KR20080108096A - 신규 백신 담체 - Google Patents

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KR20080108096A
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antigen
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시노부 와타라이
겐지 고노
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니혼 바이오로지컬즈 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명에 있어서는, 체액성 그리고 세포성 면역 응답을 효율적으로 유도할 수 있는 백신의 제조를 위해서 사용할 수 있는, 신규 백신 담체를 제조하는 것을 과제로 한다. 본 발명은 또한, 체액성 그리고 세포성 면역 응답을 효율적으로 유도할 수 있는 백신을 제공하는 것 또한, 과제로 한다. 본 발명의 발명자들은, 숙시닐화 폴리글리시돌을 함유하는 리포솜을 사용함으로써, 상기 서술한 과제를 해결할 수 있는 것을 명확히 하고, 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 본 발명은, 숙시닐화 폴리글리시돌을 함유하는 리포솜으로 구성되는 백신 담체를 제공함으로써, 상기 서술한 과제를 해결할 수 있다.

Description

신규 백신 담체{NOVEL VACCINE CARRIER}
본 발명은, 막융합성 지질막을 갖는 리포솜을 사용한 신규 백신 담체에 관한 것이다.
동물의 면역계는 자기와 비자기를 식별하고, 비자기를 체내로부터 배제하도록 기능한다. 이와 같은 자기와 비자기의 구별을 실시하는 생체 내의 면역 반응은, MHC 클래스 I 분자를 이용한 세포성 면역, 그리고 MHC 클래스 II 분자를 이용한 체액성 면역에 의해 담당되어 있다. 예를 들어 감염증 병원체인 바이러스나 세균이 감염되었을 경우, 생체는 이들 세포성 면역이나 체액성 면역을 사용하여, 이들 감염증 병원체를 배제한다.
이와 같은 감염증 병원체에 대한 예방 수단으로서 자주 이용되는 것이 백신 접종이다. 사람의 경우에도, 가축 동물이나 애완 동물의 경우에도, 타종류의 백신이 많이 이용되고 있다.
이들 백신은, 크게 나누어, 불활화 백신 (톡소이드백신도 포함한다) 과 약독생 백신의 2 종류의 타입으로 분류된다. 불활화 백신은, 병원체 또는 톡소이드를 포르말린이나 그 밖의 화학 처리에 의해 감염력을 잃게 하고, 비활화된 형태로 투여하는 백신, 또는 병원체의 항원 부분만을 투여하는 백신을 의미하는 것으로서, 예를 들어 사람의 백신의 경우, 3 종 혼합 백신 (디프테리아, 파상풍 톡소이드, 백일해) 이나 일본 뇌염 백신, 인플루엔자 백신, 파상풍 톡소이드백신 등이 이 타입이다. 한편, 약독생 백신은, 독력은 약하지만 감염력을 갖는 병원체, 즉 천연에 존재하는 약독주나 인위적으로 만들어진 약독변이주를 투여하는 백신을 의미하는 것으로서, 예를 들어 사람의 백신인 경우, BCG 백신, 폴리오백신, 홍역 백신, 풍진 백신, 유행성 이하선염 백신, 수포창 백신 (수포창) 등이 이 타입이다.
불활화 백신은, 백신 투여의 결과로서, 병원체에 의한 감염의 가능성이 낮고, 부작용이 잘 생기지 않는다는 이점이 있고, 그 반면, 체액성 면역밖에 획득할 수 없다는 특징을 갖는다. 한편, 약독생 백신의 경우에는, 살아 있는 병원체를 사용하기 때문에, 어떠한 이유로 독성을 회복하여 부작용을 발현할 가능성도 있다는 결점을 갖는다. 그리고, 경구 투여하는 일부의 약독생 백신 (예를 들어, 폴리오) 의 사례를 제외하고, 일반적으로 백신은 근육 주사에 의해 투여하기 때문에, IgG 항체의 항체가는 상승하지만, 그 밖의 클래스의 항체 (예를 들어, IgA 나 IgM) 의 항체가가 상승되지 않는다는 문제점, 또 감염 방어에 중요한 세포성 면역 응답도 충분히 유도할 수 없다는 문제점 또한 가지고 있다.
감염증 병원체의 감염은, 코, 기관, 장관, 눈 등의 점막 표면으로부터 병원체가 체내에 침입하는 것으로부터 비롯되기 때문에, 백신 접종에 의해 세포성 면역을 유도할 수 있으면, 병원체의 체내로의 침입을 경계에서 방어할 수 있게 된다. 그러나, 생체에 있어서의 점막은, 구강, 비강, 소화관 및 생식기 등의 관강 표면 및 눈의 점막 표면을 덮고 있지만, 그 표면에서는, 끊임없이 폭로되어 있는 바이러 스, 세균 등의 병원 미생물, 식이성 항원, 이물질에 대해, 분비형 IgA 나 점막 부속 림프액 조직을 주체로 한, 점막 면역이 기능하고 있다. 이 점막 면역은, 점막면으로부터의 단백질 항원의 흡수를 억제하고, 세균이나 바이러스의 점막 상피에 대한 흡착을 저지하고, 상피 세포에 관염된 바이러스를 중화하는 등의 다양한 작용을 발휘하여 이들 이물질이 체내에 침입하는 것을 방지하고 있다.
그러나, 상기 서술한 바와 같이, 종래부터의 백신 접종의 상당수는, IgG 항체 이외의 클래스의 항체 (예를 들어, IgA 나 IgM) 의 항체가가 상승되지 않고, 또 세포성 면역 응답도 충분히 유도할 수 없기 때문에, 감염성 병원체의 감염 부위인 점막면에 대해서는, 효과적으로 항원 특이적 항체 (분비형 IgA) 생성을 함유하는 면역 응답을 유도할 수 없다는 문제점이 있었다. 그러한 문제점을 해결하기 위해서, 경구 면역이나 경비 면역 등과 같은, 점막면을 개재하여 항원을 투여함으로써, 전신성 그리고 전신의 점막면에 항원 특이적 면역 응답을 유도할 수 있을 것으로 생각되어 검토를 하였다.
이와 같은 점막 면역을 부여하는 것을 목적으로 하고, 리포솜 중에 항원을 함유시켜, 그것을 백신으로서 점막에 투여하는 시도를 해 왔다. 예를 들어, 닭에 있어서, Salmonella enterica 혈청형 Enteritidis 항원을 면역원으로서 리포솜 중에 함유시키고, 그 리포솜을 닭에 점안함으로써, 전신성의 면역 응답을 유도할 수 있고, 장관내강으로부터의 Salmonella enterica 혈청형 Enteritidis 의 침입을 저해할 수 있다는 것이 나타났다 (비특허 문헌 1 및 비특허 문헌 2).
그러나, 백신 제조의 분야에 있어서는, 더욱 효율적으로 여러 가지 클래스의 항체의 항체가 (체액성 면역 응답) 나 세포성 면역 응답을 상승시킬 수 있는 백신 담체를 개발하는 것이 요구되고 있다.
[비특허 문헌 1] Fukutome, K., et al., Developmental and Comparative Immunology, 25, 2001, 475-484
[비특허 문헌 2] Li, W., et al., Developmental and Comparative Immunology, 28, 2004, 29-38
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명에 있어서는, 체액성 그리고 세포성 면역 응답을 효율적으로 유도할 수 있는 백신의 제조를 위해서 사용할 수 있는, 신규 백신 담체를 제조하는 것을 과제로 한다. 본 발명은 또, 체액성 그리고 세포성 면역 응답을 효율적으로 유도할 수 있는 백신을 제공하는 것 또한, 과제로 한다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명의 발명자들은, 막융합성 지질 (숙시닐화 폴리글리시돌) 을 함유하는 리포솜을 사용함으로써, 상기 서술한 과제를 해결할 수 있는 것을 명확히 하고, 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 본 발명은, 숙시닐화 폴리글리시돌을 함유하는 리포솜으로 구성되는 백신 담체를 제공함으로써, 상기 서술한 과제를 해결할 수 있다.
발명의 효과
상기 서술한 숙시닐화 폴리글리시돌을 함유하는 리포솜으로 구성되는 백신 담체를 사용하여 백신을 제조함으로써, 종래의 리포솜으로 구성되는 백신 담체를 사용했을 경우와 비교하여, 현저하게 항체가를 상승시킬 수 있는 효율적인 백신을 얻을 수 있다. 또, 상기 서술한 백신 담체를 사용하여 제조된 백신에 의해, 체액성 면역 뿐만 아니라, 세포성 면역을 효율적으로 유도할 수도 있다.
도 1 은, OVA-SucPG-리포솜에 의한 백신, OVA-리포솜에 의한 백신, 및 OVA 만에 의한 백신을, BALB/c 마우스의 복강 내에 면역시켰을 경우의, 혈청 중에 있어서의 OVA 특이적 IgM 항체, IgG 항체, 및 IgE 항체의 항체가를 나타내는 도면이다.
도 2 는, OVA-SucPG-리포솜에 의한 백신, OVA-리포솜에 의한 백신, 및 OVA 만에 의한 백신을 BALB/c 마우스의 복강 내에 면역시켰을 경우의, 혈청 중에 있어서의 OVA 특이적 IgG 항체의 서브 클래스 (IgG1, IgG2a 및 IgG3) 의 항체가를 나타내는 도면이다.
도 3 은, 경비적으로 면역시켰을 경우의 장액 중의 항체 클래스 유도의 결과를 나타내는 도면이다.
도 4 는, OVA-SucPG-리포솜에 의한 백신을 복강 내에 면역시킨 마우스의 비장 림프구에 있어서의 IFN-γ 유전자 및 IL-4 유전자의 mRNA 의 발현을, RT-PCR 법에 의해 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5 는, OVA-SucPG-리포솜에 의한 백신을 복강 내에 면역시킨 마우스의 비장 림프구 배양상청 중에 있어서의 IFN-γ 및 IL-4 의 정량 결과를 나타내는 도면 이다.
도 6 은, OVA-SucPG-리포솜에 의한 백신, OVA-리포솜에 의한 백신, 및 OVA 만에 의한 백신을 BALB/c 마우스의 복강 내에 면역시켰을 경우의, 혈청 중에 있어서의 OVA 특이적 IgM 항체, IgG 항체, 및 IgE 항체의 항체가를 나타내는 도면이다.
도 7 은, OVA-SucPG-리포솜에 의한 백신, OVA-리포솜에 의한 백신, 및 OVA 만에 의한 백신을 BALB/c 마우스의 복강 내에 면역시켰을 경우의, 혈청 중에 있어서의 OVA 특이적 IgG 항체의 서브 클래스 (IgG1, IgG2a 및 IgG3) 의 항체가를 나타내는 도면이다.
도 8 은, OVA-SucPG-리포솜에 의한 백신을 복강 내에 면역시킨 마우스의 비장 림프구에 있어서의 IFN-γ 유전자 및 IL-4 유전자의 mRNA 의 발현을, RT-PCR 법에 의해 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9 는, OVA-SucPG-리포솜에 의한 백신을 복강 내에 면역시킨 마우스의 비장 림프구 배양상청 중에 있어서의 IFN-γ 및 IL-4 의 정량 결과를 나타내는 도면이다.
도 10 은, Salmonella Enteritidis 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을, 점안에 의해 투여하여 면역시킨 닭의 혈중 항체의 항체가에 대한 결과를 나타내는 도면이다.
도 11 은, 트리파노소마 (Trypanosoma brucei) 의 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을, 경비적으로 투여하여 면역시킨 마우스의 혈중 항체의 항체가에 대한 결과를 나타내는 도면이다.
도 12 는, 황색 포도상구균 (Staphylococcus aureus) 의 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을, 경비적으로 투여하여 면역시킨 소의 혈중 항체의 항체가에 대한 결과를 나타내는 도면이다.
도 13 은, 황색 포도상구균 (Staphylococcus aureus) 의 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을, 경비적으로 투여하여 면역시킨 소의 젖 중 항체의 항체가에 대한 결과를 나타내는 도면이다.
도 14 는, Aeromonas salmonicida 의 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을, 경구적으로 투여하여 면역시킨 잉어의 혈중 항체의 항체가에 대한 결과를 나타내는 도면이다.
도 15 는, Aeromonas salmonicida 의 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을, 경구적으로 투여하여 면역시킨 잉어의 장액 중 및 담즙 중 항체의 항체가에 대한 결과를 나타내는 도면이다.
도 16 은, Aeromonas salmonicida 의 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을, 경구적으로 투여하여 면역시킨 잉어의 생존률의 추이를 나타내는 도면이다.
도 17 은, Mycoplasma gallisepticum 의 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을, 경비적으로 투여하여 면역시킨 마우스의 혈중 항체의 항체가에 대한 결과를 나타내는 도면이다.
도 18 은, 뉴캐슬병 바이러스의 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을, 경비적으로 투여하여 면역시킨 마우스의 혈중 항체의 항체가에 대한 결과를 나타내는 도면이다.
발명의 실시형태
상기 서술한 바와 같이, 본 발명은, 숙시닐화 폴리글리시돌 (SucPG) 을 함유하는 리포솜으로 구성되는 백신 담체를 제공하는 것을 특징으로 하다. 이 리포솜으로 구성되는 백신 담체를 사용하는 경우, 리포솜 중에 함유되는 면역원이 불활화 백신인지 약독생 백신인지에 상관없이, 또 투여 경로에 상관없이, IgG 항체의 항체가 뿐만 아니라 그 밖의 클래스의 항체의 항체가 또한 상승시킬 수 있고, 또한 체액성 면역 뿐만 아니라 세포성 면역 또한 유도할 수 있었다.
본 발명의 숙시닐화 폴리글리시돌 (SucPG) 을 함유하는 리포솜으로 구성되는 백신 담체를 사용하는 경우에 유도된 세포성 면역은, 면역원을 항원 제시 세포 내부에 내재화시킴으로써, 달성된 것이라고 생각된다. 즉, 본 발명의 백신 담체를 사용함으로써, 면역원을 리포솜 내강에 함유시킬 수 있기 때문에, 면역원을 항원 제시 세포 내부에 내재화시킬 수 있다. 그 결과, 항원 제시 세포 중에 도입된 면역원은, 자기 성분으로서 MHC 클래스 I 분자와 조합되어 항원 제시 세포 표면 상에 항원 제시되고, 그 결과, 세포성 면역이 유도된 것이라고 생각되었다.
여기서, 숙시닐화 폴리글리시돌 (SucPG) 이란, 알킬기를 갖는 것을 특징으로 하는 양 친매성의 화합물이다. 알킬기를 가짐으로써, SucPG 는 리포솜막에 앵커링이 가능해진다. SucPG 의 알킬기의 탄소수는 6∼24 로 양호하고, 탄소수 6∼18 의 알킬기가 보다 바람직하다. 가장 바람직하게는, 알킬기는 탄소수 10 의 n-데실기이다. SucPG 는, 양 친매성의 폴리에틸렌 글리콜과 유사한 주사슬 골격 및 측사슬에 카르복실기를 갖기 때문에 중성 환경 하에서는 리포솜막을 안정 화시키지만, 산성 환경 하에서는 측사슬 카르복실기가 프로톤화되고, 막융합을 야기한다는 특징을 갖는다. 이 SucPG 를 리포솜막에 삽입함으로써, 그 리포솜 (SucPG-리포솜) 은, 산성 환경 하에 있어서 막융합능을 발현하게 된다. 즉, SucPG-리포솜이 엔도사이토시스에 의해 항원 제시 세포에 조합되었을 경우, 리소좀 내의 pH 가 저하된다. 그 때 SucPG-리포솜은, 막융합성을 발휘하여 리소좀막과 융합하고, 봉입되어 있는 항원 물질을 세포질 내에 방출시킬 (항원의 내재화) 수 있다.
본 발명에 있어서 사용하는 SucPG 는, 합성 고분자 폴리글리시돌을 무수 숙신산과 N,N-디메틸포름아미드 중에 있어서 80℃ 에서 6 시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서는, 백신 담체에 사용하는 리포솜을 구성하는 지질에 대해, 숙시닐화 폴리글리시돌을 첨가하는 것이 특징이다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 백신 담체에 있어서는, 리포솜을 구성하는 지질에 대해, 10∼40 중량%, 바람직하게는 20∼35 중량%, 가장 바람직하게는 30 중량% 의 숙시닐화 폴리글리시돌이 함유된다.
본 발명의 백신 담체는, 리포솜의 내부에 함유되는 면역원을 경점막적으로 투여하기 위해서 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서 「점막」이라고 하는 경우, 소화기, 호흡기, 비뇨생식기 등의 관강장기 내강면을 덮는 부위의 총칭을 의미하고, 그 자유면은 점액선이나 배상 세포로부터의 분비물로 항상 습윤되어 있다. 본 발명의 백신 담체를 적용할 수 있는 점막으로서는, 구강, 인후, 비강, 이강, 결 막 낭, 질, 항문 등이 있다. 이들 점막면에 대해 면역원을 함유하는 리포솜을 적용함으로써, 점막면을 경유하여 면역원을 체내에 도입할 수 있다.
본 발명의 백신 담체는, 백신 담체의 리포솜의 내부에 함유되는 면역원을 비경점막적으로 투여함으로써 송달하기 위해서 사용할 수도 있다. 본 발명에 있어서 경점막 이외의 경로라고 하는 경우, 백신 담체의 리포솜의 내부에 함유되는 면역원을 복강 내 투여하는 것 등이 포함된다. 예를 들어, 면역원을 복강 내에 투여하면, 복강 내의 위장관, 생식기, 간장, 췌장 등의 장기 표면으로부터, 면역원을 체내에 도입하 수 있다. 이와 같이 하여 면역원을 체내에 투여하면, 체내 도처의 존재하는 항원 제시 세포에 면역원을 도입시킬 수 있다.
본 발명의 리포솜을 구성하는 지질로서는, 예를 들어, 포스파티딜콜린류, 포스파티딜에탄올아민류, 포스파티딜세린류, 포스파티딘산류 혹은 장사슬 알킬인산염류, 혹은 포스파티딜글리세롤류, 콜레스테롤 (Chol) 류 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서 리포솜을 제조하는 경우, 여기에 열거하는 지질을 단독으로 사용해도 되고, 혹은 이들 중 어느 하나를 조합시켜 사용해도 된다.
본 발명의 리포솜을 구성하는 지질로서 사용하는 경우, 포스파티딜콜린류로서는, 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레일포스파티딜콜린(DOPC) 난황 레시틴 (egg PC) 등이 바람직하다.
또, 본 발명의 리포솜을 구성하는 지질로서 사용하는 경우, 포스파티딜에탄올아민류로서는, 디올레일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 디미리스토일포스파티딜에 탄올아민, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE) 등이 바람직하다.
또, 본 발명의 리포솜을 구성하는 지질로서 사용하는 경우, 포스파티딜세린류로서는, 디올레일포스파티딜세린(DOPS), 디팔미토일포스파티딜세린(DPPS) 등이 바람직하다.
본 발명의 리포솜을 구성하는 지질로서 사용하는 경우, 포스파티딘산류 혹은 장사슬 알킬인산염류로서는, 디미리스토일포스파티딘산, 디팔미토일포스파티딘산, 디스테아로일포스파티딘산, 디세틸인산 등이 바람직하다.
본 발명의 리포솜을 구성하는 지질로서 사용하는 경우, 포스파티딜글리세롤류로서는, 디미리스토일포스파티딜글리세롤, 디팔미토일포스파티딜글리세롤, 디스테아로일포스파티딜글리세롤 등이 바람직하다.
바람직하게는, 상기에 예로 든 화합물 중에서도, DOPE, DPPC, DSPC, DPPS, DSPE, Chol 등이 사용된다.
상기의 지질을 혼합하여 사용하는 경우, 각각의 지질의 배합 비율은 리포솜의 원하는 크기, 원하는 유동성 등에 의해 적절히 결정할 수 있다. 본 발명에 있어서는, DOPE ： DPPC 를 1 ： 1 로 혼합하여 리포솜을 제조하는 것이 바람직하다.
리포솜은, 그 구조 또는 제조법에 의해, MLV (multilamellar vesicles, 다중층 리포솜), DRV (dehydration-rehydration vesicles, 재수화 리포솜), LUV (large umilamellar vesicles, 큰 단층 리포솜) 혹은 SUV (small unilamellar vesicles, 작은 단층 리포솜) 등으로 분류된다. 본 발명의 숙시닐화 폴리글리시돌 (SucPG) 을 함유하는 리포솜에도 다층막으로 구성되는 MLV, DRV, LUV, 또는 SUV 등의 종류가 존재한다.
SucPG 를 함유하는 리포솜을 제조할 때에는, 종래부터 알려져 있는 리포솜의 제조 방법이면, 어떠한 방법을 사용해도 된다. 리포솜의 제조 방법으로서는, 당해 기술 분야에 있어서, 지금까지 여러 가지의 방법이 알려져 있다.
예를 들어, 일반적인 리포솜의 제조 방법으로서 (1) 지질을 적당한 유기 용매 (예를 들어, 클로로포름, 에테르 등) 에 용해시켜, 감압 하에서 이들 용매를 증류 제거하고, 일단 지질 박막을 형성시킨 후, 이 지질 박막을 기계적 교반 수단에 의해 물에 수화 (또는 팽윤) 시키는 방법, (2) 지질을 에테르 혹은 에탄올 등의 유기 용매에 용해시켜, 이 용액을 고온에 따뜻하게 한 수중에 시린지 혹은 노즐 등으로부터, 가압 하에서, 일정 속도로 주입하고, 주입과 함께 유기 용매가 증류 제거 혹은 희석됨으로써 지질이 이중층을 형성하고, 리포솜이 조제되는 방법, (3) 지질을 콜산 혹은 데옥시콜산 등의 계면활성제와 함께 수용액 중에서 혼합 미셀을 형성시켜, 그 미셀 용액을 투석 혹은 겔 여과 등의 조작에 의해 콜산 혹은 데옥시콜산 등의 계면활성제를 제거하고, 리포솜을 조제하는 방법, (4) 지질을 용해한 유기 용매를 수상(水相) 에 첨가하고, 초음파 처리하고, 일단 W/O형 에멀션을 형성하고, 이어서 유기 용매를 제거함으로써 겔화시켜, 이 겔을 기계적 교반에 의해 전상(轉相)시켜 리포솜을 조제하는 방법, (5) 박막을 형성시킨 지질에 수계 용매를 추가하여 수화ㆍ팽윤시켜, 기계적 진동에 의해 용기로부터 지질 박막을 박리시킨 후, 초 음파 처리, 또는 프렌치 프레스, 가압 여과기 혹은 익스트루더를 사용하여 일정한 크기의 구멍을 통과시킴으로써 리포솜을 제조하는 방법, (6) 리포솜을 동결건조시킨 후, 수계 용매로 재수화시킴으로써 리포솜을 제조하는 방법 등을 들 수 있다.
본 발명의 백신 담체에는, 면역 부활 활성을 추가하는 것을 목적으로 하고, 아쥬반트가 추가로 함유되어도 된다. 본 발명의 백신 담체에 함유시킬 수 있는 아쥬반트로서는, 모노포스폴릴리피드 A, 사이토카인, 렉틴 등을 들 수 있다.
본 발명의 백신 담체에 함유시킨 면역원에는, 특별히 한정되지 않고, 사람 또는 동물 (포유 동물, 어류 등) 에 있어서 백신 접종이 요망되는 면역원의 어느 것을 함유시켜도 된다. 면역원으로서는, 세균 유래의 면역원, 바이러스 유래의 면역원, 원충 유래의 면역원 등이 함유된다.
예를 들어, 본 발명의 백신 담체를 사람의 면역원에 적용하는 경우, 바이러스 유래의 면역원으로서 인플루엔자 바이러스 항원, SARS 바이러스 항원, AIDS 바이러스 항원 등의 어느 하나를 세균 유래의 면역원으로서 병원성 대장균 O-157 항원, 살모넬라 항원, 황색 포도상구균 항원, 에로모나스 항원, 결핵균 항원 등의 어느 하나를 원충 유래의 면역원으로서 트리파노소마 항원, 코크시듐 항원, 말라리아 항원, 타일레리아 항원 등 중 어느 하나를 백신 담체에 함유시켜도 된다.
본 발명의 백신 담체를 동물의 면역원에 적용하는 경우, 가축의 감염증으로서 중요한 감염 병원체 유래의 항원 중 어느 하나, 예를 들어 닭의 경우에는, 세균 유래의 면역원인 Salmonella enterica 혈청형 Enteritidis 항원, Haemophilus paragallinarum 항원 등, 바이러스 유래의 면역원인 닭 인플루엔자 바이러스 항원, 뉴캐슬병 바이러스 항원, 전염성 기관지염 바이러스 항원 등, 원충 유래의 면역원인 류코사이토준 항원, 아이메리아 항원 등；돼지의 경우에는, 바이러스 유래의 면역원인 전염성 위장염 바이러스 항원, 세균 유래의 면역원인 Bordetella bronchiseptica 항원, 원충 유래의 면역원인 톡소플라즈마 항원, 아이메리아 항원 등；소의 경우에는, 바이러스 유래의 면역원인 소 바이러스성 설사ㆍ점막병 바이러스 항원, 세균 유래의 면역원인 황색 포도상구균 항원, Mycobacterium avium 아종 paratuberculosis 항원, 원충 유래의 면역원인 타일레리아 항원, 바베시아 항원 등；말의 경우에는, 바이러스 유래의 면역원인 말 비폐렴 바이러스 항원, 말 인플루엔자 바이러스 항원, 원충 유래의 면역원인 트리파노조마 항원, 바베시아 항원 등；어류의 경우에는, 세균 유래의 면역원인 비브리오 항원, 에로모나스 항원 등, 바이러스 유래의 면역원인 전염성 췌장 괴사증 바이러스 항원, 이리도바이러스 항원 등, 원충 유래의 면역원인 익티오보도 원충항원, 헥사미타 원충항원 등；을 함유시킬 수 있다.
실시예 1 ： 숙시닐화 폴리글리시돌 ( SucPG ) 리포솜의 제조
SucPG 를 함유하는 리포솜으로서 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC)(Sigma) 과 디올레일포스파티딜에탄올아민(DOPE)(Sigma) 의 몰비 1 ： 1 (각각 10μ몰) 로 이루어지는 지질 조성에, SucPG 를 지질 중량비로 10%, 20% 또는 30% 첨가하고, SucPG 농도가 상이한 3 종류의 SucPG 를 함유하는 리포솜을 제조하였다. 본 실시예에서 사용하는 SucPG 는, 알킬기로서 탄소수 10 의 n-데실기를 갖는 것이며, 문헌에 기재된 방법에 따라, 합성하였다 (Kono K., et al., J.Controlled Release, 68, 225-235 (2000)；Kono K., et al., Biochim. Biophys. Acta, 1325, 143-154 (1997)；또는 Kono K., et al., Biochim. Biophys. Acta, 1193, 1-9 (1994)). 구체적으로는, 폴리에피클로로히드린을 디메틸포름아미드 중, 아세트산 칼륨 존재 하에서, 175℃, 6시간 반응시킴으로써 폴리글리시딜아세테이트를 제조하고, 제조된 폴리글리시딜아세테이트를 추가로 메틸카르비톨 중, 아세트산 칼륨 존재 하에서 150℃, 1 시간 반응시킴으로써 폴리글리시돌을 합성하였다. 이와 같이 합성된 합성 고분자 폴리글리시돌을 무수 숙신산과 N,N-디메틸포름아미드 중에 있어서 80℃ 에서 6시간 반응시킴으로써 SucPG 를 제조하였다.
리포솜의 제조는, 예를 들어 특허 문헌 1 에 기재하는 바와 같이 제조한다. 구체적으로는, 먼저 2μ몰의 DPPC, 2μ몰의 DOPE 및 SucPG 를 유기 용매 중에 용해하고, 코니컬플라스크 중에서 혼합한다. 이 지질을, 로터리에버포레이터를 사용하여 건조시키고, 그리고 데시케이터 중에서 감압 하에서 30분간 정치(靜置)한다. 모델 항원으로서 4mg/㎖ 의 난백 알부민 (OVA) 을 첨가하여 35∼40℃ 에서 3분간 인큐베이트한 후, 격렬하게 진동 교반함으로써, 지질 필름을 분산시킨다. 이와 같이 하여, 리포솜 중에 모델 항원의 OVA 를 봉입시킨다. 한편, 리포솜 중에 봉입되지 않은 OVA 를, 14000g 으로 20분간, 4℃ 에서 원심 처리하는 것을 반복함으로써 제거하고, 모델 항원 OVA 를 봉입한 리포솜을 정제한다. 이와 같이 하여, 다중층형 리포솜 (OVA-SucPG-리포솜)(MLV) 을 제조하였다.
실시예 2 ： 숙시닐화 폴리글리시돌 ( SucPG ) 리포솜에 의한 백신을 경점막 투여했을 경우의 면역 응답의 검토
본 실시예는, 실시예 1 에 있어서 제조된 SucPG 를 함유하는 리포솜에 의한 백신을 경점막 투여했을 경우의 면역 응답에 대해, SucPG 를 함유하지 않은 리포솜에 의한 백신과 비교 검토하는 것을 목적으로 하여 실시하였다.
SucPG 를 함유하는 리포솜에 의한 백신은, 실시예 1 에 기재하는 바와 같이 제조하였다. 한편, SucPG 를 함유하지 않은 리포솜에 의한 백신으로서 DPPC ： DOPE 의 몰비 1 ： 1 로 이루어지는 지질 조성으로 OVA 를 봉입시킴으로써, 다중층형 리포솜 (OVA-리포솜)(MLV) 에 의한 백신을 제조하였다.
상기와 같이 하여 제조된 OVA-SucPG-리포솜에 의한 백신 및 OVA-리포솜에 의한 백신, 또한 OVA 만에 의한 백신의 각각을, BALB/c 마우스에 대해 경비적으로 7 일 간격으로 2회, 각각 100㎍/마리의 OVA 가 되도록 투여하였다.
면역원의 최종 투여 후 7 일 후에 안와 정맥총으로부터 혈액을 0.1㎖ 채취하고, 그 혈액으로부터 회수된 혈청을 사용하여, 항 OVA 항체 (IgM, IgG, 또는 IgE) 의 생성에 대해 ELISA 법에 의해 검토하였다. 또, 최종 투여 후 7일 후에 장액을 채취하고, 항 OVA 항체 (IgA, 또는 IgG) 의 생성에 대해 ELISA 법에 의해 검토하였다. 또한, 얻어진 면역 혈청을 사용하여, 항 OVA-IgG 의 서브 클래스에 대해서도 ELISA 법을 사용하여 해석하였다.
결과를 도 1∼도 3 에 나타낸다. 도 1 은, OVA-SucPG-리포솜에 의한 백신, OVA-리포솜에 의한 백신, 및 OVA 만에 의한 백신을, BALB/c 마우스의 경비적으로 면역시켰을 경우의 면역 응답에 대해 혈청 중의 항체 클래스 유도의 결과를 나 타낸 것으로서, 흑색 칼럼은 OVA 만을 면역시켰을 경우 (OVA), 회색 칼럼은 OVA-리포솜을 면역시켰을 경우 (OVA-lipo), 그리고 백색 칼럼은 OVA-SucPG-리포솜을 면역시켰을 경우 (OVA-SucPG-lipo) 의 결과를 각각 나타낸다. 도 2 는, 혈청 중에 유도된 항 OVA-IgG 항체의 서브 클래스를 추가로 나타낸 것이다. 도 3 은, 경비적으로 면역시켰을 경우의 장액 중의 항체 클래스 유도의 결과를 나타낸 것이다. 도 2 및 도 3 에 있어서, 각 칼럼의 면역 항원에 관한 설명은, 도 1 에 있어서 상기 서술한 것과 동일하다.
도 1 에 나타나는 결과로부터, 각종 면역원을 BALB/c 마우스의 비강 내에 면역시켰을 경우, IgA 및 IgG 클래스의 항체가 체내에서 생성되는 것을 알 수 있고, 전체적으로 IgG 클래스 항체가 IgA 클래스 항체보다 생성량이 많았다. 또, 각 클래스의 항체에 대해, 백신 담체의 종류와 생성되는 항체량을 대비한 결과, OVA 만에 의한 백신 또는 OVA-리포솜에 의한 백신을 면역시켰을 경우와 비교한 결과, OVA-SucPG-리포솜에 의한 백신을 사용하여 면역시킨 경우에는, 현저하게 효율적으로 항체 생성을 유도할 수 있다는 것이 나타났다 (p＜0.0027).
또, 도 2 에 나타나는 결과로부터, OVA-SucPG-리포솜에 의한 백신을 사용하여 면역시킨 경우에는, Th2 (체액성 면역) 타입의 IgG 서브 클래스인 IgG1 뿐만 아니라, Th1 (세포성 면역) 타입의 IgG 서브 클래스인 IgG2a 및 IgG3 을 유도할 수 있다는 것이 나타났다. 이에 대하여, OVA-리포솜에 의한 백신이 사용하여 면역시켰을 경우, 및 OVA 만에 의한 백신을 사용하여 면역시킨 경우에는, 거의 IgG1 밖에 생성할 수 없었지만, 그 IgG1 항체의 생성량에 대해서도, OVA-SucPG-리포솜에 의한 백신을 사용하여 면역시킨 경우에는, 다른 백신 담체에 의한 백신 (OVA-리포솜에 의한 백신 또는 OVA 만에 의한 백신) 을 사용하여 면역시켰을 경우보다, 현저하게 효율적으로 항체 생성을 유도할 수 있다는 것이 나타났다 (p＜0.011).
또, 도 3 에서, OVA-SucPG-리포솜에 의한 백신을 경비적으로 사용하면, OVA-SucPG-리포솜에 의한 백신과 비교하여, 효율적으로 장관에 항체 생성을 유도할 수 있다는 것이 나타났다.
따라서, 일반적으로, SucPG 를 함유하는 리포솜에 의한 백신을 경점막 투여했을 경우, 항원 제시 세포에 대해 효율적으로 항원 도입을 할 수 있고, 그 결과적으로 높은 혈중에서의 항체 생성 및 높은 장관에서의 항체 생성을 유도할 수 있다는 것, 그리고 또한 체액성 면역 뿐만 아니라, 세포성 면역 응답의 유도를 실시할 가능성이 나타났다.
실시예 3 ： SucPG 를 함유하는 리포솜에 의한 백신의 경점막 투여에 의한 세포성 면역 응답의 유도
실시예 2 에 있어서, SucPG 를 함유하는 리포솜에 의한 백신을 사용하여 항원을 경점막 투여를 통해서 면역시킴으로써, 세포성 면역 응답의 유도를 실시할 가능성이 나타났다는 점에서, 본 실시예에 있어서는, SucPG 를 함유하는 리포솜에 의한 백신을 사용한 경우의 세포성 면역 응답능에 대해 검토하였다.
실시예 1 에 있어서 제조된 OVA-SucPG-리포솜에 의한 백신을, BALB/c 마우스의 비강 내에 7 일 간격으로 2회, 100㎍/마리의 OVA 가 되도록 투여하였다. 최종 투여 후 7 일 후에 마우스를 희사(犧死)시켜, 비장을 적출하고, 비중 원심법에 의해, 비장 림프구를 정제하였다.
정제 비장 림프구로부터 TRIzolTM(Invitrogen사) 를 사용하여 전체 RNA 를 추출하고, 세포성 면역의 지표인 IFN-γ 및, IL-4 의 mRNA 발현에 대해, RT-PCR 법으로 조사하였다.
먼저, 전체 RNA 로부터 cDNA 를 합성하였다. 전체 RNA 1㎍∼5㎍ 와 올리고 (dT)12-18 프라이머 500ng, dNTP Mix 10nmol 를 총량이 12㎕ 가 되도록 혼합하고, 65℃ 에서 5분간 반응시켜, 빙상에서 급속히 냉각하였다. 이어서, 4㎕ 의 5×First-Strand Buffer, 2㎕ 의 0.1M DTT, 1㎕ 의 RNaseOUTTM Recombinant Ribonuclease Inhibitor (40 units/㎕)(Invitrogen사) 를 첨가하여, 42℃ 에서 2분간 반응시켜, SuperScriptTM II 역전사 효소 (Invitrogen사) 를 200 units 첨가하였다. 추가로 42℃에서 50분간 반응시킨 후, 역전사 효소를 비활화하기 위해, 70℃ 에서 15분간 반응시켰다.
얻어진 cDNA 1㎕ 와 각 프라이머 2.5pmol, 37.5nmol MgCl2, 10nmol dNTP Mix, 1 unit Taq DNA Polymerase(Invitrogen사) 를 PCR Buffer 에 첨가하여 총량을 25㎕ 로 하고, TaKaRa PCR Thermal Cycler MP TP3000 (TaKaRa사) 로 PCR 반응을 실시하였다. PCR 반응은, 94℃ 에서 5분간 반응 후, 94℃ 45초, 60℃ 45초, 72℃ 2 분의 반응을 35회 반복하고, 72℃ 에서 7분간 반응시킴으로써 실시하였다. PCR 후의 샘플은 2% 의 아가로오스겔 위에서 전기 영동하고, 에티듐브로마이드로 염색하여 가시화하였다.
본 실시예에 있어서는, 마우스 IFN-γ 유전자를 증폭하기 위한 프라이머로서
포워드 프라이머 ： 5'-tgcatcttggcttgcagctcttcctcatggc-3'(SEQ ID NO : 1), 및 리버스 프라이머 ： 5'-tggacctgtgggttgttgacctcaaacttggc-3'(SEQ ID NO : 2), 그리고 마우스 IL-4 유전자를 증폭하기 위한 프라이머로서, 포워드 프라이머 ： 5'-ccagctagttgtcatcctgctcttctttctcg-3'(SEQ ID NO : 3), 및 리버스 프라이머 ： 5'-cagtgatgtggacttggactcattcatggtgc-3'(SEQ ID NO : 4) 를 사용하였다 (각각 CLONTEC사). 대조로서 마우스 G3PDH 유전자를 증폭하기 위한 프라이머로서, 포워드 프라이머 ： 5'-accacagtccatgccatcac-3'(SEQ ID NO : 5), 및 리버스 프라이머 ： 5'-tccaccaccctgttgctgta-3'(SEQ ID NO : 6) 도 사용하였다.
IFN-γ 및 IL-4 의 mRNA 의 발현에 대한 측정 결과를, 도 4 에 나타낸다. 도 4 의 레인 1 은 양성 대조, 레인 2 는 200㎕ 의 생리 식염수를 복강 내에 주사한 음성 대조 마우스 유래의 전체 RNA, 레인 3 은 OVA-SucPG-리포솜을 복강 내에 면역시킨 마우스 유래의 전체 RNA, 그리고 레인 4 는 OVA 를 함유하지 않은 SucPG-리포솜을 복강 내에 면역시킨 음성 대조 마우스 유래의 전체 RNA 를 각각 주형으로서 RT-PCR 을 실시한 결과를 나타낸다. 도 4 에 나타내는 바와 같이, OVA-SucPG-리포솜을 면역시킨 마우스의 비장 림프구에 있어서, 세포성 면역 반응의 지표인 IFN-γ 의 mRNA 및 체액성 면역 반응의 지표인 IL-4 의 mRNA 의 양방이 발현되어 있다는 것이 밝혀졌다.
또 본 실시예에 있어서는, 동시에, 정제 비장 림프구를 OVA 첨가 배지에서 5 일간 배양하고, 배양상청 중에 방출된 IFN-γ 량 및 IL-4 량을 세포성 면역 그리고 체액성 면역의 지표로서 측정하였다. 배양상청 중의 IFN-γ 및 IL-4 의 정량은, 각각의 정량 키트 (Endogen사) 를 사용하여 실시하였다.
비장 림프구 배양상청 중에 방출된 IFN-γ 량 및 IL-4 량의 정량 결과를 도 5 에 나타낸다. 도 5 의 레인 1 은 OVA 를 함유하지 않은 SucPG-리포솜을 비강 내에 면역시킨 음성 대조 마우스 유래의 비장 림프구로부터 생성된 IFN-γ 량 및 IL-4 량을, 그리고 레인 2 는 OVA-SucPG-리포솜을 비강 내에 면역시킨 마우스 유래의 비장 림프구로부터 생성된 IFN-γ 량 및 IL-4 량을, 각각 나타낸다. 도 5 에 나타내는 바와 같이, OVA-SucPG-리포솜을 면역시킨 마우스의 비장 림프구의 배양상청 중에 있어서, 세포성 면역 반응의 지표인 IFN-γ 및 체액성 면역 반응의 지표인 IL-4 의 양방이 유의하게 높게 생성되어 있다는 것이 밝혀졌다 (p＜0.0001).
실시예 2 및 3 에 나타내는 결과로부터, 본 발명의 SucPG 를 함유하는 리포솜에 의한 백신은 경비면역을 실시함으로써, 체액성 면역 뿐만 아니라, 세포성 면역 또한 유도할 수 있다는 것이 나타나고, 본 발명의 SucPG 를 함유하는 리포솜이 경점막 백신의 항원 캐리어로서 유용하다는 것이 나타났다.
실시예 4 ： 숙시닐화 폴리글리시돌 ( SucPG ) 리포솜에 의한 백신의 비경점막 투여의 경우의 면역 응답의 검토
본 실시예는, 실시예 1 에 있어서 제조된 SucPG 를 함유하는 리포솜에 의한 백신을 비경점막 투여했을 경우의 면역 응답에 대해, SucPG 를 함유하지 않은 리포솜에 의한 백신 비교 검토하는 것을 목적으로 하여 실시하였다.
SucPG 를 함유하는 리포솜에 의한 백신은, 실시예 1 에 기재하는 바와 같이 제조하였다. 한편, SucPG 를 함유하지 않은 리포솜에 의한 백신으로서 DPPC ： DOPE 의 몰비 1 ： 1 로 이루어지는 지질 조성으로 OVA 를 봉입시킴으로써, 다중층형 리포솜 (OVA-리포솜)(MLV) 에 의한 백신을 제조하였다.
상기와 같이 하여 제조된 OVA-SucPG-리포솜에 의한 백신 및 OVA-리포솜에 의한 백신, 또 OVA 만에 의한 백신을, BALB/c 마우스의 복강 내에 7 일 간격으로 2회, 각각 100㎍/마리의 OVA 가 되도록 투여하였다.
면역원의 최종 투여 후 7일 후에 안와 정맥총으로부터 혈액을 0.1㎖ 채취하고, 그 혈액으로부터 회수된 혈청을 사용하여, 항 OVA 항체 (IgM, IgG, 또는 IgE) 의 생성에 대해 ELISA 법에 의해 검토하였다. 또 얻어진 면역 혈청을 사용하여, 항 OVA-IgG 의 서브 클래스에 대해서도 ELISA 법을 사용하여 해석하였다.
결과를 도 6 및 도 7 에 나타낸다. 도 6 은, OVA-SucPG-리포솜에 의한 백신, OVA-리포솜에 의한 백신, 및 OVA 만에 의한 백신이, BALB/c 마우스의 복강 내에 면역시켰을 경우의 면역 응답에 대한 결과를 나타낸 것으로서, 흑색 칼럼은 OVA 만을 면역시켰을 경우 (OVA), 회색 칼럼은 OVA-리포솜을 면역시켰을 경우 (OVA-lipo), 그리고 백색 칼럼은 OVA-SucPG-리포솜을 면역시켰을 경우 (OVA-SucPG-lipo) 의 결과를 각각 나타낸다. 도 7 은, 항 OVA-IgG 항체의 서브 클래스에 나타낸 것으로서, 각 칼럼의 면역 항원에 관한 설명은, 도 6 에 있어서 상기 서술한 것과 동일하다.
도 6 에 나타나는 결과로부터, 각종 면역원을 BALB/c 마우스의 복강 내에 면 역시켰을 경우, IgM 및 IgG 클래스의 항체가 체내에서 생성되는 것을 알 수 있고, 전체적으로 IgG 클래스 항체가 IgM 클래스 항체보다 생성량이 많았다. 또, 각 클래스의 항체에 대해, 백신 담체의 종류와 생성되는 항체량을 대비한 결과, OVA 만에 의한 백신을 면역시켰을 경우보다 OVA-리포솜에 의한 백신을 면역시켰을 경우가 항체 생성량은 많았지만, t 검정의 결과, 유의차는 존재하지 않았는데, OVA-리포솜에 의한 백신을 면역시켰을 경우와 OVA-SucPG-리포솜에 의한 백신이 사용하여 면역시켰을 경우를 비교한 결과, OVA-SucPG-리포솜에 의한 백신을 사용하여 면역시킨 경우에는, 현저하게 효율적으로 항체 생성을 유도할 수 있다는 것이 나타났다 (p＜0.019).
또, 도 7 에 나타나는 결과로부터, OVA-SucPG-리포솜에 의한 백신을 사용하여 면역시킨 경우에는, Th2 (체액성 면역) 타입의 IgG 서브 클래스인 IgG1 뿐만 아니라, Th1 (세포성 면역) 타입의 IgG 서브 클래스인 IgG2a 및 IgG3 을 유도할 수 있다는 것이 나타났다. 이에 대하여, OVA-리포솜에 의한 백신이 사용하여 면역시켰을 경우, 및 OVA 만에 의한 백신을 사용하여 면역시킨 경우에는, 거의 IgG1 밖에 생성할 수 없었지만, 그 IgG1 항체의 생성량에 대해서도, OVA-SucPG-리포솜에 의한 백신을 사용하여 면역시킨 경우에는, 다른 백신 담체에 의한 백신 (OVA-SucPG-리포솜에 의한 백신 또는 OVA 만에 의한 백신) 을 사용하여 면역시켰을 경우보다, 현저하게 효율적으로 항체 생성을 유도할 수 있다는 것이 나타났다 (p＜0.019).
따라서, 일반적으로, SucPG 를 함유하는 리포솜에 의한 백신을 비경점막 투 여했을 경우, 항원 제시 세포에 대해 효율적으로 항원 도입을 할 수 있고, 그 결과적으로 높은 항체 생성을 유도할 수 있다는 것, 그리고 또한 체액성 면역뿐만 아니라, 세포성 면역 응답의 유도를 실시할 가능성이 나타났다.
실시예 5 ： SucPG 를 함유하는 리포솜에 의한 백신의 비경점막 투여에 의한 세포성 면역 응답의 유도
실시예 4 에 있어서, SucPG 를 함유하는 리포솜을 사용하여 항원을 면역시킴으로써, 세포성 면역 응답의 유도를 실시할 가능성이 나타났다는 점에서, 본 실시예에 있어서는, SucPG 를 함유하는 리포솜을 사용한 경우의 세포성 면역 응답능에 대해 검토하였다.
실시예 1 에 있어서 제조된 OVA-SucPG-리포솜을, BALB/c 마우스의 복강 내에 7 일 간격으로 2회, 100㎍/마리의 OVA 가 되도록 투여하였다. 최종 투여 후 7일 후에 마우스를 희사시켜, 비장을 적출하고, 비중 원심법에 의해, 비장 림프구를 정제하였다. 이와 같이 하여 조제된 비장 림프구에 대해, 실시예 3 에 기재한 바와 같이, IFN-γ 및, IL-4 의 mRNA 발현에 대해 RT-PCR 법으로 배양상청 중에 방출된 IFN-γ 량 및 IL-4 량을 ELISA 법으로 각각 측정하였다.
IFN-γ 및 IL-4 의 mRNA 의 발현에 대한 측정 결과를, 도 8 에 나타낸다. 도 8 의 레인 1 은, OVA-SucPG-리포솜을 복강 내에 면역시킨 마우스 유래의 전체 RNA, 레인 2 는 양성 대조, 레인 3 은 OVA 를 함유하지 않은 SucPG-리포솜을 복강 내에 면역시킨 음성 대조 마우스 유래의 전체 RNA, 그리고 레인 4 는 200㎕ 의 생리 식염수를 복강 내에 주사한 음성 대조 마우스 유래의 전체 RNA 를 각각 주형으 로서 RT-PCR 을 실시한 결과를 나타낸다. 도 8 에 나타내는 바와 같이, OVA-SucPG-리포솜을 면역시킨 마우스의 비장 림프구에 있어서, 세포성 면역 반응의 지표인 IFN-γ 의 mRNA 및 체액성 면역의 지표인 IL-4 의 mRNA 의 양방이 발현되어 있다는 것이 밝혀졌다.
또 비장 림프구 배양상청 중에 방출된 IFN-γ 량 및 IL-4 량의 정량 결과를 도 9 에 나타낸다. 도 9 의 레인 1 은 OVA 를 함유하지 않은 SucPG-리포솜을 복강 내에 면역시킨 음성 대조 마우스 유래의 비장 림프구로부터 생성된 IFN-γ 량 및 IL-4 량을, 그리고 레인 2 는 OVA-SucPG-리포솜을 복강 내에 면역시킨 마우스 유래의 비장 림프구로부터 생성된 IFN-γ 량 및 IL-4 량을 각각 나타낸다. 도 9 에 나타내는 바와 같이, OVA-SucPG-리포솜을 면역시킨 마우스의 비장 림프구의 배양상청 중에 있어서, 세포성 면역 반응의 지표인 IFN-γ 및 체액성 면역의 지표인 IL-4 의 양방이 유의하게 높게 생성되어 있는 것이 밝혀졌다 (p＜0.0001).
실시예 4 및 5 에 나타내는 결과로부터, 본 발명의 SucPG 를 함유하는 리포솜에 의한 백신은 비경비적 면역을 실시하는 경우라도, 경비면역을 실시하는 경우와 마찬가지로, 체액성 면역뿐만 아니라, 세포성 면역 또한 유도할 수 있다는 것이 나타나고, 본 발명의 SucPG 를 함유하는 리포솜이 비경점막 백신의 항원 캐리어로서도 유용하다는 것이 나타났다.
실시예 6 ： 살모넬라 항원- SucPG -리포솜에 의한 백신에 의한, 닭에 대한 점안 (경점막) 면역
본 실시예는, Salmonella Enteritidis 항원을 면역원으로서 함유하는 SucPG 를 함유하는 리포솜에 의한 백신을, 닭에 대해, 점안 (경점막) 투여했을 경우의 면역 응답에 대해, 검토하는 것을 목적으로 하여 실시하였다.
본 실시예에 있어서 사용하는 면역원, Salmonella Enteritidis 항원은 이하와 같이 조제하였다. 먼저 Salmonella Enteritidis (1227주) 를 하트인퓨젼 배지 (닛스이 제약) 에 접종하고, 37℃ 에서 14시간 배양한 후, 7×1014 CFU 의 Salmonella Enteritidis 세균을 채취하였다. 이 채취된 Salmonella Enteritidis 균을 과잉량의 포르말린에 의해 변성시켜 불활화시키고, 포르말린을 제거한 후, 추가로 초음파 처리를 함으로써 항원액을 조제하였다. 이와 같이 조제된 Salmonella Enteritidis 항원을 함유하는 SucPG 를 함유하는 리포솜에 의한 백신 (Salmonella Enteritidis 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신) 은, 기본적으로 실시예 1 에 기재하는 방법에 따라 제조하였다.
상기와 같이 하여 제조된 Salmonella Enteritidis 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을, 생후 3주령의 닭 (백색 레그혼), 5 마리에 대해, 100㎍/마리의 양의 Salmonella Enteritidis 항원이 되도록, 점안에 의해 1회 투여하였다.
면역원의 투여 후 14일 후 (2주 (5주령)), 및 35일 후 (5주(8주령)) 에 익하 정맥으로부터 혈액을 2.0㎖ 채취하고, 그 혈액으로부터 회수된 혈청을 사용하여, 항 Salmonella Enteritidis 항원 항체 (IgG 또는 IgA) 의 생성에 대해 ELISA 법에 의해 검토하였다. 대조로서 Salmonella Enteritidis 항원으로 면역되기 전 (pre(3주령)) 의 닭 개체로부터 얻은 혈청을 사용하였다.
결과를 도 10 에 나타낸다. 도 10 에 있어서, 흑색 칼럼은 IgG 항체의 항체가에 대한 결과를 (도 10A), 그리고 백색 칼럼은 IgA 항체의 항체가에 대한 결과를 (도 10B), 각각 나타낸다. 그리고, 면역 전 (Day 0) 의 닭 개체에 있어서의 항체의 항체가와 비교하여, 유의차 (p＜0.0001) 가 존재하는 경우에 * 표시를 부여하였다. 데이터는, 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 10 에 나타나는 결과로부터, Salmonella Enteritidis 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을 닭에 대해 점안 투여함으로써 면역시켰을 경우, IgG 및 IgA 클래스의 항체가 양방 모두 체내에서, 「pre(3주령)」의 경우와 비교하여 현저하게 생성되는 것을 알 수 있는데, 장기적으로 (면역원의 최종 투여 후부터 5주간 (8주령)) 보면, IgG 클래스 항체가 IgA 클래스 항체보다 생성량이 많다는 경향이 있었다.
이 결과로부터, Salmonella Enteritidis 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을 점안 (경점막) 투여함으로써 닭을 면역시키면, 혈중에서의 높은 항체 생성을 유도할 수 있다는 것이 나타났다.
실시예 7 ： 트리파노소마 항원- SucPG -리포솜에 의한 백신에 의한, 마우스에 대한 경비 (경점막) 면역
본 실시예는, 트리파노소마 (Trypanosoma brucei) 의 항원을 면역원으로서 함유하는 SucPG 를 함유하는 리포솜에 의한 백신을, 마우스에 대해, 경비 (경점막) 투여했을 경우의 면역 응답에 대해, 검토하는 것을 목적으로 하여 실시하였다.
본 실시예에 있어서 사용하는 면역원, T.brucei 항원을 얻기 위해서, 먼저 T.brucei 원충을 채취하였다. 채취의 방법은 문헌에 기재된 방법에 따랐다 (Lanham, S.M., Nature, 218, 1273-1274 (1968)). 구체적으로는, T.brucei 원충 (1×105개) 을 위스타 래트 (일본 SLC) 의 복강 내에 접종하고, 4일 후 심장으로부터 전혈을 회수하였다. 회수된 혈액은 헤파린 (10units/㎖) 으로 응고 방지를 실시하고, 원심 (1300×g, 10분) 처리에 의해 버피코트를 회수하였다. 회수된 버피코트로부터 DE52 셀룰로오스 (Whatman사) 칼럼에 의해 원충을 정제ㆍ채취하였다. 채취된 T.brucei 원충을 초음파 처리함으로써 파쇄하고, T.brucei 항원을 얻었다. 이와 같이 얻어진 T.brucei 항원을 함유하는 SucPG 를 함유하는 리포솜에 의한 백신 (T.brucei 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신) 은, 기본적으로 실시예 1 에 기재하는 방법에 따라 제조하였다.
상기와 같이 하여 제조된 T.brucei 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을, 생후 6주령의 Balb/c 마우스 (일본 SLC), 5 마리에 대해, 100㎍/마리의 양의 T.brucei 항원이 되도록 경비적으로 투여하고, 2주일 후에 동일량의 T.brucei 항원을 첨가로 경비적으로 투여하여 면역시켰다.
면역원의 첫회 투여 후 14일 후 (Day 14), 및 최종 투여 후 7일 후 (Day 21) 에 안와 정맥총으로부터 혈액을 0.1㎖ 채취하고, 그 혈액으로부터 회수된 혈청을 사용하여, 항T.brucei 항원 항체 (IgG 또는 IgM) 의 생성에 대해 ELISA 법에 의해 검토하였다. 대조로서 T.brucei 항원으로 면역되기 전 (Day 0) 의 마우스 개체로부터 얻은 혈청을 사용하였다.
결과를 도 11 에 나타낸다. 도 11 에 있어서, 흑색 칼럼은 IgM 항체의 항체가에 대한 결과를, 그리고 백색 칼럼은 IgG 항체의 항체가에 대한 결과를 각각 나타낸다. 그리고, 면역 전 (Day 0) 의 마우스 개체에 있어서의 항체가와 비교하여 유의 차 (p＜0.0012) 가 존재하는 경우에 ＃ 표시를, 유의 차 (p＜0.0006) 가 존재하는 경우에 ＄ 표시를, 유의 차 (p＜0.0001) 가 존재하는 경우에 * 표시를 각각 부여하였다. 데이터는, 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 11 에 나타나는 결과로부터, T.brucei 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을 마우스에 대해 경비 투여함으로써 면역시켰을 경우, IgM 및 IgG 클래스의 항체가 체내에서, Day 0 의 경우와 비교하여 현저하게 생성되는 것을 알 수 있고, 전체로서는, IgG 클래스 항체가 IgM 클래스 항체보다 생성량이 많다는 경향이 있었다.
이 결과로부터, T.brucei 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을 경비적 (경점막) 투여함으로써 마우스를 면역시키면, 혈중에서의 높은 항체 생성을 유도할 수 있다는 것이 나타났다.
실시예 8 ： 황색 포도상구균 항원- SucPG -리포솜에 의한 백신에 의한, 착유 소에 대한 경비 (경점막) 면역
본 실시예는, 황색 포도상구균 (Staphylococcus aureus) 의 항원을 면역원으로서 함유하는 SucPG 를 함유하는 리포솜에 의한 백신을, 소에 대해, 경비 (경점막) 투여했을 경우의 면역 응답에 대해, 검토하는 것을 목적으로 하여 실시하였다.
본 실시예에 있어서 사용하는 면역원, S.aureus 항원은, 먼저 S.aureus (Cowan I주) 를 LB 배지 (닛스이 제약) 에 접종하고, 37℃ 에서 14시간 배양한 후 S.aureus 세균을 채취하였다. 이 채취된 S.aureus 세균을 과잉량의 포르말린에 의해 변성시켜 불활화시키고, 포르말린을 제거한 후, 추가로 초음파 처리를 함으로써 항원액을 조제하였다. 이와 같이 조제된 S.aureus 항원을 함유하는 SucPG 를 함유하는 리포솜에 의한 백신 (S.aureus 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신) 은, 기본적으로 실시예 1 에 기재하는 방법에 따라 제조하였다.
상기와 같이 하여 제조된 S.aureus 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을, 홀스타인의 착유소, 3 마리에 대해, 5mg/마리의 양의 S.aureus 항원이 되도록 경비적으로 투여하고, 14일 후에 동량의 S.aureus 항원을 추가로 경비적으로 투여하여 면역시켰다.
면역원의 첫회 투여 후 14일째 (Day 14), 면역원의 최종 투여 후 7일째 (Day 21), 및 14일째 (Day 28) 에 경정맥으로부터 혈액을 5㎖ 채취하고, 그 혈액으로부터 회수된 혈청을 사용하여, 항 S.aureus 항원 항체 (IgA 또는 IgG) 의 생성에 대해 ELISA 법에 의해 검토하였다. 대조로서 S.aureus 항원으로 면역되기 전 (Day 0) 의 착유소 개체로부터 얻은 혈청을 사용하였다.
결과를 도 12 에 나타낸다. 도 12 에 있어서, 흑색 칼럼은 IgA 항체의 항체가에 대한 결과를, 그리고 백색 칼럼은 IgG 항체의 항체가에 대한 결과를 각각 나타낸다. 그리고, 면역 전 (Day 0) 의 착유소 개체에 있어서의 항체가와 비교하여, 유의 차 (p＜0.018) 가 존재하는 경우에 ＃ 표시를, 유의 차 (p＜0.039) 가 존재하는 경우에 ＆ 표시를, 유의 차 (p＜0.0076) 가 존재하는 경우에 * 표시를, 유의 차 (p＜0.0001) 가 존재하는 경우에 ＠ 표시를, 유의 차 (p＜0.017) 가 존재 하는 경우에
Figure 112008063210420-PCT00001
표시를 각각 부여하였다. 데이터는, 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 12 에 나타나는 결과로부터, S.aureus 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을 착유소에 대해 경비 투여함으로써 면역시켰을 경우, 혈중에서는 거의 동일한 정도의 IgG 및 IgA 클래스의 항체가 Day 0 의 경우와 비교하여 현저하게 생성되는 것을 알 수 있었다.
또, 면역원의 첫회 투여 후 14일째 (Day 14), 면역원의 최종 투여 후 7일째 (Day 21), 및 14일째 (Day 28) 에 젖을 채취하고, 항 S.aureus 항원 항체 (IgG 또는 IgA) 의 생성에 대해 ELISA 법에 의해 검토하였다. 대조로서 S.aureus 항원으로 면역되기 전 (Day 0) 의 착유소 개체로부터 얻은 젖을 사용하였다.
결과를 도 13 에 나타낸다. 도 13 에 있어서, 흑색 칼럼은 IgA 항체의 항체가에 대한 결과를, 그리고 백색 칼럼은 IgG 항체의 항체가에 대한 결과를 각각 나타낸다. 그리고, 면역 전 (Day 0) 의 착유소 개체에 있어서의 항체가와 비교하여, 유의 차 (p＜0.0046) 가 존재하는 경우에 ＃ 표시를, 유의 차 (p=0.054) 가 존재하는 경우에 ＆ 표시를, 유의 차 (p＜0.011) 가 존재하는 경우에 * 표시를, 유의 차 (p＜0.02) 가 존재하는 경우에 ＠ 표시를, 유의 차 (p＜0.025) 가 존재하는 경우에 † 표시를 각각 부여하였다. 데이터는, 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 13 에 나타나는 결과로부터, S.aureus 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을 착유소에 대해 경비 투여함으로써 면역시켰을 경우, 젖 중에서 IgG 및 IgA 클래스 의 항체가, Day 0 의 경우와 비교하여 현저하게 생성되는 것을 알 수 있고, 전체로서는, IgA 클래스 항체가 IgG 클래스 항체보다 생성량이 많다는 경향이 있었다.
이들 결과로부터, S.aureus 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을 경비적 (경점막) 투여함으로써 착유소를 면역시키면, 혈중 및 젖 중의 어느 것에서 현저하게 높은 항체 생성을 유도할 수 있다는 것이 나타났다.
실시예 9 ： Aeromonas salmonicida 항원- SucPG -리포솜에 의한 백신에 의한, 잉어에 대한 경구 면역
본 실시예는, Aeromonas salmonicida 의 항원을 면역원으로서 함유하는 SucPG 를 함유하는 리포솜에 의한 백신을, 잉어에 대해, 경구 (경점막) 투여했을 경우의 면역 응답에 대해, 검토하는 것을 목적으로 하여 실시하였다.
본 실시예에 있어서 사용하는 면역원, A.salmonicida 항원은, 먼저 A.salmonicida (T1031주) 를 하트인퓨젼 배지에 접종하고, 20℃ 에서 24시간 배양한 후, A.salmonicida 세균을 채취하고, 이 채취된 A.salmonicida 세균을 과잉량의 포르말린에 의해 변성시켜 불활화시키고, 포르말린을 제거한 후, 추가로 초음파 처리를 함으로써 조제하였다. 이와 같이 하여 조제된 A.salmonicida 항원의 일부는 그대로 면역원으로서 다른 일부를 A.salmonicida 항원을 함유하는 SucPG 를 함유하는 리포솜에 의한 백신을 조제하기 위해, 각각 사용하였다. 비활화된 A.salmonicida 항원을 함유하는 SucPG 를 함유하는 리포솜에 의한 백신 (A.salmonicida 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신) 은, 기본적으로 실시예 1 에 기재하는 방법에 따라 제조하였다.
상기와 같이 하여 제조된 A.salmonicida 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을, 잉어 (오사카부립 쇼쿠토 미도리의 종합 기술 센터ㆍ수성 생물 센터로부터 분여), 6 마리에 대해, 200㎍/마리의 양의 A.salmonicida 항원이 되도록, 경구적으로, 2주간 간격으로 3회 투여하여 면역시켰다. 한편, 대조로서 A.salmonicida 항원만을, 4마리의 잉어에 대해 200㎍/마리의 양의 A.salmonicida 항원이 되도록, 경구적으로, 2주간 간격으로 3회 투여하여 면역시켰다.
면역원의 첫회 투여시 (Day 0), 2번째 투여시 (Day 14), 3번째 투여시 (Day 28), 및 최종 투여 후 14일 후 (Day 42) 에 꼬리자루부로부터 혈액을 1㎖ 채취하고, 그 혈액으로부터 회수된 혈청을 사용하여, 항A.salmonicida 항원 항체의 생성에 대해 ELISA 법에 의해 검토하였다. 대조로서 A.salmonicida 항원만으로 면역시킨 잉어 개체로부터 얻은 혈청을 사용하였다.
결과를 도 14 에 나타낸다. 도 14 에 있어서, 흑동그라미 (●) 는 A.salmonicida 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신에 의해 경구 면역시킨 잉어의 항체의 항체가에 대한 결과를, 그리고 흑삼각 (▲) 은 A.salmonicida 항원에 의해서만 경구 면역시킨 잉어의 항체의 항체가에 대한 결과를 각각 나타낸다. 그리고, A.salmonicida 항원에 의해서만 경구 면역시킨 잉어의 항체의 항체가와 비교하여, 유의 차 (p＜0.01) 가 존재하는 경우에 * 표시를 부여하였다. 데이터는, 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 14 에 나타나는 결과로부터, A.salmonicida 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을 잉어에 대해 경구 투여함으로써 면역시켰을 경우, A.salmonicida 항원에 의해 서만 경구 면역시킨 잉어와 비교하여, 혈중에서의 항체의 항체가가 현저하게 항진되는 것을 알 수 있었다.
이 결과를 받고, A.salmonicida 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신의 최종 투여 후 14일 후 (Day 42) 에, 잉어로부터 장액과 담즙을 채취하고, 항A.salmonicida 항원 항체의 생성에 대해 ELISA 법에 의해 검토하였다. 대조로서 비면역의 잉어 개체로부터 얻은 장액 및 담즙을 사용하였다.
결과를 도 15 에 나타낸다. 도 15 에 있어서, 장관 점막에 있어서의 항체의 항체가에 대한 결과를 (도 15A), 그리고 담즙 중에 있어서의 항체의 항체가에 대한 결과를 (도 15B), 각각 나타낸다. 각각의 도면에 있어서, 흑색 칼럼은 비면역의 잉어 개체에 있어서의 항체의 항체가에 대한 결과를, 그리고 백색 칼럼은 A.salmonicida 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을 투여한 잉어 개체에 있어서의 항체의 항체가에 대한 결과를 각각 나타낸다. 그리고, 비면역의 잉어 개체에 있어서의 항체의 항체가와 비교하여, 유의 차 (p＜0.01) 가 존재하는 경우에 * 표시를 부여하였다. 데이터는, 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 15 에 나타나는 결과로부터, A.salmonicida 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을 잉어에 대해 경구 투여함으로써 면역시켰을 경우, 장액 중 및 담즙 중의 어느 하나이어도, 항체의 항체가가 현저하게 항진되는 것을 알 수 있었다.
또한, A.salmonicida 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신의 최종 투여 후 14일 후에, 6 마리의 잉어를 A.salmonicida 균액 (1×106cfu/㎖) 중에 60분간 침지함으로 써 A.salmonicida 에 의한 공격을 실시하고, 그 후의 생존률의 추이를 기록하였다. 대조로서 8 마리의 비면역의 잉어 개체를 동일하게 처리하고, 그 후의 생존률의 추이를 기록하였다.
결과를 도 16 에 나타낸다. 도 16 에 있어서, 흑동그라미 (●) 는 A.salmonicida 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신에 의해 경구 면역시킨 잉어의 생존률의 추이를, 그리고 흑삼각 (▲) 은 비면역의 잉어의 생존률의 추이를 각각 나타낸다. 그리고, A.salmonicida 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신에 의해 경구 면역시킨 잉어의 생존률은 비면역의 잉어의 생존률과 비교하여 높다는 점이 나타났다.
이들 결과로부터, 어류인 잉어에 있어서도, A.salmonicida 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을 경구적 (경점막) 투여하여 면역시키면, 혈중에서 높은 항체 생성을 유도할 수 있다는 것이 나타났다.
실시예 10 ： Mycoplasma gallisepticum 항원- SucPG -리포솜에 의한 백신에 의한, 마우스에 대한 경비 ( 경점막 ) 면역
본 실시예는, Mycoplasma gallisepticum 의 항원을 면역원으로서 함유하는 SucPG 를 함유하는 리포솜에 의한 백신을, 마우스에 대해, 경비 (경점막) 투여했을 경우의 면역 응답에 대해, 검토하는 것을 목적으로 하여 실시하였다.
본 실시예에 있어서 사용하는 면역원, Mycoplasma gallisepticum 항원은, 먼저 Mycoplasma gallisepticum (S6주) 을 신선 이스트 엑기스 첨가 Fray 배지 (Difco) 에 접종하고, 37℃ 에서 48시간 이상 배양한 후, 3.58x1011 CFU 의 Mycoplasma gallisepticum 세균을 채취하였다. 이 채취된 Mycoplasma gallisepticum 세균을 과잉량의 포르말린에 의해 변성시켜 불활화시키고, 포르말린을 제거한 후, 추가로 초음파 처리를 함으로써 항원액을 조제하였다. 이와 같이 조제된 Mycoplasma gallisepticum 항원을 함유하는 SucPG 를 함유하는 리포솜에 의한 백신 (Mycoplasma gallisepticum 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신) 은, 기본적으로 실시예 1 에 기재하는 방법에 따라 제조하였다.
상기와 같이 하여 제조된 Mycoplasma gallisepticum 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을, 생후 5주령의 Balb/c 마우스 (일본 SLC), 5 마리에 대해 100㎍/마리의 Mycoplasma gallisepticum 항원이 되도록 경비적으로 투여하고, 2주일 후에 동량의 Mycoplasma gallisepticum 항원을 추가로 경비적으로 투여하여 면역시켰다.
면역원의 최종 투여 후 7일 후 (Day 21) 에 안와 정맥총으로부터 혈액을 0.1㎖ 채취하고, 그 혈액으로부터 회수된 혈청을 사용하여, 항M.gallisepticum 항체 (IgG 및 IgA) 의 생성에 대해 ELISA 법에 의해 검토하였다. 대조로서 M.gallisepticum 항원으로 면역되기 직전의 마우스 개체로부터 얻은 혈청 (Day 0) 을 사용하였다.
결과를 도 17 에 나타낸다. 도 17 은, M.gallisepticum 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을, 마우스에 대해 경비적으로 투여하여 면역시켰을 경우의 면역 응답에 대해, 혈청 중의 항체 클래스 유도의 결과를 나타낸 것으로서, 흑색 칼럼은 IgG 항체의 항체가에 대한 결과를, 그리고 백색 칼럼은 IgA 항체의 항체가에 대한 결과를 각각 나타낸다.
도 17 에 나타나는 결과로부터, M.gallisepticum 항원을 마우스에 대해 경비적으로 투여하여 면역시켰을 경우, IgG 클래스 및 IgA 클래스의 항체가 양방 모두 체내에서 생성되는 것을 알 수 있고, 전체적으로 IgG 클래스 항체가 IgA 클래스 항체보다 생성량이 많았다. 그리고, M.gallisepticum 항원으로 면역되기 직전의 마우스 개체로부터 얻은 혈청 (Day 0) 의 항체의 항체가와 비교하여, 유의 차 (p＜0.0063) 가 존재하는 경우에 ＃ 표시를, 유의 차 (p＜0.0003) 가 존재하는 경우에 * 표시를 각각 부여하였다. 데이터는, 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
따라서, SucPG 를 함유하는 리포솜에 의해 M.gallisepticum 항원에 대한 백신을 경점막 투여하면, 혈중에서의 높은 항체 생성을 유도할 수 있다는 것, 그리고 또한 체액성 면역뿐만 아니라, 세포성 면역 응답의 유도를 실시할 가능성이 나타났다.
실시예 11 ： 뉴캐슬병 바이러스 항원- SucPG -리포솜에 의한 백신에 의한, 마우스에 대한 경비 ( 경점막 ) 면역
본 실시예는, 뉴캐슬병 바이러스의 항원을 면역원으로서 함유하는 SucPG 를 함유하는 리포솜에 의한 백신을, 마우스에 대해, 경비 (경점막) 투여했을 경우의 면역 응답에 대해, 검토하는 것을 목적으로 하여 실시하였다.
본 실시예에 있어서 사용하는 면역원, 뉴캐슬병 바이러스 항원은, 시판되는 뉴캐슬병 생백신을 초음파 처리함으로써 불활화시켜 항원액을 조제하였다. 이 와 같이 조정된 뉴캐슬병 바이러스 항원을 함유하는 SucPG 를 함유하는 리포솜에 의한 백신 (뉴캐슬병 바이러스 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신) 은, 기본적으로 실시예 1 에 기재하는 방법에 따라 제조하였다.
상기와 같이 하여 제조된 뉴캐슬병 바이러스 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을, 생후 5주령의 Balb/c 마우스 (일본 SLC), 5 마리에 대해 100㎍/마리의 뉴캐슬병 바이러스 항원이 되도록 경비적으로 투여하고, 2주일 후에 동량의 뉴캐슬병 바이러스 항원을 추가로 경비적으로 투여하여 면역시켰다.
면역원의 최종 투여 후 7일 후 (Day 21) 에 안와 정맥총으로부터 혈액을 0.1㎖ 채취하고, 그 혈액으로부터 회수된 혈청을 사용하여, 항뉴캐슬병 바이러스 항원 항체 (IgG 또는 IgA) 의 생성에 대해 ELISA 법에 의해 검토하였다. 대조로서 뉴캐슬병 바이러스 항원 항원으로 면역되기 전 (Day 0) 의 마우스 개체로부터 얻은 혈청을 사용하였다.
결과를 도 18 에 나타낸다. 도 18 에 있어서, 흑색 칼럼은 IgG 항체의 항체가에 대한 결과를, 그리고 백색 칼럼은 IgA 항체의 항체가에 대한 결과를 각각 나타낸다. 그리고, 면역 전 (Day 0) 의 마우스 개체에 있어서의 항체가와 비교하여 유의 차 (p＜0.0027) 가 존재하는 경우에 ＃ 표시를, 유의 차 (p＜0.00122) 가 존재하는 경우에 * 표시를 각각 부여하였다. 데이터는 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.
도 18 에 나타나는 결과로부터, 뉴캐슬병 바이러스 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을 마우스에 대해 경비 투여함으로써 면역시켰을 경우, IgG 클래스 및 IgA 클래스의 항체가 체내에서, Day 0 의 경우와 비교하여 현저하게 생성되는 것을 알 수 있고, 전체로서는, IgG 클래스 항체가 IgA 클래스 항체보다 증가율이 높다는 경향이 있었다.
이 결과로부터, 뉴캐슬병 바이러스 항원-SucPG-리포솜에 의한 백신을 경비적 (경점막) 투여함으로써 마우스를 면역시키면, 혈중에서의 높은 항체 생성을 유도할 수 있다는 것이 나타났다.
상기 서술한 숙시닐화 폴리글리시돌을 함유하는 리포솜으로 구성되는 백신 담체를 사용하여 백신을 제조함으로써, 종래의 리포솜으로 구성되는 백신 담체를 사용했을 경우와 비교하여, 현저하게 항체가를 상승시킬 수 있는 효율적인 백신을 얻을 수 있다. 또, 상기 서술한 백신 담체를 사용하여 제조된 백신에 의해, 체액성 면역뿐만 아니라, 세포성 면역을 유도할 수도 있다.
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Claims (22)

  1. 숙시닐화 폴리글리시돌을 함유하는 리포솜으로 구성되는 백신 담체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    숙시닐화 폴리글리시돌을 10∼40 중량% 함유하는 백신 담체.
  3. 제 2 항에 있어서,
    숙시닐화 폴리글리시돌을 30 중량% 함유하는 백신 담체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    리포솜을 구성하는 지질이 디올레일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 디팔미토일포스파티딜세린(DPPS), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 난황 레시틴(egg PC) 또는 콜레스테롤 중 어느 하나, 혹은 이들 중 어느 하나의 조합으로 구성되는 백신 담체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    리포솜이 디올레일포스파티딜에탄올아민(DOPE) 및 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE) 의 조합으로 구성되는 백신 담체.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    리포솜 중에 함유되는 면역원을 항원 제시 세포에 대한 내재화를 가능하게 하는 것을 특징으로 하는 백신 담체.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    리포솜 중에 함유되는 면역원을 경점막적으로 투여하기 위한 백신 담체.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    리포솜 중에 함유되는 면역원을 비경점막적으로 투여하기 위한 백신 담체.
  9. 면역화를 위해 투여해야 할 면역원을, 숙시닐화 폴리글리시돌을 함유하는 리포솜으로 구성되는 백신 담체 중에 함유시킨 백신.
  10. 제 9 항에 있어서,
    면역원에 대한 세포성 면역을 유도시키기 위한 백신.
  11. 제 10 항에 있어서,
    면역원에 대한 체액성 면역 또한 유도시키기 위한 백신.
  12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    백신 담체 중에 숙시닐화 폴리글리시돌을 10∼40 중량% 함유하는 백신.
  13. 제 12 항에 있어서,
    백신 담체 중에 숙시닐화 폴리글리시돌을 30 중량% 함유하는 백신.
  14. 제 9 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    백신 담체의 리포솜을 구성하는 지질이 디올레일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 디팔미토일포스파티딜세린(DPPS), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 난황 레시틴(egg PC) 또는 콜레스테롤 중 어느 하나, 혹은 이들 중 어느 하나의 조합으로 구성되는 백신.
  15. 제 9 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    백신 담체 중의 리포솜이 디올레일포스파티딜에탄올아민(DOPE) 및 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE) 의 조합으로 구성되는 백신.
  16. 제 9 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    리포솜 중에 함유되는 면역원을 항원 제시 세포 중에 내재화시키는 것을 가능하게 하는 백신.
  17. 제 9 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역원을 경점막적으로 투여하기 위한 백신.
  18. 제 9 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역원을 비경점막적으로 투여하기 위한 백신.
  19. 제 9 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역원이 세균, 바이러스, 원충 중 어느 하나에서 유래되는 항원에서 선택되는 백신.
  20. 제 19 항에 있어서,
    세균이 살모넬라, 황색 포도상구균, 에로모나스, 미코플라스마에서 선택되는 백신.
  21. 제 19 항에 있어서,
    바이러스가 뉴캐슬병 바이러스인 백신.
  22. 제 19 항에 있어서,
    원충이 트리파노소마인 백신.
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