM) no lo harán y no pueden inducir completamente la respuesta inmune celular que es importante para la protección contra la infección. La infección con patógenos infecciosos empieza con aquellos patógenos que invaden el cuerpo desde superficies de la mucosa como en la mucosa nasal, traqueal, intestinal y ocular, de modo que si la inmunidad celular puede ser inducida por vacunación, la invasión de patógenos en el cuerpo puede ser detenida en la colindancia. Aunque las membranas mucosas en el cuerpo vivo cubren las superficies de lúmenes de tracto tales como cavidad oral, cavidad nasal, tracto digestivo y órganos reproductores, así como las superficies mucosas de los ojos, lo que está constantemente funcionando en esas superficies es inmunidad de la mucosa que principalmente implica IgA secretora y tejidos linfáticos asociados con la mucosa contra microorganismos patógenos (v.gr., virus y bacterias), antígenos de la dieta y sustancias extrañas no propias a las cuales están constantemente expuestas las membranas mucosas. La inmunidad de la mucosa detiene la invasión de aquellas sustancias extrañas no propias en el cuerpo al presentar diversas acciones tales como la supresión de la incorporación de antígenos de proteína desde las superficies de la mucosa, inhibición de la adsorción de bacterias o virus sobre el epitelio de la mucosa y neutralización de virus con los cuales se han infectado las células epiteliales. Sin embargo, como se mencionó antes, muchos casos de la vacunación convencional han tenido el problema de fallar para incrementar los títulos de anticuerpo de anticuerpos de la clase no-lgG (tales como IgA e IgM) o para inducir completamente la respuesta inmune celular, por lo que ninguna respuesta inmune que implique la producción de anticuerpos específicos de antígeno (IgA secretora) puede ser inducida de manera efectiva sobre las superficies mucosas que son sitios de infección con patógenos infecciosos. Para resolver estos problemas, se han realizado estudios sobre la suposición de que la respuesta inmune específica de antígeno podría ser inducida tanto sistemáticamente como sobre las superficies mucosas en varias partes del cuerpo al administrar antígenos por las superficies mucosas como en la inmunización oral o la inmunización nasal. Con una vista a impartir dicha inmunidad mucosa, se han realizado intentos para incorporar antígenos en liposomas y administrarlos a membranas mucosas como vacunas. Se muestra, por ejemplo, que al incorporar un antígeno de Enteritidis por Salmonella entérica serovar Enteritidis por un inmunógeno en liposomas y aplicarlo mediante gotas para los ojos en pollos, la respuesta inmune sistémica se podría inducir para inhibir de esta manera la invasión de Salmonella entérica serovar Enteritidis a través del lumen intestinal (documento que no es patente 1 y documento que no es patente 2). Sin embargo, en el campo de producción de vacunas, se desea desarrollar vehículos de vacuna que puedan lograr incrementos aún más eficientes en los títulos de anticuerpos de varias clases de anticuerpos (en respuesta inmune humoral) y en respuesta inmune celular. Documento que no es patente 1 : Fukutome, K. et al., Development and Comparative Immunology, 25, 2001 , 475-484; Documento que no es patente 2: Li, W. et al, Development and Comparative Immunology, 28, 2004, 29-38.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Un objeto de la presente invención es preparar vehículos de vacuna novedosos que se puedan usar para producir vacunas que sean capaces de inducción eficiente de respuestas inmunes humoral y celular. Otro objeto de la presente invención es proveer vacunas capaces de inducción eficiente de respuestas inmunes humoral y celular.
Medios para resolver los problemas Los inventores de la presente revelaron que los problemas anteriormente señalados de la presente invención podría resolverse usando liposomas: que contengan un lípido fusogénico (poli(glicidol) succinilado) y este hallazgo ha conducido al éxito de la invención. Señalado de manera especifica, la presente invención puede resolver los problemas antes mencionados al proveer vehículos de vacunas que contengan liposomas que contengan poli(glicidol) succinilido.
Efectos de la invención Al usar los vehículos de vacunas anteriormente descritos que comprenden líposomas que contienen poli(glicídol) succinilado, se pueden obtener vacunas eficientes que obtengan incrementos significativos en títulos de anticuerpo en comparación con el caso de usar vehículos de vacuna que comprendan los líposomas convencionales. Además, las vacunas preparada al usar los vehículos de vacuna anteriormente descritos son capaces de inducción eficiente no sólo de inmunidad humoral sino también inmunidad celular.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una gráfica que muestra los títulos de anticuerpo de anticuerpo IgM, anticuerpo IgG y anticuerpo IgE específicos de OVA en el suero para el caso en donde ratones BALB/c fueron inmunizados intraperitonealmente con una vacuna hecha de OVA-SucPG-liposomas, una vacuna hecha de OVA-liposomas y una vacuna compuesta únicamente de OVA. La figura 2 es una gráfica que muestra los títulos de anticuerpo de subclases de anticuerpo IgG (lgG1 , lgG2a, e lgG3) específicos de OVA en el suero para el caso en donde ratones BALB/c fueron inmunizados intraperitonealmente con una vacuna hecha de OVA-SucPG-liposomas, una vacuna hecha de OVA-liposomas, y una vacuna compuesta únicamente de OVA. La figura 3 es una gráfica que muestra los resultados de inducción de clase de anticuerpo en el fluido intestinal ara el caso de inmunización transnasal. La figura 4 muestra los resultados del examinen de expresión de ARNm de gen IFN-? y gen IL-4 en linfocitos de bazo de ratones inmunizados intraperitonealmente con una vacuna hecha de OVA-SucPG-liposomas usando la técnica de RT-PCR. Las figuras 5A-5B muestran en gráficas los resultados de la cuantificación de IFN-? e IL-4 en el sobrenadante de cultivo de linfocitos de bazo de ratones inmunizados intraperitonealmente con una vacuna hecha de OVA-SucPG-liposomas. La figura 6 es una gráfica que muestra los títulos de anticuerpo de anticuerpo IgM, anticuerpo IgG y anticuerpo IgE específicos de OVA en el suero para el caso en donde ratones BALB/c fueron intraperitonealmente inmunizados con una vacuna hecha de OVA-SucPG-liposomas, una vacuna hecha de OVA-liposomas y una vacuna compuesta únicamente de OVA. La figura 7 es una gráfica que muestra los títulos de anticuerpo de la subclase de anticuerpo IgG (lgG1 , lgG2a, e lgG3) específico de OVA en el suero para el caso en donde ratones BALB/c fueron intraperitonealmente inmunizados con una vacuna hecha de OVA-SucPG-liposomas, una vacuna hecha de OVA-liposomas, y una vacuna compuesta únicamente de OVA. La figura 8 muestra los resultados del examen de expresión de ARNm de gen IFN-? y gen IL-4 en linfocitos de bazo de ratones inmunizados intraperitonealmente con una vacuna hecha de OVA-SucPG-liposomas usando la técnica de RT-PCR. Las figuras 9A-9B muestran en gráficas los resultados de la cuantificación de gen IFN-? y gen IL-4 en el sobrenadante de cultivo de linfocitos de bazo de ratones inmunizados intraperitonealmente con una vacuna hecha de OVA-SucPG-liposomas. Las figuras 10A-10B muestran en gráficas los resultados de la cuantificación titulo de anticuerpo de anticuerpos en la sangre de pollos inmunizados mediante la administración oftálmica de una vacuna hecha de antígeno-SucPG-liposomas de Salmonella enteritidis. La figura 1 1 es una gráfica que muestra los resultados de título de anticuerpo de anticuerpos en la sangre de ratones inmunizados mediante administración transnasal de una vacuna hecha de antígeno-SucPG-liposomas de Trypanosoma brucei. La figura 12 es una gráfica que muestra los resultados de título de anticuerpo de anticuerpos en la sangre de vacas inmunizadas mediante administración transnasal de una vacuna hecha de antígeno-SucPG-liposomas de Staphylococcus aureus. La figura 13 es una gráfica que muestra los resultados de título de anticuerpo de anticuerpos en la leche de vacas inmunizadas mediante administración transnasal de una vacuna hecha de antígeno-SucPG-liposomas de Staphylococcus aureus. La figura 14 es una gráfica que muestra los resultados de título de anticuerpo de anticuerpos en la sangre de carpa inmunizada mediante administración oral de una vacuna hecha de antígeno-SucPG-liposomas de Aeromonas salmonicida. Las figuras 15A-15B muestran en gráficas los resultados de título de anticuerpos de anticuerpos en el fluido intestinal y bilis de carpa inmunizada mediante administración oral de una vacuna hecha de antígeno-SucPG-liposomas de Aeromonas salmonicida. La figura 16 es una gráfica que muestra el cambio transicional en la tasa de supervivencia de carpa inmunizada mediante administración oral de una vacuna hecha de antigeno-SucPG-liposomas de Aeromonas salmonicida. La figura 17 es una gráfica que muestra los resultados de título de anticuerpo de anticuerpos en la sangre de ratones inmunizados mediante administración transnasal de una vacuna hecha de antígeno-SucPG-liposomas de Mycoplasma gallisepticum. La figura 18 es una gráfica que muestra los resultados de título de anticuerpo de anticuerpos en la sangre de ratones inmunizados mediante administración transnasal de una vacuna hecha de antígeno-SucPG-liposomas de virus de enfermedad de Newcastle.
MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCION Como se describió antes, la presente invención se caracteriza por proveer vehículos de vacunas que comprenden liposomas que contienen poli(glicidol) succinilado (SucPG). La ventaja de usar los vehículos de vacunas que comprenden dichos liposomas es que independientemente de si el inmunógeno contenido en liposomas es una vacuna inactivada o una vacuna activada y cualquiera que sea la vía de administración, no sólo los títulos de anticuerpo de anticuerpos IgG sino también aquellos de otras clases de anticuerpos pueden ser elevados y lo que es más, la inmunidad celular así como la inmunidad humoral también pueden ser inducidas. La inmunidad celular que es inducida a partir del uso del vehículo de vacuna de la presente invención que comprende liposomas que contienen polí(glicidol) succinilado (SucPG) se cree que se ha logrado mediante internalización del inmunógeno dentro de las células que presentan antígeno. Para ser más específicos, usando el vehículos de vacunas de la presente invención, se puede incorporar el inmunógeno en los lúmenes de liposomas y por lo tanto se puede internalizar el inmunógeno dentro de las células que presentan antígeno. Como resultado, tal como se supone, el inmunógeno incorporado en la célula que presenta antígeno combinado como un componente propio con una molécula de MHC de clase I y presentado como tal como un antígeno o la célula que presenta antígeno, finalmente induce inmunidad celular.
El poli(glicidol) succinilado (SucPG) como se usa aquí es un compuesto anfifático caracterizado por tener un grupo alquilo. Al tener un grupo alquilo, SucPG puede ser anclado a una membrana de liposoma. El grupo alquilo en SucPG preferiblemente contiene 6 a 24 átomos de carbono y, muy preferiblemente, contiene grupos alquilo que tienen 6 a 18 átomos de carbono. El grupo alquilo más preferido es un grupo n-decilo que tiene 10 átomos de carbono. SucPG tiene la estructura de base de la cadena principal siendo similar a la del polietilenglicol anfifílico y cadenas laterales con un grupo carboxilo, por lo que se caracteriza porque estabiliza la membrana de liposoma en un ambiente neutro pero en un ambiente ácido el grupo carboxilo en cadenas laterales es protonado para inducir fusión de membrana. Al incorporar el SucPG en la membrana de liposoma, el liposoma resultante (SucPG-liposoma) desarrolla fusogenicidad en un ambiente ácido. En otras palabras, cuando el SucPG-liposoma se incorpora en la célula que presenta antigeno por endocitosis, el pH en el lisosoma disminuye. Entonces, el SucPG-liposoma presenta su fusogenicidad y se fusiona con la membrana de liposoma para hacer que la sustancia antigénica encapsulada sea liberada al citoplasma (internalización del antígeno). El SucPG que se ha de usar en la presente invención se puede preparar haciendo reaccionar el polímero sintético poli(glicidol) con anhídrido succínico en ?,?-dimetilformamida a 80°C durante 6 horas. Lo que es característico de la presente invención es que poli(glicidol) succinilado se añade al lípido que compone el liposoma usado en el vehículo de vacuna. Para ser más específicos, el vehículo de vacuna de la presente invención contiene poli(glicidol) succinilado en una cantidad de 10 a 40% en peso, preferiblemente 20 a 35% en peso, muy preferiblemente 30% en peso del lipido que compone el liposoma. El vehículo de vacuna de la presente invención se puede usar para administración de transmucosa del inmunogeno contenido dentro del liposoma. El término "mucosa" o "membrana mucosa" como se usa aquí colectivamente se refiere a sitios que cubren las superficies internas de los lúmenes de visceras huecas tales como los órganos digestivos, órganos respiratorios y órganos genitourinarios y sus superficies libres siempre están húmedas con secreciones de glándulas de la mucosa y células globaliformes. Las membranas mucosas a las cuales el vehículo de vacuna de la presente invención se puede aplicar incluye membranas de la cavidad oral, garganta, cavidad nasal, cavidad aural, saco conjuntival, vagina y ano. Al aplicar el liposoma que contiene inmunogeno a esta superficies mucosas, el inmunogeno puede ser incorporado en el cuerpo mediante las superficies mucosas. El vehículo de vacuna de la presente invención también se puede usar para suministrarse mediante administración no transmucosa del inmunogeno contenido dentro del liposoma del vehículo de vacuna. En la presente invención, vías distintas a la vía transmucosa pueden incluir administración intraperitoneal del inmunogeno contenido dentro del liposoma del vehículo de vacuna. Por ejemplo, cuando el inmunogeno es administrado ¡ntraperitonealmente, se puede incorporar en el cuerpo desde las superficies de órganos de la cavidad abdominal, como lo ilustran el tracto gastrointestinal, órganos genitales, hígado y páncreas. Al administrarse el inmunógeno en el cuerpo, el inmunógeno puede ser incorporado en las células que presentan antigeno presentes en forma ubicua en el cuerpo. Los lípidos que componen el liposoma en la presente invención incluyen, por ejemplo, fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserinas, ácidos fosfatidicos o alquilfosfatos de cadena larga o fosfatidilgliceroles, y colesteroles (Chol). Cuando se preparan liposomas en la presente invención, los lipidos listados anteriormente se pueden usar ya sea de manera independiente o en combinación de cualesquiera dos o más de estos lípidos. Las fosfatidilcolinas que se usan como lípidos para componer el liposoma en la presente invención incluyen dimiristoil fosfatídilcolina (DMPC), dipalmitoil fosfatídilcolina (DPPC), diestearoil fosfatídilcolina (DSPC), dioleil fosfatídilcolina (DOPC), lecitina de yema de huevo (PC huevo), etc. Las fosfatidiletanolaminas que se usan como lípidos para componer el liposoma en la presente invención incluyen dioleil fosfatidíletanolamina (DOPE), dimiristoil fosfatídiletanolamina, dipalmitíol fosfatidiletanolamina, diestearoil fosfatidíletanolamina (DSPE), etc. Las fosfatidilserinas que se usan como lípidos para componer el liposoma en la presente invención incluyen dioleil fosfatidílserina (DOPS), dipalmitoil fosfatidílserina (DPPS), etc. Los ácidos fosfatidicos o alquilfosfatos de cadena larga que se usan como lípidos para componer el liposoma en la presente invención incluyen ácido dimiristoilfosfatidico, ácido dipalmitoilfosfatídico, ácido diestearoilfosfatídico, dicetilfosfato, etc. Los fosfatidilgliceroles que se usan como lípidos para componer el liposoma en la presente invención incluyen dimiristoilfosfatidilglicerol, dipalmitoilfosfatidilglicerol, diestearoilfosfatidilglicerol, etc. Entre los compuestos listados anteriormente, aquellos que son particularmente preferidos para usarse son DOPE, DPPC, DSPC, DPPS, DSPE, Chol, etc. Cuando los lípidos anteriormente listados se han de usar en mezcla, las proporciones a las cuales los lípidos respectivos son incorporados se pueden determinar como apropiados por el tamaño deseado de liposomas, la fluidez deseada, etc. En la presente invención, los liposomas preferiblemente se preparan mezclando DOPE y DPPC a 1 :1 . Los liposomas se clasifican como MLV (vesículas multilaminares), DRV (vesículas de deshidratación-rehidratación, LUV (vesícula unílaminares grandes) o SUV (vesículas unilaminares pequeñas), etc., dependiendo de sus estructuras o el método de su preparación. El liposoma de la presente invención que contiene poli(glicidol) succinilado (SucPG) está también disponible en varios tipos de liposomas incluyendo MLV, DRV, LUV y SUV que están compuestos de capas múltiples. Para preparar los liposomas que contienen SucPG, cualesquiera métodos convencionalmente conocidos de producción de liposoma se pueden utilizar. Una variedad de métodos para producción de liposoma se han conocido hasta ahora en el campo de interés técnico. Para dar ejemplos de algunos métodos comunes para producción de liposomas, se puede mencionar lo siguiente: (1 ) un lípido se disuelve en un solvente orgánico adecuado (tal como cloroformo, éter, etc.) y el solvente se destila bajo vacío para formar una película de lípido delgada, que después es hidratada (o hinchada) en agua por medio de agitación mecánica; (2) un lípido se disuelve en un solvente orgánico (tal como éter o etanol) y la solución resultante es inyectada en el agua calentada a alta temperatura por medios adecuados (tal como una jeringa o una boquilla) bajo presión a una velocidad constante, en dicho procedimiento el solvente orgánico se destila o se diluye, después de lo cual el lípido forma una doble capa para preparar liposomas; (3) un lípido se mezcla con un agente tensoactivo (tal como ácido cólico o ácido desoxicólico) pata formar micelas en una solución acuosa y la solución de micelas resultante es provista del agente tensoactivo (tal como ácido cólico o ácido desoxicólico) por una operación adecuada tal como diálisis o filtración en gel para preparar liposomas; (4) un solvente orgánico que tiene un lípido disuelto en el mismos e añade a una fase acuosa, que después es sometida a sonicación para formar una emulsión de agua/aceite que es después desprovista de solvente orgánico para formar un gel que se deja que pase por inversión de fase mediante agitación mecánica para preparar liposomas; (5) una película delgada de lípido se mezcla con un solvente acuoso de modo que es hidratada o hinchada y el contenedor se hace vibrar mecánicamente para separar la película de lípido delgada de las superficies internas y posteriormente la película de lípido delgada separada es sometida a sonicación o se hace pasar a través de un orificio de un tamaño dado por medio de una prensa francesa, un aparato de filtración presurizado o un extrusor para preparar liposomas; y (6) los liposomas son secados por congelamiento y después rehidratados con un solvente acuoso para preparar así liposomas. Con una vista para complementar la actividad de inmunoaumento, el vehículo de vacuna de la presente invención puede contener además un adyuvante. Los adyuvantes que pueden estar contenidos en el vehículo de vacuna de la presente invención incluyen lípido monofosforílíco A, citosina, lectina, etc. El ¡nmunógeno que puede estar contenido en el vehículo de vacuna de la presente invención puede incluir (pero no se limita a) cualesquiera de los inmunogenos con los cuales los seres humanos o animales (mamíferos, peces, etc) son deseablemente vacunados. Ejemplos de los inmunogenos incluyen inmunogenos derivados de bacterias, inmunogenos derivados de virus e inmunogenos derivados de protozoaríos. Por ejemplo, en el caso de aplicar el vehículo de vacuna de la presente invención a inmunogenos en humanos, lo siguiente puede estar contenido en el vehículo de vacuna: un ¡nmunógeno derivado de virus seleccionado de entre un antígeno de virus de la influenza, un antígeno de virus de SARS, un antígeno de virus de SIDA y similares; o un inmunógeno derivado de bacteria seleccionado de entre antígeno de Escherichia coli O-157 patogénico, antígeno de Salmonella, antígeno de Staphylococcus aureus, antígeno de Aeromonas, antígeno de bacilo de tuberculosis y similares; o un inmunógeno derivado de protozoarios seleccionado de entre antígeno de Trypasonoma, antígeno de coccidio, antígeno de malaria, antígeno de Theileria y similares. Considérese entonces el caso de aplicar el vehículo de vacuna de la presente invención a inmunógenos en animales; en este caso, cualquiera de los antígenos derivados de patógenos de enfermedades infecciosas importantes en animales domésticos pueden estar contenidos y ejemplos de los antígenos incluyen: para pollos, inmunógenos derivados de bacterias tales como antígeno de Salmonella entérica serovar Enteritidis, antígeno de Haemophilus, paragallinarum, antígeno derivados de virus tales como antígeno de virus de influenza de pollos, antígeno de virus de enfermedad de Newcastle, antígeno de virus de bronquitis infecciosa; inmunógenos derivados de protozoarios tales como antígeno de Leucocytozoon, antígeno de Eimeria; para cerdos, un inmunógeno derivado de virus tal como antígeno de virus de gastroenteritis infecciosa; un inmunógeno derivado de bacterias tal como antígeno de Bordetella bronchiseptica; e inmunógenos derivados de protozoarios tales como antígeno de toxoplasma, antígeno de Eimeria; para vacas, un inmunógeno derivado de virus tal como antígeno de virus de diarrea viral/enfermedad de la mucosa de bovinos; inmunógenos derivados de bacterias tales como antígeno de Staphylococcus aureus, y antígeno de paratuberculosis de Mycobacterium avium; e inmunógenos derivados de protozoarios tales como antígeno de Theileria, antígeno de Babesia y similares; para caballos, inmunógenos derivados de virus tales como antígeno de virus de rinoneumonitis equina y antígeno de virus de influenza equina; e inmunógenos derivados de protozoarios tales como antígeno de Trypanosoma, antígeno de Babesia; y para peces, inmunógenos derivados de bacterias tales como antígeno de Vibrio, antígeno de Aeromonus, inmunógenos derivados de virus tales como antígeno de virus de necrosis pancreática infecciosa, antígeno de Iridovirus; e inmunógenos derivados de protozoarios tales como antígeno de protozoario de Ichthyobodo, antígeno de protozoarios de Hexamita.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 Preparación de liposomas de poli(glicidol) succinilado (SucPG) A una composición de lípído que consistía de dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) (Sigma) y dioleil fosfatidiletanolamina (DOPE) (Sigma) a una relación molar de 1 :1 (cada uno siendo de 10 µ????ee), se añadió SucPG a una relación de peso de lípido de 10%, 20% o 30% para preparar tres tipos de liposomas que contenían SucPG con diferentes concentraciones de SucPG. El SucPG que se ha de usar en el ejemplo 1 fue de un tipo que tenía un grupo n-decilo de C10 como un grupo alquilo y se sintetizó por un método documentado (Kono K. et al., J. Controlled Reléase, 68, 225-235 (2000); Kono K. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1325, 143-154 (1997); o Kono K. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1 193, 1 -9 (1994)). De manera específica, poli(epiclorohidrina) se sometió a reacción en dimetilformamida en presencia de acetato de potasio a 175°C durante 6 horas para preparar acetato de poliglicidilo, que a su vez se sometió a reacción en metilcarbitol en presencia de acetato de potasio a 150°C durante 1 hora para sintetizar poli(glicidol). Por lo tanto, el polímero sintetizado poli(glicidol) se hizo reaccionar con anhídrido succínico en ?,?-dimetilformamida a 80°C durante 6 horas para preparar SucPG. Para preparar liposomas, el procedimiento descrito en el documento que no es patente 1 se puede adoptar. De manera específica, 2 µ????ße de DPPC, 2 µ????ße de DOPE, y SucPG se disolvieron en un solvente y se mezclaron en un matraz cónico. Los lípidos se secaron en un evaporador giratorio y se colocaron durante 30 minutos bajo vacio en un desecador. Como un antígeno modelo, 4 mg/ml de ovalbúmina (OVA) se añadió y la mezcla se incubó a 35-40°C durante 3 minutos, seguido por acción de remolino vigorosa para dispersar la película de lípido. De esta manera, el antígeno modelo OVA se encapsuló en los liposomas. Cualquier OVA que no era encapsulado en los liposomas era removido por centrifugación repetida a 14000 g durante 20 minutos a 4°C para purificar los liposomas que tenían el antígeno modelo OVA encapsulado en el mismo. De esta manera se prepararon vesículas multilaminares (OVA-SucPG-liposomas) (MLV).
EJEMPLO 2 Estudio de respuesta inmune a partir de administración transmucosa de vacuna en liposomas de poli(glicidol) succinilado (SucPG) El propósito de este ejemplo fue estudiar la respuesta inmune de administración transmucosa de una vacuna en los liposomas que contenían SucPG preparados en el ejemplo 1 , en comparación con una vacuna en los liposomas libres de SucPG. La vacuna en los liposomas que contenía SucPG se preparó como se describe en el ejemplo 1 . Por otra parte, la vacuna en los liposomas libres de SucPG fueron una vacuna en vesículas multilaminares (OVA-liposomas) (MLV) que se prepararon encapsulando OVA en una composición de lípído que consistía de DPPC y DOPE en una relación molar de 1 :1. Los dos tipos de vacunas así preparados, uno en los OVA-SucPG-liposomas y el otro en los OVA-liposomas, así como una vacuna únicamente compuesta de OVA se administraron transnasalmente a ratones BALB/c dos veces en un intervalo de 7 días, cada vez para dar 100 µg por ratón de OVA. Siete días después de la administración final del inmunógeno, 0.1 mi de sangre se tomó del plexo venoso orbital y el suero recolectado de la sangre se usó para estudiar la producción de anticuerpos anti-OVA (IgM, IgG, e IgE) por el procedimiento de ELISA. También, siete días después de la administración final, el fluido intestinal se recolectó y se estudió para la producción de anticuerpos anti-OVA (IgA e IgG) mediante el procedimiento de ELISA. Además, el suero inmune obtenido se usó para hacer el análisis para subclases anti-OVA-lgG por el procedimiento de ELISA. Los resultados se muestran en las figuras 1 a 3. La figura 1 muestra los resultados de inducción de clase de anticuerpo en el suero con respecto a la respuesta inmune de inmunización transnasal de los ratones BALB/c con la vacuna en los OVA-SucPG-liposomas, la vacuna en los OVA-liposomas, y la vacuna únicamente compuesta de OVA; la columna negra muestra el resultado de inmunización con OVA únicamente (OVA); las columnas grises muestran el resultado de inmunización con los OVA-liposomas (OVA-lipo); y las columnas blancas muestran el resultado de inmunización con los OVA-SucPG-liposomas (OVA-SucPG-lipo). La figura 2 muestra los resultados específicos con las subclases de anticuerpo antiOVA-IgG que fueron inducidas en el suero. La figura 3 muestra los resultados de inducción de clase de anticuerpo en el fluido intestinal para el caso de inmunización transnasal. En las figuras 2 y 3, los inmunógenos asociados con las columnas respectivas son los mismos que se explicaron anteriormente en conexión con la figura 1 . A partir de los resultados mostrados en la figura 1 , se puede ver que cuando los ratones BALB/c fueron inmunizados intranasalmente con la variedad de inmunogenos, anticuerpos de las clases IgA e IgG se produjeron en los cuerpos de los animales, con la producción del anticuerpo de clase IgG siendo generalmente mayor que el del anticuerpo de clase IgA. Para cada clase de anticuerpo, la relación entre el tipo de vehículo de vacuna y la cantidad de producción de anticuerpo se investigó; se mostró que, en comparación con el caso de inmunización con la vacuna únicamente compuesta de OVA o con la vacuna en los OVA-liposomas, la inmunización en la vacuna en los OVA-SucPG-liposomas fue capaz de producción de anticuerpos en una eficiencia significativamente alta (p<0.0027). Además, los resultados mostrados en la fórmula 2 indican que la inmunización con la vacuna en los OVA-SucPG-liposomas podría inducir no sólo lgG1 que era una subclase de IgG de tipo Th2 (inmunidad humoral) sino también lgG2a e lgG3 que fueron subclases IgG del tipo Th1 (inmunidad celular). Por otra parte, cuando se efectuó inmunización usando la vacuna en los OVA-liposomas o la vacuna únicamente compuesta de OVA, lgG1 fue prácticamente todo el anticuerpo que se pudo producir. Además, para la cantidad de producción de ese anticuerpo lgG1 , se mostró que la inmunización con la vacuna en los OVA-SucPG-liposomas fue capaz de producción de anticuerpo en una eficiencia significativamente alta (p<0.01 1 ) en comparación con el caso de inmunización con las vacunas en otros vehículos de vacunas (la vacuna en los OVA-liposomas y la vacuna únicamente compuesta de OVA).
Además, la figura 3 muestra que el uso transnasal de la vacuna en los OVA-SucPG-liposomas fue capaz de producción de anticuerpo eficiente en el fluido intestinal en comparación con la vacuna en los OVA-liposomas. Por consiguiente, se obtuvieron las siguientes observaciones generales de administración de transmucosa de la vacuna en los liposomas que contenían SucPG: fue capaz de introducción de antígeno eficiente en células que presentaban antígeno, induciendo finalmente producción de anticuerpo alta en la sangre así como producción de anticuerpo alta en el tracto gastrointestinal; y fue potencialmente capaz de inducir no sólo en inmunidad humoral sino también respuesta inmune celular.
EJEMPLO 3 Inducción de respuesta inmune celular de administración transmucosa de vacuna en liposomas que contienen SucPG Puesto que se mostró en el ejemplo 2 que la inmunización con la vacuna en los liposomas que contenían SucPG por administración transmucosa del antígeno tuvieron el potencial para inducir respuesta inmune celular, el ejemplo 3 se condujo para estudiar la capacidad para ejercer la respuesta inmune celular para el caso de usar la vacuna en los liposomas que contenían SucPG. La vacuna en los OVA-SucPG-líposomas preparados en el ejemplo 1 se administró transnasalmente a ratones BALB/c dos veces en un intervalo de 7 días, cada vez para dar 100 µg por ratón de OVA. Siete días después de la administración final, los ratones fueron sacrificados y los bazos fueron recolectados y sometidos a centrifugación por gradiente de densidad para purificar los linfocitos del bazo. De los linfocitos del bazo purificados, se extrajo ARN total usando TRIzol™ (Invitrogen) e IFN-? que fue un índice de inmunidad celular y IL-4 se verificaron para expresión de ARNm por la técnica de RT-PCR. Antes que nada, ADNc se sintetizó a partir del ARN total. El ARN total (1 g a 5 se mezcló con un iniciador de oligo(dT) 2-i8 (500 ng) y dNTP Mix (10 nmoles) para hacer un volumen total de 12 µ?; la mezcla se sometió a reacción a 65°C durante 5 minutos y se extinguió sobre hielo. Subscuentemente, 4 µ? de regulador de pH 5 x First-Strand, 2 µ? de DTT 0.1 M y 1 µ? de inhibidor de ribonucleasa recombinante RNaseOUT( (40 unidades/(l) (Invitrogen) se añadieron y después de una reacción de 2 minutos a 42°C se añadió transcriptasa inversa II SuperScript( (Invitrogen) en una cantidad de 200 unidades. Después de una-reacción adicional de 50 minutos a 42°C, la transcriptasa inversa fue inactivada al realizar una reacción a 70°C durante 15 minutos. Un microlitro del ADNc resultante, 2.5 pmoles de cada uno de los iniciadores identificados más adelante, 37.5 nmoles de MgCI2, 10 nmoles de mezcla de dNTP, y 1 unidad de ADN polimerasa Taq (Invitrogen) se añadieron a un regulador de pH de PCR para hacer un volumen total de 25 µ? y la reacción de PCR se realizó en TaKaRa PCR Thermal Cycler MP TP3000 (TaKaRa). La reacción de PCR consistió de una reacción de 5 minutos a 94°C, seguida por 35 ciclos, en los cuales cada una consistió de una reacción de 94°C x 45-seg, una reacción de 60°C x 45-seg y una reacción de 72°C x 2-min, y la reacción final a 72°C durante 7 minutos. Después del PCR, la muestra se sometió a electroforesis sobre un gel de agarosa al 2% y se hizo visible tiñendo con bromuro de etidio. En el ejemplo 3, se usaron los siguientes iniciadores para amplificar el gen IFN-? de ratón: iniciador hacia adelante; 5'-tgcatcttggcttgcagctcttcctcatggc-3' (SEQ ID NO: 1 ) y iniciador de reversa: 5'-tggacctgtgggttgttgacctcaaacttggc-3' (SEQ ID NO: 2); y se usaron los siguientes iniciadores para amplificar el gen IL-4 de ratón: iniciador hacia adelante; 5'-ccagctagttgtcatcctgctcttctttctcg-3' (SEQ ID NO: 3) y iniciador de reversa: 5'-cagtgatgtggacttggactcattcatggtgc-3' (SEQ ID NO: 4), cada uno de estos iniciadores estando disponible de CLONTEC. Como iniciadores para amplificar un gen G3PDH de ratón de control se usaron los siguientes: iniciador hacia adelante: 5'-accacagtccatgccatcac-3' (SEQ ID NO: 5) y iniciador de reversa: 5'-tccaccaccctgttgctgta-3' (SEQ ID NO: 6).
Los resultados de medición para la expresión de ARNm de IFN-? y IL-4 se muestran en la figura 4. En la figura 4: la franja 1 muestra los resultados de RT-PCR realizados usando el control positivo como una plantilla; la franja 2 muestra el resultado de RT-PCR realizado usando como una plantilla el ARN total derivado de los ratones de control negativos a los que se inyectaron intraperitonealmente 200 µ? de solución salina fisiológica; la franja 3 muestra el resultado de RT-PCR realizado usando como una plantilla el ARN total derivado de los ratones inmunizados intraperitonealmente con OVA-SucPG-liposomas; y la franja 4 muestra los resultados de RT-PCT realizado usando como una plantilla el ARN total derivado de los ratones de control negativos inmunizados intraperitonealmente con SucPG-liposomas libre de OVA. Como se muestra en la figura 4, resultó claro que el ARNm de IFN-? que fue un índice de reacción inmune celular y el ARNm de IL-4 que fue un índice de reacción inmune humoral se expresaron ambos en los línfocitos del bazo de ratones inmunizados con los OVA-SucPG-liposomas. En el ejemplo 3, los línfocitos del bazo purificados también se cultivaron en un medio complementado con OVA durante 5 días y las cantidades de IFN-? y IL-4 que fueron liberadas en el sobrenadante del cultivo se midieron como índices de inmunidad celular e inmunidad humoral, respectivamente. Para cuantificar el IFN-? y IL-4 en el sobrenadante de cultivo, se usaron los equipos de cuantificación pertinentes (Endogen). Los resultados de cuantificación de las cantidades de IFN-? y IL-4 liberadas en el sobrenadante del cultivo de línfocitos del bazo se muestran en las figuras 5A-5B. En las figuras 5A-5B: la franja 1 muestra la cantidad de IFN-? y IL-4 como se produjo a partir de los linfocitos del bazo derivados de los ratones de control negativos inmunizados intranasalmente con los SucPG-liposomas libres de OVA, y la franja 2 muestra la cantidad de IFN-? o IL-4 como se produjo a partir de los linfocitos del bazo derivados de los ratones inmunizados intranasalmente con los OVA-SucPG-liposomas. Como se muestra en las figuras 5A-5B, resultó claro que en el sobrenadante del cultivo de los linfocitos del bazo de los ratones inmunizados con los OVA-SucPG-liposomas, IFN-? que fue un índice de reacción inmune celular y IL-4 que fue un índice de reacción inmune humoral se produjeron ambos en niveles significativamente altos estadísticamente (p<0.0001 ). A partir de los resultados descritos en los ejemplos 2 y 3, se ha mostrado que la vacuna en los liposomas que contienen SucPG de la presente invención, cuando se usa en inmunización transnasal, puede inducir no sólo inmunidad humoral sino también inmunidad celular y eso indica que los liposomas que contienen SucPG de la presente invención son útiles como un vehículo de antígeno para vacunas transmucosa.
EJEMPLO 4 Estudio de respuesta inmune de a partir de administración no transmucosa de vacunas en liposomas de poli(glicidol) succinilado (SucPG) El propósito de este ejemplo fue estudiar la respuesta inmune a partir de la administración no transmucosa de una vacuna en los liposomas que contenían SucPG preparados en el ejemplo 1 , en comparación con una vacuna en los liposomas libres de SucPG. La vacuna en los liposomas que contenía SucPG se preparó como se describe en el ejemplo 1 . Por otra parte, la vacuna en los liposomas libres de SucPG fue una vacuna en vesículas multilamínares (OVA-liposomas) (MLV) que se prepararon encapsulando OVA en una composición de lípido que consistía de DPPC y DOPE a una relación molar de 1 :1 . Los dos tipos de vacunas así preparados, uno en los OVA-SucPG-liposomas y el otro en los OVA-liposomas, así como una vacuna únicamente compuesta de OVA se administraron intraperitonealmente a ratones BALB/c dos veces en un intervalo de 7 días, cada vez para dar 100 (g por ratón de OVA. Siete días después de la administración final del inmunógeno, 0.1 mi de sangre se tomó del plexo venoso orbital y el suero recolectado de la sangre se usó para estudiar la producción de anticuerpos anti-OVA (IgM, IgG, e IgE) por el procedimiento de ELISA. Además, el suero inmune obtenido se usó para hacer el análisis para subclases anti-OVA-lgG por el proced imiento de ELISA. Los resultados se muestran en las figuras 6 y 7. La figura 6 muestra los resultados para respuesta inmune de inmunización intraperitoneal de los ratones BALB/c con la vacuna en los OVA-SucPG-liposomas, la vacuna en los OVA-liposomas, y la vacuna únicamente compuesta de OVA; las columnas negras muestran los resultados de inmunización únicamente con OVA (OVA); las columnas grises muestran los resultados de la inmunización con los OVA-liposomas (OVA-lipo); y las columnas blancas muestran los resultados de inmunización con OVA-SucPG-liposomas (OVA-SucPG-lipo). La figura 7 muestra los resultados con las subclases de anticuerpo antiOVA-lgG y los inmunógenos asociados con las columnas respectivas son las mismas que se explicaron anteriormente en conexión con la figura 6. A partir de los resultados mostrados en la figura 6, se puede ver que cuando los ratones BALB/c fueron inmunizados intraperitonealmente con la variedad de inmunógenos, anticuerpos de las clases IgM e IgG se produjeron en los cuerpos de los animales, con la producción del anticuerpo de clase IgG siendo generalmente mayor que el del anticuerpo de clase IgM. Para cada clase de anticuerpo, la relación entre el tipo de vehículo de vacuna y la cantidad de producción de anticuerpo se investigó; se mostró que, en comparación con el caso de inmunización con la vacuna únicamente compuesta de OVA, el caso de inmunización con la vacuna en los OVA-liposomas produjeron una mayor cantidad de anticuerpo pero no se encontró diferencia significativa como resultado de la prueba de t; por otra parte, una comparación entre el caso de inmunización con la vacuna en los OVA-liposomas y el caso de inmunización con la vacuna en los OVA-SucPG-liposomas mostró que la inmunización con la vacuna en los OVA-SucPG-liposoma fue capaz de producción de anticuerpos en una eficiencia marcadamente alta (p<0.0019). Además, los resultados mostrados en la formula 7 indican que la inmunización con la vacuna en los OVA-SucPG-liposomas podría inducir no sólo lgG1 que era una subclase de IgG de tipo Th2 (inmunidad humoral) sino también lgG2a e lgG3 que fueron subclases IgG del tipo Th1 (inmunidad celular). Por otra parte, cuando se efectuó inmunización usando la vacuna en los OVA-liposomas o la vacuna únicamente compuesta de OVA, lgG1 fue prácticamente todo el anticuerpo que se pudo producir. Además, para la cantidad de producción de ese anticuerpo lgG1 , se mostró que la inmunización con la vacuna en los OVA-SucPG-liposomas fue capaz de producción de anticuerpo en una eficiencia marcadamente alta (p<0.019) en comparación con el caso de inmunización con las vacunas en otros vehículos de vacunas (la vacuna en los OVA-liposomas y la vacuna únicamente compuesta de OVA). Por consiguiente, se obtuvieron las siguientes observaciones generales de administración no transmucosa de la vacuna en los liposomas que contenían SucPG: fue capaz de introducción de antígeno eficiente en células que presentaban antígeno, induciendo finalmente producción de anticuerpo alta; y fue potencialmente capaz de inducir no sólo inmunidad humoral sino también respuesta inmune celular.
EJEMPLO 5 Inducción de respuesta inmune celular de administración no transmucosa de vacuna en liposomas que contienen SucPG Puesto que se mostró en el ejemplo 4 que la inmunización con la vacuna en un antígeno usando los liposomas que contenían SucPG tuvo el potencial para inducir respuesta inmune celular, el ejemplo 5 se condujo para estudiar la capacidad para ejercer la respuesta inmune celular para el caso de usar los liposomas que contienen SucPG. Los OVA-SucPG-liposomas preparados en el ejemplo 1 se administraron intraperitonealmente a ratones BALB/c dos veces en un intervalo de 7 días, cada vez para dar 100 (g por ratón de OVA. Siete días después de la administración final, los ratones fueron sacrificados y el bazo se recolectó y se sometió a centrifugación por gradiente de densidad para purificar los linfocitos del bazo. Usando los linfocitos del bazo así purificados, IFN-? y IL-4 se midieron para expresión de ARNm por la técnica de RT-PCR y las cantidades de IFN-? y IL-4 liberadas en el sobrenadante del cultivo se midieron por el procedimiento de ELISA como se describe en el ejemplo 3. Los resultados de medición para la expresión de ARNm de IFN-? y IL-4 se muestran en la figura 8. En la figura 8: la franja 1 muestra el resultado de RT-PCR realizado usando como una plantilla el ARN total derivado de los ratones inmunizados intraperitonealmente con los OVA-SucPG-liposomas; la franja 2 muestra el resultado de RT-PCR realizado usando un control positivo como una plantilla; la franja 3 muestra el resultado de RT-PCR realizado usando como una plantilla el ARN total derivado de los ratones de control negativos inmunizados intraperitonealmente con SucPG-liposomas libres de OVA; y la franja 4 muestra el resultado de RT-PCT realizado usando como una plantilla el ARN total derivado de los ratones de control negativos a los que se inyectaron intraperitonealmente 200 µ? de solución salina fisiológica. Como se muestra en la figura 8, resultó claro que el ARNm de IFN-? que fue un índice de reacción inmune celular y el ARNm de IL-4 que fue un índice de reacción inmune humoral se expresaron ambos en los linfocitos del bazo de ratones inmunizados con los OVA-SucPG-líposomas. Además, los resultados de cuantificación de las cantidades de IFN-? y IL-4 liberadas en el sobrenadante del cultivo de linfocitos del bazo se muestran en las figuras 9A-9B. En las figuras 9A-9B: la franja 1 muestra la cantidad de IFN-? y IL-4 como se produjo a partir de los linfocitos del bazo derivados de los ratones de control negativos inmunizados intraperitonealmente con SucPG-liposomas libres de OVA, y la franja 2 muestra la cantidad de IFN-? o IL-4 como se produjo a partir de los linfocitos del bazo derivados de los ratones inmunizados intraperitonealmente con los OVA-SucPG-liposomas. Como se muestra en las figuras 9A-9B, resulta claro que en el sobrenadante del cultivo de los linfocitos del bazo de los ratones inmunizados con los OVA-SucPG-liposomas, IFN-? que fue un índice de reacción inmune celular e IL-4 que fue un índice de reacción inmune humoral fueron producidos ambos en niveles significativamente altos estadísticamente (p<0.0001 ). A partir de los resultados descritos en los ejemplos 4 y 5, se ha mostrado que la vacuna en los liposomas que contenían SucPG de la presente invención, aun cuando se usa en inmunización no transnasal, puede inducir no sólo inmunidad humoral sino también inmunidad celular como en el caso de inmunización transnasal y esto indica que los liposomas que contienen SucPG de la presente invención también son útiles como un vehículo de antígeno para vacunas no transmucosa.
EJEMPLO 6 Inmunización oftálmica (transmucosa) de pollos con vacuna en antígeno- SucPG-liposomas de Salmonella El propósito de este ejemplo fue estudiar la respuesta inmune de administración oftálmica (transmucosa) a pollos de una vacuna en liposomas que contienen SucPG que contenían antígeno de Salmonella enteritidis como un ¡nmunógeno El antígeno de Salmonella enteritidis o el inmunógeno para ser usado en este ejemplo, se preparó de la siguiente manera. Primero, de Salmonella enteritidis (cepa 1227) se inoculó en un medio de infusión de corazón (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) y después de cultivarse a 37°C durante 14 horas, 7 x 1014 CFU de la bacteria de Salmonella enteritidis se cosechó. La bacteria de Salmonella enteritidis cosechada fue inactivada por desnaturalización con una cantidad excesiva de; después de remover la formalina, la sonicación se condujo para preparar un fluido antigénico. Una vacuna en liposomas que contenían SucPG que contenían el antígeno de de Salmonella enteritidis preparado (vacuna en antígeno-SucPG-liposomas de Salmonella enteritidis) se preparó por un método que fue básicamente el mismo que el procedimiento descrito en el ejemplo 1 . La vacuna así preparada en antígeno-SucPG-liposomas de Salmonella enteritidis se administró una vez a 5 pollos (leghorn blancos) de 3 semanas de edad después del nacimiento al aplicar a los ojos gotas para dar 100 ng por pollo de antígeno de Salmonella enteritidis. En los días 14 y 35 después de la administración del inmunógeno (designado como "2 semanas (5 semanas de edad)" y "5 semanas (8 semanas de edad)", respectivamente), 2.0 mi de sangre se recolectaron de la vena del ala (también llamada vena basílica) y usando el suero recolectado de la muestra de sangre, la producción de anticuerpo anti-antígeno de Salmonella enteritidis (IgG o IgA) se estudió por el procedimiento de ELISA. Como un control, se usó suero que se había obtenido de pollos que sin embargo fueron inmunizados con antígeno de Salmonella enteritidis (designado como pre (3 semanas de edad)). Los resultados se muestran en las figuras 10A-10B. En las figuras 10A-10B, las columnas negras muestran los resultados para el título de anticuerpo del anticuerpo IgG (figura 10A) y las columnas blancas muestran el resultado para el título de anticuerpo del anticuerpo IgA (figura 10B). El símbolo "*" indica la presencia de una diferencia significativa (p<0.0001 ) de los títulos de anticuerpo de los anticuerpos en pollos antes de la inmunización (día 0). Los datos muestran la media ± error estándar. A partir de los resultados mostrados en las figuras 10A-10B, se puede ver que cuando se inmunizó a los pollos por administración oftálmica de la vacuna en antígeno-SucPG-liposomas de Salmonella enteritidis, ambas clases de IgG e IgA de anticuerpo se produjeron marcadamente en el cuerpo en comparación con el caso de "pre (3 semanas de edad)" pero desde un punto de vista a largo plazo (5 semanas (8 semanas de edad) después de la administración final del inmunógeno), la clase IgG de anticuerpo tendió a producirse en mayor cantidad que la clase de anticuerpo IgA. A partir de estos resultados, se ha mostrado que la inmunización de pollos por administración oftálmica (transmucosa) de la vacuna en antígeno-SucPG-liposomas de Salmonella enteritidis puede inducir producción de anticuerpos alta en la sangre.
EJEMPLO 7 Inmunización transnasal (transmucosa) de ratones con vacuna en antígeno-SucPG-liposomas en Trypanosoma El propósito de este ejemplo fue estudiar la respuesta inmune de administración transnasal (transmucosa) a ratones de una vacuna en liposomas que contiene SucPG que contenía antígeno de Trypanosoma brucei como un inmunógeno. Para obtener el antigeno de T. brucei, el inmunógeno que se ha de usar en este ejemplo, protozoario T. brucei se recolectó. El método de recolección fue de conformidad con un método publicado (Lanham, S.M., Nature, 218, 1273-1274 (1968)). Específicamente, protozoarios T. brucei (1 x 105 parásitos) fueron inoculados en las cavidades abdominales de ratas Wistar (Japan SLC, Inc.) y 4 días más tarde, sangre entera se recolectó de sus corazones. La sangre recolectada se trató con heparina (10 unídades/ml) para la inhibición de protección contra coagulación, y la linfa cuajada se recolectó centrifugando (1300 g x 10 min). Los protozoarios fueron purificados y cosechados de la linfa cuajada recolectada por medio de una columna de celulosa DE52 (Whatman). Los protozoarios T. brucei cosechados se trituraron por sonicacion para obtener el antígeno de T. brucei. Una vacuna en liposomas que contenían SucPG que contenían el antígeno de T. brucei preparado (vacuna en antígeno-SucPG-liposomas de T. brucei) se preparó por un método que fue básicamente el mismo que el procedimiento descrito en el ejemplo 1 . La vacuna así preparada en antígeno-SucPG-liposomas de T. brucei se administró transnasalmente a cinco ratones BALB/c (Japan SLC, Inc.) de 6 semanas de edad desde el nacimiento para dar 100 por ratón de antígeno de T. brucei, y 2 semanas más tarde la misma cantidad de antigeno de T. brucei se reforzó adicionalmente por vía transnasal para efectuar inmunización. Catorce días después de la administración inicial del inmunógeno (día 14) y siete días después de la administración final del inmunógeno (día 21 ), 0.1 mi de sangre se obtuvieron del plexo venoso orbital y el suero recolectado de la sangre se usó para estudiar la producción de anticuerpos anti-antígeno de T. brucei (IgG e IgM) por el procedimiento de ELISA. Como un control, se usó suero que se había obtenido de ratones individuales que sin embargo fueron inmunizados con el antígeno de T. brucei (día 0). Los resultados se muestran en la figura 1 1 . En la figura 1 , las columnas negras muestran los resultados para el título de anticuerpo del anticuerpo IgM y las columnas blancas muestran los resultados para el título de anticuerpo del anticuerpo IgG. El símbolo "#" indica la presencia de una diferencia significativa en p<0.0012 a partir de los títulos de anticuerpo en ratones antes de la inmunización (día 0), el símbolo "$" indica la presencia de una diferencia significativa en p<0.0006, y el símbolo "*" indica la presencia de una diferencia significativa en p<0.0001. Los datos muestran media ± error estándar. A partir de los resultados mostrados en la figura 1 1 , se puede ver que cuando los ratones fueron inmunizados por administración transnasal de la vacuna en antígeno-SucPG-liposomas en T. brucei, ambas clases de IgM e IgG de anticuerpo se produjeron marcadamente en el cuerpo en comparación con el caso del día 0 y, en general, la clase IgG de anticuerpo tendió a ser producida en una mayor cantidad IgM de anticuerpo. A partir de estos resultados, se ha mostrado que la inmunización de ratones por administración transnasal (transmucosa) de la vacuna en antígeno-SucPG-liposomas de T. brucei puede inducir producción de anticuerpos alta en la sangre.
EJEMPLO 8 Inmunización transnasal (transmucosa) de vacas lecheras con vacuna en antígeno-SucPG-liposomas de Staphylococcus aureus El propósito de este ejemplo fue estudiar la respuesta inmune de administración transnasal (transmucosa) a vacas de una vacuna en liposomas que contienen SucPG que contenía antígeno de Staphylococcus aureus como un inmunógeno. Para preparar el antígeno de S. aureus el inmunógeno que se ha de usar en este ejemplo, S. aureus (cepa Cowan I) fue inoculado primero en un medio LB (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) y después de cultivarse a 37°C durante 14 horas, la bacteria S. aureus se cosechó. La bacteria S. aureus cosechada fue inactivada por desnaturalización con una cantidad excesiva de formalina; después de la remoción de formalina, se condujo sonicación para preparar un fluido antigénico. Una vacuna en liposomas que contenía SucPG que contenían el antígeno de S. aureus preparado (vacuna en antígeno-SucPG-liposomas de S. aureus) se preparó por un método que fue básicamente el mismo que el procedimiento descrito en el ejemplo 1 . La vacuna así preparada en antígeno-SucPG-liposomas de S. aureus se administró por vía transnasal a tres vacas lecheras Holstein para dar 5 mg por vaca de antígeno de S. aureus, y 14 días más tarde la misma cantidad de antígeno de S. aureus fue reforzada adícionalmente por vía transnasal para efectuar inmunización. Catorce días después de la administración inicial del inmunógeno (día 14) y 7 y 14 días después de la administración final del inmunógeno (día 21 y día 28), 5 mi de sangre se tomaron de la vena cervical y el suero recolectado de la sangre se usó para estudiar la producción de anticuerpos anti-antígeno de S. aureus (IgA e IgG) por el procedimiento de ELISA. Como un control, se usó suero que se había obtenido de vacas lecharas individuales que habían de ser inmunizadas con el antígeno de S. aureus (día 0). Los resultados se muestran en la figura 12. En la figura 12, las columnas negras muestran los resultados del título de anticuerpo del anticuerpo IgA y las columnas blancas muestran los resultados para el título de anticuerpo del anticuerpo IgG. El símbolo "#" indica la presencia de una diferencia significativa en p<0.018 a partir de los títulos de anticuerpo en vacas lecheras individuales antes de la inmunización (día 0), el símbolo "&" indica la presencia de una diferencia significativa en p<0.039, y el símbolo "*" indica la presencia de una diferencia significativa en p<0.0076, el símbolo "@" indica la presencia de una diferencia significativa en p<0.0001 , el símbolo "†" indica la presencia de una diferencia significativa en p<0.017. Los datos muestran media ± error estándar. A partir de los resultados mostrados en la figura 12, se puede ver que cuando las vacas lecheras fueron inmunizadas por administración transnasal de la vacuna en antígeno-SucPG-liposomas de S. aureus, niveles casi comparables de las clases IgG e IgA de anticuerpo se produjeron marcadamente en la sangre en comparación con el caso del día 0. Catorce días después de la administración inicial del inmunógeno (día 14) y 7 y 14 días después de la administración final del inmunógeno (día 21 y día 28), la leche se recolectó de las vacas y se estudió para la producción de anticuerpos anti-antígeno de S. aureus (IgG e IgA) por el procedimiento de ELISA. Como controles, se usó leche que había sido obtenida al ordeñar vacas que iban a ser inmunizadas con el antígeno de S. aureus (día 0). Los resultados se muestran en la figura 13. En la figura 13, las columnas negras muestran los resultados del título de anticuerpo del anticuerpo IgA y las columnas blancas muestran los resultados para el título de anticuerpo del anticuerpo IgG. El símbolo "#" indica la presencia de una diferencia significativa en p<0.0046 a partir de los títulos de anticuerpo en vacas lecheras individuales antes de la inmunización (día 0), el símbolo "&" indica la presencia de una diferencia significativa en p<0.054, el símbolo "*" índica la presencia de una diferencia significativa en p<0.01 1 , el símbolo "@" índica la presencia de una diferencia significativa en p<0.02, el símbolo "†" indica la presencia de una diferencia significativa en p<0.25. Los datos muestran media ± error estándar. A partir de los resultados mostrados en la figura 13, se puede ver que cuando las vacas lecheras fueron inmunizadas por administración transnasal de la vacuna en antígeno-SucPG-liposomas de S. aureus, ambas clases de IgG e IgA de anticuerpo se produjeron marcadamente en la leche en comparación con el caso del día 0 y, en general, la clase IgA de anticuerpo tendió a ser producida en una cantidad mayor que la clase IgG de anticuerpo. A partir de esos resultados, se ha mostrado que la inmunización de vacas lecheras por administración transnasal (transmucosa) de la vacuna en antígeno-SucPG-liposomas de S. aureus puede inducir marcadamente producción de anticuerpos alta tanto en la sangre como en la leche.
EJEMPLO 9 Inmunización oral de carpa con vacuna en antígeno-SucPG-liposomas de Aeromonas salmonicida El propósito de este ejemplo fue estudiar la respuesta inmune de administración oral (transmucosa) a carpa de una vacuna en liposomas que contenían SucPG que contenían antígeno de Aeromonas salmonicida como un inmunógeno. El antígeno de A. salmonicida, o el inmunógeno que se ha de usar en este ejemplo, se preparó de la siguiente manera. Primero, A. salmonicida (cepa T1031 ) fue inoculada en un medio de infusión al corazón y después de cultivarse a 20°C durante 24 horas, la bacteria A. salmonicida se cosechó y la bacteria A. salmonicida cosechada fue inactivada por desnaturalización con una cantidad excesiva de formalina; después de la remoción de formalina, se condujo sonicación para preparar un fluido antigénico. Una parte del antígeno de A. salmonicida se utilizó inmediatamente como un inmunógeno mientras que otra parte se utilizó para preparar una vacuna en liposomas que contenían SucPG que contenían el antígeno de A. salmonicida. La vacuna en liposomas que contienen SucPG que contenía el antígeno A. salmonicida inactivado (vacuna en liposomas que contenían SucPG de A. salmonicida) se preparó por un método que fue básicamente el mismo que el procedimiento descrito en el ejemplo 1 . La vacuna así preparada en antígeno-SucPG-liposomas de A. salmonicida se administró oralmente tres veces en intervalos de 2 semanas a seis carpas (distribuidas de Aquatic Life Conservation Research Center, Research Institute of Environment, Agruculture and Fisheries, Osaka Prefectural Government) para inmunización para dar 200 µg por carpa del antígeno de A. salmonicida. Como un control, sólo el antígeno de A. salmonicida se administró oralmente tres veces a intervalos de 2 semanas a cuatro carpas para inmunización para dar 200 ng por carpa del antígeno de A. salmonicida. En la administración inicial del inmunógeno (día 0) en su segunda administración (día 14), en su tercera administración (día 28) y 14 días después de su administración final (día 42), 1 mi de sangre se recogió del pedúnculo caudal de cada carpa y el suero recolectado de la muestra de sangre se usó para estudiar la producción de anticuerpo anti-antígeno de A. salmonicida por el procedimiento de ELISA. Como un control, se usó suero que se había obtenido de carpas individuales inmunizadas con el antígeno de A. salmonicida únicamente. Los resultados se muestran en la figura 14. En la figura 14, los círculos negros (·) indican el resultado para el título de anticuerpo del anticuerpo en la carpa oralmente inmunizada con la vacuna en antigeno-SucPG-liposomas de A. salmonicida mientras que los triángulos negros ( A ) indican los resultados para el título de anticuerpo del anticuerpo en la carpa oralmente inmunizada con el antígeno de A. salmonicida solo. El símbolo "*" indica la presencia de una diferencia significativa (p<0.01 ) del título de anticuerpo del anticuerpo en la carpa oralmente inmunizada con un antígeno de A. salmonicida solo. Los datos muestran la media ± error estándar. A partir de los resultaos mostrados en la figura 14, se puede ver que cuando las carpas fueron inmunizadas por administración ora l de la vacuna en antígeno-SucPG-liposomas en A. salmonicida, el título de anticuerpo del anticuerpo en la sangre se incrementó marcadamente en comparación con las carpas que fueron inmunizadas oralmente con el antígeno de A. salmonicida únicamente. Con base en estos resultados, 14 días después de la administración final de la vacuna en antígeno-SucPG-liposomas de A. salmonicida (día 42), el fluido intestinal y bilis fueron recolectados de la carpa y estudiados para la producción de anticuerpo anti-antígeno de A. salmonicida por el procedimiento de ELISA. Como controles, se usaron el fluido intestinal y bilis que habían sido obtenidos carpas no inmunizadas. Los resultados se muestran en las figuras 15A-15B para el título de anticuerpo del anticuerpo en el fluido intestinal (figura 5A) y para el título de anticuerpo del anticuerpo en la bilis (figura 15B). En cada panel, la columna negra se refiere a los resultados para el título de anticuerpo del anticuerpo en las carpas no inmunizadas mientras que la columna blanca se refiere al resultado para el título de anticuerpo del anticuerpo en las carpas inmunizadas con la vacuna en antígeno-SucPG-liposomas en A. salmonicida. El símbolo "*" indica la presencia de una diferencia significativa (p<0.01 ) del título de anticuerpo del anticuerpo en las carpas no inmunizadas. Los datos muestran media ± error estándar. A partir de los resultados mostrados en las figuras 15A-1 5B, se puede ver que cuando las carpas fueron inmunizadas por administración oral de la vacuna en antígeno-SucPG-liposomas en A. salmonicida, el título de anticuerpo del anticuerpo se incrementó marcadamente en cada uno del fluido intestinal y la bilis. Además, 14 días después de la administración de la vacuna en antígeno-SucPG-liposomas de A. salmonicida, seis carpas fueron sumergidas en una suspensión de la bacteria A. salmonicida (1 x 106 cfu/ml) du 60 minutos por lo que serían atacados por A. salmonicida; el cambio transicional subsecuente de su tasa de supervivencia se registró. Como controles, ocho carpas no inmunizadas se trataron de manera similar y el cambio transicional subsecuente de su tasa de supervivencia se registró. Los resultados se muestran en la figura 16. En la figura 16, los círculos negros (·) indican el cambio transicional de la tasa de supervivencia de la carpa oralmente inmunizada con la vacuna en antígeno-SucPG-liposomas de A. salmonicida mientras que los triángulos negros ( A ) indican el cambio transicional de la tasa de supervivencia de la carpa no inmunizada. Como resultado, la tasa de supervivencia de la carpa oralmente inmunizada con la vacuna en antígeno-SucPG-liposomas de A. salmonicida fue mayor que la tasa de supervivencia de la carpa no inmunizada. A partir de estos resultados, se mostró que incluso con la primera carpa, la inmunización por administración oral (transmucosa) de la vacuna en antígeno-SucPG-liposomas de A. salmonicida puede inducir la producción de anticuerpos alta en la sangre.
EJEMPLO 10 Inmunización transnasal (transmucosa) de ratones con vacuna en antígeno-SucPG-liposomas de Mycoplasma gallisepticum El propósito de este ejemplo fue estudiar la respuesta inmune de administración transnasal (transmucosa) a ratones de una vacuna en liposomas que contenían SucPG que contenían antígeno de Mycoplasma gallisepticum como un inmunógeno. El antígeno de Mycoplasma gallisepticum, el inmunógeno que se ha de usar en este ejemplo, se preparó de la siguiente manera. Primero, Mycoplasma gallisepticum (cepa S6) se inoculó en medio de Fray (Difco) complementado con un extracto de levadura fresco y después de cultivarse a 37°C durante 48 horas o más, 3.58 x 1011 CFU de la bacteria Mycoplasma gallisepticum se cosechó. La bacteria Mycoplasma gallisepticum cosechada fue inactivada por desnaturalización con una cantidad excesiva de formalina; después de la remoción de la formalina, se condujo la sonicación para preparar el fluido antigénico. Una vacuna en liposomas que contenían SucPG que contenían el antígeno de Mycoplasma gallisepticum preparado (vacuna en antígeno-SucPG-liposomas de Mycoplasma gallisepticum) se preparó por un método que fue básicamente el mismo que el procedimiento descrito en el ejemplo 1 . La vacuna así preparada en antigeno-SucPG-liposomas de Mycoplasma gallisepticum se administró transnasalmente a cinco ratones BALB/c (Japan SLC, Inc.) de 5 semanas de edad desde el nacimiento para dar 100 ig por cabeza de antígeno de Mycoplasma gallisepticum, y 2 semanas más tarde la misma cantidad de antígeno de Mycoplasma gallisepticum se reforzó adicionalmente por vía transnasal para efectuar la inmunización. Siete días después de la administración final del inmunógeno (día 21 ), 0.1 mi de sangre se tomó del plexo venoso orbital y el suero recolectado de la sangre se usó para estudiar la producción de anticuerpos anti-antígeno de M. gallisepticum (IgG e IgA) por el procedimiento de ELISA. Como un control, se usó suero que se había obtenido de ratones que iban a ser inmunizados con el antígeno de M. gallisepticum (día 0). Los resultados se muestran en la figura 17. La figura 17 muestra los resultados de inducción de clase de anticuerpo en suero con respecto a la respuesta inmune de administración transnasal de la vacuna en antígeno-SucPG-liposomas en M. gallisepticum a ratones; las columna negras muestran los resultados para el título de anticuerpo del anticuerpo IgG y la columna blanca muestra los resultados para el título de anticuerpo del anticuerpo IgA. A partir de los resultados mostrados en la figura 17, se puede ver que cuando los ratones fueron inmunizados por administración transnasal del antigeno de M. gallisepticum, ambas clases de IgG e IgA de anticuerpo se produjeron en el cuerpo y, en general, la clase IgG de anticuerpo tendió a ser producida en una cantidad mayor que la clase IgA de anticuerpo. El símbolo "#" indica la presencia de una diferencia significativa en p<0.0063 de los títulos de anticuerpo en los ratones inmediatamente antes de la inmunización con el antígeno de M. gallisepticum (día 0) y el símbolo "*" indica la presencia de una diferencia significativa en p<0.0003. Los datos muestran la media ± error estándar. Por consiguiente, se ha mostrado que la administración transmucosa de la vacuna del antígeno de M. gallisepticum por medio de los liposomas que contienen SucPG puede inducir producción de anticuerpos alta en la sangre y que es potencialmente capaz de inducir no sólo inmunidad humoral sino también respuesta inmune celular.
EJEMPLO 11 Inmunización transnasal (transmucosa) de ratones con vacuna en antígeno-SucPG-liposomas de virus de enfermedad de Newcastle El propósito de este ejemplo fue estudiar la respuesta inmune de administración transnasal (transmucosa) a ratones de una vacuna en liposomas que contenían SucPG que contenían antígeno de virus de enfermedad de Newcastle como un inmunógeno. El antígeno de virus de enfermedad de Newcastle, el inmunógeno que se ha usado en este ejemplo, se preparó a partir de una vacuna viva comercial de enfermedad de Newcastle que se sometió a sonicación para preparar un fluido antigénico. Una vacuna en liposomas que contenían SucPG que contenían el antígeno de virus de enfermedad de Newcastle así preparado (vacuna en antígeno-SucPG-liposomas de virus de enfermedad de Newcastle) se prepararon por un método que fue básicamente el mismo que el procedimiento descrito en el ejemplo 1. La vacuna así preparada en antígeno-SucPG-liposomas de virus de enfermedad de Newcastle se administró transnasalmente a cinco ratones BALB/c (Japan SLC, Inc.) de 5 semanas de edad desde el nacimiento para dar 100 ig por cabeza de antígeno de virus de enfermedad de Newcastle, y 2 semanas más tarde la misma cantidad de antígeno de virus de enfermedad de Newcastle fue reforzada adicionalmente por vía transnasal para efectuar la inmunización. Siete días después de la administración final del inmunógeno (día 21 ), 0.1 mi de sangre se tomó del plexo venoso orbital y el suero recolectado de la sangre se usó para estudiar la producción de anticuerpos anti-antígeno de virus de enfermedad de Newcastle (IgG e IgA) por el procedimiento de ELISA. Como un control, se usó suero que se había obtenido de ratones que iban a ser inmunizados con el antígeno de virus de enfermedad de Newcastle (día 0). Los resultados se muestran en la figura 18. En la figura 18, la columna negra muestra el resultado para el título de anticuerpo del anticuerpo IgG y las columna blancas muestran el resultado para el título de anticuerpo del anticuerpo IgA. El símbolo "#" indica la presencia de una diferencia significativa en p<0.0027 de los títulos de anticuerpo en los ratones antes de la inmunización (día 0) y el símbolo "*" indica la presencia de una diferencia significativa en p<0.00122. Los datos muestran la media ± error estándar. A partir de los resultados mostrados en la figura 18, se puede ver que cuando los ratones fueron inmunizados por administración transnasal de la vacuna en antígeno-SucPG-liposomas de virus de enfermedad de Newcastle, ambas clases IgG e IgA de anticuerpo se produjeron marcadamente en el cuerpo en comparación con el caso del día O y, en general, la clase IgG de anticuerpo tendió a incrementar en un grado mayor de la clase IgA del anticuerpo. A partir de estos resultados, se ha mostrado que la inmunización de los ratones por administración transnasal (transmucosa) de la vacuna en antígeno-SucPG-liposomas de virus de enfermedad de Newcastle puede inducir producción de anticuerpos alta en la sangre.
Aplicabilidad industrial Al usar los vehículos de vacunas anteriormente descritos que comprenden liposomas que contienen poli(glicidol) succinilado, se pueden obtener vacunas eficientes que logren incrementos marcados en títulos de anticuerpo en comparación con el caso del uso de vehículos de vacunas que comprenden los liposomas convencionales. Además, las vacunas preparadas al usar los vehículos de vacuna anteriormente descritos son capaces de inducción eficiente no sólo de inmunidad humoral sino también inmunidad celular.

Claims (11)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES
1 .- Un vehículo de vacuna que comprende un liposoma que contiene poli(glicidol) succinilado, con un péptido o una proteína sirviendo como inmunógeno.
2. - El vehículo de vacuna de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque contiene 10 a 40% en peso de poli(glicidol) succinilado.
3. - El vehículo de vacuna de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque contiene 30% en peso de poli(glícidol) succinilado.
4. - El vehículo de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque el lípido que compone el liposoma comprende cualquiera de dioleil fosfatidiletanolamina (DOPE), diestearoil fosfatidiletanolamina (DSPE), dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS), dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC), diestearoil fosfatidilcolina (DSPC), dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC), lecitina de yema de huevo (PC huevo), o colesterol, o combinaciones de cualesquiera dos o más de los mismos.
5. - El vehículo de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque el liposoma comprende la combinación de dioleil fosfatidiletanolamina (DOPE) y diestearoil fosfatidiletanolamina (DSPE).
6. - El vehículo de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque permite que el inmunógeno de péptido o proteína en el liposoma sea internalizado dentro de una célula que presenta antígeno.
7. - El vehículo de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque es para administración transmucosa del inmunógeno de péptido o proteína contenido en el liposoma.
8. - El vehículo de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque es para administración no transmucosa del inmunógeno de péptido o proteína contenido en el liposoma.
9. - Una vacuna que tiene un inmunógeno de péptido o proteína incorporado en un vehículo de vacuna que comprende un liposoma que contiene poli(glicidol) succinilado, dicho inmunógeno ha de ser administrado para inmunización.
10. - La vacuna de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque es para inducir inmunidad celular contra el inmunógeno de péptido o proteína. 1 1 .- La vacuna de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque es también para inducir inmunidad humoral contra el inmunógeno de péptido o proteína. 12.- La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 1 1 , caracterizada además porque contiene 10 a 40% en peso de poli(glicidol) succinilado en el vehículo de vacuna. 13. - La vacuna de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque contiene 30% en peso de poli(glicidol) succinilado en el vehículo de vacuna. 14. - La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, caracterizada además porque el lípido que compone el liposoma del vehículo de vacuna comprende cualquiera de dioleil fosfatidiletanolamina (DOPE), diestearoil fosfatidiletanolamina (DSPE), dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS), dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC), diestearoil fosfatidilcolina (DSPC), dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC), lecitina de yema de huevo (PC huevo), o colesterol, o combinaciones de cualesquiera dos o más de los mismos. 15. - La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, caracterizada además porque el liposoma del vehículo de vacuna comprende la combinación de dioleil fosfatidiletanolamina (DOPE) y diestearoil fosfatidiletanolamina (DSPE). 16. - La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, caracterizada además porque permite que el inmunógeno de péptido o proteína en el liposoma sea internalizado dentro de una célula que presenta antígeno. 17. - La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16, caracterizada además porque es para administración transmucosa del inmunógeno de péptido o proteína. 18.- La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16, caracterizada además porque es para administración no transmucosa del inmunógeno de péptido o proteína. 19.- La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 18, caracterizada además porque el inmunógeno de péptido o proteína se selecciona del grupo que consiste de antígenos derivados de cualquiera de una bacteria, un virus y un protozoario. 20. - La vacuna de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque la bacteria Salmonella, Staphylococcus aureus, Aeromonas, y Micoplasma. 21 . - La vacuna de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque el virus es un virus de enfermedad de Newcastle. 22.- La vacuna de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque el protozoario es Trypanosoma.
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