WO2007091580A1 - 新規ワクチン担体 - Google Patents

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WO2007091580A1
WO2007091580A1 PCT/JP2007/052079 JP2007052079W WO2007091580A1 WO 2007091580 A1 WO2007091580 A1 WO 2007091580A1 JP 2007052079 W JP2007052079 W JP 2007052079W WO 2007091580 A1 WO2007091580 A1 WO 2007091580A1
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vaccine
ribosome
antigen
sucpg
immunogen
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French (fr)
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Shinobu Watarai
Kenji Kono
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Nippon Biologicals, Inc.
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    • C12N2760/18151—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the present invention relates to a novel vaccine carrier using a ribosome having a membrane-fusible lipid membrane.
  • the animal's immune system functions to distinguish between self and non-self and to eliminate non-self from the body.
  • the in vivo immune response that distinguishes between self and non-self is mediated by cellular immunity using MHC class I molecules and humoral immunity using MHC class II molecules.
  • MHC class I molecules MHC class I molecules
  • humoral immunity MHC class II molecules.
  • a virus or bacterium that is an infectious disease pathogen is infected, the living body uses these cellular immunity and humoral immunity to eliminate these infectious disease pathogens.
  • Vaccination is often used as a preventive measure against such infectious pathogens.
  • inactivated vaccines including toxoid vaccines
  • live attenuated vaccines An inactive vaccine is a vaccine in which a pathogen or toxoid is administered in an inactivated form after its infectivity has been lost by formalin or other chemical treatment, or a vaccine in which only the antigen part of the pathogen is administered.
  • inactive vaccines include toxoid vaccines
  • live attenuated vaccines live attenuated vaccines.
  • An inactive vaccine is a vaccine in which a pathogen or toxoid is administered in an inactivated form after its infectivity has been lost by formalin or other chemical treatment, or a vaccine in which only the antigen part of the pathogen is administered.
  • three types of vaccines diphtheria, tetanus toxoid, whooping cough
  • Japanese encephalitis vaccine influenza vaccine
  • tetanus toxoid vaccine etc.
  • live attenuated vaccines are vaccines that administer pathogens that are weakly toxic but have infectivity, that is, naturally attenuated strains or artificially produced attenuated mutants.
  • BCG vaccine, polio vaccine, measles vaccine, rubella vaccine, mumps vaccine, chickenpox vaccine (chicken pox) etc. are this type.
  • Inactivated vaccines have the advantage that, as a result of vaccine administration, the possibility of infection by pathogens is low and side effects are unlikely to occur, while humoral immunity cannot be acquired.
  • live attenuated vaccines use live pathogens, so For some reason, it has a drawback that it may recover toxicity and develop side effects.
  • actin is administered by intramuscular injection, so the antibody titer of IgG antibody increases, but other classes of antibodies ( For example, the antibody titer of IgA and IgM) does not increase, and the cellular immune response that is important for protection against infection cannot be sufficiently induced.
  • Infectious disease pathogen infection begins with the invasion of pathogens from mucosal surfaces such as the nose, trachea, intestinal tract, and eyes, so if cellular immunity can be induced by vaccination, The invasion into the body can be protected at the water's edge.
  • the mucous membrane in the living body is a force that covers the luminal surface of the oral cavity, nasal cavity, digestive tract and genital organs and the mucosal surface of the eye, on which the pathogenic microorganisms such as viruses and bacteria are constantly exposed
  • Mucosal immunity functions mainly with secretory IgA and mucosa-associated lymphoid tissues against dietary antigens and foreign substances.
  • This mucosal immunity exerts various actions such as suppressing the absorption of protein antigens such as the strength of the mucosa, blocking the adsorption of bacteria and viruses to the mucosal epithelium, and neutralizing the virus observed in epithelial cells. Thus, these foreign substances are prevented from entering the body.
  • the antibody titer of a class of antibodies other than IgG antibodies does not increase, and the cellular immune response
  • antigen-specific immune responses are induced in the systemic and systemic mucosal surfaces by administering antigens through the mucosal surfaces such as oral immunization and nasal immunization. It was considered that it could be done, and the study was conducted.
  • Non-patent literature 1 Fukutome, K., et al., Developmental and Comparative Immunology, 2 5, 2001, 475-484
  • Non-Patent Document 2 Li, W., et al., Developmental and Comparative Immunology, 28, 2004, 29-38
  • the inventors of the present invention have clarified that the above-mentioned problems can be solved by using a liposome containing a membrane-fusible lipid (succin-louis polyglycidol), and disclosed the invention. It came to be completed. That is, the present invention can solve the above-mentioned problems by providing a vaccine carrier composed of liposomal capsules containing sax-louis polyglycidol.
  • FIG. 1 shows OVA-specific IgM in serum when immunized intraperitoneally with BAVA / c mice with OVA-SucPG-ribosome vaccine, OVA-ribosome vaccine, and OVA-only vaccine. It is a figure which shows the antibody titer of an antibody, IgG antibody, and IgE antibody.
  • FIG. 2 shows the serum of OVA-specific IgG antibodies in serum when immunized intraperitoneally with BAVA / c mice with vaccines with OVA-SucPG-ribosome, vaccine with OVA-ribosome, and vaccine with OVA alone.
  • FIG. 4 is a view showing antibody titers of subclasses (IgG1, IgG2a and IgG3).
  • Fig. 3 is a graph showing the results of antibody class induction in the intestinal fluid when immunized intranasally.
  • FIG. 4 shows the expression of mRNA of IFN- ⁇ gene and IL-4 gene in spleen lymphocytes of mice immunized intraperitoneally with vaccine with OVA-SucPG-ribosome by RT-PCR method. It is a figure which shows a result.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of quantification of IFN-y and IL-4 in the spleen lymphocyte culture supernatant of mice immunized intraperitoneally with a vaccine with OVA-SucPG-ribosome.
  • FIG. 6 shows the OVA-specific IgM antibody in serum when immunized intraperitoneally with BAVA / c mice with vaccines with OVA-SucPG-ribosome, vaccine with OVA-ribosome, and vaccine with OVA alone, It is a figure which shows the antibody titer of IgG antibody and IgE antibody
  • FIG. 7 shows the serum of OVA-specific IgG antibody in serum when immunized intraperitoneally with BAVA / c mice with vaccines with OVA-SucPG-ribosome, vaccine with OVA-ribosome, and vaccine with OVA alone.
  • FIG. 4 is a view showing antibody titers of subclasses (IgG1, IgG2a and IgG3).
  • Fig. 8 shows the expression of mRNA of IFN- ⁇ gene and IL-4 gene in spleen lymphocytes of mice immunized intraperitoneally with vaccine with OVA-SucPG-ribosome by RT-PCR method. It is a figure which shows a result.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of quantification of IFN-y and IL-4 in the spleen lymphocyte culture supernatant of mice immunized intraperitoneally with a vaccine with OVA-SucPG-ribosome.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of antibody titers of blood antibodies of chickens immunized by instillation of a salmonella Enteritidis antigen-SucPG-ribosome vaccine.
  • FIG. 11 is a graph showing the antibody titer of antibody in blood of mice immunized by intranasal administration of a vaccine with trypanosoma brucei antigen-SucPG-ribosome. .
  • FIG. 12 shows the results of antibody titers of antibodies in blood of urchins immunized by nasal administration of Staphylococcus aureus antigen-SucPG-ribosome vaccine.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of antibody titers of antibodies in milk of sushi immunized by nasal administration of a vaccine with Staphylococcus aureus antigen-SucPG-ribosome. It is.
  • FIG. 14 is a view showing the results of antibody titers of blood antibodies of carp immunized by oral administration of a vaccine of Aeromonas salmonicida antigen-SucPG-ribosome.
  • FIG. 15 is a graph showing the results of antibody titers of antibodies in the intestinal fluid and bile of carp immunized by oral administration of a vaccine with Aeromonas salmonicida antigen-SucPG-ribosome.
  • FIG. 16 is a graph showing changes in the survival rate of carp immunized by oral administration of a vaccine of Aeromonas salmonicida antigen-SucPG-ribosome.
  • FIG. 17 shows a vaccine with Mycoplasma gallisepticum antigen-SucPG-ribosome.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of antibody titers of blood antibodies in mice immunized by intranasal administration.
  • FIG. 18 is a view showing the results of antibody titers of blood antibodies in mice immunized by intranasal administration of a vaccine with Newcastle disease virus antigen-SucPG-ribosome.
  • the present invention provides a ribosome comprising succin-louis polyglycidol (SucPG). It is characterized by providing a structured vaccine carrier.
  • this ribosome-powered vaccine carrier regardless of whether the immunogen contained in the ribosome is an inactivated vaccine or a live attenuated vaccine, and regardless of the route of administration, only the antibody titer of the IgG antibody.
  • the antibody titers of other classes of antibodies could also be raised, and also induced cellular immunity as well as humoral immunity.
  • Cellular immunity induced when using the actin carrier composed of a ribosome containing succinylated polyglycidol (SucPG) of the present invention causes the immunogen to be internalized inside the antigen-presenting cell. This is considered to have been achieved. That is, by using the vaccine carrier of the present invention, since the immunogen can be contained in the lumen of the ribosome, the immunogen can be internalized inside the antigen-presenting cell. As a result, the immunogen taken up into the antigen-presenting cell is combined with MHC class I molecules as a self-component and presented as an antigen on the surface of the antigen-presenting cell. As a result, cellular immunity is induced. it was thought.
  • succinylated polyglycidol is an amphiphilic compound characterized by having an alkyl group.
  • SucPG can anchor to the ribosome membrane.
  • the alkyl group of SucPG has 6 to 24 carbon atoms and is preferably an alkyl group having 6 to 18 carbon atoms. Most preferably, the alkyl group is an n-decyl group having 10 carbon atoms.
  • SucPG has a carboxyl group in the main chain skeleton and side chain similar to amphiphilic polyethylene glycol, so it stabilizes the ribosome membrane in a neutral environment, but the side chain carboxyl group in an acidic environment.
  • the ribosome (SucPG-ribosome) becomes capable of expressing membrane fusion ability in an acidic environment. That is, if S UcPG- ribosomes was incorporated into antigen-presenting cells by endocytosis one cis, P H in Rye Sozomu decreases. At that time, the SucPG-ribosome exhibits a membrane fusion property and fuses with the lysosomal membrane to release the encapsulated antigenic substance into the cytoplasm (antigen internalization).
  • SucPG used in the present invention is prepared by reacting a synthetic polymer polyglycidol with succinic anhydride in ⁇ , ⁇ -dimethylformamide at 80 ° C for 6 hours. Togashi.
  • the present invention is characterized in that succiniol polyglycidol is added to the lipid constituting the ribosome used in the vaccine carrier. More specifically, in the vaccine carrier of the present invention, with respect to the lipid constituting the ribosome, 10-40 0/0, good Mashiku 20-35 wt%, most preferably 30 wt% illusion two Includes Louis ⁇ polyglycidol.
  • the vaccine carrier of the present invention can be used for transmucosal administration of an immunogen contained inside a ribosome.
  • the term “mucosa” means a general term for a portion covering the luminal surface of a luminal organ such as the digestive organ, respiratory organ, urogenital organ, and the free surface is always a secretion from mucous gland and goblet cells. Wet and get wet.
  • mucous membranes to which the vaccine carrier of the present invention can be applied include oral cavity, throat, nasal cavity, ear cavity, conjunctival sac, vagina and anus.
  • the vaccine carrier of the present invention can also be used for delivery by transmucosally administering an immunogen contained within the ribosome of the vaccine carrier.
  • the route other than transmucosal includes intraperitoneal administration of an immunogen contained in the ribosome of the vaccine carrier.
  • the immunogen when an immunogen is administered intraperitoneally, the immunogen can be taken into the body from the surface of organs such as the gastrointestinal tract, genital organs, liver, and spleen. When the immunogen is administered into the body in this manner, the immunogen can be taken into antigen-presenting cells that exist throughout the body.
  • Examples of the lipid constituting the ribosome of the present invention include phosphatidylcholines, phosphatidylethanolamines, phosphatidylserines, phosphatidic acids, or long-chain alkyl phosphates, or Examples thereof include phosphatidylglycerols and cholesterol (Choi) s.
  • the lipids listed here may be used alone or in combination with any of these.
  • phosphatidylcholines include dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC), dipalmitoyl phosphatidine.
  • DMPC dimyristoyl phosphatidylcholine
  • DPPC dipalmitoyl phosphatidine
  • DSPC distearoylphosphatidylcholine
  • DOPC dioleylphosphatidylcholine
  • egg yolk lecithin egg PC
  • phosphatidylethanolamines include dioleyl phosphatidylethanolamine (DOPE), dimyristyl phosphatidylethanolamine. Min, dipalmitoylphosphatidylethanolamine, distearoylphosphatidylethanolamine (DSPE), etc. are preferred!
  • DOPE dioleyl phosphatidylethanolamine
  • DSPE distearoylphosphatidylethanolamine
  • phosphatidylserines when used as a lipid constituting the ribosome of the present invention, preferred examples of phosphatidylserines include dioleylphosphatidylserine (DOPS) and dipalmitoylphosphatidylserine (DPPS). ,.
  • DOPS dioleylphosphatidylserine
  • DPPS dipalmitoylphosphatidylserine
  • phosphatidic acids or long-chain alkyl phosphates include dimyristoyl phosphatidic acid, dipalmitoyl phosphatidic acid, distearoyl phosphatidine. Acid, dicetyl phosphoric acid and the like are preferred.
  • the phosphatidyl glycerols include dimyristoyl phosphatidyl glycerol, dipalmitoyl phosphatidyl glycerol, distearoyl phosphatidyl glycerol and the like. I like it!
  • DOPE DOPE
  • DPPC DPPC
  • DSPC DPPS
  • DSPE Choi and the like are used.
  • the blending ratio of each lipid can be appropriately determined depending on the desired size of ribosome, desired fluidity, and the like.
  • DOPE DPPC is mixed 1: 1 to prepare a ribosome.
  • Ribosomes depend on their structure or production method, MLV (multilamellar vesicles), DRV (dehydration—rehydration vesicles), LUV (large umilamellar vesicles) A) Acupuncture is classified as SUV ⁇ small unilamellar vesicles.
  • the ribosome containing the succiniol ⁇ polyglycidol (SucPG) of the present invention also includes MLV, DRV, LUV, SUV and the like composed of multilayer films.
  • lipids are dissolved in an appropriate organic solvent (eg, black mouth form, ether, etc.), and these solvents are distilled off under reduced pressure. After the formation of the lipid thin film, the lipid thin film is hydrated (or swollen) with water by mechanical stirring means. (2) The lipid is dissolved in an organic solvent such as ether or ethanol.
  • an organic solvent such as ether or ethanol.
  • a lipid is mixed with a surfactant such as cholic acid or deoxycholic acid to form mixed micelles in an aqueous solution, and the micelle solution is dialyzed or gel filtered, for example, to perform cholic acid or deoxycholation.
  • the vaccine carrier of the present invention may further contain an adjuvant for the purpose of adding immunostimulatory activity.
  • adjuvants that can be contained in the vaccine carrier of the present invention include monophosphoryl lipid A, cytodynamic ins, lectins and the like.
  • the immunogen included in the vaccine carrier of the present invention may include any immunogen that is desired to be vaccinated in humans or animals (such as mammals and fish) without particular limitation.
  • Immunogens include bacterial-derived immunogens, virus-derived immunogens, protozoan-derived immunogens, and the like.
  • the vaccine carrier of the present invention when applied to a human immunogen, an influenza virus antigen, SARS virus antigen, AIDS virus antigen, etc. as a virus-derived immunogen
  • a virus-derived immunogen Any of the pathogenic E. coli 0-157 antigen, Salmonella antigen, Staphylococcus aureus antigen, Aeromonas antigen, Mycobacterium tuberculosis antigen, etc. as a bacterial-derived immunogen, trypanosomal antigen as a protozoan-derived immunogen, Any of coccidium antigen, malaria antigen, Tyreria antigen, etc. may be included in the vaccine carrier.
  • the vaccine carrier of the present invention is applied to an animal immunogen, one of antigens derived from an infectious agent important as an infectious disease of livestock, for example, in the case of a chicken, Salmonella te with a bacterial-derived immunogen.
  • Entenca serotype Enteritids Kashihara, Haemophilus paragallinarumini and other immunogens derived from viruses-Leukochitozone a protozoan-derived immunogen such as avian avian influenza virus antigen, Newcastle disease virus antigen, infectious bronchitis virus antigen
  • infectious gastroenteritis virus antigen which is a virus-derived immunogen
  • Bordetella bronchiseptica antigen which is a bacterial-derived immunogen
  • Toxoplasma antigen which is a protozoan-derived immunogen
  • Aimeria antigen etc.
  • bovine viral diarrhea 'mucosal disease virus antigen Saccharomyces cerevisiae, a Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis antigen, a Tyrelia antigen, a Babesia antigen, etc. derived from a protozoa; an immunogen derived from a virus.
  • Some equine rhinitis virus antigens equine influenza virus antigens, trypanosome antigens that are protozoan-derived immunogens, Babesia antigens, etc .; in the case of fish, viruses such as vibrio antigens and eromonas antigens that are bacterial-derived immunogens Infectious spleen necrosis virus antigens and iridovirus antigens, which are derived from protozoa, and ichytobodo protozoan antigens, hexamita protozoan antigens, etc., which are derived from protozoa.
  • Example 1 equine rhinitis virus antigens, equine influenza virus antigens, trypanosome antigens that are protozoan-derived immunogens, Babesia antigens, etc .
  • viruses such as vibrio antigens and eromonas antigens that are bacterial-derived immunogen
  • a lipid composition consisting of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) (Sigma) and dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) (Sigma) in a molar ratio of 1: 1 (each 10 moles) has a SucPG Was added at a lipid weight ratio of 10%, 20%, or 30%, and ribosomes containing three types of SucPG with different SucPG concentrations were prepared.
  • SucPG used in this example has an n_decyl group having 10 carbon atoms as an alkyl group, and was synthesized according to the method described in the literature (Kono K., et al., J. Controlled).
  • polyglycidyl acetate was prepared by reacting polyepichlorofodrine in dimethylformamide in the presence of potassium acetate at 175 ° C for 6 hours.
  • Polyglycidol was synthesized by further reacting the acetate in methyl carbitol in the presence of potassium acetate at 150 ° C for 1 hour.
  • the synthesized polymer polyglycidyl was synthesized with succinic anhydride and ⁇ , ⁇ - SucPG was prepared by reacting in dimethylformamide at 80 ° C for 6 hours.
  • the ribosome is produced as described in Patent Document 1, for example. Specifically, 2 ⁇ mol DPPC, 2 ⁇ mol DOPE and SucPG are first dissolved in an organic solvent and mixed in a co-flask. The lipid is dried using a rotary evaporator and allowed to stand for 30 minutes under reduced pressure in a desiccator. Add 4 mg / ml ovalbumin (OVA) as a model antigen, incubate at 35-40 ° C for 3 minutes, and then vigorously shake to disperse the lipid film. In this way, the model antigen OVA is encapsulated in the ribosome.
  • OVA ovalbumin
  • OVA not encapsulated in ribosome is removed by repeating centrifugation at 14000 g for 20 minutes at 4 ° C to purify ribosome encapsulating model antigen OVA.
  • MLV multilayered ribosome
  • Example 2 Examination of immune response when transmucosal administration of vaccine with succinylated polyglycidol (SucPG) ribosome
  • the purpose of this example is to compare the immune response when the mucosal administration of the ribosomal vaccine containing SucPG prepared in Example 1 with the ribosomal vaccine containing no SucPG. went.
  • a vaccine with ribosomes containing SucPG was prepared as described in Example 1.
  • a ribosome vaccine that does not contain SucPG a multilayer ribosome (OVA-ribosome) (MLV) vaccine is prepared by encapsulating OVA with a lipid composition of DPPC: DOPE molar ratio of 1: 1. did.
  • OVA-ribosome multilayer ribosome
  • OVA-SucPG-ribosome vaccine and OVA-liposome prepared as described above Each of the vaccines of the vaccine and OVA alone was administered to BALB / c mice twice intranasally at 7-day intervals, each at 100 g / animal OVA.
  • FIG. 1 shows the results of antibody class induction in the serum for the immune response of BALB / c mice immunized intranasally with OVA-SucPG-ribosome vaccine, OVA-liposome vaccine, and OVA-only vaccine.
  • OVA OVA
  • FIG. 2 further illustrates the subclasses of anti-OV A-IgG antibodies induced in serum.
  • Figure 3 shows the results of antibody class induction in the intestinal fluid when immunized intranasally.
  • the explanation regarding the immunizing antigen of each column is the same as that described above in FIG.
  • Fig. 1 The results shown in Fig. 1 show that Ig A and IgG class antibodies are produced in the body when various immunogens are immunized in the nasal cavity of BALB / c mice. The production amount was higher than IgA class antibody.
  • the type of vaccine carrier and the amount of antibody produced were compared, and compared with the case of immunizing with a vaccine with OVA alone or with a vaccine with 0 VA-ribosome, OVA-SucPG-liposome It was shown that antibody production can be induced remarkably efficiently when immunized with a vaccine by p. (P ⁇ 0.0027).
  • Figure 3 shows that the use of a vaccine with OVA-SucPG-ribosome intranasally can induce antibody production in the intestinal tract more efficiently than a vaccine with OVA-SucPG-ribosome. It was done.
  • Example 2 the possibility of inducing a cellular immune response by immunizing an antigen through transmucosal administration using a ribosomal vaccine containing SucPG was demonstrated.
  • the OVA-SucPG-ribosome vaccine prepared in Example 1 was administered into the nasal cavity of BALB / c mice twice at 7-day intervals to give 100 g / animal OVA. Seven days after the final administration, the mice were sacrificed, the spleen was removed, and spleen lymphocytes were purified by specific gravity centrifugation.
  • cDNA was synthesized from total RNA.
  • Taq DNA Polymerase (Invitrogen) was added to PCR Buffer to make a total volume of 25 ⁇ 1, and PCR was performed with TaKaRa PCR Thermal Cycler MP TP3000 (TaKaRa). The PCR reaction was performed by reacting at 94 ° C for 5 minutes, then repeating the reaction at 94 ° C for 45 seconds, 60 ° C for 45 seconds, and 72 ° C for 2 minutes 35 times and at 72 ° C for 7 minutes. It was. Samples after PCR were electrophoresed on a 2% agarose gel and visualized by staining with ethidium bromide.
  • forward primer 5 tgcatcttggcttgcagctcttcctcatggc-3 '(SEQ ID NO: 1), and
  • Reverse primer 5 and tggacctgtgggttgttgacctcaaacttggc-3 '(SEQ ID NO: 2), and primer for amplifying mouse IL-4 gene,
  • Reverse primer 5 and cagtgatgtggacttggactcattcatggtgc-3 '(SEQ ID NO: 4) were used (CLONTEC, respectively).
  • CLONTEC As a control, as a primer to amplify the mouse G3PDH gene,
  • Forward primer 5'—accacagtccatgccatcac—3 ′ (SEQ ID NO: 5), and reverse primer: 5 tccaccaccctgttgctgta-3 ′ (SEQ ID NO: 6),
  • FIG. 4 shows the measurement results for the expression of IFN- ⁇ and IL-4 mRNA.
  • lane 1 is a positive control
  • lane 2 is total RNA from a negative control mouse injected with 200 1 saline intraperitoneally
  • lane 3 is derived from a mouse immunized intraperitoneally with OVA-SucPG-ribosome.
  • Lane 4 shows the results of RT-PCR using total RNA and lane 4 of total RNA from negative control mice immunized intraperitoneally with SucPG_ribosome without OVA! /. As shown in Fig.
  • IFN-y mRNA which is an indicator of cellular immune response
  • IL- which is an indicator of humoral immune response
  • purified spleen lymphocytes were cultured in an OVA-added medium for 5 days, and the amounts of IFN- ⁇ and IL-4 released into the culture supernatant were determined to be cellular. It was measured as an index of immunity and humoral immunity.
  • the quantification of IFN- ⁇ and IL-4 in the culture supernatant was performed using the respective quantification kits (Endogen).
  • FIG. 5 shows the results of quantification of the amount of IFN- ⁇ and IL-4 released into the spleen lymphocyte culture supernatant.
  • Lane 5 in Figure 5 does not contain OVA! /, Splenic lymphocyte force from negative control mice immunized intranasally with SucPG_ribosomes, and the amount of IFN- ⁇ and IL-4 produced
  • lane 2 2 shows the amounts of IFN- ⁇ and IL-4 produced by splenic lymphocytes derived from mice immunized intranasally with OVA-SucPG-ribosome.
  • IFN- ⁇ which is an indicator of cellular immune response, and an indicator of humoral immune response, in the culture supernatant of spleen lymphocytes of mice immunized with OVA-SucPG-liposome Both IL-4 forces were found to be significantly higher (p 0.0001).
  • the purpose of this example is to compare vaccines with SucPG-containing ribosomes in the immune response when the vaccine with ribosomes containing SucPG prepared in Example 1 was administered transmucosally. Went as.
  • a ribosomal vaccine containing SucPG was prepared as described in Example 1.
  • a ribosome vaccine that does not contain SucPG a multilayer ribosome (OVA-ribosome) (MLV) vaccine is prepared by encapsulating OVA with a lipid composition of DPPC: DOPE molar ratio of 1: 1. did.
  • OVA-ribosome multilayer ribosome
  • FIG. 6 shows the results of immune responses when immunized intraperitoneally in BALB / c mice with OVA-SucPG-ribosome vaccine, OVA-ribosome vaccine, and OVA-only vaccine.
  • OVA-SucPG-ribosome OVA-SucPG-ribosome
  • FIG. 7 shows subclasses of the anti-OVA-IgG antibody, and the explanation regarding the immunizing antigen of each column is the same as that described above in FIG.
  • Example 5 Summary of Cellular Immunity by Nonmucosal Administration of Eribosome-Containing Vaccine Containing SucPG
  • Example 4 the possibility of inducing a cellular immune response by immunizing an antigen with ribosomes containing SucPG was used.
  • ribosomes containing SucPG were used.
  • the cellular immune response capacity of each case was examined.
  • the OVA-SucPG-ribosome prepared in Example 1 was administered into the peritoneal cavity of BALB / c mice twice at 7-day intervals to give 100 g / animal OVA. Seven days after the final administration, the mice were sacrificed, the spleen was removed, and spleen lymphocytes were purified by specific gravity centrifugation. For the spleen lymphocytes thus prepared, the amount of IFN- ⁇ released into the culture supernatant by RT-PCR for the expression of IFN- ⁇ and IL-4 mRNA as described in Example 3. And IL-4 levels were measured by ELISA, respectively.
  • FIG. 8 shows the measurement results of IFN- ⁇ and IL-4 mRNA expression.
  • Lane 1 in Figure 8 is total RNA from mice immunized intraperitoneally with OVA-SucPG-ribosome
  • lane 2 is a positive control
  • lane 3 is a negative control immunized intraperitoneally with SucPG-ribosome without OVA
  • Lane 4 shows the results of RT-PCR using mouse-derived total RNA, and total RNA derived from negative control mice injected intraperitoneally with 200 1 physiological saline, each as a saddle type.
  • Fig. 9 shows the results of quantification of the amount of IFN- ⁇ and IL-4 released into the spleen lymphocyte culture supernatant.
  • Lane 1 in Figure 9 shows the amount of IFN- ⁇ and IL-4 that also produced splenic lymphocyte strength from negative control mice immunized intraperitoneally with SucPG-ribosomes without OVA
  • 2 shows the amounts of IFN- ⁇ and IL-4 produced from spleen lymphocytes derived from mice immunized intraperitoneally with OVA-SucPG-ribosome.
  • Fig. 9 shows the results of quantification of the amount of IFN- ⁇ and IL-4 released into the spleen lymphocyte culture supernatant.
  • Lane 1 in Figure 9 shows the amount of IFN- ⁇ and IL-4 that also produced splenic lymphocyte strength from negative control mice immunized intraperitoneally with SucPG-ribosomes without OVA
  • 2 shows the amounts of IFN- ⁇ and IL-4 produced from spleen lymphocyte
  • IFN- ⁇ which is an indicator of cellular immune response
  • IL which is an indicator of humoral immunity
  • the ribosome-containing vaccine containing SucPG of the present invention can be used not only for nasal immunity, but also for humoral immunity as well as non-nasal immunity. It was also shown that cellular immunity can also be induced, and it was shown to be useful as an antigen carrier for a ribosomal force non-mucosal vaccine containing SucPG of the present invention.
  • Example 6 Salmonella Kanghara-SucPG-Ribosomal Vaccine with Needle to Chicken This Example is a vaccine with a liposome containing SucPG containing Salmonella Enteritidis antigen as an immunogen. The purpose of this study was to examine the immune response when administered by instillation (transmucosal).
  • the immunogen Salmonella Enteritidis antigen used in the present example was prepared as follows. First, Salmonella Enteritidis (122 strain) was inoculated into Heart Infusion Medium (Nissui Pharmaceutical) and cultured at 37 ° C for 14 hours, and then 7 X 10 14 CFU Salmonella Enteritidis bacteria were collected. The collected Salmonella Enteritidis bacterium was denatured and inactivated by an excessive amount of formalin, and after removing formalin, an antigen solution was prepared by further sonication. A ribosome-containing vaccine containing SucPG containing Salmonella Enteritidis antigen (Salmonella Enteritidis antigen-SucPG-ribosome vaccine) thus prepared was basically produced according to the method described in Example 1.
  • a Salmonella Enteritidis antigen-SucPG-ribosome vaccine prepared as described above was used in Salmonell a Enteritidis at a dose of 100 g / five for five chickens (white leghorns) 3 weeks old. It was administered once by instillation to become an antigen.
  • FIG. 10 The results are shown in FIG. In FIG. 10, the black column shows the results for the antibody titer of the IgG antibody (FIG. 10A), and the white column shows the results for the IgA antibody titer (FIG. 10B).
  • the black column shows the results for the antibody titer of the IgG antibody (FIG. 10A)
  • the white column shows the results for the IgA antibody titer (FIG. 10B).
  • Example 7 Needle to mouse by vaccine with trypanoso-ma Kanghara-SucPG-ribosome ( ⁇ )
  • This example examines the immune response when a ribosome-containing vaccine containing SucPG containing Trypanosoma brucei antigen as an immunogen is administered to mice nasally (transmucosally). I went for the purpose.
  • T. brucei antigen used in the present example, T. brucei protozoa were first collected.
  • the collection method was according to the method described in the literature (Lanham, SM, Nature, 218, 1273-1274 (1968)). Specifically, T. brucei protozoa (1 X 10 5 ) were inoculated intraperitoneally into Wistar rats (Japan SLC), and 4 days later, whole blood such as heart force was collected. The collected blood was anticoagulated with heparin (10 units / ml), and the puffy coat was recovered by centrifugation (1300 X g, 10 minutes).
  • T. brucei antigen-SucPG-ribosome vaccine was prepared basically according to the method described in Example 1.
  • T. brucei antigen-SucPG-ribosome vaccine prepared as described above was applied in an amount of 100 ⁇ g / animal to five 6-week-old Balb / c mice (Japan SLC). Two weeks later, the same amount of T. brucei antigen was administered nasally to immunize.
  • 0.1 ml of blood was collected from the orbital venous plexus 14 days after the first administration of the immunogen (Day 14) and 7 days after the final administration (Day 21), and the serum collected from the blood was used.
  • the production of anti-T. Brucei antigen antibody (IgG or IgM) was examined by ELISA.
  • serum obtained from the individual strength of mice before immunization with T. brue antigen (Day 0) was used.
  • the black column shows the result for the antibody titer of IgM antibody
  • the white column shows the result for the antibody titer of IgG antibody.
  • a # mark indicates that a significant difference (p ⁇ 0.0006) exists and a $ mark indicates that there is a significant difference (p ⁇ 0.0006).
  • * indicates that there is a significant difference (p ⁇ 0. 0001).
  • Data show mean average error.
  • Example 8 Milking cows by vaccine with old-colored staphylococcal antigen-SucPG-ribosome (membrane)
  • This example examines the immune response when a ribosomal vaccine containing SucPG containing the antigen of Staphylococcus aureus as an immunogen is administered nasally (mucosally) I went for that purpose.
  • the immunogen used in this example S. aureus antigen, was first inoculated with S. aureus (Cowan I strain) in LB medium (Nissui Pharmaceutical) and cultured at 37 ° C for 14 hours. After that, S. aureus bacteria were collected. The collected S. aureus bacterium was denatured and inactivated by an excessive amount of formalin, and after removing formalin, an antigen solution was prepared by further sonication.
  • a ribosome-containing vaccine containing SucPG containing S. aureus antigen S. aureus antigen-SucPG-ribosome vaccine
  • the black column shows the results for the antibody titer of IgA antibody
  • the white column shows the results for the antibody titer of IgG antibody.
  • the # mark indicates that there is a significant difference (p ⁇ 0.018), and the sign is significant if there is a significant difference (p ⁇ 0.039). If there is a significant difference (p ⁇ 0.0001), mark *, if there is a significant difference (p ⁇ 0.0001), mark @, if there is a significant difference (P 0.017). Each ⁇ is marked. Data show mean standard error.
  • the black column shows the result for the antibody titer of IgA antibody
  • the white column shows the result for the antibody titer of IgG antibody.
  • the data show the average average error.
  • Example 9 Endocrine immunity to a carp by a vaccine with Aeromonas salmonicida Kanghara-SucPG-ribosome
  • the purpose of this example is to investigate the immune response when a liposomal vaccine containing SucPG containing the antigen of Aeromonas salmonicida as an immunogen is administered orally (transmucosally) to a carp. It was.
  • the immunogen A. salmonicida antigen used in this example was prepared by inoculating A. salmonicida (T 1031 strain) in a heart infusion medium and culturing at 20 ° C for 24 hours. Bacteria were collected, and the collected A. salmonicida bacteria were inactivated by modifying with an excessive amount of formalin. After removing formalin, the bacteria were further sonicated. A part of the A. salmonicida antigen thus prepared was used as an immunogen as it was, and another part was used to prepare a ribosome-containing vaccine containing SucPG containing the A. salmonicida antigen. Inactivated A. salmonicida antigen-containing liposomal vaccines containing SucPG (A. salmonicida antigen-SucPG-ribosomal vaccines) Specifically, it was prepared according to the method described in Example 1.
  • A. salmonicida antigen-SucPG-ribosome vaccine prepared as described above was applied to 200 g of Koy (Osaka Prefectural Food and Green Technology Center. Aquatic Biotechnology Center). Immunization was orally administered 3 times at 2-week intervals to achieve the amount of A. salmonicida antigen per animal. On the other hand, as a control, only A. salmonicida antigen was administered orally three times at 2-week intervals to give an A. salmonicida antigen in an amount of 200 g / animal for 4 caries. did.
  • FIG. 15 The results are shown in FIG. In FIG. 15, the results for the antibody titer of the antibody in the intestinal mucosa (FIG. 15A) and the results for the antibody titer of the antibody in bile (FIG. 15B) are shown. Show each one. In each figure, the black column shows the antibody titer results for the non-immunized carp individuals, and the white column shows the antibody titers for the carp individuals administered with the A. salmonicida antigen-SucPG-liposome vaccine. The results are shown respectively. Then, when there was a significant difference (p ⁇ 0.01) compared to the antibody titer of the antibody in the non-immunized carp individual, an asterisk was attached. Data show mean average error.
  • the black circle ( ⁇ ) shows the change in the survival rate of the carp immunized orally with the vaccine of .salmonicida antigen-SucPG-liposome
  • the black triangle ( ⁇ ) shows the change in the survival rate of the non-immune carp.
  • the survival rate of carp immunized orally with A. salmonicida antigen-SucPG-ribosome vaccine was shown to be higher than that of non-immunized carp.
  • the purpose of this example was to examine the immune response when a nasal (mucosal) administration of a liposomal vaccine containing SucPG containing Mycoplasma gallisepticum antigen as an immunogen to mice. .
  • the immunogen to be used Mycoplasma gallisepticum antigen
  • Mycoplas gallisepticum (S6 strain) was first inoculated with Mycoplas gallisepticum (S6 strain) in a fresh yeast extract-supplemented Fray medium (Difco) and incubated at 37 ° C. Collect 3.58xlO u CFU Mycoplasma gallisepticum bacteria after incubation for more than an hour did.
  • the collected Mycoplasma gallisepticum bacterium was denatured and inactivated by an excessive amount of formalin, and after removing formalin, an antigen solution was prepared by further sonication.
  • the thus-prepared liposomal vaccine containing SucPG containing Mycoplasma gallisepticum antigen (Mycoplasma gallisepticum antigen-SucPG-ribosome vaccine) was prepared according to the method described in Example 1.
  • Mycoplasma gallisepticum antigen-SucPG-ribosome-derived actin prepared as described above was used in 5 week-old Balb / c mice (Japan SLC), 100 ⁇ g / mouse of Mycoplas ma gallisepticum It was administered nasally to become an antigen, and two weeks later, the same amount of Mycoplasma gal lisepticum antigen was further administered nasally and immunized.
  • FIG. Fig. 17 shows the results of antibody class induction in the serum for the immune response when immunized by nasal administration of M. gallisepticum antigen-SucPG-ribosome vaccine to mice.
  • the black column shows the results for the IgG antibody titer, and the white column shows the results for the IgA antibody titer.
  • transmucosal administration of a vaccine against M. gallisepticum antigen using ribosomes containing SucPG can induce high antibody production in blood, and further induce not only humoral immunity but also cellular immune responses. The possibility to do was shown.
  • Example 11 With a Newcastle disease virus antigen-SucPG-ribosome vaccine, ⁇ )
  • the purpose of this example is to examine the immune response when a nasal (mucosal) mucosal administration of a liposomal vaccine containing SucPG containing the antigen of Newcastle disease virus as an immunogen. It was.
  • the immunogen and Newcastle disease virus antigen used in this example were inactivated by sonicating a commercially available Newcastle disease live vaccine to prepare an antigen solution.
  • a ribosome-containing vaccine containing SucPG containing the Newcastle disease virus antigen prepared in this manner was basically prepared according to the method described in Example 1.
  • Eucuttle disease virus antigens prepared as described above-SucPG-Ribosome-derived actin was removed from 5 weeks old Balb / c mice (Japan SLC), 100 ⁇ g / mouse- It was administered nasally so that it would become the Euthrmus virus antigen, and two weeks later, the same amount of the Eukats virus virus antigen was further administered nasally and immunized.
  • FIG. 18 The results are shown in FIG. In FIG. 18, the black column shows the results for the antibody titer of the IgG antibody, and the white column shows the results for the antibody titer of the IgA antibody. And, when there is a significant difference (p ⁇ 0.0027) compared to the antibody titer in the pre-immune (Day 0) mouse individual, a # mark indicates that a significant difference (p ⁇ 0.00122) exists. Are attached respectively. Data show mean average error.
  • the antibody is remarkably compared to the case of using a conventional vaccine carrier composed of ribosome strength.
  • An efficient cutin that can increase the titer can be obtained.
  • cellular immunity can be induced not only by humoral immunity, but also by a vaccine prepared using the vaccine carrier described above.

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Abstract

　本発明においては、体液性ならびに細胞性免疫応答を効率よく誘導できるワクチンの製造のために使用することができる、新規なワクチン担体を作製することを課題とする。本発明はまた、体液性ならびに細胞性免疫応答を効率よく誘導できるワクチンを提供することもまた、課題とする。 　本発明の発明者らは、サクシニル化ポリグリシドールを含むリポソームを使用することにより、上述した課題を解決することができることを明らかにし、発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、サクシニル化ポリグリシドールを含むリポソームから構成されるワクチン担体を提供することにより、上述した課題を解決することができる。                                                                               

Description

新規ワクチン担体
技術分野
[0001] 本発明は、膜融合性脂質膜を有するリボソームを使用した新規ワクチン担体に関す る。
背景技術
[0002] 動物の免疫系は、自己と非自己とを識別し、非自己を体内から排除する様に機能 する。このような自己と非自己との区別を行う生体内の免疫反応は、 MHCクラス I分子 を利用した細胞性免疫、そして MHCクラス II分子を利用した体液性免疫により担われ ている。例えば感染症病原体であるウィルスや細菌が感染した場合、生体は、これら の細胞性免疫や体液性免疫を使って、これらの感染症病原体を排除する。
[0003] このような感染症病原体に対する予防手段としてしばしば利用されるのがワクチン 接種である。ヒトの場合にも、家畜動物やコンパ-オンアニマルの場合にも、非常に 他種類のワクチンが利用されて 、る。
[0004] これらのワクチンは、大きく分けて、不活化ワクチン（トキソイドワクチンも含む）と弱 毒生ワクチンの 2種類のタイプに分類される。不活ィ匕ワクチンは、病原体またはトキソ イドをホルマリンやその他の化学処理により感染力を失わせ、不活化した形態で投与 するワクチン、または病原体の抗原部分のみを投与するワクチンのことであり、例えば ヒトのワクチンの場合、三種混合ワクチン (ジフテリア、破傷風トキソイド、百日咳)や日 本脳炎ワクチン、インフルエンザワクチン、破傷風トキソイドワクチン等がこのタイプで ある。一方、弱毒生ワクチンは、毒力は弱いが感染力を有する病原体、すなわち天然 に存在する弱毒株や人為的に作られた弱毒変異株を投与するワクチンのことであり、 例えばヒトのワクチンの場合、 BCGワクチン、ポリオワクチン、麻疹ワクチン、風疹ワク チン、おたふくかぜワクチン、水痘ワクチン (水疱瘡）等がこのタイプである。
[0005] 不活ィ匕ワクチンは、ワクチン投与の結果として、病原体による感染の可能性が低ぐ 副作用が生じにくいという利点があり、その一方で体液性免疫し力獲得できないとい う特徴を有する。一方、弱毒生ワクチンの場合には、生きている病原体を使うため、何 らかの理由で毒性を回復して副作用を発現する可能性もあるという欠点を有する。そ して、経口投与する一部の弱毒生ワクチン (例えば、ポリオ)の事例を除き、一般にヮ クチンは筋肉注射により投与するため、 IgG抗体の抗体価は上昇するものの、その他 のクラスの抗体 (例えば、 IgAや IgM)の抗体価が上昇しないという問題点、また感染 防御に重要である細胞性免疫応答も十分に誘導できないという問題点もまた有して いる。
[0006] 感染症病原体の感染は、鼻、気管、腸管、目などの粘膜表面から病原体が体内に 侵入することから始まるため、ワクチン接種により細胞性免疫を誘導することができれ ば、病原体の体内への侵入を水際で防御することができることになる。し力しながら、 生体における粘膜は、口腔、鼻腔、消化管および生殖器などの管腔表面および眼の 粘膜表面を覆っている力 その表面では、絶えず曝露されているウィルス、細菌など の病原微生物、食餌性抗原、異物に対して、分泌型 IgAや粘膜付属リンパ組織を主 体とした、粘膜免疫が機能している。この粘膜免疫は、粘膜面力ゝらのタンパク質抗原 の吸収を抑制し、細菌やウィルスの粘膜上皮への吸着を阻止し、上皮細胞に観戦し たウィルスを中和する等の多様な作用を発揮して、これら異物が体内に侵入すること を防止している。
[0007] し力しながら、上述したように、従来力ものワクチン接種の多くは、 IgG抗体以外のク ラスの抗体 (例えば、 IgAや IgM)の抗体価が上昇せず、また細胞性免疫応答も十分 に誘導できないため、感染性病原体の感染部位である粘膜面に対しては、効果的に 抗原特異的な抗体 (分泌型 IgA)産生を含む免疫応答を誘導することができな!/ヽと！、 う問題点があった。その様な問題点を解決するために、経口免疫や経鼻免疫などと いった、粘膜面を介して抗原を投与することにより、全身性ならびに全身の粘膜面に 抗原特異的免疫応答を誘導することができると考えられ、検討が行われた。
[0008] このような粘膜免疫を付与することを目的として、リボソーム中に抗原を含ませて、そ れをワクチンとして粘膜に投与する試みが行われてきた。例えば、 -ヮトリにおいて、 S almonella enterica血清型 Enteritidis抗原を免疫原としてリボソーム中に含ませ、その リボソームを-ヮトリに点眼することにより、全身性の免疫応答を誘導でき、腸管内腔 力 の Salmonella enterica血清型 Enteritidisの侵入を阻害することができることが示さ れた (非特許文献 1および非特許文献 2)。
[0009] し力しながら、ワクチン製造の分野においては、さらに効率的に様々なクラスの抗体 の抗体価 (体液性免疫応答)や細胞性免疫応答を上昇させることができるワクチン担 体を開発することが求められて ヽる。
非特干文献 1 : Fukutome, K., et al., Developmental and Comparative Immunology, 2 5, 2001, 475-484
非特許文献 2 : Li, W., et al., Developmental and Comparative Immunology, 28, 2004 , 29-38
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 本発明においては、体液性ならびに細胞性免疫応答を効率よく誘導できるワクチン の製造のために使用することができる、新規なワクチン担体を作製することを課題と する。本発明はまた、体液性ならびに細胞性免疫応答を効率よく誘導できるワクチン を提供することもまた、課題とする。
課題を解決するための手段
[0011] 本発明の発明者らは、膜融合性脂質 (サクシ-ルイ匕ポリグリシドール)を含むリポソ ームを使用することにより、上述した課題を解決することができることを明らかにし、発 明を完成するに至った。すなわち、本発明は、サクシ-ルイ匕ポリグリシドールを含むリ ポソームカゝら構成されるワクチン担体を提供することにより、上述した課題を解決する ことができる。
発明の効果
[0012] 上述したサクシ二ルイ匕ポリグリシドールを含むリボソーム力 構成されるワクチン担 体を使用してワクチンを作製することにより、従来のリボソーム力 構成されるワクチン 担体を使用した場合と比較して、顕著に抗体価を上昇させることができる効率的なヮ クチンを得ることができる。また、上述したワクチン担体を使用して作製したワクチンに より、体液性免疫だけでなぐ細胞性免疫を効率よく誘導することもできる。
図面の簡単な説明 [図 1]図 1は、 OVA-SucPG-リボソームによるワクチン、 OVA-リボソームによるワクチン 、および OVAのみによるワクチンを、 BALB/cマウスの腹腔内に免疫した場合の、血 清中における OVA特異的 IgM抗体、 IgG抗体、および IgE抗体の抗体価を示す図であ る。
[図 2]図 2は、 OVA-SucPG-リボソームによるワクチン、 OVA-リボソームによるワクチン 、および OVAのみによるワクチンを BALB/cマウスの腹腔内に免疫した場合の、血清 中における OVA特異的 IgG抗体のサブクラス（IgGl、 IgG2aおよび IgG3)の抗体価を 示す図である。
[図 3]図 3は、経鼻的に免疫した場合の腸液中の抗体クラス誘導の結果を示す図であ る。
[図 4]図 4は、 OVA-SucPG-リボソームによるワクチンを腹腔内に免疫したマウスの脾 臓リンパ球における IFN- γ遺伝子および IL-4遺伝子の mRNAの発現を、 RT-PCR法 により調べた結果を示す図である。
[図 5]図 5は、 OVA-SucPG-リボソームによるワクチンを腹腔内に免疫したマウスの脾 臓リンパ球培養上清中における IFN- yおよび IL-4の定量結果を示す図である。
[図 6]図 6は、 OVA-SucPG-リボソームによるワクチン、 OVA-リボソームによるワクチン 、および OVAのみによるワクチンを BALB/cマウスの腹腔内に免疫した場合の、血清 中における OVA特異的 IgM抗体、 IgG抗体、および IgE抗体の抗体価を示す図である
[図 7]図 7は、 OVA-SucPG-リボソームによるワクチン、 OVA-リボソームによるワクチン 、および OVAのみによるワクチンを BALB/cマウスの腹腔内に免疫した場合の、血清 中における OVA特異的 IgG抗体のサブクラス（IgGl、 IgG2aおよび IgG3)の抗体価を 示す図である。
[図 8]図 8は、 OVA-SucPG-リボソームによるワクチンを腹腔内に免疫したマウスの脾 臓リンパ球における IFN- γ遺伝子および IL-4遺伝子の mRNAの発現を、 RT-PCR法 により調べた結果を示す図である。
[図 9]図 9は、 OVA-SucPG-リボソームによるワクチンを腹腔内に免疫したマウスの脾 臓リンパ球培養上清中における IFN- yおよび IL-4の定量結果を示す図である。 [図 10]図 10は、 Salmonella Enteritidis抗原- SucPG -リボソームによるワクチンを、点眼 により投与して免疫した-ヮトリの血中抗体の抗体価についての結果を示す図である
[図 11]図 11は、トリパノソ一マ（Trypanosoma brucei)の抗原- SucPG -リボソームによる ワクチンを、経鼻的に投与して免疫したマウスの血中抗体の抗体価についての結果 を示す図である。
[図 12]図 12は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus)の抗原- SucPG -リボソームに よるワクチンを、経鼻的に投与して免疫したゥシの血中抗体の抗体価についての結 果を示す図である。
[図 13]図 13は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus)の抗原- SucPG -リボソームに よるワクチンを、経鼻的に投与して免疫したゥシの乳汁中抗体の抗体価についての 結果を示す図である。
[図 14]図 14は、 Aeromonas salmonicidaの抗原- SucPG -リボソームによるワクチンを、 経口的に投与して免疫したコィの血中抗体の抗体価についての結果を示す図であ る。
[図 15]図 15は、 Aeromonas salmonicidaの抗原- SucPG -リボソームによるワクチンを、 経口的に投与して免疫したコィの腸液中および胆汁中抗体の抗体価についての結 果を示す図である。
[図 16]図 16は、 Aeromonas salmonicidaの抗原- SucPG -リボソームによるワクチンを、 経口的に投与して免疫したコィの生存率の推移を示す図である。
[図 17]図 17は、 Mycoplasma gallisepticumの抗原- SucPG -リボソームによるワクチンを
、経鼻的に投与して免疫したマウスの血中抗体の抗体価についての結果を示す図 である。
[図 18]図 18は、ニューカッスル病ウィルスの抗原- SucPG-リボソームによるワクチンを 、経鼻的に投与して免疫したマウスの血中抗体の抗体価についての結果を示す図 である。
発明の実施の形態
上述したように、本発明は、サクシ-ルイ匕ポリグリシドール（SucPG)を含むリボソーム 力 構成されるワクチン担体を提供することを特徴とする。このリボソーム力 構成さ れるワクチン担体を使用する場合、リボソーム中に含まれる免疫原が不活化ワクチン であるか弱毒生ワクチンであるかに関わらず、また投与経路に関わらず、 IgG抗体の 抗体価だけでなくその他のクラスの抗体の抗体価もまた上昇させることができ、さらに 体液性免疫だけでなく細胞性免疫もまた誘導することができた。
[0015] 本発明のサクシ-ル化ポリグリシドール（SucPG)を含むリボソームから構成されるヮ クチン担体を使用する場合に誘導された細胞性免疫は、免疫原を抗原提示細胞内 部に内在化させることにより、達成されたものであると考えられる。すなわち、本発明 のワクチン担体を使用することにより、免疫原をリボソームの内腔に含ませることがで きるため、免疫原を抗原提示細胞内部に内在化させることが可能である。その結果、 抗原提示細胞中に取り込まれた免疫原は、自己成分として MHCクラス I分子と組み合 わされて抗原提示細胞表面上に抗原提示され、その結果、細胞性免疫が誘導され たものと考えられた。
[0016] ここで、サクシ-ル化ポリグリシドール（SucPG)とは、アルキル基を有することを特徴 とする両親媒性の化合物である。アルキル基を有することにより、 SucPGはリボソーム 膜にアンカリングが可能となる。 SucPGのアルキル基の炭素数は 6〜24で良ぐ炭素 数 6〜18のアルキル基がより好ましい。最も好ましくは、アルキル基は、炭素数 10の n- デシル基である。 SucPGは、両親媒性のポリエチレングリコールと類似の主鎖骨格お よび側鎖にカルボキシル基を有するため、中性環境下ではリボソーム膜を安定ィ匕さ せるが、酸性環境下では側鎖カルボキシル基がプロトン化され、膜融合を誘起すると いう特徴を有する。この SucPGをリボソーム膜に組み込むことにより、そのリボソーム（S ucPG-リボソーム）は、酸性環境下において膜融合能を発現するようになる。つまり、 S ucPG-リボソームがエンドサイト一シスにより抗原提示細胞に取り込まれた場合、ライ ソゾーム内の PHが低下する。そのとき SucPG-リボソームは、膜融合性を発揮してライ ソゾーム膜と融合し、封入している抗原物質を細胞質内に放出させる (抗原の内在化 )ことができる。
[0017] 本発明において使用する SucPGは、合成高分子ポリグリシドールを無水コハク酸と Ν,Ν-ジメチルフオルムアミド中にぉ 、て 80°Cで 6時間反応させることにより作製するこ とがでさる。
[0018] 本発明においては、ワクチン担体に使用するリボソームを構成する脂質に対して、 サクシ二ルイ匕ポリグリシドールを添加することが特徴である。より具体的には、本発明 のワクチン担体においては、リボソームを構成する脂質に対して、 10〜40重量0 /0、好 ましくは 20〜35重量％、最も好ましくは 30重量％のサクシ二ルイ匕ポリグリシドールが含 まれる。
[0019] 本発明のワクチン担体は、リボソームの内部に含まれる免疫原を経粘膜的に投与 するために使用することができる。本発明において「粘膜」という場合、消化器、呼吸 器、泌尿生殖器などの管腔臓器の内腔面を覆う部位の総称を意味し、その自由面は 粘液腺や杯細胞からの分泌物で常に湿潤して 、る。本発明のワクチン担体を適用す ることができる粘膜としては、 口腔、咽喉、鼻腔、耳腔、結膜のう、膣、肛門などがある 。これらの粘膜面に対して免疫原を含むリボソームを適用することにより、粘膜面を経 由して免疫原を体内に取り込むことができる。
[0020] 本発明のワクチン担体は、ワクチン担体のリボソームの内部に含まれる免疫原を非 経粘膜的に投与することにより送達するために使用することもできる。本発明におい て経粘膜以外の経路という場合、ワクチン担体のリボソームの内部に含まれる免疫原 を腹腔内投与することなどが含まれる。例えば、免疫原を腹腔内に投与すると、腹腔 内の胃腸管、生殖器、肝臓、脾臓などの臓器表面から、免疫原を体内に取り込むこと ができる。このようにして免疫原を体内に投与すると、体内の至る所の存在する抗原 提示細胞へ免疫原を取り込ませることができる。
[0021] 本発明のリボソームを構成する脂質としては、例えば、フォスファチジルコリン類、フ ォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジルセリン類、フォスファチジン酸類 もしくは長鎖アルキルリン酸塩類、もしくはフォスファチジルグリセロール類、コレステ ロール (Choi)類等が挙げられる。本発明においてリボソームを作製する場合、ここに 列挙する脂質を単独で使用しても、もしくはこれらのいずれかを組み合わせて使用し てもよい。
[0022] 本発明のリボソームを構成する脂質として使用する場合、フォスファチジルコリン類 としては、ジミリストイルフォスファチジルコリン（DMPC)、ジパルミトイルフォスファチジ ルコリン（DPPC)、ジステアロイルフォスファチジルコリン（DSPC)、ジォレイルフォスフ ァチジルコリン（DOPC)卵黄レシチン（egg PC)等が好まし!/ヽ。
[0023] また、本発明のリボソームを構成する脂質として使用する場合、フォスファチジルェ タノールアミン類としては、ジォレイルフォスファチジルエタノールァミン（DOPE)、ジミ リストィルフォスファチジルエタノールァミン、ジパルミトイルフォスファチジルエタノー ルァミン、ジステアロイルフォスファチジルエタノールァミン（DSPE)等が好まし!/、。
[0024] また、本発明のリボソームを構成する脂質として使用する場合、フォスファチジルセ リン類としては、ジォレイルフォスファチジルセリン（DOPS)、ジパルミトイルフォスファ チジルセリン (DPPS)等が好ま U、。
[0025] 本発明のリボソームを構成する脂質として使用する場合、フォスファチジン酸類もし くは長鎖アルキルリン酸塩類としては、ジミリストイルフォスファチジン酸、ジパルミトイ ルフォスファチジン酸、ジステアロイルフォスファチジン酸、ジセチルリン酸等が好まし い。
[0026] 本発明のリボソームを構成する脂質として使用する場合、フォスファチジルグリセ口 ール類としては、ジミリストイルフォスファチジルグリセロール、ジパルミトイルフォスファ チジルグリセロール、ジステアロイルフォスファチジルグリセロール等が好まし!/、。
[0027] 好ましくは、上記に挙げた化合物の中でも、 DOPE, DPPC, DSPC, DPPS, DSPE, Choi等が用いられる。
[0028] 上記の脂質を混合して使用する場合、それぞれの脂質の配合比率は、リボソーム の所望の大きさ、所望の流動性等により適宜決定することができる。本発明において は、 DOPE: DPPCを 1： 1で混合してリボソームを作製することが好ましい。
[0029] リボソームは、その構造又は作製法によって、 MLV (multilamellar vesicles,多重層 リボソーム）、 DRV (dehydration— rehydration vesiclesゝ再水和リボソーム）、 LUV (large umilamellar vesicles ^大さな単層リポソ ~~ム)ある ヽは SUV^small unilamellar vesicles 、小さな単層リボソーム)などに分類される。本発明のサクシ二ルイ匕ポリグリシドール (S ucPG)を含むリボソームにも多層膜で構成される MLV、 DRV、 LUV、又は SUVなどの 種類が存在する。
[0030] SucPGを含むリボソームを作製する際には、従来力 知られているリボソームの製造 方法であれば、どのような方法を使用してもよい。リボソームの製造方法としては、当 該技術分野にぉ 、て、これまで種々の方法が知られて 、る。
[0031] 例えば、一般的なリボソームの製造方法として（1)脂質を適当な有機溶媒 (たとえば 、クロ口ホルム、エーテル等）に溶解させ、減圧下にてこれらの溶媒を留去し、ー且脂 質薄膜を形成させた後、この脂質薄膜を機械的撹拌手段により水に水和 (または膨 潤）させる方法、（2)脂質をエーテルあるいはエタノール等の有機溶媒に溶解させ、こ の溶液を高温に暖めた水中にシリンジあるいはノズル等より、加圧下、一定速度で注 入し、注入とともに有機溶媒が留去あるいは希釈されることにより脂質が二重層を形 成し、リボソームが調製される方法、（3)脂質をコール酸あるいはデォキシコール酸な どの界面活性剤とともに水溶液中で混合ミセルを形成させ、該ミセル溶液を透析ある いはゲル濾過等の操作によりコール酸あるいはデォキシコール酸などの界面活性剤 を除去し、リボソームを調製する方法、（4)脂質を溶解した有機溶媒を水相に加え、 超音波処理し、ー且 WZO型エマルシヨンを形成し、ついで有機溶媒を除去すること によりゲル化させ、このゲルを機械的撹拌により転相させリボソームを調製する方法、 (5)薄膜を形成させた脂質に水系溶媒を加えて水和'膨潤させ、機械的振動により容 器力 脂質薄膜を剥離させた後、超音波処理、またはフレンチプレス、加圧ろ過器あ るいはエタストルーダーを用いて一定の大きさの孔を通す事によってリボソームを作 製する方法、（6)リボソームを凍結乾燥した後、水系溶媒で再水和させることによりリ ポソームを作製する方法等が挙げられる。
[0032] 本発明のワクチン担体には、免疫賦活活性を追加することを目的として、アジュバ ントがさらに含まれてもよい。本発明のワクチン担体に含ませることができるアジュバ ントとしては、モノフォスフオリルリピド A、サイト力イン、レクチン等が挙げられる。
[0033] 本発明のワクチン担体に含ませる免疫原には、特に限定はなぐヒトまたは動物（哺 乳動物、魚類など）においてワクチン接種が望まれる免疫原のいずれを含ませてもよ い。免疫原としては、細菌由来の免疫原、ウィルス由来の免疫原、原虫由来の免疫 原などが含まれる。
[0034] 例えば、本発明のワクチン担体をヒトの免疫原に適用する場合、ウィルス由来の免 疫原としてインフルエンザウイルス抗原、 SARSウィルス抗原、 AIDSウィルス抗原など のいずれかを、細菌由来の免疫原として病原性大腸菌 0-157抗原、サルモネラ抗原 、黄色ブドウ球菌抗原、エロモナス抗原、結核菌抗原などのいずれかを、原虫由来の 免疫原としてトリパノソ一マ抗原、コクシジゥム抗原、マラリア抗原、タイレリア抗原など のいずれかを、ワクチン担体に含ませてもよい。
[0035] 本発明のワクチン担体を動物の免疫原に適用する場合、家畜の感染症として重要 な感染病原体由来の抗原のいずれか、例えばニヮトリの場合には、細菌由来の免疫 原で teる Salmonella entenca血清型 Enteritids饥原、 Haemophilus paragallinarumini 原など、ウィルス由来の免疫原である-ヮトリインフルエンザウイルス抗原、ニューカツ スル病ウィルス抗原、伝染性気管支炎ウィルス抗原など、原虫由来の免疫原である ロイコチトゾーン抗原、アイメリァ抗原など；ブタの場合には、ウィルス由来の免疫原で ある伝染性胃腸炎ウィルス抗原、細菌由来の免疫原である Bordetella bronchiseptica 抗原、原虫由来の免疫原であるトキソプラズマ抗原、アイメリァ抗原など；ゥシの場合 には、ウィルス由来の免疫原である牛ウィルス性下痢'粘膜病ウィルス抗原、細菌由 来の免疫原である黄色ブトク球菌饥原、 Mycobacterium avium亜種 paratuberculosis 抗原、原虫由来の免疫原であるタイレリア抗原、バべシァ抗原など；ゥマの場合には 、ウィルス由来の免疫原である馬鼻肺炎ウィルス抗原、馬インフルエンザウイルス抗 原、原虫由来の免疫原であるトリパノゾーマ抗原、バべシァ抗原など;魚類の場合に は、細菌由来の免疫原であるビブリオ抗原、エロモナス抗原など、ウィルス由来の免 疫原である伝染性脾臓壊死症ウィルス抗原、イリドウィルス抗原など、原虫由来の免 疫原であるイクチォボド原虫抗原、へキサミタ原虫抗原など；を含ませることができる。 実施例
[0036] 実施例 1：サクシ二ル化ポリグリシドール（SucPG)リボソームの作製
SucPGを含むリボソームとして、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC) (Sigma) とジォレオイルホスファチジルエタノールァミン（DOPE) (Sigma)のモル比 1： 1 (それぞ れ 10 モル）からなる脂質組成に、 SucPGを脂質重量比で 10%、 20%または 30%添 加し、 SucPG濃度の異なる 3種類の SucPGを含むリボソームを作製した。本実施例で 使用する SucPGは、アルキル基として炭素数 10の n_デシル基を有するものであり、文 献に記載された方法にしたがって、合成した（Kono K., et al.， J. Controlled Release, 68, 225-235 (2000) ;Kono K., et al., Biochim. Biophys. Acta, 1325, 143—154 (1997) ；または Kono K., et al" Biochim. Biophys. Acta, 1193, 1-9 (1994))。具体的には、ポ リエピクロロホドリンをジメチルホルムアミド中、酢酸カリウム存在下で、 175°C、 6時間 反応させることによりポリグリシジルアセテートを作製し、作製されたポリグリシジルァ セテートをさらにメチルカルビトール中、酢酸カリウム存在下で 150°C、 1時間反応させ ることによりポリグリシドールを合成した。この様に合成した合成高分子ポリグリシドー ルを無水コハク酸と Ν,Ν-ジメチルフオルムアミド中にお!、て 80°Cで 6時間反応させるこ とにより SucPGを作製した。
[0037] リボソームの作製は、例えば特許文献 1に記載する様に製造する。具体的には、ま ず 2 μモルの DPPC、 2 μモルの DOPEおよび SucPGを有機溶媒中に溶解し、コ-カル フラスコ中で混合する。この脂質を、ロータリーエバポレーターを使用して乾燥し、そ してデシケーター中で減圧下にて 30分間静置する。モデル抗原として 4 mg/mlの卵 白アルブミン (OVA)を添加し 35〜40°Cにて 3分間インキュベートした後、激しく振動 攪拌することにより、脂質フィルムを分散させる。このようにして、リボソーム中にモデ ル抗原の OVAを封入させる。一方、リボソーム中に封入されなかった OVAを、 14000 gで 20分間、 4°Cにて遠心処理することを繰り返すことにより除去し、モデル抗原 OVA を封入したリボソームを精製する。このようにして、多重層型のリボソーム（OVA-SucP G-リボソーム）（MLV)を作製した。
[0038] 実施例 2：サクシ二ル化ポリグリシドール (SucPG)リボソームによるワクチンを経粘膜 投与した場合の免疫 答の枪討
本実施例は、実施例 1にお ヽて作製した SucPGを含むリボソームによるワクチンを経 粘膜投与した場合の免疫応答にっ 、て、 SucPGを含まな 、リボソームによるワクチン と比較検討することを目的として行った。
[0039] SucPGを含むリボソームによるワクチンは、実施例 1に記載する様に作製した。一方 、 SucPGを含まないリボソームによるワクチンとして、 DPPC : DOPEのモル比 1 : 1からな る脂質組成で OVAを封入させることにより、多重層型のリボソーム（OVA-リボソーム） (MLV)によるワクチンを作製した。
[0040] 上記の様にして作製した OVA-SucPG-リボソームによるワクチンおよび OVA-リポソ ームによるワクチン、さらに OVAのみによるワクチンのそれぞれを、 BALB/cマウスに 対して経鼻的に 7日間隔で 2回、それぞれ 100 g/匹の OVAとなるように投与した。
[0041] 免疫原の最終投与後 7日後に眼窩静脈叢力 血液を 0.1 ml採取し、その血液から 回収した血清を使用して、抗 OVA抗体（IgM、 IgG、または IgE)の産生について ELISA 法により検討した。また、最終投与後 7日後に腸液を採取し、抗 OVA抗体 (IgA、また は IgG)の産生について ELISA法により検討した。さらに、得られた免疫血清を用いて 、抗 OVA-IgGのサブクラスにつ!、ても ELISA法を用いて解析した。
[0042] 結果を図 1〜図 3に示す。図 1は、 OVA-SucPG-リボソームによるワクチン、 OVA-リポ ソームによるワクチン、および OVAのみによるワクチンを、 BALB/cマウスの経鼻的に 免疫した場合の免疫応答について血清中の抗体クラス誘導の結果を示したものであ り、黒色カラムは OVAのみを免疫した場合（OVA)、灰色カラムは OVA-リボソームを 免疫した場合（OVA-lipo)、そして白色カラムは OVA-SucPG-リボソームを免疫した 場合（OVA-SucPG-lipo)の結果をそれぞれ示す。図 2は、血清中に誘導された抗 OV A-IgG抗体のサブクラスをさらに示したものである。図 3は、経鼻的に免疫した場合の 腸液中の抗体クラス誘導の結果を示したものである。図 2および図 3において、各カラ ムの免疫抗原に関する説明は、図 1にお 、て上述したものと同様である。
[0043] 図 1に示される結果から、各種免疫原を BALB/cマウスの鼻腔内に免疫した場合、 Ig Aおよび IgGクラスの抗体が体内で生成されることがわかり、全体的に IgGクラス抗体の 方が IgAクラス抗体よりも産生量が多力つた。また、各クラスの抗体について、ワクチン 担体の種類と産生される抗体量とを対比したところ、 OVAのみによるワクチンまたは 0 VA-リボソームによるワクチンを免疫した場合と比較したところ、 OVA-SucPG-リポソ一 ムによるワクチンを用いて免疫した場合には、顕著に効率よく抗体産生を誘導できる ことが示された（p< 0.0027)。
[0044] また、図 2に示される結果から、 OVA-SucPG-リボソームによるワクチンを用いて免 疫した場合には、 Th2 (体液性免疫）タイプの IgGサブクラスである IgGlのみならず、 T hi (細胞性免疫）タイプの IgGサブクラスである IgG2aおよび IgG3を誘導できることが示 された。これに対して、 OVA-リボソームによるワクチンを用いて免疫した場合、および OVAのみによるワクチンを用いて免疫した場合には、ほぼ IgGlしか産生できなかった 1 その IgGl抗体の産生量についても、 OVA-SucPG-リボソームによるワクチンを用 V、て免疫した場合には、他のワクチン担体によるワクチン (OVA-リボソームによるワク チンまたは OVAのみによるワクチン)を用いて免疫した場合よりも、顕著に効率よく抗 体産生を誘導できることが示された (p< 0.011)。
[0045] さらに、図 3から、 OVA-SucPG-リボソームによるワクチンを経鼻的に使用すると、 OV A-SucPG-リボソームによるワクチンと比較して、効率よく腸管に抗体産生を誘導でき ることが示された。
[0046] したがって、一般に、 SucPGを含むリボソームによるワクチンを経粘膜投与した場合 、抗原提示細胞に対して効率よく抗原導入をすることができ、その結果として高い血 中での抗体産生および高い腸管での抗体産生を誘導できること、そしてさらに体液 性免疫のみならず、細胞性免疫応答の誘導を行う可能性が示された。
[0047] ¾施例 3 : SucPG 含す リボソームによるワクチンの終 投 による細胞件免疫]^ の漏
実施例 2において、 SucPGを含むリボソームによるワクチンを用いて抗原を経粘膜投 与を通じて免疫することにより、細胞性免疫応答の誘導を行う可能性が示されたこと から、本実施例においては、 SucPGを含むリボソームによるワクチンを用いた場合の 細胞性免疫応答能にっ 、て検討した。
[0048] 実施例 1において作製した OVA-SucPG-リボソームによるワクチンを、 BALB/cマウ スの鼻腔内に 7日間隔で 2回、 100 g/匹の OVAとなるように投与した。最終投与後 7 日後にマウスを犠死させ、脾臓を摘出し、比重遠心法により、脾臓リンパ球を精製し た。
[0049] 精製脾臓リンパ球力ら TRIzol™ (Invitrogen社)を用いて全 RNAを抽出し、細胞性免 疫の指標である IFN- γおよび、 IL-4の mRNA発現について、 RT-PCR法で調べた。
[0050] まず、全 RNAから cDNAを合成した。全 RNA 1 μ g〜5 μ gとオリゴ（dT) プライマー
12-18
500 ng、 dNTP Mix 10 nmolを総量が 12 μ 1になるように混合し、 65°Cで 5分間反応させ 、氷上で急速に冷却した。っ 、で、 4 1の 5 X First-Strand Buffer、 2 μ 1の 0.1M DTT、 1 μ 1の RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor (40 units/ μ 1) (Invitrogen 社）を加えて、 42°Cで 2分間反応させ、 Superscript™ II逆転写酵素（Invitrogen社）を 2 00 unitsカ卩えた。さらに 42°Cで 50分間反応させた後、逆転写酵素を不活化するため、 70°Cで 15分間反応させた。
[0051] 得られた cDNA 1 μ 1と各プライマー 2.5 pmol、 37.5 nmol MgCl 、 10 nmol dNTP Mix
2
、 1 unit Taq DNA Polymerase (Invitrogen社）を PCR Bufferに加えて総量を 25 μ 1とし、 TaKaRa PCR Thermal Cycler MP TP3000 (TaKaRa社）で PCR反応をおこなった。 PC R反応は、 94°Cで 5分間反応後、 94°C 45秒、 60°C 45秒、 72°C 2分の反応を 35回繰り 返し、 72°Cで 7分間反応させることにより行った。 PCR後のサンプルは 2%のァガロー スゲル上で電気泳動し、ェチジゥムブロマイドで染色して可視化した。
[0052] 本実施例においては、マウス IFN- γ遺伝子を増幅するためのプライマーとして、 フォワードプライマー： 5し tgcatcttggcttgcagctcttcctcatggc- 3' (SEQ ID NO: 1)、およ び
リバースプライマー： 5し tggacctgtgggttgttgacctcaaacttggc- 3' (SEQ ID NO: 2)、 そしてマウス IL-4遺伝子を増幅するためのプライマーとして、
フォワードプライマー： 5'- ccagctagttgtcatcctgctcttctttctcg- 3' (SEQ ID NO: 3)、およ び
リバースプライマー： 5し cagtgatgtggacttggactcattcatggtgc- 3' (SEQ ID NO: 4)、 を使用した (それぞれ CLONTEC社)。対照としてマウス G3PDH遺伝子を増幅するた めのプライマーとして、
フォワードプライマー： 5'— accacagtccatgccatcac— 3' (SEQ ID NO: 5)、および リバースプライマー： 5し tccaccaccctgttgctgta- 3' (SEQ ID NO: 6)、
も使用した。
[0053] IFN- γおよび IL-4の mRNAの発現につ!、ての測定結果を、図 4に示す。図 4のレー ン 1は陽性対照、レーン 2は 200 1の生理食塩水を腹腔内に注射した陰性対照マウス 由来の全 RNA、レーン 3は OVA-SucPG-リボソームを腹腔内に免疫したマウス由来の 全 RNA、そしてレーン 4は OVAを含まな!/、SucPG_リボソームを腹腔内に免疫した陰性 対照マウス由来の全 RNAを、それぞれ铸型として RT-PCRを行った結果を示す。図 4 に示す通り、 OVA-SucPG-リボソームを免疫したマウスの脾臓リンパ球において、細 胞性免疫反応の指標である IFN- yの mRNAおよび体液性免疫反応の指標である IL- 4の mRNAの両方が発現されていることが明らかになった。
[0054] また本実施例にぉ ヽては、同時に、精製脾臓リンパ球を OVA添加培地で 5日間培 養し、培養上清中に放出された IFN- γ量および IL-4量を細胞性免疫ならびに体液 性免疫の指標として測定した。培養上清中の IFN- γおよび IL-4の定量は、それぞれ の定量キット (Endogen社)を使用しておこなった。
[0055] 脾臓リンパ球培養上清中に放出された IFN- γ量および IL-4量の定量結果を図 5に 示す。図 5のレーン 1は OVAを含まな!/、SucPG_リボソームを鼻腔内に免疫した陰性対 照マウス由来の脾臓リンパ球力 産生された IFN- γ量および IL-4量を、そしてレーン 2は、 OVA-SucPG-リボソームを鼻腔内に免疫したマウス由来の脾臓リンパ球力 産 生された IFN- γ量および IL-4量を、それぞれ示す。図 5に示す通り、 OVA-SucPG-リ ポソームを免疫したマウスの脾臓リンパ球の培養上清中にぉ 、て、細胞性免疫反応 の指標である IFN- γおよび体液性免疫反応の指標である IL-4の両方力 有意に高 く産生されて 、ることが明らかになった (pく 0.0001)。
[0056] 実施例 2および 3に示す結果から、本発明の SucPGを含むリボソームによるワクチン は、経鼻免疫を行うことにより、体液性免疫のみならず、細胞性免疫もまた誘導できる ことが示され、本発明の SucPGを含むリボソームが、経粘膜ワクチンの抗原キャリアと して有用であることが示された。
[0057] 実施例 4：サクシ二ル化ポリグリシドール（SucPG)リボソームによるワクチンの非経粘 蹬投 の場合の免痔]^容の檢討
本実施例は、実施例 1にお ヽて作製した SucPGを含むリボソームによるワクチンを非 経粘膜投与した場合の免疫応答にっ ヽて、 SucPGを含まな ヽリボソームによるワクチ ン比較検討することを目的として行った。
[0058] SucPGを含むリボソームによるワクチンは、実施例 1に記載する様に作製した。一方 、 SucPGを含まないリボソームによるワクチンとして、 DPPC : DOPEのモル比 1 : 1からな る脂質組成で OVAを封入させることにより、多重層型のリボソーム（OVA-リボソーム） (MLV)によるワクチンを作製した。
[0059] 上記の様にして作製した OVA-SucPG-リボソームによるワクチンおよび OVA-リポソ ームによるワクチン、さらに OVAのみによるワクチンを、 BALB/cマウスの腹腔内に 7日 間隔で 2回、それぞれ 100 g/匹の OVAとなるように投与した。
[0060] 免疫原の最終投与後 7日後に眼窩静脈叢力 血液を 0.1 ml採取し、その血液から 回収した血清を使用して、抗 OVA抗体（IgM、 IgG、または IgE)の産生について ELISA 法により検討した。さらに、得られた免疫血清を用いて、抗 OVA-IgGのサブクラスに っ ヽても ELISA法を用いて解析した。
[0061] 結果を図 6および図 7に示す。図 6は、 OVA- SucPG-リボソームによるワクチン、 OVA -リボソームによるワクチン、および OVAのみによるワクチンを、 BALB/cマウスの腹腔 内に免疫した場合の免疫応答についての結果を示したものであり、黒色カラムは OV Aのみを免疫した場合 (OVA)、灰色カラムは OVA-リボソームを免疫した場合 (OVA- lipo)、そして白色カラムは OVA-SucPG-リボソームを免疫した場合（OVA- SucPG-lip o)の結果をそれぞれ示す。図 7は、抗 OVA-IgG抗体のサブクラスに示したものであり 、各カラムの免疫抗原に関する説明は、図 6において上述したものと同様である。
[0062] 図 6に示される結果から、各種免疫原を BALB/cマウスの腹腔内に免疫した場合、 Ig Mおよび IgGクラスの抗体が体内で生成されることがわかり、全体的に IgGクラス抗体 の方が IgMクラス抗体よりも産生量が多力つた。また、各クラスの抗体について、ヮクチ ン担体の種類と産生される抗体量とを対比したところ、 OVAのみによるワクチンを免 疫した場合よりも OVA-リボソームによるワクチンを免疫した場合の方が抗体産生量は 多かったものの t検定の結果、有意差は存在しなかった力 OVA-リボソームによるヮ クチンを免疫した場合と OVA-SucPG-リボソームによるワクチンを用いて免疫した場 合とを比較したところ、 OVA-SucPG-リボソームによるワクチンを用いて免疫した場合 には、顕著に効率よく抗体産生を誘導できることが示された (p< 0.019)。
[0063] また、図 7に示される結果から、 OVA-SucPG-リボソームによるワクチンを用いて免 疫した場合には、 Th2 (体液性免疫）タイプの IgGサブクラスである IgGlのみならず、 T hi (細胞性免疫）タイプの IgGサブクラスである IgG2aおよび IgG3を誘導できることが示 された。これに対して、 OVA-リボソームによるワクチンを用いて免疫した場合、および OVAのみによるワクチンを用いて免疫した場合には、ほぼ IgGlしか産生できなかった 力 その IgGl抗体の産生量についても、 OVA-SucPG-リボソームによるワクチンを用 V、て免疫した場合には、他のワクチン担体によるワクチン（OVA-SucPG-リボソームに よるワクチンまたは OVAのみによるワクチン)を用いて免疫した場合よりも、顕著に効 率よく抗体産生を誘導できることが示された (p< 0.019)。
[0064] したがって、一般に、 SucPGを含むリボソームによるワクチンを非経粘膜投与した場 合、抗原提示細胞に対して効率よく抗原導入をすることができ、その結果として高い 抗体産生を誘導できること、そしてさらに体液性免疫のみならず、細胞性免疫応答の 誘導を行う可能性が示された。
[0065] 実施例 5 : SucPGを含す eリボソームによるワクチンの非経粘膜投与による細胞件免疫 の纏
実施例 4において、 SucPGを含むリボソームを用いて抗原を免疫することにより、細 胞性免疫応答の誘導を行う可能性が示されたことから、本実施例においては、 SucP Gを含むリボソームを用いた場合の細胞性免疫応答能にっ 、て検討した。
[0066] 実施例 1において作製した OVA-SucPG-リボソームを、 BALB/cマウスの腹腔内に 7 日間隔で 2回、 100 g/匹の OVAとなるように投与した。最終投与後 7日後にマウスを 犠死させ、脾臓を摘出し、比重遠心法により、脾臓リンパ球を精製した。このようにし て調製した脾臓リンパ球について、実施例 3に記載した様に、 IFN- γおよび、 IL- 4の mRNA発現について RT-PCR法で、培養上清中に放出された IFN- γ量および IL-4量 を ELISA法で、それぞれ測定した。
[0067] IFN- γおよび IL-4の mRNAの発現につ!、ての測定結果を、図 8に示す。図 8のレー ン 1は、 OVA-SucPG-リボソームを腹腔内に免疫したマウス由来の全 RNA、レーン 2は 陽性対照、レーン 3は OVAを含まない SucPG-リボソームを腹腔内に免疫した陰性対 照マウス由来の全 RNA、そしてレーン 4は 200 1の生理食塩水を腹腔内に注射した 陰性対照マウス由来の全 RNAを、それぞれ铸型として RT-PCRを行った結果を示す。 図 8に示す通り、 OVA-SucPG-リボソームを免疫したマウスの脾臓リンパ球において、 細胞性免疫反応の指標である IFN- yの mRNAおよび体液性免疫の指標である IL-4 の mRNAの両方が発現されていることが明らかになった。
[0068] また脾臓リンパ球培養上清中に放出された IFN- γ量および IL-4量の定量結果を図 9に示す。図 9のレーン 1は OVAを含まない SucPG-リボソームを腹腔内に免疫した陰 性対照マウス由来の脾臓リンパ球力も産生された IFN- γ量および IL-4量を、そしてレ ーン 2は、 OVA-SucPG-リボソームを腹腔内に免疫したマウス由来の脾臓リンパ球か ら産生された IFN- γ量および IL-4量を、それぞれ示す。図 9に示す通り、 OVA-SucP G-リボソームを免疫したマウスの脾臓リンパ球の培養上清中にぉ 、て、細胞性免疫 反応の指標である IFN- γおよび体液性免疫の指標である IL-4の両方力 有意に高 く産生されて 、ることが明らかになった (pく 0.0001)。
[0069] 実施例 4および 5に示す結果から、本発明の SucPGを含むリボソームによるワクチン は、非経鼻的免疫を行う場合でも、経鼻免疫を行う場合と同様に、体液性免疫のみ ならず、細胞性免疫もまた誘導できることが示され、本発明の SucPGを含むリボソーム 力 非経粘膜ワクチンの抗原キャリアとしても有用であることが示された。
[0070] 実施例 6 :サルモネラ杭原- SucPG-リボソームによるワクチンによる、ニヮトリに針する 本実施例は、 Salmonella Enteritidis抗原を免疫原として含む SucPGを含むリポソ一 ムによるワクチンを、 -ヮトリに対して、点眼 (経粘膜)投与した場合の免疫応答につ いて、検討することを目的として行った。
[0071] 本実施例にお!ヽて使用する免疫原、 Salmonella Enteritidis抗原は以下の様に調製 した。まず Salmonella Enteritidis (122ァ株）をハートインフユジョン培地 (日水製薬）に 接種し、 37°Cで 14時間培養した後、 7 X 1014CFUの Salmonella Enteritidis細菌を採取 した。この採取した Salmonella Enteritidis菌を過剰量のホルマリンにより変性させて不 活化させ、ホルマリンを除いた後、さらに超音波処理をすることにより抗原液を調製し た。このように調製した Salmonella Enteritidis抗原を含む SucPGを含むリボソームによ るワクチン（Salmonella Enteritidis抗原- SucPG-リボソームによるワクチン）は、基本的 に実施例 1に記載する方法にしたがって作製した。
[0072] 上記の様にして作製した Salmonella Enteritidis抗原- SucPG-リボソームによるワクチ ンを、生後 3週齢の-ヮトリ（白色レグホン）、 5羽に対して、 100 g/羽の量の Salmonell a Enteritidis抗原となるように、点眼により 1回投与した。
[0073] 免疫原の投与後 14日後（2週（5週齢) )、および 35日後（5週（8週齢) )に翼下静脈か ら血液を 2.0 ml採取し、その血液から回収した血清を使用して、抗 Salmonella Enteriti dis抗原抗体 (IgGまたは IgA)の産生について ELISA法により検討した。対照として、 Sa lmonella Enteritidis抗原で免疫する前（pre (3週齢） )の-ヮトリ個体力 得た血清を使 用した。
[0074] 結果を図 10に示す。図 10において、黒色カラムは IgG抗体の抗体価についての結 果を（図 10A)、そして白色カラムは IgA抗体の抗体価についての結果を（図 10B)、そ れぞれ示す。そして、免疫前 (Day 0)のニヮトリ個体における抗体の抗体価と比較し て、有意差 (pく 0.0001)が存在する場合に *印を付した。データは、平均士標準誤 差を示す。
[0075] 図 10に示される結果から、 Salmonella Enteritidis抗原- SucPG -リボソームによるワク チンを-ヮトリに対して点眼投与することにより免疫した場合、 IgGおよび IgAクラスの 抗体が両方とも体内で、「pre (3週齢)」の場合と比較して顕著に生成されることがわ かるが、長期的に (免疫原の最終投与後から 5週間 (8週齢)）見ると、 IgGクラス抗体の 方が IgAクラス抗体よりも産生量が多 、と 、う傾向があった。
[0076] この結果から、 Salmonella Enteritidis抗原- SucPG -リボソームによるワクチンを点眼（ 経粘膜)投与することにより-ヮトリを免疫すると、血中での高い抗体産生を誘導でき ることが示された。
[0077] 実施例 7 :トリパノソ一マ杭原- SucPG-リボソームによるワクチンによる、マウスに針す る ( 蹬)
本実施例は、トリパノソ一マ（Trypanosoma brucei)の抗原を免疫原として含む SucP Gを含むリボソームによるワクチンを、マウスに対して、経鼻 (経粘膜)投与した場合の 免疫応答について、検討することを目的として行った。
[0078] 本実施例にお!ヽて使用する免疫原、 T. brucei抗原を得るために、まず T. brucei原 虫を採取した。採取の方法は文献に記載された方法にしたがった（Lanham, S. M., N ature, 218, 1273-1274 (1968))。具体的には、 T. brucei原虫（1 X 105個）をウィスター ラット (日本 SLC)の腹腔内に接種し、 4日後心臓力ゝら全血を回収した。回収された血 液はへパリン（10 units/ml)で凝固防止を行い、遠心（1300 X g、 10分）処理によりパフ ィーコートを回収した。回収されたバフィ一コートから DE52セルロース（Whatman社） カラムにより原虫を精製'採取した。採取された T. bruce源虫を超音波処理すること により破砕し、 T. brucei抗原を得た。このように得られた T. brucei抗原を含む SucPGを 含むリボソームによるワクチン (T. brucei抗原- SucPG-リボソームによるワクチン）は、 基本的に実施例 1に記載する方法にしたがって作製した。
[0079] 上記の様にして作製した T. brucei抗原- SucPG-リボソームによるワクチンを、生後 6 週齢の Balb/cマウス（日本 SLC)、 5匹に対して、 100 μ g/匹の量の T. brucei抗原とな るように経鼻的に投与し、 2週間後に同量の T. brucei抗原をさらに経鼻的に投与して 免疫した。
[0080] 免疫原の初回投与後 14日後（Day 14)、および最終投与後 7日後（Day 21)に眼窩 静脈叢カゝら血液を 0.1 ml採取し、その血液から回収した血清を使用して、抗 T. brucei 抗原抗体 (IgGまたは IgM)の産生について ELISA法により検討した。対照として、 T. b rue 抗原で免疫する前 (Day 0)のマウス個体力 得た血清を使用した。
[0081] 結果を図 11に示す。図 11において、黒色カラムは IgM抗体の抗体価についての結 果を、そして白色カラムは IgG抗体の抗体価についての結果を、それぞれ示す。そし て、免疫前 (Day 0)のマウス個体における抗体価と比較して有意差 (p< 0.0012)が存 在する場合に #印を、有意差 (p< 0.0006)が存在する場合に $印を、有意差 (p< 0. 0001)が存在する場合に *印を、それぞれ付した。データは、平均士標準誤差を示 す。
[0082] 図 11に示される結果から、 T. brucei抗原- SucPG-リボソームによるワクチンをマウス に対して経鼻投与することにより免疫した場合、 IgMおよび IgGクラスの抗体が体内で 、 Day 0の場合と比較して顕著に生成されることがわかり、全体としては、 IgGクラス抗 体の方が IgMクラス抗体よりも産生量が多 、と 、う傾向があった。
[0083] この結果から、 T. brucei抗原- SucPG-リボソームによるワクチンを経鼻的（経粘膜） 投与することによりマウスを免疫すると、血中での高い抗体産生を誘導できることが示 された。
[0084] 実施例 8：昔色ブドウ球菌抗原- SucPG-リボソームによるワクチンによる、搾乳牛に する ( 膜)
本実施例は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus)の抗原を免疫原として含む S ucPGを含むリボソームによるワクチンを、ゥシに対して、経鼻 (経粘膜)投与した場合 の免疫応答について、検討することを目的として行った。 [0085] 本実施例にお!ヽて使用する免疫原、 S. aureus抗原は、まず S. aureus (Cowan I株） を LB培地（日水製薬）に接種し、 37°Cで 14時間培養した後 S. aureus細菌を採取した 。この採取した S. aureus細菌を過剰量のホルマリンにより変性させて不活化させ、ホ ルマリンを除いた後、さらに超音波処理をすることにより抗原液を調製した。このように 調製した S. aureus抗原を含む SucPGを含むリボソームによるワクチン（S. aureus抗原- SucPG-リボソームによるワクチン）は、基本的に実施例 1に記載する方法にしたがって 作製した。
[0086] 上記の様にして作製した S. aureus抗原- SucPG-リボソームによるワクチンを、ホルス タインの搾乳牛、 3頭に対して、 5 mg/頭の量の S. aureus抗原となるように経鼻的に投 与し、 14日後に同量の S. aureus抗原をさらに経鼻的に投与して免疫した。
[0087] 免疫原の初回投与後 14日目（Day 14)、免疫原の最終投与後 7日目（Day 21)、お よび 14日目（Day 28)に頸静脈から血液を 5 ml採取し、その血液から回収した血清を 使用して、抗 S. aureus抗原抗体（IgAまたは IgG)の産生について ELISA法により検討 した。対照として、 S. aureus抗原で免疫する前 (Day 0)の搾乳牛個体から得た血清を 使用した。
[0088] 結果を図 12に示す。図 12において、黒色カラムは IgA抗体の抗体価についての結 果を、そして白色カラムは IgG抗体の抗体価についての結果を、それぞれ示す。そし て、免疫前 (Day 0)の搾乳牛個体における抗体価と比較して、有意差 (p< 0.018)が 存在する場合に #印を、有意差 (p< 0.039)が存在する場合に &印を、有意差 (p< 0 .0076)が存在する場合に *印を、有意差 (p< 0.0001)が存在する場合に @印を、有 意差 (Pく 0.017)が存在する場合に†印を、それぞれ付した。データは、平均士標準 誤差を示す。
[0089] 図 12に示される結果から、 S. aureus抗原- SucPG-リボソームによるワクチンを搾乳 牛に対して経鼻投与することにより免疫した場合、血中ではほぼ同程度の IgGおよび I gAクラスの抗体力 Day 0の場合と比較して顕著に生成されることがわ力つた。
[0090] また、免疫原の初回投与後 14日目（Day 14)、免疫原の最終投与後 7日目（Day 21 )、および 14日目（Day 28)に乳汁を採取し、抗 S. aureus抗原抗体（IgGまたは IgA)の 産生について ELISA法により検討した。対照として、 S. aureus抗原で免疫する前（Day 0)の搾乳牛個体力 得た乳汁を使用した。
[0091] 結果を図 13に示す。図 13において、黒色カラムは IgA抗体の抗体価についての結 果を、そして白色カラムは IgG抗体の抗体価についての結果を、それぞれ示す。そし て、免疫前 (Day 0)の搾乳牛個体における抗体価と比較して、有意差 (p< 0.0046)が 存在する場合に #印を、有意差 (p = 0.054)が存在する場合に &印を、有意差 (p< 0 .011)が存在する場合に *印を、有意差 (pく 0.02)が存在する場合に @印を、有意 差 (pく 0.025)が存在する場合に†印を、それぞれ付した。データは、平均士標準誤 差を示す。
[0092] 図 13に示される結果から、 S. aureus抗原- SucPG-リボソームによるワクチンを搾乳 牛に対して経鼻投与することにより免疫した場合、乳汁中で IgGおよび IgAクラスの抗 体力 Day 0の場合と比較して顕著に生成されることがわかり、全体としては、 IgAクラ ス抗体の方が IgGクラス抗体よりも産生量が多いという傾向があった。
[0093] これらの結果から、 S. aureus抗原- SucPG-リボソームによるワクチンを経鼻的（経粘 膜)投与することにより搾乳牛を免疫すると、血中および乳汁中のいずれでも顕著に 高 ヽ抗体産生を誘導できることが示された。
[0094] 実施例 9 :Aeromonas salmonicida杭原- SucPG -リボソームによるワクチンによる、コィ に針する終口免疫
本実施例は、 Aeromonas salmonicidaの抗原を免疫原として含む SucPGを含むリポソ ームによるワクチンを、コィに対して、経口（経粘膜)投与した場合の免疫応答につい て、検討することを目的として行った。
[0095] 本実施例において使用する免疫原、 A. salmonicida抗原は、まず A. salmonicida (T 1031株）をハートインフュージョン培地に接種し、 20°Cで 24時間培養した後、 A. salmo nicida細菌を採取し、この採取した A. salmonicida細菌を過剰量のホルマリンにより変 性させて不活化させ、ホルマリンを除いた後、さらに超音波処理をすることにより調製 した。このようにして調製した A. salmonicida抗原の一部はそのまま免疫原として、別 の一部を A. salmonicida抗原を含む SucPGを含むリボソームによるワクチンを調製する ために、それぞれ利用した。不活化した A. salmonicida抗原を含む SucPGを含むリポ ソームによるワクチン（A. salmonicida抗原- SucPG-リボソームによるワクチン）は、基本 的に実施例 1に記載する方法にしたがって作製した。
[0096] 上記の様にして作製した A. salmonicida抗原- SucPG-リボソームによるワクチンを、 コィ（大阪府立食とみどりの総合技術センター.水性生物センター力 分与）、 6匹に 対して、 200 g/匹の量の A. salmonicida抗原となるように、経口的に、 2週間間隔で 3 回投与して免疫した。一方、対照として、 A. salmonicida抗原のみを、 4匹のコィに対し て 200 g/匹の量の A. salmonicida抗原となるように、経口的に、 2週間間隔で 3回投 与して免疫した。
[0097] 免疫原の初回投与時 (Day 0)、 2回目投与時 (Day 14)、 3回目投与時 (Day 28)、お よび最終投与後 14日後（Day 42)に尾柄部から血液を 1 ml採取し、その血液から回 収した血清を使用して、抗 A. salmonicida抗原抗体の産生について ELISA法により検 討した。対照として、 A. salmonicida抗原のみで免疫したコィ個体力 得た血清を使 用した。
[0098] 結果を図 14に示す。図 14において、黒丸（參）は . salmonicida抗原- SucPG-リポソ ームによるワクチンにより経口免疫したコィの抗体の抗体価についての結果を、そし て黒三角（▲)は A. salmonicida抗原のみにより経口免疫したコィの抗体の抗体価に ついての結果を、それぞれ示す。そして、 A. salmonicida抗原のみにより経口免疫し たコィの抗体の抗体価と比較して、有意差 (p< 0.01)が存在する場合に *印を付した 。データは、平均士標準誤差を示す。
[0099] 図 14に示される結果から、 A. salmonicida抗原- SucPG-リボソームによるワクチンをコ ィに対して経口投与することにより免疫した場合、 A. salmonicida抗原のみにより経口 免疫したコィと比較して、血中での抗体の抗体価が顕著に亢進されることがわ力つた
[0100] この結果を受けて、 A. salmonicida抗原- SucPG-リボソームによるワクチンの最終投 与後 14日後（Day 42)に、コイカも腸液と胆汁とを採取し、抗 A. salmonicida抗原抗体 の産生について ELISA法により検討した。対照として、非免疫のコィ個体力 得た腸 液および胆汁を使用した。
[0101] 結果を図 15に示す。図 15において、腸管粘膜における抗体の抗体価についての結 果を（図 15A)、そして胆汁中における抗体の抗体価についての結果を（図 15B)、そ れぞれ示す。それぞれの図において、黒色カラムは非免疫のコィ個体における抗体 の抗体価についての結果を、そして白色カラムは A. salmonicida抗原- SucPG-リポソ ームによるワクチンを投与したコィ個体における抗体の抗体価についての結果をそ れぞれ示す。そして、非免疫のコィ個体における抗体の抗体価と比較して、有意差（ p< 0.01)が存在する場合に *印を付した。データは、平均士標準誤差を示す。
[0102] 図 15に示される結果から、 A. salmonicida抗原- SucPG-リボソームによるワクチンをコ ィに対して経口投与することにより免疫した場合、腸液中および胆汁中の ヽずれでも 、抗体の抗体価が顕著に亢進されることがわ力つた。
[0103] さらに、 A. salmonicida抗原- SucPG-リボソームによるワクチンの最終投与後 14日後 に、 6匹のコィを A. salmonicida菌液（1 X 106 cfo/ml)中に 60分間浸漬することにより A. salmonicidaによる攻撃を行い、その後の生存率の推移を記録した。対照として、 8匹 の非免疫のコィ個体を同様に処理し、その後の生存率の推移を記録した。
[0104] 結果を図 16に示す。図 16において、黒丸（參）は . salmonicida抗原- SucPG-リポソ ームによるワクチンにより経口免疫したコィの生存率の推移を、そして黒三角（▲)は 非免疫のコィの生存率の推移を、それぞれ示す。そして、 A. salmonicida抗原- SucPG -リボソームによるワクチンにより経口免疫したコィの生存率は、非免疫のコィの生存 率と比較して高 、ことが示された。
[0105] これらの結果から、魚類であるコィにお 、ても、 A. salmonicida抗原- SucPG-リポソ一 ムによるワクチンを経口的 (経粘膜)投与して免疫すると、血中で高!ヽ抗体産生を誘 導できることが示された。
[0106] 実施例 10 : Mvcodasma gallisepticum抗原- SucPG -リボソームによるワクチンによる、 マウスに する (m ) ^
本実施例は、 Mycoplasma gallisepticumの抗原を免疫原として含む SucPGを含むリ ポソームによるワクチンを、マウスに対して、経鼻 (経粘膜)投与した場合の免疫応答 について、検討することを目的として行った。
[0107] 本実施例にぉ 、て使用する免疫原、 Mycoplasma gallisepticum抗原は、まず Mycop lasma gallisepticum (S6株）を新鮮イーストエキス添カ卩 Fray培地（Difco)〖こ接種し、 37 °Cで 48時間以上培養した後、 3.58xlOuCFUの Mycoplasma gallisepticum細菌を採取 した。この採取した Mycoplasma gallisepticum細菌を過剰量のホルマリンにより変性さ せて不活化させ、ホルマリンを除いた後、さらに超音波処理をすることにより抗原液を 調製した。このように調製した Mycoplasma gallisepticum抗原を含む SucPGを含むリポ ソームによるワクチン（Mycoplasma gallisepticum抗原- SucPG -リボソームによるワクチ ン）は、基本的に実施例 1に記載する方法にしたがって作製した。
[0108] 上記の様にして作製した Mycoplasma gallisepticum抗原- SucPG -リボソームによるヮ クチンを、生後 5週齢の Balb/cマウス（日本 SLC)、 5匹に対して 100 μ g/匹の Mycoplas ma gallisepticum抗原となるように経鼻的に投与し、 2週間後に同量の Mycoplasma gal lisepticum抗原をさらに経鼻的に投与し免疫した。
[0109] 免疫原の最終投与後 7日後（Day 21)に眼窩静脈叢力 血液を 0.1 ml採取し、その 血液から回収した血清を使用して、抗 M. gallisepticum抗体（IgGおよび IgA)の産生に ついて ELISA法により検討した。対照として、 M. gallisepticum抗原で免疫する直前の マウス個体から得た血清 (Day 0)を使用した。
[0110] 結果を図 17に示す。図 17は、 M. gallisepticum抗原- SucPG-リボソームによるワクチ ンを、マウスに対して経鼻的に投与して免疫した場合の免疫応答について、血清中 の抗体クラス誘導の結果を示したものであり、黒色カラムは IgG抗体の抗体価につい ての結果を、そして白色カラムは IgA抗体の抗体価についての結果を、それぞれ示す
[0111] 図 17に示される結果から、 M. gallisepticum抗原をマウスに対して経鼻的に投与して 免疫した場合、 IgGクラスおよび IgAクラスの抗体が両方とも体内で生成されることがわ かり、全体的に IgGクラス抗体の方が IgAクラス抗体よりも産生量が多力つた。そして、 M. gallisepticum抗原で免疫する直前のマウス個体から得た血清（Day 0)の抗体の抗 体価と比較して、有意差 (p< 0.0063)が存在する場合に #印を、有意差 (p< 0.0003) が存在する場合に *印を、それぞれ付した。データは、平均士標準誤差を示す。
[0112] したがって、 SucPGを含むリボソームにより M. gallisepticum抗原についてのワクチン を経粘膜投与すると、血中での高い抗体産生を誘導できること、そしてさらに体液性 免疫のみならず、細胞性免疫応答の誘導を行う可能性が示された。
[0113] 実施例 11 :ニューカッスル病ウィルス抗原- SucPG-リボソームによるワクチンによる、 マウスに する ^ )
本実施例は、ニューカッスル病ウィルスの抗原を免疫原として含む SucPGを含むリ ポソームによるワクチンを、マウスに対して、経鼻 (経粘膜)投与した場合の免疫応答 について、検討することを目的として行った。
[0114] 本実施例において使用する免疫原、ニューカッスル病ウィルス抗原は、市販のニュ 一カツスル病生ワクチンを超音波処理をすることにより不活化させ抗原液を調製した
。このように調整したニューカッスル病ウィルス抗原を含む SucPGを含むリボソームに よるワクチン（ニューカッスル病ウィルス抗原- SucPG-リボソームによるワクチン）は、基 本的に実施例 1に記載する方法にしたがって作製した。
[0115] 上記の様にして作製した-ユーカツスル病ウィルス抗原- SucPG-リボソームによるヮ クチンを、生後 5週齢の Balb/cマウス（日本 SLC)、 5匹に対して 100 μ g/匹の-ユー力 ッスル病ウィルス抗原となるように経鼻的に投与し、 2週間後に同量の-ユーカツスル 病ウィルス抗原をさらに経鼻的に投与し免疫した。
[0116] 免疫原の最終投与後 7日後（Day 21)に眼窩静脈叢力 血液を 0.1 ml採取し、その 血液から回収した血清を使用して、抗-ユーカツスル病ウィルス抗原抗体 (IgGまたは IgA)の産生について ELISA法により検討した。対照として、ニューカッスル病ウィルス 抗原抗原で免疫する前 (Day 0)のマウス個体から得た血清を使用した。
[0117] 結果を図 18に示す。図 18において、黒色カラムは IgG抗体の抗体価についての結 果を、そして白色カラムは IgA抗体の抗体価についての結果を、それぞれ示す。そし て、免疫前 (Day 0)のマウス個体における抗体価と比較して有意差 (p< 0.0027)が存 在する場合に #印を、有意差 (p< 0.00122)が存在する場合に *印を、それぞれ付し た。データは、平均士標準誤差を示す。
[0118] 図 18に示される結果から、ニューカッスル病ウィルス抗原- SucPG-リボソームによる ワクチンをマウスに対して経鼻投与することにより免疫した場合、 IgGクラスおよび IgA クラスの抗体が体内で、 Day 0の場合と比較して顕著に生成されることがわかり、全体 としては、 IgGクラス抗体の方が IgAクラス抗体よりも増加率が高いという傾向があった
[0119] この結果から、ニューカッスル病ウィルス抗原- SucPG-リボソームによるワクチンを経 鼻的 (経粘膜)投与することによりマウスを免疫すると、血中での高い抗体産生を誘導 できることが示された。
産業上の利用可能性
上述したサクシ二ルイ匕ポリグリシドールを含むリボソーム力 構成されるワクチン担 体を使用してワクチンを作製することにより、従来のリボソーム力 構成されるワクチン 担体を使用した場合と比較して、顕著に抗体価を上昇させることができる効率的なヮ クチンを得ることができる。また、上述したワクチン担体を使用して作製したワクチンに より、体液性免疫だけでなぐ細胞性免疫を誘導することもできる。

Claims

請求の範囲
[I] サクシ二ルイ匕ポリグリシドールを含むリボソーム力も構成されるワクチン担体。
[2] サクシ二ルイ匕ポリグリシドールを、 10〜40重量％含む、請求項 1に記載のワクチン担 体。
[3] サクシ二ルイ匕ポリグリシドールを、 30重量％含む、請求項 2に記載のワクチン担体。
[4] リボソームを構成する脂質力 ジォレイルフォスファチジルエタノールァミン (DOPE) 、ジステアロイルフォスファチジルエタノールァミン（DSPE)、ジパルミトイルフォスファ チジルセリン（DPPS)、ジパルミトイルフォスファチジルコリン（DPPC)、ジステアロイル フォスファチジルコリン（DSPC)、ジミリストイルフォスファチジルコリン（DMPC)、卵黄 レシチン（egg PC)またはコレステロールのいずれ力、もしくはこれらのいずれかの組 み合わせ力も構成される、請求項 1〜3のいずれか 1項に記載のワクチン担体。
[5] リボソームが、ジォレイルフォスファチジルエタノールァミン（DOPE)およびジステア ロイルフォスファチジルエタノールァミン（DSPE)の組み合わせから構成される、請求 項 1〜4のいずれ力 1項に記載のワクチン担体。
[6] リボソーム中に含まれる免疫原を抗原提示細胞への内在化を可能にすることを特 徴とする、請求項 1〜5のいずれか 1項に記載のワクチン担体。
[7] リボソーム中に含まれる免疫原を経粘膜的に投与するための、請求項 1〜6のいず れカ 1項に記載のワクチン担体。
[8] リボソーム中に含まれる免疫原を非経粘膜的に投与するための、請求項 1〜6のい ずれか 1項に記載のワクチン担体。
[9] 免疫化のために投与すべき免疫原を、サクシ-ルイ匕ポリグリシドールを含むリポソ ームから構成されるワクチン担体中に含ませた、ワクチン。
[10] 免疫原に対する細胞性免疫を誘導させるための、請求項 9に記載のワクチン。
[II] 免疫原に対する体液性免疫もまた誘導させるための、請求項 10に記載のワクチン。
[12] ワクチン担体中にサクシ-ル化ポリグリシドールを 10〜40重量％含む、請求項 9〜1
1のいずれ力 1項に記載のワクチン。
[13] ワクチン担体中にサクシ-ルイ匕ポリグリシドールを 30重量％含む、請求項 12に記載 のワクチン。
[14] ワクチン担体のリボソームを構成する脂質力 ジォレイルフォスファチジルエタノー ルァミン（DOPE)、ジステアロイルフォスファチジルエタノールァミン（DSPE)、ジパルミ トイルフォスファチジルセリン（DPPS)、ジパルミトイルフォスファチジルコリン（DPPC)、
DMPC)、卵黄レシチン（egg PC)またはコレステロールのいずれ力、もしくはこれらの いずれかの組み合わせから構成される、請求項 9〜13のいずれ力 1項に記載のヮクチ ン。
[15] ワクチン担体中のリボソームが、ジォレイルフォスファチジルエタノールァミン（DOP
E)およびジステアロイルフォスファチジルエタノールァミン（DSPE)の組み合わせから 構成される、請求項 9〜14のいずれ力 1項に記載のワクチン。
[16] リボソーム中に含まれる免疫原を抗原提示細胞中に内在化させることを可能にする
、請求項 9〜15のいずれ力 1項に記載のワクチン。
[17] 免疫原を経粘膜的に投与するための、請求項 9〜16のいずれか 1項に記載のワク チン。
[18] 免疫原を非経粘膜的に投与するための、請求項 9〜16のいずれか 1項に記載のヮ クチン。
[19] 免疫原が、細菌、ウィルス、原虫のいずれかに由来する抗原力 選択される、請求 項 9〜18のいずれかに記載のワクチン。
[20] 細菌が、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、エロモナス、マイコプラズマ力も選択される、 請求項 19に記載のワクチン。
[21] ウィルス力 ニューカッスル病ウィルスである、請求項 19に記載のワクチン。
[22] 原虫が、トリパノソ一マである、請求項 19に記載のワクチン。
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