CN102727876A - 抗沙门氏菌口服疫苗的制备工艺 - Google Patents

Abstract

一种抗沙门氏菌口服疫苗的制备工艺，首先构建表达沙门菌SEF14和SEF21菌毛抗原的大肠杆菌，再通过蛋白纯化技术将菌毛抗原提纯。将二棕榈酰磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰丝氨酸和胆固醇溶解在有机溶剂充分混合。将混合的脂类干燥，在混合脂质膜内加入一定量的SEF14和SEF21抗原，充分混合，接着进行脂质膜涡旋式分散，获得口服疫苗。本发明大大提高了沙门菌抗原的纯度，使生产制备工艺稳定、简单、可控，收率高，纯度高，本发明可有效抵抗酸性环境及机体酶系统的破坏作用，使生产的SEF14和SEF21菌毛蛋白抗原可以通过口服方式给药；而且，本发明完全减毒，高免疫原性，对环境不造成污染。

Description

抗沙门氏菌口服疫苗的制备工艺

技术领域

本发明涉及一种生物技术制药领域，更具体地说，涉及沙门氏菌口服疫苗的制备。

背景技术

据联合国粮食及农业组织和世界卫生组织对国际食品安全的调查结果表示，近几十年来，许多国家的食物传染疾病食源性疾病的发生率一直在上升，其与食物中微生物引起的疾病增多有关。世界各国细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的常列榜首。沙门氏菌病是一种人畜共患病，禽肉禽蛋是主要传播媒介，其特征是腹泻、发热、腹痛或痉孪、呕吐、头痛和恶心，严重时导致死亡。死亡病例多见于易感染人群，包括婴儿、老人和免疫系统缺损者。自二十世纪七十年代以来，南、北美洲和欧洲各国报告沙门氏菌肠炎发病率有了大幅度的提高。美国疾病预防和控制中心(CDC)估计美国的沙门氏菌发病率为每年1500000例，给美国人在医疗费用和生产率方面造成的损失估计每年高达23.29亿美元(以1998年美元计算)。CDC说，美国的沙门氏菌病肆虐42个州，引起上千人患病，其中毒事件与被沙门氏菌污染的鸡蛋有关，全美紧急召回数亿鸡蛋。

沙门氏菌(Salmonella)是一种革氏阴性杆菌，共有A，B，C1，C2，D，E1-E4，F，G，H，I等血清群。其血清型则很复杂，已确知有2000多种以上，其中最为普遍的是肠炎沙门氏菌。肠炎沙门氏菌是导致人类细菌性肠胃炎最常见的病原体(40-60％)。肠炎沙门氏菌感染的第一步是粘附于宿主肠粘膜上皮细胞表面，其过程是由沙门氏菌菌毛所介导的。目前，所报道的肠炎沙门氏菌菌毛有SEF14、SEF21、SEF17、SEF18、LPF、PEF和BFP。其中SEF14和SEF21在病原菌在粘膜上皮细胞粘附以及侵染过程中起关键作用。开发靶标为SEF14和SEF21抗体，可以抑制肠炎沙门氏菌菌毛与肠管粘膜中的糖脂质受体的结合，进而达到防治肠炎沙门氏菌感染的目的。

脂质体是由类脂质组成的人造细胞膜样小球体，主要由磷酸类脂、胆固醇、硬脂胺等组成的单层或多层双分子结构。脂质体既无毒性，又无免疫原性，并且在体内有可降解性，是目前最有希望成为理想的粘膜免疫佐剂之一。因脂质体因具有双层膜的保护，其与蛋白质抗原结合后，使蛋白质抗原稳定性更高，抗原不容易被胃酸以及蛋白酶所降解；脂质体能够定位于组织-粘膜相关样淋巴组织(MALT)中的M细胞(membraneous epithelial cell)激活T细胞及B细胞，并有效地引入细胞内增强机体的体液和细胞介导免疫应答；可减少抗原的剂量及接种次数；包裹有抗原的脂质体能被储存于巨噬细胞中缓慢释放，从而使机体长时间保持高效价抗体，延长疫苗使用期。因此，本专利采用脂质体包裹SEF14和SEF21抗原疫苗，有效保护SEF14和SEF21不被降解，使其在增强抗原性的基础上还可以用于口服。

随着该沙门氏菌污染的发展，国内外针对沙门氏菌疫苗市场销售金额和销售数量呈明显上升趋势，有着最为广泛的临床需求基础。我国由于缺乏具有自主知识产权的沙门氏菌疫苗，所用的疫苗均是外国进口疫苗，跨国医药公司纷纷进入中国，对我国沙门氏菌疫苗的自主创新造成了巨大的冲击。

申请者研发的脂质体包裹SEF14和SEF21疫苗对沙门氏菌预防具有潜在的应用价值。在前期研究的基础上，并按照我国SFDA颁布的相关法规和要求，改进工艺，提高其表达水平和纯化得率。同时建立了质量标准，补充了相应的临床前药理毒理研究资料。将脂质体包裹SEF14和SEF21疫苗开发成具有自主知识产权的新型沙门氏菌疫苗并推向产业化，造福全人类，具有极大的社会意义和广泛的市场意义。

目前，有关沙门菌疫苗的专利及制备研究的文章及专利如下：

(1)一种抗沙门菌单链抗体与跨膜蛋白融合蛋白的制备方法(专利公开号：200710305386.7)

本发明涉及一种用于制备抗沙门菌属O抗原单链抗体和跨膜蛋白的融合蛋白的方法。本发明还涉及包含所述融合基因的表达型重组体、包含所述表达型重组体的工程菌、由此工程菌表达和分离纯化的目的融合蛋白scFvLH-pVIII(和scFvHL-pVIII)以及此融合蛋白用于沙门菌属的临床检验诊断以及食品卫生诊断。

(2)一种快速检测沙门菌的方法(专利公开号：200810046809.2)

本发明属于食源性致病菌的快速检测技术，具体说是一种对沙门菌的环介导等温扩增(LAMP)检测方法。包括由样品处理试剂、LAMP反应试剂、BstDNA聚合酶的大片段、琼脂糖、溴氛蓝上样缓冲溶液、溴化乙锭溶液组成的试剂的配制，以及扩增产物的检测和沉淀产生的检测程序。其步骤是：首先设计特异性引物；其次是提取样品DNA；第三是反应体系。该法较之目前采用的传统细菌培养方法、免疫检测方法和其它分子生物学方法具有操作简单、快速、无需特殊仪器试剂且灵敏特异的优点。可应用于食品和其它样品中沙门菌的快速检测。

(3)沙门菌属抑制组合物(专利公开号：99813816.9)

沙门菌抑制组合物，其有效成分为：用含有蔗糖的培养基使属于明串珠菌(Leuconostoc)属、链球菌(Streptococcus)属、链杆菌(Streptobacterium)属的乳酸菌发酵，得到的发酵液自身，或者是用水混合性有机溶剂进行分级沉淀处理后，由所得上清而来的制备物。

(4)Lim S M，Jung H S，Kim M J，et al.Immunogenicity and safe-tyof Vi capsular polysaccharide typhoid vaccine in healthy per-sons inKorea[J].J Microbiol Biotechnol，2007，17(4)：611-615.

(5)Zhou W Z，Koo H W，Wang X Y，et al.Revaccination withlocally-produced vi typhoid polysaccharide vaccine amongChineseschool-aged children：safety and immunogenicityfinding s[J].Pediatr Infect Dis J，2007，26(11)：1001-1005.

(6)Ochiai R L，Acosta C J，Agtini M，et al.The use of typhoid vaccinesin Asia：the DOMI experience[J].Clin Infect Dis，2007，15(45)：34-38.

(7)Kaljee L M，Pham V，Son N D，et al.Trial participation and vaccinedesirability for Vi polysaccharide typhoid fever vaccine in Hue City，Viet Nam[J].Trop Med Int Health，2007，12(1)：25-36.

(8)Germanier于1975年用化学诱变剂亚硝基胍诱变及紫外线照射诱导非定点突变得到的。

文献1、2仅提供了一种抗沙门菌的抗体与跨膜蛋白的制备技术，该专利尽可用于沙门菌的诊断、治疗，无法起到对沙门菌的预防作用。文献3提供了一种沙门菌属抑制组合物，但该专利仅对沙门菌感染起到治疗作用，无法起到有效的预防作用，且该组合物对机体存在着导致机体过敏、排异、胃肠道反应等风险。

文献4-7提供了沙门菌经典疫苗-针对Vi荚膜多糖疫苗的制备方法，Vi荚膜多聚糖既是毒力因子也是保护性抗原，Vi特异性血清抗体是激活针对伤寒沙门菌的补体所必需的。非常多的报道显示，用荚膜多聚糖免疫可刺激产生针对伤寒沙门菌的保护性抗体反应，并且相当有效，在一些发展中国家特别是一些亚洲国家使用较多。然而接种这种疫苗会产生一些副作用。例如其保护效力与免疫原中Vi含量有关，剂量过高会引起抗体形成的抑制反应。且用降解抗原结构的方法制备的Vi抗原给黑猩猩和志愿者免疫均无保护作用。纯化的yi多糖可产生较满意的抗体应答，但在黑猩猩中结果混乱，可能是由于荚膜多糖在灵长类动物中免疫原性贫乏和多次注射产生抑制作用。

文献8提供了化学诱变突变株的伤寒沙门菌Ty21a疫苗，它是Germanier于1975年用化学诱变剂亚硝基胍诱变及紫外线照射诱导非定点突变得到的。Ty21a，在口服伤寒活菌苗的制备中发挥了开拓性作用。Ty21a具有galE突变，不能合成Vi荚膜抗原。galE编码UDP半乳糖-4-异构酶，缺失后不能完成UDP半乳糖与UDP葡萄糖的互换，而半乳糖残基是野生型伤寒杆菌光滑型LPSO抗原的重要成分，Ty21a在无半乳糖条件下为粗糙型，无免疫原性。Ty21a株是一种很有用的典型活菌苗，但它免疫后仅提供中等程度的保护作用，且接种者对菌苗配方及摄入剂量过于敏感。且全菌种抗原存在多个抗原决定簇容易发生交叉反应。另外，Ty21a也是报道用作外源基因表达的很好载体，在诱导伤寒沙门菌的同时，产生针对外源病原刺激的部分保护，如幽门螺杆菌、产肠毒素性大肠埃希菌、人乳头瘤病毒16型等。基于以上原因，迫切需要研制一种更加高效、遗传背景更明确的沙门菌减毒疫苗。

上述专利和论文均有关于沙门菌治疗和预防的方案，但存在尽可用于治疗，或虽然可以有效预防，但诱发免疫应答效果不明显或者存在交叉反应等缺陷。另外目前关于沙门菌菌毛抗原的疫苗尚无文献记载。

发明内容

本发明旨在提供一种方法简单、收率高、纯度高的抗沙门氏菌口服疫苗的制备工艺。

为了达到上述目的，本发明一种抗沙门氏菌口服疫苗的制备工艺，包括如下步骤：

Step 1、构建表达沙门菌SEF14和SEF21菌毛抗原的大肠杆菌，具体分步如下：

Step 11、分别将含有SEF14、SEF21菌毛抗原基因序列的DNA片段与pET20b(+)载体连接，然后分别对连接的片段进行扩增，此时原核表达载体pET20b(+)-SEF14以及pET20b(+)-SEF21两种质粒分别构建成功；

Step 12、分别将两种所述质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中；

Step 13、经IPTG诱导1-2小时后，收集菌体，超声波打碎、离心获得包涵体后，利用镍柱子层析纯化；

Step 14、分别利用纯化的原核表达SEF14、SEF21蛋白制备兔抗SEF14、SEF21多克隆抗体；

Step 2、制备脂质体包裹的SEF14和SEF21抗原，具体分步如下：

Step 21、将二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、胆固醇按1∶1∶2的比例充分混合；

Step 22、将混合的脂类干燥，制成脂质体混合物；

Step 23、将所述混合物与所述SEF14、SEF21多克隆抗体按照质量比为2-3∶1∶1的比例充分混合；

Step 24、在1600rpm强度下进行脂质膜涡旋式分散，获得的脂质体包裹SEF14和SEF21口服疫苗。

其中，上述Step 1之前，获得所述含有SEF14、SEF21菌毛抗原基因序列DNA片段的步骤为：

Step 01、根据GenBank accession number L03833.142-573提供的SEF14菌毛抗原基因序列，设计引物如下：

上游引物：5’-GGAATTC CATATG GCTGGCTT TGTTGGTAA-3’

下游引物：5’-CCG CTCGAG GTTTTGATACTGCTGAACG-3’

根据GenBank accession number S76043.提供的SEF21菌毛抗原基因序列，设计引物如下：

上游引物：5’-GGAATTC CATATG ATGAAACATAA ATTAATGA-3’

下游引物：5’-CCG CTCGAG TTATTCGTATTTCATGATAAAGGTG-3’

Step 02、以含有SEF14、SEF21菌毛抗原基因序列为模板，分别经PCR扩增出SEF14、SEF21菌毛抗原基因序列的DNA片段。

此外，Step 22优选步骤为：将混合的脂类在旋转蒸发器上进行干燥20-30分钟，然后再置于高真空干燥器上干燥，制成脂质体混合物。而在Step 24之后，以1000-1500rpm离心，弃去离心后的上层液，将没有被脂质体包裹的菌毛抗原去除。

为了获取疫苗的制备情况，本发明还提供了上述制备工艺最终检测SEF14和SEF21口服疫苗的方法为：首先利用异丙醇溶解脂质体，用PBS稀释，采用涡旋混合器充分搅拌混匀，而后利用蛋白质检测试剂盒测定脂质体包裹SEF14和SEF21的量。

而在具体制备过程中，尤其步骤Step 11之后，需要检测两种质粒构建是否成功，方法为：在所述连接的片段扩增后，分别利用Nde I酶和Xho I酶对所述SEF14、SEF21连接的片段进行双酶切。此时，如果结果显示457bp的SEF14和3716bp的pET20b(+)片段，则说明原核表达载体pET20b(+)-SEF14构建成功；如果结果显示568bp的SEF21和3716bp的pET20b(+)片段，则说明原核表达载体pET20b(+)-SEF21构建成功。

本发明的有益效果是：①通过原核表达技术制备沙门菌SEF14和SEF21菌毛抗原蛋白，大大提高了沙门菌抗原的纯度，并使生产制备工艺稳定、简单、可控。②采用脂质体包裹技术将SEF14和SEF21菌毛抗原包裹起来，有效地提高了抗原蛋白的稳定性，可有效抵抗酸性环境及机体酶系统的破坏作用，使生产的SEF14和SEF21菌毛蛋白抗原可以通过口服方式给药，方便给药。③完全减毒，高免疫原性。对环境不造成污染。本发明在预防和治疗沙门菌感染研究开发上具有非常重要的意义。④制备工艺简单，收率高，纯度高。

附图说明

图1是重组肠炎沙门氏菌菌毛SEF14抗原基因片段PCR琼脂糖电泳图；其中，泳道1为DNA marker；泳道2为SEF14基因(457bp)PCR结果。

图2是目的基因SEF14表达载体pET20b(+)-SEF14酶切鉴定图；其中，泳道1为DNA marker；泳道2为pET20b(+)-SEF14表达载体酶切结果。

图3是原核表达SEF14纯化SDS-PAGE电泳图；其中，泳道1为蛋白marker；泳道2为纯化后SEF14重组蛋白。

图4是Western blot法检测SEF14菌毛抗原在大肠杆菌中的表达；其中，泳道1为从肠炎沙门氏菌分离的SEF14；泳道2为纯化的原核表达SEF14

图5是重组肠炎沙门氏菌菌毛SEF21抗原基因片段PCR琼脂糖电泳图；其中，泳道1为DNA marker；泳道2为SEF21基因(568bp)PCR结果。

图6是目的基因SEF21表达载体pET20b(+)-SEF21酶切鉴定图；其中，泳道1为DNA marker；泳道2为pET20b(+)-SEF14表达载体酶切结果。

图7是原核表达SEF21纯化SDS-PAGE电泳图；其中，泳道1为蛋白marker；泳道2为纯化后SEF21重组蛋白。

图8是Western blot法检测SEF21菌毛抗原在大肠杆菌中的表达；泳道1为从肠炎沙门氏菌分离的SEF21；泳道2为纯化的原核表达SEF21。

图9是SEF14 and SEF21菌毛抗原免疫后，血清中IgG和sIgA免疫前后比较，以及肠粘膜中IgG和sIgA免疫前后比较。

具体实施方式

本发明的技术方案是：本发明首先构建表达沙门菌SEF14和SEF21菌毛抗原的大肠杆菌，使其表达SEF14和SEF21菌毛抗原，再通过蛋白纯化技术将SEF14和SEF21菌毛抗原提取、纯化。将二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、胆固醇按适当的比例溶解在有机溶剂充分混合，制备成混合脂类。将混合的脂类在旋转蒸发器上进行干燥，然后再放于高真空干燥器上进一步干燥，制成混合脂质膜，在混合脂质膜内加入一定量的SEF14和SEF21抗原，充分混合，接着在一定的强度下进行脂质膜涡旋式分散，获得大小均一的脂质体包裹SEF14和SEF21口服疫苗。通过离心，将没有被脂质体包裹的菌毛抗原去除，制备出脂质体包裹SEF14和SEF21的抗原。

具体方法步骤如下：

(1)构建表达SEF14菌毛抗原重组表达菌株及SEF14菌毛抗原的表达，构建SEF14抗原基因原核表达载体并进行表达。

根据GenBank accession number L03833.142-573提供的SEF14菌毛抗原基因序列，设计引物：

上游引物：5’-GGAATTC CATATG GCTGGCTT TGTTGGTAA-3’30bp

下游引物：5’-CCG CTCGAG GTTTTGATACTGCTGAACG-3’28bp

其中上游引物中5’端含有Nde I酶切位点、保护碱基以及SEF145’端部分氨基酸编码基因序列；下游引物中5’端含有Xho I酶切位点、保护碱基以及SEF143’端部分氨基酸编码基因的互补序列。

含有SEF14菌毛抗原基因序列为模板，经PCR分别扩增出SEF14(457bp)的DNA片段(图1所示，M处指示了SEF14的PCR扩增产物)。将所得DNA片段与pET20b(+)(3716bp)载体连接，然后对该目的片段进行扩增，然后利用Nde I和Xho I对扩增产物进行双酶切，结果显示457bp的SEF14和3716bp的pET20b(+)片段，说明原核表达载体pET20b(+)-SEF14构建成功(图2所示，N指示出pET20b；C指示出SEF14)。将构建好的pET20b(+)-SEF14质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中，经IPTG诱导1h-2h后，收集菌体，超声波打碎、离心获得包涵体，进一步利用镍柱子层析纯化。SDS-PAGE结果显示原核表达蛋白SEF14的纯度为95％以上(图3所示，D指示出SEF14)。利用纯化的原核表达SEF14蛋白制备兔抗SEF14多克隆抗体。Western blot结果显示，原核表达SEF14和肠炎沙门氏菌SEF14均与兔抗SEF14多克隆抗体结合，证明原核表达SEF14与沙门氏菌SEF14的抗原性为一致(图4所示，E指示出从肠炎沙门氏菌分离的SEF14；F指示出纯化的原核表达SEF14)。

(2)表达SEF21菌毛抗原重组表达菌株的构建及SEF21菌毛抗原表达

根据GenBank accession number S76043.提供的SEF21菌毛抗原基因序列，设计引物，

上游引物：5’-GGAATTC CATATG ATGAAACATAA ATTAATGA-3’32bp

下游引物：5’-CCG CTCGAG TTATTCGTATTTCATGATAAAGGTG-3’34bp

其中上游引物中5’端含有Nde I酶切位点、保护碱基以及SEF215’端部分氨基酸编码基因序列；下游引物中5’端含有Xho I酶切位点、保护碱基以及SEF213’端部分氨基酸编码基因的互补序列。

以含SEF21菌毛抗原基因为模板，经PCR扩增出SEF21(568bp)的DNA片段(图5所示，G指示出SEF21)。将所得DNA片段与pET20b(+)载体连接，然后对目的片段进行扩增，再利用Nde I和Xho I对该目的片段进行双酶切，结果显示568bp的SEF21和3716bp的pET20b(+)片段，说明原核表达载体pET20b(+)-SEF21构建成功(图6所示，H指示出pET20b，I指示出SEF21)。pET20b(+)-SEF21质粒转化到BL21(DE 3)表达菌株中，经I PTG诱导1h，2h后，收集菌体，超声波打碎、离心获得包涵体，进一步利用镍柱子层析纯化。SDS-PAGE结果显示原核表达蛋白SEF21的纯度为95％以上(图7所示，J指示出SEF21)。利用纯化的原核表达SEF21蛋白制备兔抗SEF21多克隆抗体。Western blot结果显示，原核表达SEF21和肠炎沙门氏菌SEF21均与兔抗SEF21多克隆抗体结合，证明原核表达SEF21与沙门氏菌SEF21的抗原性为一致(图8所示，K指示出从肠炎沙门氏菌分离的SEF21；L指示出纯化的原核表达SEF21)。

(3)脂质体包裹SEF14和SEF21口服疫苗制备

将二棕榈磷脂酰酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、胆固醇按一定比例(如1∶1∶2)充分混合在一个锥形烧瓶。将混合的脂类在旋转蒸发器上进行干燥20-30分钟，然后再置于高真空干燥器上进一步干燥，制成脂质体混合物，将脂质体混合物与SEF14和SEF21菌毛抗原按照质量比为2-3∶1∶1的比例在混悬振荡器中进行充分混合，接着在1600rpm强度下进行脂质膜涡旋式分散，获得大小均一的脂质体包裹SEF14和SEF21口服疫苗，然后1000-1500rpm离心，弃去离心后的上层液，将没有被脂质体包裹的菌毛抗原去除。然后再利用异丙醇溶解脂质体，用PBS稀释，采用涡旋混合器充分搅拌混匀，最后利用蛋白质检测试剂盒测定脂质体包裹SEF14和SEF21的量。

(4)脂质体包裹SEF14和SEF21口服疫苗保护实验-刺激机体抗体生成增多

将脂质体包裹SEF14和SEF21口服疫苗配置成200μg/100μl的浓度，每只鸡采取接种100μl进行接种，选取8周龄以上的鸡进行免疫，2周后加强免疫一次。免疫2周后，收集外周血和肠粘膜液，进行ELISA实验，测定血清和肠黏膜中IgG和sIgA含量。实验结果用均数±准差表示，**表示与未免疫组比较P＜0.01，结果见图9。

由图9中A侧可见，实验鸡口服脂质体包裹SEF14和SEF21疫苗2周后，血清中IgG和sIgA水平明显高于未免疫组，且差异具有统计学意义(P＜0.01)，说明口服SEF14和SEF21疫苗后，可以提高实验动物血清中抗SEF14和SEF21的IgG和sIgA抗体水平，有效提高机体抵抗沙门菌感染能力。

由图9中B侧可见，实验鸡口服脂质体包裹SEF14和SEF21疫苗2周后，肠粘膜中IgG和sIgA水平明显高于未免疫组，且差异具有统计学意义(P＜0.01)，说明口服SEF14和SEF21疫苗后，可以提高实验动物肠粘膜中抗SEF14和SEF21的IgG和sIgA抗体水平，有效提高机体抵抗沙门菌感染能力。

(5)脂质体包裹SEF14和SEF21口服疫苗保护实验-接种疫苗后，实验动物获得了对肠炎沙门氏菌的抵抗。

将8周龄鸡分别放在各自的隔离室内避免鸡之间的物理接触。免疫鸡群及非免疫对照鸡群分别口服1×107个菌落形成单位(CFU)的肠炎沙门氏菌。感染后隔一天收集新鲜的粪便样本，最后在无菌条件下进行解剖，取出内脏器官和小肠、盲肠和直肠。将所有的样本在无菌PBS进行称重，连续稀释100倍，接种在mannitol lysine crystal violet brilliant green琼脂平板板上，培养24小时。细菌计数时查带黑色的肠炎沙门氏菌菌落。肠炎沙门氏菌亚型是利用09特定菌群抗血清试剂盒通过凝集实验进行鉴定。

疫苗保护实验表明，免疫接种后的鸡群在接收肠炎沙门氏菌攻击后与不接种的比较鸡相比，肠道内细菌增殖受到明显抑制(约94.2％)、肠炎沙门氏菌在内脏器官、生殖器官和肠道中的定居数量大大减少了，从而垂直传播和蛋壳污染也显然减少了。PCR检测结果也显示，与未免疫鸡群相比，虽然肠炎沙门氏菌的主要感染器官-盲肠中的肠炎沙门氏菌没有完全清除，免疫鸡群的肠道内定殖的细菌数明显下降。由于使用的抗原是菌体表面抗原，与弱毒菌苗，病原基因缺损菌苗相比，此安全性更高。总之，脂质体包裹SEF14和SEF21口服疫苗既安全又有效，对减少肠炎沙门氏菌污染具有重大的意义。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

Claims (6)

1.一种抗沙门氏菌口服疫苗的制备工艺，其特征在于，包括如下步骤：

S1、构建表达沙门菌SEF14和SEF21菌毛抗原的大肠杆菌，具体分步如下：

S11、分别将含有SEF14、SEF21菌毛抗原基因序列的DNA片段与pET20b(+)载体连接，然后分别对连接的片段进行扩增，此时原核表达载体pET20b(+)-SEF14以及pET20b(+)-SEF21两种质粒分别构建成功；

S12、分别将两种所述质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中；

S13、经IPTG诱导1-2小时后，收集菌体，超声波打碎、离心获得包涵体后，利用镍柱子层析纯化；

S14、分别利用纯化的原核表达SEF14、SEF21蛋白制备兔抗SEF14、SEF21多克隆抗体；

S2、制备脂质体包裹的SEF14和SEF21抗原，具体分步如下：

S21、将二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、胆固醇按1∶1∶2的比例充分混合；

S22、将混合的脂类干燥，制成脂质体混合物；

S23、将所述混合物与所述SEF14、SEF21按照质量比2-3∶1∶1的比例充分混合；

S24、在1600rpm强度下进行脂质膜涡旋式分散，获得的脂质体包裹SEF14和SEF21口服疫苗。

2.根据权利要求1所述抗沙门氏菌口服疫苗的制备工艺，其特征在于，步骤S1之前，获得所述含有SEF14、SEF21菌毛抗原基因序列DNA片段的步骤为：

S01、根据GenBank accession number L03833.142-573提供的SEF14菌毛抗原基因序列，设计引物如下：

上游引物：5’-GGAATTC CATATG GCTGGCTT TGTTGGTAA-3’

下游引物：5’-CCG CTCGAG GTTTTGATACTGCTGAACG-3’

根据GenBank accession number S76043.提供的SEF21菌毛抗原基因序列，设计引物如下：

上游引物：5’-GGAATTC CATATG ATGAAACATAA ATTAATGA-3’

下游引物：5’-CCG CTCGAG TTATTCGTATTTCATGATAAAGGTG-3’

S02、以含有SEF14、SEF21菌毛抗原基因序列为模板，分别经PCR扩增出SEF14、SEF21菌毛抗原基因序列的DNA片段。

3.根据权利要求1或2所述抗沙门氏菌口服疫苗的制备工艺，其特征在于，步骤S22具体步骤为：将混合的脂类在旋转蒸发器上进行干燥20-30分钟，然后再置于高真空干燥器上干燥，制成脂质体混合物。

4.根据权利要求3所述抗沙门氏菌口服疫苗的制备工艺，其特征在于，在步骤S24之后，1000-1500rpm离心，弃去离心后的上层液，将没有被脂质体包裹的菌毛抗原去除。

5.根据权利要求4所述抗沙门氏菌口服疫苗的制备工艺，其特征在于，最终检测所述SEF14和SEF21口服疫苗的方法为：首先利用异丙醇溶解脂质体，用PBS稀释，采用涡旋混合器充分搅拌混匀，而后利用蛋白质检测试剂盒测定脂质体包裹SEF14和SEF21的量。

6.根据权利要求5所述抗沙门氏菌口服疫苗的制备工艺，其特征在于，步骤S11检测所述两种质粒构建是否成功的方法为：在所述连接的片段扩增后，分别利用Nde I酶和Xho I酶对所述SEF14、SEF21连接的片段进行双酶切；

结果显示457bp的SEF14和3716bp的pET20b(+)片段，说明原核表达载体pET20b(+)-SEF14构建成功；

结果显示568bp的SEF21和3716bp的pET20b(+)片段，说明原核表达载体pET20b(+)-SEF21构建成功。

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